TW201245222A - Anti-inflammatory proteins and methods of preparation and use thereof - Google Patents

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201245222 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於抗發炎蛋白、其用途及其偵測方法。 【先前技術】 蜂蜜因其多種健康益處而已在世界各地藉由培養使用 數個世紀。蜂蜜之兩個最重要之健康益處為其抗細菌及抗 發炎性質。由莖蜂自松紅梅（Leptospermum scoparium )( — 種新西蘭及南澳大利亞原生之植物）收集花蜜產生之麥盧 卡蜂蜜（Manuka honey )已被識別為一種尤其展現有效抗細 菌及抗發炎性質的蜂蜜品種。 最近，已發現化學物質甲基乙二醛（MGO/2-側氧基丙 链）為麥盧卡蜂蜜之抗細菌活性的主要組分。含有較高濃 度之MGO的麥盧卡蜂蜜樣本相較於MG〇濃度較低之蜂蜜 樣本具有較南水準之抗細菌活性。咸信MG〇賦予蜂蜜以抗 細菌性質，這是因為MG0為具高度化學反應性之化合物， 且MGO可容易地與細胞分子反應。MG〇與細菌中之細胞 分子的化學反應損傷對於細菌活力而言重要之分子，且從 而MGO充當抗細菌劑。 蜂蜜中存在高含量之MG〇為區分麥盧卡蜂蜜與其他品 種之蜂蜜的特徵。大部分蜂蜜品種展現某種程度之抗細菌 活丨生，大分蜂蜜品種之抗細菌活性主要為蜂蜜中存在過 氧化氫的結果。相較而$，麥盧卡蜂蜜主要因蜂蜜中存在 MGO而展現抗細菌活性。 201245222 在2004年Kohno等人在細胞激素層面上研究蜂王漿之 抗發炎效應或作用。研究結果表明蜂王漿具有抗發炎作 用’ s玄抗發炎作用由抑制活化之巨喔細胞產生促發炎細胞 激素（諸如TNF-α、IL-6及IL-1 )所致。該研究進一步表 明蜂王漿中之活性部分或組分的分子量介於5 kDa與30 kDa之間。此研究大概闡明大部分蜂蜜具有弱抗發炎效應係 因為在蜂蜜中存在蜂王漿蛋白。 雖然已瞭解麥盧卡蜂蜜之抗細菌活性之多重作用機 制，但麥盧卡蜂蜜充當抗發炎劑之機制仍然未知。需要研 發基於蜂蜜之抗發炎劑，這是因為許多當前可用之抗發炎 劑在其使用方面具有較多缺點。舉例而言，c〇x_2抑制劑 (一種非類固醇抗發炎藥（NSAID )形式）會提高患者之心 臟病發作及中風的風險，且阿司匹靈（aSpirin )可能提高胃 腸出血之風險。另外，皮質類固醇經報導會抑制上皮細胞 生長且NS AID經報導具細胞毒性，因此此兩個類別之抗發 炎劑不適用於傷口護理。源.自蜂蜜之抗發炎劑相較於當前 可用之藥物在一或多個領域中可具有較少毒性副作用，且 相較於當前可用之抗發炎藥物亦可提供可能之不同用途。 除需要研發基於蜂蜜之抗發炎藥物之外，亦需要研發 一種測試蜂蜜樣本之抗發炎特性的簡便方法。本發明旨在 滿足該兩種需要及其他未滿足之需要。 曰 本發明者已識別出來自麥盧卡蜂蜜的約55 kDa至75 心之經修飾王漿主蛋白（aP — n)，其係得自麥盧卡蜂 蜜中發現的高含量之甲基乙二醛。本發明者已認識到，經 201245222 修飾之王漿主蛋白相較於未經 較強之抗發炎性質。 修錦之王漿主蛋白具有顯著 【發明内容】 本文描述—種經甲基乙KMGO) 4學修飾且在蜂 蜜中識別出之王聚主蛋白蛋白質，其展現顯著提高之抗發 炎效應。在-個態樣中，提供—種分離之王漿主蛋白蛋白 質或其片段’其已經曱基乙二酸（MG〇 )化學修飾。在另 一具體實例中，該蛋白為經修飾之王漿主蛋白^ (Apai/MIUP)蛋白或其在另—具體實例中經修飾 之王漿主蛋白蛋白質或其片段係自麥盧卡蜂蜜令分離。 在另一具體實例中，蛋白或其片段具有至少17個經 MGO修飾之胺基酸殘基，或17至32個經MG〇修飾之胺 基酸殘基或約32個經MGO修飾之胺基酸殘基。在另一具 體實例中’經修飾之胺基酸殘基為一或多個離胺酸或精胺 酸殘基。 在另一態樣中，提供一種組成物，其包含分離之經MGO 修飾之王漿主蛋白蛋白質或其片段。 在另一態樣中，提供一種分離之經MGO修飾之王漿主 蛋白蛋白質或其片段，其具有「抗發炎能力」且包含與SEq ID NO 1中所述之胺基酸序列具有至少75%、85〇/〇、9〇〇/〇、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%序列一致性的胺基酸序列。在一個具體實例中，分離 之經MGO修飾之王漿主蛋白蛋白質或其片段係自麥盧卡蜂 201245222 蜜中分離。 在另一態樣中，提供一種減輕蜂巢組織中之炎症的方 法’其包含使包括如上文所定義之分離之經MGO修錦之王 漿主蛋白蛋白質的組成物與蜂巢組織接觸的步驟。 在另一態樣中，提供一種（i )降低免疫系統細胞之吞 噬率的方法，或（11 )抑制免疫系統細胞上之用於吞噬之受 體的方法，其包含投予免疫系統細胞含如上文所定義之分 離之經MGO修飾之王漿主蛋白蛋白質之組成物的步驟。 在另一具體實例中，提供一種藉由修飾蜂王漿產生抗 發炎分子的方法，該方法包括使蜂王漿與至少〇 〇1% MG〇 或0.5% MGO或1.0% MG0反應的步驟。該方法可進一步 包括自蜂王漿產物中分離經MG〇修飾之王漿主蛋白 (MRJP1 )蛋白質的步驟。 在另一態樣中，提供一種識別蜂蜜樣本之（丨）抗發炎 能力或（ii)經MGO修飾之王漿主蛋白濃度的方法，其包 含以下步驟： a) 分析蜂蜜樣本之螢光，及 b) 藉由將一蜂蜜樣本之螢光量測值以及一或多種蜂蜜 樣本之抗發炎能力與先前已經量測之抑制呑噬作用能力比 較，來使蜂蜜樣本之勞光量測值與蜂蜜樣本之抗發炎能力 具相關性。 在一個具體實例中，經MG〇修飾之王漿主蛋白為經修 飾之王漿主蛋白1蛋白質。 在一個具體實例中，該方法用於使得養蜂人能夠確定 201245222 自蜂房收集蜂蜜以獲得含有所需抗發炎能力或經mg〇修飾 之王漿主蛋白含量之蜂蜜樣本的恰當時機。 在另一具體實例令，該方法用於使得蜂蜜生產者能夠 確定儲存蜂蜜以獲得具有所需抗發炎能力及經mg〇修飾之 王漿主蛋白含量之蜂蜜樣本的所需持續時間。 種；強4夕種王漿主蛋白/ ( MRJp)蛋白質之抗發 炎及螢光特性的方法，該方法係藉由用mg〇化學處理來達 成。 種提同蜂蜜樣本之抗發炎能力及經MGO修飾之王漿 主蛋白蛋白質含量的方法’其包含將MG〇或前驅分 子添加至蜂蜜樣本中之步驟。 在另具體實例中，提供一種增強一或多種王漿主蛋 白蛋白質之抗發炎能力的方法，其係藉由肖MG〇、甲搭、 乙二醛及/或戊二醛化學處理來達成。 在另一具體實例中，提供一種增強一或多種王衆主蛋 白蛋白質之抗發炎能力的方法，其係藉由用MG〇、乙二醛 及/或戊二醛化學處理來達成。 上述概要大致描述本發明之某些具體實例之特徵及技 術優勢。其他技術優勢將在隨後之本發明之【實施方式】 及貫例中描述^咸信為本發明特性之新穎特徵在連同任何 隨附之圖式及實例一起考慮時將自本發明之【實施方式】 更透徹地瞭解。然而，本文提供之圖式及實例意欲協助說 明本發明或幫助建立對本發明的理解，而不意欲限制本發 明之範圍。 7 201245222 【實施方式】 以下描述闡述求多例示性組態、參數及其類似方面。 然而’應瞭解該描述不欲對本發明範圍進行限制，而實際 上提供作為對例示性具體實例之描述。 定義 王漿主蛋白蛋白質為醣蛋白。存在許多在蜂蜜及蜂王 聚中發現之王漿主蛋白。蜂蜜中所發現之主要王漿主蛋白 為王漿主蛋白1 ( Apa 1 )，亦稱為主要蜂王漿蛋白i ( MRJp 1 )。雖然本說明書集中於蜂蜜中所發現之主要王敬主蛋 白’但應瞭解蜂蜜中所發現之其他王漿主蛋白亦可展現類 似之修飾潛能及類似之抗發炎能力，這是因為其皆為具有 咼度甘露糖型糖基化之醜蛋白，如在2000年由Kimura等 人在Biosci. Biotechnol· Biochem中所報導。存在約9種主 要蜂王漿蛋白且主要蜂王漿蛋白1至5之序列展示於下文 中。 如貫穿本說明書中關於蜂蜜或王漿主蛋白或主要蜂王 漿蛋白所用之術語「螢光（fluorescence )」為當藉由較低波 長之光激發時實質上對應於主要處於440 nm至5 60 nm範 圍内之光之最大發射的波長。 「發炎（inflamed )」組織被定義為回應於組織損傷或感 染而出現免疫反應的組織，且該組織具有以下一或多種症 狀：疼痛、腫脹、發熱、敏感或發紅。 如本文所用之「抗發炎能力（anti-inflammatory capacity )」被定義為臨床上減輕蜂巢組織之炎症或炎症症狀 201245222 的能力。抗發炎能力可使用下文詳細描述之吞嗤作用抑制 分析法（PI A )或下文詳細描述之DCFDA分析法來確定。 應瞭解一級lie基酸序列之「修倚（modification )」包括 「缺失（deletion )」（即，一或多個胺基酸殘基不存在的多 肽）、「添加（addition )」（即，相較於所說明之多肽具有一 或多個額外胺基酸殘基的多肽）、「取代（substituti〇n)」（即， 由置換一或多個胺基酸殘基而產生的多肽），及「片段 (fragment )」（即，由與所說明多肽之一部分一級序列一致 的一級胺基酸序列組成之多肽）。 應瞭解「經修飾之王漿主蛋白（modifiedapalbumin)」 包括已藉由甲基乙二醛於胺基酸上之化學反應或曱基乙二 路於構成蛋白質之胺基側鏈上之化學反應而經修飾的任何 王漿主蛋白蛋白質或其片段。甲基乙二醛修飾有可能存在 於王漿主蛋白内的離胺酸、精胺酸及/或半胱胺酸胺基酸以 及末端胺基酸之自由胺基上且該等MG0修飾可存在於蛋白 質内約1至4 0個位點上。舉例而言，經修飾之王敷主蛋白 1意謂在其胺基酸序列上之一或多個位點處經修飾以得到 經MG0修飾之Apa 1的Apa 1。 胺基酸「序列相似性（sequence similarity )」或「序列 一致性（sequence identity)」係指兩個或兩個以上多肽在適 當位置處之胺基酸與胺基酸之比較，其中胺基酸一致或具 有相似之化學及/或物理性質’諸如電荷或疏水性。隨後可 基於該比較測定所比較之多肽序列之間的「一致性百分比 (percent identity)」〇 201245222 序列之簡要描述 SEQ ID ΝΟ:1 :自 http://www.uniprot.org/uniprot/O18330 獲得之Apal (亦稱為主要蜂王漿蛋白1 )之胺基酸序列。 1 旦 20 30 40 50 60

MTRLFMLVCL GIVCQGTTGN ILRGESLNKS LPILHEWKFF DYDFGSDEJii? QDAILSGEYD 70 80 90 100 110 120

YKNNYPSDID QWHDKIFVTM LRYNGVPSSL NVISKKVGDG GPLLQPYPDW SFAKYDDCSG 130 140 150 160 170 180

IVSASKLAID KCDRLWVLDS GLVNWTQPMC SPICLLTFDLT TSQLLKQVEI PHDVAVNATT 190 200 210 220 230 240

GKGRLSSLAV QSLDCNTNSD TMVYIADEKG EGLIVYHNSD DSFHRLTSNT FDYDPKFTKM 250 260 270 280 290 300

TIDGESYTAQ DGISGMALSP MTNNLYYSPV ASTSLYYVNT EQFRTSDYQQ NDIHYEGVQN 310 320 330 340 350 360

ILDTQSSAKV VSKSGVLFFG LVGDSALGCW NEHRTLERHN IRTVAQSDET LQMIASMKIK 370 380 390 400 410 420

EALPHVPIFD RYINREYILV IiSNKMQKMVN NDFNFDDVNF piMNANVNEL· ILNTRCENPD 430

NDRTPFKISI HL 離胺酸（K) 22個位點及精胺酸（R) 17個位點已經突 10 201245222 出顯示以識別可能由MGO糖基化之位點，藉以該糖基化產 生經MGO修飾之王漿主蛋白。 SEQIDN0..2:自 http://http://www.uniprot.org/uniprot/O77061 獲得之主要蜂王漿蛋白2之胺基酸序列係展示於序列表中。 SEQ ID NO: 3 :自 http://www.uniprot.org/uniprot/Q17060-l 獲 得之主要蜂王漿蛋白3之胺基酸序列係展示於序列表中。 SEQ ID NO: 4:自 http://www.uniprot.org/uniprot/Q17060-l 獲 得之主要蜂王漿蛋白4之胺基酸序列係展示於序列表中。 SEQ ID NO: 5 :自 http://www.uniprot.org/uniprot/097432 獲得 之主要蜂王漿蛋白5之胺基酸序列係展示於序列表中。 經MGO修飾之王漿主蛋白1 王漿主蛋白1 (亦稱為Apal或「主要蜂王漿蛋白1」 (MRJP1 ))為以不同濃度見於各種蜜蜂產物中之蛋白質。 Apal為由蜜蜂分泌之48.9千道爾頓（kDa)蛋白質，且其 見於蜂蜜、蜂王漿及其他蜜蜂產物中。所測試之所有蜂蜜 品種皆已展示含有Apal ( J. Simuth等人，2004 )。據估計 APal構成蜂王漿中48%之蛋白質（B· Lerrer等人，2007)。 曱基乙二醛或MGO為具有式C3H402之有高度化學反 應性之化合物。MGO由活生物體内多重代謝路徑形成。麥 盧卡蜂蜜之稱為「活性」麥盧卡蜂蜜之某些製劑相較於其 他蜂蜜品種含有高得多濃度之MGO。活性麥盧卡蜂蜜已經 測定含有為其他蜂蜜品種中之MGO濃度之高達1000倍的 MGO 濃度（E. Mavric 等人，2008 )。 MGO可參與活生物體内之多種化學反應，包括「晚期 201245222 糖基化終產物」（age )之形成過程。糖基化為糖與蛋白質 或月曰質在不涉及酶作為反應催化劑之情況下的反應。MG〇 可藉由與胺基酸精胺酸、離胺酸及/或半胱胺酸之自由胺基 以及末端胺基反應而糖基化蛋白質，且從而可化學修飾含 有精胺酸及/或離胺酸之蛋白質。如自SEQID NO: 1可見，

Apal含有總共約39個可經MG0化學修飾之精胺酸及離胺 酸殘基。 經MGO修飾之Apal可藉由自活性麥盧卡蜂蜜中分離 該分子而得到。經MGO修飾之Apal可藉由生物化學技術 自蜂蜜中为離出及/或由蜂蜜增濃。此等技術包括（但不限 於）過濾、離心及層析，諸如離子交換層析、親和層析、 疏水性相互作用層析、尺寸排阻層析及逆相層析。經MG〇 修飾之Apal亦可自各種來源純化或藉由將MG〇添加至蜂 王漿中而化學合成。 亦可藉由以下操作得到經MGO修飾之Apal :獲得編 碼胺基酸序列SEQ ID NO: 1之基因，將該基因選殖至適當 載體中，用該載體使細胞系轉型，使多肽表現，純化該多 肽，將多肽與MGO混合以使MGO與多肽之間進行化學反 應’及純化經MGO修飾之多肽。 表現系統可含有控制序列，諸如啟動子、強化子及終 止控制子，如此項技術中關於多種宿主所知（參見例如

Sambrook 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual， 第 2 版，Cold Spring Harbor Press (1989)，其以全文引用的 方式併入本文中）。表現系統亦可含有有助於基因表現及/ 12 201245222 或蛋白質摺疊的信號肽及原蛋白序列。

Apal ( SEQ ID ΝΟ:1)之胺基酸變異體之經MG〇修飾 形式亦可展現抗發炎能力。如一般技術者所瞭解，對SEQ ID NO: 1之一級胺基酸序列之次要修飾會產生抗發炎活性相較 於SEQ ID NO: 1實質上相等或增強之多肽。當Apai修飾包 括一或多處取代時，較佳取代為保守取代，亦即其中殘基 經另一相同通用類型之殘基置換。在對Apal蛋白進行修飾 時，可考慮胺基酸之親水指數（參見例如Kyte_等人，j. Mol.

Biol. 157，105-132 (1982)，其以全文引用方式併入本文 中）。在此項技術中已知某些胺基酸可經其他具有相似親水 指數或分數之胺基酸取代且仍產生具有相似生物活性之多 肽》 經MGO修飾之Apal變異體較佳與非變異Apal序列展 現至少約75%序列一致性，較佳與本文所述之任何野生型 或參考序列展現至少約8〇% 一致性，更佳至少約85%、 90/〇、91 /〇、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或1〇〇%序列一致性。甚至更佳，'經MGO修飾之Apal變異 體展現實質上與經MG〇修飾之非變異A—相當之抗發炎 能力。 可藉由以下操作刺激蜂蜜中經MGO修飾之Apal之形 成：（〇在環境溫度下長期健存，或（ii)在高溫（攝氏3〇 度至40度）下培育蜂蜜’從而增強蜂蜜樣本之抗發炎能力。 將 MGO 或 MGO 前雕_§* c >. ^ 驅體（诸如二羥丙鲷（DHA))添加至蜂 蜜樣本中，伴以足夠年 Ί f間及/或加熱以使]VIGO前驅體轉化 13 201245222 成MGO亦可刺激該蜂蜜樣本中經MG〇修飾之Apai之形 成’且亦可藉由在蜂蜜樣本t產生經MG0㈣之Apa / 增強蜂蜜樣本之抗發炎能力。 抗發炎性質增強之Apal亦可在蜂蜜外形成。完全或部 分純化之Apal已發現可用MG0處理以得到經MG0修都之

Apa卜經MG0修飾之Apal在與未經修飾之Apai相比較 時展現增強之抗發炎性質。 經MGO修錦之Apal及其變異體可以治療有效量納入 醫藥組成物中。本發明之醫藥組成物可經特定調配而以固 體或液體形式投予’包括適於以下之組成物：⑴經口投 樂，例如藥液（水性或非水性溶液或懸浮液）；錠劑，例如 旨在經頰、舌下及全身吸收之錠劑；丸劑；散劑；顆粒； 供塗覆於舌頭之糊劑；（2)非經腸投藥，例如以例如無菌 溶液或懸浮液或持續釋放調配物形式藉由皮下、肌肉内、 靜脈内或硬膜外注射投予；（3)局部施用，例如呈施用於 皮膚之乳膏劑、軟膏或控制釋放貼片或喷霧劑形式；（4 ) ***内或直腸内，例如呈子宮托、乳膏劑或泡沫劑形式；（5 ) 舌下；（6)眼部；（7)經皮；（8)經肺；或（9)經鼻。當 本發明化合物以藥物形式投予人類及動物時，其本身可給 與或以醫藥組成物形式給與，該醫藥組成物含有例如約 〇.1%至99%，或約1%至50%，或約10%至40%，或約1〇% 至30%，或約1〇。/〇至2〇%，或約1〇%至15%之活性成分以 及醫藥學上可接受之載劑。 濕潤劑、乳化劑及潤滑劑（諸如月桂基硫酸鈉及硬脂 14 201245222 酸鎮）以及著多如 巴劑、脫模劑、塗佈劑、甜味劑、調味劑及 香化劑、防腐齋丨；5 p

^及彳几氧化劑亦可存在於本文所述之醫藥組 成物中。此等*且&私1 γ A ^ 成物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、 乳化劑及分散劑。7 丄a , ^ 可藉由包括各種抗細菌劑及抗真菌劑（例 如對經基苯甲酿St 甚 _ T夂如、氣丁醇、苯酚山梨酸及其類似物）來 蜂保防止微生物對本發明化合物之作用。在組成物中亦可 月b需要包括等張劑，諸如糖、氯化鈉及其類似物。另外， 可藉由包括延遲吸收劑（諸如單硬脂酸鋁及明膠）來使得 可注射藥物形式之吸收延長。 實施例1-自麥盧卡蜂蜜中分離經MG〇修飾之王漿主 蛋白蛋白質 如下將自 Honey Research Unit，university 〇fWaikat〇, NZ獲得且非過氧化物抗細菌活性等效於i2% 苯酚 (Allen, Molan等人，1991)之麥盧卡蜂蜜樣本份化： 1.1去除蜂蜜之低分子量組分 將25公克麥盧卡蜂蜜懸浮於25 ml蒸餾水中且在4。〇 下針對1公升自來水透析（CeUu Sep T1管，Membrane

Filtration Products 公司，Seguin，TX ; EEUU ’ 分子質量截留 3500 Da) 48小時，在此期間更換！公升水四次。凍乾透析 保留物且接著儲存於-20°C下直至分析為止。用〇。爪“/丨乙 酸銨緩衝液將凍乾樣本復原至2 ml。 1.2葡聚糖凝膠G-50層析分離 接著將復原之透析保留物（2 ml )加栽至葡聚糖凝膠 G-50管柱（180 ml)上且將物質於1⑹洗提份中（流速： 15 201245222 0.5毫升/分鐘，在280 nm下監測）洗提。凍乾自圖3中所 示之2個峰獲得之洗提份且用純水復原至1〇〇 μ丨以在吞噬 作用分析法中進行初步評定。此分析法顯示抑制活性在於 首先洗提之峰中《進行進一步層析分離以產生較大量之蛋 白質。重複葡聚糖凝膠G-50管柱層析三次且將來自各次操 作之洗提跡線上之第一峰之洗提份彙集於一起，旋轉蒸發 至200 μΐ且接著在Superose 12管柱上分離。 1.3蛋白質經Superose 12之快速蛋白質液相層析 (FPLC)分離 為進一步份化葡聚糖凝膠G-5 0洗提跡線上之第一峰， 將100 μΐ量之復原樣本注射至Superose 12 FPLC管柱（25 ml)上且用磷酸鹽緩衝鹽水（ρϊ1 7.u)(流速：〇 5毫升/ 分鐘，0.5 cm/m卜在280 nm下監測）洗提成i ml洗提份。 此等洗提份冷凍於-2(TC下直至進一步使用為止。在吞嗤作 用分析法中分析所得兩個明顯分離之主峰（洗提份8及14 ) 的抑制活性。使此等洗提份在1 〇% SDS-PAGE凝膠上進行 電泳且處理用於MALDI-T0F質譜識別。 1.4活性洗提份之逆相 在逆相管柱上對來自Superose 12層析之發現具有吞嗤 作用抑制活性之洗提份（洗提份8)進行層析以進一步純化 蛋白質以供MALDI質譜識別之用。使用FpLC系統 (Pharmacia-LKB，Uppsala, Sweden)上之管柱進行層析。將 5〇〇 μΐ量之洗提份8樣本注射於管柱上且用移動相以ι〇〇% 水至100%乙腈之梯度（流速為i毫升/分鐘，在26〇 下 16 201245222

監測）洗提。將所得包含兩個主峰之洗提份（洗提份23及 26 )旋轉蒸發至50 μ卜將洗提份（5 μ1 )加載至丨〇% SDS 小型凝膠上以使其顯現且處理用於如下文所述之 MALDI-TOF 質譜法。 實施例2.使用THP-1細胞之吞噬作用抑制分析法 (PIA) 吞噬作用為吞沒固體粒子之細胞反應或過程且在免疫 系統中，其為用於移除病原體及細胞碎片之主要機制。細 菌、死組織細胞及小礦物質粒子皆為可能由細胞吞噬或吞 沒之目標的實例。吞噬作用在白血球發炎反應開始時出現 以引發炎症。當細胞中吞噬作用激活時由細胞產生之反應 性氧物質及細胞激素募集且使更多吞噬細胞活化作為為皆 以吞噬開始之發炎反應之細胞事件之級聯的一部分。因 此，任何吞噬作用抑制劑可恰好在級聯開始時有效地阻止 發炎反應。 量測廣泛類型之新西蘭蜂蜜之吞噬作用抑制活性。發 現麥盧卡蜂蜜總體上比其他類型具有高得多之活性，如下 表1所示，其展示不同類型之蜂蜜（0 5%)對LPS活化之 THP-1細胞中乳膠粒子之吞噬作用的影響。在添加乳膠粒子 後4小時進行分析。藉由用無菌RpMI 164〇完全培養基稀 釋蜂蜜達成麥盧卡蜂蜜及人工蜂蜜之濃度。麥盧卡蜂蜜係 自 Honey Research Unit，University 〇f Waikat〇, NZ 獲得且具 有等效於12% w/v笨酚之非過氧化物抗細菌活性（A丨丨 Molan等人，1991)。藉由稱取137 g蜂蜜（每毫升蜂蜜密 17 201245222 度）且在臨用於無菌RPMI 1640令之前用19如MUUq水 稀釋此蜂蜜（5% V/V濃度）並過濾（50 μηι、8 μηι及3 ，

Minisart Sartorius過濾器，MilliP〇re公司）以移除花粉蜜 蜂組織等來稀釋蜂蜜。在深色容器中將未稀釋之蜂蜜保持 於4t下以防止酶變性及降解。人工蜂蜜係用於提供蜂蜜中 所見之天然糖之滲透效應的對照物。此人工蜂蜜之組成係 如所公開（White 1975 )。 熟知新西蘭生產之一些類型之蜂蜜可能已具有—些麥 盧卡花蜜，該麥盧卡花蜜亦包括於其中而由蜜蜂產生，這 是因為麥盧卡在整個新西蘭廣泛地生長且為蜜蜂之有利花 蜜來源。 表1 蜂蜜類型 呑噬作用之降低百分比 蜜場蜂蜜（Pasture honey ) 13%±4% 苜蓿蜜 6%±4% 卡努卡蜂蜜（Kanuka honey ) 15%±3°/〇 麥盧卡蜂蜜 67%±10% 人工蜂蜜 0% THP- 1為充分特性化之人類單核細胞白血病細胞系。該 等細胞就若干準則而言類似於單核細胞且可藉由用PMA、 LPS或維生素D處理而分化成巨嗤細胞樣細胞（Auwerx j， 1991 )。一旦活化’巨噬細胞可用於藉由將巨噬細胞與乳膠 珠粒或其類似物一起培育且藉由在顯微鏡下觀測細胞以記 錄呑嗤性捕捉來研究呑噬作用《藉由使用螢光乳膠珠粒， 該等珠粒在吞噬後在細胞内可見。可藉由比較在添加物質 時吞嗟之量與在未添加物質之情況下吞噬之量來研究抑制 18 201245222 • 吞噬作用之物質。 對在用LPS、PMA及維生素D活化後暴露於蜂蜜之 THP-1細胞之培養物評估細胞形態、吞噬作用、細胞***速 率及所選表面標記之變化。選擇LPS用於進一步研究，這 是因為活化速率較短而使得分析能夠在3 0小時内完成。LPS 活化之細胞在24小時内變成巨嗟細胞，而用pma及維生 素D則需花費至少72小時。THP-1細胞分化之準則為細胞 貼壁、細胞形態之變化及與巨噬細胞表型有關之人類軟骨 群蛋白-39 (human cartilage group protein-39，HCgp-39) 及羧肽酶M ( CPM )之細胞表面標記表現特徵之變化，由 對經LPS處理之細胞及未經處理之細胞之mRNA進行 qRT-PCR所測定。 在3 7°C、5。/。C02及95%相對濕度（RH)下於含有10% --胎牛血清及25 mM HEPES及抗生素之不含内毒素之rpmi 1640培養基中維持THP-1細胞。每3天繼代培養細胞一次 以維持細胞計數為約1〇6個/毫升且在處理之前藉助於錐蟲 藍排除法在血球計上評定活力。繼代數目始終為4〇至5 5。 藉由將 1 mg LPS 溶解於無菌 RPMI 1640 ( Invitrogen) 中來製備100 pg/ml之LPS儲備溶液。將儲備溶液於·2〇°〇 下冷凍儲存。在臨用前’融化LPS儲備溶液且將其添加至 新鮮繼代培養之細胞中達500 ng/ml之最終濃度，其中1 〇6 個/毫升THP-1細胞具有活力95%或95%以上。將細胞以每 孔 1 ml 塗於 24 孔培養盤（Cellstar，Greiner bio-one)中且 用膠帶密封培養盤以避免蒸發。將培養盤在37〇c、5% c〇2 19 201245222 及95%相對濕度（RH)下培育24小時以活化。 在吞嗤作用分析之前，在倒置顯微鏡上檢查各孔以觀 測心不成功轉型之形態改變。對照ΤΗΡ_ 1細胞（無LPS ) 維持圓形且不聚集或黏附至培養盤表面，而用Lps處理之 活化THP-1細胞聚集’變得扁平且呈具有明顯偽足之變形 蟲狀’且黏附至培養盤表面。 用無菌RPMI培養基洗滌]Lps活化之丁只卜丄細胞單層 兩-人，移除懸浮之細胞，且接著在5〇〇卜丨RpMI中與以下三 種處理中之任一種處理一起培f 3〇分鐘；無蜂蜜、人工蜂 蜜（0.25/〇)或蜂蜜（〇25%)。將無菌之1〇 μιη經塗佈聚 苯乙烯乳膠珠粒（Sigma L540S-1 ml)以每個細胞約25個 珠粒添加至單層中且在37t、5% c〇2及95% RH下培育培 養盤。每次實驗各處理組具有至少三個重複試樣且在各別 天重複至少兩次。 培育四小時後，移除懸浮之細胞且藉由用冰冷無菌磷 酸鹽緩衝鹽水洗滌單層來停止吞噬。藉由在孔中平緩地上 下抽吸100 μΐ PBS使貼壁之細胞自培養盤脫壁。使用具有 4〇x透鏡之Axostar plus Zeiss螢光顯微鏡η相在血球計上 對各樣本之至少200個細胞進行計數。含有至少三個珠粒 之細胞被視為吞噬作用陽性。在初步分析中觀測到未活化 之ΤΗΡ-1細胞（單核細胞）的吞嗟率小於5%。在分析後使 用錐蟲藍排除法檢查活力以確保處理或蜂f未誘導細胞洞 亡0 THP-1細胞吞噬乳膠珠粒之能力係以蜂蜜處理組/無蜂 20 201245222 贫對照組之百八L A —曰 、 ▲ 百刀比來疋罝。首先，藉由用吞噬細胞數目除 =血球上計數之細胞數獲得活化率。培育四小時之可接 受之活^率為7G%或观以上。亦以此方式計數蜂蜜處理 μ且接著根據下式計算呑禮作肖之降低百分比。 呑噬作用降低。/。=(蜂蜜處理組吞噬率/對照組） χ100-100 例示性計算如下： 對照組，75% ( 75%之細胞吞噬至少3個珠粒） 蜂蜜處理組1，25% (25%細胞吞嗔至少3個珠粒） 蜂蜜處理組1，吞噬作用抑制活性=(25m ) xl00-100 = 66.7%。 此結果表明蜂蜜處理組丨對吞噬性乳膠珠粒捕捉具有 66.7°/〇抑制作用。 為篩選大量樣本，可修改此分析法而在9 6孔培養盤上 使用由（Wan，Park等人，1993 )闡明之修改方案進行。此 分析法經修改而使用THP—丨及其生長條件/培養基以及相同 之乳膠珠粒在與蜂蜜一起培育後在pBS中洗滌各孔以移 除懸浮之細胞及自由乳膠珠粒，之後在培養盤讀取器或 LAS-1000上進行量測。已比較兩個方法且得到相當類似之 結果。 實施例3 :量測螢光強度 在裝備有智慧型暗盒（intelligent darkb〇x ) π (Alphatech)之Fujifilm LAS_100上量測蜂蜜之螢光強度。 使用提供之軟體影像讀取器LAS-1000 P1US iite版本15及 21 201245222

Image Gauge 4.0 分析數據。 使蜂蜜達到室溫且在雙重蒸餾h2〇中稀釋至丨〇% Wv (1 ml蜂蜜-1.3 7 gm ) »接著經〇 2 μιη Minisart無菌一次性 針筒過濾器（Sartoris)過濾5 m丨稀釋之蜂蜜。將1〇〇 稀釋之蜂蜜吸取至96孔黑色培養盤（nunc目錄號：1371〇1) 之5個孔中。亦塗具有已知螢光之標準蜂蜜以及水空白及 空孔用於背景讀數。 將培養盤置於暗盒（能階4)内部且使用影像讀取器 LAS 1000 plus程式聚焦。進行預曝光以測定約3〇秒之所需 曝光時間。一旦獲取影像，即使用所提供之Image Gauge 4 〇 獲得結果。簡言之，以任意單位（AU)量測孔之螢光且減 去背景強度’得到處於40000 AU至260000 AU範圍内之讀 數。求得樣本之平均值，得到具有典型標準差+/_丨5〇〇 Au 之最終讀數。在一些狀況下，螢光強度過高而縮短曝光時 間以避免過度曝光。使用標準蜂蜜Au導出此等蜂蜜之正確 AU (但很少進行此操作，原因在於僅少數蜂蜜達成如此程 度之螢光）。 其在蜂蜜中具有1 %之濃度。由於可自蜂蜜洗提份獲得 之蛋白質量較小，所以使用2〇〇 μ1分析樣本量。分析如上 文所述獲得之洗提份8及14的吞噬作用抑制活性。洗提份 8具有強烈之吞噬作用抑制活性且洗提份u具有極小活 性。藉由如下文所述之MALDI-TOF質譜法以顯著命中（hh) 識別出兩個洗提份。具有大部分抗發炎活性之洗提份（洗 提份8)為經修飾之王漿主蛋白1 (MRJP-1)e洗提份14產 22 201245222 . 生兩個命中，一個命中為顯著的，其為王漿主蛋白3 (MRJP-3 )。不顯著之命中為报可能未經MG〇修飾之王漿主 蛋白 1 ( MRJP-1 )。 實施例4 : SDS小型凝膠上之電泳 使藉由份化蜂蜜獲得之蛋白質在SDS pAGE凝膠上進 行電泳以使其顯現且得到分子量估計值。使用含1〇%及12% 丙烯醯胺之解析凝膠分離不同範圍之蛋白質。1〇%凝膠最佳 用於分離14 kD至205 kD蛋白質而12%凝膠用於分離14 kD 至66 kD蛋白質。在OWL分離系統凝膠灌膠模具（Bi〇Lab Scientific LTD )中使用組裝之清潔玻璃板製成凝膠。首先 使用庄射器傾s主解析凝膠，且用丁醇層覆蓋使其凝固以確 保平坦之凝膠表面。當凝膠凝固時，移除丁醇且傾注堆叠 凝膠並***凝膠梳狀物以製成用於加載樣本之孔。凝膠之 組成為： 10%解析凝膠 6.8 ml 37%丙烯酿胺 2 ml 1 M Tris pH 9.0 5.9 ml 水 150 μΐ 10%十二烷基硫酸鈉（SDS) 15 μΐ Ν,Ν,Ν'Ν，-四亞甲基二胺（TEMED) 1 5 0 μΐ 10%過氧硫酸銨（AP S ) 12%解析凝膠 8.2 ml 37%丙稀醯胺 2 ml 1 M Tris pH 9.0 23 201245222 4.5 ml 水

150 μΐ 10% SDS

15 μΐ TEMED

150 μΐ 10% APS 5%堆疊凝膠 0.66 ml 37%丙烯醯胺 1.25 ml 0.5 M Tris pH 6.8 3.0 m 1 水

50 μΐ 10% SDS

5 μΐ TEMED

50 μΐ 10% APS 當堆疊凝膠凝固時’將凝膠***電泳腔室中且在頂部 及底部腔室中添加電泳緩衝液（3.0 g Tris、14.4 g甘胺酸、 1 g SDS ’於1 L MilliQ水中）。移除梳狀物且用電泳緩衝液 洗滌樣本孔。接著在10 mA下跑膠1〇分鐘以移除任何未聚 合之丙烯醯胺。將欲加載至凝膠上之樣本與2><三（羥甲基） 曱基甘胺酸（Tricine)樣本緩衝液（〇·ι mol/1 Tris( pH 6.8)、 24% ( w/v)甘油、8% ( w/v) SDS、0.2 mol/1 二硫蘇糖醇、 0.02 /> ( w/v )庫馬斯藍（c00massie Blue ) G-250 ) 1:1 混合 且在99°C下加熱5分鐘，接著冷卻。將樣本離心（2〇〇〇Xg， 20秒）以使任何沈積物成為離心塊且每個泳道加載1 〇 ^ 樣本。使 BIORAD Precision Plus Dual Colour 蛋白質標準梯 狀條帶（ladder)(目錄號：161_〇374 )與樣本並排進行電泳 以侍到樣本之估計蛋白質大小。標準品含有大小為丨〇 kDa 24 201245222

至250 kDa之蛋白質：在凝膠之各端上加載6μ1β^ 1()mA 下跑膠直至樣本遷移穿過堆疊凝膠進入解析凝膠中為止 接著將電流增加至20 mA。當樣本中之染料跑出凝膠邊緣 時，關掉電流且移出凝膠並染色。使用兩種方法使條帶顯 現。使用銀染色識別較淡之條帶，這是因為銀染色更靈敏。 在MALDI-TOF質譜研究之前使用固藍（μ·)法這 是因為該染色劑比銀更容易移除。固藍為使用庫馬斯亮藍 之以較低親和力結合至醣蛋白而使其對於具有大比例醣蛋 白之蜂蜜而言理想之染色劑。此允許在蛋白質maldi質譜 研究之前較佳地移除染色劑’因為殘留之染色劑可能干‘ 定量（Deutscher丨990 )。在進行染色之前5分鐘新鮮製備所 有試劑且保持在下直至需要為止。首先在5〇%乙醇/12% $酸中固定凝膠30分鐘，接著在3〇%乙醇中浸泡15分鐘。 隨後，添加100 ml〇.02。/。硫代硫酸鈉且留置i至2分鐘。在 100 ml 0.1%硝酸銀+ 1〇〇 μι甲醛中浸泡凝膠1〇分鐘。接著 將其在水中洗滌10秒且添加1〇〇 ml顯影劑（1〇〇 水中之3g碳酸鈉、100μ1甲醛、4〇μ11%硫代硫酸鈉）。在 條帶變得可見後用1 0%乙酸停止顯影。將顯影之凝膠儲存 於MilliQ水中直至需要為止。固藍係自Fisher Bi〇tec (目 錄號FS-100)獲得。在使用之前稀釋固藍（8⑺丨牢性染色 劑（Fast Stain)濃縮液、32 ml MilliQ 水、1〇 mi 45% 甲醇 (含10%乙酸））。首先在含丨〇%乙酸之4〇%甲醇中洗滌凝膠 10至20分鐘’繼而在MilliQ水中沖洗。接著，添加1〇〇 ml 稀釋之固藍且在該溶液中平緩地渦旋凝膠2〇分鐘。用丨〇% 25 201245222 乙酸將凝膠去染10分鐘，接著儲存於MilliQ水中直至需要 為止。 由SDS凝膠估計之洗提份8 ( Apal/MRJP-Ι )之分子量 為6〇kDa，其比所預期之分子量大10kDa(因為SwiSS-pr〇t 傳回僅48·9 kDa之蛋白質大小）°大小差異可由糖基化及/ 或交聯來解釋。MRJP4上三個預測之N連接之糖基化位點 已經報導（Srisuparbh，KHnbunga等人，2〇〇3 )。此等位點之 糖基化將增加分子量。由於洗提份8處於空體積中（意謂 足夠大以由管柱珠粒排除之巨分子首先自管柱洗提 (SUper〇Se 12管柱之空體積為11 ml))，所以此可能指示 Apal/MRJP-i經.高度糖基化及/或交聯，原因在於在48 9 kDa ( Apal/MRJP-i之分子量）下，單體蛋白質應容易地進 入管柱中。 實施例5 :活性蜂蜜蛋白質之MALDI-TOF質譜識別 在 Waikato Mass Spectrometry Facility, University 0f Waikato處完成下文所述之maldI-TOF研究。 5·1製備蛋白質 使用清潔刮刀切下條帶，接著用30%乙醇藉由在60t: 下培月15 5½或直至凝膠塊看似無色為止將其去染以移除 固藍染料〇在3G%乙醇中洗祕帶兩次且接著用刚％乙猜 使其收縮ίο分鐘。藉由抽吸移除乙腈且在Speed Vac中藉 ^真空乾燥凝膠塊30分鐘以移除殘留水分。藉由用胰蛋白胃 酶消化凝膠塊中之蛋白質使凝膠塊中之蛋白f裂解成狀以 用於藉由MALDI-T0F質譜法進行分析。所用方法係改編自 26 201245222 由 Jo McKenzie, University of Waikato 提供之細節。向各凝 膠塊中添加10 μΐ 25 mmol/1碳酸氫録，繼而添加ι〇μι定序 級胰蛋白酶溶液（49 μΐ於10%乙腈中之25 mmol/1碳酸氫 銨、Ιμΐ定序膜蛋白酶（1 mg/nU，Promega目錄號V5 111 ))。 接著在37°C下留置管隔夜。向各管中添加14 μι含ο」％三 氟乙酸之50。/。乙腈且渦旋管並音波處理1 〇分鐘。棄去凝膠 塊且冷凍溶液直至使用為止。 5.2製備基質 所用方法係自 Waikato Mass Spectrometry Facility，

University of Waikato獲得。將5 mg α-氰基-4-羥基肉桂酸 (CHCA)添加至500 μ1含1%三氟乙酸之65〇/〇乙腈中。渦旋 /合液2分鐘，音波處理1 〇分鐘，再渦旋2分鐘，接著以12，〇⑼ rpm離心5分鐘。合併製備之蛋白質消化溶液與基質（2:1) 且將1 μΐ點樣於MALDI Anchor晶片目標板上。空氣乾燥 斑點且接著藉由在乾燥之基質斑點上來回抽吸5 μΐ 1%三氟 乙酸來洗滌並乾燥》 5·3作程序 在分析之前用Bruker Dalt〇nics肽標準品2〇6195進行 外部校正。以土〇.1%之變焦使用單同位素肽校正。在收集到 良好之清楚之圖譜後，自動再校正f譜儀1誤差不大於 土1〇 — ’則擬合結果可接受。若存在由騰蛋白酶自溶產生 ^物，則可進行内部校正。此等產物在842及22ii處產 ^。在^分析程式中將該等峰指定為内部校正物。使 讀er Aut〇flex „ T〇F/T〇F f譜儀分析肽消化物。每種 27 201245222 樣本獲取平均30個截圖（sh〇t )以建構肽質量指紋圖譜。 將質里範圍選擇器設定在低範圍且將偵測器增益電壓偏移 設定在140〇v。偵測配置設定在48〇Da至354〇Da範圍内。 使用flex控制軟體手動操作儀器。保留適合圖譜且輸出至 flex分析中。 5.4分析]MALDI圓譜 可使用Biotools軟體針對多種蛋白質資料庫搜索所收 集之圖譜。較佳使用之資料庫為SWIS Prot及NCBInr。在 S WIS Prot中搜索真核生物蛋白質之參數為士2〇〇 ppm之肽 容許誤差及1個缺失之裂解。對於Swis Pr〇t而言，大於64 分之蛋白質評分為顯著的。在NCBInr中搜索真核生物蛋白 質之參數為1個缺失之裂解及±2〇〇 ppm之肽容許誤差。在 NCBInr中顯著命中所需之蛋白質評分為78分。此等參數為 正確的至J/直至2009年5月為止。可在分子/肽之總分子質 量之0.01%精確度以内量測分子質量。此足以使得較小質量 變化得以偵測，例如一個胺基酸取代為另一胺基酸或轉譯 後修飾。 質量分析器之主要功能在於根據在質譜儀之電離源中 形成之離子的質荷比將其分離或解析。由膜蛋白酶消化產 生之肽係因其質量而藉由電離來分離且此質量可計算出。 偵測器監測離子電A ’將其放大且接著將信號傳送至數據 系統，在數據系統中將其以質譜形式記錄。繪製離子之質 荷比值針對其強度之曲線以展示樣本中之組分數目、各組 刀之分子質量以及樣本中各種組分之相對豐度。當使用 28 201245222 MALDI-TOF識別蛋白質時，连 1f產生之離子須形成具有強峰之 清楚質譜’表明在自SDS電泳凝膠切割之條帶中僅存在一 種蛋白質（至少大量存在）。當樣本中存在一種以上蛋白質 時，典型地不存在與大量相同肽有關之清楚之峰。 5.5活性蛋白質之maldi_t〇f質譜識別 對自如上文所述之SDS電泳凝膠中切下之條帶回收之 蛋白質、來自Sup⑽e 12層析分離之洗提份8及14進行 騰蛋白酶消化以供MALDI_T〇F f譜分析來用於識別。使用 文所it之Autoflex操作程序獲得自sUperose 12層析管柱 分離之洗提份14的肽質量指紋圖譜。如圖7所示之由 MALDI-TOF質譜法產生之質譜提供各狀之分子量且將此輸 入s WIS Prot文庫中並搜索匹配。獲得s WIS pr〇t文庫中騰 蛋白酶肽之分子量的兩個命中/匹配。最顯著之命中/匹配為 蛋白質王漿主蛋白3(MRJP_3)e第二命中王漿主蛋白ι (MRJP-1 )本身不為顯著之匹配，但由於對應於此匹配之質 譜峰不同於促成MRJP-3匹配之峰，所以其極可能存在於樣 本中。 對自Superose 12層析管柱分離之洗提份8亦進行相同 程序。如圖6所示之洗提份8中之肽之MALDI質譜提供質 3香之一個顯著命中，即針對MRJP-1之匹配。 實施例6 :在MGO存在下培育蜂蜜 培育麥盧卡蜂蜜及非麥盧卡蜂蜜。基於麥盧卡蜂蜜之 初始高MG0含量及低螢光值來選擇其用於培育。基於非麥 盧卡蜂蜜之低螢光值及缺乏MGO來選擇其。培育蜂蜜三個 29 201245222 月’期間追蹤螢光讀數。經培育之各蜂蜜亦具有經冷滚以 維持原始品質之樣本。分析經培育之蜂蜜及冷凍蜂蜜對吞 噬作用之抑制且對其進行小型凝膠SDS電泳以測定因培育 所致之任何蛋白質大小改變。亦對具有高螢光值之麥盧= 蜂蜜及具有低登光值之麥盧卡蜂蜜進行SDS電泳以比較經 培育之蜂蜜與未經培育之蜂蜜。將整個貧稽蜜及蜜場蜂蜜 與MGO -起或不與MG〇 一起在抓下培育三個月以確定 MGO之存在是否隨時間推移在無螢光蜂蜜中產生螢光且增 強吞嗤作用抑制活性。先前已分析蜂蜜之吞喧作用抑制^ 性且其具有低活性。使蜂蜜在SDS小型凝膠上進行電泳以 確定因培育所致之任何蛋白質大小改變。在吞樓作用分析 法中分析經MGO處理之蜂蜜以確定培育對吞嗤作用抑制活 性有何種影響。甲基乙二駿（4G%)係、購自以㈣韻⑽ (目錄號M0252 )且以與15之非過氧化物抗細菌活性 之最終濃度使用（每公克蜂f約· Μ或每公 40%MGO)。 $ ml 6·1蜂蜜培育 在37t下培育整個麥盧卡蜂蜜（2〇 g籠2〇，峨 2〇+)、f場蜂蜜（2〇g)及苜稽蜜（2〇g)三個月。亦在3代 下培育用4〇〇_刪（混合入f卷蜜中）處理之首稽蜜 (20 g)三個月。冷凍所有绦 术/Γ頁峄蜜（20 g)之對照樣本該持續 :間。在添加卿後立即量測蜂蜜之勞光，且在添加至蜂 :中之濃度下’未發現因添加之勵而使榮光增強 蜂蜜六週及三個月後，量測螢光。 30 201245222 6.2經培育蜂蜜之sds凝膠電泳 使上文所述之蜂蜜樣本在12% SDS小型凝膠（如上文 所述製備及操作）上進行電泳。為比較，亦包括具有高登 光值之麥盧卡蜂蜜及具有低螢光值之麥盧卡蜂蜜。將蜂蜜 稀釋至1〇%。將欲加載至凝膠上之樣本與2χ三（羥甲基）甲 基甘胺酸樣本緩衝液1:1混合且在99t：下加熱5分鐘，接著 V "P之後加載。在染色之前，在UV凝膠照明器上使凝膠 成像以觀測蛋白質條帶之螢A (此帛光在染色後不可見）。 SDS小型凝膠經銀染色。 I表2展示所選蜂蜜在37°C下與天然MGO含量（麥盧 卡蜂蜜）或添加之4〇〇 mg/kg MG〇 (蜜場蜂蜜及苜稽蜜） =起培育三個月之前、期間及之後的螢光量測結果。在對 二^在4C下保持二個月之麥盧卡蜂蜜（具有高天然mG〇 3量））及在4C下與400 mg/kg MGO —起保持三個月之蜜 场蜂蜜及苜蓿冑’或在4°C下在未添加MGO下保持三個月 的蜂蜜（蜜場蜂蜜及苜蓿蜜）中，不存在登光增強（結果 未示）。 表2 蜂蜜 培育之前的螢 光值 培育6週之後的 螢光值 培育3個月之後 的螢光值

表2·蜂蜜與所示含量

之天然或添加之MGO —起在37°C 31 201245222 下培月之月丨J、培育6週之絲；S . . 取之後及培育3個月之後的螢光量測 結果（以任意单位舍本 ；参盧卡蜂蜜具有天然之MGO含 量，而蜜場蜂蜜及苜蓿蜜中添加有MCK)。 6.3經培育之蜂蜜的SDS電泳凝膠影像 與MG〇 一起培育之蜂蜜的電泳結果展示於圖9及10 中。圖9展t猜t與麥盧卡蜂蜜之間主要蛋自質（6〇咖 至65 kDa)的大小差異。圖1〇展示將蜂蜜與mg〇 一起培 育可增加兩種蜂蜜類型中之主要蛋白質的大小（增加約5 kDa 至 10 kDa)。 如上文所詳細描述，使用活性導引（activity _led )份化 來分離麥盧卡蜂蜜樣本之組分。本發明者發現麥盧卡蜂蜜 中具有呑噬作用抑制活性之分離組分具螢光。在將蜂蜜分 離成洗提份之各階段，藉由在約490 nm下量測組分之螢光 來測試各洗提份以量測其中存在呑噬作用抑制活性之程 度。如自圖la可見’發射波長介於45〇 ηιη與550 nm之間。 在透析麥盧卡蜂蜜之後發現活性存在於透析保留物中，該 透析保留物為含有分子量大於3.5 kDa之組分的洗提份，活 性而非存在於透析滲出液中，該透析渗出液為含有分子量 小於3.5 kDa之組分的洗提份。主要在視作洗提跡線上之第 一峰之洗提份（洗提份8)中發現吞噬作用抑制活性，該洗 提份以大於管柱空體積之體積洗提。在視作洗提跡線上之 第二峰之洗提份中發現少量活性》接著使自Super〇se 12管 柱洗提之第一及第二峰中之麥盧卡蜂蜜洗提份經 SDS-ΡΑΘΕ (存在有十二烧基硫酸納之聚丙稀醢胺凝膠電 32 201245222 泳）進行電泳。銀染色展示存在—個條帶。自㈣之未染 色部分切下凝膠之相應部分且用胰蛋白酶消化蛋白質且經 MALDI-TOF MS (基質辅助雷射脫附飛行時間式質譜）操作 由此獲得之肽。將肽之質量與Swiss_Pr〇t資料庫中之資料相 比較且發現來自SUper〇se 12層析之第一峰中之蛋白質與主 要蜂王漿蛋白-1 (亦稱為王漿主蛋白才目匹配，且來自 SUP_e 12層析之第-峰中之蛋白質與主要蜂王聚蛋白_3 (亦稱為王漿主蛋白_3 )相匹配。 在已藉由活性導引份化發現Apal或MRjpq蛋白質為 負責抗發炎活性之组分，且已知其他蜂蜜存在主要蜂王漿 蛋白的情況下，進行進一步研究以確定麥盧卡蜂蜜中高含 量之MG〇的存在是否修飾Apal/MJRP蛋白質。發現麥盧 卡蜂蜜具有高榮光’在其他蜂蜜類型中未見到相同程度之 螢光且此螢光係歸因於蜂蜜中修飾蛋白質之mg〇。在不希 望觉任何特定理論限制的情況下，作為麥盧卡蜂蜜之獨特 特徵之冋έ里之MGO被認為可引起Apal/MRJp蛋白質糖 基化形成晚期糖基化終產物（AGE)，該等晚期糖基化終產 物具螢光，如Schmitt等人，乂⑽〜心以2〇〇5 所報導。本發明者發現將蜂蜜與MG〇 一起培育會使得發射 波長與當將牛血清白蛋白與MG〇 一起培育時牛血清白蛋白 中所產生之螢光相同的螢光增強。進一步分析展示抗發炎 活性亦因此處理而增強。在蜂f樣本之螢光與抗發炎活性 之間發現相關性，如圖2所示。用MG0處理亦可增加 Apal/MRJP蛋白質之分子量（經伽電泳），增加之分子量 33 201245222 之條帶具螢光’如圖8及10所示。 經MGO修飾之王漿主蛋白的使用方法 組織中之炎症可藉由投予發炎組織一或多種純化之經 MGO修飾之王漿主蛋白多肽或含經MG〇修飾之王聚主蛋 白之組成物來減輕。 經MGO修飾之王衆主蛋白藉由降低免疫細 率，且藉由阻斷免疫細胞上引起吞喧作用之甘露糖受體來 減輕組織中之炎症。免疫細胞包括巨喔細胞、單核細胞、 樹突狀細胞及粒細胞。 經腦〇修飾之王聚主蛋白可以各種不同形式投予發炎 組織，包括已自其他組分純化之經MG〇修飾之王聚主蛋 白，及處於含有一或多種其他類型化合物（諸如醫藥學上 可接受之載劑、佐劑或治療性分子）之組成物中的經励 =飾之王漿主蛋白。經MG〇修飾之王漿主蛋白可自活性麥 f卡蜂蜜中純化，或自已添加有聰或mg〇前驅體來修 *王漿主蛋白之麥盧卡蜂蜜或任何其他類型之蜂蜜中純 :，或其可自蜂王聚或重組表現王衆主蛋白且接著將其用 MGO處理之系統中純化。 含有-或多種其他類型化合物之組成物令之經副修 =漿主蛋白包括經MG0修飾之王衆主蛋白已增漠之蜂 或蜂蜜提取物中之經MG〇修飾之王毁主蛋白，以及與王 取^白重組產生及用MG〇化學修飾王製主蛋白有關之提 取物中之經MGO修飾之王漿主蛋白。 純化之經MGO修飾之王难Φ> I钟之王朵主蛋白或含有經MGO修飾 34 201245222 之王浆主蛋白1之組成物可以各種不同形式投予發炎組 織’包括（但不限於）：乳膏劑、洗劑、㈣溶液或泥晏劑。 經MGO修飾之王聚主蛋白亦可藉由將經修飾之王级 主蛋白納人可食用產品中來㈣發炎組織。該等產品包括 (但不限於）：飲料、糖果、糖聚、***旋、藥丸及食物。 偵測經職修飾之王漿主蛋白及特性化蜂蜜之 方法 蜂蜜樣本之抗發炎能力可經由伯測經M G 〇修飾之王漿 主蛋白來確定。Apal經MG〇之化學修倚產生經副修餅 之Apal ’其所展現之螢光大於未經MGO修飾之Apal。由 於Apal存在於蜂蜜中，所以藉由量測蜂蜜樣本之螢光，可 獲得蜂蜜樣本中經刪修飾之Apal之相對濃度的量測結 果。蜂蜜樣本中經MG0_之Apal濃度之量測結果直接 與蜂蜜樣本之抗發炎能力有關。目2描緣螢光及由此所得 之經励修飾之Apal含量與吞嗟細胞抑制能力之間的相 關性。 藉由量測具有已知低濃度之經臟修飾之王聚主蛋白 (諸如A”1)之蜂蜜樣本的營光以及具有已知高濃度之經 MGO修飾之Apal之蜂f樣本的營光，可產生標準尺度， 該標準尺度使蜂蜜樣本之螢光與該蜂蜜樣本中之經腦〇修 飾之Apa 1濃度具相關性。為獲得可用於螢光測試及標準尺 度生成之含有已知之經_修飾之Apai濃度之蜂蜜樣 本，可藉由標準分析化學技術（諸如f譜分析）測定蜂蜜 樣本之經MGO修飾之Apal濃度。 35 201245222 在產生使蜂蜜樣本之螢光與蜂蜜樣本中之經MGO修飾 之Apal漠度具相關性之標準尺度後，可使用該標準尺度以 及對蜂蜜樣本之螢光測試來產生適用於蜂蜜製備及分析之 各種類型之資訊。 舉例而言，可量測經MG〇修飾之Apal濃度未知之蜂 蜜樣本的螢光，且基於螢光量測結果及標準尺度，可確定 測試蜂蜜樣本中經MGO修飾之Apal的濃度。測定蜂蜜樣 本中經MGO修飾之Apal之濃度的螢光法相較於其他分析 化學技術（諸如質譜分析）成本低得多且快得多。藉由以 此方式量測蜂蜜樣本中經MG〇修飾之Apal的濃度，亦快 速測定蜂蜜樣本之抗發炎能力。 由於尚MGO濃度為麥盧卡蜂蜜在所有蜂蜜品種中所獨 有之特徵，所以蜂蜜生產者可藉由將MG〇添加至天然不含 所需濃度之MGO之蜂蜜樣本中來試圖模擬活性麥盧卡蜂 蜜。消費者相較於經處理之蜂蜜而更喜歡天然產生之蜂 蜜。純化之活性MGO可輕易自商業化學物質生產商（例如

Sigma-Alddch，St· Louis，MO出售約40%曱基乙二醛之水溶 液）獲得，且蜂蜜生產者可將MG〇添加至天然不含所需濃 度之MGO的蜂蜜樣本中以提高蜂蜜樣本中之mg〇濃度達 所需水準。「與天然蜂蜜形成無關之製程」包括不由蜜蜂進 行之任何活動’且其因此包括諸如將純化之MGO添加至蜂 蜜樣本中之活動。「與天然蜂蜜形成無關之製程」不包括諸 如在蜂蜜產生過程中蜜蜂收集含有高含量《或 前驅分子之花蜜、花粉或其他植物產物的活動。 36 201245222 蜂蜜之螢光亦可用於確 集之蜂蜜以獲得具有所需抗發炎性質之蜂：紫或儲存所收 由於蜂蜜中王衆主蛋白經MGO之修 ：田時機 行，所以蜂蜜生產者可選堪脾格 疋時段内進 者了選擇將蜂蜜保持於蜂房中首s炊八 有所需抗發炎能力及所需濃度之經 ^至/、3 為止。藉由以不同時間間隔晋…修飾之王漿主蛋白 光，蜂蜜生產者可制蜂§ 樣本之螢 收集蜂蜜以獲得在蜂蜜中為確定自蜂房 蜂箠中具有所需抗發炎性質之蜂密之爭 佳時板的方法同樣’蜂f生產者亦可量測儲存在蜂房外 之蜂蜜的榮光’以確定該蜂f樣本是否具有所需水準之抗 發炎性質。藉由量測蜂蜜樣本之榮光，設法獲得含有所需 抗發炎能力之蜂蜜樣本的蜂蜜生產者可儲存蜂蜜直至 形成經MGO修飾之王喈φA L ’、 “ …桌主蛋白而產生所需水準之抗發炎能 力為止。 用MGO修飾蜂王漿及評估所得分子量變化 獲取蜂王漿且藉由MALDI_T〇F使用芬子酸作為基質 且以正離子模式進行分析。在約52 4心之_處識別出 -個顯著峰。此峰符合自先前識別為主要蜂王渡蛋白之逆 相分離之洗提份獲得的52 4 kDa2 m/z。 分析型RP HPLC方案係在具有Phenomenex SecudtyGuard C_18 保護管柱之 phen〇menex pr〇te〇9〇 管柱 C 3μ 9〇 A ’ C18 ’ 250χ4·06 mm)上進行。用緩衝液 a : 〇.1% TFA之奈米純水溶液（流速1毫升/分鐘）平衡管柱。如下 施加緩衝液B (合有〇] % TFA之】〇〇〇/。乙腈）之梯度且在 37 201245222 214 nm下監測吸光度（表1 )。 接著使蜂王漿與0.1%、0.5%及1.0%之甲基乙二路反 應。藉由以10 mg/mL之濃度將部分解凍之製劑溶解於pBS 中來製備蜂王漿蛋白質溶液。藉由用PBS稀釋儲備溶液 (Sigma ’ 40%)以達成0.1%、0.5%及1〇%範圍内之最終濃 度來製備MGO溶液。向900 gL蛋白質溶液中添加100 具有所需濃度之MGO溶液且在60°C下培育混合物隔夜。亦 藉由MALDI TOF MS研究所得反應產物。使用MALDI TOF 1^8’在0.5%及1.00/〇1^00反應產物中僅觀測到一個顯著 峰，其為約55_1 kDa之經修飾之MRJP1主要蛋白質。在〇.1% MGO反應中，自MALDI-TOF圖譜中清楚的是，不僅存在 未衍生化之蛋白質且亦存在經修飾之MRJP-1主要蛋白 質。此表明該MGO含量不足以與MRJP-1完成反應。m/z 自52.4 kDa移位至55.1 kDa可被認為是基於在Arg上添加 造成72.07 Da加合物之單個MGO而產生衍生自甲基乙二齡 之二羥基咪唑啶（MG DH )，及衍生自曱基乙二醛之氫化咪 唑酮（MG-HI )之70_05的質量移位。與離胺酸反應形成 CEL，其中CEL引起72.07之質量移位（(羧曱基）離胺 酸），且形成MOLD (曱基乙二酿離胺酸二聚體），MOLD 引起180.25 Da之增加。其他精胺酸修飾及其質量改變為己 酸2 -敍基-6-([2-[(4 -銨基-5-氧離子基-5 -側氧基戊基）胺 基]-4-甲基-4,5-二氫-1H-咪唑-5-亞基]胺基）（MODIC )(增 加166.23 Da)、四氫嘧啶（THP )(使質量改變160.18 Da) 及精胺酸嘧啶（質量改變80.09 )。參見Brock等人，Detection 38 201245222 and identification of arginine modifications on methylglyoxal-modified ribonuclease by mass spectrometric analysis，J. Maw «Specirom. 2007; 42: 89-100，在 Wiley InterScience中於2006年12月4日線上發表。 表3 :與MGO修飾有關之分子量變化 MGO修飾 質量變化 MGDH 72.07 MGHI 70.05 CEL 72.07 MOLD 180.25 MODIC 166.23 THP 160.18 精胺酸0¾咬 80.09 由於可能有多種加合物且各自形成之可能性不同，所 以使用82之平均數來確定MRJP1上MGO修飾之相對程 度。在產生部分反應之MRJP 1蛋白質之0.1% MGO的狀況 下，相較於未反應之MRJP1，質量單位之差異為1422.0 Da， 其為MRJP1上形成之約17個MGO加合物所致。在0.5% 及1.0% MGO反應產物的狀況下，質量單位之差異可見於 下表4中。0.5%及1.0%]^00皆產生形成於]\411汗1上之約 31至32個MGO加合物。亦值得注意的是，MRJP1上存在 最多39個可由MGO形成加合物之位點（不包括Cys殘基）。 存在22個精胺酸位點及17個離胺酸位點。結果提示約82% 之可能之MGO加合物形成位點經MGO修飾。由於0.5%及 1.0% MGO實質上等效地與MRJP1反應，如圖11中所示， 所以有可能得出結論，即反應完成。此外，值得注意的是 麥盧卡蜂蜜中 MGO之天然含之趨於積聚至約0.4%至 39 201245222 0.5%。接著藉由DCFDA分析法（下文詳述）進一步確定， 0.5%及1% MGO反應產物之生物活性相較於對照組具統計 顯著性，而0.1 % MGO反應產物不具統計顯著性-參見圖 12。此表明為了觀測到經修飾之MRJP 1反應產物之活性， 需要存在至少1 7個MGO位點修飾。 表4 : MRJP1 單獨 MRJP1 及 0.1% MGO MRJP1 及 0.5% MGO MRJP1 及 1.0% MGO 因MGO修飾所致之分 子量差異（質量車位） 0 1422.0 2589.8 2605.1 基於添加82道爾頓加 合物之MGO修飾數目 0 17.3 31.6 31.8 DCFDA ROS活性分析法 細胞在需氧代謝期間常常產生反應性氧物質（ROS )。 ROS產生在免疫系統中發揮重要保護及功能作用。細胞具 有有效之抗氧化防禦系統以對抗ROS過度產生。當ROS產 生壓製細胞天然抗氧化防禦時細胞出現氧化性應激。認為 ROS及氧化性損傷在許多人類疾病中起重要作用，包括癌 症、動脈粥樣硬化、其他神經退化性疾病及糖尿病❶因此， 確定其準確作用需要能夠準確地量測ROS及其引起之氧化 性損傷。存在許多量測細胞中自由基產生的方法。ROS產 生主要引起發炎反應。最直接之技術使用細胞滲透性螢光 及化學發光探針。二乙酸2'-7i-二氯二氫螢光素（DCFDA ) 氧化為一種最廣泛用於直接量測細胞之氧化還原狀態之技 術。其與所研發之其他技術相比具有若干優點。其極易於 使用，對細胞氧化還原狀態之改變極靈敏，成本低且可用 40 201245222 於追縱ROS g夺間推移之變化。反應性氧物質r〇s產生之 DCFDA分析法為細胞中之發炎反應的指示性量度，其被研 ^作為上文所述之吞嗤作用測試的替代生物活性測試。藉 由將90叫碌酸鹽緩衝鹽水（pBS) & Μ#細胞連同相關 樣本起一式二份置於96孔培養盤中，繼而添加5〇 DCFDA溶液來準備分析。藉由將3mgDCFDA溶解於丨爪匕

DMSO中來製備DCFDA。接著將1〇〇 DMSO溶液與1〇 mL PBS混合。使用螢光在SpectraMax M4培養盤讀取器中使用 Ex 473 nm及Em 520 nm監測DCFDA向螢光素之氧化。在 第〇分鐘、第2分鐘、第5分鐘及第丨〇分鐘監測分析。使 用動力學分析進行初始分析，其中在細胞存在及不存在下 母10 #量測一次並持續5分鐘。使用初始培養盤確定需要 夕少細胞及欲使用之樣本體積。整個96孔培養盤範圍内之 平均標準誤差僅為5%。藉由使用多注式吸液管，吾人能夠 確保在10分鐘内處理整個分析培養盤。此快速處理為分析 產生之樣本及對樣本進行分析導引型份化以試圖識別相關 蛋白質及肽所必需。使用1 〇 KL細胞之DCFDA分析法之動 力學分析展示於圖13中。 用LPS及1 μηι球體活化羊脾細胞看似並非必要的，這 是因為樣本在不使用無菌技術下製備且直接使用。如圖1 所示’ DCFDA之線性氧化僅在細胞存在下獲得且DCFDA 看似對所用條件具穩定性。 製備用於DCFDA ROS活性分析之細胞 自當地屠宰場（Taylor Preston Wellington )獲得整個新 41 201245222 鮮脾臟。典型地在獲取！小時内獲得細胞，但在代下儲存 24小時之後亦處理脾細胞。縱向地將脾臟切片，切口之間 存在間隙，且接著使用凝膠刮刀自脾中刮下紅細胞圓 塊。將細胞與200 mLPBS混合且接著用手動換合器短暫均 質化以將細胞團塊驅散成個別細胞。接著將混合物傾注穿 過4層細布。隨後在4它下儲存細胞直至使用為止。 離胺酸殘基之意義

乙醯化選擇性阻斷離胺酸殘基❶將12814g解凍之Rjp 混合物溶解於50mL含有6M尿素之Tris/HCi (〇」M , pH 8.5)中。在冰水浴槽上冷卻溶液。經2小時時段每2〇分鐘 以0.5 ml等分試樣添加乙酸酐一次。在每次添加之前測定 溶液之pH值且使用Tris/HCl緩衝液（！ M，pH 8 5 )調節 至咼於7.5之pH值。接著，將樣本轉移至透析管（分子量 截留10 kDa)中且針對1<6公升水透析隔夜，其中更換滲 析液三次。冷凍透析管之内含物且冷凍乾燥。回收239 9 mg 白色微黏物質。在MGO處理之後在DCFDA分析中發現乙 醯化樣本不再具有活性。此表明離胺酸殘基之MG〇修飾對 由經修飾MRJP表現之功能活性而言必不可少。

Lys C消化：使用下列方案水解蜂王漿樣本。將 C溶解於100 pL碳酸銨（pH 8.4)中。將10 Lys c儲備 溶液直接添加至100 pg MRJP提取物（100 中。在室溫 下進行反應72小時。接著將樣本與芬子酸溶液1:1混合且 將1 μί —式兩份點樣於MALDIT〇F 384孔培養盤上。使用 Applied Biosystems V〇yager 5800 分析肽以測定質量及 42 201245222 MSMS圖譜。藉由質譜分析研究來自使用〇 1〇/。、〇 5〇/。及1 〇% MGO修飾之Lys c提取物且ms曲線圖展示於圖15至19 中。在MGO修飾MRJP 1後自Lys C提取物識別出較大峰 及較多峰。亦應觀測到，MGO濃度愈高，所觀測到之較大 峰之數目愈大。此等Lys C結果表明在MRJP1上之各個Lys 殘基上存在多處修飾。 MRJP 1及經MG〇修飾之MRJp丨的胰蛋白酶離心管柱 水解.使用Sigma胰蛋白酶離心管柱（TT0010)使用製造 商說月書對蜂王製樣本（1〇 mg/mL )進行胰蛋白酶水解。 在室溫下進行水解3〇分鐘，其中使MRJp( 1〇〇盹）通過碳 酸氫銨緩衝液兩次。亦在6(rc下使MRJp與〇 1%、〇5%及 1 ·〇 /。濃度之MGO反應隔夜。亦在與對於原生酶所述之條件 相同的條件下對經MG〇修飾，之MRJp進行胰蛋白酶水解。 亦測试經MGO修飾之MRJP樣本降低DCFDA氧化速率的 能力。兩個較高濃度經展示具高度活性。在經〇 ι%以⑻ 處理之樣本中觀測到較低量之活性。 藉由質譜分析研究經MGO(0.1%、〇·5%及1.0%)修部 之胰蛋白酶消化物且MS曲線圖展示於圖21至23中。未經 修飾之胰蛋白酶消化物之Ms曲線圖展示於圖2〇 之序列覆蓋廣泛且當在其天然狀態下水解蛋白質時偵測到 許多小片段。然而，當MG0修飾存在於MRJpi上各個^ 及Arg殘基上時，可形成多達六種不同加合物且基於加合 物之疋位位置產生之組合數目可產生更多肽。修飾亦阻斷 胰蛋白酶之裂解位點，因此此減少產生之狀的可能數目。 43 201245222 觀測到較大數目之較大肽由於某些位點因Lys及Arg殘基 之修飾而不能被裂解。對於經MG0處理之MRJpl觀測到 較大數目之肽《此符合Lys及Arg殘基之預期隨機活性及 不同位置上提供相關活性物質之多個加合物產生之可能 性。 用各種酶（包括胰蛋白酶）對MRJp提取物進行水解且 對消化物進行MG0修飾。發現所得水解提取物在DCFda 分析法中具有良好活性（結果未示）。 用替代試劑修飾未經處理之Rjp 亦研究與蛋白質交聯之多種其他化合物（包括乙二醛 及戊二醛）以確定使用此等試劑是否可產生相似程度之抗 呑噬作用活性。 用已知與肽及蛋白質交聯之其他試劑處理未經處理之 MRJP。此等試劑包括乙二醛、戊二醛及甲醛。使用PBS配 製乙二醛溶液達10 mg/mL之最終濃度。使用PBS分別2 5 倍及3.7倍稀釋戊二醛（25%)及曱醛（37%)之儲備溶液， 知到10°/。之最終濃度。將5〇〇 μΐ之此等試劑溶液添加至4 $ ml RJP溶液（1〇 mg/mL)中且在6〇。〇下培育隔夜。 亦如下使RJP與葡萄糖及果糖反應。向4·5 m丨於pBs 中之蛋白質溶液（1〇 mg/mL)中添加5〇〇 於pbs中之各 別碳水化合物溶液（1 〇 mg/mL )且在60〇c下培育混合物隔 夜。在PBS中以10 mg/mL製備MRJP且在6〇艽下用下列試 劑修飾隔夜：1)乙二醛；2)葡萄糖（10〇/〇, 2 mL，1〇mg/mL， 19.7+1.97)，3)果糖（1〇%，2 mL，10 mg/mL，24.1+2.41); 44 201245222 4 )戍^一 駿（2 5 % ’ 稀釋 2·5χ2 mL ’ 800 微升+12 mLPBS); 5) MG〇 (40% ’ 稀釋 4x2 mL，500 微升+ i 5 niL PBS) ·及 未經處理之空白。在DCFDA分析法中針對R〇s產生測試

樣本且結果展示於圖14中。當用MGO或戊二酿修飾mr JP 時觀測到統計顯著性結果。當使用葡萄糖或果糖作為交聯 劑時未觀測到活性。此表明抗吞噬作用活性直接與交聯劑 形成共價鍵之能力有關。在1:1000稀釋樣本以抵消初始樣 本中可能存在之任何自由MGO的情況下，觀測到此活性。 此部分中所述之MALDI-TOF研究在university 〇f

Victoria Mass Spectrometry Facility, Wellington, New Zealand處完成。 已詳細描述本發明及其具體實例。然而，本發明範圍 不欲受限於本說明書中所述之任何製程、製造、物質組成 物、化合物、構件、方法及/或步驟之特定具體實例。可對 所揭示之物質進行各種修改、替換及變化而不背離本發明 之精神及/或基本特徵。因此，一般技術者將容易地自本發 明瞭解到與本文所述之具體實例發揮實質上相同功能或達 成實質上相同結果的稍後之修改、替換及/或變化可根據本 發月之s玄等相關具體實例加以利用。因此，以下申請專利 範圍意欲在其範圍内涵蓋對本文揭示之製程、製造、物質 ’且成物、化合物、構件、方法及/或步驟的修改、替換及變 化。 參考文獻 K. Kohno, I. Okamoto, O. Sano, N. Arai, K. Iwaki, M. 45 201245222

Ikeda 及 M. Kurimoto， 「Royal Jelly Inhibits the Production of Proinflammatory Cytokines by Activated Macrophages」， Sz.ojcz·· 68 (1)，2004，第 138-145 頁。

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Detection and identification of arginine modifications on methylglyoxal-modified ribonuclease by mass spectrometric analysis. ·/· Maw 2007; 42:89-100 o 【圖式簡單說明】 圖1描繪（a) 10%具有高螢光之麥盧卡蜂蜜溶液的螢 47 201245222 光發射光譜，及（b)藉由將10mg/ml牛血清白蛋白水溶液 與400 pg/ml MGO —起培育所製備的經MG〇修飾之牛血清 白蛋白溶液的螢光發射光譜。 圖2描繪許多蜂蜜樣本之吞噬抑制作用（piA )對比螢 光的圖》 圖3展示麥盧卡蜂蜜之透析保留物在18〇mlG 5〇葡聚 糖凝膠管柱上之層析洗提。洗提份量為1 ml。 囷4展示自圖3中所示之G_5〇葡聚糖凝膠層析獲得之 洗提份8、丨4及23的吞喔作用·抑制活性。結果展示相較於 未經處理之對照組得到的吞嗤作用降低。/^誤差槓展示至少 三次分析之平均值個SD。洗提份23因其幾乎不含/不含 蛋白質而納入作為對照物。 圓5展示來自葡聚糖凝膠G_5〇層析之洗提份4至 在25 ml Superose i2 FPLC管柱上層析之洗提特徵。洗提份 量為1 ml。 圓6展示藉由胰登白酶湞仆w e 柯街狀赏曰邶/月化M Super〇se 12層析管桎八 離之洗提份8所獲之肽的質譜。 刀 圓7展示藉由胰签白酶消仆e 田哄赏曰岬，月化u Super〇se 12層析管 離之洗提份14所獲之肽的質譜。 刀 圊8展示用來自superose 12 a祕答a +, …… 層析管柱之洗提份進行銀 朵色之SDS電泳凝膠操作之影像。 圖9展示未經處理之麥盧卡蜂蜜及首#蜜在 的銀染色SDS電泳凝膠（一式兩份）。 刖 圖10展示蜜場蜂蜜在3個月培育後（泳道。及在典 48 201245222 育之前（泳道2)的銀染色SDS電泳凝膠以及麥盧卡蜂蜜 在3個月培育後（泳道3)及在培育之前（泳道4)的銀染 色SDS電泳凝膠。 圖11展示在不同濃度之MGO下MRJP 1由MGO修飾 所致之質量變化（以道爾頓計）。 圖12展示在不同濃度之MGO下MRJP 1由MGO修飾 所達成之DFCDA生物分析結果。 圖13展示使用10 μί細胞進行DCFDA分析之動力學 分析曲線圖。 圖14展示藉由使用MGO、果糖、戊二醛及葡萄糖修飾 MRJP 1所達成之DFCDA生物分析結果。 圖15展示MRJP之Lys C消化之MS。 圖16展示經0.1% MGO修飾之MRJP之Lys C消化的 MS。 圖17展示經0.5% MGO修飾之MRJP之Lys C消化的 MS。 圓18展示經1.0% MGO修飾之MRJP之Lys C消化的 MS。 圖19展示圖15至19中所示之Lys C消化之MS曲線 的重疊圖。 圖20展示識別為源自未經MGO修飾之MRJP提取物 之MRJP 1 -胰蛋白酶消化物的峰。 圖21展示識別為源自經0.1% MGO修飾之MRJP提取 物之MRJP 1 -胰蛋白酶消化物的峰。 49 201245222 圖22展示識別為源自經0.5% MGO修飾之MRJP提取 物之MRJP1-胰蛋白酶消化物的MS峰。 圖23展示識別為源自經1 % MGO修飾之MRJP提取物 之MRJP1-胰蛋白酶消化物的MS峰。 【主要元件符號說明】 無 50 201245222 序列表 <110>曼努卡米德有限公司 阿嬡達比恩 <120>抗發炎蛋白與製備及使用其之方法 <130> 251 W01 <150> NZ 590143 <151> 2010-12-22 <160> 5 <170> Patentln 3.5 版 <210> 1 <211> 432 PRT 西方蜜蜂 <212> <213> 二H匕主要蜂王萊蛋白1 <22 2> (1)..(432) <400> 1

Met Thr Arq Leu Phe Met Leu vaT cys Leu Gly lie val Cys Gin Gly 1 5 10 15

Th「 Th「 Gly Asn lie Leu Arg Gly Glu Ser Leu Asn Lys Ser Leu Pro 20 25 30 lie Leu His Glu rrp Lys Phe Phe Asp Tyr Asp Phe Gly Ser Asp Glu 35 40 45

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Gly Ala lie val Arg Glu Asn Ser Pro Arg Asn Leu Glu LVS Ser Leu 20 25 Asn val lie His Glu Trp Lys Tyr Phe Asp Tyr Asp Phe Gly Ser Glu 35 40 45 Glu A「g A「g Gin Ala Ala lie Gin se「Gly Glu yyr ASP His Tfi「Lys 50 55 〇〇 Tyr Pro Phe Asp Asp Gin τι-p Arg Lys Thr Phe Val 益「

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Gin Ala His His Ser Ser Lys ser Asn Asn Arg His Asn Asn Asn Asp 450 455 460 201245222 <210> 5 <211>* 598 <212> PRT <213> 西方蜜蜂 <221>主要蜂王漿蛋白5 <222> (1)…（59S〕 <400> 5

Met Thr Thr Trp Leu Leu Leu val val Cys Leu Gly lie Ala Cys Gin 15 10 15

Leu Ala

Gly lie Thr ser val Thr val Arg Glu ash ser Pro Arg 20 25

Asn Ser Met Asn val lie His Glu Trp Lys Tyr Leu Asp Tyr Asp Phe 35 40 45

Gly Ser Asp Glu Arg A「g Gin Ala Ala Met Gin ser Gly Glu Tyr Asp 50 55 60

His Thr Lys Asn Tyr Pro Phe Asp val Asp Gin Trp Arg Gly Men Thr 65 70 75 80

Phe val Thr Val Pro Arg Tyr Lys Gly val 户ro Ser Ser Leu Asn val 85 90 95 lie Ser Glu Lys He Gly Asn Gly Gly Arg Leu Leu Gin pro Tyr Pro 100 105 110 asp Trp ser Trp Ala Asn Tyr Lys Asp Cys ser Gly lie Val ser Ala 115 120 125

Tyr Lys lie Ala lie Asp Lys Phe Asp Arg Leu Trp lie Leu Asp ser 130 1B5 140

Gly lie lie Asn Asn Thr Gin Pro Met Cys Ser Pro Lys Leu His val 145 150 155 160

Phe Asp Leu Asn Thr ser His Gin Leu Lys Gin val val Met Pro His 165 170 175 asp He Ala val Asn Ala Ser Thr Gly Asn Gly Gly Leu vaj Ser Leu val val Gin Ala Met Asp Pro val Asn Thr lie val Tyr Met Ala Asp 195 200 205

Asp Lys Gly Asp.Ala Leu lie va"l Tyr Gin Asn Ser Asp Glu Ser Phe 210 215 220 201245222

His Arg Leu Thr Ser Asn Thr Phe Asp Tyr Asp Pro Lys Tyr lie Lys 225 230 235 240

Met Met Asp Ala Gly Glu Ser phe Thr Ala Gin Asp Gly He Phe Gly 245 250 255

Met Ala Leu Ser Pro Met Thr Asn Asn Leu 丁yr Ty广 Ser Pro Leu Ser 260 265 270

Ser Arg Ser Leu Tyr Tyr val Asn Thr Lys Pro Phe Met Lys Ser Glu 275 280 285

Tyr Gly Ala Asn Asn val Gin Tyr Gin dy val fJn ASp lie Phe Asn

Thr Glu Ser lie Ala Lys lie Met ser Lys Asn Gly val Leu Phe Phe 305 310 315 320

Gly.Leu Met Asn Asn Ser Ala lie Gly C^s Trp Asn Glu His Gin Pro

Leu Gin Arg Glu Asn Met Asp Met val Ala Gin Asn Glu Gig 丁hr Leu 340 345 350

Girt Thr val val Ala Met Lys Met Met His Leu Pro Gin Ser Asn Lys 355 360 365

Met Asn Arg Met His Arg Met Asn Arg val A$n Arg val Asn Arg Met 370 375 380

Asp Arg Met Asp Arg lie Asp Arg Met Asp Arg Met Asp Arg Met Asp 385 390 395 400

Thr Met Asp 丁hr Met Asp Arg lie Asp Arg Met Asp Arg Met Asp Arg 405 410 415 lie Asp lie Asp Arg Met His Thr Met Asp Th「 Met Asp Th「 Met 420 42S 430

Asp Arg Thr Asp Lys Met Ser ser Met Asp Arg Met Asp Arg Met Asp 435 440 445

Arg val Asp Arg Met Asp Thr Met Asp Arg 丁hr Asp Lys Met Ser ser 450 455 460

Met Asp Arg Met Asp Arg Met Asp Arg val Asp Thr Met Asp Thr Met 465 470 475 480 aso Thr Met asd Arg Met Asp Arg Met Asp Arg Met Asp Arg Met Asp 1 485 490 495 -10· 201245222

Arg Met Asp Arg Met Asp Thr Met Asg Arg Thr Asp Lys Met ser Arg 505 5X0 工1e Asp Arg Met Asp Lys lie Asp Arg Met Asp Arg Met Asp Arg Thr 515 520 525

Asn Arq Met Asp Arg Met Asn Arg Met Asn Arg Gin Met Asn Glu Tvr 530 53S 540

Met Met Ala Leu Ser Met Lys Leu Gin Lys Phe lie Asn Asn Asp 545 S50 S55

Tyr 560

Asn phe Asn Glu Val Asn Phe Arg lie Leu Gly Ala Asn val Asn Asp 565 570 575

Leu lie Met Asn Thr Arg Cys Ala Asn Ser Asp Asn Gin Asn Asn Asn 580 585 590

Gin Asn Lys His Asn Asn 595 -11 -

Claims (1)

1. 201245222 七、申請專利範圍： 1· 一種分離之王毁主蛋白（ap albumin )蛋白質或其片 段’其已經曱基乙二醛（MGO )化學修飾。 2.如申請專利範圍第1項之蛋白質，其為經修飾之王漿 主蛋白1 ( Apal )蛋白質或其片段》 3·如申請專利範圍第1或2項之蛋白質，其係自麥盧卡 蜂蜜(manuka honey )分離。 4. 如申凊專利範圍第2或3項之蛋白質，其具有至少 17個經MGO修飾之胺基酸殘基。 5. 如申請專利範圍第2至4項中任一項之蛋白質，其具 有1 7個至32個經MGO修飾之胺基酸殘基。 6. 如申請專利範圍第2至5項中任一項之蛋白質，其具 有約32個經MGO修飾之胺基酸殘基。 7. 如申請專利範圍第2至6項中任一項之蛋白質，其中 該等經修飾之胺基酸殘基為離胺酸或精胺酸。 8. 如申請專利範圍第2至7項中任一項之蛋白質，其中 該等經修飾之胺基酸殘基為離胺酸。 9· 一種組成物，其包含如申請專利範圍第丨至8項中任 ‘一項之分離之蛋白質。 10. —種分離之經MGO修飾之王漿主蛋白蛋白質或其 片段，其具有抗發炎能力，其包含與SEq ID N〇 i中所述 之胺基酸序列具有至少75%序列一致性的胺基酸序列。 11. 一種分離之經MGO修飾之王漿主蛋白蛋白質或其 片段，其具有抗發炎能力，其包含與SEQ ID N〇 1中所述 201245222 之胺基酸序列具有至少85%序列一致性的胺基酸序列。 12. —種分離之經MGO修飾之王漿主蛋白蛋白質或其 片段，其具有抗發炎能力，其包含與SEQ ID NO 1中所述 之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。 13. 如申請專利範圍第1〇至12項中任一項之分離之經 MGO修飾之王漿主蛋白蛋白質或其片段，其係自麥盧卡蜂 蜜分離。 14. 一種組成物，其包含如申請專利範圍第1〇至12項 中任一項之蛋白質。 15. —種藉由修飾蜂王漿產生抗發炎分子之方法，該方 法包括使蜂王漿與至少〇.1% MG〇反應之步驟。 16. 如申請專利範圍第15項之方法，其包括使該蜂王漿 與至少0.5% MGO反應之步驟。 17. 如申請專利範圍第16項之方法，其包括使主要蜂王 與至少1 .〇% MGO反應之步驟。 18·如申請專利範圍第15至17項中任—項之方法其 中該方法進—步包括自該蜂王毁產物分離經刪修飾之王 漿主蛋白（MRJP1)蛋白質的步驟。 19.-種減輕蜂巢組織中之炎症的方法，其包含使如申 專利範圍第8或14項之組成物與該蜂巢組織接觸的步 2。種降低免疫系統細胞之呑嗤率的方法，其包含 系統細胞如申請專利範圍第項之組成物的 2 201245222

   2 1. —種抑制免疫系統細胞上用於吞喔之受體的方法， 其包含投予免疫系統細胞如申請專利範圍第.8或14項之組 成物的步驟。 22.—種減少發炎細胞之呼吸爆發及活性氧物質釋放的 方法，其包含投予該等發炎細胞如申請專利範圍第8或14 項之組成物的步驟。 23.種識別蜂蜜樣本之（丨）抗發炎能力或（丨丨）經 修飾之王漿主蛋白濃度的方法，其包含以下步驟： a) 分析該蜂蜜樣本之螢光，及 b) 藉由將蜂蜜樣本之螢光量測值以及一或多種蜂 蜜樣本之抗發炎能力與先前已經量測之抑制吞嗟作用能 力比較’來使該蜂蜜#本之螢光量測值與該蜂蜜樣本之 抗發炎能力具相關性^ 认如申請專利範圍第23項之方法，其中該經刪修 飾之王漿主蛋白為經修飾 之MRm)。 W 1蛋白質（經修飾 25·如申請專利範圍第23項之方法，其 使得養蜂人能夠確定自蜂 法係用於 炎能力或經MGO修飾之 需抗發 S夺機。 …蛋白含置之蜂蜜樣本的恰當 使得蜂蜜生產者能夠確定錯/二方法，其中該方法係心 能力及經則〇修飾之王/存蜂蜜以獲得具有所需抗们 飾之王浆主蛋白含量之蜂蜜樣本 201245222 續時間^ 27·種增強-或多種王漿主蛋白蛋白質之抗發炎能力 ，方法其係藉由用MG〇、〒路、乙二酸及/或戒二路化學 處理來達成。 28·種提南蜂蜜樣本之抗發炎能力及經MGO修飾之 王漿主蛋白蛋白質含量之方法，其包含將MGO或MGO前 驅分子添加至蜂蜜樣本中之步驟。 29·如申睛專利範圍第27或29項之方法，其中該王漿 主蛋白蛋白質為經修飾之王漿主蛋白U白質。 八、圖式： (如次頁）