TW201139673A - In-vivo no-viral gene delivery of human vascular endothelial growth factor following islet tranplantation - Google Patents

Description

201139673 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明大體上係關於基因傳送的領域，且更特定言之係 關於發展一種經超音波介導之基因傳送方法該方法用於 將類血$内皮生長因子（human vascular endothelial growth factar ; hVEGF)基因傳送至經移植胰島及周圍組 織’以促進胰島血管重建及存活。 【先前技術】 非限制本發明之範圍下，本發明所揭述背景是關於用於 改善經移植細胞及組織之效力及用於疾病治療之基因傳送 方法。 美國專利申請案第2〇〇8〇114287號（1^及1^1 2〇〇8)闡述 一種傳送適用於治療包括腹膜纖維化或手術後黏連之腹膜 疾病的藥劑（諸如基因、質體、及其他與DNA相關之活性 分子）之方法，明確言之是利用超音波觸發攜帶誘導性 Smad7基因之微泡系統的破裂。本發明提供一種含有用於 治療腹腔疾病之一或多個誘導性Smad7基因、DNA分子、 或質體之微泡源，隨後以該微泡灌注患者腹腔區域；對腹 部提供超音波能量，該能量足以使該一或多個誘導性 Smad7基因、DNA分子或質體自微泡轉染至腹腔區域並滲 透至位於其中之腹腔組織。 頒予Oh等人之美國專利案第7,374,39〇號（2〇〇8)揭示一種 可使2型糖尿病患者之血糖濃度恢復正常的組合物及其使 用方法。該發明包括一種經構築且被傳送至細胞中用以表 153800.doc 201139673 現活性GLP-1之質體，該質體包含小雞β肌動蛋白啟動子及 增強子；帶有弗林蛋白酶（furin)裂解位點之經改變GLP-l(7-37)cDNA(pPGLPl)。

Coleman等人申請之美國專利申請案第20090209630號 (2009)揭示一種可有效將血管生成因子傳送至心臟及周邊 血管系統之新穎方法，此方法可避免現有傳送技術所固有 之毒性問題。攜帶可編碼血管生成劑（包括Del-1或VEGF或 兩者）之序列的載體可以與泊洛沙姆（poloxamer)或其他用 於傳送至缺血組織之聚合物調配在一起，以流動至斷流方 式傳送至周邊缺血區域，並藉由逆流靜脈灌注方式傳送至 心臟。 【發明内容】 本發明使用一種超音波把向之微泡破裂法（Ultrasound Targeted Microbubble Destruction，UTMD)，以將人類血 管内皮生長因子（hVEGF)基因傳送至經移植胰島及周圍組 織中，以促進胰島血管重建及存活。將一些人類胰島移植 至糖尿病裸鼠肝臟中，隨後藉由UTMD，誘導宿主肝臟中 可編碼hVEGF或綠色螢光蛋白（GFP)基因之非病毒性質體 載體。進行無基因傳送之移植術以作為對照。採用本發明 可使血糖濃度、血清人類胰島素濃度、C-肽濃度穩定，並 使經嫁接胰島重建血管。 於一項實施例中，本發明包括一種用於在一或多個肝臟 細胞、肝臟或移植至肝臟之胰島細胞中進行超音波靶向微 泡破裂術（UTMD)之組合物，該組合物包含：一或多個已 153800.doc 201139673 預組之脂質體質體DNA(pDNA)微泡複合體，其中該微泡 包含含有氣體之脂質外殼、及含有與人類血管内皮生長因 子（hVEGF)以操作方式連接之組成性啟動子序列或誘導性 啟動子序列的pDNA ’其中於超音波破裂表現hVEGF處， 藉由超音波使位於一或多個肝臟細胞、肝臟或移植至肝臟 之細胞中之一或多個微泡破裂，從而將pDNA傳送至一或 多個肝臟細胞、肝臟或移植至肝臟之細胞中，其中該組合 物會增強一或多個經移植胰島細胞之效力。於一個態樣 中，脂質外殼包含一或多種選自由以下組成之群之其他具 生物活性之藥劑：裸露DNA、siRNA、質體、蛋白質、病 毒性載體及藥物。於另—態樣中，氣體為四氟化碳氣體。 於另一態樣中，該誘導性啟動子包含組織特異性調節元 件。於另一態樣中，該胰島移植術之效力是藉由血管重建 =強、騰島細胞功能改善、血管密度增加或其纪合加以測 定。於另一態樣中，hVEGF為重組型跳仰。於另一態樣 中，一或多種藥劑可與選自由如下組成之群之組合物二同 投與：抗細胞瑪亡藥劑、消炎藥、JNK抑制劑、GUM、 〉司（acrohmus)、西羅莫司（士〇此奶）、阿那白滯素 (anaklnra)、传文聚醯胺或其植人。 ::一實施例為一 肝臟或經移植肝臟中之經移植胰島細胞再生之 組合物，該組合物自合入女1 I丹生之 5有可編碼人類血管内皮生异田本 Η。之裸露質體_之微泡，其中該微泡== 肝臟次經移植肝臟中所進行之超音波破裂術而釋放出 153800.doc 201139673 hVEGF的月旨質。於一個態樣中，該hVEGF為重組型 hVEGF 〇於另一態樣中，該組成性啟動子序列或誘導性啟 動子序列係以操作方式連接至人類血管内皮生長因子，例 如胰島素啟動子或巨大細胞病毒（CMV)啟動子。 本發明另一實施例是一種在受檢者之活體内及原位促進 一或多個經移植細胞或經嫁接細胞血管重建、改善功能、 血管密度及效力之方法，該方法包括下列步驟：傳送包含 可編碼人類血管内皮生長因子（hVEGF)裸露質體DNA微泡 之有效量微泡組合物，其申該等微泡包含可藉由在一或多 個經移植細胞或經嫁接細胞中進行超音波破裂術而釋放出 hVEGF之脂質，其中該經釋放hVEGF可促進一或多種經移 植細胞或經嫁接細胞之血管重建、改善功能、血管密度及 效力。於一個態樣中，該一或多個經移植細胞或經嫁接細 胞包括胰島細胞。於另一態樣中，該受檢者為健康受檢 者、糖尿病受檢者或需要一或多個經移植細胞或經嫁接細 胞之受檢者。 本發明另一實施例是一種促進患者肝臟中一或多個經移 植胰島細胞之血管生成、血管密度及效力之方法，該方法 包括下列步驟：將裸露質體DNA微泡複合體注射與該患 者，該微泡複合物包含一在巨大細胞病毒（CMV)啟動子控 制下可表現人類血管内皮生長因子（hVEGF)基因之質體， 其中該注射係在患者肝臟中進行；將pDNA傳送至肝臟中 之一或多個經移植胰島細胞；並將該一或多個經移植胰島 細胞維持在可有效表現hVEGF基因之條件下，其中該表現 153800.doc 201139673 hVEGF會促進該-或多個經移植騰島細胞之血管生成、血 管密度及效力。於-態樣中，該方法進一步包括視需要共 同投與一或多種藥劑，其中該等藥劑係選自由如下組成之 群：抗細胞凋亡藥劑、消炎藥、JNK抑制劑、GUM、他 克莫司（tacrolimus)、西羅莫司（sir〇Hmus)、阿那白滯素 (anakiwa)'得文聚酸胺（Dervin p〇lyamide)或其組合。於 另一態樣中，該微泡包含已預組之脂質體-裸露質體 DNA(PDNA)複合體。於另—態樣中，該微泡包含已預組 之脂質體-PDNA複合體，其包含混合質體之^-二掠搁酿 基.甘油-3-鱗脂醯膽鹼及！，2，二標搁酿基替甘油冬鱗 脂醯乙醇胺甘油。 本發明另-實施例是—種用以治療患者糖尿病或促進血 糖正常之方法，該方法包括下列步驟：鑑別出需要對抗糖 尿病之治療或需要促進血糖正常之患者；藉由對患者肝臟 輸注-或多個胰島細胞而移植一或多個姨島細胞，其令該 -或多個經移植姨島細胞會產生騰島素，以治療糖尿病或 促進血糖正常；注射包含可編碼人類血管内皮生長因子 (跑GF)裸露質體膽寧叫的有效量之微泡組合物，其 中该等微泡包含可藉由在一或多個經移植胰島細胞中進行 超音波破裂術而釋放AhVEGF的脂質，其中所釋放W咖 會促進-或多個經移植胰島細胞之血管重建、改善功能、 血管密度及效力；及藉由該一或多個經移植胰島細胞所產 生之胰島素而治療糖尿病或促進血糖正常。於—個 中’ s亥hVEGF為重組型hVEGF。 ， J53800.doc 201139673 本發明另一實施例包括一種用於在身體器官中進行超音 波靶向之微泡破裂術（UTMD)之組合物，該級合物包八. 與微泡接觸之已預組脂質體-生物活性藥劑複合體，其中 該生物活性藥劑係選自由以下組成之群 ^ 保路質體 • DNA(pDNA)、siRNA、一或多種質體、蛋白質、病毒性載 ' 體及藥物’其中該已預組脂質體-生物活性藥劑複合體可 在一或多種啟動子控制下表現基因，其中藉由超音波使身 0 體器官標靶位置處之微泡破裂可將生物活性藥劑傳送在超 音波破裂術的位置處。於另一態樣中，該一或多個細胞包 括經移植胰島細胞。於另一態樣中，該身體器官包括肝 臟、胰臟、腎臟、肺或心臟。於另一態樣令，該身體器宫 為肝臟。於另一態樣中，該生物活性藥劑為pDNA。於另 一態樣中，該已預組脂質體-生物活性藥劑複合體在巨大 細胞病毒（CMV)啟動子控制下會表現重組型人類血管内皮 生長因子（hVEGF)基因。於另-態樣中，肖已預組脂質體_ 〇 核酸複合體包含陽離子脂質、陰離子脂質或其混合物及組 合。於另一態樣中，該等微泡分佈於醫藥上可接受之載劑 中。於另一態樣中，該已預組脂質體_生物活性藥劑複合 體包3此合貝體之1，2-二棕櫚醯基_sn_甘油_3_磷脂醯膽鹼 及1，2-二棕搁醯基_sn-甘油_3_磷脂醯乙醇胺甘油。於另一 態樣中，該組合物可促進一或多個經移植胰島細胞之血管 重建、改善功能、血管密度及效力。於另一態樣中，該組 合物進一步包含視需要選擇之塗層。 【實施方式】 153800.doc 201139673 爲了更完全理解本發明之特徵及優點，對照實施方式及 隨附圖式。 雖然下文令詳細論述製造及使用本發明之多項實施例， 但應瞭解，本發明提供許多可應用之發明概念，其可在許 多特定情形下實施。文中所論述之特定實施例僅用於依特 疋方式闡述製造及使用本發明，但並不限制本發明之範 圍。 為便於理解本發明，許多術語定義如下。文中所定義之 術語具有為本發明相關領域_之一般技術者所通常理解之 3心諸如「一」（「a」、「anj )、及「該」之術語無意於 僅指單個實體，而是通稱其中—項可供闡述之實例。本文 之術語係用㈣述本發明之特定實施例，但其用途並非限 制本發明，除非於專利申請範圍中指出。 本發明闡述一種超音波起向之微泡破裂（utmd)方法， 該方法係用於將非病毒性hVEGF基因傳送至經移植姨島〜 胞，以促進騰島重建血管及存活。本發明人在先前經騰島 細胞移植之患有糖尿病裸鼠宿主的肝臟中誘導出可編石馬 抓仰或綠色螢光蛋白（GFP)之非病毒性質體載體。本發 :人研究結果證明可使血糖恢復正常並改善胰島血管重 異性轉錄所需，且為細胞之合成機轉:所I::::: 户 =識別之dna序列。如文中所用，術語「於轉錄控 作方式連接」之定義為：啟動子處於_於杉 153800.doc -10- 201139673 正確之位置及方向上，其可控制RNA聚合酶啟動及表現 hVEGF基因。 胰島細胞移植術是治療丨型糖尿病極有前景的方法，然 而，移植的效力待改進，因為當前多種移植術均被要求需 達到無胰島素之狀態[1，2]。咸已證明，將基因傳送至胰 ‘ 島可改善胰島之功能及存活[3_6]，但所有先前研究均是使 用病毒性載體。雖然病毒性載體可高效力地傳送基因，但 ❹ 會出現與經增強子所介導之基因體DNA突變[7]或因應病 毒蛋白質之免疫反應[8]相關之副作用。 相反地，於活體内傳送裸露質體DNA(pDNA)則不會運 送具有毒性的或具有免疫原性的病毒蛋白質及聚合物顆 粒。然而，質體载體受限於低的轉染效率。爲了利用 pDNA獲得高的基因表現率，本發明發明人闡述一種由超 音波介導之基因傳送方法，稱為超音波靶向微泡破裂法 (UTMD)。將經囊封四氟化碳氣體之脂質外殼所組成之微 〇 泡注射至循環系統中’ pDNA則併入於脂質外殼。當暴露 於超音波下時’該微泡會***’致使周圍細胞之細胞膜產 生暫時性小孔’而pDNA會被***至細胞中。UTMD具有 基因療法許多所要的特性，包括低毒性、低免疫原性、可 重複應用性、器官特異性、及可廣泛應用於音波可到達之 器官。本發明者先前已證實，藉由UTMD將人類血管内皮 生長因子（hVEGF)傳送至大鼠心肌可明顯增加心肌中之毛 細金管及動脈密度[9]。更進一步，本發明者先前已報導， 該UTMD技術能夠於活體内高效率將pDNA傳送至大鼠胰 153800.doc -11- 201139673 臟β細胞中[10, 11]。胰島内微企管缺少是經嫁接胰島細胞 衰竭之其中一個最重要因素。因此，本發明者假設，藉由 傳送hVEGF基因以促進血管重建可減少胰島移植物之早期 衰竭。 於本發明中，本發明者係使用一種其中經由肝門靜脈將 人類胰島移植至小鼠肝臟中之移植模式。此模式類似於臨 床環境。藉由UTMD將hVEGF基因傳送至宿主肝臟中，以 檢查其是否有助於血管重建及改善經移植胰島之存活及功 能。 本發明研究所得之結果說明，在第30天時，13%未進行 UTMD組小鼠及14% GFP組小鼠的血糖恢復正常，而VEGF 組中有73%小鼠恢復正常血糖（未進行UTMD組對VEGF組 之p<0.05)。於第32天時，hVEGF組之血清人類胰島素濃度 及C肽濃度顯著更高（胰島素分別爲：未進行UTMD組 _17±8 ; GFP組-37±17 ; VEGF 組-l〇9±26 pmol/L，p<0.05 ; C-肽分別爲：未進行UTMD組-68±38 ; GFP組-115±58 ; VEGF 組-791±230 pmol/L，p<0.05)。VEGF 組之經嫁接胰 島的血管密度顯著更高（分別爲未進行UTMD組：169±36 ; GFP : 227士39 ; VEGF : 649±51 個 /mm2，ρ<0·05)。該等結 果說明，利用UTMD將hVEGF基因傳送至宿主肝臟在進行 胰島移植術後可促進胰島血管重建並改進血糖恢復正常的 狀況。 人類姨島：在透過本地器官勘募組織（local Organ Procurement Organizations)(Southwest Transplant Alliance, 153800.doc -12- 201139673

Dallas，TX，LifeGift，Fort Worth，TX)獲得研究同意書之 後，自多個死亡之多器官供體獲得7個供體胰臟。Baylor 地區移植研究中心（Baylor Regional Transplant Institute Surgeons)採用標準外科手術技術獲得騰臟[12]。採用腺管 注射 ΕΤ-KYOTO 溶液法（Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.，Naruto，Japan)，及隨後之兩層法（two-layer method) 保存胰臟，直至進行胰島分離製程[12]。採用經修改 Ricordi方法分離出胰島[13]。供體及分離物之變數如下： 供體年齡 35.1± 5.6(歲），性別 M/F=2/5，BMI 28.0 土 1.5，缺 氧時間（Cold ischemic time)171±21(分鐘），純度 77士5(%) ’ 生存率97±1(%)，刺激指數10.4±3.4。將經分離胰島隔夜保 存在 4°C 含有 10% 胎牛血清（FBS ; Atlanta Biologicals， Lawrenceville，USA)之補充有 CMRL 之培養基（Cellgro, Manassas, USA)中。以手挑選方式挑選共計約500個姨島 類似尺寸之胰島（約200 μηι)用於移植術。本發明者初步研 究結果顯示，在移植500個胰島後，10至20%小鼠會恢復 正常血糖。因此，判定該數目是最低限度的數值。 質體構築體：依如下方法，製得可在經強化CMV啟動子 控制下表現hVEGF165基因之質體（pCI-hVEGF):如先前技 術所述獲得hVEGF;(i5之cDNA[9]，相關部分及序列已以引 用的方式併入文中。簡言之，使用如下含有限制酶切位點 之PCR引子，進行健康志願者血液PCR擴增作用，可獲得 hVEGFM5的全長CDNA(限制酶切位點經劃底線）：引子 l(XhoI)5'- 153800.doc 13- 201139673 TTCCTCGAGAATGAACTTTCTGCTGCTGTCTTG-3'(SEQ. ID NO : 1);引子 2(SmaI)5’-AAACCCGGGTCACCGCCT CGGCTTGTCA-3，（SEQ. ID NO : 2)。利用 Xhol及 Smal酶解 該DNA，隨後連接至pCI哺乳動物表現載體（Promega)對應 位點。該質體經定序，確認不存在人工突變。使用在經強 化CMV啟動子控制下編碼綠色螢光蛋白（GFP)基因之質體 (PCS2-GFP)作為對照。 製造含質體之脂質穩定性微泡：如本發明者於先前技術 中所述之方法製得經脂質穩定性微泡[10]。簡言之，取共 計200 μΐ DPPC(1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼， Sigma, St Louis，USA，2.5 mg/ml)及 DPPE(1，2-二棕櫚醯基-sn甘油-3-石粦脂醯乙醇胺，Sigma，0·5 mg/ml)溶液、5 μΐ 10% 人類白蛋白及50 μΐ純甘油添加至1.5 ml小玻璃瓶中（其含有 溶解於50 μΐ脂質轉染胺2_(11^^1"〇呂611)中之2 mg質體）’並 充分混合，且於室溫下培養1 〇分鐘，其餘頂空填充八氟丙 烧氣體（Air Products, Inc” Allentown，USA)’ 隨後藉由牙 科用和汞器（VialmixTM，Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, N. Billerica，MA, USA)進行機械振盪 30秒。利用 粒子計（Beckman Coulter Multisizer III, Fullerton, CA, US A)測定微泡之平均直徑及濃度。以0.3 ml填酸鹽緩衝溶 液（PBS)稀釋含有約50 pg質體之10 μΐ微泡溶液’隨後立即 注射至各小鼠。 動物協議及UTMD :根據美國國家衛生研究院（National Institute of Health(NIH)建議及經實驗動物管理及使用委員 153800.doc -14- 201139673 會核准（the institutional animal care and use committee)進 行動物研究。將鏈脲佐菌素（STZ，150 mg/kg)以腹膜内注 射方式投與至雄裸鼠（8-13週齡，Harlan, Houston, USA)。 小鼠接連2次所測血_糖值均2350 mg/ml認定為罹患糖尿 病。移植前之糖尿病病狀在三組之間並無差異（糖尿病持 續期：4±1天，移植前血糖濃度：442±10 mg/dl)。藉由經 腹膜内注射***（100 mg/kg)及曱笨嘆嗪（1〇 mg/kg)麻醉 小鼠。經位於下腹部之小的中線切口拉出迴盲靜脈（肝門 靜脈之分支），使得在上腹部上可放置超音波探針（圖1A及 1B)。***27G蝴蝶針（wing needle)，並利用止血夾固定 (圖1A)。在該研究中，26隻小鼠接受下列三種處理法中之 一種：1.僅移植人類胰島，不進行UTMD(未進行UTMD 組，n=8) ; 2.移植人類胰島，並利用編碼基因之質體 進行UTMD(GFP，n=7) ; 3.移植人類胰島，並利用編碼 hVEGFMJ之質體進行 UTMD(VEGF，n=ll)。 將以手挑選方式所挑選之人類胰島經由迴盲靜脈移植至 每一小鼠的肝臟中（n=500)。隨後，將各小鼠隨機分成3 組。藉由幫浦（Genie, Kent Scientific，Torrington, CT, USA)，經由迴盲靜脈，為GFP組及VEGF組輸注含有質體 之微泡60至90秒。在輸注期間，利用市售之超音波探頭 (S3，Sonos 5500，Philips Ultrasound, Bothell, WA, USA)對 肝臟導入超音波。隨後依超諧波模式（發送1.3 MHz/接收 3_6 MHz)施加機器指數為1.4之超音波。藉由心電圖，採用 在出現R波波峰後延遲85 ms，每隔四個心縮期引發四次超 I53800.doc •15· 201139673 音波脈衝。已顯示該等設置對於藉由採用本發明特定裝置 進行UTMD的質體傳送法較佳[9-11]。在所有小鼠中均可 見微泡破裂現象（圖1C及1D)。在輸注之後，讓動物甦醒。 爲研究UTMD之效力，針對上述未經移植胰島之正常裸鼠 進行UTMD。處理後1至28天處死該等小鼠，並利用ELISA 套組（ALPCO Diagnostics，NH, USA)測定血清中人類 VEGF 濃度。於第3天，採集肝臟、胰臟、脾臟、腎臟、胃、肺 及心臟，並藉由RT-PCR評估基因表現。 爲評定該等經移植胰島中hVEGF表現的程度及面積，本 發明者經由肝門靜脈將胰島移植至正常裸鼠，隨後利用 hVEGF質體進行UTMD。處理3天之後，採集肝臟，並進 行免疫組織化學檢查。 UTMD對肝臟之影響：爲評估hVEGF之肝臟毒性及不想 要的作用（諸如肝臟血管新生過度及肝臟生長失控），如上 所述，經由肝門靜脈，利用hVEGF質體進行UTMD。在進 行UTMD之後之不同時間點採集血液。藉由酶分析套組 (Thermo Scientific, MA, USA)，分析樣本中是否存在丙胺 酸胺基轉移酶（ALT)及天冬胺酸胺基轉移酶（AST)。藉由 HE染色法，對經福馬林固定之於進行UTMD之後第2、7、 30天分離出之肝臟切片進行組織學檢查。 評估處理組小鼠：利用血糖濃度試紙（Precision, Abbott, IL, USA)測定各小鼠之非空腹葡萄糖濃度直至移植後30 天。當連著2次血糖濃度測量值均低於200 mg/dl時，則認 定血糖恢復正常。糖尿病復發之定義為：血糖又回復至 153800.doc -16- 201139673 200 mg/dl以上。於第3 1天，進行腹膜内葡萄糖耐受測試 (IPGTT)。禁食整晚之後，經腹膜内注射葡萄糖（2 g/kg)， 注射後120分鐘測定血糖濃度。第32天處死小鼠。稱量所 採集之肝臟的重量，並進行免疫組織化學檢查。採集血 液，並利用ELISA套組（ALPCO Diagnostics)測定人類胰島 素及人類C-肽濃度。 RT-PCR :該等組織樣本冷凍於液態氮並貯存於_80〇C 下。根據製造商之說明書，利用TRIzol(Invitrogen, Carlsbad, USA)製得總RNA，並利用 Superscript III第一股 合成系統（First-Strand Synthesis System)(Invtrogen)進行反 轉錄作用。於含有 1 μΐ cDNA、10 μΐ HotStarTaq Master Mix(Qiagen)、及10 pmol下列一種引子之20 μΐ液體中進行 PCR : GAPDH(人類及小鼠）：5，-CCCTTCATTGACCTCAA CTACATG-3'(正向）（SEQ. ID NO ： 3) ； 5'-TTCCATTGAT GACAAGCTTCCC-3,（反向）（SEQ. ID NO : 4) ; hVEGF : 5'-AAGGAGGAGGGCAGAATCAT-3'(正向）(SEQ. ID NO : 5) ； S'-ATCTGCATGGTGATGTTGGA-S'C 反向）(SEQ. ID NO ： 6)；小鼠 VEGF : 5，-ACGACAGAAGGAGAGCAG AAGT-3'(正向）（SEQ. ID NO : 7) ; 5’-CATGGTGATGTTG CTCTCTGAC-3，（SEQ. ID NO : 8)。PCR條件包括，於95°C 下變性5分鐘，隨後擴增25至35個循環，隨後於94°C下使 序列變性30秒，黏接引子並進行鏈延伸1分鐘。隨後於2% 瓊脂糖凝膠上分析RT-PCR產物。 免疫組織化學：將所採集組織在4°C下隔夜固定於4% 153800.doc -17- 201139673 聚甲醛中’並於4°C下隔夜平衡於30%蔗糖中以進行低溫 保護。於-80°C下，利用Tissue Tek優化切片溫度（optimal cutting temperature)(OCT)化合物（Sakura Finetek USA， Torrance，CA，USA)對組織進行低溫保護。依l〇 μηι之距離 切割切片，並置於帶正電之顯微鏡載玻片中。利用0.1 % Triton X 100滲透切片3分鐘，並培養於20% Aquablock (East Coast Biologies, North Berwick, MA, USA)中 30分鐘 以進行阻斷。使用針對下列抗原之抗體：豚鼠抗-人類胰 島素（1 : 200，Abeam, Cambridge, MA)、兔抗-姨高血糖素 (1 : 20，Millipore，Billerica, MA, USA)、山羊抗-波形蛋白 (1 · 10, Sigma-Aldrich, St. Louis，MO)、小鼠抗-人類 CD31(1 : 50, BD Biosciences，San Jose，CA)、大鼠抗-小鼠 PECAM-1(1 : 100，BD Biosciences)、及小鼠抗-人類 VEGF (1 : 100，Millipore)。4°c下隔夜培養具有該等第一抗體之 該等切片。利用與螢光素異硫氰酸酯（FITC)、Cy3(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)、Alexa-fluor-488、及 Alexa-fluor-568(Invitrogen)偶聯之適宜第二 抗體使抗原顯形。依製造商建議之濃度使用第二抗體。隨 後，對切片添加4’，6-二甲脒基-2-苯基吲哚（DAPI)，以進行 核染色。該研究中’針對人類CD3 1及小鼠PEC AM-1之第 二抗體係經相同螢光素標記。於螢光顯微鏡中可見胰島’ 並利用 MetaMorph 軟體（Molecular Devices，Sunnyvale，CA) 分析圖像。依先前技術中所述之方法測定於處理後32天之 宿主肝臟（左葉）的胰島素陽性β細胞質量[14]。 153800.doc •18- 201139673 毛細血管密度測定：藉由免疫組織化學法所顯現之胰島 内CD3 1陽性血管被認定為毛細血管。利用螢光顯微鏡， 於200倍放大倍率下計數毛細血管。每一小鼠拍攝至少兩 張宿主肝臟中胰島素陽性嫁接胰島之顯微鏡圖像，每組共 計有30張以上之胰島圖像。利用ImageJ軟體（National Institutes of Health, Bethesda，USA)測量各胰島之面積。 評估分離前之人類胰島以作為對照。毛細血管密度係以每 mm2中所含數目表示。計讀毛細血·管密度之研究者對於治 療組別係無從得知的。利用類似步驟測定小鼠肝臟之血管 密度。 VEGF對内源性胰臟之影響：爲研究循環的hVEGF對於 内源性胰臟之影響，利用hVEGF質體對經STZ誘發之糖尿 病小鼠肝臟進行UTMD。使用正常小鼠及經STZ誘發之糖 尿病小鼠作為對照。測量20天之非空腹狀態下血糖濃度。 進行UTMD後第20天，採集各組之胰臟，並以免疫組織化 學分析胰島素（β細胞）及CD31(毛細血管）。如先前技術中 所述方法測定内源性胰臟中胰島素陽性β細胞質量[14]。如 上文所述測定胰島之血管密度。 統計學分析：數據以平均值±平均值之標準差（SEM)表 示。根據司圖登特t-檢定（Student's t-test)，藉由ANOVA確 定三組間差異之統計學顯著性，並經邦弗朗尼校正法 (Bonferroni correction)校正。藉由杜凯真實顯著性差異 (Tukey Honestly Significant Difference，HSD)分析三組間 比例之差異性。 153800.doc -19- 201139673 UTMD對經由肝門靜脈將基因傳送至肝臟之影響：利用 pCI-hVEGF及pCS2-GFP質體，對經由肝門靜脈注射微泡之 小鼠肝臟進行UTMD。於第3天，檢測到肝臟中hVEGF或 GFP表現量（圖2)。根據免疫組織化學分析，hVEGF在肝門 靜脈附近會強烈地表現，但該表現在肝臟中則會不均勻式 地分布（圖2A-2C)，而未經處理之肝臟則不表現hVEGF(圖 2D)。於經誘導GFP之小鼠肝臟中檢測到GFP表現（圖2E)。 RT-PCR分析顯示，在正常小鼠肝臟中會表現小鼠 VEGF(mVEGF);然而並不表現hVEGF。另一方面，於經 誘導hVEGF之小鼠中，明顯地檢測到hVEGF表現（圖2F)。 UTMD後血清中hVEGF濃度：本發明者利用pCI-hVEGF 之活體外之初步研究證實，hVEGF蛋白質可自經轉染細胞 分泌至培養基中（數據未顯示）。吾人遂評估經UTMD處理 之小鼠血液中之hVEGF濃度。進行UTMD後之14天内均測 得hVEGF，雖然含量較低（圖2G)。此可能係由於血液之稀 釋及分解效應。 基因傳送之器官特異性：經由肝門靜脈進行UTMD之後 3天，採集小鼠多種器官，並藉由RT-PCR檢查各器官中 hVEGF表現。hVEGF在肝臟中會強力地表現，而其他器官 則未顯示表現（圖2H)。右腎稍微表現hVEGF，此可能係因 為其在解剖學上靠近肝臟，因此其暴露在超音波中。 UTMD及hVEGF對肝臟之影響：檢查因UTMD所導致對 小鼠肝臟之毒性。進行UTMD之後，測定血清中ALT及 AST濃度。UTMD後第1天，ALT及AST濃度均會稍微增 153800.doc -20- 201139673 加，且隨後快速地降至正常濃度（圖3 A)。該等數據說明， 毒性輕微且短暫。爲進一步測定進行UTMD之後，肝臟受 損程度，進行UTMD後第2、7、30天對肝臟進行組織學檢 查。雖然於第2天觀察到肝臟細胞架構已極輕微擾亂，但 大部份肝實質細胞並未顯示出顯著之組織學異常（圖3B)。 爲檢查局部表現之hVEGF是否會增加肝臟中血管或導致 失控之血管新生及肝臟生長，因而測定肝臟之企管密度及 肝臟（左葉）重量。在三組之間並無顯著差異（未進行UTMD 組、GFP組及VEGF組，圖3C及3D)。 循環的hVEGF對内源性胰臟之影響：如圖2所示，經 UTMD後，胰臟令並無hVEGF表現，但在血清中卻檢測到 hVEGF，本發明者遂研究此低量hVEGF是否會影響内源性 胰臟β細胞及胰島血管系統。以經STZ誘發之糖尿病小鼠而 言，將hVEGF基因傳送至肝臟並不會影響血糖濃度（圖 3E)、胰島中之内源性β細胞質量及血管密度（圖3F-3H)。 經嫁接胰島内及其周圍之hVEGF表現：於本發明方法， 透過相同途徑（肝門靜脈），先後進行胰島移植術及藉由 UTMD進行基因傳送。因此，咸預期該經誘導基因能夠高 效地傳送至經嫁接胰島及其周圍組織中。利用免疫組織化 學方法，hVEGF是在胰島之周邊及周圍組織中被測得，但 卻未在胰島中心檢測到，證實該外源性血管生成基因已成 功地轉染並表現（圖4)。此外，極少量之胰島素陽性β細胞 會加倍表現hVEGF(圖4Α)。一些騰高血糖素陽性細胞會與 hVEGF共同表現（圖4B)，而存在許多對hVEGF及波形蛋白 153800.doc -21 - 201139673 (Vimentin)呈雙陽性之細胞（圖4C)。該等數據說明， hVEGF基因主要係由間葉細胞表現。 經誘發hVEGF對移植後胰島功能的影響：hVEGF對於移 植後胰島之功能的影響是以每日血糖值、第32天之人類胰 島素及C-肽濃度加以測定。移植後第7天，11隻hVEGF組 小鼠中有9隻（82%)會恢復正常血糖，而8隻未進行UTMD 組中有3隻（3 8%)及7隻GFP組中有4隻（57%)會恢復正常血 糖。然而，未進行UTMD組及GFP組中的大多數小鼠的血 糖濃度則顯示會逐漸增加，並30天過後會復發糖尿病（圖 5)。總言之，於第30天，11隻hVEGF組小鼠中有8隻（73%) 恒久性地恢復至正常血糖，而8隻對照組中有1隻（13%)及7 隻GFP組中有1隻（14%)恢復至正常血糖（圖5A至5D)。 VEGF組在第30天時之血糖正常率顯著高於未進行UTMD 組（表 1，p<0.05)。Kaplan-Meier評估顯示，VEGF組之移 植物存活顯著高於其他兩組（圖5E，未進行UTMD組對 UTMD、及GFP對UTMD之p<0.05)。hVEGF組之平均血清 人類胰島素濃度及C-肽濃度顯著高於未進行UTMD組（圖 6 :胰島素=未進行 UTMD 組：16·6±7·6 pmol/1，GFP 組： 37.0±16.5卩〇1〇1/1，¥£0?組：108.9士26.4?111〇1/卜未進行 UTMD組對VEGF組之p=0.0 13 : C-肽=未進行UTMD組： 68.4士37.5 pmol/1，GFP組：115·3±58.4 pmol/1，VEGF組： 791.5士230.5 pmol/1，未進行 UTMD 組對 VEGF 組之 p=0.022) ° 葡萄糖耐受測試：爲進一步界定經移植胰島之功能，經 153800.doc -22- 201139673 移植後第31天進行IPGTT。未進行UTMD組及GFP組之2小 時血糖濃度均高於200 mg/dl，而VEGF組則顯示具有正常 的圖形（圖5F)。 表1 :三組經處理後3 0天時之血糖正常率。藉由杜凯 HSD分析三組間之差異。 未進行 UTMD 組 GFP組 VEGF 組 進行移植 8 7 11 血醣恢復正常 1 1 8 % 12.5a 14.3 Ί2.Τ :未進行UTMD組對VEGF組之p<0.05

胰島内血管生成作用及β細胞質量：經處理後32天，藉 由免疫組織化學分析評估經移植胰島之毛細血管密度（圖 7Α至7Ε)。利用抗胰島素抗體使胰島現形，且利用抗人類 CD3 1及抗小鼠PECAM-1抗體使胰島内之血管染色，此係 由於據Brissova等人報導，胰島内内皮細胞及宿主内皮細 胞可促成經移植胰島之血管重建[15]。於經hVEGF處理之 小鼠中，毛細血管密度顯著高於兩個對照組（圖7E :分別 爲未進行 UTMD 組：169±36 ; GFP 組：227士39 ; VEGF : 649±5 1個/mm2。未進行UTMD組對VEGF組及GFP組對 VEGF組之p<0.0001)。hVEGF組之jk管密度較之未進行 UTMD組者顯著增加，但仍顯著低於天然之人類胰臟中之 153800.doc •23- 201139673 胰島（原始胰島；1215±86個/mm2， VEGF組對原始胰島之 ρ<0·00001)。經處理後第32天，VEGF組之肝臟左葉之p細 胞質量顯著尚於其他組（圖7F :分別爲未進行UTMD組： 0.11 士0.01 ; GFP 組：0.13±0.02，VEGF 組：0.26土0.02。未 進行UTMD組對VEGF組及GFP組對VEGF組之ρ<0.005)。 血管重建作用對於改善經移植胰島之存活而言是非常重 要的[16-1 9]。據報導’胰臟胰島產生VEGF對於胰島之血 管重建及功能而言是重要的[20]。爲了促使經移植胰島的 重建血管，本發明者已檢查於活體外對胰島導入可編碼 hVEGF之腺病毒載體，結果證實其使得血管重建，並改善 胰島的存活[3, 21-23]。然而，病毒性基因療法係與嚴重之 田1J作用相關[7, 8]。以水動力學為基礎傳送裸露pDNA顯示 具有治療的效果[22] ’不過其步驟在臨床上並不適用。咸 已顯示，不採用水動力學壓力而僅是簡單注射pDNA是沒 有效果的[24]。剛開始時，本發明者測試在不使用微泡及 超音波下’經由肝門靜脈輸注裸露hVEGF質體，因為該種 方法最簡單。然而，並沒有在肝臟中檢測到基因表現（數 據未顯示）。隨後’本發明者檢查本發明UTMD方法，顯示 該方法具有高度效果，且無明顯的不良生物效應[911, 25_ 28] 〇 本發明研究中，本發明者是採用臨床有關的肝門靜脈胰 島移植模式。更進一步，本發明者在輸注胰島之後，經由 肝門靜脈連續注射含有pDNA之微泡。經肝門靜脈内注射 微泡具有若干優點。首先，本發明者能夠直接將高濃度之 15380〇.doc -24- 201139673 pDNA傳送至肝臟，而經靜脈内注射效力較低，且經肝職 内傳送效力更低[2 9]。第二，該方法能夠實現對經嫁接胰 島及周圍組織進行高效基因傳送。顯然，較之僅對胰島進 仃基因傳送，本方法能夠增加總基因表現量，且此係 • UTMD優於活體外基因傳送方法之另一優點。為此，本發 明者使用CMV啟動子而非大鼠胰島素啟動子，CMV啟動 子顯示藉由UTMD可高效且特異性地直接將基因傳送至胰 λ 島。 ❹ 該等結果證實，可將hVEGF基因以非侵入性方式靶向性 傳送至肝臟及經移植胰島，且可改變胰島内之微血管。值 得注意地，本發明首次證實，以非侵入性方式將轉殖基因 傳送至佰主肝臟具有治療效力，且可在生物學上改變經嫁 接胰島之血管重建。即使UMTD是一種非侵入性之方法， 但此方法仍可能會對肝臟造成傷害。爲了評估對肝臟所造 成的傷害，吾人在進行UMTD之後，檢查轉胺酶濃度並組 Ο 織學檢查肝臟。該等檢查顯示UMTD對於肝臟的副作用很 小。 經嫁接胰島中所增加的微血管很可能會促成胰島移植術 效力的改善。然而，考慮到經嫁接胰島衰竭之時間過程及 VEGF表現量及血管重建程度，可能存在另一種有關vegf 對於改善移植作用效應之機轉。本發明研究中，在經移植 胰島中之毛細血管密度會於經hVEGF質體基因傳送32天後 增加。不過，經誘發hVEGF蛋白質在經處理小鼠14天後之 血液及10天後之肝臟就可檢測到。本發明者先前已報導， 153800.doc -25- 201139673 藉由UTMD將hVEGF傳送至大鼠心臟，可增加毛細血管密 度’但在第30天時則觀察到毛細血管密度又降低至基線 值，此可能係由於質體表現之瞬時性質[9]。由於向上調節 VEGF表現里會導致騰島中血管異常及血管瘤[3〇]，因此本 發明方法瞬時表現hVEGF可提供另一優點。 藉由超音波使微泡破裂會導致空泡化、熱效應、微流效 應、產生游離基及破壞毛細血管[3卜叫，#此可能會活化 内皮細胞或其他細胞。事實上’儘管本發明者的數據顯示 在進行UTMD之後’肝臟功能僅出現極輕度的異常，但在 GFP組及hVEGF組中均觀察到輕微發炎及肝臟細胞架構瓦 解（未顯示數據）。姨島移植術本身會導致嚴重發炎作用； 因此，本發明研究令，微泡破裂所可能產生之有害生物效 應似乎會被基因療法之治療效力抵消。爲了預防與胰島移 植術相關之發炎’組合使用hVEGF及抗發炎基因或藥物 可能適用[35]。 根據本發明方法，藉由UTMD將hVEGF基因傳送至經移 植後騰島及宿主肝臟，可使得該嫁接胰島之血管密度增加 並改善移植物的功能。藉由UTMD傳送基因可安全且有效 改善騰島移植術。 ^認為本說明書中所論述之任—實施例可藉由本發明之 任一方法、套組、試劑或組合物實現，反之亦然。更進— 步，本發明組合物可用於實現本發明之方法。 可理解’文中所述之特定實施例係以闡述之方式說明， 而並不限制本發明。可在不脫離本發明範圍下，在多項實 153800.doc -26 - 201139673 施例中使用本發明之主要特徵。彼等熟習此項技術者咸瞭 解，月b夠確疋，在文中所述之特定步驟中使用常規實驗、 數量當量。認為該等當量屬於本發明之範圍内，且包括在 專利申請範圍中。 ★ #說a日中所提及之所有公開案及專利中請案可指導彼 等…、驾本么a月所涉及領域之技術的技術者之技術水平。所 >有公開案及專利中請書係以引用的方式併人文中，且程度 〇 纟好像各A開案或專利巾請書特定且個別地以引用的方式 併入一般。 「在專利申清範圍及/或說明書中，當字詞「一」與術語 、包括」一起使用時，其可意指「一個」，但其係與「一 或夕個」至J 一個」、及「一個或一個以上」之含意相 一致。在專利申請範圍中，使用術語「或」意指「及/ 或」，除非另外指出僅指替代物或替代物互斥，儘管本揭 示案支持僅指代替代物及指代「及/或」之定義。在本申 0 °月案王文中’術語「約」意指包含用於測定該數值之裝 置、方法之固有誤差、或存在於研究者之間的差異性的數 值。 如本說明書及專利申請範圍中所用，字詞「包括」 (mPrising」）（及其任一形式，諸如「comprise」及 comprises」）、「具有」（「having」）（及其任一形式 haVmg，諸如「have」及「has」）、「包含」（「including」）（及 之任一形式，諸如「includes」及「include」）、「含有」 (〇ntaining」）（及其任一形式’諸如「contains」及 153800.doc •27- 201139673 「contain」）為包含性或開放性，且並不排除其他未敘述 之要素或方法步驟。 如文中所用，術語「或其組合」係指該術語之前所列舉 主體之所有排列組合。例如，「A、B、C、或其組合」意 欲包括下列至少一個：A、B、C、AB、AC、BC、或 ABC，且若在特定内容中順序重要，則亦包括BA、CA、 CB、CBA、BCA、ACB、BAC、或 CAB。沿用該實例，該 種表述方法包括含有一或多個主體或術語之重複之組合， 諸如 BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、 CABABB等。熟習此項技術者咸瞭解，通常對於任一組合 中之主體或術語之數量並無限制，除非已在上下文中表 明。 文中所揭示及主張專利權之所有組合物及/或方法可參 照本揭示案，無須過度實驗即可製得及進行。雖然已以較 佳實施例之形式闡述本發明組合物及方法，但熟習此項技 術者咸瞭解，在不脫離本發明之概念、精神及範圍下，可 改變文中所述步驟中之組合物及/或方法、或步驟之順 序。熟習此項技術者所明瞭之所有該等類似替代及改變認 為係屬於由隨附專利申請範圍所定義之本發明精神、範圍 及概念内。 參照案 美國專利申請案第20080114287號：Ultrasound Microbubble Mediated Genes Delivery System. 美國專利案第 7374390號：GLP-1 Gene Delivery for the 153800.doc -28- 201139673

Treatment of Type 2 Diabetes. 美國專利申請案第20090209630號：Gene Delivery Formulations and Methods for Treatment of Ischemic Conditions. 1. Ryan EA, Paty BW, Senior PA 等人（2005)Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes 54:2060-2069 ^ 2. Berney T, Ricordi C(2000)Islet cell transplantation ： the future? Langenbecks Arch Surg 385:373-378 3. Narang AS, Sabek O, Gaber AO, Mahato RI(2006)C〇-expression of VEGF and IL-lreceptor antagonist improves human islet survival and function. Pharmaceutical Res 23 · 1970-1982 4. Fernandes JR, Duvivier-Kali VF，Keegan M 等人 (2004)Transplantation of islets transduced with CTLA4-Ig 〇 and TGFP using adenovirus and lentivirus vectors.

Transplant Immunology 13 · 191 -200 5. Rehman KK, Bertera S, Trucco M, Gambotto A, Robbins PD(2007)Immunomodulation by adenoviral-mediated SCD40-Ig gene therapy for mouse allogeneic islet transplantation. Transplantation 84 * 301-307 6. Panakanti Rs Mahato RI(2009)Bipartite adenoviral vector encoding hHGF and hIL-IRa for improved human islet transplantation. Pharm Res 26 · 587-596 153800.doc -29- 201139673 7. Hacein-Bey-Abina S, von Kalle C，Schmidt Μ等人 (2003)A serious adverse event after successful gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. N Engl J Med 348 ： 255-256 8. Manno CS，Pierce GF，Arruda VR 等人（2006)Successful transduction of liver in hemophilia by AAV-Factor IX and limitations imposed by the host immune response. Nat Med 12 ： 342-347 9. Korpanty G, Chen S, Shohet RV 等人（2005)Targeting of VEGF-mediated angiogenesis to rat myocardium using ultrasonic destruction of microbubbles. Gene Ther 12 · 1305-1312 10. Chen S, Ding JH, Bekeredjian R(2006)Efficient gene delivery to pancreatic islets with ultrasonic microbubble destruction technology. Proc Natl Acad Sci USA 103 · 8469-8474 11. Chen S, Ding J, Yu C(2007)Reversal of streptozotocin -induced diabetes in rats by gene therapy with betacellulin and pancreatic duodenal homeobox-1. Gene Ther 14 ： 1102- 1110 12. Matsumoto S，Noguchi H, Shimoda M 等人（2009) Seven consecutive successful clinical islet isolations with pancreatic ductal injection. Cell Transplant in press 13. Matsumoto S, Okitsu T, Iwanaga Y 等人（2006) 153800.doc -30- 201139673

Successful islet transplantation from non-heart-beating donor pancreata using modified Ricordi islet isolation method. Transplantation 82 · 460-465 14. Montana E, Bonner-Weir S, Weir GC(1993)Beta cell mass and growth after syngeneic islet cell transplantation in normal and streptozocin diabetic C57BL/6 mice. J Clin Invest 91 ： 780-787

15. Brissova M, Fowler M, Wiebe P(2004)Intraislet endothelial cells contribute to revascularization of transplanted pancreatic islets. Diabetes 53 : 1318-1325 16. Narang AS, Mahato RI(2006)Biological and biomaterial approaches for improved islet transplantation. Pharmacol Rev 58 · 194-243 17. Jones GL, Juszczak MT, Hughes SJ, Kooner P, Powis SH, Press M(2007)Time course and quantification of G pancreatic islet revascularization following intraportal transplantation. Cell Transplant 16 * 505-516 18. Menger MD ； Vajkoczy P, Beger C, Messmer K(1994)

Orientation of microvascular blood flow in pancreatic islet isografts. J Clin Invest 93 · 2280-2285 19. Vajkoczy P, Olofsson AM, Lehr HA(1995) Histogenesis and ultrastructure of pancreatic islet graft microvasculature. Evidence for graft revascularization by endothelial cells of host origin. Am J Pathol 146 · 1397-1405 153800.doc -31 - 201139673 20. Brissova M, Shostak A, Shiota M(2006)Pancreatic islet production of vascular endothelial growth factor-A is essential for islet vascularization, revascularization, and function. Diabetes 55 '· 2974-2985 21. Narang AS, Cheng K, Henry J(2004)Vascular endothelial growth factor gene delivery for revascularization in transplanted human islets. Pharm Res 2 1 : 15-25 22. Cheng K, Fraga D, Zhang C(2004)Adenovirus-based vascular endothelial growth factor gene delivery to human pancreatic islets· Gene Ther 11 : 1105-1116. 23. Zhang N, Richter A, Suriawinata J(2004)Elevated vascular endothelial growth factor production in islets improves islet graft vascularization. Diabetes 53 · 963-970 24. Miao CH, Thompson AR, Loeb K, Ye X(2001)Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo. Mol Ther 3 : 947-957 25. Bekeredjian R, Chen S, Pan W, Grayburn PA, Shohet RV(2004)Effects of ultrasound-targeted microbubble destruction on cardiac gene expression. Ultrasound Med Biol 30 ： 539-543 26. Bekeredjian R, Chen S, Frenkel PA, Grayburn PA, Shohet RV(2003)Ultrasound-targeted microbubble destruction can repeatedly direct highly specific plasmid expression to I53800.doc -32- 201139673 the heart. Circulation 108 ·' 1022-1026 27. Chen S, Shohet RV, Bekeredjian R, Frenkel P, Grayburn PA(2003)Optimization of ultrasound parameters for cardiac gene delivery of adenoviral or plasmid deoxyribonucleic acid by ultrasound-targeted microbubble destruction. J Am Coll Cardiol 42 ' 301-308 28. Chen S, Kroll MH, Shohet RV, Frenkel P, Mayer SA, ❹ Grayburn PA(2002)Bio effects of myocardial contrast microbubble destruction by echocardiography. Echocardiography 19 ： 495-500 29. Shen ZP, Brayman AA, Chen L, Miao CH(2008) Ultrasound with microbubbles enhances gene expression of plasmid DNA in the liver via intraportal delivery. Gene Ther 15 ： 1147-1155 30. Ozawa CR, Banfi A, Glazer NL(2004) 〇 Microenvironmental VEGF concentration, not total dose, determines a threshold between normal and aberrant angiogenesis. J Clin Invest 113 · 516-527 31. Miller DL, Gies RA(1998)The interaction of ultrasonic heating and cavitation in vascular bioeffects on mouse intestine. Ultrasound Med Biol 24 : 123-128 32. Wu J, Ross JP, Chiu JF(2002)Reparable sonoporation generated by microstreaming. J Acoust Soc Am 111 · 1460-4 33. Kondo T, Misik V，Riesz P(1998)Effect of gas- 153800.doc -33- 201139673 containing microspheres and echo contrast agents on free radical formation by ultrasound. Free Radic Biol Med 25 ： 605-612 34. Skyba DM, Price RJ, Linka AZ, Skalak TC, Kaul S( 1998)Direct in vivo visualization of intravascular destruction of microbubbles by ultrasound and its local effects on tissue. Circulation 98 : 290-293 35. Panakanti R, Mahato RI(2009)Bipartite vector encoding hVEGF and hIL-IRa for ex vivo transduction into human islets. Mol Pharm 6 : 274-284 【圖式簡單說明】 圖1A-1D說明，經迴盲靜脈對小鼠肝臟進行UTMD : (1A)輸注至測試小鼠102的迴盲靜脈。104 :迴盲靜脈； 106 :止血夾；108 : 27G蝴蝶針；（1B)UTMD之裝置。將 超音波探針置於上腹部。110 ··探針；（1C-1D)超音波圖 像，（1C)無微泡之小鼠肝臟，於低回聲水準下顯示肝臟； (1D)注射微泡之後之小鼠肝臟。在微泡破裂之前偵測到白 色透明影像（White opacification)(左），且在進行破裂之後 消失（右）， 圖2A-2H顯示經UTMD傳送之hVEGF基因。在利用 hVEGF或GFP質體進行UTMD之後，移除小鼠肝臟，並經 免疫組織化學及RT-PCR檢查。（2A至2E)對小鼠肝臟進行 免疫組織化學分析。（2A)在利用hVEGF進行UTMD之後3 天，（2B)10天，及（2C)14天。於圖2A及2B中，檢測到已表 153800.doc -34· 201139673 現hVEGF，尤其係於肝門靜脈附近處。於圖2C中，hVEGF 表現量極低，（2D)作為對照之正常小鼠肝臟，其中未表現 hVEGF，（2E)由GFP誘發之小鼠。檢測到已表現GFP。P : 肝門靜脈，綠色：（2A至2D)VEGF或（2E)GFP，藍色： ' DAPI。放大倍數：χΙΟΟ。比例尺：100 μπι，（2F)hVEGF- UTMD小鼠肝臟之RT-PCR結果。於UTMD處理組（第1至3 組）中，大量表現hVEGF，而在未經轉染之對照組（第4組） 0 中則未檢測到hVEGF表現。所有小鼠均表現内源性（小 鼠）VEGF。使用GAPDH作為標準。mVEGF :小鼠VEGF， (2G)經UTMD處理之小鼠的血清中之hVEGF濃度。檢測 hVEGF量直至進行UTMD後14天。ND :未測得， (2H)hVEGF表現之器官特異性。在利用hVEGF質體進行 UTMD之後三天收集各種器官，並藉由ΡΤ-PCR檢查hVEGF 表現。於肝臟中檢測到高hVEGF表現量，而在其他器官中 幾乎不表現。於右腎中觀察到少量表現，此係因為該器官 〇 在解剖學上暴露於超音波中； 圖3A至3D UTMD及hVEGF對肝臟之影響：（3 A)進行 UTMD之後之血清中之AST(實線）及ALT(虛線）濃度。箭頭 符號：進行UTMD處理之時間點，（3B)經UTMD之後之對 肝臟之組織學分析（HE染色）。原始放大倍數：XI〇〇，（3C) 於處理之後32天之肝臟血管密度。三組之間不存在顯著差 異，（3D)於進行UTMD之後32天，肝臟左葉重量對體重之 比例。三組之間不存在顯著差異； 圖3E-3H : hVEGF對自身胰臟之影響：藉由UTMD，將 153800.doc -35· 201139673 hVEGF基因傳送至經STZ誘發糖尿病之小鼠的肝臟 (STZ+VEGF組）。將該等小鼠與未經處理之小鼠（正常組）及 經STZ誘發糖尿病之小鼠（STZ組）進行比較：（3E)STZ(虛 線）及STZ+VEGF(實線）組在經處理之後未出現空腹血糖濃 度濃度。箭頭符號：進行UTMD處理之時間點’（3F)於 χΙΟΟ下，經胰島素、CD31及DAPI染色之代表性胰臟切 片。比例尺：100 μιη ’（3G)在經處理之後20天之胰臟中之 β細胞質量，（3Η)在經處理之後2〇天之胰島血管密度。 VEGF並未影響β細胞質量及血管密度。星號·· Ρ<0·01 ° NS :不顯著； 圖4Α至4C顯示在移植胰島並進行UTMD之後，於經移植 胰島及周圍組織中所表現之hVEGF。在移植人類騰島並利 用hVEGF進行UTMD之後三天，對小鼠肝臟進行免疫組織 化學分析。主要於騰島表面及外部以及周圍組織中檢測到 已表現hVEGF : (4A)綠色：hVEGF，紅色：人類姨島素’ (4B)人類姨高如糖素，（4C)波形蛋白’藍色·· DAPI。放大 倍數：χ200，白線··所移植胰島之邊界，P :肝門靜脈管 腔。比例尺：100 ; 圖5A至5D顯示三組之血糖濃度：將500個人類胰島移植 至經STZ誘導糠尿病之裸小鼠之肝臟中。隨後利用GFP (5B : GFP 組，n=7)或 hVEGF(5C : VEGF 組 ’ n=ll)質體進 行UTMD。於未進行UTMD組（5A : n=8)中未進行UTMD， (5D)三組之平均血糖濃度。虛線：未進行UTMD組’點 線：GFP組，實線·· VEGF組。preTX :預處理； 153800.doc -36- 201139673 圖5E及5F顯示關於三組之移植物存活率之Kaplan-Meyer 圖。將第7天設定為基線，並經對數級檢定（log-rank test) 測定存活率曲線之p值。（5E)UTMD組與VEGF組之間並無 顯著差異（p<〇.〇5)，且GFP組與VEGF組之間並無顯著差異 (p<0.05)，（5F)於處理後31天之三組之IPGTT。虛線：未進 • 行UTMD組，點線：GFP組，實線：VEGF組； 圖6A及6B顯示三組之（6A)血清中之人類胰島素濃度， 0 及（6B)C-肽濃度。於處理後32天，自各鼠採集血液。星 號：p<0.025 ;及 圖7A至7F顯示於處理後32天，所移植胰島之血管重建 狀況及β細胞質量。圖7A-7D :於x200下，經人類胰島 素、CD31及DAPI染色之代表性切片。分別爲（7Α)未進行 UTMD組，（7B)GFP組，（7C)VEGF組。於VEGF組之所移植 胰島中檢測到一些血管，（7D)作為對照之胰臟中之正常人 類胰島。紅色：人類胰島素；綠色：CD31 ;藍色： 〇 DAPI ;箭頭符號··胰島中之血管，（7E)所移植胰島之血管 密度。顯示處理後10天及32天之三組之血管密度的平均 .值。使用原始人類胰島作為對照。於第32天，VEGF組之 血管密度顯著高於未進行UTMD組及GFP組；但顯著低於 原始胰島，（7F)於處理之後32天時，肝臟左葉之β細胞質 量星號：ρ<〇.〇1。雙星號：Ρ<〇.〇〇5。 【主要元件符號說明】 102 測試小鼠 104 迴盲靜脈 153800.doc •37· 201139673 106 108 110 止金爽 27G蝴蝶針 探針 153800.doc -38 201139673 序列表 <110> 美商貝勒研究協會 <120> 胰島移植後之活體內非病毒性人類血管内皮生長因子基因傳送 <130> BHCS:2430 <140> 100103150 <141> 2011-01-27 <150> <151> 61/298,824 2010-01-27 O <160> <170> 8 Patentln version 3.5 <210> <211> 1 33 <212> <213> DNA 人工序列 <220> <223> <400> 合成性寡核苷酸 1 ttcctcgaga atgaactttc tgctgctgtc ttg 3 3 〇 <210> 2 <211> 28 <212> - <213> DNA 人工序列 <220> <223> 合成性寡核苷酸 <400> 2 aaacccgggt caccgcctcg gcttgtca 28 <210> 3 <21 1> 24 153800·序列表.doc 201139673 <212> <213> DNA 人工序列 <220> <223> 合成性寡核苷酸 <400> 3 cccttcattg acctcaacta catg 24 <210> 4 <21 1> 22 <212> <213> DNA 人工序列 <220> <223> 合成性寡核苷酸 <400> 4 ttccattgat gacaagcttc cc 22 <210> 5 <211> 20 <212> <213> DNA 人工序列 <220> <223> 合成性寡核苷酸 <400> 5 aaggaggagg gcagaatcat 20 <210> 6 <21 1> 20 <212> <213> DNA 人工序列 <220> <223> 合成性寡核苷酸 <400> 6 atctgcatgg tgatgttgga 20 -2- 153800-序列表.doc 201139673 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 合成性寡核苷酸 <400> 7 acgacagaag gagagcagaa gt

<210> 8 <21 1> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 合成性寡核苷酸 <400> 8 catggtgatg ttgctctctg ac

153800·序列表.doc

Claims (1)

1. 201139673 七 、申請專利範圍： 1. 一種用以在一或多個肝臟細胞、肝臟或經移植至肝臟中 之胰島細胞中進行經超音波靶向之微泡破裂法 (ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD)之 組合物，其包括： 一或多種已預組之脂質體質體DNA(pDNA)微泡複合 體，其中該微泡包含已囊封氣體及含有與人類血管内皮 Ο 生長因子（hVEGF)以操作方式連接的組成性啟動子序列 或誘導性啟動子序列的pDNA之脂質外殼，其中藉由超 音波使含於一或多個肝臟細胞、肝臟或移植至肝臟中之 胰島細胞中的一或多個微泡破裂，可將pDNA傳送至處 於進行超音波破裂處之該一或多個肝臟細胞、肝臟或經 移植至肝臟之胰島細胞，從而表現hVEGF，其中該組合 物可改善一或多個經移植胰島細胞之效力。 2. G 如請求項1之組合物，其中該脂質外殼包含選自以下組 成之群之一或多種其他生物活性藥劑：裸露DNA、 siRNA、質體、蛋白質、病毒性載體、及藥物。 3. 如請求項1之組合物，其中該氣體為四氟化碳氣體。 4. 如請求項1之組合物，其中該誘導性啟動子包括組織特 異性調節元件。 5. 如請求項1之組合物，其中該胰島移植術的效力係測定 經改善之血管重建、經改善之胰島細胞功能、經增加之 血管密度或其組合。 6. 如請求項1之組合物，其中該hVEGF為重組型hVEGF。 153800.doc 201139673 7. 如請求項1之組合物，其中一或多種藥劑可與該組合物 共同投與，其中該等藥劑係選自由以下組成之群：抗細 胞凋亡藥劑、消炎藥、JNK抑制劑、GLP-1、他克莫司 (tacrolimus)、西羅莫司（sirolimus)、阿那白滯素 (anakinra)、得文聚醯胺（Dervin polyamide)或其組合。 8. —種用以藉由超音波靶向之微泡破裂術（UTMD)使肝臟 或經移植肝臟中經移植胰島細胞再生之組合物，其包 括： 包含可編碼人類血管内皮生長因子（hVEGF)之裸露質 體DNA的微泡，其中該等微泡包含可藉由在肝臟或經移 植肝臟中進行超音波破裂術而釋放出hVEGF之脂質。 9. 如請求項8之組合物，其中該hVEGF為重組型hVEGF。 10. 如請求項8之組合物，其中該hVEGF是在巨大細胞病毒 (CMV)啟動子控制下。 11. 一種微泡組合物之用途，其係用於製備用以在受檢者之 活體内及原位促進一或多個經移植或經嫁接細胞之血管 重建、改善功能、增加血管密度及效力之醫藥物，其中 該微泡組合物包含可編碼人類血管内皮生長因子 (hVEGF)之裸露質體DNA、及藉由在一或多個經移植或 經嫁接細胞中進行超音波破裂術而釋放出hVEGF之脂 質，其中該所釋放出之hVEGF可促進一或多個經移植或 經嫁接細胞之血管重建、改善功能、血管密度及效力。 1 2.如請求項11之用途，其中該一或多個經移植或經嫁接細 胞包括胰島細胞。 153800.doc 201139673 13. 如請求項11之用途 病受檢者或需要一 者0 ，其中該受檢者為健康受檢者、糖尿 或多個經移植或經嫁接細胞之受檢 I4· 一種包含在巨大細胞病毒（CMV)啟動子控制下可表現人 ' 類血管内皮生長因子（hvEGF)基因之質體的裸露質體 • DNA微泡複合體之㈣，其係用於製備用於促進患者肝 臟中一或多個經移植胰島細胞之血管生成、增加:管密 〇 度及效力之醫藥物，其中該醫藥物係意欲注射至該患者 肝臟中，以使該PDNA傳送至肝臟中之該一或多個經移 植胰島細胞；且使該一或多個經移植胰島細胞維持在可 有效表現hVEGF基因之條件下，其中hVEGF的表現可促 進一或多個經移植胰島細胞之血管生成、增加血管密产 及效力。 & 15.如請求項14之用途，其中該醫藥物另外包含—或多種選 自由如下組成之群之藥劑或與該—或多種選自如下組成 〇 之群之藥劑投與：抗細胞〉周亡藥劑、消炎藥、JNK抑制 劑、GLP-1、他克莫司、西羅莫司、阿那白滯素、得文 聚醯胺或其組合。 1 6.如叫求項14之用途，其中該微泡包含已預組之脂質體-裸 露質體DNA(pDNA)複合體》 17.如咕求項14之用途，其中該微泡包含已預組之脂質體_ pDNA複合體’其包含混合質體之丨，2-二棕橺醯基甘 油-3-磷脂醢膽鹼及丨，2_二棕櫚醯基_sn_甘油_3•磷脂醯乙 醇胺甘油。 153800.doc 201139673 1 8 · '一種微泡組合物之^用彳全 ^ /ά. m A,i 之用途，其係用於製備用於治療糖尿病 或促進患者之血糖恢復正常之醫藥物，其中該微泡組合 物包含可編碼人類血管内皮生長因子（hVEGF)之裸露質 體DNA(pDNA)、及藉由在該一或多個經移植騰島細胞中 進订超音波破裂術而釋放出hVEGF的脂質，其中該所釋 放出之hVEGF可促進一或多個經移植胰島細胞之血管重 建、改善功能、血管密度及效力，且其中該治療法包 括： 鑑別出需要治療糖尿病或需要促進也糖恢復正常之患 者； 藉由對患者肝臟輸注一或多個胰島細胞而移植一或多 個胰島細胞，其中該—或多個經移植胰島細胞可產生用 於治療糖尿病或促進血糖恢復正常之胰島素； 對該患者注射該醫藥物；及 藉由該或多個經移植胰島細胞所產生之胰島素治療 糖尿病或促進血糖恢復正常。 19·如請求項18之用途，其申該1^£〇1?為重組型hvEGF。 20. 如請求項18之用途，其中該11¥]6〇1?係在巨大細胞病毒 (CMV)啟動子之控制下。 21. 如吻求項18之用途，其中該醫藥物另外包含一或多種選 自由如下組成之群之藥劑或與該一或多種選自如下組成 之群之藥劑投與：抗細胞凋亡藥劑、消炎藥、JNK抑制 劑、GLP-1、他克莫司、西羅莫司、阿那白滯素、得文 聚醯胺或其組合。 ]53800.doc 201139673 22· —種在身體器官中進行超音波介導之 (UTMD)之組合物，其包含： ' 術 與微泡接觸之已預組之脂㈣·生物活性_複合體， 其中該等生物活性藥劑係選自由以下組成之群：裸 Ο 體DNA(PDNA)、仙财、—或多個質體、蛋白質、病毒 性載體及藥物’其中該已預組之脂質體_生物活性藥劑複 合體可在-或多種啟動子控制下表現基因，其十藉由超 音波使身體器官標靶位置處之微泡破裂，可將該：物活 性藥劑傳送到超音波破裂術之位置處。 23.如請求項22之組合物’其中該一或多個細胞包括經移植 姨島細胞。 24. 如请求項22之組合物，— & , J兵Τ δ亥身體益官包括肝臟、胰 臟、腎臟、肺或心臟。 25. 如請求項22之組合物，其中該身體器官為肝臟。 26. 如請求項22之組合物，其中該生物活性藥劑為pDNA。 Ο 27.如请求項22之組合物，其中該已預組之脂質體-生物活性 藥劑複合體在巨大細胞病毒（CMV)啟動子控制下表現重 . 組型人類血管内皮生長因子（hVEGF)基因。 28. 如請求項22之組合物，其中該已預組之脂質體_核酸複合 體包含陽離子脂質、陰離子脂質或其混合物或組合。 29. 如請求項22之組合物，其中該等微泡係分佈於醫藥上可 接受之載劑中。 3 0.如請求項22之組合物，其中該已預組之脂質體_生物活性 藥劑複合體包含混合質體之丨，2_二棕摘醯基-sn-甘油-3- 153800.doc 201139673 磷脂醯膽鹼及1，2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺 甘油。 3 1 ·如請求項22之組合物，其中該組合物可使該一或多個經 移植胰島細胞促進血管重建、改善功能、增加金管密度 及效力。 32.如請求項22之組合物，其另外包含視需要選用之塗層。 153800.doc