TW201311898A - 作為細胞巨大病毒疫苗之條件式複製cmv - Google Patents
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Abstract
本發明係關於使用經遺傳修飾之條件式複製缺陷型細胞巨大病毒(CMV)誘導對CMV之免疫反應的方法。本發明方法可用於治療及/或預防原發性CMV感染、因潛伏CMV再活化所致之感染,及先前曾遭遇之不同株CMV之再感染(super-infection)。本發明亦關於複製缺陷型CMV,其已經重組改變以允許外部控制病毒複製。本發明亦涵蓋包含該複製缺陷型CMV之組合物。
Description
本發明係關於使用經遺傳修飾之條件式複製缺陷型細胞巨大病毒(CMV)誘導對CMV之免疫反應的方法。本發明亦係關於CMV,其已經重組改變以允許外部控制病毒複製。本發明亦涵蓋包含該複製缺陷型CMV之組合物。
細胞巨大病毒(CMV)(亦稱為人類皰疹病毒5,HHV-5)係歸類為皰疹病毒科(herpesviridae)β亞科之成員之皰疹病毒。根據疾病控制與預防中心(Centers for Disease Control and Prevention),在人類群體中相當廣泛地發現CMV感染,估計美國成人群體中有40-80%已受到感染。該病毒主要經由體液傳播且經常自懷孕母親傳遞至胎兒或新生兒。在大多數個體中,CMV感染係潛伏的,但病毒活化可導致高燒、發冷、疲乏、頭痛、噁心及脾腫大。
儘管多數人類CMV感染沒有症狀,但免疫受損個體(例如HIV陽性患者、同種異體移植患者及癌症患者)或免疫系統尚未發育完全者(例如新生兒)之CMV感染可尤其成問題(Mocarski等人,Cytomegalovirus,in Field Virology,2701-2772,編輯:Knipes及Howley,2007)。此等個體之CMV感染可造成嚴重病狀,包括肺炎、肝炎、腦炎、結腸炎、葡萄膜炎、視網膜炎、失明及神經病變,以及其他有害病況。另外,懷孕期間之CMV感染係出生缺陷之主要原因(Adler,2008 J.Clin Virol,41:231;Arvin等人,2004 Clin
Infect Dis,39:233;Revello等人,2008 J Med Virol,80:1415)。CMV感染各種活體內細胞,包括單核球、巨噬細胞、樹突細胞、嗜中性球、內皮細胞、上皮細胞、纖維母細胞、神經元、平滑肌細胞、肝細胞及基質細胞(Plachter等人1996,Adv.Virus Res.46:195)。儘管臨床CMV分離物在多種細胞類型中複製,但實驗室株AD 169(Elek及Stern,1974,Lancet 1:1)及Towne(Plotkin等人,1975,Infect.Immun.12:521)幾乎僅在纖維母細胞中複製(Hahn等人,2004,J.Virol.78:10023)。規定源於病毒在纖維母細胞中之連續傳代及最終適應之向性限制為衰減標記物(Gerna等人,2005,J.Gen.Virol.86:275;Gerna等人,2002,J.Gen Virol.83:1993;Gerna等人,2003,J.Gen Virol.84:1431;Dargan等人,2010,J.Gen Virol.91:1535)。已將造成人類CMV實驗室株中上皮細胞、內皮細胞、白血球及樹突細胞向性損失之突變作圖至三個開放閱讀框(ORF):UL128、UL130及UL131(Hahn等人,2004,J.Virol.78:10023;Wang及Shenk,2005J.Virol.79:10330;Wang及Shenk,2005 Proc Natl Acad Sci USA.102:18153)。生化及重構研究顯示,UL128、UL130及UL131組裝至gH/gL支架上以形成五聚gH複合物(Wang及Shenk,2005 Proc Natl Acad Sci USA.102:1815;Ryckman等人,2008 J.Virol.82:60)。在病毒粒子中恢復此複合物可恢復實驗室株中之病毒上皮向性(Wang及Shenk,2005 J.Virol.79:10330)。
已懷疑內皮及上皮向性損失係先前評估為諸如Towne等疫苗之缺陷(Gerna等人,2002,J.Gen Virol.83:1993;Gerna等人,2003,J.Gen Virol.84:1431)。感染天然CMV之人類個體之血清中之中和抗體針對病毒上皮進入之活性係針對纖維母細胞進入之15倍(Cui等人,2008 Vaccine 26:5760)。具有原發性感染之人類快速地產生針對病毒內皮及上皮進入之中和抗體,但僅緩慢地產生針對病毒纖維母細胞進入之中和抗體(Gerna等人,2008 J.Gen.Virol.89:853)。此外,在接受Towne疫苗之人類個體之免疫血清中不存在針對病毒上皮及內皮進入之中和活性(Cui等人,2008 Vaccine 26:5760)。最近,闡述一組來自四名具有HCMV感染之供體之人類單株抗體,且來自該組之中和效能較高之純系識別五聚gH複合物抗原(Macagno等人,2010 J.Virol.84:1005)。
本發明係關於條件式複製缺陷型CMV(rdCMV)及rdCMV在治療患者之CMV感染或與此一感染相關之病狀及/或降低其可能性之組合物及方法中的用途。本文所述rdCMV包含編碼一或多種融合蛋白之核酸,該等蛋白包含融合至去穩定蛋白之必需蛋白。在不存在穩定劑下,融合蛋白降解。因此,rdCMV可在允許複製之條件下(即,在存在穩定劑下)在組織培養物中生長,但在投與患者時(在不存在穩定劑下),減少且較佳防止複製。
本發明之一個實施例係條件式複製缺陷型CMV。rdCMV
包含編碼一或多種融合蛋白之核酸,該等蛋白包含融合至去穩定蛋白之必需蛋白。rdCMV中不再存在編碼野生型必需蛋白之核酸且因此病毒複製需要該融合蛋白。在一較佳實施例中,必需蛋白係選自IE1/2、UL51、UL52、UL79及UL84組成之群且去穩定蛋白係FKBP或其衍生物。
本發明之另一實施例係包含經分離rdCMV及醫藥上可接受之載劑之組合物。該組合物可進一步包含佐劑,包括(但不限於)ISCOMATRIX®佐劑及磷酸鋁佐劑。
本發明之另一實施例係rdCMV組合物在患者中誘導針對CMV之免疫反應的用途。可藉由投與本發明rdCMV來預防性或治療性治療患者。預防性治療提供足夠保護性免疫力以降低CMV感染之可能性或嚴重程度,該感染包括原發性感染、復發性感染(即,彼等源於潛伏CMV再活化者)及再感染(即,彼等源於與患者先前所經歷者不同株CMV之感染者)。在具體實施例中,給育齡女性、尤其早期***女性接種疫苗以降低在懷孕期間CMV感染(原發性、復發性或再)之可能性且因此降低將CMV傳染至胎兒之可能性。可執行治療性治療以降低現行CMV感染之時長/嚴重程度。
本發明之另一實施例係製備本發明rdCMV之方法,其包含在Shield-1存在下在上皮細胞(例如ARPE-19細胞,ATCC登錄號CRL-2302)上繁殖rdCMV。在一些實施例中,在微載體或其他高密度細胞培養系統上在上皮細胞繁殖rdCMV。
本發明係關於條件式複製缺陷型CMV(rdCMV)及rdCMV在治療患者之CMV感染或與此一感染相關之病狀及/或降低其可能性之組合物及方法中的用途。本文所述rdCMV編碼一或多種融合蛋白,該等融合蛋白包含融合至去穩定蛋白之必需蛋白,而非野生型必需蛋白。在不存在穩定劑下,融合蛋白由宿主細胞機器降解。在存在穩定劑下,融合蛋白穩定且不會降解。
用於本發明中之適宜融合蛋白在存在穩定劑下保留足夠必需蛋白活性以促進在宿主細胞中之病毒複製,且在不存在穩定劑下使CMV複製減少(較佳大於50%、75%、90%、95%或99%減少)。較佳地,用於融合蛋白中之必需蛋白編碼非結構蛋白且因此不會封裝至rdCMV病毒粒子中。本文所鑑別之適宜必需蛋白包括藉由必需基因IE1/2、UL51、UL52、UL79及UL84編碼之CMV蛋白。
去穩定蛋白及穩定劑之實例闡述於美國專利公開案2009/0215169中,該案件揭示使用小分子調節蛋白之穩定性的組合物、系統及方法。簡言之,將蛋白融合至影響穩定性之蛋白FKBP或其衍生物。外源添加之可透過細胞之小分子Shield-1(Shld-1)與FKBP或其衍生物相互作用並穩定融合蛋白。在Shield-1不存在下,FKBP或其衍生物引導融合蛋白由宿主細胞機器降解。
在本發明實施例中,將必需CMV蛋白融合至FKBP或其衍生物。在Shield-1存在下,融合蛋白係穩定的。然而,
在Shield-1不存在下,FKBP或其衍生物引導融合蛋白由宿主細胞機器降解。
在不存在融合蛋白下,減少(與不含有去穩定必需蛋白之CMV相比,較佳大於50%、75%、90%、95%或99%)或防止rdCMV複製。
欲用於本發明方法中之重組病毒亦在其病毒粒子上展示免疫原性五聚gH複合物。
實施例亦包括本文所述重組CMV或其組合物或包含該等CMV或組合物或由其組成之疫苗,其用於以下用途:(i)用於(a)療法(例如,人體);(b)藥物;(c)抑制CMV複製;(d)治療或預防CMV感染;或(e)治療、預防CMV相關疾病或延遲其發作或進展,(ii)用作用於以上各項之藥劑,或(iii)用於製備用於以上各項之藥劑。在該等用途中,重組CMV、其組合物及/或包含該等CMV或組合物或由其組成之疫苗可視情況與一或多種抗病毒劑(例如,抗病毒化合物或抗病毒免疫球蛋白;組合疫苗,如下文所述)組合使用。
本文所用「誘導免疫反應」係指條件式複製缺陷型CMV在所投與患者、較佳哺乳動物、更佳人類中產生免疫反應之能力,其中該反應包括(但不限於)產生特異性結合且較佳中和CMV及/或使T細胞活化之成份(例如抗體)。「保護性免疫反應」係降低患者感染CMV(包括原發性、復發性及/或再感染)之可能性及/或改善至少一種與CMV感染相關之病狀及/或降低CMV感染之嚴重程度/時長的免疫反應。
本文所用「免疫有效量」係指免疫原在投與患者時可誘導針對CMV之免疫反應之量,該免疫反應可保護患者免受CMV感染(包括原發性、復發性及/或再感染)及/或改善至少一種與CMV感染相關之病狀及/或降低患者之CMV感染之嚴重程度/時長。該量應足以顯著降低CMV感染之可能性或嚴重程度。可使用業內已知動物模型來評價投與免疫原之保護效應。例如,可針對抗體或細胞毒性T細胞之中和能力或免疫T細胞之細胞介素產生能力來分析投與免疫原之個體之免疫血清或免疫T細胞。通常用於此等評估之分析包括(但不限於)病毒中和分析、抗病毒抗原ELISA、干擾素γ細胞介素ELISA、干擾素γ ELISPOT、細胞內多細胞介素染色(ICS)及51鉻釋放細胞毒性分析。亦可使用動物刺激模型來測定免疫原之免疫有效量。
本文所用「條件式複製缺陷型病毒」係指可在某些環境而非其他環境中複製之病毒顆粒。在較佳實施例中,藉由將病毒複製所必需之一或多種蛋白去穩定使病毒成為條件式複製缺陷型病毒。在條件式複製缺陷型病毒中不再存在編碼野生型、非去穩定必需蛋白之核酸。在將一或多種必需蛋白去穩定之條件下,與不具有去穩定必需蛋白之病毒相比,病毒複製減少較佳大於50%、75%、90%、95%、99%或100%。然而,在使去穩定必需蛋白穩定之條件下,病毒複製可在不含有去穩定必需蛋白之CMV之複製量的較佳至少75%、80%、90%、95%、99%或100%下發生。在更佳實施例中,藉由與諸如FKBP或其衍生物等去穩定蛋白
融合來將一或多種必需蛋白去穩定。可藉由諸如Shield-1等穩定劑之存在來穩定此等融合蛋白。本文所用「rdCMV」係指條件式複製缺陷型細胞巨大病毒。
在較佳實施例中,由複製缺陷型病毒誘導之免疫反應與其活病毒對應部分相比在程度及/或幅度上相同或實質上類似。在其他實施例中,藉由電子顯微術分析所達成複製缺陷型病毒之形態與其活病毒對應部分不可區別或實質上類似。
本文所用「FKBP」係指SEQ ID NO:11之去穩定蛋白。含有FKBP之融合蛋白係藉由宿主細胞機器降解。本文所用「FKBP衍生物」係指已藉由一或多個胺基酸取代、缺失及/或添加改變之FKBP蛋白或其部分。FKBP衍生物在融合至蛋白時保留FKBP之實質上所有去穩定性質且亦保留FKBP藉由Shield-1穩定之實質上所有能力。較佳FKBP衍生物在所示胺基酸位置處具有以下取代中之一或多者:F15S、V24A、H25R、F36V、E60G、M66T、R71G、D100G、D100N、E102G、K105I及L106P。具有F36V及L106P取代之FKBP衍生物(SEQ ID NO:12)尤佳。在較佳實施例中,編碼FKBP或FKBP衍生物之核酸含有至少一些在人類中並不常用於內源性FKBP之密碼子。此可降低融合蛋白之FKBP或FKBP衍生物與其在人類基因組中之對應部分重排或重組的可能性。核酸序列SEQ ID NO:13使用此等密碼子編碼SEID NO:12。
本文所用術語「Shield-1」或「Shld 1」係指結合野生型
FKBP及其衍生物且用作穩定劑之合成小分子。與野生型FKBP相比,與F36V衍生物結合緊約1,000倍(Clackson等人,1998,PNAS 95:10437-42)。Shield-1可經合成(基本上如以下文獻中所述:Holt等人,1993,J.Am.Chem.Soc.115:9925-38及Yang等人,2000,J.Med.Chem.43:1135-42及Grimley等人,2008,Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 18:759)或購自Cheminpharma LLC(Farmington,CT)或Clontech Laboratories公司(Mountain View,CA)。亦可在本發明方法中使用Shield-1之鹽。Shield-1具有以下結構:
本文所用術語「融合」或「融合蛋白」係指兩條作為相同鄰接胺基酸序列一部分於框架內佈置之多肽。融合可係直接的,從而使得在多肽間不存在其他胺基酸殘基;或係間接的,從而使得存在小胺基酸連接體,以改良性能或增加功能性。在較佳實施例中,融合係直接的。
本文所用術語「五聚gH複合物」或「gH複合物」係指CMV病毒粒子表面上之五種病毒蛋白之複合物。該複合物係由藉由組裝至gH/gL支架上之UL128、UL130及UL131編碼之蛋白構成(Wang及Shenk,2005 Proc Natl Acad Sci
USA.102:1815;Ryckman等人,2008 J.Virol.82:60)。來自CMV株AD 169之複合物蛋白之序列以下列GenBank登錄號顯示:NP_783797.1(UL128)、NP_040067(UL130)、CAA35294.1(UL131)、NP_040009(gH,亦稱為UL75)及NP_783793(gL,亦稱為UL115)。一些經衰減CMV株在UL131中具有一或多種突變,從而使得不表現該蛋白且因此不形成gH複合物。在此等情形下,應修復UL131(使用諸如Wang及Shenk,2005 J.Virol.79:10330中方法等方法),從而使得在本發明rdCMV中表現gH複合物。本發明病毒表現病毒構成五聚gH複合物並在病毒包膜上組裝五聚gH複合物之五種蛋白。
本文所用「必需蛋白」係指活體內及組織培養中病毒複製所需之病毒蛋白。CMV中之必需蛋白之實例包括(但不限於)IE1/2、UL37x1、UL44、UL51、UL52、UL53、UL56、UL77、UL79、UL84、UL87及UL105。
本文所用「去穩定必需蛋白」係指經表現並在病毒複製中執行其功能且在不存在穩定劑下降解之必需蛋白。在較佳實施例中,將必需蛋白融合至諸如FKBP或其衍生物等去穩定蛋白。在正常生長條件(即,不存在穩定劑)下,融合蛋白會有所表現,但藉由宿主細胞機器降解。降解不允許必需蛋白在病毒複製中起作用,因此在功能上剔除必需蛋白。在存在諸如Shield-1等穩定劑之條件下,融合蛋白係穩定的且可以維持病毒複製之量執行其功能,該複製係不含有去穩定必需蛋白之CMV之複製量的較佳至少75%、
80%、90%、95%、99%或100%。
本發明方法使用表現五聚gH複合物之複製缺陷型CMV(rdCMV)。可根據本發明方法使表現五聚gH複合物之任何經衰減CMV病毒成為複製缺陷型。在一個實施例中,經衰減CMV係因修復UL131基因中之突變而已恢復gH複合物表現之AD 169(參見實例1)。
條件式複製缺陷型病毒係一或多種必需病毒蛋白已藉由必需蛋白之去穩定對應部分替代之突變體。去穩定對應部分係藉由編碼必需蛋白與去穩定蛋白間之融合蛋白之核酸編碼。去穩定必需蛋白僅可在存在穩定劑時起作用以支持病毒複製。在較佳實施例中,使用美國專利公開案2009/0215169中所述方法來賦予表現五聚gH複合物之CMV以條件式複製缺陷型表型。簡言之,將CMV複製所必需之一或多種蛋白融合至去穩定蛋白FKBP或FKBP衍生物。rdCMV中不再存在編碼野生型必需蛋白之核酸。在存在外源添加之可透過細胞之小分子穩定劑Shield-1(Shld-1)下,融合蛋白係穩定的且必需蛋白可起作用以支持病毒複製。rdCMV在存在穩定劑下之複製較佳係不含有去穩定融合蛋白之CMV(例如,用於構築rdCMV之親代經衰減CMV)之複製量的至少75%、80%、90%、95%、99%或100%。在Shield-1不存在下,融合蛋白之去穩定蛋白引導融合蛋白藉由宿主細胞機器實質上降解。在不存在必需蛋白或存在最低量之必需蛋白下,CMV不能以一定量複製以
在患者中產生或維持CMV感染。rdCMV在不存在穩定劑下之複製不會發生或與不含有去穩定融合蛋白之CMV(例如,用於構築rdCMV之親代經衰減CMV)相比減少較佳大於50%、75%、90%、95%或99%。
使用業內所熟知之重組DNA方法,將編碼用於CMV複製及/或建立/維持CMV感染之必需蛋白之核酸附著至編碼FKBP或其衍生物之核酸。經編碼融合蛋白包含在框架內融合至必需蛋白之FKBP或FKBP衍生物。經編碼融合蛋白在Shield-1存在下穩定。然而,經編碼融合蛋白在Shield-1不存在下去穩定且導向破壞。在較佳實施例中,FKBP係SEQ ID NO:11。在其他實施例中,FKBP衍生物係包含一或多個選自由以下之群之胺基酸取代之FKBP:F15S、V24A、H25R、F36V、E60G、M66T、R71G、D100G、D100N、E102G、K105I及L106P。在更佳實施例中,FKBP衍生物包含F36V及/或L106P取代(SEQ ID NO:12)。在更佳實施例中,FKBP衍生物係由SEQ ID NO:13編碼。
導向藉由與FKBP或其衍生物融合來去穩定之必需蛋白1)係病毒複製所必需;2)可適應去穩定蛋白之融合而不實質上破壞必需蛋白之功能;且3)可適應在編碼必需蛋白之病毒ORF之5'或3'端處***編碼FKBP或其衍生物之核酸而不實質上破壞其他周圍病毒基因之ORF。在較佳實施例中,導向藉由與FBBP或其衍生物融合來去穩定之必需蛋白編碼非結構蛋白且因此封裝至重組CMV病毒粒子中之可能性降低。表1顯示滿足上述標準之CMV基因。
本發明涵蓋包含融合蛋白之rdCMV,該等蛋白具有融合至去穩定蛋白之必需蛋白或其衍生物。必需蛋白衍生物相對於野生型必需蛋白含有一或多個胺基酸取代、添加及/或缺失,但仍可提供必需蛋白至少足以支持在Shield-1存在下之病毒複製之活性。量測病毒活性之實例提供於下文實例中。可使用業內已知方法來測定所關注CMV必需蛋白與衍生物間之差異度。在一個實施例中,使用序列一致性來確定相關性。本發明衍生物將較佳與基本序列至少85%一致、至少90%一致、至少95%一致、至少97%一致、至少99%一致。一致性百分比定義為一致殘基之數目除以殘基總數且乘以100。若比對中之序列具有不同長度(因間隙
或延伸所致),則將在計算中使用代表總長度值之最長序列之長度。
在一些實施例中,病毒複製所必需之一或多種導向去穩定之病毒蛋白係選自由以下組成之群:IE1/2、UL51、UL52、UL84、UL79、UL87、UL37x1、UL77及UL53或其衍生物。在具體實施例中,病毒複製所必需之一或多種導向去穩定之病毒蛋白係選自由以下組成之群:IE1/2、UL51、UL52、UL84、UL79、UL87。在更具體實施例中,病毒複製所必需之一或多種導向去穩定之病毒蛋白係選自由以下組成之群:IE1/2、UL51、UL52、UL79及UL84。
一種以上必需蛋白可藉由與FKBP或其衍生物融合去穩定。在一些實施例中,該等必需蛋白在CMV複製及/或感染之不同階段(包括,但不限於,立即早期、早期或晚期)作用。在較佳實施例中,病毒複製所必需之經導向去穩定之病毒蛋白的組合係選自由以下組成之群:IE1/2與UL51、IE1/2與UL52、IE1/2與UL79、IE1/2與UL84、UL84與UL51,及UL84與UL52。在一個更佳實施例中,IE1/2與UL51係於相同重組CMV中導向去穩定。在一個最佳實施例中,包含IE1/2之融合蛋白係SEQ ID NO:1且包含UL51之融合蛋白係SEQ ID NO:3。SEQ ID NO:1及3可分別由SEQ ID No:2及4編碼。具有去穩定之IE 1/2及UL51之rdCMV之基因組示於SEQ ID NO:14中。
FKBP或其衍生物可直接地或間接地融合至必需蛋白。
在較佳實施例中,FKBP或其衍生物係直接地融合至必需蛋白。
FKBP或其衍生物可在必需蛋白之N或C端融合至必需蛋白。在較佳實施例中,FKBP係融合至必需蛋白之N端。
一種以上FKBP或其衍生物可融合至必需蛋白。在一種以上FKBP或其衍生物融合至必需蛋白之實施例中,各個FKBP或其衍生物可相同或不同。在較佳實施例中,一種FKBP或其衍生物融合至必需蛋白。
在一些實施例中,進一步使用化學或物理不活化使上文所述rdCMV不活化。此等方法之實例包括熱處理,與甲醛、β-丙內酯(BPL)或二乙烯亞胺(BEI)一起培育,或γ輻照。較佳方法不破壞或不實質上破壞免疫原性,包括(但不限於)由五聚gH複合物誘導之免疫原性。由此,與無其他不活化處理之rdCMV相比,由已進一步不活化之CMV誘發之免疫反應保持或實質上保持。在較佳實施例中,進一步不活化之CMV誘導中和抗體之能力與彼等藉由無其他不活化處理治療之rdCMV誘導者相當。以經驗決確定藉由化學或物理方法中之任一者或組合之不活化方案以確保CMV(包括五聚gH複合物)在內之CMV之免疫原性。
熟習此項技術者可使用病毒複製分析來確定融合至FKBP或其衍生物之特定必需蛋白之實用性。由於在Shield-1存在下FKBP或其衍生物與必需蛋白之附著不應實
質上影響基因表現/經編碼產物功能,因此rdCMV應以在Shield-1存在下與親代CMV相當之比率(較佳係親代病毒量之至少75%、80%、90%、95%、99%或100%)複製。在不存在Shieid-1下,rdCMV之複製與親代CMV實質上不同(與不含有去穩定融合蛋白之CMV相比減少較佳大於50%、75%、90%、95%、99%或100%)。
在較佳實施例中,在存在至少2 μM Shield-1下,rdCMV複製非rdCMV複製量之較佳至少90%、更佳至少95%、最佳至少99%。
在一個實施例中,在存在至少2 μM Shield-1下,包含本發明rdCMV之組合物之病毒效價係至少105 pfu/ml、更佳至少107 pfu/ml。
反之,在Shield-1不存在下,rdCMV實質上不應複製。複製缺陷型機制之品質係藉由在不允許病毒複製之條件下控制之嚴格程度(即,子代病毒粒子在該等條件下之感染效價)來判斷。在Shield-1不存在下,本發明rdCMV實質上不能複製(在細胞培養物中或在患者內)。其在ARPE-19細胞及其他類型人類原代細胞中之複製係有條件的,且需要Shield-1在培養基中之莫耳濃度大於0.1 μM、較佳至少2 μM以維持病毒複製。
在一個實施例中,在Shield-1不存在下,包含本發明rdCMV之組合物之病毒效價小於2 pfu/ml、更佳小於1 pfu/ml。
可使用評價CMV複製之方法來評價在Shield-1不存在或
存在下之rdCMV複製。然而,在較佳實施例中,使用TCID50。
在另一實施例中,rdCMV效價係藉由50%組織培養感染劑量(TCID50)分析測定。簡言之,此稀釋分析量化殺傷50%受感染宿主所需病毒之量。平鋪宿主細胞(例如,ARPE-19細胞)且添加病毒之連續稀釋物。在培育後,觀察並記錄各病毒稀釋度之細胞死亡(即受感染細胞)之百分比。使用結果來以數學方式計算TCID50。
在另一實施例中,rdCMV效價係使用噬菌斑分析測定。病毒噬菌斑分析測定病毒試樣中噬菌斑形成單位(pfu)之數目。簡言之,宿主細胞(例如,ARPE-19細胞)之鋪滿單層經不同稀釋度之rdCMV感染且經半固體培養基(例如瓊脂或羧甲基纖維素)覆蓋,以防止病毒感染任意地傳播。病毒噬菌斑係在病毒感染固定細胞單層內之細胞時形成。病毒感染細胞將溶解並將感染傳播至毗鄰細胞,其中重複感染-溶解循環。受感染細胞區域將產生噬菌斑(由未受感染細胞包圍之感染區域),其可目視或利用光學顯微鏡觀察。對噬菌斑計數且使用與用於準備板之稀釋因子組合之結果來計算噬菌斑形成單位/試樣單位體積(pfu/mL)之數目。pfu/mL結果代表試樣內感染顆粒之數目且係基於所形成各噬菌斑皆代表一個感染病毒顆粒之假定。
在另一實施例中,使用hu-SCID小鼠模型來評估rdCMV在活體內複製之能力。簡言之,以外科手術方式將數片人類胎兒組織(例如胸腺及肝)植入SCID小鼠之腎囊膜中。在
2至3個月後,當人類組織血管化時,接種rdCMV。在接種後3至4週在噬菌斑分析中評價病毒效價。可在Shield-1不存在或存在下執行動物實驗。
將本發明rdCMV投與患者誘發對CMV之免疫反應、較佳保護性免疫反應,該反應可治療患者之CMV感染或與此一感染相關之病狀及/或降低其可能性。免疫反應至少部分地係針對五聚gH複合物。
可使用業內已知方法來評價藉由rdCMV誘發之免疫反應。
可使用業內已知動物模型來評價投與rdCMV之保護效應。在一個實施例中,可分析投與rdCMV之個體之免疫血清之中和能力,包括但不限於對病毒附著或進入宿主細胞之阻斷。在其他實施例中,可分析投與rdCMV之個體之T細胞在存在所關注抗原下之細胞介素產生能力,包括(但不限於)干擾素γ。亦可使用動物刺激模型來測定免疫原之免疫有效量。
病毒中和係指病毒特異性抗體能中斷培養物中之病毒進入及/或複製。量測中和活性之常見分析係病毒噬菌斑減少分析。本發明中之中和分析係指可阻斷病毒進入細胞之血清滴定。NT50效價定義為在病毒中和分析中阻斷50%輸入病毒之血清稀釋度的倒數。自非線性邏輯四參數曲線擬合獲得NT50效價。
本發明涵蓋製備rdCMV之方法。在存在諸如Shield-1等穩定劑下在上皮細胞上、較佳人類上皮細胞且更佳人類視網膜色素上皮細胞上繁殖本發明rdCMV。在其他實施例中,人類視網膜色素上皮細胞係以登錄號CRL-2302寄存於美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)之ARPE-19細胞。在一些實施例中,Shield-1係以至少0.5 μM之濃度存在於組織培養基中。在較佳實施例中,Shield-1係以至少2.0 μM之濃度存在於組織培養基中。
在一些實施例中,用於繁殖rdCMV之細胞係在微載體上生長。微載體係允許附著細胞在旋轉燒瓶或生物反應器(例如旋轉壁微重力生物反應器及流化床生物反應器)中生長之支持基質。微載體通常係125-250 μM球體,其密度允許其在輕緩攪拌的同時維持在懸浮液中。微載體可自諸多不同材料製得,包括(但不限於)DEAE-葡聚糖、玻璃、聚苯乙烯塑膠、丙烯醯胺及膠原。微載體可具有不同表面成份,包括(但不限於)細胞外基質蛋白、重組蛋白、肽及帶電分子。亦可使用其他高密度細胞培養系統,例如Corning HyperFlask®及HyperStack®系統。
可採集無細胞組織培養基且可自其純化rdCMV。CMV病毒顆粒之直徑係約200 nm且可使用業內已知技術將其與自存於經收穫培養基中之其他蛋白分離,該等技術包括(但不限於)經由密度梯度或20%山梨醇墊(Sorbitol cushion)之超速離心。疫苗之蛋白質量可藉由Bradford分析測定。
可使用Shield-1結合FKBP來控制rdCMV之複製。在完成
組織培養細胞中期望量之病毒繁殖後,複製能力不再合意。自rdCMV抽出Shield-1以使病毒複製為缺陷型(例如,以投與患者)。在一個實施例中,藉由洗滌一或多次自Shield-1純化rdCMV。在另一實施例中,經由超速離心自Shield-1純化rdCMV。在另一實施例中,經由透析過濾自Shield-1純化rdCMV。透析過濾通常用於純化病毒顆粒。在一個實施例中,使用孔徑為約750千道爾頓(kilodalton)之過濾器,該孔徑將僅允許Shield-1經過孔。
在自Shield-1純化rdCMV後,可存在少量殘留於rdCMV組合物中之殘餘Shield-1。在一個實施例中,在純化後,CMV組合物中之Shld-1之量係維持在組織培養物中之複製所需量之至多1/100。在另一實施例中,在純化後,rdCMV組合物中之Shield-1之量係0.1 μM或更小。在另一實施例中,在純化後,rdCMV組合物中之Shield-1之量不可檢測。
組合物中之Shield-1量之測定可使用LC/MS(液相層析-質譜)或HPLC/MS(高效液相層析-質譜)分析來檢測。該等技術組合LC或HPLC之物理分離能力與質量分析能力且可檢測複合物混合物中所關注化學品。
佐劑係可輔助免疫原產生免疫反應之物質。佐劑可藉由諸如以下中之一或多者等不同機制起作用:延長抗原生物學或免疫學半衰期;改良至抗原呈遞細胞之抗原遞送;改良藉由抗原呈遞細胞之抗原處理及呈遞;達成劑量節約及
誘導產生免疫調節細胞介素(Vogel,2000,Clin Infect Dis 30:S266)。在一些實施例中,本發明組合物包含rdCMV及佐劑。
多種不同類型之佐劑可用於輔助產生免疫反應。特定佐劑之實例包括氫氧化鋁;磷酸鋁、羥基磷酸鋁、非晶形鋁的羥基磷酸硫酸鹽佐劑(AAHSA)或其他鋁鹽;磷酸鈣;DNA CpG基序;單磷醯脂質A;霍亂毒素;大腸桿菌(E.coli)熱不穩定毒素;百日咳毒素;胞壁醯二肽;弗氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant);MF59;SAF;免疫刺激複合物;脂質體;生物可降解微球體;皂苷;非離子阻斷共聚物;胞壁醯肽類似物;聚膦腈;合成聚核苷酸;IFN-γ;IL-2;IL-12;及ISCOMS。(Vogel,2000,Clin Infect Dis 30:S266;Klein等人,2000,J Pharm Sci 89:311;Rimmelzwaan等人,2001,Vaccine 19:1180;Kersten,2003,Vaccine 21:915;O'Hagen,2001,Curr.Drug Target Infect.Disord.1:273)。
在一些實施例中,在本發明組合物中使用基於油之佐劑,包括(但不限於)不完全弗氏佐劑及MF59。
在其他實施例中,在本發明組合物中使用微粒佐劑,包括(但不限於)ISCOMATRIX®佐劑及/或磷酸鋁佐劑。
本發明之另一特徵係本文所述重組CMV在組合物、較佳免疫原性組合物或疫苗中之用途,該組合物或疫苗用於治療具有CMV感染之患者及/或降低CMV感染之可能性。適
宜地,該組合物包含醫藥上可接受之載劑。
「醫藥上可接受之載劑」意指可安全地用於全身投與之液體填充劑、稀釋劑或囊封物質。端視特定投與途徑而定,可使用多種業內熟知之醫藥上可接受之載劑。該等載劑可係選自包括以下之群:糖、澱粉、纖維素及其衍生物、麥芽、明膠、滑石粉、硫酸鈣、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸鹽緩衝溶液(包括磷酸鹽緩衝鹽水)、乳化劑、等滲鹽水及無致熱原水。特定而言,醫藥上可接受之載劑可含有不同組份,例如緩衝液、注射用無菌水、生理鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水、蔗糖、組胺酸、鹽及聚山梨醇酯。諸如「生理上可接受之」「稀釋劑」或「賦形劑」等術語可互換使用。
疫苗調配用程序揭示於(例如)New Generation Vaccines (1997,Levine等人,Marcel Dekker公司,New York,Basel,Hong Kong)中,其以引用方式併入本文中。
在一些實施例中,將本發明rdCMV投與患者以誘發免疫反應。期望在免疫原性組合物儲存期間使rdCMV組合物效能之損失最小化或避免該損失。支持此一目的之條件包括(但不限於):(1)持續儲存穩定性,(2)耐受脅迫冷凍-解凍循環,(3)在環境溫度下穩定長達一週,(4)維持免疫原性,(5)與佐劑策略相容。影響rdCMV穩定性之條件包括(但不限於)緩衝液pH、緩衝液離子強度、特定賦形劑之存在/不存在及溫度。組合物包含緩衝液以增加適宜作為疫
苗組合物之經純化rdCMV病毒顆粒之穩定性。
可在小鼠及/或病毒進入分析中藉由免疫原性分析來評估病毒顆粒完整性之保持。病毒進入事件取決於包括五聚gH複合物在內之病毒糖蛋白之完整性及功能。五聚gH複合物亦提供rdCMV之實質性免疫原性,由此將兩種性質關聯。
在一些實施例中,將rdCMV儲存在包含15-35 mM組胺酸及100-200 mM NaCl之緩衝液(pH介於5與7之間)中。在更具體實施例中,緩衝液包含25 mM組胺酸及150 mM NaCl(pH 6)。
在其他實施例中,可添加糖以提供進一步穩定性,例如多元醇(包括(但不限於)甘露醇及山梨醇);單醇(包括(但不限於)葡萄糖、甘露糖、半乳糖及果糖);二醇(包括(但不限於)乳糖、麥芽糖、蔗糖、乳果糖及海藻糖)及三糖(包括(但不限於)棉子糖及松三糖)。在更具體實施例中,糖係蔗糖。在甚至更具體實施例中,蔗糖介於5%與15%之間。
在較佳實施例中,將rdCMV儲存在包含25 mM組胺酸、150 mM NaCl、9%蔗糖(pH 6)之緩衝液中。
可使用本文所提供指導連同業內熟知技術將本文所述rdCMV調配並投與患者。醫藥投與用導則通常提供於(例如)以下文獻中:Vaccines,編輯Plotkin及Orenstein,W.B.Sanders公司,1999;Remington's Pharmaceutical Sciences第20版,編輯Gennaro,Mack Publishing,2000;及
Modem Pharmaceutics第2版,編輯Banker及Rhodes,Marcel Dekker公司,1990。
疫苗可藉由諸如以下等不同途徑投與:皮下、肌內、靜脈內、黏膜、非經腸、經皮或真皮內。皮下及肌內投與可使用(例如)針頭或噴射注射器執行。在一實施例中,本發明疫苗係經肌內投與。經皮或真皮內遞送可經由真皮內注射器針頭注射或使能器件(例如微米針頭或微米陣列貼片)達成。
本文所述組合物可以與劑量調配物相容之方式且以可在免疫原性上有效治療CMV感染(包括原發性、復發性及/或再)及/或降低其可能性之量投與。在本發明上下文中,投與患者之劑量應足以隨時間在患者中實現有益反應,例如降低CMV感染程度、改善與CMV感染相關之疾病症狀及/或縮短CMV感染之時長及/或嚴重程度或降低CMV感染(包括原發性、復發性及/或再)之可能性。
適宜給藥方案可由彼等熟習此項技術者容易地測定且較佳考慮業內熟知因素測定,該等因素包括患者之年齡、重量、性別及醫學病況;投與途徑;期望效應;及所用特定組合物。在測定欲在針對CMV之治療或預防中投與之rdCMV之有效量時,醫師可評估病毒之循環血漿濃度、疾病進展及/或抗CMV抗體之產生。疫苗組合物之劑量係由103至1012噬菌斑形成單位(pfu)之範圍組成。在不同實施例中,劑量範圍係104至1010 pfu、105至109 pfu、106至108 pfu或該等所述範圍內之任一劑量。當欲投與一種以上疫苗
(即,呈組合疫苗)時,各疫苗劑之量係在其所述範圍內。
疫苗組合物可以單一劑量或多劑量模式投與。疫苗可在投與、鑑別穩定緩衝液及適宜佐劑組合物前數小時或數天利用佐劑製備。疫苗可以通常實踐之體積(在0.1 mL至0.5 mL範圍內)投與。
劑量定時取決於業內熟知因素。在初始投與後,可投與一或多次額外劑量以維持及/或強化抗體效價及T細胞免疫力。可能需要額外強化以維持免疫反應之保護程度,該等程度係以抗體效價及T細胞免疫力(例如ELISPOT)反映。此等免疫反應之程度係臨床研究標的。
對於組合疫苗接種而言,各免疫原可一起以一種組合物或單獨地以不同組合物投與。本文所述rdCMV係與一或多種期望免疫原同時投與。術語「同時」並不限於恰好在相同時間投與治療劑,而是,其意指,本文所述rdCMV及其他期望免疫原係以一定序列且在一定時間間隔內投與個體,以使得其可一起作用,從而提供與在其以其他方式投與時相比有所增加之益處。例如,各治療劑可在相同時間或以任一順序在不同時間點依序投與;然而,若不在相同時間投與,則其應在時間上充分靠近投與以提供期望治療效應。各治療劑可單獨地、以任一合適形式及藉由任何適宜途徑投與。
「患者」係指能經CMV感染之哺乳動物。在較佳實施例中,患者係人類。患者可經預防性或治療性治療。預防性
治療提供足夠保護性免疫力以降低CMV感染之可能性或嚴重程度,該感染包括原發性感染、復發性感染(即,彼等源於潛伏CMV再活化者)及再感染(即,彼等源於與患者先前所經歷者不同株CMV之感染者)。可執行治療性治療以降低CMV感染之嚴重程度或降低復發性或再感染之可能性/嚴重程度。
可使用包含本文所述rdCMV之醫藥組合物執行治療。可將醫藥組合物投與一般群體,尤其彼等CMV感染(原發性、復發性或再)風險增加者或CMV感染將尤其成問題者(例如免疫受損個體、移植患者或孕婦)。在一個實施例中,給育齡女性、尤其早期***女性接種疫苗以降低在懷孕期間CMV感染(原發性、復發性或再)之可能性。
彼等需要治療者包括彼等已具有感染者,以及彼等傾向於感染者或期望降低感染可能性者。治療可改善與CMV感染相關之疾病症狀及/或縮短CMV感染之時長及/或嚴重程度,該感染包括因潛伏CMV再活化所致之感染。
CMV感染(原發性、復發性或再)風險增加者包括免疫減弱患者或面對導致免疫力減弱之療法(例如,經受用於癌症之化學療法或輻射療法或服用免疫抑制藥物)之患者。本文所用「免疫力減弱」係指因不適當地起作用或不以正常健康成人之程度起作用之免疫反應而不太能抵抗感染的免疫系統。免疫力減弱患者之實例係嬰兒、幼兒、老人、孕婦患者或患有影響免疫系統功能之疾病(例如HIV感染或AIDS)之患者。
下文提供實例以進一步闡釋本發明之不同特徵。該等實例亦闡釋實踐本發明之有用方法。該等實例並不限制所主張本發明。
構築感染性CMV細菌人工染色體純系,以使得編碼病毒粒子表現由組裝至gH/gL支架上之UL128、UL130及UL131組成之五聚gH複合物。
CMV株AD 169株最初係自7歲女孩之增殖腺分離(Elek及Stern,1974,Lancet,1:1)。將病毒在若干類型之人類纖維母細胞中傳代58次以衰減該病毒(Neff等人,1979,Proc Soc Exp Biol Med,160:32),其中最後5次傳代係在WI-38人類纖維母細胞中進行。使用AD 169病毒之此經傳代變體(在此研究中稱為Merck AD 169,MAD 169)作為親代病毒來構築感染性BAC純系。親代病毒AD 169與經傳代變體病毒MAD 169二者均不表現UL131或五聚gH複合物。
使用MAD 169作為親代病毒來構築感染性細菌人工染色體(BAC)純系。BAC載體係分子工具,其允許遺傳操作大腸桿菌中之大尺寸DNA片段,例如CMV基因組(約230 Kb)。在緊隨US28開放閱讀框之終止密碼子之後***BAC元件以及GFP標記物基因(在病毒基因組中之US28與US29 ORF之間),其中在片段兩端處建立LoxP位點(圖1A)。簡言之,合成兩側為兩個loxP位點之含有GFP表現盒之DNA片段及CMV US28-US29序列並將其選殖至pBeloBAC11載
體中。利用限制酶Pme I將BAC載體線性化,並將其與自經純化病毒粒子提取之MAD 169 DNA一起共轉染至MRC-5細胞中。藉由綠色螢光表現鑑別之重組變體係經噬菌斑純化的。在一輪擴增後,自受感染細胞提取環形形式之病毒基因組,且將其電穿孔至大腸桿菌DH10細胞中。藉由PCR篩選細菌菌落中US28及US29區之存在。藉由EcoR I、EcoR V、Hind III、Spe I及Bam HI限制分析進一步檢測候選純系。在篩選後,一種純系bMAD-GFP顯示與親代MAD 169病毒相同之限制模式。
在大腸桿菌中以遺傳方式修復導致MAD 169中之上皮向性缺陷的UL131之第一外顯子中之移碼突變(圖1B)。具體而言,缺失UL131基因中之7腺嘌呤核苷酸伸展中一個nt A(圖1B)。1 nt之缺失足以挽救因UL131及(由此)五聚gH複合物現在表現所致之上皮及內皮細胞向性。藉由ELISA及西方墨點(western blot)來確認表現(數據未顯示)。藉由LoxP/Cre重組去除BAC區段來進一步修飾此純系。在ARPE-19細胞、即人類視網膜色素上皮細胞(ATCC登錄號CRL-2302)中轉染BAC DNA以回收感染性病毒(圖1C)。所得感染性病毒稱為BAC源上皮向性MAD 169病毒(beMAD),其與MAD 169不同之處僅在於以下兩個基因座:(1)UL131 ORF,其中缺失單一腺嘌呤核苷酸;及(2)34 bp LoxP位點,其***US28與US29 ORF之間(參見表2)。
BAC純系beMAD之基因組經完全定序。beMAD之總體基
因組結構與以ATCC AD 169變體(GenBank登錄號X17403)報導者相同,該變體包括兩個獨特區,即長獨立區(UL)及短獨特區(US)。各獨特區包括兩個重複序列,即長端重複(TRL)-長內部重複(IRL)、短端重複(TRS)-短內部重複(IRS)。經傳代變體MAD 169及beMAD源病毒之生長動力學在人類纖維母細胞細胞系MRC-5細胞(ATCC登錄號CCL-171)中不可區別(數據未顯示)。由於在纖維母細胞細胞上生長無需gH複合物,因此MAD 169與beMAD之間之gH複合物表現差異不相關。
研究兩種習用病毒不活化方法(γ-輻照及β-丙內酯(BPL))對表現gH之CMV之效應。
對凍乾病毒粒子執行γ-輻照。使用保守凍乾循環(-50℃冷凍及在-35℃下初次乾燥約30 hr、之後在25℃下二次乾燥6 hr)將濃度為0.15 mg/mL之存於HNS(25 mM組胺酸、150 mM NaCl、9% w/v蔗糖,pH 6.0)中之重組CMV疫苗調配物凍乾,獲得乾燥粉末。將疫苗於3 mL玻璃小瓶中凍
乾,其中各小瓶中填充0.5 ml。在凍乾結束時,在氮環境中塞住小瓶並移出試樣,加標記,波紋化(crimped)且在-70℃下儲存直至γ輻照。將小瓶在Co輻照器下輻照期望輻照劑量。
對於BPL處理而言,將BPL母液添加至在ARPE-19細胞上生長之粗製病毒培養上清液中,以達到0.01%或0.1%(v/v)之最終濃度。在不同時間點利用硫代硫酸鈉終止反應。隨後藉由超速離心純化經BPL處理之表現gH之CMV。
藉由在ARPE-19細胞中進行噬菌斑分析來測定兩種方法之不活化動力學。簡言之,準備存於PBS中之病毒試樣連續稀釋物且使用0.1 mL來接種已播種ARPE-19細胞之6孔板之各孔。在37℃下將板培育1 hr,隨後每孔添加6 mL含有0.5%瓊脂糖之上覆培養基。在37℃下將板培育18天。為顯現噬菌斑,將約0.5 mL 5 mg/mL MTT溶液(噻唑藍溴化四唑鎓,Sigma M5655)添加至各孔中。在37℃將板培育2-4 hr並在lightbox下對噬菌斑計數(圖2A及2C)。
藉由測定在小鼠中誘導之中和抗體效價來分析表現gH之不活化CMV之免疫原性。簡言之,在第0週及第3週利用2.5 μg CMV/劑量對雌性Balb/c小鼠(n=10)實施免疫。在第4週採集血清並評估針對病毒上皮進入之中和活性。中和效價(NT50)定義為與陰性對照相比使病毒上皮進入減少50%之血清稀釋度之倒數。來自小鼠免疫原性研究之結果顯示,兩種習用不活化方法對由表現gH之CMV誘導之中和抗體效價具有負效應(圖2B及2D)。NT50效價之降低與
藉由γ-輻照或BPL處理之持續時間相關。延長處理使表現五聚gH複合物之CMV在小鼠中之免疫原性方面更像親代AD 169 CMV。當在兔及恆河猴中測試利用γ-輻照或BPL不活化之疫苗時,觀察到類似結果(數據未顯示)。該等觀察顯示,在所選不活化條件下,五聚gH複合物對兩種不活化方法皆敏感。
使用經衰減AD 169株骨架來構築CMV,該骨架重新獲得其上皮向性,同時為條件式複製缺陷型。使用實例1中所述方法來恢復上皮向性。
基於兩種標準來選擇欲融合至FKBP衍生物之病毒蛋白。首先,藉由蛋白組學分析在CMV病毒粒子中檢測不到所關注蛋白(Varnum等人,2004,J.Virol.78:10960),由此降低將FKBP融合蛋白納入病毒中之可能性。其次,所關注蛋白對於組織培養物中之病毒複製至關重要。
使用beMAD作為親代病毒,將FKBP衍生物(SEQ ID NO:12)個別地融合至12種必需病毒蛋白,包括IE1/2(SEQ ID NO:1)、pUL37x1、pUL44、pUL51(SEQ ID NO:3)、pUL52(SEQ ID NO:5)、pUL53、pUL56、pUL77、pUL79(SEQ ID NO:7)、pUL84(SEQ ID NO:9)、pUL87及pUL105。亦構築具有兩種融合至FKBP之不同必需蛋白之病毒,其將IE1/2及UL51中之每一者融合至FKBP衍生物(具有去穩定之IE1/2及UL51之rdCMV之基因組示於SEQ ID NO:14中)。在構築後,將所有重組BAC DNA轉染至
ARPE-19細胞中,且在含有Shld-1之培養基中培養。
檢測病毒生長對Shld-1之依賴性。在噬菌斑分析中以2 μM Shld-1容易挽救IE1/2、UL51、UL52、UL84、UL79及UL87融合病毒(數據未顯示)。UL37x 1、UL77及UL53病毒亦產生噬菌斑,但噬菌斑較小,且其與親代beMAD相比生長顯著較慢。將Shld-1濃度增加至10 μM不會顯著促進病毒生長(數據未顯示)。UL56及UL105融合物未恢復,從而表明對該等蛋白加標籤會破壞該等蛋白之功能或相鄰基因之表現。
在其他實驗中使用不同濃度之Shld-1來進一步評價在存在或不存在Shld-1下之病毒複製。藉由表現gH之CMV感染ARPE-19細胞,其中MOI為0.01 pfu/ml,該CMV亦含有融合至必需蛋白之FKBP衍生物。在感染1小時後,用新鮮培養基將細胞洗滌兩次以自接種物去除Shld-1。然後將接種物添加至在含有0.05 μM、0.1 μM、0.5 μM或2 μM Shield-1之培養基中培養之ARPE-19細胞中。感染後7天,採集上清液中之無細胞子代病毒且將其滴定於補充有2 mM Shield-1之ARPE-19細胞上。藉由50%組織培養感染劑量(TCID50)分析測定病毒效價。簡言之,此稀釋分析量化殺傷50%受感染宿主所需病毒之量。平鋪ARPE-19細胞並添加病毒之連續稀釋物。在培育後,人工觀察並記錄各病毒稀釋度之細胞死亡(即受感染細胞)之百分比。使用結果來以數學方式計算TCID50。
如圖3中所示,所有含有FKBP融合物之CMV之有效複製
取決於Shield-1濃度,但程度有所不同。較低濃度之Shield-1通常降低子代病毒產生之效價。在具有單一融合物之病毒中,僅UL51及UL52之複製絕對需要Shield-1。其他具有單一融合物之病毒(IE1/2、UL84、UL79及UL87)可在Shield-1不存在下產生可檢測子代病毒。當FKBP衍生物融合至UL51或UL52時,調控最嚴格。
在2 μM Shld-1存在或Shld-1不存在下比較具有IE1/2、UL51、IE1/2-UL51融合物之病毒之生長動力學與親代beMAD病毒。如圖4中所示,在Shld-1存在下,單一或雙融合物之生長動力學與親代beMAD相當。然而,在Shld-1不存在下,僅IE1/2可複製,但速率比親代beMAD低且慢。
亦以不同細胞類型測試對雙融合病毒中之病毒複製之控制嚴格性(圖5)。該等細胞包括人類臍帶靜脈細胞(HUVEC)、MRC-5纖維母細胞、主動脈平滑肌細胞(AoMC)、骨骼肌細胞(SKMC)及CCF-STTG1星形細胞瘤細胞。藉由IE1/2-UL51融合病毒感染細胞(以5 pfu/細胞之MOI感染之CCF-STTG1除外),其中MOI為0.01 pfu/細胞,且隨後在存在或不存在Shield-1之培養基中培育。所有細胞類型在Shield-1存在下皆能支持溶解性病毒複製。在Shield-1不存在下未檢測到病毒產生。
在小鼠、兔及恆河猴中評估IE1/2-UL51雙融合病毒之免疫原性。首先在小鼠中比較針對IE1/2-UL51雙融合病毒或
親代beMAD病毒之劑量依賴性中和反應(圖6A)。在第0週及第4週利用劑量在0.12 μg至10 μg範圍內之beMAD或IE1/2-UL51雙融合病毒對6週齡雌性BALB/c小鼠實施免疫。第6週採集血清試樣並藉由CMV微中和分析於ARPE-19細胞上分析,如先前所述(Tang等人,Vaccine,「A novel throughput neutralization assay for supporting clinical evaluations of human cytomegalovirus vaccines」,2011年8月30日以電子形式發表,doi:10.1016/j.vaccine.2011.08.086)。在0.12 μg、0.37 μg、1.1 μg、3.3 μg及10 μg之劑量下比較反應。在低劑量範圍(0.12 μg至1.1 μg)下,beMAD之免疫原性略高,且在劑量量高於0.37 μg時始終檢測到中和抗體。在高劑量範圍(3.3 μg及10 μg)下,由兩種病毒誘導之中和抗體效價相當。
接下來,比較劑量為10 μg之不同病毒在兔中之免疫原性。在第0週、第3週及第8週利用10 μg beMAD或所示融合病毒對雌性NZW兔實施免疫。採集第10週血清並藉由CMV微中和分析於ARPE-19細胞上分析(圖5B)。beMAD、單一融合病毒IE1/2或UL51及雙融合病毒IE1/2-UL51可顯著誘導高於MAD 169之中和抗體效價,該MAD 169係與AD 169類似且缺乏五聚gH複合物之病毒。此確認,藉由病毒表現gH複合物顯著增加重組CMV之免疫原性。
接下來,在恆河猴中測試100 μg雙融合IE1/2-UL51病毒或親代beMAD病毒之免疫原性。採集第12週血清並藉由CMV微中和分析於ARPE-19細胞上分析。第12週(第3次給
藥後)之GMT NT50效價分別係11500或15600。該等效價與自然感染個體中所觀察之NT50效價相當(圖5C)。
在恆河猴中顯示雙融合病毒IE1/2-UL51 CMV疫苗誘導之免疫反應之壽命。動物接種疫苗10 μg/劑量或100 μg/劑量雙融合病毒IE1/2-UL51(基於總蛋白質量)。亦包括10 μg/劑量疫苗與非晶形鋁的羥基磷酸硫酸鹽(AAHS)或ISCOMATRIX®佐劑之調配物。於第0週、第8週及第24週在恆河猴(n=5)中投與疫苗。為比較,對照組於第0週、第4週及第24週接受30 μg/劑量之與MF59佐劑調配之重組gB。於縱軸上呈現所有組之NT50效價倒數的幾何平均值(GMT)(圖7)。在接種疫苗前,無任一猴中可檢測中和抗體效價>40。在第一次給藥後在第4週對於所有組檢測最低中和活性,中和抗體效價在約第12週及第28週(分別在第二次及第三次疫苗接種後4週)達到峰值。100 μg/劑量組在第28週之峰值GMT係14,500(約3倍高於10 μg/劑量組之4,660效價)。與10 μg/劑量組相比,ISCOMATRIX®佐劑而非AAHS提供佐劑益處。測得ISCOMATRIX®組在第28週之GMT為15,800,而AAHS組係3,000且10 μg/劑量組係4,660。檢測對照(gB/MF59)組之最低中和活性,其中峰值GMT決不超過200。在研究第72週,即在完成第0週、第8週及第24週之疫苗接種方案後接近1年,100 μg/劑量組及ISCOMATRIX®調配組之GMT分別維持在1400及3000。此時,10 μg/劑量組及AAHS組之GMT係約200。
於疫苗接種方案之第28週(第3次給藥後4週)採集來自恆
河猴之周邊血單核細胞(PBMC)且在IFN-γ ELISPOT分析中評估。猴接種疫苗100 μg/劑量(圖8A)或10 μg/劑量(圖8B-8D)之雙融合病毒IE1/2-UL51。另外,不利用佐劑(圖8B)或利用AAHS(圖8C)或ISCOMATRIX®(圖8D)佐劑調配10 μg/劑量。使用代表五種HCMV抗原之經彙集上覆肽抗原來刺激IFN-γ之離體產生。所用HCMV抗原係IE1及IE2(兩種病毒調控蛋白)以及pp65、gB及pp 150(主要病毒結構抗原)。藉由ELISPOT反應之量級(幾何平均值)以及對病毒抗原之反應者比率來評價T細胞反應品質。在接種疫苗之前,任一猴中皆無抗原特異性ELISPOT效價(數據未顯示)。
在第28週,對五種HCMV抗原(即,IE1、IE2、pp65、gB及pp150)之ELISPOT反應之幾何平均值分別係186個、132個、253個、87個、257個斑點形成細胞(SFC)/106個PBMC(對於100 μg/劑量組而言)對21個、24個、107個、111個、33個SFC/106個PBMC(對於10 μg/劑量組而言)(圖8A及8B)。基於55個以上SFC/106個PBMC及抗原特異性反應相對於二甲基亞碸(DMSO)反應上升3倍以上之截止標準對各組(n=5)中之反應者進行評分。對五種HCMV抗原(即,IE1、IE2、pp65、gB及pp 150)之反應者數目係4個、4個、5個、1個、3個(對於100 μg/劑量組而言)對1個、1個、5個、4個、0個(對於10 μg/劑量組而言)。
ISCOMATRIX®佐劑對針對10 μg/劑量雙融合病毒IE1/2-UL51之T細胞反應之效應顯示於圖8D中。對五種HCMV抗
原(即,IE1、IE2、pp65、gB及pp 150)之ELISPOT反應之幾何平均值分別係114個、53個、491個、85個、113個SFC/106個PBMC,且組(n=5)中之反應者數目分別係3個、2個、5個、3個、3個。具有ISCOMATRIX®佐劑之組中T細胞反應之量級及幅度與彼等100 μg/劑量組中者類似。
在用HCMV抗原(pp65、IE1、IE2或完整HCMV病毒粒子)刺激後,在細胞內細胞介素染色中進一步分析用10 μg/劑量或100 μg/劑量具有ISCOMATRIX®之雙融合病毒IE1/2-UL51(基於總蛋白質量)接種之動物的PBMC。陰性對照係一種未接種疫苗雙融合病毒IE1/2-UL51之未經處理之猴,而陽性對照係葡萄球菌腸毒素B(SEB)。圖9顯示,陰性對照顯示對所有抗原刺激之最低反應,但對陽性對照劑葡萄球菌腸毒素B(SEB)有反應,如所預計。來自兩組之所有10只接種疫苗之猴皆以類似量級及模式對HCMV特異性抗原有反應。計算所有10隻猴對各抗原之幾何平均值。當用CMV抗原肽彙集物(即,pp65、IE1及IE2)刺激所有猴之PBMC時,其皆顯示相當CD8+(圖9A)及CD4+(圖9B)T細胞反應;但當用完整HCMV病毒粒子刺激時,其優先顯示CD4+ T細胞反應。此並不意外,此乃因完整病毒粒子係蛋白抗原且可能作為外源抗原處理且較佳藉由MHC II類分子呈遞至CD4+ T細胞。雙融合病毒IE1/2-UL51可誘發CD4+及CD8+表型二者之T細胞反應,此與彼等通常在具有HCMV感染之健康個體中所觀察者類似。
比較雙融合病毒IE1/2-UL51與鋁鹽之不同調配物在恆河
猴中產生中和抗體之能力(圖10)。用HNS(鹼性緩衝液)、非晶形鋁的羥基磷酸硫酸鹽(AAHS)或Merck磷酸鋁佐劑(MAPA)調配30 μg/劑量雙融合病毒IE1/2-UL51且於第0週及第8週投與。於第12週採集之血清試樣顯示,儘管MAPA增強中和抗體誘導,但增強在統計學上不顯著(雙尾非成對t測試)。
用合適緩衝液將存於HBSS(漢克氏平衡鹽溶液(Hank's Balanced Salt Solution))中且在-70℃下儲存直至使用之CMV病毒稀釋約10×。存於各試樣中之HBSS緩衝液之殘餘組份包括0.533 mM氯化鉀、0.044 mM磷酸二氫鉀、0.034 mM磷酸氫二鈉、13.79 mM氯化鈉、0.417 mM碳酸氫鈉及0.1% w/v葡萄糖。然後將試樣在室溫或2℃與8℃之間之溫度下儲存4天或冷凍解凍。對於冷凍-解凍而言,將試樣在-70℃下儲存至少1小時且在RT下解凍30分鐘,持續一或三次循環。在第4天使用病毒進入分析測試試樣之穩定性。簡言之,使用若干不同試樣稀釋執行分析以獲得反應曲線,且藉由非線性曲線擬合自病毒進入分析結果獲得EC50(μg/mL)值。較低EC50值代表較佳穩定性。比較穩定性試樣與-70℃冷凍對照試樣之EC50值。
病毒進入分析量測CMV感染ARPE-19細胞及表現IE1(即早期蛋白1)之能力。在透明96孔板中執行分析。使用IE1特異性一級抗體及生物素化二級抗體來檢測固定細胞中之靶蛋白,且使用IR Dye 800CW抗生蛋白鏈菌素(Streptavidin)
以及Sapphire 700/DRAQ5(對於細胞輸入正規化)來量化各孔之螢光信號。將結果繪製為800/700積分強度比(Integrated Intensity Ratio,Integ.Ratio)對CMV濃度(總蛋白,μg/mL)。亦使用非線性曲線擬合自感染力分析結果獲得EC50值。由於ARPE-19細胞之病毒感染依賴病毒糖蛋白抗原、特定而言五聚gH複合物之完整性,因此EC50值反映病毒顆粒在該等條件下之保持程度。
如圖11中所示,CMV當在RT下在HBSS中儲存4天時,損失感染力。此外,當藉由病毒進入分析評價時,在HBSS中進行3次冷凍-解凍循環導致感染力完全損失。因此,HBSS並非CMV儲存用最佳緩衝液。
使用3至8之pH範圍檢測pH對CMV室溫穩定性之效應。利用以下緩衝液:檸檬酸鹽緩衝液(25 mM)(pH 3.0);乙酸鹽緩衝液(25 mM)(pH 4);乙酸鹽緩衝液(25 mM)(pH 5);組胺酸緩衝液(25 mM)(pH 6);HEPES緩衝液(25 mM)(pH 7);漢克氏平衡鹽溶液(HBSS)(pH 7.5)及Tris緩衝液(25 mM)(pH 8)。
藉由用合適緩衝液將病毒本體稀釋10次來準備試樣。將試樣在RT(25℃)下儲存4天。在第4天,藉由利用病毒進入分析來量測試樣之穩定性。將於-70℃下冷凍儲存之存於HBSS中之CMV作為對照處理。在0時及第4天獲得各試樣之UV-Vis譜以檢測在儲存期間發生之結構變化及聚集。
如圖12中所示,與其他測試pH相比,25 mM組胺酸緩衝液(pH 6)藉由保留在RT下之較高感染力提供CMV之較佳穩
定性。UV譜之二階導數指示病毒在所有pH下之類似結構特徵(數據未顯示)。在任一測試pH下皆未觀察到顯著聚集,如藉由在350 nm下之光密度所量測(數據未顯示)。
在25 mM組胺酸緩衝液(pH 6)中測試尿素單獨或與氯化鈉組合對CMV病毒穩定性之效應。單獨添加2%尿素對CMV穩定性不具有效應。然而,2%尿素與150 mM NaCl組合改良CMV在RT下之穩定性(圖13)。
在pH 6下檢測離子強度對CMV穩定性之效應。將增加濃度之NaCl(0 mM、75 mM、150 mM及320 mM NaCl)添加至25 mM組胺酸緩衝液(pH 6)中。CMV穩定性取決於離子強度,其中較佳離子強度產生較佳穩定性(圖14)。尿素之存在對CMV穩定性不具有或具有最低效應(數據未顯示)。
另外,篩選若干其他賦形劑(蔗糖、山梨醇、甘油及脯胺酸)對在室溫下表現gH之CMV穩定性之效應。在室溫下將所欲測試賦形劑添加至存於25 mm組胺酸緩衝液(pH 6)中之CMV中,且保持4天,之後使用病毒進入分析量測CMV病毒穩定性。計算試樣之EC50值。在所有所測試賦形劑中,150 mM NaCl單獨或與9% w/v蔗糖組合在pH 6下提供較佳穩定性(數據未顯示)。因此,所推薦CMV在RT下儲存用緩衝液係具有150 mM NaCl且具有或不具有9% w/v蔗糖之25 mM組胺酸(pH 6)。
研究在冷凍-解凍期間低溫保護劑對CMV穩定性之效應。如前文所述(圖11),當經受3次冷凍-解凍循環時,存於HBSS中之CMV完全損失其感染力。篩選若干低溫保護
劑(包括蔗糖、山梨醇、甘油)降低對CMV之冷凍-解凍脅迫之能力。對於各冷凍-解凍循環而言,將試樣在-70℃下冷凍至少1小時且在RT下解凍30分鐘。添加低溫保護劑可增加病毒之穩定性。此外,當與其他所測試低溫保護劑比較時,9% w/v蔗糖與150 mM氯化鈉組合可顯著增強病毒之穩定性(圖15)。因此,所推薦CMV在-70℃下儲存或至多3次冷凍-解凍循環用緩衝液組合物係25 mM組胺酸、150 mM NaCl及9%蔗糖(HNS緩衝液)。
針對在3次冷凍-解凍循環、冷藏(2-8℃)及RT(25℃)期間對CMV穩定性之保護,比較HNS緩衝液與HBSS緩衝液。HNS緩衝液提供CMV活病毒在所有測試儲存條件下之較佳穩定性(數據未顯示)。
在HNS緩衝液中供應雙融合IE1/2-UL51 CMV病毒母液且將其儲存在-70℃下直至使用。在100 μg/mL之濃度(基於藉由Bradford分析量測之總蛋白含量)下執行穩定性研究。用HNS緩衝液稀釋本體病毒以獲得最終病毒濃度。然後將試樣儲存在合適溫度下且如針對所述進行測試至多3個月。對於冷凍-解凍而言,將試樣在-70℃下冷凍至少1小時且在室溫下解凍30分鐘。在不同時間點取出(pulled)試樣且將其保持在-70℃下冷凍儲存直至分析。
使用Bradford分析來量測試樣之總蛋白含量。試樣之總蛋白含量在3個月時段內無變化(數據未顯示)。
藉由使用DLS方法量測試樣之流體動力學直徑來監測試
樣中之CMV隨時間之粒徑。此方法監測病毒顆粒隨時間及在不同儲存溫度下之任何聚集或破壞。未觀察到真正趨勢,其中某些試樣之粒徑有偶發變化(數據未顯示)。結果指示,病毒顆粒完整且在升高溫度下不聚集。
藉由使CMV試樣經受不同儲存溫度來觀察病毒進入效價(EC50值)之顯著變化(數據未顯示)。與2-8℃及25℃相比,在-20℃下儲存導致較低病毒進入效價。發現2-8℃試樣之效價之病毒進入效價低於25℃儲存。基於EC50值,按以下順序對儲存溫度分級(自最穩定至最不穩定):25℃>2-8℃>-20℃,至多1個月時間點。對於在-20℃、2-8℃及25℃下儲存之試樣而言,在3個月時間點處不可檢測病毒進入效價。
在穩定性研究結束時起始小鼠免疫原性研究以測定儲存溫度對CMV誘導CMV中和抗體之能力之效應。在第0天用2.5 μg/劑量疫苗經肌內對小鼠實施免疫且在第21天實施強化,之後在第28天抽血。使用ARPE 19細胞測試小鼠血清中針對表現gH之CMV之中和抗體且藉由非線性曲線擬合獲得NT50效價。
評估在不同溫度下儲存3個月對IE1/2-UL51雙融合CMV免疫原性之效應。NT50效價取決於儲存溫度,其中與-70℃冷凍對照相比,更高溫度降低效價,但不顯著(p=0.2584,單因子ANOVA)(圖16A)。在-20℃下儲存之調配物之NT50效價較低,小於1/2,但與-70℃冷凍對照相比,該等試樣之病毒進入分析效價受到顯著影響。-20℃、2-8℃及25℃
穩定性試樣之NT50效價之趨勢遵循針對該等試樣獲得之CMV質量ELISA效價。
評估在解凍後在不同溫度下儲存8小時對IE1/2-UL51雙融合CMV免疫原性之效應。比較該等調配物與-70℃冷凍對照之NT50效價。將試樣在任一測試溫度下儲存8小時不影響NT50效價(p=0.5865,單因子ANOVA)(圖16B)。
在小鼠免疫原性研究中評估在將試樣解凍後雙融合IE1/2-UL51 CMV在25℃下儲存不同時間點之效應。比較該等調配物與-70℃冷凍對照之NT50效價。將試樣在25℃下存儲長達一週不影響NT50效價(p=0.1848,未成對雙尾t測試)。3個月時,NT 50效價下降到略低於1/2,從而指示調配物在25℃下保持較長時間時可能有穩定性問題(數據未顯示)。
藉由小鼠免疫原性來評估3次冷凍-解凍循環對在HNS緩衝液中調配之雙融合IE1/2-UL51 CMV的效應。與-70℃冷凍對照相比,雙融合CMV調配物之3次冷凍-解凍(F/T)循環不會影響免疫原性(p=0.2103,未成對雙尾t測試)(數據未顯示)。
其他實施例在下文申請專利範圍內。儘管已顯示並闡述若干實施例,但可作出各種修改,此並不背離本發明之精神及範圍。
圖1A-1B顯示恢復五聚gH複合物表現之CMV株之構築示意圖。(A)產生可自切除細菌人工染色體(BAC)以操作AD
169病毒基因組之策略。(B)修復UL131中之移碼突變以恢復其表現。(C)用cre重組酶基因替代GFP以建立可自切除CMV BAC。
圖2A-2D顯示習用不活化方法對gH複合物免疫原性之效應。使用γ-輻照(A、B)及β-丙內酯E(BPL)(C、D)來使表現gH複合物之CMV不活化。不活化動力學係藉由噬菌斑分析測定(A、C),而免疫原性係藉由評估來自投與CMV之小鼠之血清針對病毒上皮細胞進入之中和活性來測定(B、D)。
圖3顯示具有各種融合至FKBP衍生物之必需蛋白之表現gH複合物之CMV的Shield 1濃度依賴性子代病毒產生。ARPE-19細胞以0.01 PFU/細胞之複數(multiplicity)經rdCMV病毒感染1 h,用新鮮培養基洗滌兩次,且在含有0 μM、0.05 μM、0.1 μM、0.5 μM或2 μM Shield-1之生長培養基中培育。感染後7天,採集無細胞病毒,且藉由在2 μM Shield 1存在下對ARPE-19細胞實施TCID50分析來測定病毒效價。
圖4A-4D顯示rdCMV在ARPE-19細胞中之生長動力學。細胞以0.01 PFU/細胞之複數經含有(A)IE1/2、(B)UL51、(C)IE1/2-UL51融合蛋白之病毒或(D)親代beMAD病毒感染。在1小時後,用新鮮培養基將細胞洗滌兩次,且在Shield-1不存在(空心圓)或2 μM Shield-1存在(實心圓)下培育。在感染後於所示時間點採集無細胞病毒,且藉由對含有2 μM Shield-1之培養基中之ARPE-19細胞實施TCID50分
析來量化感染力病毒。
圖5A-5E係IE1/2-UL51 rdCMV在不同細胞類型中之生長動力學。(A)MRC-5、(B)HUVEC、(C)AoSMC、(D)SKMC、(E)CCF-STTG1細胞經rdCMV病毒感染且培育1小時。用新鮮培養基將細胞洗滌兩次,且隨後在Shield-1不存在(空心圓)或2 μM Shield-1存在(實心圓)下培育。在感染後於所示時間點採集無細胞病毒,且藉由對含有2 μM Shield-1之培養基中之ARPE-19細胞實施TCID50分析來量化感染力病毒。
圖6A-6C係IE1/2-UL51 rdCMV在小鼠、兔及恆河猴中之免疫原性分析。(A)在第0週及第4週用beMAD(空心圓)或IE1/2-UL51 rdCMV(實心圓)對小鼠實施免疫。(B)在第0週、第3週及第8週用10 μg beMAD或所示rdCMV對兔實施免疫。(C)在第0週及第8週用100 μg beMAD或IE1/2-UL51rdCMV對恆河猴實施免疫。在各情形下,採集血清試樣且藉由對ARPE-19細胞實施CMV微中和分析來分析。線條指示在各組中之幾何平均中和效價(NT50)。
圖7顯示接種疫苗雙融合病毒IE1/2-UL51之恆河猴之縱軸中和效價。在第0週、第8週及第24週接種所示疫苗劑量或調配物之恆河猴組(n=5)(顯示為紅色三角形),而一個組在第0週、第4週及第24週接受gb/mf59(30 mg/劑量)。在所示時間點採集免疫血清並在病毒中和分析中進行評估。以該組之標準誤差在縱軸上繪製NT50效價之GMT。AAHS:非晶形鋁的羥基磷酸硫酸鹽;IMX:
ISCOMATRIX;HNS:鹼性緩衝液。
圖8A-8D顯示接種疫苗100 μg(A)或10 μg(B-D)/劑量雙融合病毒IE1/2-UL51之恆河猴中之IFN-γ ELISPOT。不使用佐劑(A-B),或使用AAHS(C)或ISCOMATRIX(D)。用代表HCMV抗原之肽彙集物刺激PBMC。灰條代表該組(n=5)之各抗原之GMT。各抗原之反應者比率於各圖內顯示於各抗原之頂部。
圖9A-9B顯示在恆河猴中接種疫苗雙融合病毒IE1/2-UL51能誘導CD8+(A)及CD4+(B)表型二者之T細胞反應。自給予100 μg或10 μg劑量具有作為佐劑之ISCOMATRIX®之疫苗之猴採集PBMC。用代表HCMV抗原之肽彙集物刺激PBMC,之後針對IFN-γ及CD4+/CD8+表面T細胞標記物進行染色。數據呈現為每百萬PBMC中CD4+/CD8+陽性、IFN-γ陽性細胞之數目。線條代表接受相同疫苗之組(n=5)之幾何平均值(GMT)。各圖底部之數字代表兩個接種疫苗組(n=10)之GMT。CMV:經純化病毒;SEB:用作陽性對照劑之細胞***促進劑;IMX:ISCOMATRIX。
圖10顯示,Merck磷酸鋁佐劑(MAPA)可提高在猴中之中和抗體效價。在第0週及第8週用30 μg劑量在HNS(鹼性緩衝液)、AAHS或MAPA中調配之雙融合病毒疫苗對恆河猴實施免疫。在第12週採集血清試樣且評估中和效價。線條代表該組之幾何平均值。
圖11A-11B顯示在不同溫度下表現gH之CMV在漢克氏平衡鹽溶液(HBSS)中之穩定性。(A)在所示溫度下將存於
HBSS中之CMV試樣儲存4天,之後使用病毒進入分析量測CMV病毒穩定性。(B)使用病毒進入分析結果計算試樣之EC50值。*指示因感染力完全損失而不能計算EC50。
圖12A-12B顯示在室溫下pH對表現gH之CMV之穩定性之效應。(A)在室溫下將存於具有不同pH之緩衝液中之CMV試樣儲存4天,之後使用病毒進入分析量測CMV病毒穩定性。(B)使用病毒進入分析結果計算試樣之EC50值。
圖13A-13B顯示尿素單獨或與氯化鈉組合對表現gH之CMV病毒穩定性之效應。(A)將2%尿素單獨或與150 mM NaCl組合添加至存於25 mM組胺酸緩衝液(pH 6)中之CMV中,且在室溫下保持4天,之後使用病毒進入分析量測CMV病毒穩定性。(B)使用病毒進入分析結果計算試樣之EC50值。
圖14A-14B顯示離子強度對表現gH之CMV病毒穩定性之效應。(A)將增強濃度之NaCl(0 mM、75 mM、150 mM及320 mM NaCl)添加至存於25 mM組胺酸緩衝液(pH 6)中之CMV中,且在室溫下保持4天,之後使用病毒進入分析量測CMV病毒穩定性。(B)使用病毒進入分析結果計算試樣之EC50值。
圖15顯示低溫保護劑對表現gH之CMV相對於冷凍-解凍循環之穩定性之效應。將所示低溫保護劑添加至存於25 mM組胺酸緩衝液(pH 6)中之CMV中且經受3次冷凍-解凍循環,之後使用病毒進入分析量測CMV病毒穩定性。使用病毒進入分析結果計算試樣之EC50值。
圖16A-16B顯示在小鼠免疫原性研究中儲存溫度對誘導CMV中和抗體之效應。在第0天對小鼠實施免疫且在第21天實施強化,之後在第28天抽血。使用ARPE-19細胞測試小鼠血清中針對表現gH之CMV之中和抗體。藉由非線性曲線擬合獲得NT50效價。(A)在免疫原性研究之前將CMV試樣在不同溫度下儲存3個月。(B)在解凍之後且在免疫原性研究之前將CMV試樣在不同溫度下儲存8小時。
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<220>
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<212> DNA
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<223> 化學合成
<400> 14
Claims (43)
- 一種條件式複製缺陷型CMV,其包含:(a)五聚gH複合物,其包含UL128、UL130、UL131、gH及gL;及(b)編碼必需蛋白與去穩定蛋白間之融合蛋白之核酸,其中該必需蛋白係選自由IE1/2、UL51、UL52、UL79及UL84組成之群。
- 如請求項1之條件式複製缺陷型CMV,其中該去穩定蛋白係FKBP或FKBP衍生物,其中該FKBP衍生物係包含一或多個選自由以下組成之群之胺基酸取代之FKBP:F15S、V24A、H25R、F36V、E60G、M66T、R71G、D100G、D100N、E102G、K105I及L106P。
- 如請求項2之條件式複製缺陷型CMV,其中該FKBP衍生物係包含胺基酸取代F36V及L106P之FKBP。
- 如請求項1至3中任一項之條件式複製缺陷型CMV,其中該必需蛋白係IE1/2。
- 如請求項1至3中任一項之條件式複製缺陷型CMV,其中該必需蛋白係UL51。
- 如請求項1至3中任一項之條件式複製缺陷型CMV,其中該CMV包含編碼至少兩種融合蛋白之核酸,其中各融合蛋白中之必需蛋白係不同的。
- 如請求項6之條件式複製缺陷型CMV,其中該等融合蛋白之一包含IE1/2。
- 如請求項6之條件式複製缺陷型CMV,其中該等融合蛋 白之一包含UL51。
- 如請求項6之條件式複製缺陷型CMV,其中第一融合蛋白包含IE1/2及第二融合蛋白包含UL51。
- 如請求項9之條件式複製缺陷型CMV,其中(a)該第一融合蛋白係SEQ ID NO:1或與SEQ ID NO:1至少95%一致之胺基酸;及(b)該第二融合蛋白係SEQ ID NO:3或與SEQ ID NO:3至少95%一致之胺基酸。
- 如請求項10之條件式複製缺陷型CMV,其中該第一融合蛋白係SEQ ID NO:1及該第二融合蛋白係SEQ ID NO:3。
- 如請求項10之條件式複製缺陷型CMV,其中(a)該第一融合蛋白係由SEQ ID NO:2或與SEQ ID NO:2至少95%一致之核酸編碼;及(b)該第二融合蛋白係由SEQ ID NO:4或與SEQ ID NO:4至少95%一致之核酸編碼。
- 如請求項12之條件式複製缺陷型CMV,其中該第一融合蛋白係由SEQ ID NO:2編碼及該第二融合蛋白係由SEQ ID NO:4編碼。
- 如請求項9之條件式複製缺陷型CMV,其中該CMV之基因組係SEQ ID NO:14。
- 一種組合物,其包含如請求項1至14中任一項之條件式複製缺陷型CMV及醫藥上可接受之載劑。
- 如請求項15之組合物,其進一步包含佐劑。
- 如請求項16之組合物,其中該佐劑係ISCOMATRIX®。
- 一種如請求項15至17中任一項之組合物之用途,其用於製造用以在患者中誘導針對CMV之免疫反應之藥劑。
- 如請求項18之用途,其中該免疫反應係患者中針對CMV感染之保護性免疫反應。
- 如請求項18至19中任一項之用途,其中該CMV感染係原發性感染、復發性感染或再感染(super-infection)。
- 如請求項18至19中任一項之用途,其中該患者係人類。
- 如請求項21之用途,其中該患者之免疫力減弱。
- 如請求項22之用途,其中該免疫力減弱之患者患有HIV或AIDS或係移植接受者。
- 如請求項21之用途,其中該患者係育齡女性。
- 一種如請求項1至14中任一項之條件式複製缺陷型CMV之用途,其用於製造用以在患者中誘導針對CMV感染之保護性免疫反應之藥劑。
- 如請求項1至3中任一項之條件式複製缺陷型CMV,其用於藥物中以治療患者之CMV感染。
- 一種製備如請求項2至14中任一項之條件式複製缺陷型CMV之方法,其包含在Shield-1存在下在上皮細胞中繁殖重組CMV。
- 如請求項27之方法,其中該等上皮細胞係人類色素視網膜上皮細胞。
- 如請求項28之方法,其中該等人類視網膜色素上皮細胞係以登錄號CRL-2302寄存於美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)之ARPE-19細 胞。
- 如請求項27至29中任一項之方法,其中該Shield-1係以至少0.5 μM之濃度存在。
- 如請求項30之方法,其中該Shield-1係以至少2 μM之濃度存在。
- 一種製備如請求項15至17中任一項之組合物之方法,其包含:(a)在Shield-1添加之培養基中在上皮細胞中繁殖該條件式複製缺陷型CMV;(b)自該培養基採集該條件式複製缺陷型CMV;(c)自該條件式複製缺陷型CMV實質上去除該Shield-1;及(d)將該醫藥上可接受之載劑添加至該條件式複製缺陷型CMV中。
- 如請求項32之方法,其中該等上皮細胞係人類色素視網膜上皮細胞。
- 如請求項33之方法,其中該等人類視網膜色素上皮細胞係以登錄號CRL-2302寄存於美國典型培養物保藏中心(ATCC)之ARPE-19細胞。
- 如請求項32至34中任一項之方法,其中在步驟(a)期間Shield-1係以至少0.5 μM之濃度存在於該培養基中。
- 如請求項35之方法,其中在步驟(a)期間Shield-1係以至少2 μM之濃度存在於該培養基中。
- 如請求項32至34中任一項之方法,其中該去除係藉由超 速離心或透析過濾。
- 如請求項32至34中任一項之方法,其中該去除使該Shield-1降至低於0.1 μM。
- 一種組合物,其包含如請求項1至14中任一項之條件式複製缺陷型CMV於pH介於5至7之間之緩衝液中,該緩衝液包含:(a)介於15 mM至35 mM之間之組胺酸;及(b)介於100 mM至200 mM之間之NaCl。
- 如請求項39之組合物,其進一步包含介於5%至15%之間之蔗糖。
- 如請求項39至40中任一項之組合物,其中該緩衝液包含25 mM組胺酸與150 mM NaCl,pH為6。
- 如請求項41之組合物,其進一步包含9% w/v蔗糖。
- 一種SEQ ID NO:14之核酸。
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