TW200800250A

TW200800250A - Protein formulation for promoting hard tissue formation

Info

Publication number: TW200800250A
Application number: TW095126080A
Authority: TW
Inventors: Mirella Lazarov; Catherine Middleton-Hardie; David Rosen
Original assignee: Acologix Inc
Priority date: 2005-07-18
Filing date: 2006-07-17
Publication date: 2008-01-01
Also published as: US20080096798A1; WO2007011610A3; WO2007011610A2; EP1928491A4; US7622438B1; US7638486B2; EP1928491A2; JP2009502782A

Description

200800250 (1) 九、發明說明【發明所屬之技術領域】本發明係槪括地關於有二或更多種肽和載劑的用於處理硬組織之調和物和套組。【先前技術】有大量文件證明，以全世界之觀點，骨組織疾病會引起許多明顯的健康問題。因爲有此等骨疾病的健康問題，許多的努力已付諸於開發骨疾病所用的新治療劑。例如，有數種生長及/或分化因子係已知會影響骨骼、軟骨、和牙齒組織者。此等中有許多業經評定過彼等對於加速或變更此等組織中的缺陷痊癒之能力。此等因子包含下列分子：屬於轉形生長因子（T GF )和骨成形蛋白（ bone morphogenetic protein ) (BMP)族以及上皮生長因子（EGF)，上皮細胞生長因子（ECGF )，纖維母細胞生長因子（FGF)，血小板衍生生長因子（PDGF)，似胰島素生長因子（IGF )，和似胰島素生長因子結合蛋白（ IGFBP)等族。雖然許多此等因子係已知會促進成骨細胞的增殖、分化、成熟、或礦質化作用，不過，開發此等因子作爲新穎治療法的企圖都因彼等缺乏組織特異性而到限制。此等因子的投藥會影響到骨骼組織以外的組織，其可能導致不良的活性。例如，rhBMP-2對軟組織的投予（如皮下注射）會引 200800250 · (2) 起軟組織中的新骨迅速生成。此回應的結果_ 的使用受到限制且需要僅慎應用以防止在非所鈣化。使用上述生長及/或分化因子作爲治療劑制爲製造成本。該等因子皆爲由重組DNA方白質’需要大規模的發酵或細胞培養程序。此造方法需要高度專化設施，此進一步增加製造 • 果’製造成本會轉嫁到使用此等產品的非常昂之中。例如，含有BMP族分子的可局部植入式綿已用爲脊椎融合治療所用的醫療裝置。不過序的成本已經對其可使能受益於此類型治療的性施加限制。因此，對於可明顯降低治療成本的新療法持續的興趣存在。特別有用者爲一種新穎的可 • 療劑所需劑量之療法。再者，除了 BMP族中者以外的生長因 TGF、PDGF、EGF、FGF、和 IGF 等族中者，作爲潛在的治療劑。可以降低現行生長因子治有效劑量和治療成本之其他生長因子的利用對的矯形外科和相關醫療體及患者都具有極大價【發明內容】本發明係有關調和物及/或套組，用以生 ;，r h Β Μ P - 2 欲部位中的用的另一限法製造的蛋外，此等製成本。其結貴治療成本膠原蛋白海，使用此程患者之利用之開發都有降低現有治子，諸如在應予以探究療劑療法的於適用彼等値。成或再生新 -6 - 200800250 (3) 硬組織如骨、軟骨、及/或牙齒組織。該調和物包括第一種肽，其可增強第二肽的活性。更特別者，該第一肽可增強第二肽的生物學活性及/或治療效用，該第二肽可爲一種硬組織生長因子及/或分化因子。該第一肽和第二肽可在單一調和物內。或者，該第一肽和第二肽可在實質相同的時間或以任一順序依序地投予。該第一肽和第二肽可實質相同的量或彼此相對的不同比例存在於調和物內或投予〇該第一肽包括1 〇至15胺基酸，具有胺基酸序列 RGDBDXnSGZG、且其中的B、X、和Z皆爲選自任何胺基酸殘基而η係一在1與10之間的整體（SEQ ID NO:3) 。該第一肽（例如SEQ ID ΝΟ·8的肽）係以一量投予以增強選自涉及在硬組織生成的細胞之分化、增殖、成熟、和礦質化作用中的第二肽之特徵。該第二肽（例如rhBMP-2 )可爲屬於轉形生長因子 (TGF-/3 )族的一種生長因子。該TGF-/3可屬於骨成形蛋白（BMP )。該第一肽和第二肽的特別例子皆提供於此。該二種肽可於一單一調和物內投予且該調合物可包括等量或不同比例的該第一和第二肽。更特別的，本發明調和物可包含一藥學上可接受之載劑（例如一種可吸收的膠原蛋白海綿（ A C S ))和該二種蛋白質，其中該第一蛋白質係選自下列之中的蛋白質： RGDBD ( X) nSGZG [B、X、和Z可爲任何胺基酸， 200800250 (4) n=l 〜10] ] ( SEQ ID NO.l ) RGDND ( X ) nSGZG [X和 Z可爲任何胺基酸， n=l 〜10] ] ( SEQ ID NO.2 ) RGDND ( X) nSGDG [X可爲任何胺基酸，n=i〜i〇]] (SEQ ID NO.3 ) RGDNDJJPFSGDG [J 可爲任何胺基酸](SEQ ID N0.4) RGDNDISPFSGDG ( SEQ ID NO.5) RGDNDMSPFSGDG ( SEQ ID NO.6) RGDNDVPPFSGDG ( SEQ ID NO.7) TDLQERGDNDISPFSGDGQPFKD ( SEQ ID NO.8) 且該第二蛋白質係選自屬於轉形生長因子（TGF )和骨成形蛋白（BMP)族（例如rhBMP-2)以及上皮生長因子（EGF )、上皮細胞生長因子（ECGF )、纖維母細胞生長因子（FGF )、血小板衍生生長因子（PDGF )、似胰島素生長因子（IGF)、似胰島素生長因子結合蛋白（ IGFBP)等族。本發明的一方面係肽如rhBMP-2，其爲十分昂貴者，且經由組合此等肽與本發明的第一肽（例如一種SEQ ID N0.8的肽），可降低rhBMP-2的投予量，同時獲得比投予較大量rhBMP-2而不用第一肽時，實質同樣的所欲治療結果。該第二肽可爲市售重組人類骨成形蛋白-2 ( rhBMP-2 )，其可在市售型I牛可吸收性膠原蛋白海綿（ACS )如由 Integra LifeScience，Plains boro, NJ 銷售 Helistat® 之上。該調和物的第一肽可爲SEQ ID NO.8之肽，其可不昂 200800250 (5) 貴相當大量地製造。因此，雖然第一和第二肽可用相量或不同量投予，不過有經濟理由要以相對於該第二肽相當較大的量投予該調和物的第一肽。相對於製造SEq ID NO. 8 的肽之成本，肽如rhBMP-2製造起來係非常昂貴者。據此 ’如果該第一肽係一種如SEQ ID N0.8的肽且該第二肽係一種諸如骨成形蛋白-2 ( rhBMP-2 )之肽，則該第二肽對該第一肽的比例可爲與只用相同量的該等肽中之一種相比 • 可獲得改良結果之任何比例。不過，因爲該第二肽如 i:hBMP-2比該SEQ ID ΝΟ·8的肽實質上更昂貴，因此有經濟理由要求使用二種肽於一調和物中之時，要使得該第一肽諸如SEQ ID ΝΟ·8的肽之含量相對於該第二肽如 rhBMP-2較爲大。假設比例中的第一個數子代表該第一肽如SEQ ID ΝΟ·8的肽，且第二數字代表第二肽如rhBMP-2 的量，則可造出該調和物，其中第一肽對第二肽的比例爲 1: 1或更大者，且該比例可擴大至1: 5,00 0且可能更大馨。也可以使用中間量的比例諸如1 : 2至1 : 5，0 0 0之中者。其他比例如 1 : 5、1 : 10、1 : 5 0、1 : 2 0 0、1 : 3 0 0、1 :5 0 0，都可以使用和熟諳此技藝者皆能在一特別情勢和配方內，從以最經濟的成本獲得最多治療效用的論點輕易地決定所欲比例。一種蛋白質或肽對另一種的比例係以該調和物中所用蛋白質或肽的重量爲基準。本發明的一特別例子係一種調和物，其經特別地設計以促進硬組織生成和再生。該調和物可包括一種藥學上可接受之載劑如可注射的載劑，其內具有本發明的第一蛋白 -9 · 200800250 (6) 質和第二蛋白質。更特定言之，該調和物可包括一種藥學上可接受之載劑（其可爲一種ACS或可注射的載劑）’ 一具有SEQ ID ΝΟ·8的第一蛋白質和rhBMP-2形式的第二蛋白質。該第一蛋白質和第二蛋白質可爲等量或以任何不同的比例（包括上述者）存在。另外，雖然本文中所述特別的調和物包含單一第一蛋白質和單一第二蛋白質，不過要理解者，可以將來自每一組的多種蛋白質包含在一調和 φ 物之內或可分開地投予，同時地或於不同時間依序地。本發明的一方面爲經由包含本發明的第一肽，可用低於要（以其本身）提供一治療結果所預期的量之量投予第二肽。如此，可以經由將藥學上可接受之可注射載劑組合一 SEQ ID ΝΟ·8的肽和rhBMP-2而製備調和物，其中 rhBMP-2的量爲在不含SEQ ID NO.8的肽時無治療效用之量。本發明揭示一種促進生成或再生新硬組織諸如骨骼、 φ 軟骨、及/或牙齒組織的生物學程序之方法，其中該方法可在比單獨使用rhBMP-2實質減低的成本下實施。更特定言之，本發明係一種增強硬組織生長和分化因子所具生物學活性之方法，其特徵爲可以使對該硬組織生成細胞的增殖、分化、成熟及/或礦質化作用起重要作用的細胞內酵素和訊息傳遞分子予以特異性和選擇性上調（ upregulation )及/或滯留時間的延長。本發明提供醫療團體一種治療硬組織疾病和改良現行使用作業的效力之方法。此方法也預期可以導致對患者一明顯減低的成本。經由 -10- 200800250 (7) 投予可爲諸如SEQ I D NO· 8的蛋白質之第一蛋白質，可降低第二蛋白質如rhBMP-2的量且仍然可獲得在投予最優濃度的rhBMP-2時所獲得之所欲治療效用。本發明的另一方面係一種用於投予患者之套組。此套組可包含針對如何組合和投予該等成分之說明。該等成分可包含一藥學上可接受之載劑。該載劑可爲一可注射的載劑或其可爲一種可植入式可吸收性的物質如一可植入式可 φ 吸收性海綿包括類型I牛可吸收性膠原蛋白海綿（AC S ) 。另外，該套組可包含預-量過且包裝的量之第一肽，其可爲本文中所述及的任何第一肽包括SEQ ID NO.8的第一肽。該套組可進一步包括一第二肽，其可爲本文中所述及的任何第二肽，其可包括rhB MP _2。該套組可包含多種不同形式的第一肽。另外，該套組可包括多種不同形式的第二肽。於一形式中，該套組包括分開包裝的諸成分：呈可吸收性膠原蛋白海綿形式的載劑，一 S E Q ID Ν Ο · 8的第一 φ 肽和一第二肽（其係rhBMP-2 )，其中SEQ ID NO.8的肽和rhB MP - 2的含量皆爲量過的量，其比例爲能以經濟上有利的方式獲得所欲治療效用者。本發明此等和其他目的、優點、和特徵可由熟諳此技藝者於硏讀要於下面更完整說明的本發明細節之後變得明顯。發明之詳細說明在說明本發明方法和調和物之前，要瞭解者，本發明 -11 - 200800250 (8) 不限於所述及的特別具體實例，因此等係，當然，可能變異者。也要瞭解者，本文中所用的術語只用於說明特別具體實例之目的，且無意具有限制性，因爲本發明範圍只受後附申請專利範圍所限制之故。在提供一範圍的値之時，要瞭解，除非文中另有清楚的不同表明，否則也特定地揭示出在該範圍的上限値與下限値之間的每一介中値，精確到該下限値單位的十分之一 φ 。在一所述範圍內的任何所述値或介中値與該所述範圍內的任何其他値或介中値之間的較小範圍都涵蓋於本發明之內。此等較小範圍的上限値和下限値可獨立地包括在該範圍之內或排除於該範圍之外，且其中該兩限値中的任一者、非任一者或兩者都包括在於該較小範圍內之每一範圍也涵蓋於本發明中，受在該所述範圍內經任何特定地排除之限値所管制。在該所述範圍包括一或兩限値之情況中，排除此等所包括限値中的任一者或兩者之範圍也包括於本發 φ 明中。除非另有不同的定義，否則本文中所使用的所有技術性和科學性術語都具有對本發明所屬技藝具有一般技巧的人士普遍所知的相同意義。雖然類似於或等同於本文中所述者之任何方法和物質都可用於本發明的實作或試驗中，不過至此要說明某些潛在和較佳的方法及物質。本文中所提及的所有出版物都以引用方式納入本文中以揭示和說明與所引述的出版物相關的方法及/或物質。要瞭解的是本揭示內容係超越所引述出版物的任何揭示到有牴觸之程度 -12- 200800250 ⑼ 必須特別提及者，於用在本文和後附申請專利範圍中之時，單數術語“一 ”（“a”、 “an”、和“the”）係包含複數的指稱，除非該文中另有清楚地不同表明。因此，例如，對“ 一蛋白質”的指稱係包括複數種此等蛋白質且對“該肽 (the peptide) ”的指稱係包括一或多種肽和熟諳此技藝者所知的其等效物，等。本文中討論到的出版物係僅提供在本申請案申請日期之前的彼等之揭示。其中沒有要理解爲本發明不認定此等出版物爲早期先前發明者之承認。進一步地，所提出版物的曰期可能不同於實際的出版日期，此可能需要獨立地確認者。定義術語“治療” （“ treatment”、“treating”及類似者） φ 於本文中係用以說明獲得所欲藥物學及/或生理學效用，該效用係對硬組織生成、再生、生長及類似者之效用。該作用可就完全或部份預防硬組織流失而言爲預防性者及/ 或可就部份或完全地治癒可歸因於硬組織損失的不利症狀而言爲治療性者。據此，“治療”在用於本文中之時，意欲涵蓋治療哺乳動物且特別是人類，包括： (a )防止一疾病或狀況之進展，其方式爲防止硬組織的進一步流失或硬組織的進一步加速流失； (b )抑制一疾病或狀況，即停止會導致硬組織損失 13- 200800250 (10) 的狀況；及/或 (C )減輕一疾病或狀況，從而引起該疾病或狀況的消退且因此促進硬組織生成，再生及/或生長。經由實施本發明，可增強涉及在硬組織生成中的細胞之分化、增殖、成熟及/或礦質化作用。術語“協同”，“協同作用”及類似者於用於本文中係說明經由組合投予一或多種蛋白質所得改善的治療效用 φ 。雖然在某些領域中，協同作用意指超過加成性之效用（例如1 + 1 =3 )，不過於許多關於骨疾病的領域中，可將加成性（1 + 1 =2 )或甚至低於加成性（1 + 1 = 1 · 6 )得效用解讀爲協同性。例如，吾人不能僅經由將二種已知各具50%治療效用之醫藥加在一起來治療任何骨疾病就要獲得1 〇〇% 的治療效用。例如，在某些情況中，將兩種成分加在一起事實上可能具有負作用且得到比使用任一藥物本身時較不合意之結果。另外，如用於本文中者，協同意指一種成分 φ (例如rhBMP-2 )在與第二成分（例如SEQ ID ΝΟ·8 )組合時可以較低量地使用而仍然可獲得如同該rhBMP-2成分於較大含量時之相同合意效用。如此，就本發明而言，經由組合第一蛋白質如具有SEQ ID NO. 8者與第二蛋白質諸如r h Β Μ P - 2，可以減低獲得所欲治療結果所需的r h Β Μ P - 2 用量。該減低可能爲相比於沒有投予第一蛋白質之下獲得所欲結果所需劑量的10%、20%、50%、75%或更多。針對本發明調和物之經濟價値而言也可獲得協同作用。例如，當使用非常大量的第一蛋白質諸如SEQ ID ΝΟ.8之蛋白質 -14 - 200800250 (11) 之時，可使用非常小量的第二蛋白質諸如rhBMP-2。因爲該rhBMP-2製造起來比SEQIDNO.8蛋白質實質上更昂貴，所以即使得到在實質相同的治療結果，也可得到協同經濟結果。例如，當使用大量的第一蛋白質諸如SEQ ID NO. 8蛋白質之時，第二蛋白質的量可爲在沒有SEq id ΝΟ· 8第一蛋白質中得到所欲治療效用所需劑量的一半或更低，十分之一或更低或甚至於百分之一或更低。 φ 術語“同時”和“依序”就投予本發明調和物而論，於本文中係用於意指在考量正常的醫學程序和獲得的結果之下，該第一蛋白質和第二蛋白質可於準確地相同時間投予或先後投予。如此，“同時”可意指該二種成分係存在於單一調和物之內或彼等係在相同治療點投予。“依序”可意指彼等係從相同注射筒或從不同的注射筒先後依序地投予。重要者在於該第一肽和第二肽的投予方式爲使得該第一肽和第二肽就所求所欲治療而言可以有生理上交互作用 • 之機會。發明通論本發明調和物係製造供增強硬組織生成所用之調和物。該調和物爲可植入式如在作爲載劑的可吸收性膠原蛋白海綿上者或爲包括藥學上可注射的載劑之可注射的調和物。該調和物可包括一、二或更多種蛋白質。在一具體實例中，該調和物可包括一第一蛋白質，其係由SEQ ID NO: 1 通用序列所涵蓋；與所組合的第二蛋白質，其係選自屬於 -15- 200800250 (12) 下列之分子轉形生長因子（TGF )和和骨成形蛋白（BMP )族（包括rhBMP-2 )、以及上皮生長因子（EGF )、上皮細胞生長因子（ECGF )、纖維母細胞生長因子（FGF ) 、血小板衍生生長因子（PDGF)、似胰島素生長因子（ IGF )、與似胰島素生長因子結合蛋白（iGFBP )族。本發明的調和物可包括載劑和唯一的蛋白質（例如 SEQ ID N0.8 )且可能包含在一套組內，該套組內也含有 φ 預量過量的第二蛋白質（例如rhBMP-2 )且與藥學上可接受之載劑（其可爲一種可吸收性膠原蛋白海綿（A C S )或可注射的載劑）包裝在一起。該二種蛋白質可包裝在一起供同時和依序投藥所用。本發明調和物或套組可經設計成爲可獲得所欲治療結果同時使該套組或調和物中的第二蛋白質之量減到最少之方式。因爲第一蛋白質諸如SEQ ID NO.8蛋白質製造起來相對不貴而第二蛋白質（例如 rhBMP-2 )則十分昂貴，所以熟諳此技藝者都可察覺者， φ 調和以包括大量的第一蛋白質和小量的第二蛋白質之舉可以高經濟第提供所欲治療結果。該第二蛋白質可爲市售重組人類骨成形蛋白_2 ( rhBMP-2 )，其可在如由 Int e gr a Li f e S ci en c e , P1 ai n sb o r 〇， NJ銷售的Helistat®之市售型I牛可吸收性膠原蛋白海綿 (ACS )之上。於此專利申請案中的本發明係有關一種增強生長及/ 或分化因子的活性之方法，彼等因子爲已知可促進硬組織生成細胞系（包括但不限於成骨細胞、生齒細胞、成釉細 16- 200800250 (13) 胞、和牙骨質母細胞）的增殖、分化、分劣、和細胞的礦質化作用中之一或多者，且從而促進新硬組織細胞生成。在本發明一特別具體實例中，本發明方法可特異地增強該分化因子的活性且常可促進硬組織生成細胞的分化、成熟、及/或礦質化作用中之一或多者。該方法的特徵在於經由使用一種含有由SEQ ID NO.1 所槪括地定義的胺基酸序列之肽。經發現者，經由添加肽 φ 於一種試管內或活體內骨骼組織生成系統中，由硬組織生長及/或分化因子所促進的硬組織生成可獲得明顯地增強且可明顯地減低此等因子所需之量。進一步地，在硬組織生長及/或分化因子與含有SEQ ID NO.l的肽之間的此種明顯協同作用對硬組織係具高選擇性者。換言之，由該含 SEQ ID ΝΟ·1的肽所得獨特增強作用預期之出現於經指定變成硬組織之組織中。此預料外且明顯的發現提供醫學團體一種改良的治癒 φ 硬組織缺陷之方法。此種肽的使用可減少該等生長及/或分化因子要施發最大活性所需的量，從而明顯地降低整體治療成本。任何含SEQ ID NO .1的肽都可用廣用的肽化學合成方法予以製造且其成品成本都可明顯地低於重組生長及/或分化因子。此外，因爲該含SEQ ID NO· 1的肽之生物學活性化係只在硬組織環境中表現，所以即使其他生長及/或分化因子在彼等的投藥方法上可能有某些限制，該肽對有需要的 -17- 200800250 (14) 對象之投藥途徑都沒有限制。換言之，該含SEQ ID NO· 1 的肽視治療程序而定可以用多種方式調和及投予。本發明的另一特性點爲經由添加該含SEQ ID NO. 1的肽，可以明顯地上調環加氧酶-2 ( COX-2 )在硬組織生成細胞諸如成骨細胞、生齒細胞、成釉細胞、和牙骨質母細胞之中的表現和活性。COX-2的此種明顯上調係在添加該含SEQ ID NO.l的肽之後以劑量相關方式觀察。 # 再者，此等硬組織生成細胞的***素E2 ( PGE2 ) 產生可由此方法予以明顯地上調。已知者，PGE2可促進硬組織生成細胞的增殖。所以，PGE2於硬組織生成細胞中的局部上調係合乎所需者。

Nagel等人證明SEQ ID N0.8肽，其也稱爲AC-100 且已經在多重硬組織治療的第II期（Phas e 11 )臨床發展中，可上調人類間葉幹細胞中的 COX-2 ( Journal of Celluar Biochemistry，2004) 〇 % 此外，Middleton-Hardie 等人已證明該 SEQ ID NO.8 的肽可在顱蓋器官培養檢定法中以劑量相關方式上調 PGE2 的產生（27th Annual Meeting of the American Society for Bone and Mineral Research 2005，付印中）。也經證明，某些硬組織生長因子如BMP會增加由成骨細胞的PGE2產生。不過，當該含SEQ ID N0.1的肽係與次最優濃度的 rhBMP-2 —起使用之時，其單獨時僅邊際地上調COX-2或 PGE2，隨著該含 SEQ ID N0.1的肽之添加，COX-2或 -18- 200800250 (15) PGE2中任一者都以該肽的劑量相關方式明顯地上調。例如，該SEQ ID N0.8的肽單獨添加到培養中的人類間葉幹細胞中之時不能導致PGE2的明顯增加。由於PGE2 的增強係發生在器官培養中及有rhBMP-2存在（即使爲次最優濃度）之時，因此咸信該SEQ ID NO.8肽係經由實質地增強該rhBMP-2的分化活性而起作用（不論係外源地增加或在骨中局部地產生或由骨細胞產生）。 φ Smad分子。（1〜8 )係已知在TGF-β和BMP族的成員之細胞內信號傳導上起重要作用者。在硬組織生成細胞中，Smad 1、5、和8係已知可經由分化因子如BMP族分子予以活化。Smad分子的此等活化可透過在刺激後10-20 分鐘內發生的磷酸化事件予以觀察。典型地，此等經磷酸化Smad分子的滯留時間係短暫存留者，通常在細胞的起始刺激後約0.5至12小時之內消失。骨生成細胞，如MC3T3細胞用rhBMP-2和含SEQ ID Φ NO. 1肽兩者予以刺激後，細胞內Smad分子（特別是 Smad 1、5、和8 )即經磷酸化且保持磷酸化長達48小時。此強烈地推斷出含SEQ ID N0.1肽具有能力來延長該硬組織生成細胞的活性且藉此增強硬組織生成。在該硬組織生成的增強與磷酸化Smad分子的滯留時間延長之間的此種相關性係極有益於設計或鑑定一可增強硬組織生成的新穎分子。熟諳此技藝者都能建立一鑑定系統以觀察在硬組織生成細胞內的磷酸化Smad分子的滯留時間且用以篩選一可刺激硬組織生成之新穎化學實體。 -19- 200800250 (16) 能延長硬組織生成細胞內磷酸化Smad分子的滯留時間之任何化合物及使用篩選系統評估硬組織生成細胞內磷酸化Smad分子的滯留時間以鑑定此等化合物之方法都在本發明範圍之內。已知者，BMP在投予或植入哺乳動物時會引起骨生成。在給予適當遞送媒劑時該活性可能增強。如實施例6中指出者，在將含有5微克或更高量rhBMP-2的包括聚乳酸 φ ( PLA )，聚乙二醇（PEG)、和連結質（DX)的聚合物植入小鼠背肌內之約20天後，新骨組織即局部生成。用較低的、次最優劑量的rhBMP-2，有極微的或沒有骨生成。特別地，於使用3微克劑量時的情況中，相較於5微克劑量的投藥，有實質較低的骨生成。將不定量的SEQ ID NO.8肽添加於含有次最優劑量， 3微克的rhBMP-2，之聚合物中。不過，如圖3所指出者，當添加一劑量的 SEQ ID N0.8肽於次最優劑量的 φ rhBMP-2中之時，於骨生成上會有明顯且劑量相關性增加。當給予5 0微克/毫升或更高時，新骨生成的程度係相似或優於使用最優劑量rhBMP-2時生成的骨量。於使用不同的具有由SEQ ID NO.l所界定的胺基酸序列之肽之時的相同實驗中得到同等或可比較的結果。此等活體內結果清楚地推斷出含SEQ ID NO. 1肽可在其與rhBMP-2用於晡乳動物中生成新骨之時明顯地降低 rhBMP-2的需要量。rhBMP-2需要量的此種明顯減低，因爲有較低的成本及較低的來自較高劑量rhBMP-2所致異位 -20- 200800250 (17) 鈣化之風險，所以極有利於醫學實作。由於硬組織生成細胞係在相同譜系中，因此於牙齒硬組織諸如齒質、琺瑯質、和牙骨質，彼等係由生齒細胞、造釉母細胞（ameroblasts )、和成牙骨質母細胞分別地生成，等之中也預期有相似的協同作用。該含SEQ ID N0.1肽於上述硬組織生成目的之共同-使用不限於只與BMP族分子一起使用。當該肽與其他硬 φ 組織生長因子或分化因子包括但不限於）屬於TGF族（ BMP 族係其一部份），EGF、PDGF、FGF、IGF、和 IGFBPs等一起使用時，可預期有相似效用。本發明中所用的肽係由彼等含有的由SEQ ID NO.1所表特別胺基酸序列所界定。該肽可爲近似1 0至50胺基酸之尺寸，係由彼等所含由SEQ ID NO.l所表胺基酸序列估計。用於本發明中之肽不一定要爲線性肽，而可爲環狀或分枝肽。含有本發明序列單位之串聯序列的長於5 0胺基 • 酸之肽也在本發明範圍內。含有SEQ ID NO. 1的肽之多聚體也在該範圍之內。此等多聚體可爲二聚體（dimers )、三聚體（trimers)、四聚體（tetr amer s )、五聚體（ pentamers )、六聚體(hexamers )、七聚體(heptamers )、八聚體（octamers )、九聚體（nonamers )、十聚體 (decamers )、等。本發明肽之最小尺寸具有RGDBDXSGZG胺基酸序列，其中B、X、和Z可爲任何胺基酸。含有Seq ID N0.4 通式胺基酸序列的肽展現出對本發明目的而言比其他序列 -21 - 200800250 (18) 更高的生物學活性而SEQ ID NO·8展示出最高活性。 S EQ ID Ν 0.5和8分別等於已知的稱爲基質細胞外磷酸糖蛋白（MEPE)的人類蛋白質所含胺基酸序號247-259 和 242-264。SEQ ID N0.6 爲人類序歹[j SEQ ID ΝΟ·5 獼猴之同源物（orthologue) 。SEQ ID NO.7係相同部份的嚅齒動物（通常介於小鼠與大鼠之間）同源物。所有此等 MEPE同源物都含有在SEQ ID N0.1範圍內的序列，彼等以同等方式促進硬組織生成細胞的增殖、分化、成熟、和礦質化。槪要而言，本發明呈出一種促進或增強新硬組織生成之方法，提供一包括約1 〇至5 〇個胺基酸，含有由S E Q ID NO. 1具體指定的胺基酸序列之肽。此肽降可減低需要促進有效新骨生成所需的骨分化及/或生成因子（例如 rhBMP-2 )之量。進一步硏究推斷此可能經由包括將已知涉及在負責骨生成的信號傳導路徑中的經特定磷酸化 Smad分子所具壽命予以延長之機制而發生。套組根據本發明的套組包括一或多種在商業上通常與 rhBMP-2關聯用到的類型之可吸收性膠原蛋白海綿。該海綿含有第一蛋白質如SEQ ID N0.8肽的溶液和一種分開的谷器’其中裝有第一蛋白質如rhBMP-2。於該套組的另一形式中，該第一蛋白質（如SEQ ID N0.8肽）和第二蛋白質（如rhBMP-2 )係裝在相同的容器之內。將兩種蛋白質 22- 200800250 (19) 包括在不同的容器之內的優點在於若該二種容器的擱置壽命不相同之時，當只有一者的擱置壽命到期時，可不必將兩個容器都丟棄。另外，該套組可經設計成使得該可吸收性的膠原蛋白海綿或多個綿該都具有恰當的尺寸以從裝有第一和第二肽的一或兩個容器吸收該量的溶液。更進一步者，該第一和第二肽可包括於分開的容器之內或以所欲比例諸如上述比例混合在一單一容器之內。如先前指出者， φ 此等比例通常係提供相當大量的第一蛋白質（如SEQ ID ΝΟ·8肽）和相當少量的第二蛋白質（如rhBMP-2 )。骨成形蛋白本發明調和物中所用的第二蛋白質係一種自然存在的蛋白質或爲此等一種自然存在蛋白質的重組產生形式。此種蛋白質的一個例子爲骨成形蛋白-2 ( BMP-2 )，其重組形式係稱爲人類重組骨成形蛋白-2 ( rhBMP-2 )。有關骨 φ 成形蛋白的資訊係包含有下列出版物中，彼等都以引用方式納入本文中。BioDrugs. 2002;16 ( 5 ) :376-7 ; Journal of Orthopaedics 2005;2 ( 4 ) e3;專利：5， 108,922; 5,187,07; 5,318,898; 5,459,047; 5,618,924 ； 5,631，142° 骨成型蛋白與本發明第一蛋白質一起可與適當的藥學上可接受之載劑如類型I牛可吸收性膠原蛋白海綿（ACS )組合。沐1發明治療用調和物係施用於骨及/或軟骨傷害部位 (例如骨斷裂、切骨手術、等），因此提供本發明治療用 -23- 200800250 (20) 蛋白質組成物的局部遞送。例如，可將治療用蛋白質組成物經由於適當的載劑（例如油性溶劑如花生油或可注射的骨膠結劑）之中注射於目標部位或，於開放手術的情況中，將此等化合物於適當載劑諸如骨蠟、去礦物質骨基質散劑、聚合物行骨膠結劑、骨密封劑等之中局部施用到該等部位。或者，可經由下述達成局部施用：將治療用蛋白質組成物在適當載劑中的溶液或分散液施用表面之上，或摻 % 到整形手術慣用的固體或半-固體植體之內，如修復術、達克龍網線（Dacron-mesh) 、Gore-tex™、凝膠-發泡體 (gel-foam )和新鮮小牛骨（kiel bone)、及/或膠原蛋白海綿/基質。例如，自牛腱重組成的可吸收性膠原蛋白海綿和自去礦物質/胍-萃取牛骨所衍生的以膠原蛋白爲基之基質係現行用來將BMP遞送到目標部位的二種遞送材料 (參閱例如，InfuseTM，Medtronic，Inc.; Induct Os TM， W y e t h / A s t e 11 a s B V )。 • 在某些具體實例中，本發明治療調和物包括一基質，其能遞送治療用蛋白質組成物如SEQ ID NO.8與rhBMP-2 至骨及/或軟骨傷害部位同時提供一發育骨骼和軟骨之結構。此等基質可由任何方便物質所生成包括目前已在其他植入式醫學應用中所用的彼等物質。此等調和物可合宜地施用在海綿，其可植入、灌封或注射於黏稠形式中以遞送至骨骼，軟骨或組織傷害部位。該基質物質的選擇可基於數種因素，包括生物相容性、生物降解性、機械性質、美容外觀和介面性質。一特定治療用調和物的特別施用會影 -24- (21) 200800250 響其設計和實施。組成物用的可能基質可爲具有生物性且經化學上定義的硫酸鈣、磷酸三鈣、羥磷灰石、酸和聚酸酐類。其他潛在物質皆爲生物可降解且經生明確定義者，諸如骨或皮膠原蛋白。其他基質包括純質或細胞外基質成分。其他可能基質爲非生物可降解化學定義者，諸如燒結羥磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽或其他陶瓷。基質可包括任何上述類型之物質的組合諸如聚乳酸和羥磷灰石或膠原蛋白與磷酸三鈣。該生瓷可在組成上變異，諸如鈣-鋁-磷酸鹽類且經加工以孔隙尺寸、粒子尺寸、粒子形狀、和生物降解性。本發明治療調和物諸如SEQ ID NO.8與rhBMP-2 藥法決定於許多可能影響本發明調和物的治療用蛋白成物之作用的因素，包括所欲生成量的骨重量，骨傷部位，受傷骨的狀況，傷口的大小，受傷組織的類型者的年齡、性別、和飲食、任何感染的嚴重性、投藥及其他臨床因素。劑量可隨所用媒劑、載劑、或基質型以及調和物的治療用蛋白質或多蛋白質之實體而變治療效率可於臨床中經由骨骼生長及/或修復的定期，例如使用X-光，予以監測。在某些具體實例中，本發明調和物之治療用蛋白成物諸如SEQ ID ΝΟ·8與rhBMP-2的總重量劑量可自 (从g)至毫克（mg)量（例如，自1微克至10毫括自2微克至50毫克，如自1〇微克至25毫克，微克至1 〇毫克等）。如上面指出者，該總劑量可降解聚乳物學蛋白且經類、物，物陶變更的服質組害的，患時間的類異。評估質組微克，包 100 許多 -25- 200800250 (22) 因素所決定。在某些具體實例中，該調和物中所含該治療用蛋白質組成物之濃度（即，治療用蛋白質組成物的重量劑量/總調和物的重量）係自0.1毫克/毫升至5毫克/毫升，包括〇·5毫克/毫升至4毫克/毫升，諸如1毫克/毫升至 3毫克/毫升，例如，2毫克/毫升。本發明調和物中的治療用蛋白質組成物可含有二或更多種蛋白質。在一具體實例中，該調和物包括一第一蛋白 φ 質（其係由SEQ ID ΝΟ·1通式序列所涵蓋的一種蛋白質） ’與第二蛋白質之組合，該第二蛋白質係選自屬於下列之分子：轉形生長因子（TGF )和骨成形蛋白（BMP )族以及上皮生長因子（EGF )、上皮細胞生長因子（ECGF )、纖維母細胞生長因子（F GF )、血小板衍生生長因子（ PDGF )、似胰島素生長因子（IGF )、和似胰島素生長因子結合蛋白（IGFBP )等族。在某些此等具體實例中，本發明治療用調和物中的第二蛋白質對第一蛋白質比例係自 φ 1: 1或更大至卜5,000或更大，包括自1: 1或更大至i :1，000或更大，諸如自1: 2或更大至1: 500或更大。熟諳此技藝者都可察覺者，有關B MP (其於本文中也稱爲BMP-2和rhBMP-2)之實質其他資訊可在包括已核發的眾多美國專利之文獻中找到。另外，包括可促進硬組織生成生長的其他蛋白質之特別調和物可在與本發明相關的文獻中找到，其包括一由SEQ ID ΝΟ·1所涵蓋的第一蛋白質組合著可促進硬組織生成和生長之任何蛋白質，以增強治療效用同時使用較少量的該蛋白質。 -26- 200800250 (23) 方法所用製造該調和物及/或套組可經製造以實施一方法，該方法包括= 投予一患者一第一肽，其包括1 〇至5 0個胺基酸殘基，且具有一胺基酸序列RGDBD ( X ) nSGZG ( SEQ ID NO.l ) ’其中B、X、和z可爲任何胺基酸殘基且^爲在 φ 1與1 〇之間的任何整數；且

進一步投予該患者一第二蛋白質，其係選自包括下列之群組··轉形生長因子（TGF )、骨成形蛋白（BMP )、上皮生長因子（EGF)、上皮細胞生長因子（ECGF)、纖維母細胞生長因子（F G F )、血小板衍生生長因子（P D G F )、似胰島素生長因子（IGF)、和似胰島素生長因子結合蛋白（IGFBP)。在該方法中，該患者可爲人類且該方法可進行以增強 # 硬組織生成活性。該方法可經實施以延長磷酸化Smad分子的滯留時間。該方法可經實施以縮減將Smad分子去磷酸化所需時間。該方法爲如申請專利範圍第1 4項所述者 ’其中該方法係經實施以縮減將硬組織生成細胞中的磷酸化Smad分子予以降解所需的時間。所處理的細胞可爲選自下列群組之組織生成細胞：（ a ) —種成骨細胞系的細胞，其中硬組織係呈骨組織之形式；（b ) —種成釉細胞系的細胞，其中硬組織係呈琺瑯質形式；（c ) 一種生造牙本質細胞系的細胞，其中硬組 -27- 200800250 (24) 織係呈牙本質形式；及（d ) —種牙骨質母細胞系的細胞其中該硬組織係牙骨質的生成。該第一肽和第二肽可經由注射投予。該第一肽可爲 SEQ ID N0.1肽且該第二肽係重組人類骨成形蛋白-2 ( rhBMP-2 )。該第一蛋白質和第二蛋白質可同時投予。該第一蛋白質和第二蛋白質可在一種可吸收性膠原蛋白海綿 (ACS )上投予。 Φ 該調和物及/或套組可經製造以用於治療一有硬組織缺陷特徵之疾病，該治療包括： (a )投予一肽，其包括約1 〇至50個胺基酸，且其含有一胺基酸序列 RGDBD(X) nSGZG(SEQ ID NO.l) ，其中B、X、和Z可爲任何胺基酸殘基且η爲在1與1〇之間的任何整數；及 (b )投予一可促進硬組織生長的分子，和一載劑。該方法可實施成其中（a)和（b)係同時投予。該方 # 法可實施成其中（a )和（b )係依序地投予，以該肽在該可促進硬組織生長的分子之前投予。該方法可實施成其中 (b )和（a )係依序地投予，以該可促進硬組織生長的分子在該肽之前投予。該方法可實施成其中投予（a )和（b )可上調及/或活化該所治療的硬組織中之環加氧酶_ 2 ( COX-2 )。該方法可實施成其中使該所治療的硬組織中之 ***素E2 ( PGE2 )產生得以增加。該方法可實施成其中使該所治療的硬組織中之磷酸化Smad分子的降解時間得以延長。 28· 200800250 (25) 套組及/或調和物係經製造供進行增強硬組織細胞的方法，包括延長該磷酸化S m a d 1、5、和8的滯留時間，其中係增強促進增殖、分化、成熟、或礦質化作用。套組及/或調和物係經製造供進行治療有硬組織缺陷特徵的疾病之方法，其包括：投予一或多種藥學活性分子，其能延長於硬組織生成細胞中的磷酸化Smad分子之滯留時間。 Φ 套組及/或調和物係經製造供進行軟骨再生的方法，其包括：投予一患者一種藥學上活性量的組成物，該組成物包括具有本發明所定義的SEQ ID NO. 1序列之多肽。套組及/或調和物係經製造供進行一種治療方法，其包括：投予一患者一治療有效量的調和物，該調和物包括一藥學上可接受之載劑和一選自本發明所定義的SEq id # NO·1— SEQ ID N0.8肽中任何一者的肽。該方法可進一步包括於一期間內以促進硬組織生長的方式定期地重複投予該調和物於該患者。該方法可進一步包括投予可起始硬組織生成的第二種藥物。該方法可經實施成其中該第二種藥物係一種經重組產生的骨成形蛋白（BMP)。【實施方式】 -29 - 200800250 (26) 實施例下面的實施例係提出以提供給諳於此技者對於如何做出及使用本發明一完全的揭示和說明，但是無意用以限制本案發明人士視爲彼等的發明者之範圍，彼等實施例也無意代表下述諸實驗爲所有或唯有的所實施過的實驗。其中也付出努力以確保所用數値之準確度（例如量、溫度等） ’不過應計及某些實驗誤差和偏差。除非另有不同指出， • 否則份數係重量份數，分子量係重量平均分子量計，溫度係攝氏溫度，且壓力係大氣壓或接近大氣壓。實施例1 在次優濃度BMP-2與添加SEQ ID ΝΟ·8肽於培養物之下於原成骨細胞內鹼性磷酸酶（ALP )活性的增加。材料和方法：將採自小鼠胎兒顱蓋的原成骨細胞於〇或25毫微克/毫升bmp-2下培養。於此培養系統加入〇、 0.2、0.4、1 ·〇、2.0、和 4·0 // Μ 的 SEQ ID ΝΟ·8 肽，於第〇、第3、和第7天評定八1^的含量。結果：如圖1所顯示者，在用BMP-2和SEQ ID NO. 8 肽處理的組中，於成骨細胞內的ALP活性以劑量相關方式明顯地增加。於2 // M S E Q ID Ν Ο . 8肽處理組中，相較於對照組，ALP活性增加約3倍且與沒有添加肽的BMP-2 處理細胞比較，增加2倍。討論：此等結果證明 SEQ ID N0.8肽明顯地增加 BMP-2正面影響前-成骨細胞成變爲成骨細胞的分化之能 -30- 200800250 (27) 力。實施例2 添加不同劑量的SEQ ID ΝΟ·8肽之下於原hMSC中的 COX2含量之增加材料和方法：於Clonetics hMSC細胞中使用先前所述基因表現微陣列分析評估SEQ ID N0.8肽處理對基因表現之影響（Locklin等人，2001 )。簡單地說，將細胞植入 5個T“ 50排氣燒瓶內，其密度爲ΐ·〇 X 106每燒瓶的生長培養基內，且在3 7 °C培養4 8小時。將裝有單獨媒液或 SEQ ID N0.8的肽（1 000毫微克（ng) /毫升）的燒瓶係於標準分化培養基內培養24小時或48小時。在每一時點 ’將該媒液燒瓶和處理燒瓶予以胰蛋白酶處理（ trypsinized )，區出細胞且透過 Qiagen Rneasy Kit( Qiagen)萃取出總RNA供分析所用。將8微克的總RNA 放大且用生物素標記。將該混合物融合到含有對12,600 人類基因的探針（probe)之U95A人類基因表現微陣列（ Affymetrix)。之後清洗該晶片，用藻紅蛋白-鏈黴抗生物素蛋白(phycoerythrin-streptavidin )染色且用 Affymetrixn掃瞄器讀取。將融合強度値對mRNA頻率計算成分子數每一百萬。強度値的分析係使用 Spotfire Decision Site ( Somerville，ΜΑ)軟體執行。結果：只考慮經由用SEQ ID ΝΟ.8肽處理而有2-倍或更多倍改變的mRNA。在兩時間間隔有改變到此等程度的 -31 - 200800250 (28) 唯一 mRNA爲COX-2 :其在24小時增加3.6 _倍且在48小時增加2.2-倍。討論：此等數據證明該SEQ ID ΝΟ·8肽可增加（達〜3.6-倍）該環加氧酶-2 ( —種***素合成所需的可誘導性酵素）（COX-2 )的mRNA。因此該SEQ ID ΝΟ·8肽具有誘導已知對骨生成具有正面作用的PGE2之可能。實施例3 SEQ ID ΝΟ·8肽對於MC3T3細胞的BMP-2剌激PGE2 產生之強化方法：MC3T3-E1分殖株4細胞爲初生小鼠衍生的具有纖維母細胞形態之顱蓋前成骨細胞。在含有抗壞血酸和無機磷酸鹽之中生長之時，此分殖株展現出高層次的成骨細胞分化。爲此實驗，將該.MC 3 T3細胞在24-洞板中於生長培養基（a MEM + 1 mM丙酮酸鈉 + 10%胎牛血清（ FBS ))以105細胞每洞平板培養。培養24小時後，移除培養基且換上含有試驗物質的檢定培養基（a MEM+1 mM 丙酮酸鈉 + 2% FB S )。每一試驗組使用4個洞。於再培養 24小時之後，移除培養基和且使用 ELISA ( R&D Systems)測定PGE2的含量。結果：該SEQ ID N0.8肽可增加BMP-2誘發PGE2產生如圖2所示者。實施例4 -32- 200800250 (29) 於細胞培養基中添加SEQ ID ΝΟ·8肽時BMP-活化磷酸化S m a d 1、 5、和8在原小鼠成骨細胞內的滯留材料和方法··將採自胎小鼠顱蓋的原成骨細胞在培養系統中有添加0或25毫微克/毫升BMP-2與〇或2 /z Μ 的SEQ ID ΝΟ·8肽之下進行培養。在〇、0.5、1、2、12、 24、48和72小時以西方點漬法（Western blotting )測定 Smad 1/5/8的磷酸化。 φ 結果：在此等條件下，BMP-2可誘發Smad 1/5/8的磷酸化，此可在從0.5至12小時偵測到。對BMP-2的2 // M SEQ ID N0.8肽之添加誘發出延長的Smad 1/5/8磷酸化，此可在自0.5至4 8小時偵測到（圖3 )。討論：此等數據指出SEQ ID ΝΟ·8肽強化BMP-2活性之能力可能至少部份係來自該肽明顯延長該磷酸化 Smad 1/5/8蛋白質的半生期之能力，該磷酸化Smad 1/5/8 蛋白質係BMP-2和其他骨合成代謝劑的信號傳導途徑之 m 整體部份。實施例5 於次最優濃度的 Β Μ P - 2及添加不同濃度的 s E Q ID Ν Ο· 8肽之下對於小鼠顱蓋器官培養檢定法中ρ 〇 ε 2產生之增加方法：顱蓋器官培養業經使用多年以硏究骨生成和骨吸回的調節。此方法相對於活體內硏究的優點在於沒有混淆效應（諸如激素性和機械性影響），意謂著可測定出試 -33- 200800250 (30) 驗物質對骨組織的更直接影響。且也與分離的細胞系統相比較，在不同細胞類型的骨之間及此等細胞與骨基質之間維持著相互關係。簡單的說，從4天大的Swiss Webster小鼠分離出半顱蓋且在鋼網柵格上的培養基中培育。每天於培養基中添力口 SEQ ID NO.8肽（1、10、100微克/毫升）共7天且在第1和第4天處理BMP-2 ( 40毫微克/毫升）對照組。每 φ 曰採取經調理過的培養基樣品供PGE2濃度分析所用（ R&D Systems ELISA kit)。在培養結束之時，使用組織學分析該骨的新骨生成和成骨細胞數目。結果：用SEQ ID ΝΟ·8肽處理的組在PGE2產生（圖 4 )和新骨生成，成骨細胞表面和骨細胞密度等參數上（圖形5 )都有明顯增加。討論：此等結果指出該SEQ ID NO.8肽可增強顱蓋骨器官內所含內源性骨因子之能力（包括BMP-2)以透過增 • 加的PGE2產生機制增加骨生成參數。實施例6 使用含有BMP-2和SEQ ID NO.8肽的可植入式聚合物誘發小鼠背肌內的BMP-2所具骨骼合成代謝活性材料和方法：將含有下列量（參閱下表）的BMP-2 和S E Q ID Ν Ο . 8肽兩者之聚合物小九植入4星期大的IC R 小鼠之背肌膜內。3星期後將該小鼠犧牲和分離出新生成的骨供使用軟X -光照相術和骨礦物質密度測定所用。 -34- 200800250 N-l 0 AC-100 (微克 ) 0 50 250 1250 BMP-2 (微克 ) 5 5 5 5 BMP-2 (微克 ) 3 3 3 3 聚合物 (毫克 ) 30 30 30 30 結果· 如圖6 所示，於小鼠 (ICR) 背肌內植入30 克聚合物（含有5微克或3微克的BMP-2與不同劑量（0 、50、250、或1250微克）的SEQ ID ΝΟ·8肽）之3星期後，以異位小骨的尺寸和礦物質密度評估骨生成量。在使用5微克的BMP-2時該肽的效力不清礎。不過，當使用3 微克的BMP-2時，該肽顯示出對BMP-2效用的明顯增強〇討論：此等數據說明該SEQ ID NO.8肽能明顯地誘發出BMP-2的活體內骨合成代謝作用，特別是在使用次最優劑量的BMP-2之時。序列表 RGDBD(X)nSGZG [B，X，和Z可爲任何胺基酸，n=l〜10]] (SEQ ID ΝΟ·1) RGDND(X)nSGZG [ X和Z可爲任何胺基酸，n=I〜10] (SEQ DD ΝΟ·2) RGDND(X)nSGDG [ X可爲任何胺基酸，η=1 〜10] (SEQ ID ΝΟ·3) RGDNDJJPFSGDG [J可爲任何胺基酸](SEQ Π>Μ)··4) RGDNDISPFSGDG (SEQ ID N0.5) RGDNDMSPFSGDG (SEQ ID N0.6) RGDNDVPPFSGDG (SEQ ID N0.7) TDLQERGDNDISPFSGDGQPFKD (SEQ ID N0.8) 前述只是用以闡明本發明的原理。要瞭解的是熟諳此 •35· 200800250 (32) 技藝者能設計出不同的配置，其雖然不在本文中明確地說明或顯示，不過彼等都能體現本發明的原理且都包括其旨意和範圍之內。再者，本文中所引述的所有例子和條件語言主要係意欲幫助讀者瞭解本發明的原理和發明人所貢獻的槪念以推動技藝，且要理解爲不受此等特別引述的例子和條件所限制。此外，於本文中引述本發明的原理、方面、和具體實例以及其特別例子之所有敘述，意欲涵蓋彼等 φ 的結構和功能兩者的等效物。此外，此等效物理應包括包括現行已知等效物和未來開發出的等效務，即，經開發出可實施相同的功能之任何要件，不論其結構爲何。所以，本發明的範圍不欲受限於本文中所顯示與說明的示範性具體實例。更確切地，本發明的範圍和旨意係由後附申請專利範圍所體現。【圖式簡單說明】 Φ 根據本發明，本發明可自配合所附圖式閱讀的詳細說明部份獲得最佳了解。要強調者，根據常用做法，圖式的各特徵係不按比例繪出。相異地，爲了清晰起見，各特徵的尺寸係經任意地擴大或縮減。於圖式中包括下列圖：圖1爲條形圖’顯示在用次最優濃度的rhBMP-2培養小鼠原級成骨細胞時，於培養物中添加不同濃度的s E Q ID Ν Ο . 8的肽，所得鹼性磷酸酶（A L p )活性的劑量相關性上調。其中a表相對於對照組p<〇.〇5 ; b表相對於只接受BMP-2之組p<〇.〇5 ; c表對所有其他組p<〇〇5。 -36- 200800250 (33) 圖2條形圖，顯示經由用次最優濃度的rhBMP-2加上於培養物中添加的不同濃度 SEQ ID N0.8的肽培養 MC3T3細胞時，***素 E2之劑量相關性產生。圖3係一凝膠的影像，其展現出於不同的時間點得自 MC3T3細胞由西方點漬指出的磷酸化Smads 1、5、和8 ( 總計）的表現。細胞係用次最優濃度的：rhBMP-2於有或無添加SEQ ID N0.8肽之下予以培養。圖4爲一條形圖，說明將顱蓋離析出且用不同劑量的 SEQIDNCK8肽培養時，其PGE2的產生。圖5爲一條形圖，展示出使用 SEq ID NO.8肽或 rhBMP-2培養的小鼠顱蓋器官培養物的中之多種骨參數諸如新骨體積、在骨組織內的細胞密度、和成骨細胞表面。圖6顯示條形圖和影像，其表出在小鼠背肌中植入包括rhBMP-2和不同劑量的SEQ ID ΝΟ·8肽之聚合物之時，該小鼠背肌內生成的放射照片（指示出新的鈣化組織/骨 )’其中a表相對於未有AC-100之組p<〇.〇5。（時間點 -37-

Claims

200800250 (1) 十、申請專利範圍 1· 一種調和物，包其括：一藥學上可接受的載劑；一第一肽，其包括1 0至50胺基酸殘基，具有胺基酸序歹[]RGDBD(X)nSGZG(SEQIDN0.1)，其中 B、X、和Z可爲任何胺基酸殘基且n爲在1與ί 〇之間的任何整數；和 φ 一第二肽，其係選自包括下列的群組：轉化生長因子 (TGF )、骨成形蛋白（BMP )、表皮生長因子（EGF ) 、上皮細胞生長因子（ECGF )、纖維母細胞生長因子（ FGF )、血小板衍生生長因子（PDGF )、似胰島素生長因子（IGF )、和似胰島素生長因子結合蛋白（1〇?8卩）。 2 ·如申請專利範圍第1項之調和物，其中該載劑爲可吸收性的膠原蛋白海綿（AC S )。 3 .如申請專利範圍第1項之調和物，其中該載劑爲 Φ 可注射的載劑。 4. 如申請專利範圍第2項之調和物，其中該第二蛋白質爲骨成形蛋白（BMP)。 5. 如申請專利範圍第4項之調和物，其中該BMP係重組人類骨成形蛋白-2 ( rhBMP-2)。 6 ·如申請專利範圍第1項之調和物，其中z爲d且 B爲N。 7.如申請專利範圍第6項之調和物，其中“ η”爲選自2、3、4、5、或6之整數。 38- 200800250 (2) 8. 如申請專利範圍第6項之調和物，其中η爲4。 9. 如申請專利範圍第8項之調和物，其中該X 4的胺基酸序列爲JJPF其中J可爲任何胺基酸。 1 〇.如申請專利範圍第9項之調和物，其中該的胺基酸序列係選自IS、MS、或VP。 1 1 .如申請專利範圍第5項之調和物，其中該第一肽具有胺基酸序歹丨J TDLQERGDNDISPFSGDGQPFKD ( SEQ ID • NO.8 )。 12.如申請專利範圍第1項之調和物，其中該第一和第二蛋白質的含量爲使得彼等在一起可上調和活化硬組織生成細胞中的環加氧酶-2 ( COX-2 )且增加由硬組織生成細胞的***素E2 ( PGE2 )之產生。 1 3 .如申請專利範圍第1項之調和物，其中該第二肽對該第一肽的比例係在1:5或更大的範圍之內。 1 4 . 一種套組，其包括： φ 一藥學上可接受之載劑；一預-量過的量之一第一肽，該第一肽包含10至50 個胺基酸殘基，且具有一胺基酸序列的 RGDBD ( X ) nSGZG ( SEQ ID NO.l )，其中B、X、和Z可爲任何胺基酸殘基且η爲在1與1 0之間的任何整數；一預-量過的量之一第二肽，其係選自包括下列之群組：轉化生長因子（T G F )、骨成形蛋白（Β Μ Ρ )、表皮生長因子（EGF)、上皮細胞生長因子（ECGF)、纖維母細胞生長因子（FGF )、血小板衍生生長因子（PDGF )、 -39- 200800250 (3) 似胰島素生長因子（IGF )、和似胰島素生長因子結合蛋白（IGFBP);和一說明件，說明該載劑、第一肽和第二肽之組合和投予。 1 5 ·如申請專利範圍第1 4項之套組，其中該載劑爲可吸收性膠原蛋白海綿（AC S )。 1 6·如申請專利範圍第1 4項之套組，其中該載劑係 φ 與該第一和第二肽分開包裝。 1 7 .如申請專利範圍第1 4項之套組，其中該第二蛋白質爲BMP。 1 8 .如申請專利範圍第17項之套組，其中該81^?爲重组人類骨成形蛋白_2 ( rhBMP-2)。 1 9 ·如申請專利範圍第1 4項之套組，其中Z爲D且 B爲N 〇 20·如申請專利範圍第1 9項之套組，其中“ η”爲選 φ 自2、3、4、5、或6之整數。 2 1 ·如申請專利範圍第1 9項之套組，其中η爲4。 22.如申請專利範圍第21項之套組，其中該Χ4的胺基酸序列爲J J P F其中J可爲任何胺基酸。 23·如申請專利範圍第22項之套組，其中該JJ的胺基酸序列係選自IS、MS、或VP。 2 4.如申請專利範圍第1 8項之套組，其中該第一肽具有胺基酸序列 TDLQERGDNDISPFSGDGQPFKD ( SEQ ID NO.8)。 -40 - 200800250 (4) 25·如申請專利範圍第14項之套組，其中該第一和第二蛋白質的含量爲使得彼等在一起可上調和活化硬組織生成細胞中的環加氧酶-2 ( COX-2 )且增加由硬組織生成細胞的***素Ε2 ( PGE2 )之產生。 26.如申請專利範圍第1 4項之套組，其中該第二肽對該第一肽的比例係在1 : 5或更大的範圍之內。

-41 - 200800250 序列表 <110> LAZAROV, MIRELLA MIDDLETON-HARDIE, CATHERINE ROSEN, DAVID <120>促進硬組織生成的蛋白質調合物 <130> BEAR-012TW <150> 60/805,201 <151> 2006-06-19 <150> 60/803,327 <151> 2006-05-26

<150> 60/747,255 <151> 2006-05-15 <150> 60/747,143 <151> 2006-05-12 <150> 60/700,518 <151> 2005-07-18 <160> 8 < 17 0〉用Windows 版本4.0的FastSEQ <210> 1 <211〉 10 <212> PRT <213>人類 <220> <221>變異體 <222> (6)...(6) <223> Xaa可爲自^10個胺基酸長 <220> <221〉變異體 <222> 4, 6, 9 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 1 Arg Gly Asp Xaa Asp Xaa Ser Gly Xaa Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213>人類 <220〉 <221>變異體 <222> (6)...(6) <223〉xaa可爲自1至i〇個胺基酸長 <220> <221〉變異體 200800250 <222〉 6, 9 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 2 Arg Gly Asp Asn Asp Xaa Ser Gly Xaa Gly 15 10 <210> 3 <211〉 10 <212> PRT <213〉人類 <220> <221〉變異體 <222> (6)...(6)

<223> Xaa可爲自1至10個胺基酸長 <220> <221>變異體 <222> 6 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 3 Arg Gly Asp Asn Asp Xaa Ser Gly Asp Gly 15 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213>人類 <220> <221〉變異體 <222> 6, 7 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 4 Arg Gly Asp Asn Asp Xaa Xaa Pro Phe Ser Gly Asp Gly 15 10 <210> 5 <211〉 13 <212> PRT <213>人類 <400> 5 Arg Gly Asp Asn Asp lie Ser Pro Phe Sex Gly Asp Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 13 .<212> PRT 〈213〉人類 <400> 6 Arg Gly Asp Asn Asp Met Ser Pro Phe Ser Gly Asp Gly 1 5 10 200800250 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213〉人類 <400> 7 Arg Gly Asp Asn Asp Val Pro Pro Phe Ser Gly Asp Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 23 <212> PRT <213〉人類 <400> 8

Thr Asp Leu Gin Glu Arg Gly Asp Asn Asp lie Ser Pro Phe Ser Gly 1 5 10 15 Asp Gly Gin Pro Phe Lys Asp 20

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