TW201139673A - In-vivo no-viral gene delivery of human vascular endothelial growth factor following islet tranplantation - Google Patents
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Description
201139673 六、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明大體上係關於基因傳送的領域,且更特定言之係 關於發展一種經超音波介導之基因傳送方法該方法用於 將類血$内皮生長因子(human vascular endothelial growth factar ; hVEGF)基因傳送至經移植胰島及周圍組 織’以促進胰島血管重建及存活。 【先前技術】 非限制本發明之範圍下,本發明所揭述背景是關於用於 改善經移植細胞及組織之效力及用於疾病治療之基因傳送 方法。 美國專利申請案第2〇〇8〇114287號(1^及1^1 2〇〇8)闡述 一種傳送適用於治療包括腹膜纖維化或手術後黏連之腹膜 疾病的藥劑(諸如基因、質體、及其他與DNA相關之活性 分子)之方法,明確言之是利用超音波觸發攜帶誘導性 Smad7基因之微泡系統的破裂。本發明提供一種含有用於 治療腹腔疾病之一或多個誘導性Smad7基因、DNA分子、 或質體之微泡源,隨後以該微泡灌注患者腹腔區域;對腹 部提供超音波能量,該能量足以使該一或多個誘導性 Smad7基因、DNA分子或質體自微泡轉染至腹腔區域並滲 透至位於其中之腹腔組織。 頒予Oh等人之美國專利案第7,374,39〇號(2〇〇8)揭示一種 可使2型糖尿病患者之血糖濃度恢復正常的組合物及其使 用方法。該發明包括一種經構築且被傳送至細胞中用以表 153800.doc 201139673 現活性GLP-1之質體,該質體包含小雞β肌動蛋白啟動子及 增強子;帶有弗林蛋白酶(furin)裂解位點之經改變GLP-l(7-37)cDNA(pPGLPl)。
Coleman等人申請之美國專利申請案第20090209630號 (2009)揭示一種可有效將血管生成因子傳送至心臟及周邊 血管系統之新穎方法,此方法可避免現有傳送技術所固有 之毒性問題。攜帶可編碼血管生成劑(包括Del-1或VEGF或 兩者)之序列的載體可以與泊洛沙姆(poloxamer)或其他用 於傳送至缺血組織之聚合物調配在一起,以流動至斷流方 式傳送至周邊缺血區域,並藉由逆流靜脈灌注方式傳送至 心臟。 【發明内容】 本發明使用一種超音波把向之微泡破裂法(Ultrasound Targeted Microbubble Destruction,UTMD),以將人類血 管内皮生長因子(hVEGF)基因傳送至經移植胰島及周圍組 織中,以促進胰島血管重建及存活。將一些人類胰島移植 至糖尿病裸鼠肝臟中,隨後藉由UTMD,誘導宿主肝臟中 可編碼hVEGF或綠色螢光蛋白(GFP)基因之非病毒性質體 載體。進行無基因傳送之移植術以作為對照。採用本發明 可使血糖濃度、血清人類胰島素濃度、C-肽濃度穩定,並 使經嫁接胰島重建血管。 於一項實施例中,本發明包括一種用於在一或多個肝臟 細胞、肝臟或移植至肝臟之胰島細胞中進行超音波靶向微 泡破裂術(UTMD)之組合物,該組合物包含:一或多個已 153800.doc 201139673 預組之脂質體質體DNA(pDNA)微泡複合體,其中該微泡 包含含有氣體之脂質外殼、及含有與人類血管内皮生長因 子(hVEGF)以操作方式連接之組成性啟動子序列或誘導性 啟動子序列的pDNA ’其中於超音波破裂表現hVEGF處, 藉由超音波使位於一或多個肝臟細胞、肝臟或移植至肝臟 之細胞中之一或多個微泡破裂,從而將pDNA傳送至一或 多個肝臟細胞、肝臟或移植至肝臟之細胞中,其中該組合 物會增強一或多個經移植胰島細胞之效力。於一個態樣 中,脂質外殼包含一或多種選自由以下組成之群之其他具 生物活性之藥劑:裸露DNA、siRNA、質體、蛋白質、病 毒性載體及藥物。於另—態樣中,氣體為四氟化碳氣體。 於另一態樣中,該誘導性啟動子包含組織特異性調節元 件。於另一態樣中,該胰島移植術之效力是藉由血管重建 =強、騰島細胞功能改善、血管密度增加或其纪合加以測 定。於另一態樣中,hVEGF為重組型跳仰。於另一態樣 中,一或多種藥劑可與選自由如下組成之群之組合物二同 投與:抗細胞瑪亡藥劑、消炎藥、JNK抑制劑、GUM、 〉司(acrohmus)、西羅莫司(士〇此奶)、阿那白滯素 (anaklnra)、传文聚醯胺或其植人。 ::一實施例為一 肝臟或經移植肝臟中之經移植胰島細胞再生之 組合物,該組合物自合入女1 I丹生之 5有可編碼人類血管内皮生异田本 Η。之裸露質體_之微泡,其中該微泡== 肝臟次經移植肝臟中所進行之超音波破裂術而釋放出 153800.doc 201139673 hVEGF的月旨質。於一個態樣中,該hVEGF為重組型 hVEGF 〇於另一態樣中,該組成性啟動子序列或誘導性啟 動子序列係以操作方式連接至人類血管内皮生長因子,例 如胰島素啟動子或巨大細胞病毒(CMV)啟動子。 本發明另一實施例是一種在受檢者之活體内及原位促進 一或多個經移植細胞或經嫁接細胞血管重建、改善功能、 血管密度及效力之方法,該方法包括下列步驟:傳送包含 可編碼人類血管内皮生長因子(hVEGF)裸露質體DNA微泡 之有效量微泡組合物,其申該等微泡包含可藉由在一或多 個經移植細胞或經嫁接細胞中進行超音波破裂術而釋放出 hVEGF之脂質,其中該經釋放hVEGF可促進一或多種經移 植細胞或經嫁接細胞之血管重建、改善功能、血管密度及 效力。於一個態樣中,該一或多個經移植細胞或經嫁接細 胞包括胰島細胞。於另一態樣中,該受檢者為健康受檢 者、糖尿病受檢者或需要一或多個經移植細胞或經嫁接細 胞之受檢者。 本發明另一實施例是一種促進患者肝臟中一或多個經移 植胰島細胞之血管生成、血管密度及效力之方法,該方法 包括下列步驟:將裸露質體DNA微泡複合體注射與該患 者,該微泡複合物包含一在巨大細胞病毒(CMV)啟動子控 制下可表現人類血管内皮生長因子(hVEGF)基因之質體, 其中該注射係在患者肝臟中進行;將pDNA傳送至肝臟中 之一或多個經移植胰島細胞;並將該一或多個經移植胰島 細胞維持在可有效表現hVEGF基因之條件下,其中該表現 153800.doc 201139673 hVEGF會促進該-或多個經移植騰島細胞之血管生成、血 管密度及效力。於-態樣中,該方法進一步包括視需要共 同投與一或多種藥劑,其中該等藥劑係選自由如下組成之 群:抗細胞凋亡藥劑、消炎藥、JNK抑制劑、GUM、他 克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sir〇Hmus)、阿那白滯素 (anakiwa)'得文聚酸胺(Dervin p〇lyamide)或其組合。於 另一態樣中,該微泡包含已預組之脂質體-裸露質體 DNA(PDNA)複合體。於另—態樣中,該微泡包含已預組 之脂質體-PDNA複合體,其包含混合質體之^-二掠搁酿 基.甘油-3-鱗脂醯膽鹼及!,2,二標搁酿基替甘油冬鱗 脂醯乙醇胺甘油。 本發明另-實施例是—種用以治療患者糖尿病或促進血 糖正常之方法,該方法包括下列步驟:鑑別出需要對抗糖 尿病之治療或需要促進血糖正常之患者;藉由對患者肝臟 輸注-或多個胰島細胞而移植一或多個姨島細胞,其令該 -或多個經移植姨島細胞會產生騰島素,以治療糖尿病或 促進血糖正常;注射包含可編碼人類血管内皮生長因子 (跑GF)裸露質體膽寧叫的有效量之微泡組合物,其 中该等微泡包含可藉由在一或多個經移植胰島細胞中進行 超音波破裂術而釋放AhVEGF的脂質,其中所釋放W咖 會促進-或多個經移植胰島細胞之血管重建、改善功能、 血管密度及效力;及藉由該一或多個經移植胰島細胞所產 生之胰島素而治療糖尿病或促進血糖正常。於—個 中’ s亥hVEGF為重組型hVEGF。 , J53800.doc 201139673 本發明另一實施例包括一種用於在身體器官中進行超音 波靶向之微泡破裂術(UTMD)之組合物,該級合物包八. 與微泡接觸之已預組脂質體-生物活性藥劑複合體,其中 該生物活性藥劑係選自由以下組成之群 ^ 保路質體 • DNA(pDNA)、siRNA、一或多種質體、蛋白質、病毒性載 ' 體及藥物’其中該已預組脂質體-生物活性藥劑複合體可 在一或多種啟動子控制下表現基因,其中藉由超音波使身 0 體器官標靶位置處之微泡破裂可將生物活性藥劑傳送在超 音波破裂術的位置處。於另一態樣中,該一或多個細胞包 括經移植胰島細胞。於另一態樣中,該身體器官包括肝 臟、胰臟、腎臟、肺或心臟。於另一態樣令,該身體器宫 為肝臟。於另一態樣中,該生物活性藥劑為pDNA。於另 一態樣中,該已預組脂質體-生物活性藥劑複合體在巨大 細胞病毒(CMV)啟動子控制下會表現重組型人類血管内皮 生長因子(hVEGF)基因。於另-態樣中,肖已預組脂質體_ 〇 核酸複合體包含陽離子脂質、陰離子脂質或其混合物及組 合。於另一態樣中,該等微泡分佈於醫藥上可接受之載劑 中。於另一態樣中,該已預組脂質體_生物活性藥劑複合 體包3此合貝體之1,2-二棕櫚醯基_sn_甘油_3_磷脂醯膽鹼 及1,2-二棕搁醯基_sn-甘油_3_磷脂醯乙醇胺甘油。於另一 態樣中,該組合物可促進一或多個經移植胰島細胞之血管 重建、改善功能、血管密度及效力。於另一態樣中,該組 合物進一步包含視需要選擇之塗層。 【實施方式】 153800.doc 201139673 爲了更完全理解本發明之特徵及優點,對照實施方式及 隨附圖式。 雖然下文令詳細論述製造及使用本發明之多項實施例, 但應瞭解,本發明提供許多可應用之發明概念,其可在許 多特定情形下實施。文中所論述之特定實施例僅用於依特 疋方式闡述製造及使用本發明,但並不限制本發明之範 圍。 為便於理解本發明,許多術語定義如下。文中所定義之 術語具有為本發明相關領域_之一般技術者所通常理解之 3心諸如「一」(「a」、「anj )、及「該」之術語無意於 僅指單個實體,而是通稱其中—項可供闡述之實例。本文 之術語係用㈣述本發明之特定實施例,但其用途並非限 制本發明,除非於專利申請範圍中指出。 本發明闡述一種超音波起向之微泡破裂(utmd)方法, 該方法係用於將非病毒性hVEGF基因傳送至經移植姨島〜 胞,以促進騰島重建血管及存活。本發明人在先前經騰島 細胞移植之患有糖尿病裸鼠宿主的肝臟中誘導出可編石馬 抓仰或綠色螢光蛋白(GFP)之非病毒性質體載體。本發 :人研究結果證明可使血糖恢復正常並改善胰島血管重 異性轉錄所需,且為細胞之合成機轉:所I::::: 户 =識別之dna序列。如文中所用,術語「於轉錄控 作方式連接」之定義為:啟動子處於_於杉 153800.doc -10- 201139673 正確之位置及方向上,其可控制RNA聚合酶啟動及表現 hVEGF基因。 胰島細胞移植術是治療丨型糖尿病極有前景的方法,然 而,移植的效力待改進,因為當前多種移植術均被要求需 達到無胰島素之狀態[1,2]。咸已證明,將基因傳送至胰 ‘ 島可改善胰島之功能及存活[3_6],但所有先前研究均是使 用病毒性載體。雖然病毒性載體可高效力地傳送基因,但 ❹ 會出現與經增強子所介導之基因體DNA突變[7]或因應病 毒蛋白質之免疫反應[8]相關之副作用。 相反地,於活體内傳送裸露質體DNA(pDNA)則不會運 送具有毒性的或具有免疫原性的病毒蛋白質及聚合物顆 粒。然而,質體载體受限於低的轉染效率。爲了利用 pDNA獲得高的基因表現率,本發明發明人闡述一種由超 音波介導之基因傳送方法,稱為超音波靶向微泡破裂法 (UTMD)。將經囊封四氟化碳氣體之脂質外殼所組成之微 〇 泡注射至循環系統中’ pDNA則併入於脂質外殼。當暴露 於超音波下時’該微泡會***’致使周圍細胞之細胞膜產 生暫時性小孔’而pDNA會被***至細胞中。UTMD具有 基因療法許多所要的特性,包括低毒性、低免疫原性、可 重複應用性、器官特異性、及可廣泛應用於音波可到達之 器官。本發明者先前已證實,藉由UTMD將人類血管内皮 生長因子(hVEGF)傳送至大鼠心肌可明顯增加心肌中之毛 細金管及動脈密度[9]。更進一步,本發明者先前已報導, 該UTMD技術能夠於活體内高效率將pDNA傳送至大鼠胰 153800.doc -11- 201139673 臟β細胞中[10, 11]。胰島内微企管缺少是經嫁接胰島細胞 衰竭之其中一個最重要因素。因此,本發明者假設,藉由 傳送hVEGF基因以促進血管重建可減少胰島移植物之早期 衰竭。 於本發明中,本發明者係使用一種其中經由肝門靜脈將 人類胰島移植至小鼠肝臟中之移植模式。此模式類似於臨 床環境。藉由UTMD將hVEGF基因傳送至宿主肝臟中,以 檢查其是否有助於血管重建及改善經移植胰島之存活及功 能。 本發明研究所得之結果說明,在第30天時,13%未進行 UTMD組小鼠及14% GFP組小鼠的血糖恢復正常,而VEGF 組中有73%小鼠恢復正常血糖(未進行UTMD組對VEGF組 之p<0.05)。於第32天時,hVEGF組之血清人類胰島素濃度 及C肽濃度顯著更高(胰島素分別爲:未進行UTMD組 _17±8 ; GFP組-37±17 ; VEGF 組-l〇9±26 pmol/L,p<0.05 ; C-肽分別爲:未進行UTMD組-68±38 ; GFP組-115±58 ; VEGF 組-791±230 pmol/L,p<0.05)。VEGF 組之經嫁接胰 島的血管密度顯著更高(分別爲未進行UTMD組:169±36 ; GFP : 227士39 ; VEGF : 649±51 個 /mm2,ρ<0·05)。該等結 果說明,利用UTMD將hVEGF基因傳送至宿主肝臟在進行 胰島移植術後可促進胰島血管重建並改進血糖恢復正常的 狀況。 人類姨島:在透過本地器官勘募組織(local Organ Procurement Organizations)(Southwest Transplant Alliance, 153800.doc -12- 201139673
Dallas,TX,LifeGift,Fort Worth,TX)獲得研究同意書之 後,自多個死亡之多器官供體獲得7個供體胰臟。Baylor 地區移植研究中心(Baylor Regional Transplant Institute Surgeons)採用標準外科手術技術獲得騰臟[12]。採用腺管 注射 ΕΤ-KYOTO 溶液法(Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.,Naruto,Japan),及隨後之兩層法(two-layer method) 保存胰臟,直至進行胰島分離製程[12]。採用經修改 Ricordi方法分離出胰島[13]。供體及分離物之變數如下: 供體年齡 35.1± 5.6(歲),性別 M/F=2/5,BMI 28.0 土 1.5,缺 氧時間(Cold ischemic time)171±21(分鐘),純度 77士5(%) ’ 生存率97±1(%),刺激指數10.4±3.4。將經分離胰島隔夜保 存在 4°C 含有 10% 胎牛血清(FBS ; Atlanta Biologicals, Lawrenceville,USA)之補充有 CMRL 之培養基(Cellgro, Manassas, USA)中。以手挑選方式挑選共計約500個姨島 類似尺寸之胰島(約200 μηι)用於移植術。本發明者初步研 究結果顯示,在移植500個胰島後,10至20%小鼠會恢復 正常血糖。因此,判定該數目是最低限度的數值。 質體構築體:依如下方法,製得可在經強化CMV啟動子 控制下表現hVEGF165基因之質體(pCI-hVEGF):如先前技 術所述獲得hVEGF;(i5之cDNA[9],相關部分及序列已以引 用的方式併入文中。簡言之,使用如下含有限制酶切位點 之PCR引子,進行健康志願者血液PCR擴增作用,可獲得 hVEGFM5的全長CDNA(限制酶切位點經劃底線):引子 l(XhoI)5'- 153800.doc 13- 201139673 TTCCTCGAGAATGAACTTTCTGCTGCTGTCTTG-3'(SEQ. ID NO : 1);引子 2(SmaI)5’-AAACCCGGGTCACCGCCT CGGCTTGTCA-3,(SEQ. ID NO : 2)。利用 Xhol及 Smal酶解 該DNA,隨後連接至pCI哺乳動物表現載體(Promega)對應 位點。該質體經定序,確認不存在人工突變。使用在經強 化CMV啟動子控制下編碼綠色螢光蛋白(GFP)基因之質體 (PCS2-GFP)作為對照。 製造含質體之脂質穩定性微泡:如本發明者於先前技術 中所述之方法製得經脂質穩定性微泡[10]。簡言之,取共 計200 μΐ DPPC(1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼, Sigma, St Louis,USA,2.5 mg/ml)及 DPPE(1,2-二棕櫚醯基-sn甘油-3-石粦脂醯乙醇胺,Sigma,0·5 mg/ml)溶液、5 μΐ 10% 人類白蛋白及50 μΐ純甘油添加至1.5 ml小玻璃瓶中(其含有 溶解於50 μΐ脂質轉染胺2_(11^^1"〇呂611)中之2 mg質體)’並 充分混合,且於室溫下培養1 〇分鐘,其餘頂空填充八氟丙 烧氣體(Air Products, Inc” Allentown,USA)’ 隨後藉由牙 科用和汞器(VialmixTM,Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, N. Billerica,MA, USA)進行機械振盪 30秒。利用 粒子計(Beckman Coulter Multisizer III, Fullerton, CA, US A)測定微泡之平均直徑及濃度。以0.3 ml填酸鹽緩衝溶 液(PBS)稀釋含有約50 pg質體之10 μΐ微泡溶液’隨後立即 注射至各小鼠。 動物協議及UTMD :根據美國國家衛生研究院(National Institute of Health(NIH)建議及經實驗動物管理及使用委員 153800.doc -14- 201139673 會核准(the institutional animal care and use committee)進 行動物研究。將鏈脲佐菌素(STZ,150 mg/kg)以腹膜内注 射方式投與至雄裸鼠(8-13週齡,Harlan, Houston, USA)。 小鼠接連2次所測血_糖值均2350 mg/ml認定為罹患糖尿 病。移植前之糖尿病病狀在三組之間並無差異(糖尿病持 續期:4±1天,移植前血糖濃度:442±10 mg/dl)。藉由經 腹膜内注射***(100 mg/kg)及曱笨嘆嗪(1〇 mg/kg)麻醉 小鼠。經位於下腹部之小的中線切口拉出迴盲靜脈(肝門 靜脈之分支),使得在上腹部上可放置超音波探針(圖1A及 1B)。***27G蝴蝶針(wing needle),並利用止血夾固定 (圖1A)。在該研究中,26隻小鼠接受下列三種處理法中之 一種:1.僅移植人類胰島,不進行UTMD(未進行UTMD 組,n=8) ; 2.移植人類胰島,並利用編碼基因之質體 進行UTMD(GFP,n=7) ; 3.移植人類胰島,並利用編碼 hVEGFMJ之質體進行 UTMD(VEGF,n=ll)。 將以手挑選方式所挑選之人類胰島經由迴盲靜脈移植至 每一小鼠的肝臟中(n=500)。隨後,將各小鼠隨機分成3 組。藉由幫浦(Genie, Kent Scientific,Torrington, CT, USA),經由迴盲靜脈,為GFP組及VEGF組輸注含有質體 之微泡60至90秒。在輸注期間,利用市售之超音波探頭 (S3,Sonos 5500,Philips Ultrasound, Bothell, WA, USA)對 肝臟導入超音波。隨後依超諧波模式(發送1.3 MHz/接收 3_6 MHz)施加機器指數為1.4之超音波。藉由心電圖,採用 在出現R波波峰後延遲85 ms,每隔四個心縮期引發四次超 I53800.doc •15· 201139673 音波脈衝。已顯示該等設置對於藉由採用本發明特定裝置 進行UTMD的質體傳送法較佳[9-11]。在所有小鼠中均可 見微泡破裂現象(圖1C及1D)。在輸注之後,讓動物甦醒。 爲研究UTMD之效力,針對上述未經移植胰島之正常裸鼠 進行UTMD。處理後1至28天處死該等小鼠,並利用ELISA 套組(ALPCO Diagnostics,NH, USA)測定血清中人類 VEGF 濃度。於第3天,採集肝臟、胰臟、脾臟、腎臟、胃、肺 及心臟,並藉由RT-PCR評估基因表現。 爲評定該等經移植胰島中hVEGF表現的程度及面積,本 發明者經由肝門靜脈將胰島移植至正常裸鼠,隨後利用 hVEGF質體進行UTMD。處理3天之後,採集肝臟,並進 行免疫組織化學檢查。 UTMD對肝臟之影響:爲評估hVEGF之肝臟毒性及不想 要的作用(諸如肝臟血管新生過度及肝臟生長失控),如上 所述,經由肝門靜脈,利用hVEGF質體進行UTMD。在進 行UTMD之後之不同時間點採集血液。藉由酶分析套組 (Thermo Scientific, MA, USA),分析樣本中是否存在丙胺 酸胺基轉移酶(ALT)及天冬胺酸胺基轉移酶(AST)。藉由 HE染色法,對經福馬林固定之於進行UTMD之後第2、7、 30天分離出之肝臟切片進行組織學檢查。 評估處理組小鼠:利用血糖濃度試紙(Precision, Abbott, IL, USA)測定各小鼠之非空腹葡萄糖濃度直至移植後30 天。當連著2次血糖濃度測量值均低於200 mg/dl時,則認 定血糖恢復正常。糖尿病復發之定義為:血糖又回復至 153800.doc -16- 201139673 200 mg/dl以上。於第3 1天,進行腹膜内葡萄糖耐受測試 (IPGTT)。禁食整晚之後,經腹膜内注射葡萄糖(2 g/kg), 注射後120分鐘測定血糖濃度。第32天處死小鼠。稱量所 採集之肝臟的重量,並進行免疫組織化學檢查。採集血 液,並利用ELISA套組(ALPCO Diagnostics)測定人類胰島 素及人類C-肽濃度。 RT-PCR :該等組織樣本冷凍於液態氮並貯存於_80〇C 下。根據製造商之說明書,利用TRIzol(Invitrogen, Carlsbad, USA)製得總RNA,並利用 Superscript III第一股 合成系統(First-Strand Synthesis System)(Invtrogen)進行反 轉錄作用。於含有 1 μΐ cDNA、10 μΐ HotStarTaq Master Mix(Qiagen)、及10 pmol下列一種引子之20 μΐ液體中進行 PCR : GAPDH(人類及小鼠):5,-CCCTTCATTGACCTCAA CTACATG-3'(正向)(SEQ. ID NO : 3) ; 5'-TTCCATTGAT GACAAGCTTCCC-3,(反向)(SEQ. ID NO : 4) ; hVEGF : 5'-AAGGAGGAGGGCAGAATCAT-3'(正向)(SEQ. ID NO : 5) ; S'-ATCTGCATGGTGATGTTGGA-S'C 反向)(SEQ. ID NO : 6);小鼠 VEGF : 5,-ACGACAGAAGGAGAGCAG AAGT-3'(正向)(SEQ. ID NO : 7) ; 5’-CATGGTGATGTTG CTCTCTGAC-3,(SEQ. ID NO : 8)。PCR條件包括,於95°C 下變性5分鐘,隨後擴增25至35個循環,隨後於94°C下使 序列變性30秒,黏接引子並進行鏈延伸1分鐘。隨後於2% 瓊脂糖凝膠上分析RT-PCR產物。 免疫組織化學:將所採集組織在4°C下隔夜固定於4% 153800.doc -17- 201139673 聚甲醛中’並於4°C下隔夜平衡於30%蔗糖中以進行低溫 保護。於-80°C下,利用Tissue Tek優化切片溫度(optimal cutting temperature)(OCT)化合物(Sakura Finetek USA, Torrance,CA,USA)對組織進行低溫保護。依l〇 μηι之距離 切割切片,並置於帶正電之顯微鏡載玻片中。利用0.1 % Triton X 100滲透切片3分鐘,並培養於20% Aquablock (East Coast Biologies, North Berwick, MA, USA)中 30分鐘 以進行阻斷。使用針對下列抗原之抗體:豚鼠抗-人類胰 島素(1 : 200,Abeam, Cambridge, MA)、兔抗-姨高血糖素 (1 : 20,Millipore,Billerica, MA, USA)、山羊抗-波形蛋白 (1 · 10, Sigma-Aldrich, St. Louis,MO)、小鼠抗-人類 CD31(1 : 50, BD Biosciences,San Jose,CA)、大鼠抗-小鼠 PECAM-1(1 : 100,BD Biosciences)、及小鼠抗-人類 VEGF (1 : 100,Millipore)。4°c下隔夜培養具有該等第一抗體之 該等切片。利用與螢光素異硫氰酸酯(FITC)、Cy3(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)、Alexa-fluor-488、及 Alexa-fluor-568(Invitrogen)偶聯之適宜第二 抗體使抗原顯形。依製造商建議之濃度使用第二抗體。隨 後,對切片添加4’,6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI),以進行 核染色。該研究中’針對人類CD3 1及小鼠PEC AM-1之第 二抗體係經相同螢光素標記。於螢光顯微鏡中可見胰島’ 並利用 MetaMorph 軟體(Molecular Devices,Sunnyvale,CA) 分析圖像。依先前技術中所述之方法測定於處理後32天之 宿主肝臟(左葉)的胰島素陽性β細胞質量[14]。 153800.doc •18- 201139673 毛細血管密度測定:藉由免疫組織化學法所顯現之胰島 内CD3 1陽性血管被認定為毛細血管。利用螢光顯微鏡, 於200倍放大倍率下計數毛細血管。每一小鼠拍攝至少兩 張宿主肝臟中胰島素陽性嫁接胰島之顯微鏡圖像,每組共 計有30張以上之胰島圖像。利用ImageJ軟體(National Institutes of Health, Bethesda,USA)測量各胰島之面積。 評估分離前之人類胰島以作為對照。毛細血管密度係以每 mm2中所含數目表示。計讀毛細血·管密度之研究者對於治 療組別係無從得知的。利用類似步驟測定小鼠肝臟之血管 密度。 VEGF對内源性胰臟之影響:爲研究循環的hVEGF對於 内源性胰臟之影響,利用hVEGF質體對經STZ誘發之糖尿 病小鼠肝臟進行UTMD。使用正常小鼠及經STZ誘發之糖 尿病小鼠作為對照。測量20天之非空腹狀態下血糖濃度。 進行UTMD後第20天,採集各組之胰臟,並以免疫組織化 學分析胰島素(β細胞)及CD31(毛細血管)。如先前技術中 所述方法測定内源性胰臟中胰島素陽性β細胞質量[14]。如 上文所述測定胰島之血管密度。 統計學分析:數據以平均值±平均值之標準差(SEM)表 示。根據司圖登特t-檢定(Student's t-test),藉由ANOVA確 定三組間差異之統計學顯著性,並經邦弗朗尼校正法 (Bonferroni correction)校正。藉由杜凯真實顯著性差異 (Tukey Honestly Significant Difference,HSD)分析三組間 比例之差異性。 153800.doc -19- 201139673 UTMD對經由肝門靜脈將基因傳送至肝臟之影響:利用 pCI-hVEGF及pCS2-GFP質體,對經由肝門靜脈注射微泡之 小鼠肝臟進行UTMD。於第3天,檢測到肝臟中hVEGF或 GFP表現量(圖2)。根據免疫組織化學分析,hVEGF在肝門 靜脈附近會強烈地表現,但該表現在肝臟中則會不均勻式 地分布(圖2A-2C),而未經處理之肝臟則不表現hVEGF(圖 2D)。於經誘導GFP之小鼠肝臟中檢測到GFP表現(圖2E)。 RT-PCR分析顯示,在正常小鼠肝臟中會表現小鼠 VEGF(mVEGF);然而並不表現hVEGF。另一方面,於經 誘導hVEGF之小鼠中,明顯地檢測到hVEGF表現(圖2F)。 UTMD後血清中hVEGF濃度:本發明者利用pCI-hVEGF 之活體外之初步研究證實,hVEGF蛋白質可自經轉染細胞 分泌至培養基中(數據未顯示)。吾人遂評估經UTMD處理 之小鼠血液中之hVEGF濃度。進行UTMD後之14天内均測 得hVEGF,雖然含量較低(圖2G)。此可能係由於血液之稀 釋及分解效應。 基因傳送之器官特異性:經由肝門靜脈進行UTMD之後 3天,採集小鼠多種器官,並藉由RT-PCR檢查各器官中 hVEGF表現。hVEGF在肝臟中會強力地表現,而其他器官 則未顯示表現(圖2H)。右腎稍微表現hVEGF,此可能係因 為其在解剖學上靠近肝臟,因此其暴露在超音波中。 UTMD及hVEGF對肝臟之影響:檢查因UTMD所導致對 小鼠肝臟之毒性。進行UTMD之後,測定血清中ALT及 AST濃度。UTMD後第1天,ALT及AST濃度均會稍微增 153800.doc -20- 201139673 加,且隨後快速地降至正常濃度(圖3 A)。該等數據說明, 毒性輕微且短暫。爲進一步測定進行UTMD之後,肝臟受 損程度,進行UTMD後第2、7、30天對肝臟進行組織學檢 查。雖然於第2天觀察到肝臟細胞架構已極輕微擾亂,但 大部份肝實質細胞並未顯示出顯著之組織學異常(圖3B)。 爲檢查局部表現之hVEGF是否會增加肝臟中血管或導致 失控之血管新生及肝臟生長,因而測定肝臟之企管密度及 肝臟(左葉)重量。在三組之間並無顯著差異(未進行UTMD 組、GFP組及VEGF組,圖3C及3D)。 循環的hVEGF對内源性胰臟之影響:如圖2所示,經 UTMD後,胰臟令並無hVEGF表現,但在血清中卻檢測到 hVEGF,本發明者遂研究此低量hVEGF是否會影響内源性 胰臟β細胞及胰島血管系統。以經STZ誘發之糖尿病小鼠而 言,將hVEGF基因傳送至肝臟並不會影響血糖濃度(圖 3E)、胰島中之内源性β細胞質量及血管密度(圖3F-3H)。 經嫁接胰島内及其周圍之hVEGF表現:於本發明方法, 透過相同途徑(肝門靜脈),先後進行胰島移植術及藉由 UTMD進行基因傳送。因此,咸預期該經誘導基因能夠高 效地傳送至經嫁接胰島及其周圍組織中。利用免疫組織化 學方法,hVEGF是在胰島之周邊及周圍組織中被測得,但 卻未在胰島中心檢測到,證實該外源性血管生成基因已成 功地轉染並表現(圖4)。此外,極少量之胰島素陽性β細胞 會加倍表現hVEGF(圖4Α)。一些騰高血糖素陽性細胞會與 hVEGF共同表現(圖4B),而存在許多對hVEGF及波形蛋白 153800.doc -21 - 201139673 (Vimentin)呈雙陽性之細胞(圖4C)。該等數據說明, hVEGF基因主要係由間葉細胞表現。 經誘發hVEGF對移植後胰島功能的影響:hVEGF對於移 植後胰島之功能的影響是以每日血糖值、第32天之人類胰 島素及C-肽濃度加以測定。移植後第7天,11隻hVEGF組 小鼠中有9隻(82%)會恢復正常血糖,而8隻未進行UTMD 組中有3隻(3 8%)及7隻GFP組中有4隻(57%)會恢復正常血 糖。然而,未進行UTMD組及GFP組中的大多數小鼠的血 糖濃度則顯示會逐漸增加,並30天過後會復發糖尿病(圖 5)。總言之,於第30天,11隻hVEGF組小鼠中有8隻(73%) 恒久性地恢復至正常血糖,而8隻對照組中有1隻(13%)及7 隻GFP組中有1隻(14%)恢復至正常血糖(圖5A至5D)。 VEGF組在第30天時之血糖正常率顯著高於未進行UTMD 組(表 1,p<0.05)。Kaplan-Meier評估顯示,VEGF組之移 植物存活顯著高於其他兩組(圖5E,未進行UTMD組對 UTMD、及GFP對UTMD之p<0.05)。hVEGF組之平均血清 人類胰島素濃度及C-肽濃度顯著高於未進行UTMD組(圖 6 :胰島素=未進行 UTMD 組:16·6±7·6 pmol/1,GFP 組: 37.0±16.5卩〇1〇1/1,¥£0?組:108.9士26.4?111〇1/卜未進行 UTMD組對VEGF組之p=0.0 13 : C-肽=未進行UTMD組: 68.4士37.5 pmol/1,GFP組:115·3±58.4 pmol/1,VEGF組: 791.5士230.5 pmol/1,未進行 UTMD 組對 VEGF 組之 p=0.022) ° 葡萄糖耐受測試:爲進一步界定經移植胰島之功能,經 153800.doc -22- 201139673 移植後第31天進行IPGTT。未進行UTMD組及GFP組之2小 時血糖濃度均高於200 mg/dl,而VEGF組則顯示具有正常 的圖形(圖5F)。 表1 :三組經處理後3 0天時之血糖正常率。藉由杜凯 HSD分析三組間之差異。 未進行 UTMD 組 GFP組 VEGF 組 進行移植 8 7 11 血醣恢復正常 1 1 8 % 12.5a 14.3 Ί2.Τ :未進行UTMD組對VEGF組之p<0.05
胰島内血管生成作用及β細胞質量:經處理後32天,藉 由免疫組織化學分析評估經移植胰島之毛細血管密度(圖 7Α至7Ε)。利用抗胰島素抗體使胰島現形,且利用抗人類 CD3 1及抗小鼠PECAM-1抗體使胰島内之血管染色,此係 由於據Brissova等人報導,胰島内内皮細胞及宿主内皮細 胞可促成經移植胰島之血管重建[15]。於經hVEGF處理之 小鼠中,毛細血管密度顯著高於兩個對照組(圖7E :分別 爲未進行 UTMD 組:169±36 ; GFP 組:227士39 ; VEGF : 649±5 1個/mm2。未進行UTMD組對VEGF組及GFP組對 VEGF組之p<0.0001)。hVEGF組之jk管密度較之未進行 UTMD組者顯著增加,但仍顯著低於天然之人類胰臟中之 153800.doc •23- 201139673 胰島(原始胰島;1215±86個/mm2, VEGF組對原始胰島之 ρ<0·00001)。經處理後第32天,VEGF組之肝臟左葉之p細 胞質量顯著尚於其他組(圖7F :分別爲未進行UTMD組: 0.11 士0.01 ; GFP 組:0.13±0.02,VEGF 組:0.26土0.02。未 進行UTMD組對VEGF組及GFP組對VEGF組之ρ<0.005)。 血管重建作用對於改善經移植胰島之存活而言是非常重 要的[16-1 9]。據報導’胰臟胰島產生VEGF對於胰島之血 管重建及功能而言是重要的[20]。爲了促使經移植胰島的 重建血管,本發明者已檢查於活體外對胰島導入可編碼 hVEGF之腺病毒載體,結果證實其使得血管重建,並改善 胰島的存活[3, 21-23]。然而,病毒性基因療法係與嚴重之 田1J作用相關[7, 8]。以水動力學為基礎傳送裸露pDNA顯示 具有治療的效果[22] ’不過其步驟在臨床上並不適用。咸 已顯示,不採用水動力學壓力而僅是簡單注射pDNA是沒 有效果的[24]。剛開始時,本發明者測試在不使用微泡及 超音波下’經由肝門靜脈輸注裸露hVEGF質體,因為該種 方法最簡單。然而,並沒有在肝臟中檢測到基因表現(數 據未顯示)。隨後’本發明者檢查本發明UTMD方法,顯示 該方法具有高度效果,且無明顯的不良生物效應[911, 25_ 28] 〇 本發明研究中,本發明者是採用臨床有關的肝門靜脈胰 島移植模式。更進一步,本發明者在輸注胰島之後,經由 肝門靜脈連續注射含有pDNA之微泡。經肝門靜脈内注射 微泡具有若干優點。首先,本發明者能夠直接將高濃度之 15380〇.doc -24- 201139673 pDNA傳送至肝臟,而經靜脈内注射效力較低,且經肝職 内傳送效力更低[2 9]。第二,該方法能夠實現對經嫁接胰 島及周圍組織進行高效基因傳送。顯然,較之僅對胰島進 仃基因傳送,本方法能夠增加總基因表現量,且此係 • UTMD優於活體外基因傳送方法之另一優點。為此,本發 明者使用CMV啟動子而非大鼠胰島素啟動子,CMV啟動 子顯示藉由UTMD可高效且特異性地直接將基因傳送至胰 λ 島。 ❹ 該等結果證實,可將hVEGF基因以非侵入性方式靶向性 傳送至肝臟及經移植胰島,且可改變胰島内之微血管。值 得注意地,本發明首次證實,以非侵入性方式將轉殖基因 傳送至佰主肝臟具有治療效力,且可在生物學上改變經嫁 接胰島之血管重建。即使UMTD是一種非侵入性之方法, 但此方法仍可能會對肝臟造成傷害。爲了評估對肝臟所造 成的傷害,吾人在進行UMTD之後,檢查轉胺酶濃度並組 Ο 織學檢查肝臟。該等檢查顯示UMTD對於肝臟的副作用很 小。 經嫁接胰島中所增加的微血管很可能會促成胰島移植術 效力的改善。然而,考慮到經嫁接胰島衰竭之時間過程及 VEGF表現量及血管重建程度,可能存在另一種有關vegf 對於改善移植作用效應之機轉。本發明研究中,在經移植 胰島中之毛細血管密度會於經hVEGF質體基因傳送32天後 增加。不過,經誘發hVEGF蛋白質在經處理小鼠14天後之 血液及10天後之肝臟就可檢測到。本發明者先前已報導, 153800.doc -25- 201139673 藉由UTMD將hVEGF傳送至大鼠心臟,可增加毛細血管密 度’但在第30天時則觀察到毛細血管密度又降低至基線 值,此可能係由於質體表現之瞬時性質[9]。由於向上調節 VEGF表現里會導致騰島中血管異常及血管瘤[3〇],因此本 發明方法瞬時表現hVEGF可提供另一優點。 藉由超音波使微泡破裂會導致空泡化、熱效應、微流效 應、產生游離基及破壞毛細血管[3卜叫,#此可能會活化 内皮細胞或其他細胞。事實上’儘管本發明者的數據顯示 在進行UTMD之後’肝臟功能僅出現極輕度的異常,但在 GFP組及hVEGF組中均觀察到輕微發炎及肝臟細胞架構瓦 解(未顯示數據)。姨島移植術本身會導致嚴重發炎作用; 因此,本發明研究令,微泡破裂所可能產生之有害生物效 應似乎會被基因療法之治療效力抵消。爲了預防與胰島移 植術相關之發炎’組合使用hVEGF及抗發炎基因或藥物 可能適用[35]。 根據本發明方法,藉由UTMD將hVEGF基因傳送至經移 植後騰島及宿主肝臟,可使得該嫁接胰島之血管密度增加 並改善移植物的功能。藉由UTMD傳送基因可安全且有效 改善騰島移植術。 ^認為本說明書中所論述之任—實施例可藉由本發明之 任一方法、套組、試劑或組合物實現,反之亦然。更進— 步,本發明組合物可用於實現本發明之方法。 可理解’文中所述之特定實施例係以闡述之方式說明, 而並不限制本發明。可在不脫離本發明範圍下,在多項實 153800.doc -26 - 201139673 施例中使用本發明之主要特徵。彼等熟習此項技術者咸瞭 解,月b夠確疋,在文中所述之特定步驟中使用常規實驗、 數量當量。認為該等當量屬於本發明之範圍内,且包括在 專利申請範圍中。 ★ #說a日中所提及之所有公開案及專利中請案可指導彼 等…、驾本么a月所涉及領域之技術的技術者之技術水平。所 >有公開案及專利中請書係以引用的方式併人文中,且程度 〇 纟好像各A開案或專利巾請書特定且個別地以引用的方式 併入一般。 「在專利申清範圍及/或說明書中,當字詞「一」與術語 、包括」一起使用時,其可意指「一個」,但其係與「一 或夕個」至J 一個」、及「一個或一個以上」之含意相 一致。在專利申請範圍中,使用術語「或」意指「及/ 或」,除非另外指出僅指替代物或替代物互斥,儘管本揭 示案支持僅指代替代物及指代「及/或」之定義。在本申 0 °月案王文中’術語「約」意指包含用於測定該數值之裝 置、方法之固有誤差、或存在於研究者之間的差異性的數 值。 如本說明書及專利申請範圍中所用,字詞「包括」 (mPrising」)(及其任一形式,諸如「comprise」及 comprises」)、「具有」(「having」)(及其任一形式 haVmg,諸如「have」及「has」)、「包含」(「including」)(及 之任一形式,諸如「includes」及「include」)、「含有」 (〇ntaining」)(及其任一形式’諸如「contains」及 153800.doc •27- 201139673 「contain」)為包含性或開放性,且並不排除其他未敘述 之要素或方法步驟。 如文中所用,術語「或其組合」係指該術語之前所列舉 主體之所有排列組合。例如,「A、B、C、或其組合」意 欲包括下列至少一個:A、B、C、AB、AC、BC、或 ABC,且若在特定内容中順序重要,則亦包括BA、CA、 CB、CBA、BCA、ACB、BAC、或 CAB。沿用該實例,該 種表述方法包括含有一或多個主體或術語之重複之組合, 諸如 BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、 CABABB等。熟習此項技術者咸瞭解,通常對於任一組合 中之主體或術語之數量並無限制,除非已在上下文中表 明。 文中所揭示及主張專利權之所有組合物及/或方法可參 照本揭示案,無須過度實驗即可製得及進行。雖然已以較 佳實施例之形式闡述本發明組合物及方法,但熟習此項技 術者咸瞭解,在不脫離本發明之概念、精神及範圍下,可 改變文中所述步驟中之組合物及/或方法、或步驟之順 序。熟習此項技術者所明瞭之所有該等類似替代及改變認 為係屬於由隨附專利申請範圍所定義之本發明精神、範圍 及概念内。 參照案 美國專利申請案第20080114287號:Ultrasound Microbubble Mediated Genes Delivery System. 美國專利案第 7374390號:GLP-1 Gene Delivery for the 153800.doc -28- 201139673
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Mol Pharm 6 : 274-284 【圖式簡單說明】 圖1A-1D說明,經迴盲靜脈對小鼠肝臟進行UTMD : (1A)輸注至測試小鼠102的迴盲靜脈。104 :迴盲靜脈; 106 :止血夾;108 : 27G蝴蝶針;(1B)UTMD之裝置。將 超音波探針置於上腹部。110 ··探針;(1C-1D)超音波圖 像,(1C)無微泡之小鼠肝臟,於低回聲水準下顯示肝臟; (1D)注射微泡之後之小鼠肝臟。在微泡破裂之前偵測到白 色透明影像(White opacification)(左),且在進行破裂之後 消失(右), 圖2A-2H顯示經UTMD傳送之hVEGF基因。在利用 hVEGF或GFP質體進行UTMD之後,移除小鼠肝臟,並經 免疫組織化學及RT-PCR檢查。(2A至2E)對小鼠肝臟進行 免疫組織化學分析。(2A)在利用hVEGF進行UTMD之後3 天,(2B)10天,及(2C)14天。於圖2A及2B中,檢測到已表 153800.doc -34· 201139673 現hVEGF,尤其係於肝門靜脈附近處。於圖2C中,hVEGF 表現量極低,(2D)作為對照之正常小鼠肝臟,其中未表現 hVEGF,(2E)由GFP誘發之小鼠。檢測到已表現GFP。P : 肝門靜脈,綠色:(2A至2D)VEGF或(2E)GFP,藍色: ' DAPI。放大倍數:χΙΟΟ。比例尺:100 μπι,(2F)hVEGF- UTMD小鼠肝臟之RT-PCR結果。於UTMD處理組(第1至3 組)中,大量表現hVEGF,而在未經轉染之對照組(第4組) 0 中則未檢測到hVEGF表現。所有小鼠均表現内源性(小 鼠)VEGF。使用GAPDH作為標準。mVEGF :小鼠VEGF, (2G)經UTMD處理之小鼠的血清中之hVEGF濃度。檢測 hVEGF量直至進行UTMD後14天。ND :未測得, (2H)hVEGF表現之器官特異性。在利用hVEGF質體進行 UTMD之後三天收集各種器官,並藉由ΡΤ-PCR檢查hVEGF 表現。於肝臟中檢測到高hVEGF表現量,而在其他器官中 幾乎不表現。於右腎中觀察到少量表現,此係因為該器官 〇 在解剖學上暴露於超音波中; 圖3A至3D UTMD及hVEGF對肝臟之影響:(3 A)進行 UTMD之後之血清中之AST(實線)及ALT(虛線)濃度。箭頭 符號:進行UTMD處理之時間點,(3B)經UTMD之後之對 肝臟之組織學分析(HE染色)。原始放大倍數:XI〇〇,(3C) 於處理之後32天之肝臟血管密度。三組之間不存在顯著差 異,(3D)於進行UTMD之後32天,肝臟左葉重量對體重之 比例。三組之間不存在顯著差異; 圖3E-3H : hVEGF對自身胰臟之影響:藉由UTMD,將 153800.doc -35· 201139673 hVEGF基因傳送至經STZ誘發糖尿病之小鼠的肝臟 (STZ+VEGF組)。將該等小鼠與未經處理之小鼠(正常組)及 經STZ誘發糖尿病之小鼠(STZ組)進行比較:(3E)STZ(虛 線)及STZ+VEGF(實線)組在經處理之後未出現空腹血糖濃 度濃度。箭頭符號:進行UTMD處理之時間點’(3F)於 χΙΟΟ下,經胰島素、CD31及DAPI染色之代表性胰臟切 片。比例尺:100 μιη ’(3G)在經處理之後20天之胰臟中之 β細胞質量,(3Η)在經處理之後2〇天之胰島血管密度。 VEGF並未影響β細胞質量及血管密度。星號·· Ρ<0·01 ° NS :不顯著; 圖4Α至4C顯示在移植胰島並進行UTMD之後,於經移植 胰島及周圍組織中所表現之hVEGF。在移植人類騰島並利 用hVEGF進行UTMD之後三天,對小鼠肝臟進行免疫組織 化學分析。主要於騰島表面及外部以及周圍組織中檢測到 已表現hVEGF : (4A)綠色:hVEGF,紅色:人類姨島素’ (4B)人類姨高如糖素,(4C)波形蛋白’藍色·· DAPI。放大 倍數:χ200,白線··所移植胰島之邊界,P :肝門靜脈管 腔。比例尺:100 ; 圖5A至5D顯示三組之血糖濃度:將500個人類胰島移植 至經STZ誘導糠尿病之裸小鼠之肝臟中。隨後利用GFP (5B : GFP 組,n=7)或 hVEGF(5C : VEGF 組 ’ n=ll)質體進 行UTMD。於未進行UTMD組(5A : n=8)中未進行UTMD, (5D)三組之平均血糖濃度。虛線:未進行UTMD組’點 線:GFP組,實線·· VEGF組。preTX :預處理; 153800.doc -36- 201139673 圖5E及5F顯示關於三組之移植物存活率之Kaplan-Meyer 圖。將第7天設定為基線,並經對數級檢定(log-rank test) 測定存活率曲線之p值。(5E)UTMD組與VEGF組之間並無 顯著差異(p<〇.〇5),且GFP組與VEGF組之間並無顯著差異 (p<0.05),(5F)於處理後31天之三組之IPGTT。虛線:未進 • 行UTMD組,點線:GFP組,實線:VEGF組; 圖6A及6B顯示三組之(6A)血清中之人類胰島素濃度, 0 及(6B)C-肽濃度。於處理後32天,自各鼠採集血液。星 號:p<0.025 ;及 圖7A至7F顯示於處理後32天,所移植胰島之血管重建 狀況及β細胞質量。圖7A-7D :於x200下,經人類胰島 素、CD31及DAPI染色之代表性切片。分別爲(7Α)未進行 UTMD組,(7B)GFP組,(7C)VEGF組。於VEGF組之所移植 胰島中檢測到一些血管,(7D)作為對照之胰臟中之正常人 類胰島。紅色:人類胰島素;綠色:CD31 ;藍色: 〇 DAPI ;箭頭符號··胰島中之血管,(7E)所移植胰島之血管 密度。顯示處理後10天及32天之三組之血管密度的平均 .值。使用原始人類胰島作為對照。於第32天,VEGF組之 血管密度顯著高於未進行UTMD組及GFP組;但顯著低於 原始胰島,(7F)於處理之後32天時,肝臟左葉之β細胞質 量星號:ρ<〇.〇1。雙星號:Ρ<〇.〇〇5。 【主要元件符號說明】 102 測試小鼠 104 迴盲靜脈 153800.doc •37· 201139673 106 108 110 止金爽 27G蝴蝶針 探針 153800.doc -38 201139673 序列表 <110> 美商貝勒研究協會 <120> 胰島移植後之活體內非病毒性人類血管内皮生長因子基因傳送 <130> BHCS:2430 <140> 100103150 <141> 2011-01-27 <150> <151> 61/298,824 2010-01-27 O <160> <170> 8 Patentln version 3.5 <210> <211> 1 33 <212> <213> DNA 人工序列 <220> <223> <400> 合成性寡核苷酸 1 ttcctcgaga atgaactttc tgctgctgtc ttg 3 3 〇 <210> 2 <211> 28 <212> - <213> DNA 人工序列 <220> <223> 合成性寡核苷酸 <400> 2 aaacccgggt caccgcctcg gcttgtca 28 <210> 3 <21 1> 24 153800·序列表.doc 201139673 <212> <213> DNA 人工序列 <220> <223> 合成性寡核苷酸 <400> 3 cccttcattg acctcaacta catg 24 <210> 4 <21 1> 22 <212> <213> DNA 人工序列 <220> <223> 合成性寡核苷酸 <400> 4 ttccattgat gacaagcttc cc 22 <210> 5 <211> 20 <212> <213> DNA 人工序列 <220> <223> 合成性寡核苷酸 <400> 5 aaggaggagg gcagaatcat 20 <210> 6 <21 1> 20 <212> <213> DNA 人工序列 <220> <223> 合成性寡核苷酸 <400> 6 atctgcatgg tgatgttgga 20 -2- 153800-序列表.doc 201139673 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 合成性寡核苷酸 <400> 7 acgacagaag gagagcagaa gt
<210> 8 <21 1> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 合成性寡核苷酸 <400> 8 catggtgatg ttgctctctg ac
153800·序列表.doc
Claims (1)
- 201139673 七 、申請專利範圍: 1. 一種用以在一或多個肝臟細胞、肝臟或經移植至肝臟中 之胰島細胞中進行經超音波靶向之微泡破裂法 (ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)之 組合物,其包括: 一或多種已預組之脂質體質體DNA(pDNA)微泡複合 體,其中該微泡包含已囊封氣體及含有與人類血管内皮 Ο 生長因子(hVEGF)以操作方式連接的組成性啟動子序列 或誘導性啟動子序列的pDNA之脂質外殼,其中藉由超 音波使含於一或多個肝臟細胞、肝臟或移植至肝臟中之 胰島細胞中的一或多個微泡破裂,可將pDNA傳送至處 於進行超音波破裂處之該一或多個肝臟細胞、肝臟或經 移植至肝臟之胰島細胞,從而表現hVEGF,其中該組合 物可改善一或多個經移植胰島細胞之效力。 2. G 如請求項1之組合物,其中該脂質外殼包含選自以下組 成之群之一或多種其他生物活性藥劑:裸露DNA、 siRNA、質體、蛋白質、病毒性載體、及藥物。 3. 如請求項1之組合物,其中該氣體為四氟化碳氣體。 4. 如請求項1之組合物,其中該誘導性啟動子包括組織特 異性調節元件。 5. 如請求項1之組合物,其中該胰島移植術的效力係測定 經改善之血管重建、經改善之胰島細胞功能、經增加之 血管密度或其組合。 6. 如請求項1之組合物,其中該hVEGF為重組型hVEGF。 153800.doc 201139673 7. 如請求項1之組合物,其中一或多種藥劑可與該組合物 共同投與,其中該等藥劑係選自由以下組成之群:抗細 胞凋亡藥劑、消炎藥、JNK抑制劑、GLP-1、他克莫司 (tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、阿那白滯素 (anakinra)、得文聚醯胺(Dervin polyamide)或其組合。 8. —種用以藉由超音波靶向之微泡破裂術(UTMD)使肝臟 或經移植肝臟中經移植胰島細胞再生之組合物,其包 括: 包含可編碼人類血管内皮生長因子(hVEGF)之裸露質 體DNA的微泡,其中該等微泡包含可藉由在肝臟或經移 植肝臟中進行超音波破裂術而釋放出hVEGF之脂質。 9. 如請求項8之組合物,其中該hVEGF為重組型hVEGF。 10. 如請求項8之組合物,其中該hVEGF是在巨大細胞病毒 (CMV)啟動子控制下。 11. 一種微泡組合物之用途,其係用於製備用以在受檢者之 活體内及原位促進一或多個經移植或經嫁接細胞之血管 重建、改善功能、增加血管密度及效力之醫藥物,其中 該微泡組合物包含可編碼人類血管内皮生長因子 (hVEGF)之裸露質體DNA、及藉由在一或多個經移植或 經嫁接細胞中進行超音波破裂術而釋放出hVEGF之脂 質,其中該所釋放出之hVEGF可促進一或多個經移植或 經嫁接細胞之血管重建、改善功能、血管密度及效力。 1 2.如請求項11之用途,其中該一或多個經移植或經嫁接細 胞包括胰島細胞。 153800.doc 201139673 13. 如請求項11之用途 病受檢者或需要一 者0 ,其中該受檢者為健康受檢者、糖尿 或多個經移植或經嫁接細胞之受檢 I4· 一種包含在巨大細胞病毒(CMV)啟動子控制下可表現人 ' 類血管内皮生長因子(hvEGF)基因之質體的裸露質體 • DNA微泡複合體之㈣,其係用於製備用於促進患者肝 臟中一或多個經移植胰島細胞之血管生成、增加:管密 〇 度及效力之醫藥物,其中該醫藥物係意欲注射至該患者 肝臟中,以使該PDNA傳送至肝臟中之該一或多個經移 植胰島細胞;且使該一或多個經移植胰島細胞維持在可 有效表現hVEGF基因之條件下,其中hVEGF的表現可促 進一或多個經移植胰島細胞之血管生成、增加血管密产 及效力。 & 15.如請求項14之用途,其中該醫藥物另外包含—或多種選 自由如下組成之群之藥劑或與該—或多種選自如下組成 〇 之群之藥劑投與:抗細胞〉周亡藥劑、消炎藥、JNK抑制 劑、GLP-1、他克莫司、西羅莫司、阿那白滯素、得文 聚醯胺或其組合。 1 6.如叫求項14之用途,其中該微泡包含已預組之脂質體-裸 露質體DNA(pDNA)複合體》 17.如咕求項14之用途,其中該微泡包含已預組之脂質體_ pDNA複合體’其包含混合質體之丨,2-二棕橺醯基甘 油-3-磷脂醢膽鹼及丨,2_二棕櫚醯基_sn_甘油_3•磷脂醯乙 醇胺甘油。 153800.doc 201139673 1 8 · '一種微泡組合物之^用彳全 ^ /ά. m A,i 之用途,其係用於製備用於治療糖尿病 或促進患者之血糖恢復正常之醫藥物,其中該微泡組合 物包含可編碼人類血管内皮生長因子(hVEGF)之裸露質 體DNA(pDNA)、及藉由在該一或多個經移植騰島細胞中 進订超音波破裂術而釋放出hVEGF的脂質,其中該所釋 放出之hVEGF可促進一或多個經移植胰島細胞之血管重 建、改善功能、血管密度及效力,且其中該治療法包 括: 鑑別出需要治療糖尿病或需要促進也糖恢復正常之患 者; 藉由對患者肝臟輸注一或多個胰島細胞而移植一或多 個胰島細胞,其中該—或多個經移植胰島細胞可產生用 於治療糖尿病或促進血糖恢復正常之胰島素; 對該患者注射該醫藥物;及 藉由該或多個經移植胰島細胞所產生之胰島素治療 糖尿病或促進血糖恢復正常。 19·如請求項18之用途,其申該1^£〇1?為重組型hvEGF。 20. 如請求項18之用途,其中該11¥]6〇1?係在巨大細胞病毒 (CMV)啟動子之控制下。 21. 如吻求項18之用途,其中該醫藥物另外包含一或多種選 自由如下組成之群之藥劑或與該一或多種選自如下組成 之群之藥劑投與:抗細胞凋亡藥劑、消炎藥、JNK抑制 劑、GLP-1、他克莫司、西羅莫司、阿那白滯素、得文 聚醯胺或其組合。 ]53800.doc 201139673 22· —種在身體器官中進行超音波介導之 (UTMD)之組合物,其包含: ' 術 與微泡接觸之已預組之脂㈣·生物活性_複合體, 其中該等生物活性藥劑係選自由以下組成之群:裸 Ο 體DNA(PDNA)、仙财、—或多個質體、蛋白質、病毒 性載體及藥物’其中該已預組之脂質體_生物活性藥劑複 合體可在-或多種啟動子控制下表現基因,其十藉由超 音波使身體器官標靶位置處之微泡破裂,可將該:物活 性藥劑傳送到超音波破裂術之位置處。 23.如請求項22之組合物’其中該一或多個細胞包括經移植 姨島細胞。 24. 如请求項22之組合物,— & , J兵Τ δ亥身體益官包括肝臟、胰 臟、腎臟、肺或心臟。 25. 如請求項22之組合物,其中該身體器官為肝臟。 26. 如請求項22之組合物,其中該生物活性藥劑為pDNA。 Ο 27.如请求項22之組合物,其中該已預組之脂質體-生物活性 藥劑複合體在巨大細胞病毒(CMV)啟動子控制下表現重 . 組型人類血管内皮生長因子(hVEGF)基因。 28. 如請求項22之組合物,其中該已預組之脂質體_核酸複合 體包含陽離子脂質、陰離子脂質或其混合物或組合。 29. 如請求項22之組合物,其中該等微泡係分佈於醫藥上可 接受之載劑中。 3 0.如請求項22之組合物,其中該已預組之脂質體_生物活性 藥劑複合體包含混合質體之丨,2_二棕摘醯基-sn-甘油-3- 153800.doc 201139673 磷脂醯膽鹼及1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺 甘油。 3 1 ·如請求項22之組合物,其中該組合物可使該一或多個經 移植胰島細胞促進血管重建、改善功能、增加金管密度 及效力。 32.如請求項22之組合物,其另外包含視需要選用之塗層。 153800.doc
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