TW200800250A - Protein formulation for promoting hard tissue formation - Google Patents
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Description
200800250 (1) 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係槪括地關於有二或更多種肽和載劑的用於處 理硬組織之調和物和套組。 【先前技術】 有大量文件證明,以全世界之觀點,骨組織疾病會引 起許多明顯的健康問題。因爲有此等骨疾病的健康問題, 許多的努力已付諸於開發骨疾病所用的新治療劑。 例如,有數種生長及/或分化因子係已知會影響骨骼 、軟骨、和牙齒組織者。此等中有許多業經評定過彼等對 於加速或變更此等組織中的缺陷痊癒之能力。此等因子包 含下列分子:屬於轉形生長因子(T GF )和骨成形蛋白( bone morphogenetic protein ) (BMP)族以及上皮生長因 子(EGF),上皮細胞生長因子(ECGF ),纖維母細胞生 長因子(FGF),血小板衍生生長因子(PDGF),似胰島 素生長因子(IGF ),和似胰島素生長因子結合蛋白( IGFBP)等族。 雖然許多此等因子係已知會促進成骨細胞的增殖、分 化、成熟、或礦質化作用,不過,開發此等因子作爲新穎 治療法的企圖都因彼等缺乏組織特異性而到限制。此等因 子的投藥會影響到骨骼組織以外的組織,其可能導致不良 的活性。 例如,rhBMP-2對軟組織的投予(如皮下注射)會引 200800250 · (2) 起軟組織中的新骨迅速生成。此回應的結果_ 的使用受到限制且需要僅慎應用以防止在非所 鈣化。 使用上述生長及/或分化因子作爲治療劑 制爲製造成本。該等因子皆爲由重組DNA方 白質’需要大規模的發酵或細胞培養程序。此 造方法需要高度專化設施,此進一步增加製造 • 果’製造成本會轉嫁到使用此等產品的非常昂 之中。 例如,含有BMP族分子的可局部植入式 綿已用爲脊椎融合治療所用的醫療裝置。不過 序的成本已經對其可使能受益於此類型治療的 性施加限制。 因此,對於可明顯降低治療成本的新療法 持續的興趣存在。特別有用者爲一種新穎的可 • 療劑所需劑量之療法。 再者,除了 BMP族中者以外的生長因 TGF、PDGF、EGF、FGF、和 IGF 等族中者, 作爲潛在的治療劑。可以降低現行生長因子治 有效劑量和治療成本之其他生長因子的利用對 的矯形外科和相關醫療體及患者都具有極大價 【發明內容】 本發明係有關調和物及/或套組,用以生 ;,r h Β Μ P - 2 欲部位中的 用的另一限 法製造的蛋 外,此等製 成本。其結 貴治療成本 膠原蛋白海 ,使用此程 患者之利用 之開發都有 降低現有治 子,諸如在 應予以探究 療劑療法的 於適用彼等 値。 成或再生新 -6 - 200800250 (3) 硬組織如骨、軟骨、及/或牙齒組織。該調和物包括第一 種肽,其可增強第二肽的活性。更特別者,該第一肽可增 強第二肽的生物學活性及/或治療效用,該第二肽可爲一 種硬組織生長因子及/或分化因子。該第一肽和第二肽可 在單一調和物內。或者,該第一肽和第二肽可在實質相同 的時間或以任一順序依序地投予。該第一肽和第二肽可實 質相同的量或彼此相對的不同比例存在於調和物內或投予 〇 該第一肽包括1 〇至15胺基酸,具有胺基酸序列 RGDBDXnSGZG、且其中的B、X、和Z皆爲選自任何胺 基酸殘基而η係一在1與10之間的整體(SEQ ID NO:3) 。該第一肽(例如SEQ ID ΝΟ·8的肽)係以一量投予以增 強選自涉及在硬組織生成的細胞之分化、增殖、成熟、和 礦質化作用中的第二肽之特徵。 該第二肽(例如rhBMP-2 )可爲屬於轉形生長因子 (TGF-/3 )族的一種生長因子。該TGF-/3可屬於骨成形 蛋白(BMP )。 該第一肽和第二肽的特別例子皆提供於此。該二種肽 可於一單一調和物內投予且該調合物可包括等量或不同比 例的該第一和第二肽。更特別的,本發明調和物可包含一 藥學上可接受之載劑(例如一種可吸收的膠原蛋白海綿( A C S ))和該二種蛋白質,其中該第一蛋白質係選自下列 之中的蛋白質: RGDBD ( X) nSGZG [B、X、和Z可爲任何胺基酸, 200800250 (4) n=l 〜10] ] ( SEQ ID NO.l ) RGDND ( X ) nSGZG [X和 Z可爲任何胺基酸, n=l 〜10] ] ( SEQ ID NO.2 ) RGDND ( X) nSGDG [X可爲任何胺基酸,n=i〜i〇]] (SEQ ID NO.3 ) RGDNDJJPFSGDG [J 可爲任何胺基酸](SEQ ID N0.4) RGDNDISPFSGDG ( SEQ ID NO.5) RGDNDMSPFSGDG ( SEQ ID NO.6) RGDNDVPPFSGDG ( SEQ ID NO.7) TDLQERGDNDISPFSGDGQPFKD ( SEQ ID NO.8) 且該第二蛋白質係選自屬於轉形生長因子(TGF )和 骨成形蛋白(BMP)族(例如rhBMP-2)以及上皮生長因 子(EGF )、上皮細胞生長因子(ECGF )、纖維母細胞生 長因子(FGF )、血小板衍生生長因子(PDGF )、似胰島 素生長因子(IGF)、似胰島素生長因子結合蛋白( IGFBP)等族。 本發明的一方面係肽如rhBMP-2,其爲十分昂貴者, 且經由組合此等肽與本發明的第一肽(例如一種SEQ ID N0.8的肽),可降低rhBMP-2的投予量,同時獲得比投 予較大量rhBMP-2而不用第一肽時,實質同樣的所欲治療 結果。該第二肽可爲市售重組人類骨成形蛋白-2 ( rhBMP-2 ),其可在市售型I牛可吸收性膠原蛋白海綿(ACS )如 由 Integra LifeScience,Plains boro, NJ 銷售 Helistat® 之 上。該調和物的第一肽可爲SEQ ID NO.8之肽,其可不昂 200800250 (5) 貴相當大量地製造。因此,雖然第一和第二肽可用相量或 不同量投予,不過有經濟理由要以相對於該第二肽相當較 大的量投予該調和物的第一肽。相對於製造SEq ID NO. 8 的肽之成本,肽如rhBMP-2製造起來係非常昂貴者。據此 ’如果該第一肽係一種如SEQ ID N0.8的肽且該第二肽係 一種諸如骨成形蛋白-2 ( rhBMP-2 )之肽,則該第二肽對 該第一肽的比例可爲與只用相同量的該等肽中之一種相比 • 可獲得改良結果之任何比例。不過,因爲該第二肽如 i:hBMP-2比該SEQ ID ΝΟ·8的肽實質上更昂貴,因此有經 濟理由要求使用二種肽於一調和物中之時,要使得該第一 肽諸如SEQ ID ΝΟ·8的肽之含量相對於該第二肽如 rhBMP-2較爲大。假設比例中的第一個數子代表該第一肽 如SEQ ID ΝΟ·8的肽,且第二數字代表第二肽如rhBMP-2 的量,則可造出該調和物,其中第一肽對第二肽的比例爲 1: 1或更大者,且該比例可擴大至1: 5,00 0且可能更大 馨 。也可以使用中間量的比例諸如1 : 2至1 : 5,0 0 0之中者 。其他比例如 1 : 5、1 : 10、1 : 5 0、1 : 2 0 0、1 : 3 0 0、1 :5 0 0,都可以使用和熟諳此技藝者皆能在一特別情勢和 配方內,從以最經濟的成本獲得最多治療效用的論點輕易 地決定所欲比例。一種蛋白質或肽對另一種的比例係以該 調和物中所用蛋白質或肽的重量爲基準。 本發明的一特別例子係一種調和物,其經特別地設計 以促進硬組織生成和再生。該調和物可包括一種藥學上可 接受之載劑如可注射的載劑,其內具有本發明的第一蛋白 -9 · 200800250 (6) 質和第二蛋白質。更特定言之,該調和物可包括一種藥學 上可接受之載劑(其可爲一種ACS或可注射的載劑)’ 一具有SEQ ID ΝΟ·8的第一蛋白質和rhBMP-2形式的第二 蛋白質。該第一蛋白質和第二蛋白質可爲等量或以任何不 同的比例(包括上述者)存在。另外,雖然本文中所述特 別的調和物包含單一第一蛋白質和單一第二蛋白質,不過 要理解者,可以將來自每一組的多種蛋白質包含在一調和 φ 物之內或可分開地投予,同時地或於不同時間依序地。 本發明的一方面爲經由包含本發明的第一肽,可用低 於要(以其本身)提供一治療結果所預期的量之量投予第 二肽。如此,可以經由將藥學上可接受之可注射載劑組合 一 SEQ ID ΝΟ·8的肽和rhBMP-2而製備調和物,其中 rhBMP-2的量爲在不含SEQ ID NO.8的肽時無治療效用之 量。 本發明揭示一種促進生成或再生新硬組織諸如骨骼、 φ 軟骨、及/或牙齒組織的生物學程序之方法,其中該方法 可在比單獨使用rhBMP-2實質減低的成本下實施。更特定 言之,本發明係一種增強硬組織生長和分化因子所具生物 學活性之方法,其特徵爲可以使對該硬組織生成細胞的增 殖、分化、成熟及/或礦質化作用起重要作用的細胞內酵 素和訊息傳遞分子予以特異性和選擇性上調( upregulation )及/或滯留時間的延長。本發明提供醫療團 體一種治療硬組織疾病和改良現行使用作業的效力之方法 。此方法也預期可以導致對患者一明顯減低的成本。經由 -10- 200800250 (7) 投予可爲諸如SEQ I D NO· 8的蛋白質之第一蛋白質,可 降低第二蛋白質如rhBMP-2的量且仍然可獲得在投予最優 濃度的rhBMP-2時所獲得之所欲治療效用。 本發明的另一方面係一種用於投予患者之套組。此套 組可包含針對如何組合和投予該等成分之說明。該等成分 可包含一藥學上可接受之載劑。該載劑可爲一可注射的載 劑或其可爲一種可植入式可吸收性的物質如一可植入式可 φ 吸收性海綿包括類型I牛可吸收性膠原蛋白海綿(AC S ) 。另外,該套組可包含預-量過且包裝的量之第一肽,其 可爲本文中所述及的任何第一肽包括SEQ ID NO.8的第一 肽。該套組可進一步包括一第二肽,其可爲本文中所述及 的任何第二肽,其可包括rhB MP _2。該套組可包含多種不 同形式的第一肽。另外,該套組可包括多種不同形式的第 二肽。於一形式中,該套組包括分開包裝的諸成分:呈可 吸收性膠原蛋白海綿形式的載劑,一 S E Q ID Ν Ο · 8的第一 φ 肽和一第二肽(其係rhBMP-2 ),其中SEQ ID NO.8的肽 和rhB MP - 2的含量皆爲量過的量,其比例爲能以經濟上有 利的方式獲得所欲治療效用者。 本發明此等和其他目的、優點、和特徵可由熟諳此技 藝者於硏讀要於下面更完整說明的本發明細節之後變得明 顯。 發明之詳細說明 在說明本發明方法和調和物之前,要瞭解者,本發明 -11 - 200800250 (8) 不限於所述及的特別具體實例,因此等係,當然,可能變 異者。也要瞭解者,本文中所用的術語只用於說明特別具 體實例之目的,且無意具有限制性,因爲本發明範圍只受 後附申請專利範圍所限制之故。 在提供一範圍的値之時,要瞭解,除非文中另有清楚 的不同表明,否則也特定地揭示出在該範圍的上限値與下 限値之間的每一介中値,精確到該下限値單位的十分之一 φ 。在一所述範圍內的任何所述値或介中値與該所述範圍內 的任何其他値或介中値之間的較小範圍都涵蓋於本發明之 內。此等較小範圍的上限値和下限値可獨立地包括在該範 圍之內或排除於該範圍之外,且其中該兩限値中的任一者 、非任一者或兩者都包括在於該較小範圍內之每一範圍也 涵蓋於本發明中,受在該所述範圍內經任何特定地排除之 限値所管制。在該所述範圍包括一或兩限値之情況中,排 除此等所包括限値中的任一者或兩者之範圍也包括於本發 φ 明中。 除非另有不同的定義,否則本文中所使用的所有技術 性和科學性術語都具有對本發明所屬技藝具有一般技巧的 人士普遍所知的相同意義。雖然類似於或等同於本文中所 述者之任何方法和物質都可用於本發明的實作或試驗中, 不過至此要說明某些潛在和較佳的方法及物質。本文中所 提及的所有出版物都以引用方式納入本文中以揭示和說明 與所引述的出版物相關的方法及/或物質。要瞭解的是本 揭示內容係超越所引述出版物的任何揭示到有牴觸之程度 -12- 200800250 ⑼ 必須特別提及者,於用在本文和後附申請專利範圍中 之時,單數術語“一 ”(“a”、 “an”、和“the”)係包含複數 的指稱,除非該文中另有清楚地不同表明。因此,例如, 對“ 一蛋白質”的指稱係包括複數種此等蛋白質且對“該肽 (the peptide) ”的指稱係包括一或多種肽和熟諳此技藝者 所知的其等效物,等。 本文中討論到的出版物係僅提供在本申請案申請日期 之前的彼等之揭示。其中沒有要理解爲本發明不認定此等 出版物爲早期先前發明者之承認。進一步地,所提出版物 的曰期可能不同於實際的出版日期,此可能需要獨立地確 認者。 定義 術語“治療” (“ treatment”、“treating”及類似者) φ 於本文中係用以說明獲得所欲藥物學及/或生理學效用, 該效用係對硬組織生成、再生、生長及類似者之效用。該 作用可就完全或部份預防硬組織流失而言爲預防性者及/ 或可就部份或完全地治癒可歸因於硬組織損失的不利症狀 而言爲治療性者。據此,“治療”在用於本文中之時,意 欲涵蓋治療哺乳動物且特別是人類,包括: (a )防止一疾病或狀況之進展,其方式爲防止硬組 織的進一步流失或硬組織的進一步加速流失; (b )抑制一疾病或狀況,即停止會導致硬組織損失 13- 200800250 (10) 的狀況;及/或 (C )減輕一疾病或狀況,從而引起該疾病或狀況的 消退且因此促進硬組織生成,再生及/或生長。經由實施 本發明,可增強涉及在硬組織生成中的細胞之分化、增殖 、成熟及/或礦質化作用。 術語“協同”,“協同作用”及類似者於用於本文中 係說明經由組合投予一或多種蛋白質所得改善的治療效用 φ 。雖然在某些領域中,協同作用意指超過加成性之效用( 例如1 + 1 =3 ),不過於許多關於骨疾病的領域中,可將加 成性(1 + 1 =2 )或甚至低於加成性(1 + 1 = 1 · 6 )得效用解讀 爲協同性。例如,吾人不能僅經由將二種已知各具50%治 療效用之醫藥加在一起來治療任何骨疾病就要獲得1 〇〇% 的治療效用。例如,在某些情況中,將兩種成分加在一起 事實上可能具有負作用且得到比使用任一藥物本身時較不 合意之結果。另外,如用於本文中者,協同意指一種成分 φ (例如rhBMP-2 )在與第二成分(例如SEQ ID ΝΟ·8 )組 合時可以較低量地使用而仍然可獲得如同該rhBMP-2成分 於較大含量時之相同合意效用。如此,就本發明而言,經 由組合第一蛋白質如具有SEQ ID NO. 8者與第二蛋白質諸 如r h Β Μ P - 2,可以減低獲得所欲治療結果所需的r h Β Μ P - 2 用量。該減低可能爲相比於沒有投予第一蛋白質之下獲得 所欲結果所需劑量的10%、20%、50%、75%或更多。針對 本發明調和物之經濟價値而言也可獲得協同作用。例如, 當使用非常大量的第一蛋白質諸如SEQ ID ΝΟ.8之蛋白質 -14 - 200800250 (11) 之時,可使用非常小量的第二蛋白質諸如rhBMP-2。因爲 該rhBMP-2製造起來比SEQIDNO.8蛋白質實質上更昂貴 ,所以即使得到在實質相同的治療結果,也可得到協同經 濟結果。例如,當使用大量的第一蛋白質諸如SEQ ID NO. 8蛋白質之時,第二蛋白質的量可爲在沒有SEq id ΝΟ· 8第一蛋白質中得到所欲治療效用所需劑量的一半或 更低,十分之一或更低或甚至於百分之一或更低。 φ 術語“同時”和“依序”就投予本發明調和物而論, 於本文中係用於意指在考量正常的醫學程序和獲得的結果 之下,該第一蛋白質和第二蛋白質可於準確地相同時間投 予或先後投予。如此,“同時”可意指該二種成分係存在於 單一調和物之內或彼等係在相同治療點投予。“依序”可 意指彼等係從相同注射筒或從不同的注射筒先後依序地投 予。重要者在於該第一肽和第二肽的投予方式爲使得該第 一肽和第二肽就所求所欲治療而言可以有生理上交互作用 • 之機會。 發明通論 本發明調和物係製造供增強硬組織生成所用之調和物 。該調和物爲可植入式如在作爲載劑的可吸收性膠原蛋白 海綿上者或爲包括藥學上可注射的載劑之可注射的調和物 。該調和物可包括一、二或更多種蛋白質。在一具體實例 中,該調和物可包括一第一蛋白質,其係由SEQ ID NO: 1 通用序列所涵蓋;與所組合的第二蛋白質,其係選自屬於 -15- 200800250 (12) 下列之分子轉形生長因子(TGF )和和骨成形蛋白(BMP )族(包括rhBMP-2 )、以及上皮生長因子(EGF )、上 皮細胞生長因子(ECGF )、纖維母細胞生長因子(FGF ) 、血小板衍生生長因子(PDGF)、似胰島素生長因子( IGF )、與似胰島素生長因子結合蛋白(iGFBP )族。 本發明的調和物可包括載劑和唯一的蛋白質(例如 SEQ ID N0.8 )且可能包含在一套組內,該套組內也含有 φ 預量過量的第二蛋白質(例如rhBMP-2 )且與藥學上可接 受之載劑(其可爲一種可吸收性膠原蛋白海綿(A C S )或 可注射的載劑)包裝在一起。該二種蛋白質可包裝在一起 供同時和依序投藥所用。本發明調和物或套組可經設計成 爲可獲得所欲治療結果同時使該套組或調和物中的第二蛋 白質之量減到最少之方式。因爲第一蛋白質諸如SEQ ID NO.8蛋白質製造起來相對不貴而第二蛋白質(例如 rhBMP-2 )則十分昂貴,所以熟諳此技藝者都可察覺者, φ 調和以包括大量的第一蛋白質和小量的第二蛋白質之舉可 以高經濟第提供所欲治療結果。 該第二蛋白質可爲市售重組人類骨成形蛋白_2 ( rhBMP-2 ),其可在如由 Int e gr a Li f e S ci en c e , P1 ai n sb o r 〇, NJ銷售的Helistat®之市售型I牛可吸收性膠原蛋白海綿 (ACS )之上。 於此專利申請案中的本發明係有關一種增強生長及/ 或分化因子的活性之方法,彼等因子爲已知可促進硬組織 生成細胞系(包括但不限於成骨細胞、生齒細胞、成釉細 16- 200800250 (13) 胞、和牙骨質母細胞)的增殖、分化、分劣、和細胞的礦 質化作用中之一或多者,且從而促進新硬組織細胞生成。 在本發明一特別具體實例中,本發明方法可特異地增 強該分化因子的活性且常可促進硬組織生成細胞的分化、 成熟、及/或礦質化作用中之一或多者。 該方法的特徵在於經由使用一種含有由SEQ ID NO.1 所槪括地定義的胺基酸序列之肽。經發現者,經由添加肽 φ 於一種試管內或活體內骨骼組織生成系統中,由硬組織生 長及/或分化因子所促進的硬組織生成可獲得明顯地增強 且可明顯地減低此等因子所需之量。進一步地,在硬組織 生長及/或分化因子與含有SEQ ID NO.l的肽之間的此種 明顯協同作用對硬組織係具高選擇性者。換言之,由該含 SEQ ID ΝΟ·1的肽所得獨特增強作用預期之出現於經指定 變成硬組織之組織中。 此預料外且明顯的發現提供醫學團體一種改良的治癒 φ 硬組織缺陷之方法。此種肽的使用可減少該等生長及/或 分化因子要施發最大活性所需的量,從而明顯地降低整體 治療成本。 任何含SEQ ID NO .1的肽都可用廣用的肽化學合成方 法予以製造且其成品成本都可明顯地低於重組生長及/或 分化因子。 此外,因爲該含SEQ ID NO· 1的肽之生物學活性化係 只在硬組織環境中表現,所以即使其他生長及/或分化因 子在彼等的投藥方法上可能有某些限制,該肽對有需要的 -17- 200800250 (14) 對象之投藥途徑都沒有限制。換言之,該含SEQ ID NO· 1 的肽視治療程序而定可以用多種方式調和及投予。 本發明的另一特性點爲經由添加該含SEQ ID NO. 1的 肽,可以明顯地上調環加氧酶-2 ( COX-2 )在硬組織生成 細胞諸如成骨細胞、生齒細胞、成釉細胞、和牙骨質母細 胞之中的表現和活性。COX-2的此種明顯上調係在添加該 含SEQ ID NO.l的肽之後以劑量相關方式觀察。 # 再者,此等硬組織生成細胞的***素E2 ( PGE2 ) 產生可由此方法予以明顯地上調。 已知者,PGE2可促進硬組織生成細胞的增殖。所以 ,PGE2於硬組織生成細胞中的局部上調係合乎所需者。
Nagel等人證明SEQ ID N0.8肽,其也稱爲AC-100 且已經在多重硬組織治療的第II期(Phas e 11 )臨床發展 中,可上調人類間葉幹細胞中的 COX-2 ( Journal of Celluar Biochemistry,2004) 〇 % 此外,Middleton-Hardie 等人已證明該 SEQ ID NO.8 的肽可在顱蓋器官培養檢定法中以劑量相關方式上調 PGE2 的產生(27th Annual Meeting of the American Society for Bone and Mineral Research 2005,付印中)。 也經證明,某些硬組織生長因子如BMP會增加由成骨細 胞的PGE2產生。 不過,當該含SEQ ID N0.1的肽係與次最優濃度的 rhBMP-2 —起使用之時,其單獨時僅邊際地上調COX-2或 PGE2,隨著該含 SEQ ID N0.1的肽之添加,COX-2或 -18- 200800250 (15) PGE2中任一者都以該肽的劑量相關方式明顯地上調。 例如,該SEQ ID N0.8的肽單獨添加到培養中的人類 間葉幹細胞中之時不能導致PGE2的明顯增加。由於PGE2 的增強係發生在器官培養中及有rhBMP-2存在(即使爲次 最優濃度)之時,因此咸信該SEQ ID NO.8肽係經由實質 地增強該rhBMP-2的分化活性而起作用(不論係外源地增 加或在骨中局部地產生或由骨細胞產生)。 φ Smad分子。(1〜8 )係已知在TGF-β和BMP族的成員 之細胞內信號傳導上起重要作用者。在硬組織生成細胞中 ,Smad 1、5、和8係已知可經由分化因子如BMP族分子 予以活化。Smad分子的此等活化可透過在刺激後10-20 分鐘內發生的磷酸化事件予以觀察。典型地,此等經磷酸 化Smad分子的滯留時間係短暫存留者,通常在細胞的起 始刺激後約0.5至12小時之內消失。 骨生成細胞,如MC3T3細胞用rhBMP-2和含SEQ ID Φ NO. 1肽兩者予以刺激後,細胞內Smad分子(特別是 Smad 1、5、和8 )即經磷酸化且保持磷酸化長達48小時 。此強烈地推斷出含SEQ ID N0.1肽具有能力來延長該硬 組織生成細胞的活性且藉此增強硬組織生成。 在該硬組織生成的增強與磷酸化Smad分子的滯留時 間延長之間的此種相關性係極有益於設計或鑑定一可增強 硬組織生成的新穎分子。熟諳此技藝者都能建立一鑑定系 統以觀察在硬組織生成細胞內的磷酸化Smad分子的滯留 時間且用以篩選一可刺激硬組織生成之新穎化學實體。 -19- 200800250 (16) 能延長硬組織生成細胞內磷酸化Smad分子的滯留時 間之任何化合物及使用篩選系統評估硬組織生成細胞內磷 酸化Smad分子的滯留時間以鑑定此等化合物之方法都在 本發明範圍之內。 已知者,BMP在投予或植入哺乳動物時會引起骨生成 。在給予適當遞送媒劑時該活性可能增強。如實施例6中 指出者,在將含有5微克或更高量rhBMP-2的包括聚乳酸 φ ( PLA ),聚乙二醇(PEG)、和連結質(DX)的聚合物 植入小鼠背肌內之約20天後,新骨組織即局部生成。用 較低的、次最優劑量的rhBMP-2,有極微的或沒有骨生成 。特別地,於使用3微克劑量時的情況中,相較於5微克 劑量的投藥,有實質較低的骨生成。 將不定量的SEQ ID NO.8肽添加於含有次最優劑量, 3微克的rhBMP-2,之聚合物中。不過,如圖3所指出者 ,當添加一劑量的 SEQ ID N0.8肽於次最優劑量的 φ rhBMP-2中之時,於骨生成上會有明顯且劑量相關性增加 。當給予5 0微克/毫升或更高時,新骨生成的程度係相似 或優於使用最優劑量rhBMP-2時生成的骨量。 於使用不同的具有由SEQ ID NO.l所界定的胺基酸序 列之肽之時的相同實驗中得到同等或可比較的結果。 此等活體內結果清楚地推斷出含SEQ ID NO. 1肽可在 其與rhBMP-2用於晡乳動物中生成新骨之時明顯地降低 rhBMP-2的需要量。rhBMP-2需要量的此種明顯減低,因 爲有較低的成本及較低的來自較高劑量rhBMP-2所致異位 -20- 200800250 (17) 鈣化之風險,所以極有利於醫學實作。 由於硬組織生成細胞係在相同譜系中,因此於牙齒硬 組織諸如齒質、琺瑯質、和牙骨質,彼等係由生齒細胞、 造釉母細胞(ameroblasts )、和成牙骨質母細胞分別地生 成,等之中也預期有相似的協同作用。 該含SEQ ID N0.1肽於上述硬組織生成目的之共同-使用不限於只與BMP族分子一起使用。當該肽與其他硬 φ 組織生長因子或分化因子包括但不限於)屬於TGF族( BMP 族係其一部份),EGF、PDGF、FGF、IGF、和 IGFBPs等一起使用時,可預期有相似效用。 本發明中所用的肽係由彼等含有的由SEQ ID NO.1所 表特別胺基酸序列所界定。該肽可爲近似1 0至50胺基酸 之尺寸,係由彼等所含由SEQ ID NO.l所表胺基酸序列估 計。用於本發明中之肽不一定要爲線性肽,而可爲環狀或 分枝肽。含有本發明序列單位之串聯序列的長於5 0胺基 • 酸之肽也在本發明範圍內。含有SEQ ID NO. 1的肽之多聚 體也在該範圍之內。此等多聚體可爲二聚體(dimers )、 三聚體(trimers)、四聚體(tetr amer s )、五聚體( pentamers )、六聚體(hexamers )、七聚體(heptamers )、八聚體(octamers )、九聚體(nonamers )、十聚體 (decamers )、等。 本發明肽之最小尺寸具有RGDBDXSGZG胺基酸序列 ,其中B、X、和Z可爲任何胺基酸。含有Seq ID N0.4 通式胺基酸序列的肽展現出對本發明目的而言比其他序列 -21 - 200800250 (18) 更高的生物學活性而SEQ ID NO·8展示出最高活性。 S EQ ID Ν 0.5和8分別等於已知的稱爲基質細胞外磷 酸糖蛋白(MEPE)的人類蛋白質所含胺基酸序號247-259 和 242-264。SEQ ID N0.6 爲人類序歹[j SEQ ID ΝΟ·5 獼猴 之同源物(orthologue) 。SEQ ID NO.7係相同部份的嚅 齒動物(通常介於小鼠與大鼠之間)同源物。所有此等 MEPE同源物都含有在SEQ ID N0.1範圍內的序列,彼等 以同等方式促進硬組織生成細胞的增殖、分化、成熟、和 礦質化。 槪要而言,本發明呈出一種促進或增強新硬組織生成 之方法,提供一包括約1 〇至5 〇個胺基酸,含有由S E Q ID NO. 1具體指定的胺基酸序列之肽。此肽降可減低需要 促進有效新骨生成所需的骨分化及/或生成因子(例如 rhBMP-2 )之量。進一步硏究推斷此可能經由包括將已知 涉及在負責骨生成的信號傳導路徑中的經特定磷酸化 Smad分子所具壽命予以延長之機制而發生。 套組 根據本發明的套組包括一或多種在商業上通常與 rhBMP-2關聯用到的類型之可吸收性膠原蛋白海綿。該海 綿含有第一蛋白質如SEQ ID N0.8肽的溶液和一種分開的 谷器’其中裝有第一蛋白質如rhBMP-2。於該套組的另一 形式中,該第一蛋白質(如SEQ ID N0.8肽)和第二蛋白 質(如rhBMP-2 )係裝在相同的容器之內。將兩種蛋白質 22- 200800250 (19) 包括在不同的容器之內的優點在於若該二種容器的擱置壽 命不相同之時,當只有一者的擱置壽命到期時,可不必將 兩個容器都丟棄。另外,該套組可經設計成使得該可吸收 性的膠原蛋白海綿或多個綿該都具有恰當的尺寸以從裝有 第一和第二肽的一或兩個容器吸收該量的溶液。更進一步 者,該第一和第二肽可包括於分開的容器之內或以所欲比 例諸如上述比例混合在一單一容器之內。如先前指出者, φ 此等比例通常係提供相當大量的第一蛋白質(如SEQ ID ΝΟ·8肽)和相當少量的第二蛋白質(如rhBMP-2 )。 骨成形蛋白 本發明調和物中所用的第二蛋白質係一種自然存在的 蛋白質或爲此等一種自然存在蛋白質的重組產生形式。此 種蛋白質的一個例子爲骨成形蛋白-2 ( BMP-2 ),其重組 形式係稱爲人類重組骨成形蛋白-2 ( rhBMP-2 )。有關骨 φ 成形蛋白的資訊係包含有下列出版物中,彼等都以引用方 式納入本文中。BioDrugs. 2002;16 ( 5 ) :376-7 ; Journal of Orthopaedics 2005;2 ( 4 ) e3;專利:5, 108,922; 5,187,07; 5,318,898; 5,459,047; 5,618,924 ; 5,631,142° 骨成型蛋白與本發明第一蛋白質一起可與適當的藥學 上可接受之載劑如類型I牛可吸收性膠原蛋白海綿(ACS )組合。 沐1發明治療用調和物係施用於骨及/或軟骨傷害部位 (例如骨斷裂、切骨手術、等),因此提供本發明治療用 -23- 200800250 (20) 蛋白質組成物的局部遞送。例如,可將治療用蛋白質組成 物經由於適當的載劑(例如油性溶劑如花生油或可注射的 骨膠結劑)之中注射於目標部位或,於開放手術的情況中 ,將此等化合物於適當載劑諸如骨蠟、去礦物質骨基質散 劑、聚合物行骨膠結劑、骨密封劑等之中局部施用到該等 部位。或者,可經由下述達成局部施用:將治療用蛋白質 組成物在適當載劑中的溶液或分散液施用表面之上,或摻 % 到整形手術慣用的固體或半-固體植體之內,如修復術、 達克龍網線(Dacron-mesh) 、Gore-tex™、凝膠-發泡體 (gel-foam )和新鮮小牛骨(kiel bone)、及/或膠原蛋白 海綿/基質。例如,自牛腱重組成的可吸收性膠原蛋白海 綿和自去礦物質/胍-萃取牛骨所衍生的以膠原蛋白爲基之 基質係現行用來將BMP遞送到目標部位的二種遞送材料 (參閱例如,InfuseTM,Medtronic,Inc.; Induct Os TM, W y e t h / A s t e 11 a s B V )。 • 在某些具體實例中,本發明治療調和物包括一基質, 其能遞送治療用蛋白質組成物如SEQ ID NO.8與rhBMP-2 至骨及/或軟骨傷害部位同時提供一發育骨骼和軟骨之結 構。此等基質可由任何方便物質所生成包括目前已在其他 植入式醫學應用中所用的彼等物質。此等調和物可合宜地 施用在海綿,其可植入、灌封或注射於黏稠形式中以遞送 至骨骼,軟骨或組織傷害部位。該基質物質的選擇可基於 數種因素,包括生物相容性、生物降解性、機械性質、美 容外觀和介面性質。一特定治療用調和物的特別施用會影 -24- (21) 200800250 響其設計和實施。組成物用的可能基質可爲具有生物 性且經化學上定義的硫酸鈣、磷酸三鈣、羥磷灰石、 酸和聚酸酐類。其他潛在物質皆爲生物可降解且經生 明確定義者,諸如骨或皮膠原蛋白。其他基質包括純 質或細胞外基質成分。其他可能基質爲非生物可降解 化學定義者,諸如燒結羥磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽 或其他陶瓷。基質可包括任何上述類型之物質的組合 諸如聚乳酸和羥磷灰石或膠原蛋白與磷酸三鈣。該生 瓷可在組成上變異,諸如鈣-鋁-磷酸鹽類且經加工以 孔隙尺寸、粒子尺寸、粒子形狀、和生物降解性。 本發明治療調和物諸如SEQ ID NO.8與rhBMP-2 藥法決定於許多可能影響本發明調和物的治療用蛋白 成物之作用的因素,包括所欲生成量的骨重量,骨傷 部位,受傷骨的狀況,傷口的大小,受傷組織的類型 者的年齡、性別、和飲食、任何感染的嚴重性、投藥 及其他臨床因素。劑量可隨所用媒劑、載劑、或基質 型以及調和物的治療用蛋白質或多蛋白質之實體而變 治療效率可於臨床中經由骨骼生長及/或修復的定期 ,例如使用X-光,予以監測。 在某些具體實例中,本發明調和物之治療用蛋白 成物諸如SEQ ID ΝΟ·8與rhBMP-2的總重量劑量可自 (从g)至毫克(mg)量(例如,自1微克至10毫 括自2微克至50毫克,如自1〇微克至25毫克, 微克至1 〇毫克等)。如上面指出者,該總劑量可 降解 聚乳 物學 蛋白 且經 類、 物, 物陶 變更 的服 質組 害的 ,患 時間 的類 異。 評估 質組 微克 ,包 100 許多 -25- 200800250 (22) 因素所決定。在某些具體實例中,該調和物中所含該治療 用蛋白質組成物之濃度(即,治療用蛋白質組成物的重量 劑量/總調和物的重量)係自0.1毫克/毫升至5毫克/毫升 ,包括〇·5毫克/毫升至4毫克/毫升,諸如1毫克/毫升至 3毫克/毫升,例如,2毫克/毫升。 本發明調和物中的治療用蛋白質組成物可含有二或更 多種蛋白質。在一具體實例中,該調和物包括一第一蛋白 φ 質(其係由SEQ ID ΝΟ·1通式序列所涵蓋的一種蛋白質) ’與第二蛋白質之組合,該第二蛋白質係選自屬於下列之 分子:轉形生長因子(TGF )和骨成形蛋白(BMP )族以 及上皮生長因子(EGF )、上皮細胞生長因子(ECGF )、 纖維母細胞生長因子(F GF )、血小板衍生生長因子( PDGF )、似胰島素生長因子(IGF )、和似胰島素生長因 子結合蛋白(IGFBP )等族。在某些此等具體實例中,本 發明治療用調和物中的第二蛋白質對第一蛋白質比例係自 φ 1: 1或更大至卜5,000或更大,包括自1: 1或更大至i :1,000或更大,諸如自1: 2或更大至1: 500或更大。 熟諳此技藝者都可察覺者,有關B MP (其於本文中也 稱爲BMP-2和rhBMP-2)之實質其他資訊可在包括已核發 的眾多美國專利之文獻中找到。另外,包括可促進硬組織 生成生長的其他蛋白質之特別調和物可在與本發明相關的 文獻中找到,其包括一由SEQ ID ΝΟ·1所涵蓋的第一蛋白 質組合著可促進硬組織生成和生長之任何蛋白質,以增強 治療效用同時使用較少量的該蛋白質。 -26- 200800250 (23) 方法所用製造 該調和物及/或套組可經製造以實施一方法,該方法 包括= 投予一患者一第一肽,其包括1 〇至5 0個胺基酸殘基 ,且具有一胺基酸序列RGDBD ( X ) nSGZG ( SEQ ID NO.l ) ’其中B、X、和z可爲任何胺基酸殘基且^爲在 φ 1與1 〇之間的任何整數;且
進一步投予該患者一第二蛋白質,其係選自包括下列 之群組··轉形生長因子(TGF )、骨成形蛋白(BMP )、 上皮生長因子(EGF)、上皮細胞生長因子(ECGF)、纖 維母細胞生長因子(F G F )、血小板衍生生長因子(P D G F )、似胰島素生長因子(IGF)、和似胰島素生長因子結 合蛋白(IGFBP)。 在該方法中,該患者可爲人類且該方法可進行以增強 # 硬組織生成活性。該方法可經實施以延長磷酸化Smad分 子的滯留時間。該方法可經實施以縮減將Smad分子去磷 酸化所需時間。該方法爲如申請專利範圍第1 4項所述者 ’其中該方法係經實施以縮減將硬組織生成細胞中的磷酸 化Smad分子予以降解所需的時間。 所處理的細胞可爲選自下列群組之組織生成細胞:( a ) —種成骨細胞系的細胞,其中硬組織係呈骨組織之形 式;(b ) —種成釉細胞系的細胞,其中硬組織係呈琺瑯 質形式;(c ) 一種生造牙本質細胞系的細胞,其中硬組 -27- 200800250 (24) 織係呈牙本質形式;及(d ) —種牙骨質母細胞系的細胞 其中該硬組織係牙骨質的生成。 該第一肽和第二肽可經由注射投予。該第一肽可爲 SEQ ID N0.1肽且該第二肽係重組人類骨成形蛋白-2 ( rhBMP-2 )。該第一蛋白質和第二蛋白質可同時投予。該 第一蛋白質和第二蛋白質可在一種可吸收性膠原蛋白海綿 (ACS )上投予。 Φ 該調和物及/或套組可經製造以用於治療一有硬組織 缺陷特徵之疾病,該治療包括: (a )投予一肽,其包括約1 〇至50個胺基酸,且其 含有一胺基酸序列 RGDBD(X) nSGZG(SEQ ID NO.l) ,其中B、X、和Z可爲任何胺基酸殘基且η爲在1與1〇 之間的任何整數;及 (b )投予一可促進硬組織生長的分子,和一載劑。 該方法可實施成其中(a)和(b)係同時投予。該方 # 法可實施成其中(a )和(b )係依序地投予,以該肽在該 可促進硬組織生長的分子之前投予。該方法可實施成其中 (b )和(a )係依序地投予,以該可促進硬組織生長的分 子在該肽之前投予。該方法可實施成其中投予(a )和(b )可上調及/或活化該所治療的硬組織中之環加氧酶_ 2 ( COX-2 )。該方法可實施成其中使該所治療的硬組織中之 ***素E2 ( PGE2 )產生得以增加。該方法可實施成其 中使該所治療的硬組織中之磷酸化Smad分子的降解時間 得以延長。 28· 200800250 (25) 套組及/或調和物係經製造供進行增強硬組織細胞的 方法,包括延長該磷酸化S m a d 1、5、和8的滯留時間, 其中係增強促進增殖、分化、成熟、或礦質化作用。 套組及/或調和物係經製造供進行治療有硬組織缺陷 特徵的疾病之方法,其包括: 投予一或多種藥學活性分子,其能延長於硬組織生成 細胞中的磷酸化Smad分子之滯留時間。 Φ 套組及/或調和物係經製造供進行軟骨再生的方法, 其包括: 投予一患者一種藥學上活性量的組成物,該組成物包 括具有本發明所定義的SEQ ID NO. 1序列之多肽。 套組及/或調和物係經製造供進行一種治療方法,其 包括: 投予一患者一治療有效量的調和物,該調和物包括一 藥學上可接受之載劑和一選自本發明所定義的SEq id # NO·1— SEQ ID N0.8肽中任何一者的肽。 該方法可進一步包括於一期間內以促進硬組織生長的 方式定期地重複投予該調和物於該患者。 該方法可進一步包括投予可起始硬組織生成的第二種 藥物。 該方法可經實施成其中該第二種藥物係一種經重組產 生的骨成形蛋白(BMP)。 【實施方式】 -29 - 200800250 (26) 實施例 下面的實施例係提出以提供給諳於此技者對於如何做 出及使用本發明一完全的揭示和說明,但是無意用以限制 本案發明人士視爲彼等的發明者之範圍,彼等實施例也無 意代表下述諸實驗爲所有或唯有的所實施過的實驗。其中 也付出努力以確保所用數値之準確度(例如量、溫度等) ’不過應計及某些實驗誤差和偏差。除非另有不同指出, • 否則份數係重量份數,分子量係重量平均分子量計,溫度 係攝氏溫度,且壓力係大氣壓或接近大氣壓。 實施例1 在次優濃度BMP-2與添加SEQ ID ΝΟ·8肽於培養物 之下於原成骨細胞內鹼性磷酸酶(ALP )活性的增加。 材料和方法:將採自小鼠胎兒顱蓋的原成骨細胞於〇 或25毫微克/毫升bmp-2下培養。於此培養系統加入〇、 0.2、0.4、1 ·〇、2.0、和 4·0 // Μ 的 SEQ ID ΝΟ·8 肽,於 第〇、第3、和第7天評定八1^的含量。 結果:如圖1所顯示者,在用BMP-2和SEQ ID NO. 8 肽處理的組中,於成骨細胞內的ALP活性以劑量相關方式 明顯地增加。於2 // M S E Q ID Ν Ο . 8肽處理組中,相較於 對照組,ALP活性增加約3倍且與沒有添加肽的BMP-2 處理細胞比較,增加2倍。 討論:此等結果證明 SEQ ID N0.8肽明顯地增加 BMP-2正面影響前-成骨細胞成變爲成骨細胞的分化之能 -30- 200800250 (27) 力。 實施例2 添加不同劑量的SEQ ID ΝΟ·8肽之下於原hMSC中的 COX2含量之增加 材料和方法:於Clonetics hMSC細胞中使用先前所述 基因表現微陣列分析評估SEQ ID N0.8肽處理對基因表現 之影響(Locklin等人,2001 )。簡單地說,將細胞植入 5個T“ 50排氣燒瓶內,其密度爲ΐ·〇 X 106每燒瓶的生長 培養基內,且在3 7 °C培養4 8小時。將裝有單獨媒液或 SEQ ID N0.8的肽(1 000毫微克(ng) /毫升)的燒瓶係 於標準分化培養基內培養24小時或48小時。在每一時點 ’將該媒液燒瓶和處理燒瓶予以胰蛋白酶處理( trypsinized ),區出細胞且透過 Qiagen Rneasy Kit( Qiagen)萃取出總RNA供分析所用。將8微克的總RNA 放大且用生物素標記。將該混合物融合到含有對12,600 人類基因的探針(probe)之U95A人類基因表現微陣列( Affymetrix)。之後清洗該晶片,用藻紅蛋白-鏈黴抗生物 素蛋白(phycoerythrin-streptavidin )染色且用 Affymetrixn掃瞄器讀取。將融合強度値對mRNA頻率計 算成分子數每一百萬。強度値的分析係使用 Spotfire Decision Site ( Somerville,ΜΑ)軟體執行。 結果:只考慮經由用SEQ ID ΝΟ.8肽處理而有2-倍或 更多倍改變的mRNA。在兩時間間隔有改變到此等程度的 -31 - 200800250 (28) 唯一 mRNA爲COX-2 :其在24小時增加3.6 _倍且在48小 時增加2.2-倍。 討論:此等數據證明該SEQ ID ΝΟ·8肽可增加(達 〜3.6-倍)該環加氧酶-2 ( —種***素合成所需的可誘導 性酵素)(COX-2 )的mRNA。因此該SEQ ID ΝΟ·8肽具 有誘導已知對骨生成具有正面作用的PGE2之可能。 實施例3 SEQ ID ΝΟ·8肽對於MC3T3細胞的BMP-2剌激PGE2 產生之強化 方法:MC3T3-E1分殖株4細胞爲初生小鼠衍生的具 有纖維母細胞形態之顱蓋前成骨細胞。在含有抗壞血酸和 無機磷酸鹽之中生長之時,此分殖株展現出高層次的成骨 細胞分化。爲此實驗,將該.MC 3 T3細胞在24-洞板中於生 長培養基(a MEM + 1 mM丙酮酸鈉 + 10%胎牛血清( FBS ))以105細胞每洞平板培養。培養24小時後,移除 培養基且換上含有試驗物質的檢定培養基(a MEM+1 mM 丙酮酸鈉 + 2% FB S )。每一試驗組使用4個洞。於再培 養 24小時之後,移除培養基和且使用 ELISA ( R&D Systems)測定PGE2的含量。 結果:該SEQ ID N0.8肽可增加BMP-2誘發PGE2產 生如圖2所示者。 實施例4 -32- 200800250 (29) 於細胞培養基中添加SEQ ID ΝΟ·8肽時BMP-活化磷 酸化S m a d 1、 5、和8在原小鼠成骨細胞內的滯留 材料和方法··將採自胎小鼠顱蓋的原成骨細胞在培養 系統中有添加0或25毫微克/毫升BMP-2與〇或2 /z Μ 的SEQ ID ΝΟ·8肽之下進行培養。在〇、0.5、1、2、12、 24、48和72小時以西方點漬法(Western blotting )測定 Smad 1/5/8的磷酸化。 φ 結果:在此等條件下,BMP-2可誘發Smad 1/5/8的磷 酸化,此可在從0.5至12小時偵測到。對BMP-2的2 // M SEQ ID N0.8肽之添加誘發出延長的Smad 1/5/8磷酸化 ,此可在自0.5至4 8小時偵測到(圖3 )。 討論:此等數據指出SEQ ID ΝΟ·8肽強化BMP-2活 性之能力可能至少部份係來自該肽明顯延長該磷酸化 Smad 1/5/8蛋白質的半生期之能力,該磷酸化Smad 1/5/8 蛋白質係BMP-2和其他骨合成代謝劑的信號傳導途徑之 m 整體部份。 實施例5 於次最優濃度的 Β Μ P - 2及添加不同濃度的 s E Q ID Ν Ο· 8肽之下對於小鼠顱蓋器官培養檢定法中ρ 〇 ε 2產生之 增加 方法:顱蓋器官培養業經使用多年以硏究骨生成和骨 吸回的調節。此方法相對於活體內硏究的優點在於沒有混 淆效應(諸如激素性和機械性影響),意謂著可測定出試 -33- 200800250 (30) 驗物質對骨組織的更直接影響。且也與分離的細胞系統相 比較,在不同細胞類型的骨之間及此等細胞與骨基質之間 維持著相互關係。 簡單的說,從4天大的Swiss Webster小鼠分離出半 顱蓋且在鋼網柵格上的培養基中培育。每天於培養基中添 力口 SEQ ID NO.8肽(1、10、100微克/毫升)共7天且在 第1和第4天處理BMP-2 ( 40毫微克/毫升)對照組。每 φ 曰採取經調理過的培養基樣品供PGE2濃度分析所用( R&D Systems ELISA kit)。在培養結束之時,使用組織學 分析該骨的新骨生成和成骨細胞數目。 結果:用SEQ ID ΝΟ·8肽處理的組在PGE2產生(圖 4 )和新骨生成,成骨細胞表面和骨細胞密度等參數上( 圖形5 )都有明顯增加。 討論:此等結果指出該SEQ ID NO.8肽可增強顱蓋骨 器官內所含內源性骨因子之能力(包括BMP-2)以透過增 • 加的PGE2產生機制增加骨生成參數。 實施例6 使用含有BMP-2和SEQ ID NO.8肽的可植入式聚合 物誘發小鼠背肌內的BMP-2所具骨骼合成代謝活性 材料和方法:將含有下列量(參閱下表)的BMP-2 和S E Q ID Ν Ο . 8肽兩者之聚合物小九植入4星期大的IC R 小鼠之背肌膜內。3星期後將該小鼠犧牲和分離出新生成 的骨供使用軟X -光照相術和骨礦物質密度測定所用。 -34- 200800250 N-l 0 AC-100 (微克 ) 0 50 250 1250 BMP-2 (微克 ) 5 5 5 5 BMP-2 (微克 ) 3 3 3 3 聚合物 (毫克 ) 30 30 30 30 結果· 如圖6 所示 ,於小鼠 (ICR) 背肌內 植入30 克聚合物(含有5微克或3微克的BMP-2與不同劑量(0 、50、250、或1250微克)的SEQ ID ΝΟ·8肽)之3星期 後,以異位小骨的尺寸和礦物質密度評估骨生成量。在使 用5微克的BMP-2時該肽的效力不清礎。不過,當使用3 微克的BMP-2時,該肽顯示出對BMP-2效用的明顯增強 〇 討論:此等數據說明該SEQ ID NO.8肽能明顯地誘發 出BMP-2的活體內骨合成代謝作用,特別是在使用次最 優劑量的BMP-2之時。 序列表 RGDBD(X)nSGZG [B,X,和Z可爲任何胺基酸,n=l〜10]] (SEQ ID ΝΟ·1) RGDND(X)nSGZG [ X和Z可爲任何胺基酸,n=I〜10] (SEQ DD ΝΟ·2) RGDND(X)nSGDG [ X可爲任何胺基酸,η=1 〜10] (SEQ ID ΝΟ·3) RGDNDJJPFSGDG [J可爲任何胺基酸](SEQ Π>Μ)··4) RGDNDISPFSGDG (SEQ ID N0.5) RGDNDMSPFSGDG (SEQ ID N0.6) RGDNDVPPFSGDG (SEQ ID N0.7) TDLQERGDNDISPFSGDGQPFKD (SEQ ID N0.8) 前述只是用以闡明本發明的原理。要瞭解的是熟諳此 •35· 200800250 (32) 技藝者能設計出不同的配置,其雖然不在本文中明確地說 明或顯示,不過彼等都能體現本發明的原理且都包括其旨 意和範圍之內。再者,本文中所引述的所有例子和條件語 言主要係意欲幫助讀者瞭解本發明的原理和發明人所貢獻 的槪念以推動技藝,且要理解爲不受此等特別引述的例子 和條件所限制。此外,於本文中引述本發明的原理、方面 、和具體實例以及其特別例子之所有敘述,意欲涵蓋彼等 φ 的結構和功能兩者的等效物。此外,此等效物理應包括包 括現行已知等效物和未來開發出的等效務,即,經開發出 可實施相同的功能之任何要件,不論其結構爲何。所以, 本發明的範圍不欲受限於本文中所顯示與說明的示範性具 體實例。更確切地,本發明的範圍和旨意係由後附申請專 利範圍所體現。 【圖式簡單說明】 Φ 根據本發明,本發明可自配合所附圖式閱讀的詳細說 明部份獲得最佳了解。要強調者,根據常用做法,圖式的 各特徵係不按比例繪出。相異地,爲了清晰起見,各特徵 的尺寸係經任意地擴大或縮減。於圖式中包括下列圖: 圖1爲條形圖’顯示在用次最優濃度的rhBMP-2培養 小鼠原級成骨細胞時,於培養物中添加不同濃度的s E Q ID Ν Ο . 8的肽,所得鹼性磷酸酶(A L p )活性的劑量相關 性上調。其中a表相對於對照組p<〇.〇5 ; b表相對於只接 受BMP-2之組p<〇.〇5 ; c表對所有其他組p<〇 〇5。 -36- 200800250 (33) 圖2條形圖,顯示經由用次最優濃度的rhBMP-2加上 於培養物中添加的不同濃度 SEQ ID N0.8的肽培養 MC3T3細胞時,***素 E2之劑量相關性產生。 圖3係一凝膠的影像,其展現出於不同的時間點得自 MC3T3細胞由西方點漬指出的磷酸化Smads 1、5、和8 ( 總計)的表現。細胞係用次最優濃度的:rhBMP-2於有或無 添加SEQ ID N0.8肽之下予以培養。 圖4爲一條形圖,說明將顱蓋離析出且用不同劑量的 SEQIDNCK8肽培養時,其PGE2的產生。 圖5爲一條形圖,展示出使用 SEq ID NO.8肽或 rhBMP-2培養的小鼠顱蓋器官培養物的中之多種骨參數諸 如新骨體積、在骨組織內的細胞密度、和成骨細胞表面。 圖6顯示條形圖和影像,其表出在小鼠背肌中植入包 括rhBMP-2和不同劑量的SEQ ID ΝΟ·8肽之聚合物之時, 該小鼠背肌內生成的放射照片(指示出新的鈣化組織/骨 )’其中a表相對於未有AC-100之組p<〇.〇5。(時間點 -37-
Claims (1)
- 200800250 (1) 十、申請專利範圍 1· 一種調和物,包其括: 一藥學上可接受的載劑; 一第一肽,其包括1 0至50胺基酸殘基,具有胺基酸 序歹[]RGDBD(X)nSGZG(SEQIDN0.1),其中 B、X、 和Z可爲任何胺基酸殘基且n爲在1與ί 〇之間的任何整 數;和 φ 一第二肽,其係選自包括下列的群組:轉化生長因子 (TGF )、骨成形蛋白(BMP )、表皮生長因子(EGF ) 、上皮細胞生長因子(ECGF )、纖維母細胞生長因子( FGF )、血小板衍生生長因子(PDGF )、似胰島素生長因 子(IGF )、和似胰島素生長因子結合蛋白(1〇?8卩)。 2 ·如申請專利範圍第1項之調和物,其中該載劑爲 可吸收性的膠原蛋白海綿(AC S )。 3 .如申請專利範圍第1項之調和物,其中該載劑爲 Φ 可注射的載劑。 4. 如申請專利範圍第2項之調和物,其中該第二蛋 白質爲骨成形蛋白(BMP)。 5. 如申請專利範圍第4項之調和物,其中該BMP係 重組人類骨成形蛋白-2 ( rhBMP-2)。 6 ·如申請專利範圍第1項之調和物,其中z爲d且 B爲N。 7.如申請專利範圍第6項之調和物,其中“ η”爲選 自2、3、4、5、或6之整數。 38- 200800250 (2) 8. 如申請專利範圍第6項之調和物,其中η爲4。 9. 如申請專利範圍第8項之調和物,其中該X 4的胺 基酸序列爲JJPF其中J可爲任何胺基酸。 1 〇.如申請專利範圍第9項之調和物,其中該的 胺基酸序列係選自IS、MS、或VP。 1 1 .如申請專利範圍第5項之調和物,其中該第一肽 具有胺基酸序歹丨J TDLQERGDNDISPFSGDGQPFKD ( SEQ ID • NO.8 )。 12.如申請專利範圍第1項之調和物,其中該第一和 第二蛋白質的含量爲使得彼等在一起可上調和活化硬組織 生成細胞中的環加氧酶-2 ( COX-2 )且增加由硬組織生成 細胞的***素E2 ( PGE2 )之產生。 1 3 .如申請專利範圍第1項之調和物,其中該第二肽 對該第一肽的比例係在1:5或更大的範圍之內。 1 4 . 一種套組,其包括: φ 一藥學上可接受之載劑; 一預-量過的量之一第一肽,該第一肽包含10至50 個胺基酸殘基,且具有一胺基酸序列的 RGDBD ( X ) nSGZG ( SEQ ID NO.l ),其中B、X、和Z可爲任何胺基 酸殘基且η爲在1與1 0之間的任何整數; 一預-量過的量之一第二肽,其係選自包括下列之群 組:轉化生長因子(T G F )、骨成形蛋白(Β Μ Ρ )、表皮 生長因子(EGF)、上皮細胞生長因子(ECGF)、纖維母 細胞生長因子(FGF )、血小板衍生生長因子(PDGF )、 -39- 200800250 (3) 似胰島素生長因子(IGF )、和似胰島素生長因子結合蛋 白(IGFBP);和 一說明件,說明該載劑、第一肽和第二肽之組合和投 予。 1 5 ·如申請專利範圍第1 4項之套組,其中該載劑爲 可吸收性膠原蛋白海綿(AC S )。 1 6·如申請專利範圍第1 4項之套組,其中該載劑係 φ 與該第一和第二肽分開包裝。 1 7 .如申請專利範圍第1 4項之套組,其中該第二蛋 白質爲BMP。 1 8 .如申請專利範圍第17項之套組,其中該81^?爲 重组人類骨成形蛋白_2 ( rhBMP-2)。 1 9 ·如申請專利範圍第1 4項之套組,其中Z爲D且 B爲N 〇 20·如申請專利範圍第1 9項之套組,其中“ η”爲選 φ 自2、3、4、5、或6之整數。 2 1 ·如申請專利範圍第1 9項之套組,其中η爲4。 22.如申請專利範圍第21項之套組,其中該Χ4的胺 基酸序列爲J J P F其中J可爲任何胺基酸。 23·如申請專利範圍第22項之套組,其中該JJ的胺 基酸序列係選自IS、MS、或VP。 2 4.如申請專利範圍第1 8項之套組,其中該第一肽 具有胺基酸序列 TDLQERGDNDISPFSGDGQPFKD ( SEQ ID NO.8)。 -40 - 200800250 (4) 25·如申請專利範圍第14項之套組,其中該第一和 第二蛋白質的含量爲使得彼等在一起可上調和活化硬組織 生成細胞中的環加氧酶-2 ( COX-2 )且增加由硬組織生成 細胞的***素Ε2 ( PGE2 )之產生。 26.如申請專利範圍第1 4項之套組,其中該第二肽 對該第一肽的比例係在1 : 5或更大的範圍之內。-41 - 200800250 序列表 <110> LAZAROV, MIRELLA MIDDLETON-HARDIE, CATHERINE ROSEN, DAVID <120>促進硬組織生成的蛋白質調合物 <130> BEAR-012TW <150> 60/805,201 <151> 2006-06-19 <150> 60/803,327 <151> 2006-05-26<150> 60/747,255 <151> 2006-05-15 <150> 60/747,143 <151> 2006-05-12 <150> 60/700,518 <151> 2005-07-18 <160> 8 < 17 0〉用Windows 版本4.0的FastSEQ <210> 1 <211〉 10 <212> PRT <213>人類 <220> <221>變異體 <222> (6)...(6) <223> Xaa可爲自^10個胺基酸長 <220> <221〉變異體 <222> 4, 6, 9 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 1 Arg Gly Asp Xaa Asp Xaa Ser Gly Xaa Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213>人類 <220〉 <221>變異體 <222> (6)...(6) <223〉xaa可爲自1至i〇個胺基酸長 <220> <221〉變異體 200800250 <222〉 6, 9 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 2 Arg Gly Asp Asn Asp Xaa Ser Gly Xaa Gly 15 10 <210> 3 <211〉 10 <212> PRT <213〉人類 <220> <221〉變異體 <222> (6)...(6)<223> Xaa可爲自1至10個胺基酸長 <220> <221>變異體 <222> 6 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 3 Arg Gly Asp Asn Asp Xaa Ser Gly Asp Gly 15 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213>人類 <220> <221〉變異體 <222> 6, 7 <223> Xaa =任何胺基酸 <400> 4 Arg Gly Asp Asn Asp Xaa Xaa Pro Phe Ser Gly Asp Gly 15 10 <210> 5 <211〉 13 <212> PRT <213>人類 <400> 5 Arg Gly Asp Asn Asp lie Ser Pro Phe Sex Gly Asp Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 13 .<212> PRT 〈213〉人類 <400> 6 Arg Gly Asp Asn Asp Met Ser Pro Phe Ser Gly Asp Gly 1 5 10 200800250 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213〉人類 <400> 7 Arg Gly Asp Asn Asp Val Pro Pro Phe Ser Gly Asp Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 23 <212> PRT <213〉人類 <400> 8Thr Asp Leu Gin Glu Arg Gly Asp Asn Asp lie Ser Pro Phe Ser Gly 1 5 10 15 Asp Gly Gin Pro Phe Lys Asp 20-3-
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