TW201142029A - Banana promoters - Google Patents

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201142029 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明提供啟動子序列，其可用於調節所需聚核苷酸之 轉錄及/或構造用於植物轉化之重組體基因，從而使得能 在單子葉及雙子葉植物中表現外來或内源性編碼序列。本 發明亦係關於包含本發明啟動子之聚核苷酸構築體，該啟 動子與編碼目標蛋白之外來或内源性聚核苷酸或能調節靶 基因表現之轉錄本以可操作方式連接。本發明另外係關於 含有邊構築體之經轉化植物細胞以及經轉化植物及其子 代、該等植物之植株部分或繁殖材料。 【先前技術】 遺傳改造之主要目標係獲得具有經改良特徵或性狀之植 物。許多不同類型之特徵或性狀可視為有利的，且彼等特 別重要者包括對植物疾病之抵抗、對病毒或昆蟲之抵抗及 對除草劑之抵抗。其他有利特徵或性狀包括對低溫或土壤 鹽度之耐受性、得自植物之最終消費者產品之穩定性增強 或貯藏壽命延長、或植物可使用部分之營養價值提高。 遺傳改造之最新進展已容許向植物細胞中納入選定基因 以賦予目標植物以所需品質。所選基因可源自與目標植物 不同之來源’或可為所需植物之天然基因，但經改造而在 表現程度或模式經修改後具有不同或改良品質或賦予該植 物以改變特性。再生植物細胞中此一基因之表現可賦予新 植物性狀或特徵。 為在基因組中產生新基因功能，必須考慮基因（作為廣 152350.doc 201142029 義上之結構及功能單元）之三個主要組份。除了編碼可執 行基因功能之多肽之編碼序列（或嚴格意義上之基因）以 外’需要存在在空間及時間上控制編碼序列之表現所需之 緊鄰的上游及下游調節區且其應位於適當位置。上游（亦 稱作5')調節區含有不轉錄為RNA之啟動子序列及所謂的5, 非轉譯區（UTR)或前導序列，其轉錄為rna但不轉譯為蛋 白質。該兩類序列中’啟動子具有最重要作用，此乃因其 用作多種DNA結合及DNA彎曲轉錄因子蛋白以及包括DNa 依賴性RNA聚合酶全酶及其他輔因子在内之總轉錄機構的 停泊位點。與之相比，3· UTR在基因表現調節中具有次要 調節作用》 基因表現之效率主要受用於表現該基因之啟動子之控 制。啟動子通常係引導植物之細胞機構自啟動子下游（3,) 之鄰接可轉錄區產生（轉錄）RNA(轉錄本）之DNA序列。啟 動子影響產生基因轉錄本之速率。假定轉錄本包括具有適 宜轉譯信號之編碼區，則啟動子亦影響產生所得基因蛋白 質產物之速率。啟動子活性亦可依賴於若干其他順式作用 調節元件之存在，該等調節元件結合細胞因子決定強度、 特異性及轉錄起始位點（综述參見Zawel及Reinberg，1992,

Curr. Opin. Cell Biol. 4: 488)。 已顯示某些啟動子能以高於其他啟動子之速率引導rna 合成。該等啟動子稱作「強啟動子」。已顯示某些其他啟 動子可僅在特定類型之細胞或組織中以較高程度引導rna 產生且經常稱作「組織特異性啟動子」。「調節或可誘導啟 152350.doc 201142029 動子」分別在特定發育階段期間在某些器官、組織及細胞 類型中控制基因表現，或係由經界定化學或環境信號來活 化。能在多種或所有植物組織中引導RNA產生之啟動子稱 作組成型啟動子」。高等植物中之組成型啟動子之實例 包括花椰菜花葉病毒（CaMV) 35S轉錄本起始區及源自根癌 土壌才干菌（Agrobacterium tumefaciens)之 Τ-DNA之 Γ 或 2'啟 動子，及熟習此項技術者已知之來自各種植物基因之其他 轉錄起始區，例如玉米泛素_丨啟動子。因此，藉由確定及 使用具有所需特徵之啟動子可潛在地控制引入細胞（尤其 植物細胞）中之基因之表現。 出於植物遺傳改造中之多個目的，需要近似組成型強啟 動子來確保在整個植物中具有足夠表現。用於植物遺傳操 縱之若干近似組成型強啟動子為業内已知（例如花椰菜花 葉病毒之35S啟動子-參見美國專利第5,352,6〇5號、美國專 利第5，164,316號、美國專利第5，196,525號、美國專利第 5,322,938號及美國專利第5,359,^2號）。然而，在植物中 需要表現若干個不同基因（基因聚合）時，具有不止一種近 似組成型啟動子可能極有用。人們已頻繁地觀察到，基因 沉默發生在經若干基因轉化之植物中，該等基因各自由相 同啟動子調知（Flavell，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91， 3490-3496 [1994] ; Finnegan 及 McElroy，Bio/Technology 12，883-888 [1994] ; Matzke等人，Mol. Gen. Genet. 244, 219-229 [1994]，Park等人，The Plant Journal 9，183-194 [1996])。人們認為此問題係由基於同源性之遺傳干擾所致 152350.doc 201142029 且可使用用於基因聚合之不同啟動子來避免。另外，在基 因内概念背景中（即將DNA序列轉移至植物基因組中）亦需 要新啟動子，該啟動子據記錄源自相同植物物種或性相容 植物物種。另外，還有一些可能的情況係較佳以不同但仍 來自相同（或性相容）物種之啟動子而非以其自身啟動子引 入新（内）基因。該等情況中之一係入侵病原體試圖下調作 用於宿主防禦機制之基因啟動子之情形。在此情形下，期 望使欲轉移基因與另一不受病原體影響之類似或甚至不同 基因之啟動子融合，從而確保該基因甚至在不良條件下亦 可正確表現。 【發明内容】 本發明一目標係提供經分離聚核苷酸序列，其包含來自 植物、尤其來自香蕉（芭蕉屬（Musa sp.))PAL基因之啟動子 及啟動子元件。該等啟動子及啟動子元件可在植物細胞中 發揮作用且可用於調節基因表現之遺傳改造。 在第一態樣中’本發明提供在植物細胞中具有啟動子活 性之聚核苷酸序列。更具體而言，本發明提供具有植物啟 動子活性之經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含具有核 苷酸序列SEQ ID NO:4之聚核苷酸，或其核苷酸序列與 SEQ ID NO:4具有至少70°/◦序列一致性之生物活性片段或 同系物。 較佳地，經同系物或變體聚核苷酸與SEQ ID NO:4最佳 比對後，同系物所包含聚核苷酸之核苷酸序列與SEQ ID NO:4具有至少70%、較佳至少80%或85%、更佳90°/。、最 152350.doc 201142029 佳至少95%或97%之序列一致性’其中不包括空位長度為 至少5個核苷酸、較佳至少6、7、8、9或10個核苦酸之空 位位置。 在一特定實施例中，具有植物啟動子活性之聚核苦酸包

含具有 SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4之核苷酸序列的聚核苷酸。 在本發明另一實施例中，提供可在植物細胞中發揮作用 之經分離啟動子聚核苷酸序列，該啟動子序列包含 ⑴核苷酸序列SEQ ID ΝΟ:1或SEQ ID NO:2 ;或 (ii) (i)中經分離聚核苷酸之截短啟動子活性片段；或 (iii) 作為（i)或（ii)之同系物或變體之聚核苷酸序列； 較佳地，該同系物或變體包含聚核苷酸核苷酸序列具有 至少70°/。、較佳至少80%或85%、更佳90%、最佳至少95% 或97%序列一致性與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2或其一或 多個長於100個鄰接核苷酸、較佳長於丨50或200個鄰接核 苷酸、最佳長於300個鄰接核苷酸之區段。或者，該同系 物或變體包含可在嚴格條件下與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2或其截短啟動子活性片段（之補體）雜交之聚核苷酸。 較佳地’該截短啟動子活性片段包含SEq ID n〇:3或 SEQ ID NO:4或其具有可在嚴格條件下與SEq id n〇:3或 SEQ ID NO:4(之補體）雜交之聚核苷酸之變體。 較佳地’該等啟動子包含一或多個能用作（例如）以下元 件或執行其功能之元件：TATA盒、PAL盒、CAAT盒、 GATA盒、AS1元件、MYB/WRE3元件、轉譯起始信號、聚 152350.doc 201142029 a S#、、'σ &位點起始子位點、轉錄因子結合位點、增強 子、反向重複序列、基因座控制區或骨架/基質結合區。 本發明另一目標係提供聚核普酸構築體、較佳DNA構築 體，或包含該具有I物啟自？活性之經分離聚核普酸序 列、或其變體或同系物或其與第二異源性聚核苷酸序列操 作性連接之生物活性片&，該第二異源性聚核苷酸序列係 編碼RNA及/或多肽之編碼序列或係調節序列。本發明另 一目標提供包含本發明該聚核苷酸構築體之載體。 本發明另一目標係提供經轉化宿主細胞、較佳經轉化植 物細胞’其包含本發明該等包含具有植物啟動子活性之聚 核苷酸序列之聚核苷酸構築體。較佳地，將本發明該啟動 子聚核苷酸及/或該聚核苷酸構築體穩定納入該植物細胞 之基因組中。本發明亦涵蓋產生經轉化植物細胞之方法， 其包含向可再生植物細胞中引入本發明聚核苷酸構築體以 產生經轉化植物細胞並鑑別或選擇經轉化植物細胞。該等 經轉化植物細胞可為單子葉或雙子葉植物細胞，較佳係來 自屬於芭蕉科（Musaceae)、禾本科（poaceae)、十字花科 (Brassicaceae)或茄科（Solanaceae)之植物物種之植物細 胞’或來自以下之植物細胞：大豆、向曰蔡、甜菜、紫花 首稽、花生、棉花、咖啡、椰子、鳳梨或柑橘類水果。根 據本發明特定實施例’植物係芭蕉科植物，更具體而言係 在本發明特定實施例中，該等經轉化植物細胞能再生為 植物°本發明另外涵蓋產生轉基因植物之方法，其包含將 152350.doc 201142029 本發明聚核^酸構築體引入可再生植物細胞中以產生可再 生之經轉化細胞，鑑別或選擇一種或一群經轉化植物細 胞’及使轉基因植物自該細胞或細胞群再生。 本發明另一目標提供經轉化植物或植株部分、植物組織 或植物繁殖材料，其中經轉化植物或植株部分、組織或繁 殖材料包含本發明植物細胞’該等植物細胞包含本發明該 等聚核苷酸構築體。本發明亦提供源自該等轉基因植物之 果實、種子及子代植物或其部分。 在本發明另一態樣中’提供在植物細胞中或在植物中表 現產物之方法’該方法包含將本發明聚核苷酸構築體引入 植物細胞中，其中該構築體之編碼序列或其尺^^八轉錄本編 碼該產物。 在另一態樣中，本發明提供經處理食品，其包含本文所 述聚核苷酸構築體。 【實施方式】 1·定義 為使說明書中通篇使用之術語具有明確一致之含義，提 供以下定義： 「生物活性片段」或「活性片段」意指參照胺基酸或核 苷Ιλ序列中具有至少約〇」％、較佳至少約丨、且更佳至 /、.勺25 /〇之參照啟動子序列活性之片段。亦應理解，片語 生物活）±片#又」或「活性片段」係指所示聚核苷酸序列 (較佳DNA序列）中之一部分，其起始⑽八轉錄，或在與特 疋編碼序列融合並引入植物細胞中後可引發編碼序列表現 152350.doc 201142029 且表現程度尚於不存在所示DNA序列中該部分時之可能表 現程度。 編瑪序列.編碼功能性RNA轉錄本之聚核苷酸序列，其 隨後可轉譯為或不轉譯為多肽。 組成型啟動子.在本文中稱作「組成型啟動子」之啟動 子，其在大多數（但並不一定全部）環境條件及發育或細胞 分化狀態下積極促進轉錄。組成型啟動子在有機體中之大 夕數細胞中具有活性。所用術語近似組成型表示啟動子在 植物發育期間之所有細胞類型中在大多數情形下具有活 陡但在不同植物發育階段期間在不同細胞類型中活性比 率可能不同。 内源·本發B月上下文中之術語「内源性」係指任一聚 核苷酸、多肽或蛋白質序列，其係細胞中或自該細胞再生 之有機體中之天然部分。 異源性序列.「異源性序列J係彼等本質上彼此並非操 作性連接或不鄰接者。舉例而言，可認為來自Μ之啟動 子與擬南芥屬（Arabid_相瑪區序列具有異源性。同 樣，可認為來自編碼玉米生長因子之基因之啟動子與編碼 該生長因子之玉米受體之序列具有異源性。可認為本質上 並非與編碼序列源自相同基因之調節元件序列（例如磁 =3,端終止序列）與該編碼序列具有異源性。本質上彼此操 乍性連接且鄰接之元件彼此不具有異源m，本文所 用異源性調節及/或編碼序时提及包含本發明啟動子聚 核普酸之構築料表㈣調節序狀/或編碼序列本質上 152350.doc 201142029 彼此不鄰接》 同系物：來自（例如）另一有機體（病毒、細菌、真菌、動 物或植物）且經與參照啟動子序列之最佳比對後與該參照 啟動子序列具有至少70%之序列一致性（其中較佳不包括空 位長度為至少5、6、7、8、9或10個核苷酸之空位位置）且 與參照聚核苷酸序列具有實質相同功能之聚核苷酸。較佳 地’同系物具有至少80%或85%、較佳至少85%或90%、更 佳至少9 5 /〇之序列一致性。在本發明上下文中，實質上相 同之功能係指具有植物啟動子活性，更佳係指確保與本發 明參照聚核苷酸序列具有實質上相同之表現模式。 用於闡述兩個或更多個聚核苷酸或多肽之間之序列關係 之術語包括「參照序列」、「對比窗」、「序列一致性」、「序 列一致性百分比」及「實質一致性」。本發明上下文中之 「參照序列」包括核苷酸序列SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或更具體而言SEQ ID NO:4或其一或 多個構成具有足夠長度之對比窗之區段。由於兩個聚核苷 酸可各自包含（1)該兩個聚核苷酸之間類似之序列（即僅完 整聚核苷酸序列中之一部分），及（2)兩個聚核苷酸之間不 同之序列，故兩個（或更多個）聚核苷酸之間之序列對比通 常係藉由在「對比窗」中比較兩個聚核苷酸之序列來實 施’以鑑別並比較具有序列相似性之局部區域。「對比 窗」係指具有至少100個鄰接核苷酸、較佳至少150或200 個鄰接核苷酸、更佳至少300個鄰接核苷酸、最佳具有序 列中之至少一半或實質上所有核苷酸之概念性區段，其中 152350.doc 201142029 將該序列與具有相同鄰接位置數之參照序列在兩個序列達 成最佳比對後進行對比》較佳對比窗覆蓋序列（尤其係最 短序列）中之實質上所有核苷酸。對比窗可相對於參照序 列（不包含添加或缺失）包含約10%或20%或更小之添加或 缺失（即空位）以使兩個序列達成最佳比對。用於比對對比 窗之序列最佳比對可藉由電腦化執行算法（Clustalw、 GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)來實施，或藉由檢查 並藉由所選各種方法中之任一者達成最佳比對（即在對比 窗中獲得最高一致性百分比）來實施。亦可參照blast系 列程式，如例WAltschul等人在1997年所揭示（Nucl八以如

Res. 25:3389) (http://www_ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。關於 序列分析之詳細論述可參見Ausubel等人，「Current Protocols in Molecular Bi〇1〇gy」，J〇hn 公 司，1994-1998，第 15章，第 19.3單元。 本文所用術語「序列一致性」係指多個序列基於各核苷 酸（DNA或RNA)或基於各胺基酸在該等序列之最佳比對中 之相同程度。因此，本文所用「序列一致性百分比」係藉 由在對比窗中對比兩個最佳比對序列來測定，其中聚核普 酸在對比窗中之片段可相對於參照序列（其不包含添加或 缺失）包含添加或缺失（例如空位或突出）以達成兩個序列之 最佳比對°該百分比係藉由以下方式來計算：測定兩個序 列中存在相同核酸鹼基之位置數以獲得匹配位置數用匹 配位置數除以對比窗中之位置總數（g卩「窗口大小」）（較佳 不包括具有至少5、6、7、8、9或10個核苷酸之空位位 152350.doc -13- 201142029 置）’且將結果乘以100以獲得序列一致性百分比》另一較 佳窗口大小對應於兩個序列中較短者之核苷酸數。 在本發明特定實施例中，兩個核苷酸序列之最佳比對係 藉由基礎 BLASTn 算法（可在 http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi獲得）以默認設置[即「期望閾值」=1〇 ;「字 長」=11 ;「匹配/錯配分數」=(2，·3) ;「空位成本」=(存 在：5·延伸：2);用於低複雜度區域之過濾器及僅用於查 找表之屏蔽]來實施。該程序通常如下所述： (Α)使用基礎Blastn算法以默認參數來比對SEQ ID Ν0:1 及SEQ ID ΝΟ:2。在構成足夠長對比窗之兩個區域中觀察 到極高序列一致性：（1) SEQ ID Ν0:1中核苷酸1與核苷酸 1095之間之區段序列與SEQ ID Ν0:2中核苷酸1與核苷酸 112〇之間之區段序列比對，有1060個核苷酸相同。考慮到 SEQ ID Νο:1中該區段之核苷酸序列最短（1〇95 nt)，此結 果對應於約96%序列一致性（1〇6〇/1〇95)。（2)8£(^10 1<[〇:1 中核苷酸1251與核苷酸1664之間之區段序列與SEQ ID NO:2中核苷酸1120與核苷酸1527之間之區段序列比對，有 402個核苷酸相同。考慮到SEq id N0:2中該區段之核芽酸 序列最短（408 nt)，此結果對應於約98%序列一致性 (402/408) » (B)使用基礎Blastn算法以默認參數來比對SEQ ID N0:3 及SEQ ID NO:4。在構成足夠長對比窗之兩個區域中觀察 到極高序列一致性：（1) SEQ ID N0:1中核苷酸1與核苷酸 472之間之區段序列與SEQ ID N0:2中核苷酸1與核苷酸463 152350.doc •14· 201142029 之間之區段序列比對，有45 1個核苷酸相同。考慮到SEQ ID NO:2中該區段之核苷酸序列最短（463 nt)，此結果對應 於約97%序列一致性（451/463)。（2) SEQ ID ΝΟ:1中核苷酸 628與核苷酸1041之間之區段序列與SEQ ID NO:2中核苷酸 463與核苷酸870之間之區段序列比對，有402個核苷酸相 同。考慮到SEQ ID NO:2中該區段之核苷酸序列最短（408 nt)，此結果對應於約98%序列一致性（402/408)。 (C)使用基礎Blastn算法以默認參數來比對SEQ ID ΝΟ:1 及SEQ ID NO:4。在構成足夠長對比窗之兩個區域中觀察 到極高序列一致性：（1) SEQ ID NO: 1中核苷酸624與核苷 酸1095之間之區段序列與SEQ ID NO:2中核苷酸1與核苷酸 463之間之區段序列比對，有45 1個核苷酸相同。考慮到 SEQ ID NO:2中該區段之核苷酸序列最短（463 nt)，此結果 對應於約97%序列一致性（451/463)。（2)SEQIDNO:l中核 苷酸1251與核苷酸1664之間之區段序列與SEQ ID NO:2中 核苷酸463與核苷酸870之間之區段序列比對，有402個核 苷酸相同。考慮到SEQ ID NO:2中該區段之核苷酸序列最 短（408 nt)，此結果對應於約98%序列一致性（402/408)。 在本發明另一特定實施例中，多個核苷酸序列之最佳比 對及序列一致性百分比係藉由ClustalW算法（可在 www.ebi.ac.uk/clustalw/獲得）以默認設置[即，對於逐對比 對：比對類型=緩慢；DNA權矩陣=IUB ;空位開放=10 ; 空位延伸=0.1 ;對於多序列比對：DNA權矩陣=IUB ;空位 開放=10 ;空位延伸=0.2 ;無端空位=無；迭代=無；迭代 152350.doc -15- 201142029 次數（numiter)=l ;成藏=NJ]來實施。在ClustalW程式中， 計算欲比對序列中每對核苷酸之逐對分數。逐對分數係藉 由用最佳比對中之一致殘基數除以所對比殘基數（且可大 致對應於最短序列且不包括空位位置）來計算。由於逐對 分數之計算獨立於所選矩陣及空位，故對於各序列中之特 定殘基對而言其始終係相同值。SEQ ID NO:l、SEQ ID >10:2、8£()10 1^0:3與8五(5 10]^0:4之比對及評分顯示： -SEQ ID NO:4與 SEQ ID NO:3具有 97%序列一致性； -SEQ ID NO:4與 SEQ ID NO:l 具有 97%序列一致性； -SEQ ID NO:4 與 SEQ ID NO:2 具有 100%序列一致性（由 於後一序列包含SEQ ID NO:4且因此包含相同核苷酸）； -SEQ ID ΝΟ:1 與 SEQ ID NO:2具有 95%序列一致性； -SEQ ID ΝΟ:1 與 SEQ ID NO:3具有 1000%序列一致性（由 於後一序列包含SEQ ID NO:4且因此包含相同核苷酸）。 「實質性序列一致性」或「實質一致性」意指參照序列 與長度較佳大致相同且與參照序列達成最佳比對之另一聚 核苷酸具有至少70%序列一致性、較佳至少80%或85°/〇、 更佳至少90%、95°/。或97%序列一致性。 在特定實施例中，本發明啟動子係以經分離聚核苷酸形 式來提供。本文所用「經分離」核酸實質上不含產生該核 酸之有機體之天然基因組中存在之側翼序列（即位於其5 ’或 3’側之序列）。另外，較佳地，本文所用「經分離」核酸在 藉由重組技術產生時實質上不含其他細胞材料或培養基， 或在以化學方式合成時實質上不含化學前體。 152350.doc -16- 201142029 本文所用術語「以可操作方式連接」或「操作性連接」 意指啟動子與第二聚核苷酸（即編碼序列）之功能性連接， 其一般取向5'至3’方向，且此一連接方式使得該啟動子起 始並介導該第二聚核苷酸之轉錄。一般而言，具有操作性 連接之聚核苷酸係鄰接聚核苷酸。 本文所用術s吾「聚核苷酸」或「核酸」表示mRNA、 RNA、cRNA、cDNA或DNA，較佳係DNA。該術語通常係 指長度大於30個核苷酸之分子。 啟動子：基因中位於編碼序列5,端之側翼DNA序列，其 包括參與編碼序列轉錄起始之元件。「植物啟動子」或 「具有植物啟動子活性之聚核苷酸」係能在植物細胞中起 始轉錄且可調節聚核苷酸之轉錄之啟動子。該等啟動子不 需要源自植物。舉例而言，源自植物病毒之啟動子（例如 CaMV 35S啟動子）或源自根癌土壌桿菌之啟動子（例如丁_ DNA啟動子）可為植物啟動子。 本文所「嚴格性」係、聚核苦酸或探針長度、聚核皆酸 或探針組成（G+C含量）及鹽濃度 '有機溶劑濃度及雜交溫 度或洗祕狀功能i格性„侧由參^根據與L 之溫差來比較，T』、雜交中5()%互補分子雜交之溫度。高 嚴格性條件係彼等提供^。叫俄之條件者。中間 或中等嚴格性條件係彼等提供τ 。 。 t促识1 „^20 c至之條件 者。低嚴格性條件係彼等提供Tm_4Gt至之條件 者。雜交條件與Tm(以t計）之間之關係細如下數學方程 來表示： 152350.doc 201142029

Tm=81.5-16.6(log,〇 [Na+])+〇.41(% G+C)-(600/N) (1) 其中N係聚核苷酸或探針之長度。 此方程可有效用於長14至70個核苷酸且與輕序列相同之 核酸或探針。下文用於DNA-DNA雜合體之Tm之方程可用 於具有50個至500個以上核苷酸之聚核苷酸或探針，且可 用於包括有機溶劑（甲醯胺）之條件。

Tm=81.5 + 16.6 log {[Na+]/(l + 〇.7[Na+])} + 〇.41(%G+C)- 500/L 0.63(% 曱醯胺）（2) 其中L係聚核苷酸探針之長度。（p.邛“咖， 「Hybridization with Nucleic Acid Probes」，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，p.c. van der Vliet ’ 編輯 ’ c. 1993，Elsevier，Amsterdam)。方 程（2)中之^受雜合體之性質影響；對於dna_RNa雜合 體’ Tm比計算值高i〇_i5°C ’對於RNA-RNA雜合體，Tm比 計算值尚20-25°C。由於在使用長探針時同源性每降低 1%’ Tjp 降低約 i°C [Bonner等人，j Μ〇ι· Bi〇丨 81:123 (1973)]，故可調節嚴格性條件以有利於相同基因或相關家 族成員之檢測。 變體：本文所用術語「變體」表示在某些方面與參照聚 核苷酸不同之聚核苷酸分子，但其較佳具有與參照聚核苷 酸類似之主要生物學功能。一般而言，「聚核苷酸變體」 相對於參照聚核苷酸序列顯示實質性序列一致性或可在嚴 格條件下與參照序列雜交。應轉，在本巾請案所用或所 揭示之序列或片段内可能存在序列差異。 152350.doc •18· 201142029 術語「變體」或「聚核苷酸變體」亦涵蓋已添加或缺失 一或多個核苷酸或一或多個核苷酸已經不同核苷酸替代之 聚核苷酸。就此而言，業内熟知可對參照聚核苷酸進行某 些改變，包括突變、添加、缺失及取代，其中經改變聚核 苷酸保留參照聚核苷酸之生物學功能或活性。因此，本發 明啟動子聚核苷酸上下文中之「變體」或「聚核苷酸變 體」涵蓋聚核4酸，其起始RNA轉錄’或在與特定基因融 合並引入植物細胞中時可使該基因表現，且表現程度高於 該等聚核苷酸不存在時之可能程度。術語「聚核苷酸變 體J及「變體」亦包括天然等位基因變體。 另外’聚核普酸變體可包含向參照序列添加特定聚核普 酸序列或自參照序列缺失特定聚核苷酸序列之變化，例如 (但不限於）特定UTR或外顯子序列。該添加或缺失亦可發 生在内部’例如發生在SEq ID ΝΟ:1中核苷酸1〇96與核苦 酸1251之間之區域，或發生在本發明聚核苷酸之5，或3，端 (例如位於SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4末端之ATG序列）。較佳地，變體包含一或多 個具有足夠長度之鄰接核苷酸區段，其相對於參照啟動子 序列中相同大小之對應區域或在與最佳比對序列對比時顯 示至少70%或80%、較佳至少85%、9〇%、95%或97%序列 一致性，其中該比對係藉由業内已知之電腦同源性程式來 實施。可藉由習用技術來確定構成適宜變體者。舉例而 言，可藉由對本發明經分離天然啟動子之先前製備之變體 或非變體形式實施隨機誘變（例如轉座子誘變）、寡核苷酸 152350.doc •19· 201142029 介導（或定點）誘變、PCR誘變及盒式誘變來使參照聚核苷 酸突變。 DNA中核普酸之單字母密碼符合The Bi〇chemical

Journal 219:3 45-373 (1984)中所述之IUPAC-IUB標準。 2.說明 2.1啟動子序列 本發明者已在香蕉***酸氨裂解酶（pal)基因序列之 TAIL-PCR後分離啟動子序列及啟動子元件。該等啟動子 及啟動子元件以及其同系物及變體可結合適宜編碼序列 (分開或組合）用於製備能以適宜程度表現目標編碼序列之 轉基因植物。 因此’在一態樣中’本發明提供具有植物啟動子活性之 經分離聚核苷酸分子或該等聚核苷酸分子之啟動子活性片 段或變體或同系物。更具體而言，本發明提供具有植物啟 動子活性之經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含具有核 苷酸序列SEQ ID NO:4之聚核苷酸，或其核苷酸序列與 SEQ ID NO:4具有至少70%序列一致性之生物活性片段或 同系物。 在特定實施例中，經同系物或變體聚核苷酸與SEq ID NO: 4之最佳比對後或係藉由將相同位置數除以所比對序列 中最短者之核苷酸數’同系物所包含聚核苷酸之核苦酸序 列與SEQ ID NO:4具有至少70%、較佳至少80%或85%、更 佳90%、最佳至少95%或97%之序列一致性，其中較佳不 包括空位長度為至少5個核苷酸、較佳至少6、7、8、9或 152350.doc -20- 201142029 1 〇個核普酸之空位位置。 本發明特定啟動子聚核苷酸包含與SEQ ID NO:l、SEQ ID ΝΟ:2 或 SEQ ID ΝΟ:3 具有至少 80%、85%、90%或 93%例 如至少95%或97%序列一致性之聚核苷酸。 本發明其他特定啟動子聚核苷酸包含與SEq ID NO: 1及 SEQ ID NO:3 或與 SEQ ID NO:2 及 SEQ ID NO:4 具有至少 80%、85%、90%或93%例如至少95%或97%序列一致性之 聚核苷酸。

在其他特定實施例中，可在本發明植物細胞中發揮作用 之經分離啟動子聚核苷酸序列包含⑴核苷酸序列SEQ ID ΝΟ··1、SEQ ID NO:2 ' SEQ ID NO·· 3 或 SEQ ID NO·· 4 ;或 (ii)(i)中經分離聚核苷酸之截短啟動子活性片段；或（iH) (i) 或（ii)之聚核苷酸同系物或變體，其包含核苷酸序列與

SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO: 4具有至少70%、較佳至少80%或85%、更佳至少 90%、最佳至少95。/。序列一致性之聚核苷酸，或包含其一 或多個構成具有足夠長度之對比窗之區段；或（iv)⑴或（Η) 之聚核苷酸同系物或變體，其包含在嚴格條件下與⑴或 (ii) 之聚核苷酸（之補體）雜交之聚核苷酸。 在一特定實施例中，該等SEQ ID NO: 1之聚核苷酸同系 物或變體包含核苷酸序列與SEQ ID ΝΟ:1中核苷酸624與核 苷酸1095之間之核苷酸序列及/或SEq id NO: 1中核苷酸 1252與核苷酸1 661之間之核苷酸序列具有至少7〇%、較佳 至少80%或85%、更佳90%、最佳至少95%序列一致性之聚 152350.doc -21· 201142029 核普酸。在其他實施例中，SEQ ID NO: 1之該等聚核苦酸 同系物或變體包含與SEQ ID NO: 1及/或SEQ ID NO:3具有 實質性序列一致性之聚核苷酸，且另外與SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO:3相比，有一或多個聚核苷酸序列作為該等具 有實質性序列一致性之聚核苷酸之***物或n_或c_末端添 加至其中或自其缺失。更具體而言，SEQ ID ΝΟ:1之該聚 核苷酸變體包含與SEQ ID ΝΟ:1及/或SEQ ID NO:3具有實 質性序列一致性且其中缺失SEq ID NO: 1或其部分中核苷 酸1095與核苷酸1252之間之區域之聚核苷酸。在本發明另 一實施例中，SEQ ID NO: 1之該等聚核苷酸同系物或變體 包含SEQ ID N〇:2或SEQ ID NO:4，或與其具有實質性序 列一致性之聚核苷酸。 根據當前知識，啟動子序列及啟動子元件係作為功能性 重要區域存在’例如蛋白質結合位點及其他啟動子元件， 及間隔區。蛋白質結合位點之正確定位顯然需要該等間隔 區。因此’在該等間隔區中可在一定程度上对受核普酸取 代、***及缺失而不損害功能。相反，在功能性重要區域 中可容許之差異較小，此乃因序列中之變化可干擾蛋白質 結合。然而，只要可保全功能，功能性重要區域中可容許 一定差異。 因此，本發明聚核苷酸同系物或變體包括具有植物啟動 子活性之聚核苷酸，其包含一或多個與參照啟動子序列

SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4之對應區域或最佳比對區域具有實質性序列一致性之 152350.doc •22· 201142029 區域。應理解，該等區域包含具有足夠長度之對比窗。在 本發明上下文中，具有足夠長度之對比窗係指核苷酸序列

SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2、SEQ ID N〇:3 或 SEQ ID NO:4中具有至少loo個鄰接核苷酸、較佳至少i5〇或個 鄰接核苷酸、更佳至少300個鄰接核苷酸之一或多個區 &。較佳地，该對比窗包含一或多個啟動子元件，例如 TATA 盒、PAL 盒、CAAT 盒、GATA 盒、AS1 元件、 MYB/WRE3元件、轉譯起始信號、聚合酶結合位點、起始 子位點、轉錄因子結合位點、增強子、反向重複序列、基 因座控制區或骨架/基質結合區β 較佳對比窗包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID ΝΟ:2中具有至 少100個鄰接核苷酸 '較佳至少15〇或2〇〇個鄰接核苷酸、 更佳至少300個鄰接核苷酸之區段。其他較佳對比窗包含 SEQ ID ΝΟ:1中核苷酸624與核苷酸1661之間之區域或SEQ ID NO:2中核苷酸658與核苷酸1524之間之區域或其具有至 少100個鄰接核苷酸、較佳至少1 5〇或2〇〇個鄰接核苷酸、 更佳至少300個鄰接核苷酸之區段。更佳對比窗包含 ID N〇:l t核苷酸624與核苷酸1〇95之間之區域及/或SEq ID ΝΟ:1中核苷酸1252與核苷酸1661之間之區域或其一或 多個具有至少1〇〇個鄰接核苷酸、較佳至少15〇或2〇〇個鄰 接核苦酸、更佳至少300個鄰接核苷酸之區段。 本發明另外係關於本文所揭示啟動子序列之截短啟動子 活性片段。本發明截短啟動子活性片段係SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO:2或其同系物或變體之經修飾形式，其具有植 152350.doc -23- 201142029 物啟動子活性且其自SEQ ID ΝΟ:1或SEQ ID NO:2或其同 系物或變體之3'或5'端缺少至少個核苷酸，較佳缺少至少 10、50、100、150、200、250、300、400、500、600或更 多個核苷酸。本發明啟動子序列之特定截短啟動子活性片 段包含 (i) 核苷酸序列 SEQIDNO:3 或 SEQIDNO:4，或 (ii) 聚核苷酸，其核苷酸序列與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4或其構成具有足夠長度之對比窗之區段具有至少 70%、較佳至少80%或85%、更佳至少90%、最佳至少95% 序列一致性。 熟習此項技術者可藉由（例如）以下方式來測定SEQ ID ΝΟ:1或SEQ ID NO:2或其同系物或變體中維持啟動子活性 所需之植物啟動子活性片段之核苷酸序列：生成SEQ⑴ NO: 1或SEQ ID NO:2或其同系物或變體之缺失片段以獲得 假定啟動子’以可操作方式使該假定啟動子與轉基因融 合’將該構築體引入宿主細胞中’且量測該轉基因之表 現。轉基因可為報道基因，例如β_葡糖酸酸糖苷酶（gUS)、 綠色螢光蛋白（gfp)、氯黴素乙醯轉移酶（cat)或螢光素酶 (luc)基因。將含有啟動子及轉基因之構築體選殖至載體 中’並使用該載體來轉化宿主細胞。轉基因之表現係藉由 分析轉基因產物來量測。可使用標準分析來敏感地檢測報 道基因產物。舉例而言，GUS可藉由組織化學或螢光量測 分析來量測（Mendel等人，1989 ; Cervero，1984)。轉基因 產物之存在指示功能性啟動子。 152350.doc •24· 201142029 包含本發明啟動子之經分離聚核苷酸可藉由自植物基因 組（較佳自香蕉（芭蕉屬）基因組，例如自栽培種大矮筹、 (Grand Naine)及加爾各答4 (Calcutta 4))選殖DNA來獲得， 如熟習此項技術者已知。舉例而言，該等啟動子序列可藉 由對基因組DNA實施聚合酶鏈式反應（pcr)擴增來生成。 來自其他物種之對應聚核苷酸（較佳DNA)亦可使用PCR來 分離。探測（例如）香蕉（芭蕉屬）或其他物種之植物基因組 文庫所需之引物可自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4之核苷酸序列數據進行設計及優 化。分離包含本發明啟動子序列之聚核苷酸之其他程序包 括（但不限於）tail-PCR及cDNA末端之5,快速擴增^八⑶）。 產生本發明聚核苷酸之另一方法係DNA合成。亦可合成互 補寡核苷酸以形成所需聚核苷酸序列之雙鏈分子。另外， 了使用_促及化學合成及修飾核酸之熟知方法來獲得與

SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或其片段具有實質性序列一致性之啟動子序列。 本發明亦係關於自植物分離本發明啟動子之方法，該方

法包含（a)用包含 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3或SEQ ID N〇:4或其一或多個片段之聚核苷酸探測植 物基因組，（b)使該聚核苷酸與植物基因組中之核酸在嚴格 條件下雜交，及（c)自植物基因組分離啟動子。較佳地，植 物基因組係香蕉（芭蕉屬）基因組文庫。 因此，本發明提供與本發明啟動子聚核苷酸序列互補、 更具體而言能與本發明序列及其同系物或變體特異性雜交 152350.doc -25- 201142029 之序列。在特定實施例中’本發明此態樣中之探針及引物 包3與如下序列互補之序列：與π。N〇 i、wo ID: 2 SEQ ID NO: 3及/或SEQ ID NO:4内之區域具有至少70% 序列致性且與任何其他天然序列不具有100%序列一致 性。在特定實施例中，引物及探針具有10至100個核苷酸 之長度。 2.2構築體及載體 本發明另外提供包含本發明該等啟動子聚核苷酸序列之 聚核苦酸構築體’該等啟動子聚核苷酸序列與異源性編碼 序列及/或調節序列以可操作方式連接。因此，該等聚核 苷酸構築體包含具有植物啟動子活性之聚核苷酸，該聚核 苷酸與異源性編碼序列或另一異源性調節序列以可操作方 式連接，其中該等啟動子序列包含 更具體而言，本發明提供包含具有植物啟動子活性之啟 動子聚核苷酸之聚核苷酸構築體，該等啟動子聚核苷酸與 異源性編碼序列及/或調節序列相連接，其中該啟動子聚 核苷酸包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:4之聚核苷酸，或 其核苷酸序列與SEq ID N〇:4具有至少7〇%序列一致性之 生物活性片段或同系物。 用於本發明聚核苷酸構築體中之啟動子聚核苷酸序列之 特定實施例對應於上述啟動子聚核苷酸序列之實施例。 該異源性編碼序列可編碼RNA，該RNA用做反義RNA、 核酶或結構組件，或轉譯為用作酶、結構組件、標記之多 肽，或具有一定生理效應。該異源性編碼序列包括所有可 152350.doc -26- 201142029 藉由遺傳改造弓I入植物中之經合成改造及生物衍生之編碼 序列或基因’包括(但不限於)非植物基因、外來或内源性 植物基因、經修饰基因、合成基因及基因部分。該編碼序 列可編碼不止—種RNA或不止—種多肽。此外，該編碼序 列可編碼至少—種RNA與至少—❹肽之組合。該等編碼 序列包括（例如）開放式閱讀框、開放式閱讀框之-部分、 編碼融合蛋白之聚核；g:酸、反義序列、編碼雙鏈序列 之序列、轉基因及諸如此類。 可在轉基ϋ植物t使用本發明啟動子有用地表現的轉基 因產物之非限制性實例係有助於以下之基因產物：（1)獲得 針對植物感染性病毒、細菌、真菌或線蟲之疾病抗性或耐 又〖生，（2)獲得針對食草動物及其他害蟲之抗性；（？）獲得 針對除草劑、重金屬或可選標記試劑之抗性；（4)賦予針對 非生物因子及環境應力（例如乾旱、鹽、低溫、缺氧條件） 之抗性；（5)對研究用基因及基因產物實施功能分析（藉由 使用可選擇及/或可篩選標記基因）；（6)使基因及基因產物 沉默或增強（調節基因表現）；（7)改變高分子及次級代謝產 物之組成（例如提高營養價值或改變結構組成，例如改良 澱粉特性或數量、油數量及品質、胺基酸或蛋白質組成及 諸如此類）；（8)改變植物發育，或（9)改良果實或作物產率 及/或品質（例如收穫後貯藏壽命或疾病抗性）。 在一特定實施例中，本發明聚核苷酸構築體之特徵另外 在於該啟動子或其生物活性片段或變體能使外來或内源性 (但係異源性）編碼序列在特定、多種或所有植物組織中轉 152350.doc •27· 201142029 錄（較佳高程度轉錄）。該等植物組織包括已分化及未分化 組織或植物’包括（但不限於）根、莖、苗、子葉、上胚 軸、下胚轴、葉、花粉、種子、腫瘤組織及培養物中之各 種細胞形式（例如單細胞、原生質體、胚胎及愈傷組織。 該植物組織可存於植物中或存於器官、組織或細胞培養物 中。 代表性編碼序列包括（例如）離胺酸增加之細菌dap A基 因；編碼用於昆蟲抵抗之蘇雲金芽孢桿菌（BaciUus thuringiensis) (Bt)内毒素（尤其美國專利第5,46〇 963號、第 5,683,691 號、第 5,545,565 號、第 5,530,197 號、第 5,317,096號）或自發光桿菌（卩]1〇1〇1>1^0113)分離之殺昆轰毒 素（WO 97/17432或WO 98/08932)之基因；用於疾病抗性之 裂解肽基因、賦予針對苯腈類除草劑之耐受性之基因（美 國專利第4,810,648號及第5,559,024號）、用於針對草甘膦 及EPSPS抑制劑除草劑之抗性之細菌或植物Epgps(美國專 利第 4,940,835 號、第 5，188,642 號、第 4,971，908 號、第 5，145,783 號、第 5,312,910 號、第 5,633,435 號、第 5,627,061號、第 5,310,667號、WO 97/04103);賦予針對固 殺草（glufosinate)之耐受性之基因（EP 2斗2 236)、用於針對 HPPD抑制劑除草劑（即二酮、異噁唑等）之細菌或植物 HPPD(WO 96/38567、WO 98/02562)、用於殺真菌特性之 殼多糖酶或葡聚糖内-1，3-β -葡糖苦酶基因、用於果實成熟 控制之ACC合成酶及ACC氧化酶。同樣，可引入編碼序列 以用作生成突變體之遺傳工具及/或幫助基因區段（例如單 152350.doc • 28· 201142029 子葉基因）之鑑別、遺傳標記或分離。 包3本發明啟動子序列之聚核苷酸構築體可包括不止一 個與編碼序列操作性連接之啟動子。該等額外啟動子可為 相同啟動子、相同啟動子之衍生物或異源性啟動子。另 外，諸如增強子或沉默子等操作性連接之調節元件可包括 於聚核苷酸構築體中。 包含與異源性編碼序列以可操作方式連接之本發明啟動 子之聚核苷酸構築體可藉由業内熟知製方法來構造。構築 體亦可在編碼序列之3,末端含有聚腺苷酸化位點。 載體係本發明之可用組件。具體而言，可藉助載體將本 發明啟動子及/或啟動子控制元件遞送至諸如細胞等系統 中。出於本發明之目的，該遞送可介於將啟動子或啟動子 控制元件自身簡單地隨機引入細胞中至整合含有本發明啟 動子或啟動子控制元件之選殖載體範圍内。因此，載體不 一定夂限於能在宿主細胞中自主複製之DNA分子，例如質 粒、黏粒或細菌噬菌體。涵蓋所有遞送本發明啟動子及啟 動子控制元件之其他方式。多種可用載體可自市場上購 得。因此，在另一態樣中，本發明提供包含本發明啟動子 或聚核苷酸構築體之載體。 載體可源自質粒、黏粒、噬菌體及病毒。載體包括直接 DNA遞送載體及用於土壌桿菌（Agr〇bacterium)介導之基因 轉移之載體。直接DNA遞送載體及基於土壤桿菌之載體及 其構造方法為業内所熟知且揭示於（例如）以下文獻中： 「Gene Transfer to Plants」，potrykus等人編輯，Springer- 152350.doc -29- 201142029

Hag，Berlin 1995 及「Plant M〇lecular Bi〇1〇gy: A Practical Approach」，Shaw 編輯，IRL press，〇xf〇rd 1988。 用於直接DNA遞送之載體一般在可選擇細菌複製子中含 有本發明聚核苷酸構築體，且可另外含有其他調節元件、 報道基因及可選擇標記。用於土壌桿菌介導之基因轉移之 載體一般具有以下功能：使得可維持在大腸桿菌（E c〇H) 及土壤才干菌中’自大腸桿菌轉移至土壞桿菌中，及容許土 壤捍菌T-DNA邊界片段。載體可為整合載體或二元載體。 在一較佳實施例中，載體係用於土壌桿菌介導之基因轉移 之二元載體。 載體可另外含有可選擇標記及報道基因以幫助鑑別及選 擇經轉化細胞，且含有適宜調節序列以使得可在植物中表 現。Weising等人（1988) Annual Rev. Genetics 22:241 閣述 可包括於標的載體中之組件，例如聚腺苷酸化序列、標記 基因、報道基因、增強子及内含子。 本發明載體一般可含有可選擇標記或報道基因或二者以 幫助鑑別及選擇經轉化細胞。或者，可選擇標記可載於單 獨載體上並用於共轉化程序中。可選擇標記及報道基因二 者側翼可具有適宜調節序列以使得可在植物中表現。可用 可選擇標§己為業内所熟知且包括（例如）抗生素及除草劑抗 性基因。該等基因之具體實例揭示於Weising等人（見上文） 及 Miki 及 McHugh (Journal of Biotechnology，2004，107. 193-232)中。其他可選擇標記基因包括編碼以下酶之基 152350.doc •30- 201142029 因··木糖異構酶、碌酸甘露糖異構酶、胺猜水合酶、乙酿 乳酸合酶、EPSP合成酶、麩醯胺酸合成酶、色胺酸脫羧 酶。較佳可選擇標記基因係潮黴素㈣酸轉#酶咖)編碼 序列，其可源自大腸桿菌。其他業内已知之較佳可選擇標 記包括轉座子Tn5 (Aphll)之胺基糖苷磷酸轉移酶基因，其 編碼針對抗生素卡那黴素（kanamycin)、新徽素（ne〇mycin) 及〇418之抗性；以及彼等編碼針對草甘膦、雙丙氨磷 (b〗alaph〇s)、氨甲喋呤、咪唑啉酮、磺醯脲、溴苯腈、茅 草枯（dalapon)及諸如此類之抗性或耐受性之基因。賦予除 草劑耐受性之可選擇標記基因在所得經轉化植物中亦具有 商業用途。 為確定編碼序列與接受植物細胞之特定組合適用於本文 中，載體可包括報道基因。編碼易分析標記蛋白之報道基 因為業内所熟知。一般而言，報道基因係接受有機體或組 織中不存在或不表現且編碼表現顯示一些易檢測特性（例 如酶活性之表型變化）之蛋白質。該等基因之實例展示於 Weising等人，上述文獻中。較佳基因包括大腸桿菌中 uidA基因座之β_葡糖醛酸糖苷酶（gus)基因、來自大腸桿菌 中Tn9之氯黴素乙醯轉移酶（cat)基因、來自維多利亞多管 水母（Aequoria victoria)之綠色螢光蛋白（GFP)基因及來自 北美螢火蟲（Photinus pyralis)之螢光素酶（luc)基因。 諸如内含子、增強子、聚腺苷酸化序列及諸如此類等其 他元件亦可存於本發明構築體或載體中。該等元件必須與 基因構築體中之其餘部分相容。該等元件可能係或並非基 152350,doc •31· 201142029 因功能所需’但其可藉由影響轉錄來使基因具有更佳表現 或功月b使mRNA穩定或諸如此類。該等元件可包括於所 議苦酸中，以使植物中之轉化基因具有最佳性能。舉 例而。玉米Adhl S第-内含子可位於啟動子與編碼序列 之門已*此内3子在包括於基因構築體中時，一般可提 高玉米細胞中之蛋白質表現（CaUis等人（1987) Genes Dev 1:1183)。然而，可選擇標記經常不使用内含子即可充分表 現而具有良好性能（Battraw等人（199〇) piant Μ〇ι則〇1 15:527)。 諸如增強子等轉錄活化劑包括菸草嵌紋病毒（TMV)轉譯 活化劑（W087/07644)及煙草蝕紋病毒（TEV)轉譯活化劑 (Carrington 等人（1990) J. Virol. 64:1590)。聚腺苷酸化及 終止子調節序列包括細菌源序列，例如根癌土壤桿菌 (Agrobacterium iumifaciens)之胭脂鹼合酶（nos)終止子；或 植物源序列，例如組蛋白終止子（EP 06333 1 7)。包含與編 碼序列以可操作方式連接之本發明啟動子之載體亦可包含 編碼轉運肽之序列，以驅使由編碼序列編碼之蛋白進入植 物細胞之色質體中。該等轉運肽為熟習此項技術者所熟 知’且可包括單一轉運肽，及藉由編碼至少兩個轉運狀之 序列組合獲得之多重轉運肽。 2.3植物、植物組織及植物細胞之轉化 將本發明聚核苷酸構築體引入植物基因組中之技術為業 内所熟知且闡述於（例如）以下文獻中：Sdgi等人（Bi〇/ Technology，1995，13，481-485)、May 等人（Bio/Technology， 152350.doc -32- 201142029 1995，13, 485-492)、Zhong等人（Piant phySi〇i·，1996，11〇, 1097-1107) ^本發明構築體係藉由業内已知方法引入植物’ 細胞中。直接基因轉移方法包括藉由顯微注射、電穿孔、 化學誘導之DNA攝取（P〇trykUS，上述文獻）及生物彈道（微 彈轟擊法）方法（Klein等人（1987) Nature 327:7〇)將基因轉 移至原生質體中。土壤桿菌介導之基因轉移方法包括葉盤 轉化、原生質體培養、種子轉化、莖或根外植體、植株原 位真空滲入法（Potrykus ’上述文獻）及花序轉化法（美國專 利第 6,037,522號）。 本發明另-目標係提供經轉化宿主細胞、較佳經轉化植 物細胞，其包含具有植物啟動子活性且與異源性（外來或 内源性）編碼序列以可操作方式連接之聚核苷酸序列，及 更具體而言上文所述之本發明聚核普酸構築體或其片段。 較佳地將本發明該啟動子聚核芽酸或該聚核苦酸構築 體穩定納入該植物細胞之基因組中。本發明亦涵蓋產生經 轉化宿主細胞、較佳植物細胞之方法，其包含向可再生植 物細胞中以本發明聚核㈣構築體以產生經轉化植物細 胞及鑑別或選擇經轉化植物細胞。 可引入本發明聚核苷酸之植物細胞包括所有可轉移入聚 h苦I之植物之細胞。植物細胞包括諸如愈傷组織等未分 化組織及諸如胚胎、植株部分、植株、果實及種子等已分 化組織。本發明啟動子可用於單子葉及雙子葉植物細胞 令。在一較佳實施例中’本發明啟動子用於屬於以下種類 之植物物種之植物細胞中：爸薦科、禾本科、十字花科或 J52350.doc • 33 - 201142029 茄科；或用於來自以下之植物細胞中：大豆、向日葵、甜 菜、紫花苜辖、花生、棉花、咖钟、椰子、鳳梨或松橘類 水果。在一更佳實施例中，該經轉化植物細胞係來自以下 之植物細胞：香蕉、水稻、玉米、小麥、大麥、燕麥、裸 麥、高粱、甘蔗、馬鈐薯、番茄、煙草或油菜。 在特疋實施例中，用本發明啟動子、聚核苷酸構築體戋 載體轉化植物細胞可賦予所轉化細胞以表型特徵。 本發明啟動子、聚核苷酸構築體、載體及植物細胞可用 於在活體外製備重組體基因產&，及用於製備具有所 性之轉基因植物。 因此，本發明之另一態樣提供轉基因植物、其子代、其 植株部分、植物組織、植物果實及種子及其他部分，其含 有穩定整合至基因組中之本發明聚核苷酸構築體、較佳 DNA構築體。因此，本發明提供轉基因植物、其子代、植 株部分、植物組織、其果實及種子及其他部分，其包含與 異源!·生序列（其係、本文所述編碼序列或另—調節序列）以可 操作方式連接之本發明啟動子活性聚核㈣或包含本文所 述聚核苷酸構築體。 涵蓋單子葉及雙子葉植物二者。已證實，本發明啟動子 可引導單子葉及雙子葉植物二者t之表現。在特定實= 中’包含啟動子或包含該等與異源性編碼序列或另-調節 序列以可操作方式連接之啟動子序列之聚核普酸構築體的 經轉化植物、其子代、其植株部分、植物組織、果實及種 子及其他部分來自屬於Η科、禾本科、十字花科或痴科 152350.doc •34· 201142029 之植物物種’或來自以下之植物細胞：大豆、肖日葵、甜 菜、紫花苜蓿、花生、棉花、咖啡、椰子、鳳梨或柑橘類 水果。在一更佳實施例中’該等經轉化植物、其子代、其 植株部分、植物組織及種子及其他部分選自由以下組成^ 群··香，、水稻、玉米、小麥、大麥、燕麥、裸麥、高 粱、甘蔗、馬鈴薯、番茄、煙草及油菜。在特定實施例 甲’植物係、單子葉植物，更具體而言來自$Μ科及 科。 可對含有本發明聚核苷酸構築體之轉基因植物、其子 代、其植株部分、植物組織、植物果實及種子及其他部分 實施其他處理步驟，尤其食物處理步驟’包括（但不限於） 研磨、切割、剝皮、打漿、乾燥、蒸煮、洪培、油煎、冷 凍等。因a，本發明亦涵蓋包含本發明聚核普酸構築體之 經處理產物’例如但不限於食品。 本發明之特定實施例係關於包含本發明 酸構築體之錢植株。本發明讀定出新穎香薦=/ “可用於在香焦中引導轉基因表現。在欲避免使用非植物 啟動子時，此啟動子尤其受關注。本發明香筹、啟動子尤其 可用於在香Μ中引導組成型表現，該組成型表現在所需組 成型表現之疾病及/或害蟲（例如真菌）抗性或其他性狀（包 括產生諸如疫苗等蛋白質）背景中受人關注。因此，本發 明之特定實施例係關於香蕉植株或香蕉果實，《包含整合 至其基因組中之一或多種本發明聚核苷酸構築體，該等聚 核普酸構築體包含本發明具有植物啟動子活性之核普酸序 152350.doc 35- 201142029 列從而驅使一或多種基因表現並賦予該香蕉植株以目標 性狀》 下 在本發明其他特定實施例中’包含本發明啟動子或聚核 苷酸構築體之植物選自水稻及煙草。 根據本發明一特定態樣，用本發明啟動子、聚核苷酸構 築體或載體轉化植物細胞可賦予所轉化細胞以表型特徵。 植物細胞係藉由業内已知任一植物轉化方法（例如上文所 述之彼等）用聚核苷酸構築體來轉化，且藉由熟習此項技 術者熟知之方法使其再生成完整轉基因植物（Potrykus，上 述文獻；Shaw，上述文獻）。在植株原位轉化方法甲，不 需要再生步驟。一般而言，用含有核酸構築體之土壤桿菌 接種嘀芽種子或受傷植物，使植物生長至成熟，並收集種 子’播種，並選擇轉化體。

製備包含本發明聚核苷酸構築體之轉基因植物之方法包 含用包含一或多種與異源性編碼序列以可操作方式連接之 本發明啟動子聚核苷酸（即包含SEQ ID NO:4之聚核苷酸或 其同系物或變體或其生物活性截短片段，例如包含SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3 或 SEQ ID NO:4 之聚核 普酸）之載體轉化植物細胞，從而提供經轉化植物細胞， 及自該經轉化植物細胞再生轉基因植物。製備包含本發明 聚核苷酸構築體之轉基因植物之另一方法包含用包含一或 多種與外來或内源性編碼序列以可操作方式連接之本發明 啟動子聚核苷酸（即包含SEQ ID N0:4之聚核苷酸或其同系 物或變體或其生物活性片段）之載體轉化種子或未成熟植 152350.doc -36 - 201142029 株，使該種子或植株生長至成熟，獲得植物種子，及自該 等種子生成轉基因植物。本發明轉基因植物之可用性在於 其可表現具有所需特性之基因產物，例如真菌抗性、疾病 抗性、昆蟲抗性、殺蟲劑抗性、炎熱、低溫或乾旱耐受 性、除草劑耐受性、經改良特性等等。 本發明所得經轉化植物在一或多種本發明啟動子序列控 制下表現***編碼序列。此一植物可用於習用育種方案中 以產生更多具有相同？文良表型特徵之經轉化植力，或將基 因引入其他多種相同或相關植物物種中。可使用已知植物 育種方法使本發㈣基因植物與類似轉基因植物或缺少與 編碼序列以可操作方式連接之本發明啟動子之植物雜交， 從而產生種子。仔自經轉化植物之種子含有作為穩定基因 組***物之基因。然後種植種子以獲得包含與本發明啟動 :操作性連接之目標編碼序列之雜交可育轉基因植物。雜 六β月轉基因植物可具有經由雌性親本或經由雄性親本遺 傳之特定表現盒。第二植株可為近交植株。雜交可育轉基 因植物可為雜合體。本發明亦包括該等雜交可育轉基因植 物中任一者之種子。 本發明另外體現為包含複數種本發明轉基因植物之作 物，該等植物係—起種植於農田中。 〜解並非排他性列表，而僅說明本發明聚核皆酸 及調節元件之眾多種用途。 闡述以下實例以更全面地閣釋本發明之較佳實施例。然 而，決不應將該等實例視為限制本發明之較寬範圍。 152350.doc •37· 201142029 實例 材料及方法 1.材料 用於感染、接種及基因選殖之不同香蕉地方品種以及其 特徵列示於表1中。 表1.香蕉地方品種

地方品種 基因組 組成 對Mi：之抗 性 來源 登錄號 代碼 「加爾各答4」 AA 完全抵抗 ITC Leuven ITC.0249 CA 「Tuu Gia」 AA 完全抵抗 ITC Leuven ITC.0610 TG 「大矮蕉」 AAA 易感 ITC Leuven ITC.0180 GN M.f.:香焦黑條葉斑病菌（Mycosphaerella fijiensis)， ITC :國際生物多樣性轉運中心（International Transit Centre of Bioversity)，Katholieke Universiteit Leuven o 對於遺傳轉化，採用以下四種物種及相應材料。 *在香蕉中，在補加有5 μΜ 2,4-D及1 μΜ玉米素之半濃 度MS培養基（Murashige及Skoog，1962)(稱作ΖΖ培養基）中 維持並繼代培養市售鮮果香蕉栽培種「大矮蕉」（GN， ITC.1256，細胞系128f及128h)之胚性細胞懸浮培養物 (Dhed'a等人，1991)。 *在水稻中，自標準日本產栽培種「日本晴 (Nipponbare)」之已滅菌成熟種子誘導胚性愈傷組織，如 Sallaud等人（2003)所述。 *對於擬南芥屬，在相同遺傳背景下在溫室中播種標準 生態型ColO及sgs2 [基因沉默抑制劑-SGS2編碼RNA依賴性 152350.doc -38- 201142029 RNA聚合酶，其在轉錄後（轉）基因沉默中具有關鍵作用 (Mourrain等人，2000)]突變體之種子（Elmayan等人，1998) 並使幼苗生長至始花期。 在溫室條件下自滅菌種子生長煙草（本塞姆氏煙草 (Nicotiana benthamiana))植株。然後使用完全發育（約8週 齡）植株之最幼葉以無針注射器實施滲入。 香蕉黑條葉斑病菌（M.f_)係廣泛分佈之破壞性香蕉葉條 斑病（稱作香蕉葉斑病（black Sigatoka))之病因因子。 香煮炭疽菌（匚〇1161：〇1；14(：111111111111836)[(8611<；.&]^.八· Curtis) Arx 1957] (C.m.)係香蕉果實病原體，但其亦可接 種於葉上（Postmaster等人，1997)。使用此病原體係因為其 在活體外接種實驗中比M.f.更有效。 2.接種及感染實驗 香蕉炭疽菌 自溫室植株（GN及TG)之幼葉切下葉片（5x5 cm)，在70% (v/v)乙醇中進行表面滅菌，在無菌水中沖洗並乾燥。之 後，用穿孔器在中央穿孔（直徑5 mm)且將葉片遠軸側向上 置於含有經3 ml水飽和之無菌厄特曼紙（Whatman paper)之 9 cm皮氏培養皿（Petri dish)中。自含有馬鈴薯右旋糖瓊脂 培養基（含有2°/。（w/v)葡萄糖及1.5% (w/v)瓊脂糖及7曰孢 子形成C.m.培養物）之皮氏培養皿中取出一栓狀物（直徑5 mm)(Nemestothy及Guest，1990)。使真菌側向下將該栓狀 物置於葉片之中央孔中。在28°C下培育皮氏培養皿且在48 h後自經接種葉分離總RNA(表2)。 152350.doc -39- 201142029

表2.用香蕉炭疽菌活體外感染 地 葉片中之孔 C.m.栓狀物 代碼 GN + - GN0 + + GNC TG + - TG0 + + TGC 香蕉Μ條葉斑病菌 在雨季開始時（6月中旬）在C0RBaNa (Corporaci0n

Bananera Nacicmal，Gudpiles，哥斯達黎加）之天然感染試 驗田中收集葉材料。在兩個不同位置選擇「大矮蕉」（GN) 及「加爾各答4」（C A)植株。在早晨收集該等植株中之一半 最幼及次幼葉（並非煙草葉），將其置於乾冰上，在乾冰上 運輸至比利時並分離總RNA»每3至4天觀察剩餘一半葉直 至症狀變得可見。該等數據表明，在收集時該等葉的確已 感染（表3^ 在收集葉後兩天，自所選植株切下含有分生組織之球莖 丁，將其消毒並置於運輸用起始培養基上。在到達比利時 後，所有培養物最終皆受到微生物感染之污染，因此以無 菌方式切除分生組織並使其再生成小植株。在冬季〇月）， 將每個地方品種之兩個植株轉移至溫室中之盆中且在一個 月後轉移至土壌中。在4-5個月後（5月）植株已達到可接受 之高度時，分離總RNA。已測試所選植株中Bsv、CMV及 馬鈐薯Y病毒（potyvims)之存在，但該等植株無完全不含 病毒者（表3)。 152350.doc -40· 201142029 表3 ·植物表徵及香蕉黑條葉斑病菌之田間感染 地方 品種 植物 代碼 病毒測試 症狀(天數)h 代碼 未感染 已感染 BSVe CMVf PV8 葉1* 葉2j 葉〇_ 葉1· 葉2J GN KUL2 + - + 12 6 GN2〇 gn2i GN22 CA KUL4 + - + 48 39 CA4O CA41 CA42 CA KUL5 + - 84 75 ca5o ca51 CA52 e香蕉條斑病毒。f黃瓜花葉病毒。g馬鈴薯Y病毒。h在剩 餘一半葉上症狀可見時之天數（在收集一半葉後）。；葉1係 已感染植株中與煙草葉分離之最幼葉。]葉2係已感染植株 中與煙草葉分離之次幼葉。1葉0係未感染植株中與煙草葉 分離之最幼葉。 3.軟體及電腦分析 軟想 所有序列處理（比對、轉譯等）皆係用OMIGA 1.1.3版軟 體（Oxford Molecular Group, PLC)來實施。對於核酸濃度 之定量量測，採用Biolise (Labsystems)軟體。 保守引物設計 正向引物及反向引物係基於六種其他植物物種中10個 PAL基因之保守區之比對來設計（表4)。 表4.用於保守引物設計之異源性PAL基因 種類 植物物種 基因庫(GenBank)登錄號 單子葉植物 稻(Oryza sativa) X87946 XI6099 小麥(Triticum aestivum) X99705 雙子葉植物 煙草(Nicotiana tabacum) AB008199 AB008200 X78269 腕豆(Pisum sativum) D10002 D10003 紫苜蓿(Medicago sativa) X58180 經梨(Persea americana) U16130 152350.doc -41- 201142029 序列分析 在基因庫（國家生物技術資訊中心（National Centre for Biotechnology Information，NCBI)中用 BLAST軟體經由網 路 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/搜索與所得序列之 同源性（Altschul等人，1990及1997)。為在數據庫中比較核 苷酸序列與^苷酸序列，以默認設置使用針對「nr」數據 庫（基因庫+RefSeq核苷酸+EMBL+DDBJ+PDB)之 BLASTn(標準核苷酸-核苷酸BLAST)，只是使用低複雜度 過濾、器。亦在水稻（http://redb.ncpgr.cn/)、水稻基因組計 劃（Rice Genome Project) (http://riceblast.dna.affrc_go.jp/) 及全球香蕉基因組學聯合會（Global Musa Genomics Consortium)之表現序列標籤（EST)數據庫中對序列實施 BLASTn搜索。 為在數據庫中比較核苷酸序列與胺基酸序列’以默認設 置採用針對「nr」數據庫之BLASTx(核苷酸詢問-蛋白質 db)，只是使用低複雜度過濾器。 為在數據庫中比較胺基酸序列與胺基酸序列’使用 BLASTp(標準蛋白質-蛋白質BLAST)以及「nr」數據庫及 默認設置，只是使用低複雜度過濾器。若預期E值低於e_G5 之閾值，則認為序列與數據庫中之匹配序列同源’但亦藉 由肉眼個別評估每一情形。 藉由結構域搜索軟體interpr〇來檢驗所鑑別PAL基因 (Mulder 等人 ’ 2003 ; http://www.ebi.ac.uk/interpro/)。亦 使用SMART軟體以默認設置來搜索蛋白質結構域（Schultz 152350.doc • 42· 201142029 等人，1998 ; http://smart.embl-heidelberg.de/)。 所選殖啟動子序列之第一次分析係經由網路在PLACE數 據庫（www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)中詢問該等序列來實 施。重複序列及長末端重複序列（LTR)係使用回文序列軟 體（http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/palindrome.html)來 分析。 統計分析 對於在轉基因植物之田間評估期間收集之表現數據之統 計評估’採用STATISTICA®軟體包（第5版，StatSoft)來實 施方差分析（ANOVA)。對於AN0VA之有效解釋，必須滿 足兩個條件：（i)不同樣品間之方差係同質方差，且（ii)因 變量（例如組織、葉齡等）之數據符合組（處理）内之正態分 佈。 對於方差之同質性，使用萊氏測試（Levene's test) (Levene，1960):若萊氏測試之所得p值高於0 05，則隨機 抽樣效應可能會引起樣品方差之間產生較小差異。因此， 維持等方差性之虛無假設且得出結論，種群中之方差之間 無差異。若不滿足此條件’則首先對數據實施對數 [log(x)]或平方根轉化，並重複萊氏測試。 對於小規模或中等規模（最多5〇〇〇個）樣品之正態性評 估，人們認為夏皮羅-威爾克測試（shapir〇_wilk test) (Shapiro及Wilk，1965)最為可靠：若夏皮羅·威爾克測試之 所得P值高於0.05，則維持數據正態性之虛無假設且繼續 進行參數AN0VA。或者’可使用離群值之鑑別（參見下文） 152350.doc • 43- 201142029 作為對正態性之簡單檢驗。 一旦藉由ANOVA確定統計學上顯著之總體差異’事後 測試通常可鑑別出彼此顯著不同之群。出於此目的’使用 鄭肯多範圍測試（Duncan’s multiple range test) (Duncan， 195 5)，此乃因其可耐受不等組員數。 所有上述測試皆涵蓋於STATISTICA®中’且因此係在此 軟體包内實施。然後以標準盒狀圖形式呈現所得結果。 4. 核酸處理 對DNA及RNA之處理係使用已知方法來實施，例如 Sambrook等人（Molecular Cloning: a Laboratory Manual， 第 2版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour N.Y. [1989]，其全部内容係以交叉參考方式併入 本文中）所述之彼等。試劑及其他材料得自商業來源或如 其他部分所述。 5. 核酸分離 *質粒DNA分離係用Plasmid Mini套組（Qiagen)或 QIAprep Spin Miniprep套組（Qiagen)根據製造商說明書來 實施。 *基因組DNA係根據經修改Dellaporta方案（Dellaporta等 人 ’ 1983)及 DNeasy Plant Mini 套組（Qiagen)之組合來分 離。 *RNA係自C.m.接種實驗中之香蕉葉使用RNeasy方案 (Qiagen)來分離且係自M.f·感染實驗中之葉使用Aijanabi方 案來分離。將總RNA儲存在1 mM棒檬酸Na (pH 6.4)中（此 152350.doc -44- 201142029 係RNA儲存溶液之組成，Ambion)。 RNeasy 方案：RNA 係使用 RNeasy Plant Mini 套組 (Qiagen)根據製造商說明書來分離。RLT緩衝液補加有2% (w/v)聚乙稀0比洛咬顚|(PVP MW 10,000)及1% (ν/ν) β-疏基 乙醇。 經修改Aljanabi方法：修改產生大量共分離RNA之基因 組 DNA 分離方案（Aljanabi 及 Martinez, 1997)以供 RNA 分 離。提取緩衝液補加有2% (w/v) PVP及1% (ν/ν) β-巯基乙 醇，且用氯仿提取RNA，然後用6 M LiCl沉澱以使其與溶 液中之DNA分離。 6. 核酸之定量 * DNA濃度係使用 PicoGreen試劑（Molecular Probes)來測 定。在480 nm下激發後，在520 nm下於SPECTRAFluor Plus微量滴定板讀取器（Tecan)中量測螢光。用Biolise軟體 (Labsystems)分析數據。 * RNA濃度係使用 SYBR Green II試劑（Molecular Probes) 來測定（Schmidt及Ernst，1995)。在495 nm下激發後，在 530 nm下於SPECTRAFluor Plus微量滴定板讀取器中量測 螢光。用Biolise軟體分析數據。 7. RNA之DNA酶I處理 用DNA酶I處理欲用於RT-PCR中之RNA以移除DNA污染 且由此避免假陽性結果。 在DNA酶I處理中，將20 pg總RNA及20 U DNA酶I (Ambion)在 ΙχΜη緩衝液（660 μΜ MnCl2及 10 mM Tris-HCl， 152350.doc -45- 201142029 pH 7.8)中及37°C下培育30 min。之後，添加EDTA至終濃 度為2.5 mM以在熱滅活步驟期間避免RNA在二價陽離子存 在下降解，且藉由在75°C下培育5 min來使該酶失活。 DNA酶I處理係藉由用ACTIN引物實施PCR來驗證。陰性 PCR結果顯示總DNA移除。 8.擴增反應 5.7. PC7?·指定以下參數用於吾人之標準PCR方案： 酶： 0.025 U/pL Taq DNA聚合酶（Qiagen)或 0.025 U/pL Hot Star Taq DNA聚合酶（Qiagen) 緩衝液：lxPCR緩衝液（1.5 mM MgCl2) (Qiagen) dNTP : 200 μΜ 引物： 0.5 μΜ 引物解鏈溫度之計算：Tm=2 (AT數）+4 (GC數） 引物序列始終按Y至3’方向書寫。正向引物具有與 mRNA相同之序列；反向引物具有反向互補序列。 模板： 0.25 ng/pL DNA 程式： 初始變性 94〇C 02'00"或 95〇C 15'00’·，對於Hot Star Taq 變性 94〇C 00Ί5" 引物複性 54至 58〇C 00'20" (溫度取決於引物） 引物延伸 72〇C 00'20·，至 l'OO" (時間取決於預期產物大小） 循環數 X35 152350.doc • 46· 201142029 (自變性開始） 最終延伸 72°C 02Ό0" 設備： Eppendorf Mastercycler 梯度（或 Perkin-Elmer Gene Amp 9700) 〇 5.2兩在兩步式RT-PCR中，首先使用聚（dT)引 物實施逆轉錄且將所得總cDNA添加至單獨PCR反應中。 反應組份： lx RT缓衝液（Qiagen)

500 μΜ dNTP 1 μΜ dT12-i8 引物 1 υ/μί 抗 RNA 酶(Ambion)以抑制 RNA 酶 0.2 υ/μί Omniscript逆轉錄酶（Qiagen) 100 ng/pL經DNA酶處理之總ARNA(在65°C 下加熱5 min以使RNA變性） 反應條件： 在37°C下培育1 h 在PCR中使用總cDNA作為模板（7.5 ng/pL RNA當量）， 且在第二步驟中使用Hot Star Taq DNA聚合酶： 酶： 0.025 U/pL Hot Star Taq DNA聚合酶 緩衝液：lxPCR緩衝液（1.5 mM MgCl2) dNTP : 300 μΜ 引物： 0.5 pM(PALF2-PALRl，表 6)

模板： 7.5 ng經DNA酶處理之RNA 程式： 初始變性 95〇C 15W 變性 94〇C 00Ί5' 引物複性 53〇C 00'20' 152350.doc -47- 201142029 引物延伸 72°C 00'20" 循環數 x35 (ACTINX24) 最終延伸 72°C 02Ό0" 設備： Mastercycler梯度（Eppendorf) 8.3 半定量二重RT-PCR (SQD RT-PCR) 為以定量方式解釋RT-PCR結果，擴增必須在線性範圍 内。擴增之線性範圍係藉由將RT-PCR反應分為若干個等 份並在不同循環數後分析其每一者來確定。SQD RT-PCR 中用於ACTIN引物之優化參數係：150 ng模板，24-28個循 環，及51-56°C複性溫度。 酶： Hot Star Taq DNA聚合酶 引物： ACTINF-. ACTINR+PALF2-PALR1 程式： 逆轉錄 60°C 30Ό0" 初始變性 95〇C 15Ό0" 變性 94〇C 00Ί5" 引物複性 51°C 00'20" 引物延伸 72〇C 00'20" 循環數 x36 (ACTIN:x28) 最終延伸 72〇C 10,00M 設備： Mastercycler 梯度 總cDNA係根據兩步式RT-PCR來合成。隨後，測定 ACTIN引物（見上文）及特異性PAL引物之線性擴增範圍。 此係基於擴增產物強度與不同模板之差異來實施，其指示 線性範圍。然後實施二重RT-PCR，但首先僅添加線性擴 152350.doc -48- 201142029 增所需之使用最高循環數之引物對。在所需循環數後，亦 將其他引物對添加至PCR反應中。兩個引物對在反應中之 最終濃度為0.5 μΜ » 對於每次SQD RT-PCR而言，亦平行實施單重反應（一次 反應使用ACTIN引物且一次反應使用PAL特異性引物）作為 二重RT-PCR之對照。單獨反應之相對譜帶強度（藉由肉眼 來估算或藉由ImageJ軟體1.37k版，NIH，USA來量測）通常 與二重反應之彼等類似（數據未顯示）。PAL基因表現比率 始終係相對於ACTIN之表現比率來考慮，且二者之擴增皆 在其各自之線性範圍内。 對於組特異性SQD RT-PCR，採用以下參數： 酶： Hot Star Taq DNA 聚合酶 引物組合：PALGNF1-PALGNR1、PALGNF2-PALGNR2、 PALGNF3-PALGNR3、PALCAF4-PALCAR4(參見表 10) 程式： 逆轉錄 60°C 30Ό0" 初始變性

95〇C 15Ό0" 變性

94〇C 00Ί5' 引物複性 67.5°C 00'20" 第1組

67.0〇C 第2組

62.0〇C 第3組

63.0〇C 第4組 引物延伸 72°C 00'20" 循環數 x35，第1及4組（ACTIN:x30) x34 >第2組 152350.doc •49· 201142029 x40，第3組 最終延伸 72°C 02Ό0" 設備： Mastercycler 梯度 9.藉由TAIL-PCR實施基因步移 TAIL-PCR(熱不對稱交錯PCR)係由三個連續PCR回合組 成，其中使用任意（簡並性）引物及巢式基因特異性引物 (Liu及 Huang，1998 ; Terauchi及 Kahl，2000)。 引物設計 每一回合中之正向引物係任意簡並性引物（ADI、AD2或 AD3)或任意引物（RA1至RA5)。巢式反向引物係基於第2組 特異性（GS)序列：PALCAR2或PAL2TAILR1分別用於第一 及第二延長步驟中之第一 PCR、PALGNR2或PAL2TAILR2 用於第二PCR、且PAL2IR或PAL2TAILR用於第三PCR(表 5)。 表5. TAIL引物 名稱 取向 序列(5W) Tro 位置 SEQ (°C) ID NO: AD1 正向 SCA CNT CST NGT NTC T 49 n.a. 5 AD2 正向 NGT CGA S WG ANA WGA A 46 n.a. 6 AD3 正向 WGT GNA GWA NCA NAG A 45 n.a. 7 RA1 正向 GAG CTT GAAC 30 n.a. 8 RA2 正向 ATCTCGCTAG 30 n.a. 9 RA3 正向 CTGATC CATG 30 n.a. 10 RA4 正向 TCCACT GGCA 32 n.a. 11 RA5 正向 GGTACTCCAC 32 n.a. 12 PALCAR2 反向 TTC CCG ATG GCG GCG AC 58 308-324* 13 PALGNR2 反向 GAT GGA CTT GGT GGA GGC G 62 166-184* 14 PAL2IR 反向 TCC TGC TTC GGC TTC TGC AGT 66 88-108* 15 PAL2TAILR1 反向 ACC CTA ACC GCC GAG TGG 60 572-589** 16 PAL2TAILR2 反向 CTG CCG TTC GCA TGG ACG 60 386-403** 17 PAL2TAILR 反向 CTT CAA CCA CTG GAT CGG TC 62 199-218** 18 縮寫：S = G+C，N=A+G+C + T，W=A+T，n.a.:不適用。 152350.doc -50- 201142029 *基於圖4中之序列比對，**與第一步驟TAIL-PCR中之AD2 引物之距離 方案

AD或RA(正向）引物：2 Μ GS(反向）引物：0.15 μΜ $ -PCR 引物組合：ADl/2/3+PALGNR2(第一步驟），RA1/2/3/4/5 + PAL2TAILR1(第二步驟） 程式： 94°C 02Ό0" 94〇C 0Γ00" 64〇C 00'20" 72〇C 03Ό0" x5 94〇C 0Γ00" 27.5〇C 03 W， 72〇C 03Ό0" 之後實施15個以下循環： 94〇C 00'30" 64〇C 0Γ00" 72〇C 03Ό0" x2 94〇C 00'30" 44°C或42°C 0Γ00”（分別對於AD或RA引物） 72〇C 03Ό0" 之後實施：72°C 03 W' 酶：二倍量之TaqDNA聚合酶 ，在第一 PCR中 152350.doc -51 - 201142029 模板（第一步驟）：DNA GN、DNA CA、pPALGNl(10·5稀釋 液）、pPALCA2(10·5 稀釋液）、pPALGN3(l(T5 稀釋液）、 pPALCA4( 10_5稀釋液）（參見表9及其腳註） 模板（第二步驟）：DNA GN、DNA CA、pPAL2AD2CA07 (1〇·5稀釋液，參見表 11)、pPAL4ADlGN12(10·5稀釋液， 第4組特異性對照）

第二 PCR 引物組合：ADl/2/3+PALCAR2(第一步驟）、RA1/2/3/4/5 + PAL2TAILR2(第二步驟） 程式： 12個以下循環： 94〇C 00'30'丨 64〇C 01Ό0" 72〇C 03Ό0" x2 94〇C 00'30" 44°C或42°C 0Γ00"(分別對於AD或RA引物） 72〇C 03Ό0" 之後實施：72°C 03’00” 模板： 第一 PCR lOOx稀釋

第三PCR 引物組合：AD1/2/3+PAL2IR(第一步驟）、RA1/2/3/4/5 + PAL2TAILR(第二步驟） 程式： 10個如第二PCR中之循環： 模板： 第二PCR 100 X稀釋 10. PCR選殖及純系分析 152350.doc •52· 201142029 使用ΤΟΡΟ ΤΑ選殖套組或測序用ΤΟΡΟ ΤΑ選殖套組（皆 購自Invitrogen)根據製造商說明書來直接選殖PCR產物。 使用TOPO XL PCR選殖套組（Invitrogen)根據製造商說明書 直接選殖較大PCR產物（>3 kb)。 根據Maas (1999)實施藍-白篩選。將X-Gal鋪展至過夜生 長之板上而非將基質尜加至瓊脂培養基中。在使用500 pg/mL之X-Gal濃度時，在3 h後出現藍色。 對於PCR純系分析，將上樣染料（〇.25x)直接添加至PCR 反應中（Menossi等人，2000)。 11. 核苷酸測序 在 Genetic Service Facility(Flemish Institute for Biotechnology，VIB，Wilrijk，比利時）對純系實施定製測 序。在模板或質粒製備後，使用ABI PRISM® BigDye™ 終止子循環測序套組（Applied Biosystems, Foster City, CA， USA)實施測序且在Applied Biosystems 3730 DNA分析儀上 進行反應。 12. 載體構造 二元表現載體？0八]^81八13912(11，226 5?，基因庫登錄號 AF2343 12)用作通用載體，其確保所有構築體除***啟動 子外具有相同骨架及T-DNA。pCAMBIA1391z包含含有無 啟動子内含子之gusAINT基因作為報道基因及嵌合潮黴素鱗 酸轉移酶（hpt)基因作為可選擇標記基因。EcoRI位點（序列 位置11，056)用作四種香蕉啟動子序列之***點以生成載體 pLS13-16(圖1及2) »對於對照啟動子，在相同多選殖區（介 152350.doc .53· 201142029 於序列位置11，026-11，061之間）中採用BamHI/ Hindlll(花椰 菜花葉病毒35S RNA及玉米ubil啟動子，分別為pLS23及 pLS25)或Ncol/Hindlll(擬南芥屬植物防禦素啟動子， pLS26)之雙重消化。重組體純系係藉由核苷酸測序（如上 所述）來驗證且正確純系係藉由電穿孔至根癌土壤桿菌菌 株EHA105中來轉化。 另外，對於擬南芥屬轉化，在PFAJ3160載體中製備另外 五種 uidAINT 構築體（pLS35-39，表 13)(De Bolle 等人， 2003)，其含有用於植物對固殺草除草劑之抵抗之嵌合bar 可選擇標記基因而非hpt可選擇標記基因。pFAJ3160載體 亦含有35S對照啟動子：:1^(1八~1'融合體。 對於經由粒子轟擊實施之瞬時基因表現分析，在 pCAMBIA1291z(ll，378 bp，基因庫登錄號 AF234295)中製 備 pLS7-8(pCAS 及 pGNL)及 pLSll-12(pCAL 及 pGNS)，該 pCAMBIA1291z除了細菌可選擇標記基因以外與 pCAMBIA1391z相同。pAHC27(Christensen及 Quail，1996) 用作陽性對照，其在玉米ubil啟動子控制下含有相同但無 内含子之uidA基因。 13.植物轉化 ΨΜ 香蕉胚性細胞之瞬時轉化（見上文）係在自製粒子導入搶 中藉由粒子轟擊來實施，如Sdgi等人（1995)所述。瞬時報 道基因表現係藉由GUS表現之組織化學分析來測定（參見 下文）。 152350.doc -54- 201142029 入香蕉轉基因植物係藉由以下方式來生成：實施土壤桿菌 ”導之胚性細胞懸浮液之轉化，之後選擇轉基因集落且根 丁準方案自其實施植物分化（P6rez-Hern^ndez等人， 2006) ° 使含有個別啟動子：：gusAINT 口“載體之根癌土壞桿菌菌 株EHA105在補加有適宜抗生素之γΕρ培養基（1〇 g/L細菌 用酵母提取物，1〇 g/L細菌蛋白脒，5 g/L Nac卜pH 7.5) 中生長20-24 h。將細菌培養物稀釋至〇d6〇〇為約〇.4單位且 隨後將其轉移至含有用於誘導之2〇〇 μΜ乙醯丁香酮（AS)之 無抗生素ZZ培養基（ρΗ5·6)中。 將市售鮮果香蕉栽培種「大矮蕉」（GN ’細胞系128£及 128h)之200 pL胚性細胞懸浮液以33%沉降細胞體積（± 5〇 mg細胞鮮重）與丨mL經誘導土壌桿菌在24孔板之孔中混合 並在暗環境及25°C下於旋轉振盪器（25 rpm)上培育6 h。在 補加有200 μΜ AS之ZZ培養基（ρΗ 5·6)上共培養丨週後，將 具有細胞之網狀物轉移至含有50 mg/L潮黴素及2〇〇 mg/L 特美汀（timentin)之選擇性ZZ培養基（pH 5.8)上且經2至3個 月每2週繼代培養。使單獨挑選之獨立轉基因細胞集落進 一步再生為完整植株係如先前所述來實施（Dhed,a等人， 1991 ; Sdgi等人，1995)。 其他植物物種 *水稻轉化係藉由土壤桿菌介導之標準日本產栽培種 「曰本晴」之成熟種子源胚性愈傷組織之共培養來實施， 如Sallaud等人（2003)所述。對所選初代再生體實施組織化 152350.doc •55· 201142029 學GUS染色。 *始花期之擬南芥屬植物（生態型ColO，參見1.1.1.)係遵 循Clough及Bent (1998)之植株原位程序來轉化。收穫種 子，將其播種於土壤中，之後藉由除草劑（Basta)噴霧及組 織化學GUS染色來選擇。 *煙草（本塞姆氏煙草）係藉由對盆栽植株上之完全成熟 葉實施土壤桿菌滲入來瞬時轉化。在滲入後兩天，對葉進 行分離及染色以供組織化學GUS分析。

14.對轉基因植物之分析 PCR 為檢驗在香蕉植株中是否存在轉基因，基於自活體外小 植株分離之DNA模板實施PCR(參見2.5.1.)。引物（正向： 5，-CTTCTACACAGCCATCGGTC-3’（SEQ ID NO: 19)及反 向：5'-GACCTGCCTGAAACCGAACTG-3，)(SEQ ID ΝΟ··20) 擴增潮黴素磷酸轉移酶（hpt)基因之668-bp片段，該基因已 用作可選擇標記基因。 PCR循環程式為：在95t：下2 min，（在95°C下30秒，在 Tann下 30秒，在 68°C 下 1 min)x3(在 68°C、66°C、64°C 及 62°C之每一 Tann下），（在95°C下30秒，在60°C下30秒，在 68°C下1 min)x3 0，且最後在68°C下2 min，之後儲存在4°C 下。 組織化學GVS分析

製備含有1 mg/mL X-Gluc(5-溴-4-氣-3-吲哚基-β_ϋ-葡糖 醛酸）基質之染色溶液，如Mendel等人（1989)所述。在37°C 152350.doc -56- 201142029 下將來自不同植物物種(香蕉、水稻、擬南芬属及本塞姆 氏煙草織（葉、根、花、梗、果肉、果皮及種子） 在染色溶液中培育3 h且在室溫下保持過夜，之後拍攝照 片。染色溶液通常以G.2% (w/v)補加有兩性離子去污劑 chAPS(3-[(3·膽酿胺丙基）_二曱基錄基丙續酸幻以促 進基質滲透至植物組織（主要係香蕉葉）中。 定量GUS酶活性分析 轉基因香蕉植株中之GUS酶活性係藉由標準定量螢光量 測分析來測定（Cervera，2004)。該方法係由以下步驟組 成：在含有 10 mM EDTA鈉、20〇/。（v/v)甲醇、2% (w/v) PW (MW 10，_)、〇.1% (w/v)月桂醯肌胺酸鈉、〇 ι% (Wv) Triton X-100 及 0.07% (v/v)卜巯基乙醇之 5〇 mM 磷酸 鈉緩衝液（PH 7)中實施總蛋白提取，之後藉由Bradf〇rd分 析使用牛血清白蛋白作為校準標準來測定蛋白質濃度。然 後用4-甲基傘形酮基_p_D_葡糖苷酸基質及螢光性4_甲基伞 形酮作為校準標準來量測GUS活性。在pi下培育i h後， 用0.2 Μ碳酸鈉溶液（pH 9.5)終止反應，且在 SPECTRAFluor P1US微量滴定板讀取器中量測螢光。 酶比活性係以皮莫耳MU/h/pg總蛋白表示。 15.轉基因田間評估

在自國家生物安全管理局獲得許可後，將總計145値香 蕉事件（即126個轉基因事件，其中66個事件含有四種香蕉 PAL啟動子中之一者，且60個獨立事件含有三種對照啟動 子中之每一者）及20個未轉化對照（亦係在活體外自相同GN 152350.doc •57- 201142029 細胞懸浮液再生，參見上文）轉移至哥斯達黎加田中。在 母事件中，將至少六個植株種植在小區塊中，其中各有 三個植株分佈在經殺真菌劑處理及未經處理之兩個主區塊 中。小區塊之位置隨機分佈在兩個主區塊内。另外，在網 至中设計用於66個轉基因香蕉pAL啟動子事件中之者 (82 /。）之對照實驗，以測試單獨殺真菌劑處理是否對啟動 子活性有影響。田間以及網室係由獨立生物安全稽核員定 期檢查。 按字母順序對含有構築體pLS13_16、pLS 23&pLS25 26 之轉基因品系以及未轉化對照品系進行編碼（A_H)以確保 田間之無偏盲評估。將在不同季節自不同植株部分（一或 多個葉、根、假莖、梗、果肉及果皮）收集之樣品轉移至 經“ s己铭袋中並在田間於乾冰上立即冷康。在_2〇c>C冷藏 庫中將冷康樣品儲存在乾冰上直至運輸。在到達比利時 後，將所有樣品儲存在-8 〇 冷藏庫中直至螢光或組織化 學GUS分析。 實例1·香蕉中PAL基因及致動子之鑑別及選殖 1.1.保守引物之設計 保守引物係基於來自六個植物物種之十個pAL基因之核 苷酸序列來設計（參見表4).。比對所分析十個pal基因中之 保守區使得可設計四個保守PAL引物。基於該等比對，設 計兩個正向引物（PALF1及PALF2)及兩個反向引物（PAlri 及PALR2)，如表6中所概述。在使用該等引物之所有組合 實施（RT-)PCR後之預期產物大小以及其在PAL編碼區上之 152350.doc -58 - 201142029 大致位置（圖3)列示於表7中。 表6.保守PAL引物之序列及解鏈溫度（Tm) 名稱 序列(5’-3’） Τπ,ΓΟ SEQ ID NO: PALF1 TCK YTK TCY TAC ATT GC Y GG 60.0 SEQIDNO:21 PALF2 AAG YTG AAG CAY CAY CCH GG 62.0 SEQ ID NO: 22 PALR1 TT GAA VCC RTA RTC CAA GCT 58.0 SEQ ID NO: 23 PALR2 GA GTT SAC RTC YTG GTT GTG 60.0 SEQ ID NO: 24

縮寫：K=G+T，Y=C+T，H=A+C+T，V=A+G+C， R=A+G，S = G+C 表7.用保守PAL引物獲得之預期（RT-)PCR產物大小（bp) 引物 PALR1 PALR2 PALF1 750 858 無内含子 無内含子 PALF2 452 560 無内含子 無内含子 1.2.使用保守PAL引物之（RT-)PCR分析 PCJ?分於：除PALF1-PALR2以外之所有引物組合皆產生 具有預期大小之產物。即使複性溫度降低至47°C，此引物 組合亦保持陰性（數據未顯示）。 及:對於C.m.接種，所有模板使用引物組合 PALF2-PALR1皆產生預期452 bp譜帶。來自經接種葉之產 物之強度高於來自對照葉之譜帶，其中對TG之誘導強於 GN(數據未顯示）。對於M.f.感染，產物大小亦經校正，但 其感染葉之間之強度無規律，其中CA —般強於GN(數據未 顯示）。該等觀察確認了先前的認知，即M.f.感染不具有可 複現性，且另一方面，C.m_接種對香蕉地方品種葉中之 152350.doc -59- 201142029 PAL基因表現產生可檢測之誘導。 半定量二重RT-PCR分析（SQD RT-PCR) 對於ΜΛ.氣 染，大部分模板使用引物組合PALF2-PALR1產生預期452 bp譜帶（數據未顯示）°來自經感染葉之產物強於彼等來自 對照葉者（數據未顯示）。慮及使用ACTIN之強度比率，GN 中之感染對PAL之誘導似乎較弱且在CA中之誘導更強。此 結果確認了先前RT_PCR實驗。 自所有樣品選殖pAL (RT-)PCR產物且對其進行測序以鑑 別基因家族成員（表8)。總計自GN獲得20個序列（14個來自 cDNA且6個來自gDNA)且自CA獲得17個序列（9個來自 cDNA且8個來自gDNA)。 根據核苷酸序列對該37個純系進行分組。在分組時不包 括純系 PAL-CA-05、PAL-CA-15、PAL-CA1-09、PAL-GN2-07及PAL-GN-03，此乃因其與該等組顯著不同或其序列品 質不佳。在其餘32個純系中，可區分四組PAL序列；每組 含有亞組，各亞組僅相差少數核苷酸（表9)。 第1-4組之序列皆與來自其他植物之PAL基因同源。在核 苷酸層面上’四組之間之同源性介於86%至95%範圍内（圖 4)，且對於轉譯序列而言介於95%至97%範圍内。第1、2 及4組含有得自經感染葉之片段（表9)。 152350.doc -60- 201142029 表8.來自（RT-)PCR反應之經測序純系之概述 模板 純系代碼 模板 純系代碼 RNAGN20 PAL-GN0-01 RNACA40 - RNAGN21 PAL-GN1-02 RNACA51 PAL-CA1-07 PAL-GN1-03 PAL-CA1-09 PAL-GN1-10 PAL-GN1-11 PAL-GN1-12 RNAGN22 PAL-GN2-01 RNACA52 PAL-CA2-01 PAL-GN2-02 PAL-CA2-03 PAL-GN2-07 PAL-CA2-11 PAL-GN2-08 PAL-CA2-19 PAL-GN2-11 PAL-CA2-24 PAL-GN2-12 PAL-CA2-26 PAL-GN2-15 PAL-CA2-29 PAL-GN2-16 DNAGN PAL-GN-01 DNACA PAL-CA-02 PAL-GN-03 PAL-CA-04 PAL-GN-05 PAL-CA-05 PAL-GN-06 PAL-CA-06 PAL-GN-15 PAL-CA-07 PAL-GN-17 PAL-CA-08 PAL-CA-09 PAL-CA-15 表9. PAL序列之分組 組 純系代碼 第1A組 PAL-CA2-03、 -11、-29、PAL-CA-04 第1B組 PAL-CA1-07、 PAL-CA2-19、-24、-26 第1C組 PAL-GN1-121 、PAL-GN-05、-15、-17 第1D組 PAL-CA-08 ' - 09 第2A組 PAL-GN1-10、 PAL-GN2-02、-08、-11 第2B組 PAL-GN2-15、 -16 第2C組 PAL-GN2-12、 PAL-CA2-012 第2D組 PAL-GN1-11、 PAL-GN2-01 第3A組 PAL-CA-02、· 07 第3B組 PAL-GN0-013 、PAL-GN-06 第3C組 PAL-GN-01 第4 A組 PAL-GN1-02、 -03 第4B組 PAL-CA-064 152350.doc -61 - 201142029 1代表第1組之純系及其質粒稱作pPALGNl。2代表第2組 之純系及其質粒稱作PPALCA2。3代表第3組之純系及其質 粒稱作PPALGN3。4代表第4組之純系及其質粒稱作 pPALCA4。 組特異性半定量二重RT-PCR (SQD RT-PCR) 設計組特異性引物用於第1至4組PAL(表10，圖4)。 表10.用於SQD RT-PCR之組特異性PAL引物 组 名稱 序列(5’-3’） Tm (°C) 位置* 大小 (bp) SEQ IDNo: 第1組 PALGNF1 TCA CGA GCA AGA CCC GCT G 62 73-91 112 25 PALGNR1 GAT GGA CTT GGT GGC GGA G 62 166-184 26 第2組 PALCAF2 GCT CCA CGA GCA AGA CCC AC 66 70-89 255 27 PALCAR2 TTC CCG ATG GCG GCG AC 58 308-324 28 第3組 PALGNF3 CCA CGA AGT CCA TCG AAC GT 62 171-190 222 29 PALGNR3 AAA GGT TCG AGG GGA GCC CA 64 373-392 30 第4組 PALCAF4 CCT CGA CGG AAG CTC GTT T 60 34-52 313 31 PALCAR4 GGA GAA CTG GGC GAA CAT C 60 328-346 32 *基於圖4中之序列比對 優化用於組特異性引物之RT-PCR條件（例如複性溫度）以 僅擴增其組中之片段。組特異性（SQD) RT-PCR分析之結果 概述如下： 第1組：對於GN及CA二者，在最幼葉中引起輕度誘導， 但在較老葉中具有相等表現或因感染引起下調 (數據未顯示）。 第2組：對於GN，在最幼葉中引起輕度誘導，且在較老 葉中具有相等表現。在CA中感染引起強誘導（數 據未顯示）。 第3組：對於GN，在最幼葉中引起輕度誘導，但在較老 152350.doc -62- 201142029 葉中因感染引起下調。在CA中亦因感染引起下 調（數據未顯示）。 第4組：在GN及CA二者中因感染引起輕度誘導（數據未顯 示）。 因此，RT-PCR確認了第2及4組之可誘導特徵，而第1組 及（如人們所預期）第3組不可誘導或甚至在感染後下調。在 第2及4組中，對於經感染樣品觀察到相對於對照樣品顯著 較強之信號。以下事實顯示引物具有高特異性：引物僅結 合（且特異性擴增）其來源組之初始純系，而與其他特異性 對照質粒之反應為陰性。此外，對另外兩個已用對第4組 具有特異性之引物擴增之RT-PCR產物（一個來自CA40且另 一個來自CA51)實施測序，且其與第4組初始序列100%— 致（數據未顯示）。此亦表明，各組之間之序列差異真實存 在而非係由於聚合酶錯誤摻入或測序誤差所致。 1.3.使用保守PAL引物之（RT-)PCR分析 選擇第2組來分離已知PAL序列之上游區域，包括啟動 子。嘗試了若干種方法；然而，反向PCR(Pang及Knecht， 1997)及錨定PCR (P0rez Herndndez, 2000)皆不能產生大於1 kb之清晰譜帶。相反，TAIL-PCR(熱不對稱交錯PCR)，一 種由三個使用任意簡並性（AD)引物及巢式基因特異性引物 之PCR回合組成之方法（Liu及Huang, 1 998 ; Terauchi及 Kahl，2000)獲得了令人滿意的結果。 藉由TAIL-PCR實施之第一延長步驟 使用AD3正向引物之所有反應皆產生斑點，且有用產物 152350.doc -63- 201142029 係在僅使用AD2引物之第三PCR中獲得。反向引物具有組 特異性，此乃因僅相應第2組質粒產生約2.4 kb之擴增產 物，而特異性對照質粒獲得預期陰性結果。對兩個2.4 kb 之產物進行選殖及測序（表11)。該等TAIL-PCR產物具有組 特異性，此乃因該等序列重疊且與第2組中之序列一致。 到達轉譯起始密碼子上游之最大距離為361 bp(對於gn)及 366 bp(對於CA)。除了 GN中具有6 bp之缺失以外，兩個序 列幾乎一致。 表11.藉由TAIL-PCR實施之第一延長步驟之結果 譜帶_大小(kb) 純系代瑪_自末端測序 |區之大小(bp) PAL2AD2GN 2.4 PAL2AD2GN01 PAL2AD2GN02 PAL2AD2GN03 5' 3' 3, …7败4八 417 680 544 PAL2AD2CA 2.4 PAL2AD2CA071 5' 720 PAL2AD2CA08 5' 392 PAL2AD2CA11 5' 608 ---Z.__ 152350.doc -64- 1 在TAIL-PCR之第二延長步驟中用作第2組特異性對照 質粒（p〇7) 藉由TAIL-PCR實施之第二延長步驟 實施TAIL-PCR之第二步驟以將序列進一步向上游延 長。 巢式反向引物係基於在TAIL-PCR之第一延長步驟中獲 得之組特異性序列：PAL2TAILR1用於第_ pCR， PAL2TAILR2 用於第二 PCR，且 PAL2TAILR用於第 sPCR。 由於正向AD引物與該等反向引物之組合產生斑點，故使 201142029 用其他任意引物（RA1至RA5)來代替（表5)。 可用產物係在僅使用RA1、RA3及RA4引物之第三PCR 中獲得。再次證實反向引物具有組特異性，此乃因僅相應 的第2組質粒（並非對第4組具有特異性者）產生擴增產物， 但顯示陰性之RA3除外（數據未顯示）。對1.1至3.0 kb之三 種產物實施選殖及測序（表12)。得自2TAIL01GN產物之兩 個純系在兩端含有RA1引物，故此係錯誤引導序列。其他 產物之邊界為正確引物序列且其具有第2組特異性，此乃 因PAL2TAILR引物之上游序列重疊（對於CA及GN分別為 219 bp及214 bp)且與先前延長TAIL-PCR中之產物一致。 對於2TAIL16GN，未到達中間約190 bp，而2TAIL12CA係 完全測序（參見下文）。 表12.藉由TAIL-PCR實施之第二延長步驟之結果 譜帶 大小〇cb) 純系代碼 測序區之大小(bp) 2TAIL01GN 3.0 2TAIL01-04 1146 2TAIL01-09 1129 2TAIL12CA 1.1 2TAIL12-06 967 2TAIL12-08 966 2TAIL16GN 1.6 2TAIL16-03 1400 實例2.測序及序列分析 得自TAIL-PCR中第—及第二延長步驟之合併序列分別 產生CA及GN轉譯起始密碼子上游之m4 bp及約153〇 bp(此乃因中間部分有約19〇 bp尚未精確測定”在其他步 驟中’首先在GN啟動子區中對此未知部分〇89 bp)進行測 序’且隨後使CA延長至與序列相同之5,端位置。該等 精整步驟提供1661 bp(對於(：八)及1524 bp(對於GN)之最終 152350.doc •65· 201142029 序列長度，其皆係自PAL轉譯起始位點計數。 除若干單核苷酸多態性（SNP)以外，CA與GN序列之間之 主要差異位於兩個界定區域中。在CA中距轉譯起始位點 1100 bp以外有五處3 bp至15 bp之缺失，且在GN中有四處 最多約800 bp之缺失，即⑴先前提及之6 bp缺失（參見實例 1)位於重複序列區（轉譯起始密碼子上游266 bp處），（ii) 另一3 bp及7 bp之缺失、且更顯著地（iii)156 bp之缺失位於 距轉譯起始位點404 bp處（圖15)。因此，似乎合理的是， 分開該兩個區域以研究其對基因表現之（組合或單獨）效 應。出於此目的，設計CA及GN序列之全長及截短形式， 其命名為：CA 之 pCAL(長，1661 bp)及 pCAS(短，1038 bp)，及 GN之 pGNL(長 ’ 1524 bp)及 pGNS(短，867 bp)。 另外’使用BLAST算法未在任一數據庫中發現與已知序 列具有顯著同源性，此表明所選殖序列可能不發生轉錄或 並非源自編碼區’且其可能係具有調節功能之新穎序列。 可自對DNA序列之電腦分析演繹出所得片段之可能啟動 子活性之其他指示。對含有大多數當前已知植物啟動子之 PLACE數據庫（www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)實施匿名詢問 且最重要功能元件展示於圖15中。在比對並對比所有四個 (全長及截短）啟動子序列時，可觀察到若干有趣之特徵。 確定假定TATA盒位於轉譯起始位點上游97-104 bp處（分 別在pCAL及pGNL中之1556位及1415位），從而表明存在短 未轉譯前導區。包括兩個典型PAL盒在内之少量可能的啟 動子元件可定位於假定TATA盒上游600-700 bp區中。然 152350.doc • 66 - 201142029 動子元件可定位於假定TATA盒上游600-700 bp區中。然 而，最驚人之特徵係在GN啟動子區中有156 bp之缺失，其 可能在感染後引起表現模式差異。有趣的是，若干潛在啟 動子元件定位於CA之此額外區中（圖15)。 實例夂载體構造及轉基因植物之生成 為獲得所選殖香蕉序列具有啟動子活性之實驗證據，將 總計七種不同啟動子***二元載體pCAMBIA1391z及 pFAJ3 160中，從而分別生成用於土壤桿菌介導植物轉化之 七種及五種構築體之通用骨架（表13)。選殖至表現載體中 之四種香蕉啟動子係：來自CA之全長（pCAL : 1649 bp， pLS15 及 pLS37)及截短（pCAS : 1026 bp，pLS 13 及 pLS35) 形式，以及來自GN之全長（pGNL : 1512 bp，pLS14及 pLS36)及截短（pGNS : 855 bp，pLS16 及 pLS38)啟動子。此 設定亦代表用於功能分析之初始步驟，此乃因可藉由比較 全長與截短形式來確定不存在或存在必需DNA區域。另 外，採用三種對照啟動子：來自花椰菜花葉病毒之35S RNA啟動子（872 bp，p35S)，其係經典組成型對照，主要用 於雙子葉植物；玉米泛素1基因之啟動子及第一内含子（約 2000 bp，pUBI)，其同樣係廣泛分佈之組成型對照，用於 單子葉植物；及植物防禦素啟動子（1234 bp，pPDF)，其係 雙子葉植物中之標準病原體可誘導啟動子。 使七種啟動子中之每一種與細菌uidA1N"^^道基因融合， 該報道基因編碼β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS)且含有來自蓖麻 子過氧化氫酶基因之190 bp内含子（Ohta等人，1990)以抑 152350.doc •67· 201142029 制報道基因在土壌桿菌中之表現。因此，植物細胞中之陽 性報道基因活性表明，整合啟動子在轉基因植物中的確具 有轉錄活性。已在pCAMBIA1391z中實施選殖；香蕉啟動 子係藉由PCR用序列特異性引物自基因組DNA生成。實施 兩個步驟：首先’藉由DNA測序來確認重組體純系在大腸 桿菌中之轉化，且然後藉由電穿孔將正確構築體轉移至土 壤桿菌中。 另外，在PFAJ3160中製備另外五種uidA1NT構築體 (PLS35-39 ’表13)，該pFAJ3160含有用於抵抗固殺草除草 劑之bar可選擇標記基因而非hpt可選擇標記基因。製備此 額外載體組之原因在與’儘管潮黴素選擇在香蕉及水稻中 作用良好，但尚未證實其在擬南芥屬中有效β在約 240,000個種子中，使用六個hpt構築體（pLS1316、pLS23 及pLS26)之平均轉化頻率為〇 〇3%，而使用新bar載體平均 頻率可達到2.4%( 140,〇〇〇個種子）。 最後’在經由.粒子轟擊實施之瞬時基因表現分析中在 含有相同uidA報道基因之pCAMBIA1291z載體中製備 pLS7-8(pCAS^pGNL)^pLSll-12(pCAL^pGNS) ° 從而使得在此研究中製備總計16個GUS構築體（加上即 用型PFAJ3160對照）用於植物轉化。 152350.doc •68- 201142029 表13.用於土壤桿菌介導之植物轉化之香蕉啟動子構築體 列表

報道基因 (蛋白質） 啟動子 「加爾各答4」 「大矮蕉」 對照 短 長 短 長 35S UBI PDF uidA(GUS) 轟擊 pLS07 pLSll pLS12 pLS08 uidA®'11' (GUS) 用於香蕉、水 稻(hpt) pLS13* pLS15* pLS16* pLS14* pLS23* pLS25* pLS26* 用於擬南芥屬 (bar) pLS35 pLS37 pLS38 pLS36 pFAJ3160 - pLS39 啟動子長度 (bp) 1026 1648 854 1507 872 ±2000 1234 縮寫 pCAS pCAL pGNS pGNL p35S pUBI pPDF :用於轉基因田間測試之載體 總計自分佈在以下構築體之間之GN胚性細胞懸浮液生 成249個獨立轉基因香蕉品系：pLS13 (pCAS)-24個品系、 pLS14 (pGNL)-21 個品系、pLS15 (pCAL)-26個品系、 pLS16 (pGNS)-35個品系、pLS23 (p35S)-49個品系、pLS25 (pUBI)-45個品系及pLS26 (pPDF)-49個品系。隨後將所有 該等品系增殖至約8-10個植株/品系以供田間測試。 亦實施水稻轉化實驗。首先在曰本產栽培種「曰本晴」 中成功引入pLS15 (pCAL)構築體，且再生六個獨立植株。 藉由組織化學GUS染色分析所有該等植株之啟動子活性。 另外，在溫室中用其他構築體生成更多植株並收集種子子 代：pLS13 (pCAS)-8個品系、pLS14 (pGNL)-5個品系、 pLS15 (pCAL)-4個品系、pLS16 (pGNS)-16個品系、PLS23 (p35S)-9個品系。 152350.doc -69- 201142029 總計自140,000個種子收集3405個轉基因擬南芬屬植 株’該專種子係藉由植株原位轉化來獲得，其中使用呈兩 個基因型（ColO及Sgs2)之構築體pLS36、pLS38-39及作為對 照之僅呈sgs2之pFAJ3160(表13)。該等品系中，選擇總計 252個品系（每個構築體及每種基因型有36個品系）用於組織 化學分析。 實例4.在活體外及溫室中之轉基因植物分析 4.1.瞬時表現 所選殖香蕉序列具有啟動子活性之第一實驗證據來自香 蕉及煙草中引入uidA基因之瞬時表現分析。 ## 用塗佈有不同表現載體構築體之DNA的微粒森擊GN胚 性細胞懸浮液。一天後，組織化學GUS分析揭示所有香蔑 PAL啟動子之表現（圖5C-F)皆與陽性對照UBI(圖5A)類似， 細胞中可見藍點，而未轉化細胞顯示無背景活性（圖5B)。 基於藍色聚集點之在、度’不同構築體之間似乎無顯著差 異，且相應啟動子之強度因此亦無顯著差異。結果亦表 明，來自野生二倍體CA之啟動子在培養三倍體^^^中具有 活性。 煙草 在用包含表現載體PLS13-16、pLS23及pLS26之土壤桿 菌滲入後2天，對瞬時轉化煙草（本塞姆氏煙草）葉實施組織 化學GUS染色（染色數據未顯示與香蕉中之瞬時表現類 似，所有四種香蕉PAL啟動子在煙草葉中皆具有活性，葉 152350.doc -70· 201142029 中可見藍色著色，且已知兩個對照在雙子葉植物中具有活 性，且在未轉化對照葉中無GUS背景。同樣，各香蕉PAL 啟動子之強度之間未表現顯著差異，只是CAS似乎稍強。 如人們所預期，PDF啟動子稍弱，此乃因其係可誘導啟動 子（Penninckx等人，1996)。另外，結果表明香蕉啟動子之 活性超越種屬邊界，因此，在雙子葉物種中亦具有活性。 4.2.香蕉中之卩01分析 為驗證hpt可選擇標記基因在假定轉基因植物中之存 在，用基因特異性引物實施PCR分析，其擴增668-bp產 物。總計分析所再生249個獨立事件中之233個事件，且其 中總計146個（63%)係PCR陽性（表14)。 表14.針對hpt可選擇標記基因在轉基因香蕉植株中之存在 之PCR篩選之概述 啟動子 事件數 PCR + % CAS 24 9 38 CAL 25 21 84 GNS 32 23 72 GNL 21 16 76 35S 47 30 64 UBI 43 24 56 PDF 41 23 56 總數 233 146 63 陰性 25 0 0 4.3.轉基因植物中之GUS表現分析（活體外及溫室中） 香蕉活體外植株 152350.doc -71 - 201142029 對香蕉活體外植株（GN)之GUS表現分析係藉由對葉及根 進行組織化學GUS染色（染色數據未顯示）及量化葉中之 GUS酶活性之螢光量測分析來實施。兩個測試皆顯示，四 種香蕉PAL啟動子與兩個陽性對照類似，在活體外條件下 在穩疋轉化之葉及根中具有活性。根據香黨細胞中之瞬時 表現’ CA啟動子在GN栽培種中具有活性β確認煙草中之 瞬時表現結果，CAS啟動子再次表現較強。另外，pDF啟 動子與未轉化對照類似，在葉及根中皆未顯示任何表現， 從而表明此（可誘導）擬南芥屬啟動子在單子葉中可能無活 性’至少在基線表現方面無活性。 對轉基因香蕉活體外葉中之GUS表現之定量分析及統計 學分析（圖6，表15)確認了組織化學GUS分析：四種香蕉 肌啟動子具有類似活性（Ρ>〇·〇5)，iLCAS具有高平均活 陡:另外，組成型對照啟動子35S&UBI顯著（ρ£〇 〇5)強於 香煮PAL啟動子但相互之間並無不同。 表5·對轉基因香蕉活體外植株中之Gus表現分析及表現 AL啟動子及對照啟動子構築體之活體外香蒸小植株葉令 之GUS酶*性的概述。Gus酶比活性係'以皮莫耳廳 矣包蛋白矣 - ° _ 不。由不同字母代表之平均值彼此顯著（pSO.001) 不同多範圍測試）° n=所測試複製（樣品）數 152350.doc •72· 201142029 啟動子 事件數 組織化學 GUS 對葉中GUS之螢光量測 + % -l· % 平均特異性活性(η) CAS 24 9 38 8/23 35 2609 a(7) CAL . 25 18 72 18 72 1409 a (17) GNS 32 23 72 21/31 68 2770 a (20) GNL 21 16 76 16 76 1733 a(16) 35S 47 27 57 17 36 5294 b (21) UBI 43 21 49 21 49 5677 b(20) PDF 41 0 0 0 0 NT 總數/平均值 233 114 59 101 53 NA 陰性 25 0 0 0 0 0 p=0.000000 NT未測試；ΝΑ不適用。 為了深入理解該等數據及結論之可靠性，比較組織化學 與螢光量測分析之觀察結果（表15)。除了 35S組之外，兩 組數據顯示幾乎完全等效。另外，其與陽性事件之頻率及 一致性密切相關，如PCR所揭示（表14)。該等觀察結果證 實，所選殖香蕉PAL序列的確具有啟動子活性，該等活性 在香蕉中穩定且可複現性，包括CA啟動子在GN植物中亦 具有活性。最後，在葉及根中之穩定表現（及在胚性細胞 中之瞬時表現）表明，香蕉PAL啟動子可能在眾多種器官及 組織中具有活性。 香蕉溫室植株 由於香蕉植株之大小，僅將有限數量之植株轉移至溫室 中以供在活體内條件下進行第一表現分析。對於每種香蕉 152350.doc •73- 201142029 PAL啟動子種植三個轉基因gN植株以及兩個未轉化對照植 株。 在每一植株中以組織化學方式分析不同葉組織中之GUS 表現’葉柄、葉身及維管束，從而評價PAL啟動子活性在 葉中之組織特異性（染色數據未顯示）。所有啟動子在所測 试所有組織（葉柄、葉及維管組織）中皆為陽性，而未轉化 對照組織皆未顯示背景GUS活性。在葉身中，僅受傷邊緣 由於X-Gluc基質穿過蠟質表皮之有限滲透而發生染色。葉 柄之特徵在於具有鬆散組織結構，因此基質吸收更有效且 染色更強。在維管截面中，在主脈中及主脈周圍染色更顯 著。該等觀察結果顯示，在活體内生長條件下，所有香煮 PAL啟動子在若干種香蕉葉組織中皆具有活性。 水稻活韹外植株 藉由對根及葉實施組織化學Gus染色來分析所有六個在 經pLS15 (pCAL)轉化後生成之活體外植株之啟動子活性。 根據結果（染色數據未顯示），CAL啟動子在根及葉中具有 活/·生在該等植株中之二者（5 G%)中，而兩個未轉化對照植 株在該等組織中未顯示背景Gus活性。自該等植株收獲種 子以供進-步分析子代。然而’三個⑽表現植株中兩個 僅結出空殼且剩餘一個Gus陽性植株產生超過1〇〇個種 子。該等觀察結果確認了煙草中之瞬時表現分析’即香蕉 PAL啟動子之活性超越物種邊界，因此在其他單子葉植物 物種中具有活性’且此活性穩定。同樣’結果與香煮中之 活體外表現-致，其中PAL啟動子引導轉基因植物根及葉 152350.doc -74· 201142029 中之GUS表現。 擬南芥屬溫室植株 選擇〜汁252個獨立轉基因品系（呈兩個基因型及 耶2之構築體 PLS36、PLS38-39及僅呈 sgs22pFAJ316〇各 有36個。0系）進行組織化學Gus分析。取六個呈c〇i〇之未轉 2品系作為陰性對照。同時分析所有轉基因及對照品系之 刀離葉（木色數據未顯示）。在經pLS38 (GNS)及pLS36 (GNL)轉化之品系以及未轉化對照中研究花、梗及種殼中 之表現。 所有252個轉基因品系之葉中GUS表現皆為陽性且所有 /、個對照σσ系皆為陰性，其表明香煮啟動子在擬南芬屬中 具有極可罪之表現模式。然而，近似定性檢驗揭示獨立於 基因型之特徵性啟動子特異性差異二兩個香蕉（GN) pAL啟 動子主要在維官組織中具有活性，而擬南芥屬pDF啟動子 在葉中產生更均勻之表現，從而確認Manners等人（1998)之 先前報導》有趣的是，35S啟動子在葉中引導似乎隨機之 不均勻表現且未轉化對照保持陰性。 對於在生殖器官中之特異性，香蕉pAL啟動子在擬南芥 屬之化、梗及種殼中具有活性且在陰性（未轉化）對照中無 #景活性。缺少背景Gus活性可歸因於染色溶液之高 PH(參見材料及方法），其抑制針對擬南芥屬報告之内源性 GUS樣酶（Sudan等人，2006)。 5亥等結果表明’除煙草外’香蕉PAL啟動子在另一雙子 葉植物物種中亦具有活性，另外，此係香蕉啟動子不僅在 152350.doc -75· 201142029 營養組織且在生殖器官中亦可引導轉基因表現之第一指示。 實例5.香蕉之轉基因田間測試 在實際農業應用之前，對於香蕉，必需要求係首先在真 實熱帶條件下進行詳細的田間表徵。因此，對與uidAIN"^^ 道基因融合之本發明啟動子在轉基因植物（香蕉）中之表現 模式實施系統的田間評估。 在哥斯達黎加在田間種植包括126個轉基因事件（66個香 蕉PAL啟動子事件及60個對照啟動子事件）及20個未轉化對 照（表16)在内之總計146個獨立香蕉事件。在每一事件中， 將至少六個植株種植在小區塊中，其中各有三個植株分佈 在經殺真菌劑處理（區塊B)及未經處理（區塊C)之兩個主區 塊中。另外，在網室中設計用於66個轉基因香蕉PAL啟動 子事件中之54者（>81%)之對照實驗，以測試單獨殺真菌劑 處理是否對啟動子活性有影響。 表16.選擇用於田間測試之轉基因香蕉事件列表 土壌桿菌構築體 事件數 實驗性處理： pLS13 (CAS-GUS) 9 pLS15 (CAL-GUS) 19 pLS16 (GNS-GUS) 22 pLS14 (GNL-GUS) 16 小計 65 對照處理： pLS23 (35S-GUS) 20 pLS25 (UBI-GUS) 20 pLS26 (PDF-GUS) 20 陰性對照：未轉化 20 小計 80 總計 146 152350.doc -76· 201142029 在综合分析中’設計五個實驗來研究： -組織特異性表現及啟動子強度（實驗丁）， -在網室中之對照條件（無感染）下殺真菌劑喷霧之效應 (實驗C)， _真菌感染之誘導能力，比較兩個主區塊之間相同事件 中之各植株（實驗F及X)， -相同事件中不同葉中之發育表現（實驗D)，及 -事件間差異，即來自相同事件中不同植株之相同葉 (實驗I)。 5.1.组織特異性研究（實驗τ) 在經喷霧區塊B中對生殖期之田間植株進行取樣（以便有 較高幾率獲得更多發育穗）。自每個事件之一個植株（單獨） 取五個樣品，即最幼全葉、根、穗梗、果實之果肉及果 皮。在實驗T中，由每種處理採取四個事件且採取八種處 理（八種構築體），使此取樣倍增至總計丨6〇個樣品，對其實 施組織化學GUS染色（染色數據未顯示卜所有香莲pAL啟 動子以及35S及U_照啟動子在田間轉基因香魏株之所 有組織中皆具有活性’此點可由其藍色著色所證實，而未 轉化對照保持陰性。 在個別比較每種組織時，啟動子之間出現一些可見之系 統差異：組成型啟動子（35S及UBI)在根及梗中之染色表現 比香舊PAL啟動子更強。所有六種啟動子在所有組織中皆 具有活性，但所有啟動子在梗中之再現性表現皆高於盆他 組織。該等數據確認了先前在擬南芥屬中獲得之結果(實 152350.doc •77· 201142029 例4)，即香蕉PAL啟動子在生殖發育期間形成之組織中具 有活性。自相同田地收集之陰性（未轉化）對照在所測試任 一組織中皆未顯示背景GUS活性，從而表示所觀察到之 GUS表現模式並非由内源性植物GUS樣活性或由具有功能 性GUS基因之植物内生有機體來引發，但該等表現模式反 映了整合啟動子之真實效應。亦進行定量GUS酶分析及統 計學分析。所測試兩個因變量（組織及啟動子）之間並無顯 著相互作用’因此對每個變量單獨實施單向an〇va。 組織：在藉由香蕉PAL啟動子表現GUS之轉基因植物中 (圖7 ;表17A) ’在梗中之表現顯著（ρ$〇 〇〇1)高於所測試其 他組織。在果實中’果肉中之GUS表現顯著低於果皮。在 藉由組成型對照啟動子35S及UBI表現GUS之轉基因植物中 (圖8，表17B)，葉中之表現顯著（ρ$00()1)低於所測試其他 組織且梗中之表現仍顯著高於其他組織。 表17A.在表現香蕉pal啟動子構築體之獨立轉基因田間 香蕉植株之葉、根、梗、果肉及果皮中之GUS酶活性。 GUS酶比活性係以皮莫耳MU/h/pg總蛋白表示。由不同字 母代表之平均值彼此顯著（p^0.001)不同（對l〇gl0換算數據 之鄧肯多範圍測試）。n=所測試複製（樣品）數 組織 平均值 n 果肉 1839.5a 8 根 2147.5ab 8 葉 2641.6ab 8 果皮 3729.4ab 8 梗 7288.3c 8 p=0.000122 (ANOVA) 152350.doc •78· 201142029 表17Β·表現組成型啟動子構築體之田間獨立轉基因香焦之 葉、根、梗、果肉及果皮中之GUS酶活性。⑽酶比活性 係以皮莫耳MU/h/㈣總蛋白表示。由不同字母代表之平均 值彼此顯著（pS〇.〇〇1)不同（鄧肯多範圍測試卜所測試複 製（樣品）數 組織 平均值 葉 3756.4a 4 果皮 1 7517石 4 根 9322.2b 4 果肉 9544.5b 4 梗 13374.1c 4 p=0.000113 構築趙：評估香賴動子與對照啟動子之間之表現程度 差異（圖7及8及表18)。在葉中藉由對照啟動子驅動與藉由 香IPAL啟動子驅動之GUS基因之表現程度無顯著不同S。 然而，在藉由對照啟動子驅動Gus基因時，GUS基因在 梗、根、果實之果肉及果皮中之表現程度顯著較高。 表18_實驗T中田間植株之定量GUS量測之統計學分析（單 變量測試分組變體：香蕉啟動子對對照啟動子。 P值 —— 顯著不同？ 葉 0.2152 否 梗 0.0095 - 果肉 Γ<0.0001 果皮 7.0083 根 <0.0001 定量GUS酶分析確認了組織化學Gus染色，即梗係表現 性最強之組織，且在各香蔑PAL啟動子之間無顯著強度差 異。由於在轉基因香蕉活體外植株中亦發現定量與組織化 152350.doc •79· 201142029 學GUS分析之存在類似之良好—致性，故此關聯可視作 牢固關聯。 5.1.網室對照（實驗C) 將田間實驗分為喷霧區塊（保護植物並使感染可能引起 之誘導降至最低）及未喷霧區塊（確保天然感染引起誘導卜 然而，殺真菌劑自身亦可能影響啟動子表現模式並由此影 響對真菌誘導％力之結論。因此，需要在無感染但其他方 面與田間極為類似之條件下測試殺真菌劑喷霧之效應。出 於此目的在網至中於香蕉培養區外使來自轉基因田間品 系之營養性子代植物（「萌蘖」）生長以使可能之感染降至 最低。另外，將苗完全剪除以移除可能暴露於孢子之葉。 右可能，自取樣用於實驗F之轉基因香蕉PAL啟動子事 件（參見5.3)(區塊B及c)及自12個未轉化對照植株取兩個萌 蘖。如在田間_般定期用相同殺真菌劑處理一式兩份中之 者’且不對另-植株進行喷霧以用作對照。使植物生長 3個月，之後取葉樣品。實驗c係由254個樣品組成。 實施定量GUS酶分析並進行統計學分析。僅考慮成對數 據（兩個區塊中之事件樣品）。所測試兩個因變量（啟動子及 喷霧)之間並無顯著相互作用，因此對每個變量單獨實施 單向ANOVA。 構築艘：在控制元件之網室植株之葉中，不同PAL啟動 子與對照啟動子之GUS基因表現並無顯著差異（P>0.05)。 在對來自經喷霧植株之數據進行分析時觀察到相同結果。 PAL啟動子·各啟動子在網室植株葉中之gus表現無顯 152350.doc • 80. 201142029 著差異（p>G.G5)(gI 9)。所有香μ啟動子之表現程度皆與在 活體外所觀察到者類似且比田間低約2倍，此表明僅轉移 至土壤中並不足以解釋該差異，且可能亦涉及發育相關因 素。 喷霧.在網至植株葉中，在受PAL啟動子控制時用殺真 菌劑對植物進行噴霧對Gus基因之表現程度無顯著效應 (ρ>0·05)(圖10)。在針對每一個別構築體進一步細分數據 時獲得類似結果（結果未顯示）。 此對照實驗顯示，單獨殺真菌劑喷霧對香蕉pAL啟動子 之表現模式不顯示可檢測效應，因此對比經喷霧及未喷霧 區塊田間適合於評價真菌誘導能力。 5·3·真菌誘導能力（實驗f) 為測試真菌感染對啟動子活性之影響，用自到達生殖期 之刖之田間植株的症狀葉收集之樣品實施第一實驗。若可 能，自所有145個事件中每個事件之兩個植株（一個來自喷 霧區塊Β’即未感$，且另一個來自未噴霧區塊。，即球 腔菌屬（Mycosphaerella)感染植株）取葉樣品。此實驗總計 取290個樣品。實施定量GUS酶分析並進行統計學分析。 僅考慮成對數據（兩個區塊中之事件樣品）。所測試兩個因 變量（感染及構築體）之間並無顯著相互作用，因此對每個 變量單獨實施單向AN0VA。 感染.儘官GUS基因在天然感染（未喷霧）植株之葉中之 表現始終高於經喷霧植株，但總體而言數據之統計學分析 (圖11)揭示並非所有構築體之間均具有顯著差異 152350.doc -81 _ 201142029 (Ρ>〇·〇5)(顯著性之單變量測試·效應=感染：p=〇 〇74)。此 可月b係由於數據中之高方差所致。在針對每一個別構築體 或每組（香蕉及對照）構築體進一步細分數據時獲得類似結 果（結果未顯示）。因此設計第二實驗（實驗x)來減小數據差 異（參見下文）。 啟動子·在藉由不同PAL及對照啟動子表現GUS之轉基 因植物中（圖12)，田間植株之經喷霧葉中無顯著差異 (ρ>〇·05) ^在分析天然感染（未喷霧）植株之數據時獲得類 似結果（結果未顯示）。在對組合經喷霧與未經喷霧植株實 施統計學分析時，觀察到一些差異（結果未顯示因此設 計另一樣品收集（參見下文，實驗X)。 5·4·真菌誘導能力（實驗X) 第真菌感染實驗（實驗F)之結果顯示，使數據方差降 至最低具有重要意義。因此，在第二實驗（實驗⑺中，每 種構築體僅選擇3個事件，即顯示相當表現程度之事件， 且每個事件中收集更多數量之獨立樣品。 每個事件自4個植株取24個樣品（2個植株受感染且2個植 株未受感染）。在每個植株中，自來自母本之葉丨、2及3及 萌蘖取樣。此使得在每個條件（經感染，未經感染）下取12 個樣品。類似地，自陽性對照（ubi)之兩個事件取24個葉樣 品（陽性對照35S不取樣），且自陰性對照之一個事件中取 樣，從而使得總樣品數（24x16)達到384。如下所述取24個 樣品：自經喷霧及未經喷霧植株（兩個區塊）各取12個樣 口。。在該12個樣品中，六個樣品係自一個植株編號收集， 152350.doc •82· 201142029 且另外六個係自相同事件中之第二植株編號收集。自來自 兩個事件編號之母本及第一萌蘖取樣（葉i、2、3)。藉由此 取樣策略，可得出關於各植株内及母本植株與萌蘖之間之 任何表現差異的其他結論。所有取樣皆係對有症狀植株實 施，但不對具有穗之植株取樣，且在此情形下將次強植株 視作母本植株。 感染：在對數據進行統計學分析（未顯示）後可得出結 論，藉由香蕉PAL啟動子驅動之Gus基因之表現程度在經 感染植株與未經感染植株之間無顯著差異（p>〇 〇5)。類似 地，藉由泛素啟動子驅動之GUS基因之表現程度在經感染 植株與未經感染植株之間無顯著差異（p>〇 〇5)。 母本及萌蘖：在對數據進行統計學分析（未顯示）後可得 出結論，藉由香蕉PAL啟動子或藉由UBI啟動子驅動之 GUS基因之表現程度在母本與萌禁植株之間無顯著差異 (Ρ>0·05) ° 、 葉1、2及3之間之差異：在對數據進行統計學分析可得 出結論，藉由香蕉PAL啟動子驅動之〇1；8基因之表現程度 在葉1中顯著高於葉2 (15<〇.〇5)(表19)。藉由泛素啟動子驅 動之GUS基因之表現程度在葉】、2及3之間無顯著差異 (Ρ>>0·05)。 表19.表現PAL啟動子構築體之田間獨立轉基因香黨田之葉 1、2及3甲之GUS酶活性。Gus酶比活性係以皮莫耳 MU/h/叩總蛋白表示。由不同字母代表之平均值彼此顯著 (PS0.001)不同(鄧肯多範圍測試）。n=所測試複製(樣品） 152350.doc -83 - 201142029 數。 平均值 η 一3 1074.4a 97 ~2 " 1171.6a 101 1 1454.3b 100 P<〇.00001 5·5·發育研究（實驗D) 為表徵啟動子表現在（營養性）發育期間之穩定性，分析 同一植株上不同年齡之相鄰葉。在每個事件中自兩個植株 收集五個樣品，即煙草及第丨、3、5、8號葉：一個植株來 自喷霧區塊B且另一植株來自天然感染之區塊c。在實驗d 中藉由每個構築體採取四個事件且採取八個構築體來使此 取樣倍增至總計320個（2x160)樣品，對該等樣品實施定量 GUS酶分析。 根據統計學分析，在所測試三個因變量（葉編號、區塊 及構築體）之間無顯著相互作用，因此對各變量單獨實施 單向ANOVA。 葉編號··在藉由香蕉PAL啟動子（圖13)及對照啟動子（圖 14)表現GUS之轉基因植物中，田間植株之不同葉之間無 顯著差異（p>0.05)，但在葉3(PAL、35S及UBI)及葉5 (PAL) 中表現稍低。可觀察到以下趨勢：在煙草及第一葉中之表 現稍高（與實驗X中之結果一致），但在此實驗設定中此趨 勢在統計上不顯著。在針對每一區塊或每一個別構築體進 一步細分數據時獲得類似結果（結果未顯示）。自所有啟動 子來看，結果表明香蕉PAL啟動子（與組成型啟動子類似） 152350.doc •84- 201142029 在田間香蔑植株之整個營養性發育期間顯示穩定表現。此 意指在轉基因真菌控制策略之情形下，例如，可預期抗真 菌基因具有極均勻表現，在植物中之所有葉中可達成相等 保護。 感染：在所有葉中藉由組合香蕉pal啟動子表現Gus之 轉基因植物（未顯示）中，兩個（經喷霧及未經噴霧）區塊之 間無顯著差異（p>0 05)。在針對每個個別構築體進一步細 分數據時獲得類似結果（結果未顯示）。此結果亦顯示，在 田間天然感染對香焦PAL啟動子之活性無顯著影響。 5.5.事件間差異（實驗穩定性及可複現性 對於有前景之商業（轉基因）品系之增殖及分佈，關鍵係 瞭解植株間或事件間差異之均勻性。 在區塊Α及區塊C中取葉樣品（葉υ，兩個區塊皆未經殺 真菌劑喷霧。每個事件中自4個植株收集樣品，且每個構 ，體（8個構築體）取4個事件。實驗！係由128個樣品組成。 量測1個事件中之4個植株且每個構築體量測4個事件。為 使㈣對數據進行統計分析，將_事件之4個量測值自低 至高分級，最低為！且最高為4。對所有事件實施此步驟。 計算每個等級之平均值。 在對數據進行統計學分析（表2〇)後可得出結論，藉由 PAL啟動子驅動之GUS基因之表現程度在一個事件之不同 植株之間存在顯著差異（1)<0.05)。第⑷級之結果顯著低 於第3及4級之結果。在對每個構築體進行分析時，未出現 顯著差異（未顯示）。對於藉由對照啟動子驅動之咖基因 I52350.doc -85- 201142029 表現獲得類似結果（結果未顯示）^第1級之結果（1 126 9皮 莫耳MU/h/pg總蛋白）顯著低於第2級之結果（1732.7皮莫耳 MU/h~g總蛋白）、第3級之結果（2276 2皮莫耳Mu/h/pg總 蛋白）及第4級之結果（25〇5 4皮莫耳MU/h/pg總蛋白），且第 2級之結果顯著低於第3及4級之結果。然而，方差過大， 從而使付難以得出有效結論。

表19.表現PAL啟動子構築體之田間獨立轉基因香蕉田之J 個事件中不同植株之間之GUS酶活性。GUS酶比活性係以 皮莫耳MU/h/pg總蛋白表示。由不同字母代表之平均值彼 此顯著（PS0.001)不同（鄧肯多範圍測試）。n=所測試複製（樣 品）數。 分級 平均值 η 1 1152.7a 14 2 1407.9a 16 3 1928.9b 16 4 2318.2b 15 p<0.00012 對兩個香蕉啟動子進行選殖及測序：一個來自真菌疾病 抗性野生二倍體「加爾各答4」（CA)且另一個來自易感市 售鮮果三倍體栽培種「大矮蕉」。之後，使用包含香蕉啟 動子（全長或截短）之載體生成轉基因香蕉及異源性植株， 且與經包含不同組成型或可誘導對照啟動子之載體轉化之 轉基因植物進行對比。 分別在活體外（或溫室中）及真實田間（及網室）條件下對 152350.doc •86· 201142029 PAL啟動子表現模式實施之論證及詳細監測確認： a.啟動子在其他香蕉地方品種（即來自市售三倍體「大矮 蕉」中之野生二倍體「加爾各答4」）中具有活性， b·啟動子在諸如其他單子葉及雙子葉物種等眾多種宿主中 具有功能性， c ·相應全長及截短啟動子形式在表現模式（穩定性及組織特 異性）方面具有稍微不同之強度及相同之活性， d.啟動子之活體外強度顯著（約5〇%)低於標準組成型啟動 子（35S及UBI)，而在田間其似乎並無不同， e_殺真菌劑或真菌感染在田間並不顯著影響啟動子， f. 啟動子在田間之眾多種營養或生殖器官及特定香蕉組織 中具有活性， g. 啟動子在田間香蕉植株發育期間穩定且均勻表現，且 h. PAL啟動子在轉基因香蕉品系進行微體繁殖後穩定表現。 因此，基於原始及綜合大規模田間研究可得出結論，現 有一系列經詳細表徵之穩定香蕉pal啟動子可用於高等植 物中之*規及/或商業轉基因應用以及香蕉中之順化基因 或基因内應用。 彼等熟習此項技術者在考量本說明書及實踐本文所揭示 發明後可瞭解本發明之其他實施例。本說明書及各實例意 欲僅視為例示性’且本發明之真實範圍及精神係由隨附申 請專利範圍來闡述》 參考文獻

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Wiame I、Remy S、Swennen R、Sdgi L (2000) Irreversible heat inactivation of DNase I without RNA degradation. BioTechniques 29:252-256 。 【圖式簡單說明】 圖1代表用於植物轉化之表現載體，其包含啟動子序列 SEQ ID NO:l (A-pCAL)或 SEQ ID NO:3 (B-pCAS)。 圖2代表用於植物轉化之表現載體，其包含啟動子序列 SEQ ID NO:2 (A-pGNL)或 SEQ ID NO:3 (B-pGNS)。 圖3展示保守PAL引物在編碼序列上之示意性位置。内 含子位置表示為星號。 152350.doc •93- 201142029 圖4展示四組經選殖香蕉PAL序列之序列比對及組特異 性引物之位置。以下引物組合對四組中之每一組具有特異 性：PAL(GN)F1及 PAL(GN)R1針對第 1組；PAL(CA)F2 及 PAL(CA)R2針對第 2組；PAL(GN)F3及 PAL(GN)R3針對第 3 組；PAL(CA)F4及PAL(CA)R4針對第4組。序列不含有引物 且始於針對麩醯胺酸（Q)之第8密碼子（CAG)。PAL第1組 = SEQ ID ΝΟ··33 ; PAL 第 2 組=SEQ ID NO:3 4 ; PAL 第 3 組 = SEQ ID NO:35且 PAL 第 4組=SEQ ID NO:36。 圖5展示在經不同啟動子構築體進行微粒轉化後1天香蕉 胚性細胞中之瞬時GUS表現。A陽性對照：質粒AHC27， 其含有與玉米泛素啟動子（UBI)融合之uidA報道基因；B 陰性對照：未轉化細胞；C pLS07 (CAS) ； D pLS08 (GNL) ; E pLSll (CAL) ; F pLS12 (GNS)。放大：30x » 圖6展示表現不同啟動子構築體之獨立轉基因香蕉活體 外植株葉中之GUS酶活性》GUS酶比活性係以皮莫耳 MU/h/pg總蛋白表示。n=所測試複製（樣品）數。 圖7展示田間表現香蕉PAL啟動子構築體之獨立轉基因 香蕉植株中葉、根、梗、果肉及果皮中之GUS酶活性。 GUS酶比活性係以皮莫耳MU/h/pg總蛋白表示。n=所測試 複製（樣品）數。 圖8展示田間表現組成型啟動子構築體之獨立轉基因香 蕉田中葉、根、梗、果肉及果皮中之GUS酶活性。GUS酶 比活性係以皮莫耳MU/h/pg總蛋白表示。n=所測試複製（樣 品）數。 152350.doc •94- 201142029 圖9展示網室中表現香薦pAL啟動子構築體之獨立轉基 因香_葉中之GUS酶活性。⑽酶比活性係以皮莫耳 MU/h/pg總蛋白表示β n=所測試複製（樣品）數。 圖1〇展示網室中表現香碁舰啟動子構築體之獨立轉基 因香蒸植株之經喷灌或未經喷㈣之組合咖酶活性。 GUS酶比活性係以皮莫耳Mu/h~g總蛋白表示。一斤測試 複製（樣品）數。 圖11展示田間表現不同啟動子構築體之獨立轉基因香蒸 植株中未感染及經感染（分別為經喷灌或未經喷濃葉）之組 σ GUS酶Α性。Gus酶比活性係以皮莫耳總蛋白 表示。n=所測試複製（樣品）數。 圖12展示田間表現不同啟動子構築體之獨立轉基因香蕉 植株之經噴灑葉中之Gus酶活性。刪酶比活性係以皮莫 耳MU/h~g總蛋白表示。n=所測試複製（樣品）數。 圖13展不田間表現香蕉PAL啟動子構築體之獨立轉基因 香蕉植株之不同葉中之組合Gus酶活性。GUS酶比活性係 以皮莫耳MU/h/pg總蛋白表示。組員數（n=所測試複製（樣 m )數）.煙草（3〇);葉 i(31)、葉 3(32);葉 5(31);葉 8(14)。 圖14展示田間表現組成型啟動子構築體之獨立轉基因香 蕉植株中不同葉之組合（}118酶活性。Gus_比活性係以皮 莫耳MU/h/pg總蛋白表示》組員數（n=所測試複製（樣品） 數）：煙草（7);葉 1(7);葉 3(7);葉 5(7);葉 8(6)。 圖15展示4個PAL啟動子序列及其啟動子元件之比對。 152350.doc -95- 201142029 序列表

<110>比利時魯汶大學K.U.魯汶R&D <120>香蕉啟動子

<130> BNAN-001-PCT <140> 099140636 <141> 2010-11-24 <150 61/281874 <151> 2009-11-24 <160> 36 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 1664 <212> DNA <213>芭蕉屬 <400> 1 gcttcctttg tttttgctag ttagatcctt atgccaaggc tcatgtgatt tggctgtcat 60 ggttggtggt gaagagcatt ccacaccaaa ctcccagtct cataaacaaa ggcttgcatt 120 caattttctc acccttgacc agaatttcca attttggttg gtggaaattt ccttcagaca 180 aaagaaaaac tattggccac aaggttaaat tgacagcaag tttggagcat gtctcatcaa 240 taaactgata ggtgtgtcca cttgactcaa atctttagtc ggtaaagatt ttgatagttt 300 atcgtaagac tctgaactca aatctgtctt tgtaaaaaaa ataatataaa tattcattga 360 aacaaaaaat caagtatcaa aagattaagt taacgtctct caaacataag aattgtatgc 420 cgaggttcca cttaagtcat gttaagtatc taataattga accaaggaag gaaggagtgt 480 tgtttgttgt catgatagag gtaaaaagag tttatgatgt cataatactt gtattaacaa 540 ccattcatcc atgcatacca tctgaattaa gtggtaatcc tgtacaagat tgttcaagtg 600 gaatttgact gtcaaaagag taagctgcat actaaggatc tgtcatctac aactaatctt 660 gtggaagatc tgaatcgaag aacctgagct tggaaacaac tcccaagata ttgtgtcttt 720 catttctcag aaagtctagg gacttaaaag tatgttcaac aagccatatt cctttaatct 780 tgctgaggaa ttggattaca tcttccttgc aattcctctc catttgcatg gcaattcggc 840 agctatttct tacttggttc tatgagggaa gggagaaggg aggttggtga ggacaattcc 900 catggcaatt tggcagctac ttccatacct acttcattag aggagagagg ttggtgggga 960 caatgacctg tgtggcaggc agtagtacaa caactcactt gcgtttcttc tcctatactt 1020 aaatgacgac aaaatcttcg attgggttca atttaattaa aattattatt ttatatgatt 1080 tacacaaact aaatagttca ttctaataga aaactgtggg atcagaagcc acacacaaaa 1140 aaaaaaagac aaaactatag aatcgaactt atctttaatt tatatttttt atatctaaaa 1200 cattaatatg ataataatat acttactaga tacacatagt tgccatgatc aacattacta 1260 gaagaagatg aaaagaatga tgaatgctta tatgactcga gtatgacatg aacgtggaaa 1320 tcaccttcta ctcaggagaa gcaatcgtca tatccgcggg atcgtcctgg aaagagagag 1380 152350-序列表.doc 201142029 agagagagat agagagaaga cgaggggatg aggaaggaag aattggtgag gaaaacgatg 1440 gcatgcatgc ctcatatctc cacccacccc tctcctcccc tccatctttg acgagaccga 1500 tccagtggtt gaagtattat gcccacctaa ctctctccat gccaccacaa gctgctctat 1560 ttaacccttc cttgtgctcc tctctacctc agggttatct caccttcctt accttccacc 1620 tcctcccttc tggtctttcg tcggatctcg ttccgtgatc gatg 1664 <210> 2 <2U> 1527 <212> DNA <213>芭蕉屬 <400> 2 gcttcctttg tttttgctag ttagatcctt atgccaaagg ctcatgtgat ttggctgtca 60 tgtttggtgg tgaagagcat tccacaccaa actcccagtc tcataaacag aggctttcat 120 tcaattttct cacccttgac cagaatttcc aagcttggtt ggtggaaatt tccttcagac 180 aaaagaaaaa ctattggcca caaggttaaa ttgacagcaa gttcggagca tgtctcatca 240 ataaactgat aggtgtgtcc agttgactca aatctttagt cgataaagat tttgatagtt BOO tatcgtaaga ctctgaactc aaatctcgtc tttgtaaaaa aaaaaaaaat actataaata 360 ttcattgaaa caaaaaatca agtatcaaaa gattaacaat ttgatgacga aattaacgtt 420 tctcaaacat aagaattgta tgccgaggga ggttccactt aagtcatgtt aagtatctaa 480 taattgaacc aaggaaggaa ggaaggagtg ctgtttgttg tcatgataga ggtcaaaaga 540 gtttatgatg tcataatact tgtattaaca accattcatc catacatacc atctgaatta 600 agtggtaatc ctgtacaaga ttgttcaagt ggaatttgac tgtcaaaaga gtaagctgct 660 gcatactaag gatctgtcat ctacaactaa tcttgtggaa gatctgaatc gaagaccttg 720 agctcggaaa caacttccaa gatattgtgt ctttcatttc tcagaaagta tagggactta 780 aaaagtatgc tcaacaagcc atattccttt aatcttgttg aggaattgga ttacatcttc 840 cttgcaattc ctctccattt gcatggcaat tcggcagcta tttcttactt ggttctatga 900 gggaagggag gttggtgagg acaattccca tggaaatttg gcagctactt ccatacctac 960 ttcattagag gagagaggtt ggtggggata atgacctgtg tggcaggcag tacaacaact 1020 cacttgcgtt tcttctccta tacttaaatg acgacaaaat ctttgattgg gttcaattta 1080 attaaaatta ttgttttata tgatttacac aaactaaata acattactag aagaagatga 1140 aaagaaagat gaatgcttat atgactcgag tgtgacatga acgtggaaat caccttctac 1200 tcgggagaag caatcgtcat atccgcggga tcgtcctgga aagagagaga gagagagaga 1260 ggacgagggg atgaggaagg aagaattggt gaggaaaacg atggcatgca tgcctcttat 1320 ctccacccac ccctctcctc ccctccatct ttgacgagac cgatccagtg gttgaagtat 1380 tatgcccacc taactctctc catgccacca caagctgctc tatttaaccc ttccttgtgc 1440 tcctctctac ctcagggtta tctcaccttc cttaccttcc acttcctccc ttctggtctt 1500 tcgtcggatc tcgttccgtg atcgatg 1527 -2- 152350-序列表.doc 201142029 <210> 3 <211> 1041

<212> DNA <213>芭蕉屬

<400> B gctgcatact aaggatctgt catctacaac taatcttgtg gaagatctga atcgaagaac 60 ctgagcttgg aaacaactcc caagatattg tgtctttcat ttctcagaaa gtctagggac 120 ttaaaagtat gttcaacaag ccatattcct ttaatcttgc tgaggaattg gattacatct 180 tccttgcaat tcctctccat ttgcatggca attcggcagc tatttcttac ttggttctat 240 gagggaaggg agaagggagg ttggtgagga caattcccat ggcaatttgg cagctacttc 300 catacctact tcattagagg agagaggttg gtggggacaa tgacctgtgt ggcaggcagt 360 agtacaacaa ctcacttgcg tttcttctcc tatacttaaa tgacgacaaa atcttcgatt 420 gggttcaatt taattaaaat tattatttta tatgatttac acaaactaaa tagttcattc 480 taatagaaaa ctgtgggatc agaagccaca cacaaaaaaa aaaagacaaa actatagaat 540 cgaacttatc tttaatttat attttttata tctaaaacat taatatgata ataatatact 600 tactagatac acatagttgc catgatcaac attactagaa gaagatgaaa agaatgatga 660 atgcttatat gactcgagta tgacatgaac gtggaaatca ccttctactc aggagaagca 720 atcgtcatat ccgcgggatc gtcctggaaa gagagagaga gagagataga gagaagacga 780 ggggatgagg aaggaagaat tggtgaggaa aacgatggca tgcatgcctc atatctccac 840 ccacccctct cctcccctcc atctttgacg agaccgatcc agtggttgaa gtattatgcc 900 cacctaactc tctccatgcc accacaagct gctctattta acccttcctt gtgctcctct 960 ctacctcagg gttatctcac cttccttacc ttccacctcc tcccttctgg tctttcgtcg 1020 gatctcgttc cgtgatcgat g 1041 • <210> 4 <211> 870 <212> DNA <213>芭蕉屬 <400> 4 gctgcatact aaggatctgt catctacaac taatcttgtg gaagatctga atcgaagacc 60 ttgagctcgg aaacaacttc caagatattg tgtctttcat ttctcagaaa gtatagggac 120 ttaaaaagta tgctcaacaa gccatattcc tttaatcttg ttgaggaatt ggattacatc 180 ttccttgcaa ttcctctcca tttgcatggc aattcggcag ctatttctta cttggttcta 240 tgagggaagg gaggttggtg aggacaattc ccatggaaat ttggcagcta cttccatacc 300 tacttcatta gaggagagag gttggtgggg ataatgacct gtgtggcagg cagtacaaca 360 actcacttgc gtttcttctc ctatacttaa atgacgacaa aatctttgat tgggttcaat 420 ttaattaaaa ttattgtttt atatgattta cacaaactaa ataacattac tagaagaaga 480 tgaaaagaaa gatgaatgct tatatgactc gagtgtgaca tgaacgtgga aatcaccttc 540 152350·序列表.doc 201142029 tactcgggag aagcaatcgt catatccgcg ggatcgtcct ggaaagagag agagagagag 600 agaggacgag gggatgagga aggaagaatt ggtgaggaaa acgatggcat gcatgcctct 660 tatctccacc cacccctctc ctcccctcca tctttgacga gaccgatcca gtggttgaag 720 tattatgccc acctaactct ctccatgcca ccacaagctg ctctatttaa cccttccttg 780 tgctcctctc tacctcaggg ttatctcacc ttccttacct tccacttcct cccttctggt 840 ctttcgtcgg atctcgttcc gtgatcgatg 870 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213>人造 <220> <223>引物 <220> <221> misc_feature <222> (5^..(5) <223> n 4 a、c、g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n 係 a、c、g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n 係 a、c、g 或 t <400> 5 scacntcstn gtntct 16 <210> <211> <212> <213>

6 16 DNA 人造 <220> <223> 引物 <220> <221> im'sc_feature <222> (1)_.(1) <223> n )系 a、c、g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n 係 a、c、g 或 t <400> 6 ngtcgaswga nawgaa 16

<210> 7 <211> 16 <212> DNA 152350-序列表.doc 4- 201142029 <213> 人造 <220> <22 3> 引物 <220> <221> mi sc_feature <222> (5)..(5) <223> η # a、c、g 或 t <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <22 3> n 係 a、c、g 或 t <220> <221> mi sc_feature <222> (13)..(13) <223> n 係 a、c、g 或 t <400> 7 wgtgnagwan canaga <210> 8 <211> 10 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> 引物 <400> 8 gagcttgaac <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> 人造 <22〇> <22 3> 引物 <400> 9 atctcgctag <210> 10 <211> 10 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> 引物 <400> 10 ctgatccatg <210> 11 <211> 10 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> 引物 152350-序列表.doc 201142029 <400> 11 tccactggca 10 <210> 12 <211> 10 <212> DNA <213>人造 <220> <223> 引物 <400> 12 ggtactccac 10 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213>人造 <220> <223> 引物 <400> 13 ttcccgatgg cggcgac 17 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213>人造 <220> <223> 引物 <400> 14 gatggacttg gtggaggcg 19 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213>人造 <220> <223> 引物 <400> 15 tcctgcttcg gcttctgcag t 21 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213>人造 <220> <223> 引物 <400> 16 accctaaccg ccgagtgg

<210> 17 <211> 18 <212> DNA 152350-序列表.doc 18 201142029 <213>人造 <220> <223> 引物 <400> 17 ctgccgttcg catggacg <210> 18 <211> 20 <212> ONA <213>人造 引物 <220> <223> <400> 18 cttcaaccac tggatcggtc <210> 19 <211> 20 <212> ONA <213>人造 <220> <223>引物 <400> 19 cttctacaca gccatcggtc <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213>人造 <220> <223> 引物 <400> 20 gacctgcctg aaaccgaact g <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213>人造 引物 <220> <223> <400> 21 tckytktcyt acattgcygg <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213>人造 <220> <223>引物 <400> 22 aagytgaagc aycaycchgg 152350-序列表.doc 201142029 <210> 23 <211> <212> <213> 20 DNA 人造 <220> <223> 引物 <400> 23 ttgaavccrt artccaagct 20 <210> 24 <211> <212> <213> 20 DNA 人造 <220> <223> 引物 <400> 24 gagttsacrt cytggttgtg 20 <210> 25 <211> <212> <213> 19 DNA 人造 <220> <223> 引物 <400> 25 tcacgagcaa gacccgctg 19 <210> 26 <211> <212> <213> 19 DNA 人造 <220> <223> 引物 <400> 26 gatggacttg gtggcggag 19 <210> 27 <211> <212> <213> 20 DNA 人造 <220> <223> 引物 <400> 27 gctccacgag caagacccac 20 <210> 28 <211> <212> <213> 17 DNA 人造 <220> <223> 引物 152350·序列表.doc 201142029 <400> 28 ttcccgatgg cggcgac 17 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213>人籩 <220> <223>引物 <400> 29 ccacgaagtc catcgaacgt 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213>人造 <220> <223>引物 <400> 30 aaaggttcga ggggagccca 20 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213>人造 <220> <223>引物 <400> 31 cctcgacgga agctcgttt 19 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213>人造 <220> <223>引物 <400> 32 ggagaactgg gcgaacatc 19 <210> 33 <211> 409 <212> DNA <213>芭蕉屬 <400> 33 ccagatcgag gccgccgcca tcatggagca catcctcgac ggcagctcct acatgaagat 60 ggccaagaag cttcacgagc aagacccgct gcagaagccg aagcaggacc ggtacgccct 120 ccgcacctcc ccgcagtggc tcggccccca gatcgaggtc atccgctccg ccaccaagtc 180 catcgagcgg gagatcaact ctgtcaacga caaccccctc atcgacgtct ccaggaacaa 240 ggccctgcac ggcggcaact tccagggcac gcccatcggc gtgtccatgg acaacacccg 300 -9· 152350·序列表.doc 201142029 cctggccctc gccgccatcg ggaagctcat gttcgcgcag ttctcggagc tcgtcaacga 360 cttctacaac aacgggctgc cgtcgaacct ctccggcggg cgcaacccg 409 <210> 34 <211> 409 <212> DNA <213>芭蕉屬 <400> 34 ccagatcgag gccgccgcta ttatggagca catcctcgac ggcagctcct acatgaagat 60 ggccaagaag ctccacgagc aagacccact gcagaagccg aagcaggacc gctacgccct 120 ccgcacctcc ccgcagtggc tcggccccca gatcgaggtc atccgcgcct ccaccaagtc 180 catcgagagg gagatcaact ccgtcaacga caaccccctc atcgacgtct ccaggaacaa 240 ggccctccac ggcggcaact tccagggcac ccccatcggt gtgtcgatgg acaacacccg 300 cctggccgtc gctgccatcg ggaagctcat gttcgcgcag ttctccgagc tcgtcaacga 360 cttctacaac aacggcctgc cctcgaacct ctccggtggg cgcaacccc 409 <210> 35 <211> 409 <212> DNA <213>芭蕉屬 <400> 35 ccaaatcgaa gccgccgcta tcatggagca cgtcctcgag ggcagctcct acatgaagat 60 ggcgaagaag ctccatgagc aagacccgct ccagaagcca aagcaggacc gctacgccct 120 ccgcacctca ccgcagtggc tcggccccca gatcgaagtc atccggtcgt ccacgaagtc 180 catcgaacgt gagatcaact cggtgaacga caaccccctc attgacgtct cccggaacaa 240 ggccttgcac ggtggcaact tccaggggac cccgatcggt gtctccatgg acaacacccg 300 cttagccatt gccgccatcg gcaaactcat gttcgcacag ttctcagagc tcgtcaacga 360 cttctacaac aatgggctcc cctcgaacct ttccggtgga agaaacccg 409 <210> 36 <211> 409 <212> DNA <213>芭蕉屬 <400> 36 ccagatcgag gccgccgcca tcatggagca catcctcgac ggaagctcgt ttatgaagat 60 agcgaagaag ctccatgagc aagacccctt gcagaagccg aagcaggatc gctacgccct 120 gcgcacctcc ccgcagtggc tcggccctca gatcgaggtc atccgctcgt ccaccaagtc 180 catcgagcgg gagatcaact ccgtcaacga caaccccctc atcgacgtct ccaggaacaa 240 ggccctccac ggcggcaact tccagggcac acccatcggc gtgtccatgg acaacacccg 300 cctcgccctc gcggccatcg ggaagctgat gttcgcccag ttctccgagc tcgtcaacga 360 tttctataac aacggcctgc cgtcgaacct ctccggcggg cgcaccccg 409 152350-序列表.doc •10-

Claims (1)

1. 201142029 七、申請專利範圍·· 1 · 一種具有植物啟動子活性之經分離聚核苷酸，其中該聚 核皆酸包含具有核苷酸序列SEq ID NO:4之聚核苷酸； 或其核苷酸序列與SEQ ID NO:4具有至少70%序列一致性 之生物活性片段或變體或同系物。 2. 如請求項1之經分離聚核苷酸，其包含與SEq id NO: 1、 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO: 4之核苷酸 序列具有9 0 %序列一致性之聚核苷酸。 3. —種聚核苷酸構築體，其包含如請求項1或請求項2之具 有植物啟動子活性之聚核苷酸，其中該具有植物啟動子 活性之聚核苷酸與異源性調節序列及/或異源性編碼序列 以可操作方式連接。 4. 如6月求項3之聚核苷酸構築體，其中該異源性編碼序列 係編碼RNA或多肽之聚核苷酸。 5. —種载體，其包含如請求項3或請求項4之聚核苷酸構築 體。 6. —種經轉化宿主細胞，其包含如請求項3或4之聚核苷酸 構築體。 7. 如請求項6之經轉化宿主細胞，其中該宿主細胞係植物 細胞。 8. 如凊求項7之植物細胞，其中該植物細胞係單子葉或雙 子葉植物細胞。 9. 如请求項8之植物細胞，其中該植物係屬於茄科 (anaceae)、十子花科（Brassicaceae)、爸焦科 152350.doc 201142029 (Musaeeae)或禾本科（PQaeeae)之物種，或其中該植物係 大豆、向日葵、甜菜、紫花苜蓿、花生、棉花、咖啡、 椰子、鳳梨或柑橘樹。 10. -種轉基因植物或其子代、植株部分、植物組織或植物 繁殖材料，其包含如請求項3或4之聚核苷酸構築體。 11· 一種轉基因植物或其子代、植株部分、植物組織或植物 繁殖材料，其包含穩定納入該植物基因組中之如請求項 3或4之聚核苷酸構築體。 12. —種產生經轉化植物細胞之方法，其包含：（勾將如請求 項3或4之聚核苷酸構築體引入可再.生植物細胞中，以產 生經轉化植物細胞；及（b)鑑別或選擇經轉化植物細胞。 13. —種產生轉基因植物之方法，其包含：（a)將如請求項3 或4之聚核普酸構築體引入可再生植物細胞中，以產生 可再生經轉化植物細胞；（b)鏗別或選擇經轉化植物細胞 群；及（c)自該細胞群再生分化之轉基因植物。 14. 一種在宿主細胞中表現產物之方法，該方法包含將如請 求項3或4之聚核苷酸構築體引入宿主細胞中，其中該聚 核苷酸構築體之編碼序列編碼該產物。 15. —種經處理食品或非食品產品，其包含如請求項3或4之 聚核苷酸構築體。 152350.doc