TW200831898A - Treatment of insulin resistance - Google Patents

Description

200831898 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於治療胰島素阻抗之方法，並提 種用以治療胰島素阻抗之化合物。 〃 【先前技術】 r

V 胰島素阻抗（insulin resistance)或葡萄糖耐受不 良(glucose intolerance)之特徵在於身體無法妥善利$胰 島素或血糖之情況。在此一症狀下，正常量的^島素無 法於脂肪細胞、肌肉細胞或肝臟細胞適當產生正&的月^ 島素反應。脂肪細胞的胰島素阻抗會導致儲存的三酸甘 油脂水解，使得血漿中的自由脂肪酸含量升高。肌^細 胞的胰島素阻抗會減低葡萄糖攝取，而肝臟的胰島素阻 抗會減低葡萄糖的儲藏，由於以上兩者作用導致血糖上 升。高血漿胰島素以及高血糖乃是肇因於胰島素阻抗， 通常會產生代謝症狀例如腹部肥胖、動脈粥樣化的血脂 肪不正常（atherogenic dyslipidemia)、血壓上升、血栓形 成前狀態(prothrombotic state)(例如高血漿纖維蛋白原 (fibrinogen )或胞漿素原（piasmin〇gen)活化因子抑制子 I) ’發炎前期狀態（proinflammatory state)(例如血液中 反應蛋白（C_Reactive Protein)上升）。具有代謝症狀 的人產生心血管疾病以及第二型糖尿病的風險會上 升。而具有代謝症狀的人在美國普遍性地增加。因此尋 找有效治療胰島素阻抗成為一種需求。 【發明内容】 本發明係關於治療胰島素阻抗，並確認一用以治療 胰島素阻抗之化合物。 5 200831898 本發明之一方面在於提供一種方法，用以鑑定治療 胰島素阻抗的之化合物。該方法包含將一待測化合物接 觸一表現第三型酸敏感性離子通道蛋白（acid sensing ion channel 3(ASIC3))第一細胞；以及量測細胞中第三型酸 敏感性離子通道蛋白之表現或是活性程度。如果表現或 是活性程度低於一以相同方法處理但未與待測化合物 接觸的第二細胞之表現或活性程度時，表示待測化合物 為治療胰島素阻抗的之候選化合物。第三型酸敏感性離 子通道蛋白的活性可以電物理（electrophysical)分析。第 二型酸敏感性離子通道蛋白的離子通道活性可以全細 胞電流紀錄(whole cell patch recording)，電壓敏感染色 (voltage-sensitive dye)，離子敏感染色（i〇n -sensitve dye )或細胞毒性試驗來決定。上述方法可進一步包含以 候選化合物對非人類動物進行處理，以確認其治療胰島 素阻抗的效果。前述第一細胞或第二細胞可為非神經原 細胞或是AdiproR2-細胞，例如NIH3T3細胞、NIH3T3 L1 細胞、已分化NIH3T3 L1細胞、脂肪細胞（adipose cells) 和纖維母細胞(fibroblast cells)。前述第一或第二細胞可 對於FAS、FGF10 (纖維母細胞生長因子1〇)、ap2(脂肪 酉夂結合蛋白2)、ET0(氧化乙細）、ppARy(peroxisome proliferators-activated receptor γ ;過氧化物酶體增長因 子活化受體）以及 AdipoRl(adiponectin receptor 1 ;脂聯 素受體1)其中之一項或多項有反應。在一實施例當中， 前述第一細胞或第二細胞為脂肪組織細胞，例如白脂肪 組織細胞（white adipose tissue cell) 〇 另一方面，本發明提供一治療胰島素阻抗的方法， 包含確認一具有胰島素阻抗或有發展為胰島素阻抗風 險之對象；抑制該對象之第三型酸敏感性離子通道蛋 白；量測該對象之第三型酸敏感性離子通道蛋白抑制前 6 200831898 或抑制後之表現量以及活性程度；以及與控制組之表現 私度或活性程度比較，以確認抑制。前述之抑制步驟係 對前述對象施予一有效量之多胜肽結合至第三型酸敏 感性離子通道蛋白，或是以一核酸減少第三型酸敏感性 離子通道蛋白的表現量。控制組的表現程度係來自^當 對象。 本發明又提供一治療騰島素阻抗的方法，包含確認 一具有胰島素阻抗或有發展為胰島素阻抗風險之對 象；施予一有效量之第三型酸敏感性離子通道蛋白抑制 劑至前述對象。前述抑制劑可為連結之第三型酸敏感性 離子通道蛋白之多胜肽或是一核酸以減少第三型酸敏 感性離子通道蛋白的表現1。舉例而言，抑制劑可為抗 體、反義核酸（antisense-nucleic acid)或一 RNAi(干擾 RNA)試劑。控制組織表現程度係來自正常對象。 本發明提供一緊急救治胰島素阻抗的方法，包含確 認一具有胰島素阻抗或有發展為胰島素阻抗風險之對 象；以及於進食一小時内，施予一有效量之第三型酸敏 感性離子通道蛋白抑制劑至前述對象。 前述抑制劑可為連結至第三型酸敏感性離子通道 蛋白之多胜肽或是一核酸以減少第三型酸敏感性離子 通道蛋白的表現量。舉例而言，抑制劑可為抗體、反義 核酸（antisense-nucleic acid)或一 RNAi(干擾 RNA)試 劑。控制組織表現程度係來自正常對象。 本發明之一個或多個實施例之細節係陳述如下。本 發明之其他特徵、標的以及優點將仔細陳述如下以及專 利申請範圍。 【實施方式】 本發明係基於，至少是部分，一未預期之發現一45/C3V-小鼠由於胰島素敏感度被強化而可被保護對抗與年紀相關的 7 200831898 葡萄糖财受不良現象(glucose intolerance)，而與年紀相關的葡 萄糖耐受不良現象係與白脂肪組織（white adipose tissue， WAT )而非感覺神經原的 ASIC3正向調控 (up-regulation )有關。 當胞外pH值驟降，第三型酸敏感性離子通道蛋白 (acid sensing ion channel (ASICs))會調整向内的電流 (inward current)並將細胞去極化（Krishtal，2003, Trends Neurosci· 26, S477-483)。其屬於上皮鈉離子通道/退化蛋 白（degenerin)超家族，特徵在於（membrane-spanning domain )包含細胞内N-與C-端以及一大的細胞外環(l〇op) 之兩個跨膜區域（\\^1(11皿1111&11(11^2(1111131<^，1998，（^11〇\ Opin. Neurobiol. 85 418-424 and Kellenberge r and Schild5 2002, Physiol· Rev· 82, 735-767)。ASICs 有七種次單位， 分別包含 ASICla、ASIClb、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、 ASIC4以及ASIC5，由五個基因所轉譯(encode)。數個 次單位組合成為一具功能的離子通道。同次單位或異次 早位的ASICs對於細胞外的pH值有不同的敏感度，從 接近身體之pH值(ASIC3為約ρΗ7·0)到非常酸的狀態 (ASIC2a 為約 ρΗ5·0)皆有（Krishtal，2003，Trends Neurosci· 26, 477-483)。因此，ASICs被認為在偵測組織 酸中毒（acidosis)、局部缺jk ( ischemia )以及調控突觸 活動扮演一定的角色（Molliver et al·，2005，Molecular Pain 1，35, and Xiong et al·，2004, Cell 118, 687-698)。 ASIC3是最敏感的第三型酸敏感性離子通道蛋白 (pH 0·5活化〜ρΗ6·7)，主要表現於初級感覺神經原 (primary sensory neurons)，特別是在代謝感知相關的感 覺神經原（metaboreceptive sensory neurons)或是局部缺 血感知神經原（Waldmann and Lasdunski，1998，Curr. Opin· Neurobiol· 8, 418-424)。ASIC3 在去極化局部缺血 8 200831898 感知神經原時對乳酸的反應比對其他酸類反應佳。因 此，表現ASIC3的神經原也許扮演代謝感知受器的角 色，可感知組織厭氧代謝，並引起肌肉和心臟的傳遞酸 引起的痛感（acid_linked pain sensation) (Molliver et al·， 2005, Molecular Pain 1，35) 〇 本發明之特徵在於提供一種方法，用來鑑定ASIC3 的抑制劑以治療胰島素阻抗。一統計方法上顯著可降低 ASIC3的表現量或通道活性的ASIC3抑制劑，可根據以 下方法被確認出來。 欲篩選之候選化合物（例如蛋白質、胜肽、模擬 肽（peptidomimetics)、類肽(pept〇ids)、抗體、小分子或 其他藥物）可利用習知技術之組合庫（combinatorial library)方法中的數種路徑取得。組合庫包括：胜肽庫、 類肽庫（資料庫中的分子具有胜肽的功能，但擁有新穎非 胜肽的骨架，可抵抗酵素分解），空間可定位平行固相或 液相資料庫（spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries);經由運算(deconvolution)或是 親和層析法（affinity chromatography )所得之合成資料 庫；以及” 一珠一化合物”（one bead—one compound) 資料庫。（參考 Zuckermann ei α/· 1994，J· Med· Chem. 37:2678-2685; and Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145. Examples of methods for the synthesis of molecular libraries can be found in, e.g.9 DeWitt et al., 1993, PNAS USA 90:6909; Erb et al., 1994? PNAS USA 91:11422; Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al., 1993? Science 261:1303; Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl 33:2059; Carell et aL, 1994? Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; and Gallop et al., 1994 J. Med. Chem. 37:1233. Libraries of compounds may be presented in solution (e.g·，Houghten，1992, Biotechniques 13:412-421)，or 9 200831898 on beads (Lam，1991，Nature 354:82-84)，chips (Fodor，1993, Nature 364:555-556)，bacteria (U.S· Patent No· 5,223,409)，spores (U.S. Patent No. 5,223,409), plasmids (Cull et ah, 1992, PNAS USA 89:1865-1869)，or phages (Scott and Smith 1990，Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et ah, 1990，PNAS USA 87:6378-6382; Felici 1991, J· Mol· Biol. 222:301-310; and U.S. Patent No. 5,223,409)) 為確認一 ASIC3抑制劑，可將一待測化合物接觸 一含有ASIC3基因或多胜肽之系統。該系統可為無細胞 系統或是含細胞系統，例如一試管内細胞株或是試管外 的動物模式。在一含細胞之系統當中，細胞可以自然表 現ASIC3基因或是可被改造為表現一重組核苦酸。該重 組核苦酸可含有ASIC3基因的編碼區（coding region)融 合一異質（heterologous)啟動子或一 ASIC3基因的啟動子 融合一報導基因。之後測量ASIC3含多胜肽通道之表現 程度或通道活性。 上述之一 ASIC3多胜肽係指一 ASIC3多胜肽之全 長或是功能等價體(functional eauivalent)。一功能等價體 係指來自ASIC3多胜肽之多胜肽，例如一融合胜肽或一 具有一個或多個點突變、***（insertion)、刪除 (deletion)、修剪(truncation)或任意組合前述方式之多胜 肽。此多胜肽仍然實質具有ASIC3多胜肽之正常功能性 通道的活性，例如當胞外pH值驟降會調整向内的電流 並將細胞去極化。以下顯示ASIC3之多種轉錄變異以及 多種 SNP(Single Nucleotide Polymorphism ;單核苷酸多 態性）之胺基酸以及核苷酸序列。（SEQIDNO:l-6) SEQ ID NO ： 1

Transcript variant 1 (isoform a) : 531 a. a. ACCESSION NP—004760

1 MKPTSGPEEA RRPASDIRVF ASNCSMHGLG HVFGPGSLSL RRGMWAAAVV LSVATFLYQV 200831898

61 AERVRYYREF HHQTALDERE SHRLIFPAVT LCNINPLRRS RLTPNDLHWA GSALLGLDPA 121 EHAAFLRALG RPPAPPGFMP SPTFDMAQLY ARAGHSLDDM LLDCRFRGQP CGPENFTTIF 181 TRMGKCYTFN SGADGAELLT TTRGGMGNGL DIMLDVQQEE YLPVWRDNEE TPFEVGIRVQ 241 IHSQEEPPII DQLGLGVSPG YQTFVSCQQQ QLSFLPPPWG DCSSASLNPN YEPEPSDPLG 301 SPSPSPSPPY TLMGCRLACE TRYVARKCGC RMVYMPGDVP VCSPQQYKNC AHPAIDAMLR 361 KDSCACPNPC ASTRYAKELS MVRIPSRAAA RFLARKLNRS EAYIAENVLA LDIFFEALNY 421 ETVEQKKAYE MSELLGDIGG QMGLFIGASL LTILEILDYL CEVFRDKVLG YFWNRQHSQR 481 HSSTNLLQEG LGSHRTQVPH LSLGPRPPTP PCAVTKTLSA SHRTCYLVTQ L SEQ ID NO ： 2

Transcript variant 1 (isoform a): 1746 bp ACCESSION NM_004769 1 agaattcggc acgacggggt tctggccatg aagcccacct caggcccaga ggaggcccgg 61 cggccagcct cggacatccg cgtgttcgcc agcaactgct cgatgcacgg gctgggccac

121 gtcttcgggc caggcagcct gagcctgcgc cgggggatgt gggcagcggc cgtggtcctg 181 tcagtggcca ccttcctcta ccaggtggct gagagggtgc gctactacag ggagttccac 241 caccagactg ccctggatga gcgagaaagc caccggctca tcttcccggc tgtcaccctg 301 tgcaacatca acccactgcg ccgctcgcgc ctaacgccca acgacctgca ctgggctggg 361 tctgcgctgc tgggcctgga tcccgcagag cacgccgcct tcctgcgcgc cctgggccgg 421 ccccctgcac cgcccggctt catgcccagt cccacctttg acatggcgca actctatgcc 481 cgtgctgggc actccctgga tgacatgctg ctggactgtc gcttccgtgg ccaaccttgt 541 gggcctgaga acttcaccac gatcttcacc cggatgggaa agtgctacac atttaactct 601 ggcgctgatg gggcagagct gctcaccact actaggggtg gcatgggcaa tgggctggac 661 atcatgctgg acgtgcagca ggaggaatat ctacctgtgt ggagggacaa tgaggagacc 721 ccgtttgagg tggggatccg agtgcagatc cacagccagg aggagccgcc catcatcgat 781 cagctgggct tgggggtgtc cccgggctac cagacctttg tttcttgcca gcagcagcag 841 ctgagcttcc tgccaccgcc ctggggcgat tgcagttcag catctctgaa ccccaactat 901 gagccagagc cctctgatcc cctaggctcc cccagcccca gccccagccc tccctatacc 961 cttatggggt gtcgcctggc ctgcgaaacc cgctacgtgg ctcggaagtg cggctgccga 1021 atggtgtaca tgccaggcga cgtgccagtg tgcagccccc agcagtacaa gaactgtgcc 1081 cacccggcca tagatgccat gcttcgcaag gactcgtgcg cctgccccaa cccgtgcgcc 1141 agcacgcgct acgccaagga gctctccatg gtgcggatcc cgagccgcgc cgccgcgcgc 1201 ttcctggccc ggaagctcaa ccgcagcgag gcctacatcg cggagaacgt gctggccctg 1261 gacatcttct ttgaggccct caactatgag accgtggagc agaagaaggc ctatgagatg 1321 tcagagctgc ttggtgacat tgggggccag atggggctgt tcatcggggc cagcctgctc 1381 accatcctcg agatcctaga ctacctctgt gaggtgttcc gagacaaggt cctgggatat 1441 ttctggaacc gacagcactc ccaaaggcac tccagcacca atctgcttca ggaagggctg 1501 ggcagccatc gaacccaagt tccccacctc agcctgggcc ccagacctcc cacccctccc 1561 tgtgccgtca ccaagactct ctccgcctcc caccgcacct gctaccttgt cacacagctc 1621 tagacctgct gtctgtgtcc tcggagcccc gccctgacat cctggacatg cctagcctgc 1681 acgtagcttt tccgtcttca ccccaaataa agtcctaatg catcaaaaaa aaaaaaaaaa 1741 aaaaaa 11 200831898 SEQ ID NO ： 3

Transcript variant 2 (isoform b) : 54 9 a. a. ACCESSION NP—064717

1 MKPTSGPEEA RRPASDIRVF ASNCSMHGLG HVFGPGSLSL RRGMWAAAVV LSVATFLYQV 61 AERVRYYREF HHQTALDERE SHRLIFPAVT LCNINPLRRS RLTPNDLHWA GSALLGLDPA 121 EHAAFLRALG RPPAPPGFMP SPTFDMAQLY ARAGHSLDDM LLDCRFRGQP CGPENFTTIF 181 TRMGKCYTFN SGADGAELLT TTRGGMGNGL DIMLDVQQEE YLPVWRDNEE TPFEVGIRVQ . 241 IHSQEEPP工工 DQLGLGVSPG YQTFVSCQQQ QLSFLPPPWG DCSSASLNPN YEPEPSDPLG

301 SPSPSPSPPY TLMGCRLACE TRYVARKCGC RMVYMPGDVP VCSPQQYKNC AHPAIDAMLR

361 KDSCACPNPC ASTRYAKELS MVRIPSRAAA RFLARKLNRS EAYIAENVLA LDIFFEALNY

421 ETVEQKKAYE MSELLGDIGG QMGLFIGASL LTILEILDYL CEVFRDKVLG YFWNRQHSQR

481 HSSTNLLQEG LGSHRTQVPH LSLGPSTLLC SEDLPPLPVP SPRLSPPPTA PATLSHSSRP

541 AVCVLGAPP / SEQ ID NO ： 4

Transcript variant 2 (isoform b): 1766bp ACCESSION NM—020321 1 agaattcggc acgacggggt tctggccatg aagcccacct caggcccaga ggaggcccgg 61 cggccagcct cggacatccg cgtgttcgcc agcaactgct cgatgcacgg gctgggccac 121 gtcttcgggc caggcagcct gagcctgcgc cgggggatgt gggcagcggc cgtggtcctg 181 tcagtggcca ccttcctcta ccaggtggct gagagggtgc gctactacag ggagttccac 241 caccagactg ccctggatga gcgagaaagc caccggctca tcttcccggc tgtcaccctg 301 tgcaacatca acccactgcg ccgctcgcgc ctaacgccca acgacctgca ctgggctggg 361 tctgcgctgc tgggcctgga tcccgcagag cacgccgcct tcctgcgcgc cctgggccgg 421 ccccctgcac cgcccggctt catgcccagt cccacctttg acatggcgca actctatgcc 481 cgtgctgggc actccctgga tgacatgctg ctggactgtc gcttccgtgg ccaaccttgt 參 541 gggcctgaga acttcaccac gatcttcacc cggatgggaa agtgctacac atttaactct k 601 ggcgctgatg gggcagagct gctcaccact actaggggtg gcatgggcaa tgggctggac 661 atcatgctgg acgtgcagca ggaggaatat ctacctgtgt ggagggacaa tgaggagacc 721 ccgtttgagg tggggatccg agtgcagatc cacagccagg aggagccgcc catcatcgat 781 cagctgggct tgggggtgtc cccgggctac cagacctttg tttcttgcca gcagcagcag 841 ctgagcttcc tgccaccgcc ctggggcgat tgcagttcag catctctgaa ccccaactat 901 gagccagagc cctctgatcc cctaggctcc cccagcccca gccccagccc tccctatacc 961 cttatggggt gtcgcctggc ctgcgaaacc cgctacgtgg ctcggaagtg cggctgccga 1021 atggtgtaca tgccaggcga cgtgccagtg tgcagccccc agcagtacaa gaactgtgcc 1081 cacccggcca tagatgccat gcttcgcaag gactcgtgcg cctgccccaa cccgtgcgcc • 1141 agcacgcgct acgccaagga gctctccatg gtgcggatcc cgagccgcgc cgccgcgcgc 1201 ttcctggccc ggaagctcaa ccgcagcgag gcctacatcg cggagaacgt gctggccctg 1261 gacatcttct ttgaggccct caactatgag accgtggagc agaagaaggc ctatgagatg 1321 tcagagctgc ttggtgacat tgggggccag atggggctgt tcatcggggc cagcctgctc 1381 accatcctcg agatcctaga ctacctctgt gaggtgttcc gagacaaggt cctgggatat 1441 ttctggaacc gacagcactc ccaaaggcac tccagcacca atctgcttca ggaagggctg 12 200831898 1501 ggcagccatc gaacccaagt 1561 gaagacctcc cacccctccc 1621 gctaccttgt cacacagctc 1681 cctggacatg cctagcctgc 1741 catcaaaaaa aaaaaaaaaa tccccacctc tgtgccgtca tagacctgct acgtagcttt aaaaaa agcctgggcc ccagcactct ccaagactct ctccgcctcc gtctgtgtcc tcggagcccc tccgtcttca ccccaaataa gctctgttcc caccgcacct gccctgacat agtcctaatg SEQ ID NO ： 5

Transcript variant 3 (isoform c): 543 a.a. ACCESSION NP—064718

1 MKPTSGPEEA RRPASDIRVF ASNCSMHGLG HVFGPGSLSL RRGMWAAAVV LSVATFLYQV

61 AERVRYYREF HHQTALDERE SHRLIFPAVT LCNINPLRRS RLTPNDLHWA GSALLGLDPA 121 EHAAFLRALG RPPAPPGFMP SPTFDMAQLY ARAGHSLDDM LLDCRFRGQP CGPENFTTIE1

181 TRMGKCYTFN SGADGAELLT TTRGGMGNGL DIMLDVQQEE YLPVWRDNEE TPFEVGIRVQ

241 IHSQEEPP工工 DQLGLGVSPG YQTFVSCQQQ QLSFLPPPWG DCSSASLNPN YEPEPSDPLG

301 SPSPSPSPPY TLMGCRLACE TRYVARKCGC RMVYMPGDVP VCSPQQYKNC MPMDAMLR

361 KDSCACPNPC ASTRYAKELS MVRIPSRAAA RFLARKLNRS EAYIAENVLA LDIFFEALNY

421 ETVEQKKAYE MSELLGDIGG QMGLFIGASL LTILEILDYL CEVFRDKVLG YFWNRQHSQR

481 HSSTNLTSHP SLCRHQDSLR LPPHLLPCHT ALDLLSVSSE PRPDILDMPS LHVAFPSSPQ

541 IKS SEQ ID NO ： 6

Transcript variant 3 (isoform c): 1671bp ACCESSION NM_020322 1 agaattcggc acgacggggt tctggccatg aagcccacct caggcccaga ggaggcccgg 61 cggccagcct cggacatccg cgtgttcgcc agcaactgct cgatgcacgg gctgggccac 121 gtcttcgggc caggcagcct gagcctgcgc cgggggatgt gggcagcggc cgtggtcctg 181 tcagtggcca ccttcctcta ccaggtggct gagagggtgc gctactacag ggagttccac 241 caccagactg ccctggatga gcgagaaagc caccggctca tcttcccggc tgtcaccctg 301 tgcaacatca acccactgcg ccgctcgcgc ctaacgccca acgacctgca ctgggctggg 361 tctgcgctgc tgggcctgga tcccgcagag cacgccgcct tcctgcgcgc cctgggccgg 421 ccccctgcac cgcccggctt catgcccagt cccacctttg acatggcgca actctatgcc 481 cgtgctgggc actccctgga tgacatgctg ctggactgtc gcttccgtgg ccaaccttgt 541 gggcctgaga acttcaccac gatcttcacc cggatgggaa agtgctacac atttaactct 601 ggcgctgatg gggcagagct gctcaccact actaggggtg gcatgggcaa tgggctggac 661 atcatgctgg acgtgcagca ggaggaatat ctacctgtgt ggagggacaa tgaggagacc 721 ccgtttgagg tggggatccg agtgcagatc cacagccagg aggagccgcc catcatcgat 781 cagctgggct tgggggtgtc cccgggctac cagacctttg tttcttgcca gcagcagcag 841 ctgagcttcc tgccaccgcc ctggggcgat tgcagttcag catctctgaa ccccaactat 901 gagccagagc cctctgatcc cctaggctcc cccagcccca gccccagccc tccctatacc 961 cttatggggt gtcgcctggc ctgcgaaacc cgctacgtgg ctcggaagtg cggctgccga 1021 atggtgtaca tgccaggcga cgtgccagtg tgcagccccc agcagtacaa gaactgtgcc 1081 cacccggcca tagatgccat gcttcgcaag gactcgtgcg cctgccccaa cccgtgcgcc 1141 agcacgcgct acgccaagga gctctccatg gtgcggatcc cgagccgcgc cgccgcgcgc 13 200831898 1201 ttcctggccc ggaagctcaa 1261 gacatcttct ttgaggccct 1321 tcagagctgc ttggtgacat 1381 accatcctcg agatcctaga 1441 ttctggaacc gacagcactc 1501 ctgtgccgtc accaagactc 1561 ctagacctgc tgtctgtgtc 1621 cacgtagctt ttccgtcttc ccgcagcgag caactatgag tgggggccag ctacctctgt ccaaaggcac tctccgcctc ctcggagccc accccaaata gcctacatcg accgtggagc atggggctgt gaggtgttcc tccagcacca ccaccgcacc cgccctgaca aagtcctaat cggagaacgt agaagaaggc tcatcggggc gagacaaggt atctgacctc tgctaccttg tcctggacat gcatcaaaaa gctggccctg ctatgagatg cagcctgctc cctgggatat ccacccctcc tcacacagct gcctagcctg SEQ ID NO ·· 7 ASIC3之SNP變異 Cluster Report: rs3192795

CTCCCTGTGCCGTCACCAAGACTCT [C/T] TCCGCCTCCCACCGCACCTGCTACC 重疊群作圖(Contig)-->mRNA-->蛋白 質(Protein) mRNA 方 向 位置 功能 dbSNP 對偶 基因 蛋 白 質 殘 基 譯碼位 置 (Codon pos) 胺基 酸位 置 NT 007914->NM 020321->NP 064717 正向 (forward) 1595 非同義 (nonsynonymous) T Phe [F] 2 525 參考序列(contig reference) C Ser [S] 2 525 NT 007914->NM 020322->NP 064718 正向 1516 非同義 T Phe [F] 1 499 參考序列 C Leu [L] 1 499 SEQ ID NO ： 8

Cluster Report: rsl 864545

GAATATCTACCTGTGTGGAGGGACA [A/G] TGGTAGGGAGCACACAAATGAGGCT 重疊群作圖Contig-->mRNA-->蛋白質 (Protein) mRNA 方 向 位置 功能 dbSNP 對偶 基因 蛋白 質殘 基 譯碼 位置 Codon pos 胺基 酸位 置 NT 007914->NM 004769->NP 004760 正向 forward 704 非同義 G Ser [S] 2 228 參考序列 A Asn [N] 2 228 14 200831898 NT 007914->NM 020321->NP 064717 正向 forward 704 非同義 G Ser [S] 2 228 參考序歹!J A Asn [N] 2 228 NT 〇〇7914->NM 020322->NP 064718 正向 forward 704 非同義 G Ser [S] 2 228 參考序列 A Asn [N] 2 228 f ^ 表現程度可由mRNA表現量或蛋白質表現量決 定。測量細胞中、組織樣本或體液中的mRNA量的方法 土熟知此技藝之人所能輕易得知。為測量mRNA表現 =Η可將細胞分解以後，測量分解液(lysate)中的mRNA ，是由分解液純化RNA或半純化RNA得知，例如雜合 ，驗(利用可偵測之基因特異性標示 )以衫量或权量RT-PCR刚適#的基\特異^ …子）。選擇性地，亦可使用組織切片或未分解之細胞懸 ^'夜’及以可偵測（螢光或酵素）之標記DNA或RNA 采針來進行定量或半定量原位雜交法。其他mRNA定量 方法包括RNA保護試驗(RPA)以及SAGE(基因表達系 歹】分析；serial analysis of gene expression)。 、、测量細胞中、組織樣本或體液中的蛋白質量的方 去為热知此技藝之人所能輕易得知。許多這一類方法使 =可專一性連結一目標蛋白的抗體（單株抗體或多株抗 巧）°這一類的試驗，抗體本身或是一連結該抗體之第二 抗體被可偵測地標示。選擇性地，抗體可結合生物素 (biotin)以及標示可债測之卵白素（avi(jin)( 一種多胜肽可 結合生物素），可用來偵測目前被生物素標示之抗體使 否存在。結合這些方法（包含多層三明治法）可用以加 強上述偵測方法的敏感度。有些蛋白質偵測方法（例如 15 200831898 ELISA或是西方墨點法），可用於體液或是細胞分解液， 而其他方法（例如免疫組織染色法或螢光流式細胞技術 (fluorescence flow cytometry))則使用於組織切片或是 尚未分解之細胞懸浮液。偵測標示的方法係根據標示物 的特性而定且為熟知此技藝之人所能輕易得知。適當的 標示包括放射標示（例如1251、1311、35S、3H或32P)、酵 素（例如：鹼性磷酸酶、辣根過氧化酶(HRP)、冷光酶 (luciferase)、β-半乳糖甘酶）、螢光基團（moieties)或蛋白 質（勞光素（fluoreseein)、若丹明（Rhodamine)、藻紅蛋 白（phycoerythrin )、綠螢光蛋白（GFP)或藍螢光蛋白 (BFP))、冷光基團（moieties)或蛋白質（QdotTM奈米分 子由Quantun Dot有限公司PaloAlto，CA提供）。其他可 使用之試驗包括定量免疫沈澱法或是競爭性酵素連結 免疫吸附試驗。 測量ASIC3的離子通道活性為熟知此技藝之人所 能輕易得知。實施例所使用的方法包括全細胞電位法 (Whole-cell patch recording) (Waldmann et al., J Biol Chem 272，20975-20978 (1997); Voilley et al·，J Neurosci 21， 8026-8033 (2001); Molliver et al·, Molecular Pain 1:35 (20〇5);電壓敏感染料(voltage-sensitive dye) (Felix da/·， Assay Drug Dev Technol. 2? 260-268 (2004); Sharma et al.5 Biophys J 88，3038_3049 (2005));離子敏感染料 (ion_sensitive dye)以及細胞毒性試驗（cytotoxicity assay) (Weiser，J Neurosci Methods 137, 79_85 (2004)) o 為決定候選化合物抑制ASIC3的能力，係比較經 由上述方法所付之表現量或活性與不具有候選化合物 的控制組表現量或活性比較。 若表現量或活性低於控制組，則該化合物被確認 為治療胰島素阻抗有效。吾人可進一步利用一動物模式 16 200831898 =實:化合物之功欵。吾人可將該化合物使用於動物模 U用下述實施例之方法或其他標準技術檢驗之： 為二瘠d著/文善胰島素敏感度時即暗示該化合物 馬/ 口療胰島素阻抗之候選藥物。 、么本發明亦揭露一種治療胰島素阻抗的方法。一欲 γϊϊ對象可依照標準診斷技術確認胰島素阻抗，例如 織二n性地’該對象可根據上述方法檢查脂肪組 是活ϋ =旨肪組織）的asic3乡胜狀的基因表現或 性：若對象之檢體中基因表現或是通道活 抑體’則該對象為以—有效量之ASIC3 抑制劑治療的候選人。 化人Π’治療”係指對一具有胰島素阻抗之對象以-=物處理’目的在於治癒、減緩、減輕、治療、預防、 以ί二疾病症狀、疾病之第二期疾病狀態或疾病之 I一，，有效量，，係指一化合物的量可以產生醫 如上述被治療之對象。該治療方； =以活體内或活體外，單獨或結合其他藥物或療法實 ㈣於Λϋviv。)内方式，以—ASIC3抑制劑處理一 j象。一般而s，使該化合物懸浮於製藥學可接受之載 t鹽水)’以口服或是靜脈點滴(intr~s 直式或/射或皮下植入、肌肉植入、腹腔植入、 直％内植入、***植入、鼻内植入、腸道内 内植入、椎管内植人、肺内植人。為治療騰島素阻^ 該化合物可直接運送到白脂肪組織或周圍組織: 需求劑量係根據實施的路徑；劑型特性；病患生 病狀況；對象的大小、重量、表面積、年齡、性別^施 加其他的藥物；及參與醫師的判斷。適當的劑量在 O.OMOOmg/kg範圍内。所需之劑量的變異係基於各種可 17 200831898 使用之化合物以及細*用j至的不同效率而定。例如口服 被認為比起i.v·注射需要較高劑量。使用劑量的不同可 根據該項技術領域眾所周知方式利用經驗法則來最佳 化以進行校正。將化合物以一適當之運送載體(例如：聚 合微顆粒或是可植入裝置）封裝卜ncapsulation)可以提升 運送效率，特別是口服運送。 實施例中被用來治療胰島素阻抗之化合物包括多 胜 肽 例 如 APETx2 (GTACSCGNSKGIYWFYRPSCPTDRGYTGSCRY FLGTCCTPAD)及其功能等價物（functional equivalents )。一 APETx2之功能性等價物係指一衍生自 APETx2的之多胜肽’例如一融合多胜肽或一具有一個 或多個點突變、***(insertion)、刪除(deletion)、修剪 (truncation)或任意組合前述方式之多胜肽。此多胜肽仍 然實質具有APETx2多胜肽之正常功能性通道的活性， 例如抑制ASIC3同質通道或含有ASIC3之異質通道之 能力，如 Diochot et al· EMBO J· 2004, 23(7):1516-25 所 述。 該多胜肽係使用已知方法合成或是利用重組技術 準備。例如，吾人可轉殖一轉譯出該多胜肽的核酸於一 表現載體，其中該核酸可以連結一適於在一宿主細胞表 現一多胜肽調控序列操作之。吾人接著可將該載體送入 一適當的宿主細胞以表現該多胜狀。該表現之重組多胜 肽可利用方法自宿主細胞純化，例如硫酸氨沈澱以及分 德管柱層析法。參見 Goeddel，（1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic

Press, San Diego，CA·。一多胜肽可用以準備測試其抗 ASIC3同質通道或含有ASIC3之異質通道之活性，方法 參見以下之實施例或Diochot et al. EMBO J. 2004, 18 200831898 23(7):1516-25.。 可用以治療胰島素阻抗的實施例之組合物亦包含 可連結多胜肽ASIC3之抗體。一”抗體”包含完整片段之 分子，例如Fab、F(ab，)2、Fv、scFv(單鍊抗體）以及 dAb(domain antibody ;功能蛋白質片段抗體；Ward，et al· (1989) Nature, 341，544)。一抗體衍生物係指一蛋白質或 蛋白質複合體，其具有一本發明之多胜肽變異。本發明 之一抗體或衍生物可藉由於一適當宿主細胞中共同表 現相對應之輕鏈與重鏈含CDRs多胜肽，該方法為習知 技術，參見 Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory，New York 〇 為製造此處所指之一抗體，ASIC3多胜肽或其抗 原片段可與一載體蛋白偶合，例如KLH，與一佐劑 (adjuvant)混合，並注射於一宿主動物。該動物所產生之 抗體可利用胜肽親和層析法純化。一般常使用之宿主動 物包含兔子、老鼠、迷你豬（guinea pigs)與大鼠(rats)。 各種佐劑可根據宿主種類被用以增加免疫反應，包括福 氏佐劑（Freund’s adjuvant)(完全與不完全）、礦物油（例 如氫氧化鋁）、表面活性物質（例如脫脂酸卵磷脂 (lysolecithin))、複合多元醇(pluronic polyols)、陰離子物 質（poly anions)、多胜肽、油滴乳化劑（〇il emulsi〇n)、 血氰蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH)以及二硝基 酚(dinitrophenol)。有用的人類佐劑包含卡介苗（bacille Calmette-Guerin)以及短棒狀桿菌（Corynebacterium parvum) 〇 多株抗體、抗體分子之異質族群係出現於被接種 (immunize)之對象的血清當中。單株抗體，針對一特 殊抗原的抗體分子之同質族群可使用標準融合瘤 19 200831898 (hybridoma)技術製備。參考 Kohler et al· (1975) Nature 256，495; Kohler et al· (1976) Eur· J. Immunol. 6，511; Kohler et al· (1976) Eur· J· Immunol· 6，292;以及 Hammerling et al· (1981) Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier, Ν·Υ·。特別是，單株抗體係可 藉由任何有關以持續培養之細胞株產生抗體分子技術 獲得’如 U.S· Patent No· 4,376，110; the human B_cell hybridoma technique (Kosbor et al. (1983) Immunol Today 4, 72; Cole et al· (1983) Proc· Natl· Acad· Sci· USA 80, 2026)以及 the EBV hybridoma technique (Cole et al· (1983) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R· Liss，Inc·，pp· 77-96)所述。此抗體可為任一種類之免 疫球蛋白種類包含IgG、IgM、IgE、IgA、IgD使及任何 一種次分類。本發明產生單株抗體之融合瘤可於試管内 或試管外培養。於試管外(in vivo)生產高力價(high titer) 抗體為一特別有用之生產方法。 一含有轉譯一 ASIC3抑制物之核酸序列的多核甘 酸（polynucleotide)可用以治療胰島素阻抗。該核酸序 列可轉譯出上述多胜肽、一抗ASIC3抗體、一反譯RNA 或一小干擾RNA (例如一 RNAi)，其係以AsiC3為標 的，抑制其表現或通道活性。 所謂的「RNAi」或「RNA干擾」係指藉由序列特 異或選擇過程將一目標分子（例如目標基因、蛋白或 RNA )降低調控（down-regulated)。本發明之範圍内係使 用RNAi以降解RNA分子（例如在細胞中）。降解传由酵 素性歷料之沈㈣合 complex ; RSIC)催化。RNAi自然存在於細胞中用以移 除外來RNA(例如病毒RNA)。自然RNAi經由片段切判 游離之雙股RNA作用導致降解機制。選擇性地，RN^ 20 200831898 可藉由例如人工方式將目標基因的表現抑制。 所謂的「RNAi試劑」係指一 RNA(或其類似物 對於目標RNA (例如欲降解之RNA)有足夠序列與^ 互補以導向RNAi。所謂「一 RNA試劑具有一足夠g 與目標RNA互補以導向RNAi」係指RNA試劑具有一 序列足以引發RN A i機制（例如RIS C複合體）或過^將目 標RNA摧毀。所謂一 rRNA試劑具有一足夠序列與目 標RNA互補以導向RNAi」亦指RNA試劑具有一^列 足以引發對目標RNA經由RNAi機制或過程所產生之轉 澤抑制。一 RNA試劑具有一足夠序列與由目標dna所 轉錄之目標RNA互補，使得目標DNA序列在染色體上 沈默（抑制表現）。亦即，RNA試劑具有一序列足以引 發轉譯基因沈默（gene silencing)，例如降低控制目標 DNA序列上或附近的基因表現，如引發目標^^^八序歹^ 上或附近的染色體結構改變。所謂「RNA」或「rNA分 子」或「核糖核酸r(ribonucleic acid)分子」係指核糖核

甘酸（ribonucleotide)聚分子。所謂「DNA」或「DNA 分子」或「去氧核糖核酸r(deoxyribonucleicacid)分子」 係指去氧核糖核甘酸（deoxyribonucleotide)聚分子。 DNA與RNA可自然合成(例如分別藉由DNA複製或 DNA轉錄）。RNA可進行後轉錄修飾。DNA及RNA係 可以化學方式合成。DNA及RNA可為單股（例如ssRNA 以及ssDNA)或是多股(例如雙股dsDNA以及dsRNA)。 多聚核苷酸（polynucleotides)可利用習知聚合生物 可分解之微粒或微膠囊運送系統。另一種達成核酸吸收 的方式為使用微脂體，係根據標準方法製備。多聚核苷 酸可單獨包入這些運送系統或是與組織特異抗體一起 包入。選擇性地，吾人可製備一分子結合子(molecular conjugate)，其由一質體或其他載體利用靜電力或共價力 21 200831898 連結多聚賴氨酸(p〇ly-L-lysine)。多聚賴氨酸連結一可與 目標細胞受器（receptor)結合之配體（ligand )。（Cristiano, et al·，1995, J· Mol· Med· 73:479)·。選擇性地，組織特異 標定可利用習知組織特異性轉錄調控因子達成。運送 「裸露DNA」（例如不具有運送工具者）至肌肉内、皮 膚内（intradermal)或皮下（subcutaneous)位置為另一種達 到試管外表現的方法。 於上述之多聚核苷酸，例如表現載體，轉譯ASIC3 抑制子的核酸序列可連接一啟動子或促進子（enhancer ) f 結合啟動子。適合的表現載體包括質體以及病毒載體， 例如皰療病毒(herpes virus)、反轉錄病毒、牛痘病毒 (vaccinia virus)、減毒牛痘病毒、金絲雀痘病毒（canary poxvirus )、腺病毒以及腺病毒相關病毒 (adeno-associated virus ; AAV) 〇 如該領域之習知技術，一病患所需之劑量需視上 述之許多因子而定。劑量不同，但一多聚核苷酸施用之 較佳劑$為106至1〇12份數(COpies)的多聚核苷酸分子。 此一劑量若有需要可重複施用。施用路徑可為上述之任 # 一路徑。 一套裝產品亦為本發明之範圍，包含一容器、一 有效虽之ASIC3抑制劑以及一於容器上之說明，並指示 抑制劑之施用以治療一遭受胰島素阻抗或具有潛在風 險之對象。該抑制劑可混合藥學上可接受載 :溶rr;r外膜他 背lj，和一專參透壓與延遲吸收劑。 抑制劑可依不同施用路徑使用傳統方法配置成製 劑，例如，可配製成一膠囊、一凝 — 片劑⑽let)用以口服。膠囊可包含任何藥學上可接ί物 貝例如明膠或纖維素。片劑可根據傳統方法壓縮抑制劑 22 200831898 與一固態載體和一潤滑劑之混合物。固態載體之實施例 包含澱粉以及糖漿膨潤土（bent〇nite)。抑制劑亦可以一 硬殼片劑或一含有結合劑(binder)，例如乳糖或甘露醣醇 (mannitol )、一傳統填充劑以及一壓片劑（tableting agent)之膠囊施用。抑制劑可經由腸外(parenteral)路徑施 用。實施例中所使用的腸外劑型包含水溶液、等滲透壓 食鹽水或5%葡萄糖的活化劑或其他已知的藥學上可接 艾之賦型劑（excipient)。ί哀糊精（CyCi〇(jextrins)或其他 助溶劑（solubilizing agent)為熟知此技術之人所普遍瞭 解，可作為藥學上的賦型劑用以運送治療物。進一步， 抑制劑可藉由腦部手術直接注射於紋狀體(striatum)。 抑制劑的效率可藉由試管内或試管外方式評估。 例抑制劑可測試其於試管内抑制ASIC3基因表現或 通道活性的能力。在試管外研究，抑制劑可注射於一動 物（例如一動物模式），並評估其對於胰島素阻抗的效 果。根據上述結果，可決定一適當劑量範圍與施用途徑。 上述ASIC3抑制劑例如ΑΡΕΤχ2對於胰島素阻抗 的急性治療特別有用，例如在進食一小時以内施用。舉 例A明 對象可接受14mg/kg水揚酸(salicylic acid) 或 APETx2 0.23mg/kg。 上述ASIC3抑制劑例如apeTx2可用以治療其他 與ASIC3基因表現量或通道活性不正常地過高有關的 疾病（例如=胖）。一被治療之對象可利用習知技術確 認或利用測量來自前述對象所準備的檢體之ASIC3多 胜肽基因ί現或通道活性而得知。若ASIC3多胜肽基因 表現，，遏活性比一般正常人的檢體表現要來得高，則 該對象為有，量ASIC3抑制劑的治療候選者。 以下係提供利用本發明之實施例詳細說明書、本發 明之技術及特點，然本實施例並非用以限定本發明，任 23 200831898 何熟悉此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍内，當 可作各種之更動與潤飾。 實施例 實驗方法 小鼠 ASIC3小鼠之產生方式如Chen等人於Proc. Natl. Acad· Sci· USA 99, 8992_8997, 2002 所述。Congenicl29 小鼠係由將ASIC3小鼠和雌性l29S2/SvPasCrl野生型小 鼠雜交而得。所有小鼠皆飼養於一 12:12小時日光-黑暗 循環（Cycle)、25°C環境以及40% -70%濕度之環境。所 有實驗使用之雖性小鼠分為不同年齡組。這些動物於一 特殊無感染源設施中飼養並根據Gw/办/or加t/此〇/ Laboratory Animals (National Academy Press, Washington DC) 照顧。試驗步驟係由中研院動物使用會議所核准。 初代脂肪細胞培養舆螢光染色 periovarian 白脂肪組織（peri〇varian WAT )之脂肪 墊(tat pads)係由母鼠分離。一克受分離之脂肪墊係以 2mg/ml第八型膠原蛋白酵素（Sigma)於4mlDMEM當 中於37°C分解1小時。接著，被分解之組織於4°C以 200xg離心5分鐘。含有成熟脂肪細胞之上清液係蒐集 用以作RNA分離。沉澱細胞（cell pellet)、基質血管層 (SVF)，包含間葉細胞（mesenchynal cells)(脂肪母細胞 (adpoblas)t)以及未成熟之脂肪細胞（脂肪細胞前驅物以 及 post adipocyte s )( Van，The adipocyte precusor cell· In: New perspectives in adipose tissue: structure, function, and development· Butterworths，Borough Green，England，chapt· 15, 353-382, 1985)。此SVF係蒐集以作RNA分離或重新懸浮 24 200831898 於含有10%胎牛血清和抗生素之DMEM當中進行細胞 培養。SVF細胞塗抹於每一蓋玻片（直徑l2mm)，每上 蓋玻片含有1〇5濃度細胞，並維持於37°C以及5%潮濕 一氧化$反狀悲。培養之細胞接著進行全細胞電位記^ (Whole-cell patch recording)5 天。

為了螢光染色’培養細胞以冰;東曱醇(iCy 固定5分鐘，接著於0.25%TriltonX_100中渗透化5分 姜里’並以PBS洗丨條。將被固定的細胞置於一含有2¾ BS A 和 0.2% Triton X-100 於 PBS 中的阻滞溶液(bi〇cking : solution)中1小時，並浸泡於一级抗體溶液（含有迷你 緒抗ASIC3 1:250抗體，購自Neuromics;兔子抗ACRP30 1:200抗體，購自Chemicon) 4°C隔夜。接著將細胞以 PBS洗滌三次、每次三分鐘，並浸泡於以一阻滯緩衝液 稀釋1:200之二級抗體1小時。二級抗體為山羊抗迷你 豬連結Alexa Fluor 488以及抗兔子連結Alex Flour 594 抗體（Molecular Probes)。 即時定量反轉錄 PCR(Real -time quantitative RT-PCR) , 總RNA係由冷凍組織樣本或利用Rneasy kit(Quiagen) 1 所分離之脂肪細胞。總互補DNA(cDNA)係由總RNA利 用 Superscript III RT(Invitrogen)所合成。每一 cDNA 之即 時聚合酶鏈反應係加入SYBR綠色染料，以便利用ABI Prism 700 序列偵測系統（PE Applied Biosystem)測量雙 股DNA的合成並均化GAPDHRNA的表現。所有SYBR 綠色核心反應劑以及AmpliTaq Gold聚合酶係購自PE Applied Biosystem (Foster City，CA)。該熱循環狀態為 95°C10分鐘，接著進行95°C15秒以及60°C1分鐘的40 個循環。即時聚合酶鏈反所使用之引子如下： ASIC3 sense，5，-TTTCACCTGTCTTGGCTCCT-3， 25 200831898 ASIC3 anti-sense，5，-CAGGATAGTGGTGGGGATTG-3， GAPDH sense，5，_GGAGCCAAACGGGTCATCATCTC_3，， GAPDH anti-sense，5，-GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT-3，· 脂肪細胞的電生理學 全細胞紀錄係使用初代脂肪細胞並利用Multiclamp 700B 放大器（amplifier，Axon instrument)進行。將片電 極（patch electrode)拉成 1.5mm o.d·的細絲玻璃（Water Instrument，Hamden，Conn·，USA)，並以一含有 100 mM KCn、lOmM EGTA、5mM MgCl2、40mM HEPES、2mM Na2ATP 以及 0.3mM Na3-GTP (pH 值以 KOH 調整至 7·4， 滲透壓調整為300-310m0sm)。當裝滿溶液時電極具有一 2-5ΜΩ電阻。標準外部溶液含有130mMNaCl、5mM KC卜 1 mM MgCl2、2mM CaCl2、1 OmM 葡萄糖以及 20mM HEPES ( pH值以NaOH調整至7·4 )。當得到一全細胞紀 錄時，記錄係以一電壓_箝模式（Voltage-clamp mode)產 生，而ASIC3媒介之電流會因經由一重力控制引流系統 施加酸（以MES調整至ρΗ=5·0)而引發。訊號以轉折頻 率（Corner frequency)3kHz之低通濾波器處理，接著使用 一 CED1401 介面（Cambridge Electonic Design，The Science Park，Cambridge，UK)跑 CED 所提供的 Signal Software以一 10kHz頻率線上婁丈位化。

單一細胞RT-PCR 在全細胞記錄後，脂肪細胞由紀錄滴管取出，並進 性單一細胞RT-PCR分離。單一脂肪細胞之總RNA係根 據操作手冊以 Absolute Nanoprepr Kit (Strategene)分離。 所分離出的總 RNA係以 Superscriptlll RT (Invitrogen)進行反轉錄。接著定量一小部分（約1/60) 26 200831898 RT產物進行PCR以偵測GAPDHRNA的表現。將1/6總 RT溶液作為複合-聚合酶鏈鎖反應(Multiplex PCR)的模 版’包含ASIC族（包含7個ASIC亞型、TRPV1、P物 質以及CGRP)或是脂肪標誌（包含FAS、FGF10、aP2、 DLK_1、SMAF 卜 ETO、UCP卜 UCP3、ACRP30、AdipoRl 與R2、ΡΡΑΙΙγ以及PPARY2)引子對組。複合_?長合酶鏈 鎖反應之熱循環係為95°C10分鐘，接著進行95°C15秒 以及60°C1分鐘的35個循環。PCR產物（1/50體積）用以 作為巢式PCR放大之模版，其用以檢驗一特殊基因是否 Γ 被表現在單一細胞。另外一組引子，巢式引子，係為上 述基因所設計。巢式PCR之熱循環係與複合-聚合酶鏈鎖 反應相同。PCR產物係以4%的洋菜膠分析。巢式引子如 下所示： ASICla sense 5，-GCCAACTTCCGTAGCTTCAAG_3， ASICla antisense 5，· TACCGCGTGAAGACCACTTTG-3， ASIClb sense 5，-TGCTCGGGTTGGATGAGAGTG-3， ASIClb antisense 5，-GGAGCAATAGAGCAGCATGTC_3， i ASIC2a sense 5，- CCGAAGCAGTTCAGCATGCTGGAG_3’ ASIC2a antisense 5,-ATCCTCGCCTGAGTTAAACATG-3， ASIC2b sense 5,-TGCCGCCGCGCCACTTCGAGG-3， ASIC2b antisense 5，-ATCCTCGCCTGAGTTAAACATG-3， ASIC3 sense 59-TCTGGCAACACTCTGCTCCAGGAAG-35 ASIC3 antisense 5’· ACTGGGAGCGGTAGGAGGCCTG -3’ ASIC4 sense 5，_ GGGTGACACAGGACAGTCAG -3’ ASIC4antisense 5’-CAGCCAAGGTCTGAAAGGTC _3’ 27 200831898 ASIC5 sense 5，- CCCTGGTTTTGCTGATGCTG -3’ ASIC5antisense 5，- TTCCCACAGGAGAAGACAAAC -3’ TRPV1 sense 5，_TCCACTGGTGTTGAGACGCC ·3’ TRPV1 antisense 5，- CTTTGAACTCGCTGTCAGTC -3’ Substance P sense 5，- GTGACCTCCCCAAAAGTAGA -3’ Substance P sense antisense ACAGGAGTCTCTGCTTCCAG 3， CGRP sense 59- GCCACCTGTGTGACTCATCG -39 CGRP antisense 5,-GGCTTCAGAGCCCACATTGG -3’ FAS sense 5，-ATTGCATCAAGCAAGTGCAG ·3’ FAS antisense 5，- GAGCCGTCAAACAGGAAGAG -3’ FGF10 sense 5，-CTGGAAAGCACTTGGGTCAT -3’ FGFlOantisense 5，- GGAGACAGAATGCACAAGCA-3’ aP2 sense 5，-ACGACAGGAAGGTGAAGAGC -3’ aP2 antisense 59-AAATTTCCATCCAGGCCTCT -3? DLK-l sense 5，· CTAACCCATGCGAGAACGAT -3’ DLK_1 antisense 5，-CTTGCACAGACACTCGAAGC -3’ SMAF1 sense 55- CTGAGTGTGGCTGTGAGGAG -35 SMAFlantisense 5，- CAGGTCTGACAACGGGAGAT -3’ ETO sense 5，-CCTGTCAATCCAGACCCAGT -3’ ETO antisense TGTCATGGGCTTTCCTCTCTG -39 28 200831898 UCP-l sense 5，- GGCCCTTGTAAACAACAAAATAC -3’ UCP-1 antisense 5，_GGCAACAAGAGCTGACAGTAAAT _3， UCP-3 sense 5，-ACTCCAGCGTCGCCATCAGGATTCT -3’ UCP-3 antisense 5、TAAACAGGTGAGACTCCAGCAACTT-3, ACRP30 sense 5’· GTTGCAAGCTCTCCTGTTCC _3’ ACRP30 antisense 5，-TCTCTCCAGGAGTGCCATCT -3’ AdipoRl sense 5，- TCTCCTGGCTCTTCCACACT -3’

AdipoRl antisense 5，_ CCACAATGATGGCAGAGATG _3’ AdipoR2 sense 5，-TGGAGGCTGTTGGTAGTGAG -3，

AdipoR2 antisense 5’- TCTTAGGGAACCGAATCACC -3， PPARy sense 59- GGAATCAGCTCTGTGGACCT -35 PPARy antisense 5’-TGGGTCAGCTCTTGTGAATG _3， PPARy2 sense 55- CTCCTGTTGACCCAGAGCATG -35 PPARy2 antisense 59- GTGGAGCAGAAATGCTGGAG -3\ 代謝研究 以9、16、25週大的小鼠測試葡萄糖耐受性(GTT)， 而18或27週大的小鼠係用以測試胰島素耐受性(ιττ)。 為測試GTT ’小鼠禁食隔仪接著腹膜（intraperitoneally)注 射葡萄糖每一體重1.5 mg/g。為測試ITT，小鼠自由給予 食物，並腹腔注射胰島素每一體重0.5 mU/g。由尾靜脈 抽血測量含葡萄糖程度。為研究ASIC3抑制劑之功效， 將水楊酸(salicylic acid)(14mg/kg)或 APETx2(0.23mg/kg) 和葡萄糖或胰島素一起腹腔注射。 29 200831898 组織之组織學或型態學分析 從每一小鼠分離Perivovarian WAT，並以布林溶液 (Bouin’ s solution) (Sigma)固定於室溫24小時。接著 被固定的組織以石躐包埋，切成5-//m切片，並以蘇木 精（hematoxylin)和伊紅（eosin)染色。WAT的型態分 析係利用 MettaMorph Offline software(Universal Imaging Corpation)分析源自3-4不同動物之各種年齡層和各種基 因型之1000或更多細胞。 結果 ASIC3加強胰島素敏感性之抑制係舆老化有關 目前研究發現ASIC3-/-小鼠相較於ASIC3+/+具有較 小體型，而ASIC3-/-小鼠當其老化時，相較於 ASIC3+/+(n=10_22，p<0.05)並不會囤積大量體脂肪。8週 大的ASIC3-/-小鼠其白脂肪組織與棕脂肪組織細胞與 ASIC+/+並無顯著不同。但是在25週時，ASIC-/-的白脂 肪組織之細胞會充滿小脂肪細胞，有些會含有多房性脂 肪堆積。相反的，棕脂肪組織則和ASIC3+/+沒有甚麼不 同。25週大的ASIC3-/-小鼠的脂肪細胞平均大小 (1018土20/zm2)遠小於相同年紀的ASIC3+/+小鼠，與8週 大之小鼠一樣（ASIC3+/+為 1877±39//m2 ; ASIC3_/-為 1897±41//m2)〇 由於小脂肪細胞通常顯示胰島素敏感度增加(Um扣 a/.9 Nature 431, 200-205, 2004 and Komazawa et al.^ Kat Medicine 10, 1208-1215, 2004)，實驗將比較ASIC3+/+與 ASIC3-/·小鼠（每一組n=6-9)的葡萄糖耐受性(GTT)與胰 島素耐受性（ITT)。當動物老化，ASIC3-/-小鼠相較 ASIC3+/+小鼠顯不較佳的匍萄糖耐受性與騰島素耐受性 (Ρ<0·05，Mann-Whitney test)。相反地，年輕小鼠（94 8 30 200831898 週)的葡萄糖耐受性與胰島素耐受性在兩種基因型並無 不同U，較老的ASIC3+/+小鼠（25週，n喝在葡 糖耐受性與胰島素耐受性顯示較差的結果，即相較於年 輕老鼠（9或16週，η=6或7)(Ρ<〇·05)為葡萄糖耐受不良。 27週大的ASIC3+/+小鼠其ΓΓΤ只有細微改變。此一年紀的 AS^3_/_小鼠其葡萄糖财受並未受損但胰島素敏感度有 不同地’ASIC3·/·小鼠不會產生與老化有關之葡萄 糖耐文文相（例如葡萄糖耐受不良）。令人訝昱的事，年 紀較大的ASIC3·/-小鼠其ITT較年輕小鼠^圭（n=6， *Ρ<0·05)。相較於ASIC3+/+小鼠，ASIC3_/_小鼠似乎可以 隨著年齡藉由改善胰島素反應維持正常葡萄糖代謝。 +為了測試ASIC3篩選抑制劑是否可逆轉老化有關的 葡萄糖耐受不良以及胰島素阻抗，我們於老化小鼠群中 測试水楊酸與APETx2的效果。水楊酸與ΑρΕΤχ2係被篩 選為ASIC3不同動力學的拮抗劑(Di〇ch〇t以β/，ΕΜβ〇 j 23, 1516-1525, 2004 and Voille et al, J. Neurosci. 21? 8026-8033, 2001)。由實驗發現，以高劑量水楊酸來治療可逆轉 ASIC3+/+小鼠中部分老化有關的葡萄糖耐受效果，但對 於胰島素耐受測試則無影響。相反地，ASIC3特殊胜肽抑 制劑APETx2可有效逆轉老化ASIC3+/+小鼠中與老化有 關的葡萄糖耐受效果且對於有效提升胰島素之敏感度， 如ITT所示。水揚酸不同的效果可能歸因於與APETx2抑 制ASIC3的動力效果不同或是可能歸因於IKK卢抑制效 果不同所致。持續以水揚酸（12〇mg/kg/day)處理齧齒類 動物可破壞IKK/3活性’並藉由使胰島素訊息敏感化逆轉 肥胖或糖尿病引起的肤島素阻抗。 老化有關的葡萄糖耐受係舆WAT所表現之ASIC3有關 為試驗為何去除ASIC3對於脂肪細胞有深遠的影 200831898 響，我們測試ASIC3是否表現於白脂肪組織（WAT>PCR 結果顯示有ASIClb、ASIC3、ASIC4以及ASIC5之表現。 在初代WAT組織，我們偵測某些脂肪細胞ASIC3的免疫 反應。在年輕的ASIC3+/+小鼠（9週大），ASIC3平均表 現於成熟脂肪細胞部分以及由WAT分離的基質血管層 (stromal vascular fraction，SVF)。有趣的是，在老化的老 鼠（30週）中WAT表現SVF的ASIC3 mRNA而非成熟 脂肪細胞，顯著被正向調控（約11倍）。相反地，老化背 根神經節（dorsal root ganglion ; DRG )ASIC3 的表現相較 於年輕的DRG只有1/3。 WAT表現的ASIC3為功能性的離子通道 為確定WAT表現的ASIC3是否有功能，我們利用全 細胞電位法測試由8-10週大的小鼠所分離之培養SVF細 胞之酸性引發電流。實驗結果發現，酸(pH5·〇)確實於sVF 脂肪細胞引起向内的電流(持續的或雙相的）。此種酸引發 電流對於篩選的ASIC3抑制劑，如水揚酸與APETx2敏 感。測試8個脂肪細胞與71個子座狀細胞（str〇ma_like cell)。實驗發現酸刺激於5個脂肪細胞與4〇個子座狀細 胞引起一向内電流。酸敏感脂肪細胞之型態、細胞大小 (直徑由15·6-64·3/ζπι)以及酸引發電流之動力學係多樣 化。有些細胞顯示雙相電流，有些則具有持續電流。具 有雙相電流之細胞的電生理特性與持續電流者在許多方 面都不同，包含電容（35·8與83·7ρΡ)、振幅（peak Amphtude )( 314·1 與 57·6ρΑ)、電流密度（8 !與 2 5pQ/pF) 以及上升時間（rising time) (33·6與885.8ms)。酸引起 雙相電流只在子座狀細胞發現。 &無動作電位（acti〇n potential)可以在這些脂肪細胞被 引啦，顯示其並未被腸神經節（entericganglia)，或平滑肌 32 200831898 肉細胞所污染。表一整理脂肪細胞的細胞大小以及電生 理特性，比較具有持續性電流和雙相電流的細胞。 **Ρ<0·01，t-test 〇 表一 直徑（#m) Vm 電容 振幅 電流密度 上升時間 (mV) (pF) (ρΑ) (pQ/pF) (ms) 持續性 28.2 士 2.3 -18.6 土 2.3 83.7 士 10.6 57.6 士 10.6 2.5 士 0.4 885.8土 104.7 (n=31) 雙相性 23.8±2.2 -14.6士2· 9 35.8 士 4·4** 314.1 士 63.2** 8.1 士 2.3** 33.6 士 10.1** (n=14) 無電流 24.1±1.6 -13.6 士 3·4 37.6±3.7 (n=34) WAT表 現的 ASIC3 主要由 ASIC3 同聚肽 (homomeric)通道組成’在全細胞電位記錄後經早一細 胞 RT-PCR 推測而知。ASIC3-ASIClb 以及 ASIC3_ASIC2b 雜聚肽（heteromeric )通道被發現位於脂肪細胞一小部分 (約3/14)。酸敏感脂肪細胞也表現於許多脂肪細胞標誌， 包含 FAS、FGF10、aP2、ETO、PPARy、AdipoRl 與 AdipoR2。AdipoR2是唯一表現於所有酸引發電流之細胞 種類。令人出乎意料的是，3個無酸引發向内電流之細胞 也表現ASIC3，顯示細胞需要額外的分子幫助ASIC3形 成一功能性通道。表二整理具有或不具酸引發向内電流 之細胞其單一細胞RT—PCR之分子特性。脂肪細胞根據 ASIC3為同聚肽或雜聚肽通道次分類。括弧内之數字係 顯示表現母一脂肪細胞基因標示的細胞數目。 表二 酸引發向内 電流 ~持續性 細胞 數目 脂肪細胞標誌和其他基因__ ASIC3 CGRP (1)，FAS (2)，FGF10 ⑴，aP2 ⑴,ETO (1)， ACRP30 (l),PPARy (1), AdipoRl (2), AdipoR2 (3) 33 7 200831898 ASIClb, ASIC3 aP2(l),AdipoR2 (1)2 2 雙相性 ASIC3 CGRP (1), FAS (1), FGF10 (2), AdipoRl (1), AdipoR2 ⑴,ΡΡΑΙΙγ (1) 4 ASIC2b,ASIC3 AdipoR2 (1) 無電流 ASIC3 FAS (1) 1 ASIClb, ASIC3 FAS (1), FGF10 (1), PPARy (1), UCP3 (1) 2 上述結果顯示，脂肪組織的細胞表現功能性ASIC3 通道也許會造成老化相關的葡萄糖耐受不良以及胰島素 阻抗。去除或抑制此一通道可增加老化小鼠的胰島素敏 感度。ASIC3-/-小鼠的體型比ASIC3+/+小鼠小並伴隨著 與老化有關且有利的表現型：較低的内臟脂肪量、較小 的脂肪細胞、較佳的GTT與ITT數據。這些有利的 ASIC3-/-小鼠表現型並非導因節食，這些老鼠皆有正常進 食。相反地，ASIC3+/+小鼠因老化導致葡萄糖耐受不良 係與WAT表現ASIC3被正向調控有關。脂肪細胞而非初 級感覺神經原傳入的ASIC3訊息，可能導致與老化有關 的葡萄糖耐受不良’因為ASIC3在背根神經節的表現隨 著年紀而衰減。 ASIC3是最敏感的第三型酸敏感性離子通道蛋白 (ρΗ0·5活化至約6.7)主要表現於初級感覺神經原，特別是 在代謝感知相關的感覺神經原（metaboreceptive sensory neurons)或是局部缺血感知神經原。這也是為什麼質子感 應原ASIC3媒介脂肪組織的訊息與乳酸有關。 由缺氧代謝而產生的乳酸係為第三型酸敏感性離子 通道有力的加強子(Immke and MacCleskey，Nat. NeuiOseL 4 869-870,2001) ’ 除了疲勞的肌肉或局部缺血，脂肪組織，尤其是老 化以及肥胖之個體，會活躍地產生乳酸作為葡萄糖代謝 34 200831898 產物。老化肥胖的齧齒類動物之較大的脂肪細胞將所攝 取的葡萄糖中總量的40%-50%轉化成乳酸，相較於年輕 齧齒類動物’其葡萄糖對乳酸的轉化率為5%-15%。然 而，脂肪細胞乳酸的角色目前依然不清楚，因為傳統糖 質新生的觀念無法解釋其如何於老化肥胖的個體活躍地 產生。因此，乳酸也許是一個訊息化合物其協調細胞與 系統功能。因為在有顯示胰島素阻抗的糖尿病個體一貫 地發現乳酸之基礎值上升，脂肪細胞的ASIC3活性也許 是乳酸訊號媒介的失落連結。ASIC3將缺血感覺神經原 去極化時與乳酸的反應較其他酸好。因此，這些神經原 也許作為代谢接受器以彳貞測組織（例如脂肪組織）的缺 氧代謝，引發肌肉及心臟的酸連結疼痛感知（chen W α/·，2002)。由於乳酸不會在很多其他之組織導致疼痛，因 此ASIC3的功能也許不只是一疼痛偵測器，也監測組織 的代謝狀態。當pH從7.4降至7·0時ASIC3通道會打開， 當生理酸驗值接近pF7.4時，乳酸會加強ASIC3通道的 打開(Immke and McCleskey，Neuron 37, 75-84, 2003)。具有偵 測乳酸酸中毒的能力，老化或肥胖個體的脂肪細胞的 WAT表現ASIC3也許會持續活化，其中約有5〇0/。的葡 萄糖代谢為乳酸。當WAT表現ASIC3也增加時，由WAT 表現ASIC3所媒介的強化訊號也許會阻礙細胞吸收葡萄 糖導致騰島素阻抗隨著老化產生。缺乏ASIC3時，脂肪 組織無法適當地偵測乳酸且會將細胞導向加強胰島素敏 感度。 老化可以導致循環系統中的乳酸偏高並減少胰島素 破感度。當生理老化日守，對胰島素反應的阻抗以及葡萄 糖耐受降低會導致普遍流行於老人的第二型糖尿病。第 二型糖尿病是在全世界老年族群中最普遍的代謝疾病， 與粒腺體功能障礙有關。因為粒腺體功能障礙會將細胞 35 200831898 轉化至缺氧性葡萄糖代謝並增加乳酸產生，乳酸感應器 ASIC3可能在控制老化有關的糖代謝中扮演其中的一個 角色。

人類ASIC3位於染色體位置7q36 (de WeiUe以虬，FEBS

Lett· 433, 257_26〇,丨"8)，其被確認為靠近葡萄糖、胰島素 以及胰島素阻抗定量特徵基因座之一（An以β/.，Diabetes 54, 909-914, 2005)。 /、、上所述，上述結果推測將WAT表現ASIC3訊息 的老化有關的騰島素阻抗以及第二型糖展病 其他實施態樣 本發明之實施方法已詳述於前 悉本技術領域之人士皆可依本發，f、施例中，任何熟 發明之精神與範圍内視需要更^^說明，在不背離本 其他實施態樣亦包含在本發明之由，飾本發明，因此， ψ請專利範圍中 【圖式簡單說明】 無 【主要元件符號說明】 無 36

Claims (1)

1. 200831898 十、申請專利範圍： • 一種確認一用以治療胰島素阻抗之化合物的方法，其 包含： 將一待測化合物接觸一表現第三型酸敏感性離 子通道蛋白 3(acid sensing ion channel 3(ASIC3))之第 一細胞；以及 量測細胞中第三型酸敏感性離子通道蛋白3之表 現或是活性程度； 其中前述待測化合物如果表現或是活性程度低 於一以相同方法處理但未與待測化合物接觸的第二 細胞之表現或活性程度，表示前述待測化合物為治療 胰島素阻抗的之候選化合物。 2·如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述細胞為 脂肪組織細胞。 3.如申請專利範圍第2項所述之方法，其中前述脂肪組 織細胞為白脂肪組織細胞。 4·如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述第三型 酸敏感性離子通道蛋白3之活性係以電物理分析來量 測。 5.如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述第三型 酸敏感性離子通道蛋白3之活性以全細胞電流紀錄 (whole cell patch recording)、電壓敏感染色 (voltage_sensitive dye)、離子敏感染色（i〇n —sensitve dye)或細胞毒性試驗量測。 6· 如申巧專利範圍第1項所述之方法，進一步包含將候 選化合物施用於非人類動物，以確認其治療胰島素阻 抗的效果。 37 200831898 7· 8· 9· 10. 11. 12. 13. 14. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述第一細 胞或第二細胞係為非神經原細胞及AdiproR2+細胞。 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中前述第一細 胞或第二細胞係選自NIH3T3細胞、NIH3T3 L1細胞、 已分化NIH3T3 L1細胞、脂肪細胞（adipose cells)和纖 維母細胞(fibroblast cells)所組成之群組。 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中前述第一細 胞或第二細胞係對於 FAS、FGF10、aP2、ET0、ΡΡΑΙΙγ 以及AdipoRl其中之一項或多項有反應。 $申請專利範圍第9項所述之方法，進一步包含將候 選化合物施用於非人類動物，以確認其治療胰島素阻 抗的效果。 一種治療胰島素阻抗的方法，包含： 確a忍一具有胰島素阻抗或 展為胰島素阻抗之風 險的對象； 2制:亥對象之第三型酸敏感性離子通道蛋白3 ; 亥2體之_樣本中第三型酸敏感性離子通道 與^制:或抑制後之表現量以及活性程度；以及 一卫制組之表現程度或活性程度比較，以確認抑 驟係對前“L第11項所述之方法’其中前述抑制步 三型酸敏感以：予有效量之多胜肽’其係連結至第 ^ m ^ I 離子通道蛋白3 ’或是以一核酸減少第 j酸破感性離子通道蛋白3的表現量。 申睛專利範園笛， 之表現程度係心常項：之方法’其中前述控制組 種治療胰島素阻抗的方法，包含： 38 200831898 確認一具有胰島素阻抗或有發展為胰島素阻抗風 險之對象；以及 施予一有效量之第三型酸敏感性離子通道蛋白3 抑制劑至前述對象； 其中前述抑制劑係為連結至第三型酸敏感性離子 通道蛋白3之多胜肽或是一核酸以減少第三型酸敏感 性離子通道蛋白3的表現量。 15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中前述多胜肽 為一抗體。 16. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中前述抑制劑 為反義核酸（antisense-nucleic acid)或一 RNAi(干擾 RNA)。 17. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中前述控制組 之表現程度係來自正常對象。 18. —種緊急救治胰島素阻抗的方法，包含： 確認一具有胰島素阻抗或有發展為胰島素阻抗風 險之對象；以及 以及於進食一小時内，施予一有效量之第三型酸 敏感性離子通道蛋白3抑制劑至前述對象。 19. 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中前述抑制劑 為連結至第三型酸敏感性離子通道蛋白3之多胜肽或 是一核酸以減少第三型酸敏感性離子通道蛋白3的表 現量。 20. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中前述多胜肽 為一抗體。 21. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中前述抑制劑 為反義核酸（antisense-nucleic acid)或一 RNAi(干擾 39 200831898 RNA)。 22. 如申請專利範圍第21項所述之方法，其中前述控制組 之表現程度係來自正常對象。 200831898 七、指定代表圖·· (一) 本案指定代表圖為：第（無）圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 無 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： 無