TW200526253A - Cross-linked polysaccharide microparticles and process for producing the same - Google Patents

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Description

200526253 (1) 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於緩釋藥物,特別爲具有藥效的蛋白質或 肽之交聯多醣藥物緩釋微粒子載體、及其製造方法。 【先前技術】 近年來,具有藥效的蛋白質、肽之製劑雖已實用化, 但一般的藥物的血中半衰期很短,且其大部分爲多次投與 的注射劑,故藥劑投與時會使患者的負擔過大。因此,期 待一種盡量以少量而可發揮藥效,且投與次數亦可減少的 蛋白質或肽藥劑的實用緩釋型製劑。 對於具有藥效的蛋白質或肽緩釋製劑,製劑調製時或 緩釋中的蛋白質或肽的變性或凝集會引起回收率降低,造 成實用化的大障礙。雖有嘗試聚乳酸一聚乙二酸共聚物( PLGA )等之生物分解性高分子作爲底材之緩釋製劑,但 底材的疏水性、乾燥步驟、pH降低所引起的蛋白質變性 、凝集(參考非專利文獻1及2 )。另一方面,雖亦有報 告指出欲解決該問題而使用親水性鹵素凝膠作爲緩釋製劑 ’但亦無法達到貫用化。又,由安全面來看,作爲緩釋底 材使用的材料必須同時具有非抗原性、非變異原性、無毒 性、生物分解性’而難以實現對於蛋白質或肽之封入率、 回收率及安全性皆到達實用化水準的緩釋型製劑。 近年來有將多醣作爲藥物載體使用之報告。其中,透 明質酸(HA)爲1 93 4年,K· Meyer的牛眼玻璃體所分離 200526253 (2) 的生物體材料(多醣),自古即知其可作爲細胞外基體的 主成分。HA爲D—葡糖醛與N—乙醯葡糖胺以点(1— 3 )糖苷鍵連結之雙糖單位所成的糖胺聚醣之一種。 HA於化學性、物理性結構上並無差異,人類亦具有 其代謝系統,於免疫性與毒性面上其爲最安全的醫用活體 材料(Biomaterial )之一。近年來藉由微生物可使高分子 量HA大量生產,亦使變形性軟骨治療藥、化粧品等領域 實用化。 HA使用於基材的交聯方法,由HA凝膠之蛋白質或 肽藥物的緩釋亦已於多數報告中揭示。作爲HA以化學交 聯進行凝膠化之方法,已知有碳化二亞胺法(參考專利文 獻1)、二乙烯基磺醯法(參考專利文獻2)、環氧丙基 醚法(參考專利文獻3 )等。一般於凝膠中封入蛋白質或 肽的情況,於交聯後導入蛋白質或肽之方法中,因HA與 蛋白質或肽之相溶性、靜電排斥等問題而使導電率降低。 另一方面,蛋白質或肽的存在下進行原位(in situ)交聯 之方法具有於高封入率下載持蛋白質或肽之優點。藉由如 此原位交聯,將HA凝膠封入蛋白質或肽中而緩釋之製劑 已被揭示(例如,參照專利文獻4 )。然而,使用如此方 法於蛋白質或肽存在下將HA進行原位交聯所得之緩釋型 製劑具有回收率之問題。例如已揭示導入醯肼基(Η Z ) 之Η Α衍生物(Η A — Η Ζ )以Ν -羥基琥珀醯酵亞胺(N H s )所成之交聯劑進行交聯的方法(參考專利文獻5 ),其 中以生理條件下之原位交聯爲目的進行p Η 7 · 4〜p Η 8 . 5下 -5 - 200526253 (3) 之交聯形成反應,但本發明者的檢討確認出由該方法所得 之HA凝膠所回收之蛋白質或肽的回收率依舊低。此原因 爲交聯反應中蛋白質或肽的一部份(主要爲胺基)與交聯 劑產生反應,使蛋白質交聯之故。又,殘留於凝膠中的變 性蛋白質或肽會使生物活性降低,成爲所謂的抗原性表現 之原因等問題。使封入藥物可高回收率下釋出,且符合作 爲醫藥品的必須條件,蛋白質或肽不會進行反應下進行 HA的化學交聯、凝膠化之方法至今爲未知。又,作爲高 回收率下封入蛋白質或肽之方法,雖有報告揭示聚乙二醇 (PEG )作爲底材而使不飽和官能基進行求核加成反應之 交聯作用(參考專利文獻6 ),但有著殘存未有生物分解 性之PEG片段的問題。 又’實際上如此藥物緩釋性物質作爲可注射用製劑時 ’必須經過微粒子化。對於如此噴霧乾燥機廣被使用,例 如有報告揭示將胰島素(參照非專利文獻3、非專利文獻 4 ) 、rh抗IgG抗體(參照非專利文獻5 )進行微粒子化 的報告、透明質酸的微粒子中封入藥物的報告(參照非專 利文獻7、專利文獻8 ),但因同時於短時間類溶解於皮 下故藥物緩釋時間非常短,作爲緩釋目的的實用性非常低 。又,亦有噴霧乾燥中進行殻聚醣的交聯反應,封入滴分 子藥物之報告(參照非專利文獻6 ),但因緩釋時間爲數 分鐘非常短,又使用交聯劑的醛類具有與胺基等官能基之 高反應性,故無法使用具有蛋白質、肽、其他胺基酸等官 能基之低分子藥物。 -6 - 200526253 (4) 〔專利文獻1〕 國際公開 WO 94/025 1 7號說明書 〔專利文獻2〕 特開昭6卜1 3 8 6 0 1號公報 〔專利文獻3〕 特開平5 - 1 4020 1號公報 〔專利文獻4〕 美國專利第5 82 793 7號說明書 〔專利文獻5〕 國際公開WO 9 5/ 1 5 1 6 8號說明書 〔專利文獻6〕 國際公開WO 00/44808號說明書 〔專利文獻7〕 專利第3445283號公報 〔專利文獻8〕 國際公開WO 96/ 1 8647號說明書 〔非專利文獻1〕 J. Pharm. Sci.第 88 卷、第 1 66 — 1 7 3 頁、1 999 年 〔非專利文獻2〕 J. Microencapsulation 第 15 卷、第 699 — 713 頁 1 99 8 年 〔非專利文獻3〕
Int. J. Pharm. 2 3 3,227 — 237,2002 年 〔非專利文獻4〕 200526253 (5) J. Control. ReL 91,3 85 — 3 94,2003 年 〔非專利文獻5〕
Biotech, and Bioeng. 60,30 1 — 309,1 998 年 〔非專利文獻6〕
Int· J. Phan 187,5 3 — 65,1 999 年 【發明內容】 發明所要解決的課題 如上述,至今未有維持蛋白質或肽等藥物的生物活性 下以原位(in situ )下進行化學交聯、乾燥、微粒子化後 封入藥物,滿足高封入率、高回收率、安全性之可注射性 生物分解性凝膠微粒子的調製方法,以及使用該方法所得 之蛋白質或肽等長期藥物緩釋製劑。 解決課題的方法 本發明者對於解決該課題進行詳細硏究結果,發現將 具有交聯形成反應的官能基之透明質酸衍生物與藥物之溶 液,使其由交聯反應進行較慢的稀薄狀態濃縮至進行交聯 反應的濃度,濃縮中HA間進行交聯反應後,將藥物封入 透明質酸交聯體中,其可維持蛋白質或肽等藥物之生物活 性下有效率地封入。又,發現由該方法所得之交聯透明質 酸微粒子係爲可注射性者,作爲生物分解性且安全的長期 藥物緩釋微粒子載體時,適合封入蛋白質或肽等藥物,而 完成本發明。 βρ,本發明係關淤維持蛋白質或肽等藥物之生物活性 -8- 200526253 (6) 下,這些可由原位交聯、微粒子形成、及乾燥而獲得’封 入凝膠中的可注射性蛋白質或肽等藥物緩釋製劑 '及製造 方法。 即,本發明的另一面爲提中一種交聯多醣微粒子的製 造方法,其爲含有 a )調製含有具可交聯官能基的多醣衍生物之稀薄溶 液的步驟; b )將該溶液分散於微粒子狀液滴之步驟;及 c )藉由含於該液滴的溶液濃縮而進行該多醣衍生物 的交聯反應之步驟者。 且本發明的另一面爲提供一種該中該步驟b)爲藉由 噴霧該溶液而分散於微粒子狀液滴之步驟的前述製造方法 〇 本發明的另一面爲提供一種該製造方法所調製出的交 聯多醣微粒子。 以下對本發明做更具體的說明。 本發明所使用的多醣衍生物僅爲具有可交聯反應的官 能基之多醣衍生物即可並無特別限定,較佳爲糖胺聚醣( 酸性黏多醣;例如透明質酸、軟骨素、軟骨素4 -硫酸、 軟骨素6 -硫酸、皮膚素硫酸、肝素、硫酸乙醯肝素、硫 酸角質素等)衍生物中具有交聯反應者,特佳爲具有可交 聯反應官能基之透明質酸衍生物。 因此’本發明的另一面爲提中一種交聯透明質酸微粒 子的製造方法,其爲含有 -9- 200526253 (7) a )調製含有具可交聯官能基的透明質酸衍生物之稀 薄溶液的步驟; b)將該溶液分散於微粒子狀液滴之步驟;及 c )藉由含於該液滴的溶液濃縮而進行該透明質酸衍 生物的交聯反應之步驟者。且本發明的另一面爲提供一種 該中該步驟b )爲藉由噴霧該溶液而分散於微粒子狀液滴 之步驟的前述製造方法。又,本發明的另一面爲提供一種 由前述製造方法所調製出的交聯透明質酸微粒子。 本發明的步驟a )之稀薄溶液係爲含有交聯反應必須 的基質及試藥等之溶液,但因以溶劑進行高度稀釋故反應 無法進行或進行極爲緩慢,其濃度雖無特別限定但例如可 爲 0.1 %〜5%,特佳爲 0.2%〜3%。又作爲本發明所使 用的溶劑,可使用該技術領域中一般所使用的溶劑或這些 混合物,雖無特別限定但可使用水、DMSO、乙醇、N -甲基吡咯烷酮、超臨界碳酸液等。 將本發明的步驟b )的稀薄溶液分散於微粒子狀液滴 之方法僅爲該技術領域常用的方法即可,雖無特別限定但 含有噴霧該稀薄溶液之方法,藉由該稀薄溶液與其他液體 混合形成乳化劑之方法。其中微粒子狀的液滴雖特別限定 例如可具有 〇.〇4//m〜1.5mm,較佳爲 Ο.ίμιη〜500//m 之平均粒子徑。 本發明的步驟c )之溶液濃縮方法爲,僅可濃縮至可 加速交聯反應進行之濃度的方法即可,並無特別限定。又 ,該濃縮方法爲例如包含溶劑完全除去下進行作爲固相反 -10- 200526253 (8) 應之該交聯反應的狀態。 且,前述步驟b )及c )亦可以一連串的步驟進行。 具體而言,作爲前述步驟b)及c)的一連串步驟’可進 行噴霧乾燥、乳化液中乾燥法、溶劑擴散法等。其中前述 步驟b )及c )作爲一連串步驟時進行噴霧乾燥爲佳。 本發明的交聯多醣微粒子爲,將含有具有可交聯反應 官能基的多醣衍生物之溶液,藉著由交聯反應進行較慢的 稀薄狀態濃縮至進行交聯反應之濃度,濃縮中交聯多酿衍 生物而製造。又,以將含有具有可交聯反應官能基的多醣 衍生物與藥物之溶液,藉著由交聯反應進行較慢的稀薄狀 態濃縮至進行交聯反應之濃度,濃縮中進行交聯反應,交 聯反應與乾燥同時進行時將藥物封入多醣交聯體中做成藥 物載持微粒子爲特徵。 藉由本發明所提供的製造方法及該製造方法所得之交 聯透明質酸微粒子等的交聯多醣微粒子,較佳爲具有以下 特徵者。 1 ·係爲完全生物分解性,對於活體可確保較高安全 2 · Η A等多醣上接枝可形成交聯之官能基時,可極度 縮小父聯點間距離(例如Η A時,葡糖醒酸中3 3莫耳% 接枝時約3 nm ),可實現長期緩釋。 3 ·係爲高交聯密度。 4 ·蛋白質作爲藥劑使用時,可防止蛋白質的變性。 5 ·可將微粒子化、乾燥化、交聯化以一製造步驟進 -11 - 200526253 (9) 行。 本發明所謂的交聯或化學交聯爲含有藉 子間或分子內交聯鍵結者,亦有同時具有分 交聯鍵結之情況。 本發明所使用的交聯反應,既使於藥物 或肽的共存下形成交聯,僅爲不會使藥物變 形成方法即可並無特別限定。作爲如此反應 氫硫基間的二硫化物鍵結形成,氫硫基與不 的加成、醯肼基與活性羧酸酯之間的反應等 交聯時的pH雖無特別限定,但無變性 促進交聯形成,可防止與含有蛋白質或肽等 應之pH爲佳。如此pH可由斯業者適當選J 3.0 〜pH 9.0,較佳爲 pH 4.5 〜pH 9.0。 本發明所使用的多醣衍生物僅爲可進行 反應即可並無特別限定,但具體可舉出將可 導入HA之透明質酸衍生物(HA衍生物) 用的可交聯官能基雖無特別限定,例如可舉 有不飽和鍵結之基(例如甲基丙烯基、丙烯 基、乙炔基羰基等)、醯肼基(HZ基)等。 父聯反應係爲來自氣硫基彼此間的―硫 時,例如可僅使用導入氫硫基之HA衍生物 形成交聯,或於此添加作爲交聯劑具有2個 之化合物(例如二硫蘇糖醇(DTT ) 、丁二 醇二硫醇、含有2個以上半胱胺酸之肽)形 由共鍵結的分 子間及分子內 ,例如蛋白質 性之交聯鍵結 ,例如可舉出 飽和鍵結之間 〇 蛋白質或肽下 藥物的胺基反 睪,但例如pH 如上述的交聯 交聯的官能基 。本發明所使 出氫硫基、具 基、乙烯磺醯 化物鍵結形成 等多醣衍生物 以上的氯硫基 硫醇、聚乙一 成交聯者。以 -12- 200526253 (10) 提高交聯反應速度爲目的,可添加連四硫酸鈉(sodium t e t r a t h i ο n a t e )、聯 P比 D定二硫化物、E11 m a η 1 s 試劑(D T N B )等化合物亦可。此時,未反應的氫硫基殘留於凝膠中時 可能與蛋白質或肽之變性有關,故欲能盡可能地提高反應 效率,可將這些化合物對於具有反應性之氫硫基而言添加 0.1莫耳倍〜2莫耳倍、更佳爲0.5莫耳倍〜1.5莫耳倍爲 導入氫硫基的多醣衍生物之調製方法雖無特別限定, 例如可由HA作爲3級銨鹽,溶解於DMSO等極性有機溶 劑,於偶合劑存在下,與具有氫硫基之胺或醯肼進行反應 的方法等調製出。具有氫硫基的胺雖無特別限定,例如可 舉出2 -胺乙烷一 1 一硫醇、3 -胺丙烷一 1 —硫醇、硫二 醇酸醯肼等。 又,HA上導入氫硫基時,首先導入胺基或醯肼基, 然後將氫硫基導入胺基或醯肼基之方法亦佳。例如HA的 羧酸、與己二酸二醯肼基(ADH)或伸乙基二胺、伸乙烯 二氧基雙乙胺等2價HZ或含有胺基的化合物以偶合劑進 行縮合,合成導入醯肼基之HA衍生物(HA — HZ )或導 入胺基的ΗA衍生物(HA -胺基),將此與例如N —琥珀 醯亞胺一 3 — ( 2 -吡啶二硫代)丙酸脂(SPDP )進行反 應,以DTT等還原劑進行還原,作爲氫硫基的方法、或2 —iminothiolane( Trout’s Reagent)與酸眺基、或與胺基 反應之方法。 作爲偶合劑,例如可舉出苯並***- 1 -基氧基-三 -13- 200526253 (11) (二甲基胺)鱗六氟磷酸鹽(BOP )、苯並***一 1 一基 氧基一三吡咯烷鳞六氟磷酸鹽(PyBOP ) 、N,N > —羰 基二咪唑(CDI) 、N,N< -二環己基碳化二亞胺(DCC )、1 一乙基一 3 — (3 -二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽 酸鹽(EDC) 、EDC/3,4 —二氫—3 - 淫基一 4 一叛基— 1,2,3 —苯並三嗪(HODhbt) 、N —乙氧基羰基一 2-乙 氧基一1,2 —二氫D奎啉(EEDQ) 、4— (4,6—二甲氧基 —1,3,5 —三嗪一2- 基)一 4 —甲基瑪琳(morpholinum )氯化物正水合物(DMT— MM) 、2-(11^一苯並*** 一 1 一基)一1,1,3,3 —四甲基尿鹽 四氟硼酸鹽( TBTU )等。 本發明的可交聯官能基爲,例如可藉由含於多醣的分 子內的羧基轉換成含有如下述的氫硫基、不飽和鍵結、胺 基或醯肼基之酯基或取代醯胺基而導入。 -CO-N ( -R1)-Y]-Q,-Y2-N ( -R2)-Y3-Q3-SH; - CO-N ( -R】)-N ( -R2)-Y3-Q2-SH; -CO-N ( -ROK^YrN ( -R2)-Y3-Q4; ‘CO-N ( -R + N ( -R2)-Y3-Q4;或 -CO-N ( -R1).Y1.Q1.Y2-NH2 ; (式中,R!表示氫原子、直鏈或支鏈C】—1G烷基、直鏈或 支鏈C !-】G羥基烷基、聚氧化伸烷基、聚肽基、或聚酯基 、 Υι 表示單鍵、—N( — R3) CO—、— N( — R3)—、 —CO — 、或一CH2CO —、 -14- 200526253 (12) Y2 表示單鍵、一 CON( — R4) CO—、或一 n(—R4)
Qi表示直鏈或支鏈C〗—io伸烷基、直鏈或支鍵Cl — 10 羥基伸烷基、聚氧化伸烷基、聚肽基、或聚醋基、 R2、R3及R4表示各自獨立的氫原子、直鏈或支鍵 c i ! 0烷基、直鏈或支鏈C !-】〇羥基烷基、聚氧化伸院基 、聚肽基、或聚酯基、 Y3 表示單鍵、一 CO -、— C〇2—、— CH2— CH(0H )或一C Ο N Η — Q2表示直鏈或支鏈伸烷基、直鏈或支鏈C】-10 羥基伸烷基、聚氧化伸烷基、聚肽基、或聚酯基、 Q4表示直鏈或支鏈C2-1()烯基、或直鏈或支鏈C2— 10 炔基)。 導入氫硫基的多醣衍生物之例子較佳爲’含有分子內 具有至少1個以上之式(I):
-15- 200526253 (13) (式中,X2 表示一 Yi— Qi— Y2— N(— r2) — γ3 — Qi — 311、或->^(-112) - Y3— Q2 - SH。
Ri表不氫原子、直鏈或支鏈Ci-1G院基、直鏈或支鏈 C ! - ! 〇羥基烷基、聚氧化伸烷基、聚肽基、或聚酯基、
Ra2、Ra3、Ra4、Ra5及Ra6表不各自獨立的氯原子、 直鏈或支鏈C!— 6烷基、直鏈或支鏈的烯基、直鏈或 支鏈Ci-6炔基、直鏈或支鏈Ci-6院基鑛基、直鏈或支鏈 的烯基羰基、直鏈或支鏈Ct 6炔基羰基、或 -S020H、 Y】表示單鍵、—N( — R3) CO—、— N (一 r3) 一、 -CO —、或一 CH2CO -、 Y2 表不單鍵、—CON ( — R4) CO—、或一 n ( — R4) Q!表示直鏈或支鏈C!—伸烷基、直鏈或支鏈Cl-】〇 羥基伸烷基、聚氧化伸烷基、聚肽基、或聚酯基、 R2、R3及R4表示各自獨立的氫原子、直鏈或支鏈 C ! - ! 0烷基、直鏈或支鏈C】-! 〇羥基烷基、聚氧化伸烷基 、聚肽基、或聚酯基、 Y3 表示單鍵、一 CO—、- C〇2 -、—CH2— CH(0H )或—CONH- q2表示直鏈或支鏈伸烷基、直鏈或支鏈c]_10 羥基伸烷基、聚氧化伸烷基、聚肽基、或聚酯基)所表示 的重複結構之透明酸衍生物。 式(I)中,所謂聚氧化伸烷基爲 -16- 200526253 (14) —(CH(— R) CH2〇) n— H(式中,R表示氫原子、或 C ! - 5烷基)所示基,較佳爲聚氧化伸乙基或聚氧化伸丙 基,更佳爲η爲1〜20的整數。又,聚肽基雖無特別限定 但較佳爲1〜2 0個胺基所成者。又聚酯基雖無特別限定但 較佳爲聚乙醇酸基、聚乳酸基。 且,式(I )中,Ri較佳爲氫原子,Χ2較佳爲 —Y1—Q1—Y2— N (— R2) — Y3— Q2— SH。且式(II)中 ,Υι較佳爲單鍵或—Ν (- R3 ) -,Υ2較佳爲單鍵,Q! 較佳爲直鏈或支鏈C! - 4伸烷基。且式(II )中,R2及R3 較佳爲氫原子,Y3較佳爲一 CO-,Q2較佳爲直鏈或支鏈 C i - 4伸烷基。 氫硫基的不飽和鍵結之間的加成反應作爲交聯反應利 用時,混合導入具有不飽和鍵結的基之HA衍生物等的多 醣衍生物、與具有2個以上的氫硫基的化合物(例如,二 硫蘇糖醇(DTT ) 、丁二硫醇、聚乙二醇二硫醇、含有2 個以上半胱胺酸之肽、導入氫硫基的HA衍生物等)亦可 ,相反地混合導入氫硫基的多醣衍生物、與具有2個以上 具有不飽和鍵結基的化合物(例如乙二醇二甲基丙烯酸酯 、伸乙基雙丙烯基醯胺、三- 2 -馬來酸酐縮亞胺乙基胺 、1,8 —雙馬來酸酐縮亞胺三乙二醇、1,4 一雙馬來酸酐 縮亞胺基一 2,3 -二羥基丁烷、導入不飽和鍵結的HA衍 生物等)亦可。又,此時欲提高交聯反應時的蛋白質或肽 之安定性、及反應速度,添加三乙醇胺等鹼性化合物爲佳 。作爲此時的較佳濃度爲1 0 " L / mL〜2 0 μ L / m L。具有 -17- 200526253 (15) 2個以上氫硫基之化合物,例如可含有直鏈或支鏈狀的 C2 - ! 〇伸烷基二硫醇(其中,伸烷基部份可***1以上的 氧原子,及/或可由1個以上的羥基取代)。 導入不飽和基的多醣衍生物之調製方法雖無特別限定 ,例如甲基丙烯酸環氧丙醚、或甲基丙烯酸酐等於HA的 羥基上直接反應之方法(J. Biomed. Mat. Res. 54,115-121,200 1 )下難得到較高導入率。此可考慮爲HA於水溶 液中藉由氫鍵、疏水性相互作用而形成高次結構後,降低 羥基、羧酸基等官能基反應性。欲延長蛋白質或肽的緩釋 時間,可望較高交聯密度。因此,於葡糖醛酸部份的羧基 上導入取代基爲佳。例如,HA作爲3級銨鹽,溶解於 DMSO等極性有機溶劑,於1 一乙基—3 —( 3 —二甲基胺 基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC )、苯並***一 1 一基 氧基一三(二甲基胺)鱗六氟磷酸鹽(BOP )、苯並三 唑—1 —基氧基—三吡咯烷鱗六氟磷酸鹽(PyBOP )等偶 合劑的存在下,由與具有不飽和鍵結之胺或醯肼進行反應 之方法調製出。具有不飽和鍵的胺雖無特別限定,例如可 舉出烯丙胺、二烯丙胺、4一胺基一 1- 丁烯、丙烯基醯阱 、甲基丙烯基醯肼等。 又導入上述的胺基或醯肼後,於該胺基或醯肼基上導 入具有不飽和鍵結的基之方法爲佳。例如HA的羧酸、與 己二酸二醯肼基(ADH )或伸乙基二胺、伸乙烯二氧基雙 乙胺等2價HZ或含有胺基的化合物’以EDC、BOP、 P y B 0 P等縮合劑進行縮合,合成經醯肼修飾之Η A衍生物 -18- 200526253 (16) (HA — HZ )或經胺基修飾HA衍生物(HA —胺基),此 與具有不飽和鍵結的羧酸衍生物,例如R】〇 - C Ο Ο Η之酸 酐或活性化酯(其中,R ! 〇表示直鏈或支鏈C 2 - , 〇烯基) ,較佳爲甲基丙烯酸酐、· N -羥基琥珀醯酵亞胺(NHS ) 活化丙烯酸或甲基丙烯酸等進行反應之方法。 HA等多醣上導入具有不飽和鍵之基後,以氫硫基進 行交聯時,對於具有氫硫基不飽和鍵結之基的比率並無特 別限定,斯業者可適宜地選擇使用,其中欲使與蛋白質、 肽之反應爲最小,且防止不飽和基於凝膠中之殘存’且可 快速地反應,以氫硫基··具有不飽和鍵之基=3 : 1〜1 : 2 爲佳,更佳爲2 : 1〜1 : 1。 於HA上導入氫硫基後, 以氫硫基進行交聯時,對於具有不飽和鍵結之基進行 交聯時,對於具有不飽和鍵之基的氫硫基之比率並無特別 限定,斯業者可適宜地選擇使用,其中欲使與蛋白質、肽 之反應爲最小,且防止不飽和基於凝膠中之殘存’且可快 速地反應,以具有不飽和鍵之基:氫硫基:=3 : 1〜1 : 2 爲佳,更佳爲2 : 1〜1 : 1。 導入具有不飽和鍵之基的多醣衍生物例子,較佳爲分 子內含有至少1個具有式(π); -19- 200526253 (17)
(式中,χ3 表示—Υι - Q】—Y2— N(— R2) — Y3— Ch、或 -N ( - R2 ) 一 Y3 - Q4。 h表示氫原子、直鏈或支鏈烷基、直鏈或支鏈 C ! - 1 〇經基院基、聚氧化伸院基、聚肽基、或聚醋基、
Ra:2、Ra3、Ra4、Ra5及Ra6表示各自獨立的氫原子、 直鏈或支鏈Ci-6烷基、直鏈或支鏈的C!-6烯基、直鏈或 支鏈Ci-6炔基、直鏈或支鏈C!-6烷基羰基、直鏈或支鏈 的烯基羰基、直鏈或支鏈Cl_6炔基羰基、或一 S〇2OH、
Yi 表示單鍵、—N(— R3) CO—、— N(— R3)—、 -CO—、或—CH2CO—、 Y2 表不單鍵、一 CON ( — R4) CO—、或一 N ( — R4) γ3 表示單鍵、一 CO—、或—ch2co-、
Ql表示直鏈或支鏈伸烷基、直鏈或支鏈(:!-!〇 羥基伸烷基、聚氧化伸烷基、聚肽基、或聚酯基、 R2、R3及R4表不各自獨立的氫原子、直鏈或支鏈 -20- 200526253 (18) C】-1 ο烷基、直鏈或支鏈C丨-】G羥基烷基、聚氧化伸烷基 、聚肽基、或聚酯基、 Q4表示直鏈或支鏈C2-1G烯基、或直鏈或支鏈C2— 10 炔基)所表示的重複結構之透明酸衍生物。 … 其中式(II )中,所謂聚氧化伸烷基爲 —(CH (- R) CH20) n—H(式中,R表示氫原子、或 C 5烷基)所示基,較佳爲聚氧化伸乙基、聚氧化伸丙 基,更佳爲η爲1〜2 0的整數。又,聚肽基雖無特別限定 但較佳爲1〜2 0個胺基所成者。又聚酯基雖無特別限定但 較佳爲聚乙醇酸基、聚乳酸基。 且,式(II )中,Ri較佳爲氫原子,Χ3較佳爲 -Yi - Qi - Υ2- Ν ( - R2 ) 一 γ3— q4。且式(π)中,γ】 較佳爲單鍵、—N( — R3) CO—、或—N( — R3)—,更 佳爲一 N ( — R3 ) CO -。又,Y2較佳爲單鍵、 —CON (— R3)—,更佳爲一 CON(— R3) -,Y3 較佳爲 早鍵、—CO—、或一 N(— R3)—,更佳爲—CO—。且 式(II)中,Q1較佳表示直鏈或支鏈Ci-4伸烷基,112及 R3較佳爲氫原子,Q4較佳爲直鏈或支鏈C2- 1()烯基。 又,導入氫硫基的多醣衍生物例子,含有分子內具有 至少1個以上的上述式(I )所示重複結構之透明酸衍生 物等。 交聯反應可利用導入醯肼基的HA酸衍生物等多醣衍 生物與活性羧酸之反應。對多醣的醯肼基導入可進行斯業 者公知的方法,例如將含有透明質酸之羧基與2價的醯肼 -21 - 200526253 (19) 之化合物(二醯肼化合物),使用縮合劑使其縮合後合成 。作爲二醯肼化合物可舉出琥珀酸二醯肼、戊二酸二醯肼 、己二酸二醯肼、庚二酸二醯肼。又,作爲縮合劑可舉出 1,3—二環己基碳化二亞胺、1,3-二異丙基碳化二亞胺 、1 一乙基一 3 —(3 —二甲基胺基丙基)碳化二亞胺等。 例如將透明質酸之羧酸與己二酸二醯肼(ADH )以1 一乙 基一 3 - (3 —二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC )進行 縮合,合成出以醯肼基修飾的透明質酸(HA - HZ )。作 爲交聯劑,僅可與HZ基反應之官能基即可並無特別限定 ,但例如可舉出同一分子內含有2個以上之NHS活化之 酯基、五氟苯氧羰基、對硝基苯氧羰基、咪唑羰基、異硫 氰酸根基、氯化磺醯基、氟化磺醯基、甲醯基、乙烯磺醯 基、酸酐、4 -硝基苯基甲酸鹽等之官能基者的分子者。 該交聯劑的例子可含有雙〔磺基琥珀醯酵亞胺〕辛二酸鹽 、二琥珀醯酵亞胺戊二酸鹽、二琥珀醯酵亞胺酒石酸鹽、 乙二醇雙〔琥珀醯酵亞胺琥珀酸鹽〕等。 與對胺基的HZ基之選擇性反應性,若考慮到蛋白質 的變性以交聯時的pH爲3.0〜6.0爲佳,更佳爲pH 4.0〜 6 · 〇。欲保持交聯反應中pH於此範圍內,所使用的緩衝液 爲揮發性較低者,例如以檸檬酸爲佳。與交聯劑中的醯肼 基反應之化合物官能基爲,對凝膠調製液中的醯肼基而言 爲4 0莫耳%以下爲佳,更佳爲20莫耳%以下,特佳爲 1 〇莫耳%以下。 可交聯反應的官能基對Η A之導入率爲雖無特別限定 -22- 200526253 (20) ’但得到於活體內不會有流動性之凝膠,ha對葡糖II酸 爲5莫耳%以上爲佳,1 〇莫耳%以上爲特佳。又,藥物 的緩釋性能因取決於經交聯的HA衍生物之交聯密度,故 藉由控制導入率可控制藥物的緩釋時間。 導入醯肼基的多醣酸衍生物之例子爲,含有分子內具 有至少1個以上之式(III):
(式中,Ri表示氫原子、直鏈或支鏈Ci-io烷基、直鏈或 支鏈C ! - ; 〇羥基烷基、聚氧化伸烷基、聚肽基、或聚酯基 、 Χι 表示—Yi — Qi — Y2 - NHNH2,
Ra2、Ra3、Ra4、Ra5及Ra6表示各自獨立的氫原子、 直鏈或支鏈C!— 6烷基、直鏈或支鏈的C^-6烯基、直鏈或 支鏈C!-6炔基、直鏈或支鏈C!—6烷基羰基、直鏈或支鏈 的烯基羰基、直鏈或支鏈Cl-6炔基羰基、或一 S〇2〇H、 Y i 表示單鍵、一 N (- R3) CO—、一 N (— R3)—、 — CO—、或一CH2CO—、 -23- 200526253 (21) (^表示單鍵、直鏈或支鏈1G伸烷基、直鏈或支鏈 C 1 - 1 〇經基伸院基、聚氧化伸院基、聚肽基、或聚酯基、 Y2 表示單鍵、一 N ( — R4 ) CO -、— CO —或一 CH2CO — R3及R4表示各自獨立的氫原子、直鏈或支鏈C!— 10 烷基、直鏈或支鏈C , — , 〇羥基烷基、聚氧化伸烷基、聚肽 基、或聚酯基) 所表示的重複結構之透明酸衍生物。 式(III )中,R!較佳爲氫原子,Ra2、Ra3、Ra4、Ra5 及Ra6較佳表示氫原子,Y!較佳表示單鍵或—CO—,Q! 較佳表示直鏈或支鏈伸烷基,Y2較佳表示單鍵或-C0—,R3較佳表示氫原子,R4較佳表示氫原子。 又式(III )中,所謂聚氧化伸烷基爲, —(CH(— R) CH20) η— OH(式中,R表示氫原子、直 鏈或支鏈C!-5烷基)所示基,較佳爲聚氧化伸乙基、聚 氧化伸丙基,又η較佳爲1〜20整數。又,聚肽基雖無特 別限定,但較佳爲1〜20個之胺基所組成。又,聚酯基雖 無特別限定,但較佳爲聚乙酸基、聚乳酸基。 本發明的交聯透明質酸微粒子製造方法爲,藉由微粒 子的溶劑餾去而同時進行乾燥與交聯反應之製造方法即可 。例如液體使用噴霧乾燥之噴霧乾燥機,藉由進行含有具 有可交聯反應的官能基透明質酸衍生物與藥物之溶液的噴 霧乾燥,於濃縮乾燥中交聯透明質酸衍生物,將藥物封入 透明質酸交聯體中得到藥物載持微粒子。使用噴霧乾燥機 -24- 200526253 (22) 時,欲防止藥物的變性,乾燥溫度設定於1 〇 〇 t以下爲佳 〇 或可交聯反應的Η A衍生物(四丁基銨鹽)與藥物溶 解於DMSO等極性有機溶劑中,添加二氧化碳等超臨界液 體,萃取D M S Ο而引起透明質酸濃縮中的交聯反應而得到 微粒子。使用這些微粒子化方法時,藉由添加Tween - 20 、Tween — 80等界面活性劑(1 %〜2%程度),可提高微 粒子的回收率。又,使用這些製造方法時,必須使用濃縮 前不會引起的交聯反應之調製液。由交聯劑混合至濃縮之 時間隨交聯性官能基的導入率、透明質酸分子量、濃度而 不同,但交聯性官能基的導入率可爲5莫耳%〜70莫耳 %,透明質酸分子量爲1萬道爾頓〜200萬道爾頓,透明 質酸濃度爲0. 1 %〜5 %爲佳。 又,做爲其他方法含有具有可交聯反應的官能基之透 明質酸衍生物與藥物之水溶液,於具有脫水性的液體(例 如,分子量400道爾頓之聚乙二醇等)中進行乳化時,於 脫水濃縮中進行透明質酸的交聯,將藥物封入透明質酸交 聯體中得到藥物載持微粒子。使用該方法時,欲提高封入 率,以陽性或中性的藥物爲佳。 又,微粒子形成後經熱處理可降低含水率,使交聯 反應完全終了爲佳。此時交聯密度亦提高,且緩釋時間的 延長亦可期待。其中熱處理的溫度並無特別限定,例如於 30〜1 1(TC,較佳爲30〜60°C下進行。 乾燥後的微粒子徑可依據用途而使其最適化,但欲使 -25- 200526253 (23) 其可注射化,一般以 0 . 〇 1 # m〜1 5 0 # 1Ώ爲佳。經鼻、經 肺投與時以〇 . 〇 1 // m〜5 // Π1的吸入效率爲佳,靜脈注射 投與時爲Ο.ΟΙμπι〜〇.2//m程度之血中含有濃度爲佳。 使用於本發明的HA可使用任意方法所得之HA,由 動物組織所萃取出之HA、由發酵法所得之HA、由化學合 成所得之Η A等,其來源不受限制。且’ H A亦可再經水 解處理等處理。本發明的H A可使用種種方法所修飾之修 飾HA、或含有鈉、鉀、鋰等之鹼金屬鹽等。HA多數由羧 基與羥基修飾,但本發明中修飾HA可爲任意部份經修飾 者。修飾HA並無特別限定,可經任意修飾,例如經硫酸 化的HA ( WO 9 5/2 5 7 5 1 )、經N -硫酸化的HA ( WO 98/45335)、經酯化的 HA(EP0216453、 WO 98/0 8 8 76、EP03 4 1 745 )、過碘酸氧化之HA、經醯胺 修飾的HA等。 本發明所使用的原料HA之分子量並無特別限定,可 使用任意分子量的HA,但一般爲使用5000道爾頓〜350 萬道爾頓、較佳爲1萬道爾頓〜100萬道爾頓之HA。又 ’ HA的分子量濃度因會影響到製造後的粒子徑,故可配 合目的的粒子徑做選擇。 具有藥效的蛋白質、肽雖無特別限定,但例如可舉出 紅血球生成素(EPO )、白血球生長激素(G— CSF)、間 白素一〇、々、7(川?—〇、/5、7)、血栓形成素( 丁PO )、睫狀神經營養因子(CNTF ) 、TNF受體結合蛋 白(TNFbp)、間白素—1〇 ( IL — 10 )、擬FMS酪胺酸活 -26- 200526253 (24) 化酵素一 3( Fit - 3)、成長激素(GH)、胰島素、擬胰 島素成長因子一 】)、來自血小板成長因子( PDFG)、間白素—1受體拮抗物(1L — lra)、源自腦之 神經滋養因子(B D N F )、表皮細胞成長因子(K G F )、 幹細胞因子(SCF )、巨核細胞生長衍生因子(MGDF ) 、造骨細胞(0PG )、萊普亭(leptine )、副甲狀腺素( PTH )、鹼性成纖維細胞成長因子(b - F G F )、骨形成蛋 白質(BMP )、心房性鈉利尿肽(ANP )、腦性鈉利尿肽 (BNP ) 、C型鈉利尿肽(CNP )、擬胰高血糖素肽一 1 ( GLP-1)、抗體、微型雙功能抗體(Diabody)等。又, 本發明的藥物緩釋載體亦可使用低分子量化合物之藥劑。 作爲低分子藥.劑爲,可舉出制癌劑(例如烷基化劑、代謝 拮抗劑、生物鹼)、免疫抑制劑、消炎劑(例如類固醇類 、非類固醇類系消炎劑)、抗風濕劑、抗菌劑(例如,冷 -丙烯胺系抗生素、胺基葡萄糖苷、紅黴素系抗生素、四 環素系抗生素、新醌系抗生素、硫磺劑)等。 本發明的緩釋載體可作爲含有1種或1種以上的藥學 上可被接受的稀釋劑、濕潤劑、乳化劑、分散劑、補助劑 、防腐劑、緩衝劑、結合劑、安定劑等藥學組成物,可對 應目的投與途徑進行各種任意的適當型態之投與。投與途 ί空可爲非經口性途徑或經口性途徑皆可。 【實施方式】 實施例 -27- 200526253 (25) ΕΡ Ο封入交聯透明質酸微粒子之調製 以下對本發明的較適實施例做詳細說明,但本發明並 未限疋於這些實施例中。 NMR測定爲使用核磁共鳴裝置JNM— ECA5 00 (日本 電子股份有限公司製作)以重水(D20 )作爲溶劑進行測 定。又取代基的導入率決定可由導入的取代基所特有的吸 收峰與來自透明酸之吸收峰的積分比所得。 〔實施例1〕 〔實施例1 一 1〕導入醯肼基(HZ基)之透明質酸衍生物 (HA— HZ)的合成
ha^hz 將2〇〇 mg的分子量ι·9χΐ〇5道爾頓之透明質酸(HA )(電氣化學工業股份有限公司製作)以0.5%濃度溶解 於蒸鶴水中,以5N鹽酸將PH調整爲4 · 7〜4 · 8。添加1 — 乙基〜3 — ( 3 一二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽( -28- 200526253 (26) EDC)與己二酸醯肼(ADH)至 HA: EDC: ADH=1: 〇·3 :4 0 (批組 1 — 1 ) 、1 : 1 ·· 4 0 (批組 1 一 2 ) 、:1 : 5 : 4 0 (批組1 一 3 )之莫耳比,以5N鹽酸保持pH爲4.7〜4.8 下於室溫攪拌2小時使其反應。1 〇〇 mM氯化鈉溶液、25 %乙醇溶液下進行透析,冷凍乾燥後得到標題HA 一 HZ ° 所得之HA — HZ中的HZ基導入率以質子NMR法定 量時,分別爲Η A的羧酸之2 6 % (批組1 一 1 ) 、4 6 % ( 批組1 一 2 ) 、69% (批組1 — 3 )經HZ化(比較HA及 HA — HZ 之 N—乙醯基(1.9ppm,3H) 、HA— HZ 的來自 己二酸部份之伸甲基(1.6ppm,2.3ppm,各2H))。 〔實施例1 一 2〕導入氫硫基(SH )之透明質酸衍生物( HA — SH )的合成 HA-HZ -卜
將各1 00 mg的實施例1 — 1的批組1 — 3之HA - HZ ,溶解於5 mL的1 00 mM磷酸緩衝液pH 8 ( HA - HZ : 2 % w/ v )、添加(HZ / ITL = 1 / 2莫耳比)亞胺四氫噻 吩(ITL ),室溫下攪拌進行2〜4小時的反應。以乙醇沈 澱洗淨3次後乾燥。又,所得之HA - SH中的SH基導入 率以質子NMR法定量’結果如表1所示。(比較HA及 HA— SH 的 N —乙醯基(]·9 ppm,3H) 、HA — SH 的來自 -29- 200526253 (27) ITL部份之伸甲基(2.1 ppm與2.7ppm,各2H)) 表1 對照 批組1 批組2 批組3 HZ基之導入率 0% 26% 46% 69% SH基之導入率 0% 2 0% 3 5% 5 6% 〔實施例1 一 3〕EPO封入交聯透明質酸微粒子的調製 將實施例1 一 2的批組1中,SH基導入率爲20莫耳 %的200 mgHA—SH、與2 mg紅血球生成素(EPO)溶解 於20 ml的10 mM磷酸緩衝液pH 8 ( PB )(室溫下攪拌 1小時)。於此加入4 mg的Tween - 20、對SH基而言爲 1旲耳倍之四連多硫酸鈉(Sodium tetrathionate: STT) 22·3 mg。將該溶液以下述條件下進行噴霧乾燥得到微粒 噴霧乾燥機:BUCHI公司製作,迷你噴霧乾燥機b - 19 1 溶液送出速度· 1.5 rnL/min(Tygon tube, Pump speed=l 5% ) 送出溶液濃度:10mg/ mL 霧狀空氣流速:6 5 0 L / h ι· 乾燥空氣流速· 4〇kL/hr ( Aspiration speed = 65°/〇) 內溫:8 5〜9 5 t:
外溫·· 5 0〜6 0 °C -30- 200526253 (28) 〔實施例2〕
實施例1 一 3的實驗操作中,使用批組2的導入SH 基之導入率爲35%的200 nigHA— SH、與62.4 mg (對SH 基爲1莫耳倍)的四連多硫酸鈉(Sodium tetrathionate : STT)以外,其他與實施例1 一 3相同方法調製出EP0封 入交聯透明質酸微粒子。 〔實施例3〕 實施例1 一 3的實驗操作中,使用批組3的導入S Η 基之導入率爲56%的200 mgHA— SH、與62.4 mg (對SH 基爲1莫耳倍)的四連多硫酸鈉(Sodium, tetrathionate : STT )以外,其他與實施例1 一 3相同方法調製出EP0封 入交聯透明質酸微粒子。 〔實施例4〕 於實施例1 一 3的實驗操作中,2 0 0 m g的批組3的導 入SH基之導入率爲56莫耳%的HA - SH、與對於SH基 爲 〇.7莫耳倍之 38.9mg四連多硫酸鈉(Sodium tetrathionate: STT)以外’其他與實施例1— 3相同方法 調製出Ε Ρ Ο封入交聯透明質酸微粒子。 〔實施例5〕 於實施例1 一 3的實驗操作中,2 0 0 m g的批組3的導 200526253 (29) 入SH基之導入率爲56莫耳%的ha 一 SH、與對於SH基 爲 0.5莫耳倍之 27.8 mg四連多硫酸鈉(Sodium tetrathionate: STT)以外,其他與實施例1— 3相同方法 調製出EPO封入交聯透明質酸微粒子。 〔實施例6〕 於實施例3的實驗操作中,取代4 mg的Tween — 20 ,使用4 m g的T w e e n — 8 0以外,其他與實施例3相同方 法調製出ΕΡ Ο封入交聯透明質酸微粒子。 〔實施例7〕 於實施例3的實驗操作中,未添加Tween— 20以外 ’其他與實施例3相同方法調製出EPO封入交聯透明質 酸微粒子。 〔實施例8〕 於實施例3的實驗操作中,未添加STT以外,其他 與貫施例3相同方法調製出EPO封入交聯透明質酸微粒 子。 〔比較例1〕 將d mg的實施例】一 2所調製出的批組3之SH基 導入午爲5 6美耳%的Η A - S Η,溶解於6 9 0 // L的1 〇 m Μ 酸緩衝液(ρ Η 8 · 〇 ),添加3 〇 β L的Ε Ρ Ο水溶液(1 〇 -32- 200526253 (30) mg/ mL ),經】〇分鐘攪拌。將此加入溶解於30 // L的 1 0 m Μ磷酸緩衝液ρ η 8.0之9 · 3 m g的對S Η基的I莫耳 倍之四連多硫酸鈉(Sodium tetrathionate : STT )的溶液 中,將2 5 0 // L裝入;[m L注射器中於3 7 °C下反應5小時, 得到圓柱狀HA凝膠。 〔比較例2〕 實施例8中,取代HA - SH使用HA以外,其他與實 施例8相同的方法調製出Ep〇封入ha微粒子。 且’實施例1〜8及比較例2的各微粒子回收率爲5 〇 % 〜65%。 〔試驗例1〕粒子徑、粒子含水率測定 實施例3所調製之微粒子的顯微鏡照片如圖1表示( 3〇〇〇倍)。該微粒子分散於PBS中時的顯微鏡照片如圖 2表示(3〇〇〇倍)。該微粒子乾燥時的粒子徑約爲1 ·2 // m ’水膨潤時的粒子徑約爲1 . 8 μ m。 進行熱重量分析(TGA ),測定以實施例3製造出的 微粒子之含水率(圖3 ),其含水率約爲]5 %。 〔試驗例2〕EP0封入交聯透明酸微粒子之EPO回收率測 定 將5 mg的實施例1〜8,比較例2之微粒子分散於 0.5 mL 的 pbs,添加 〇·25 單位的 Hyaluronidase SD (生 -33- 200526253 (31) 化學工業製:Hase) ,25°C下進行3小時之酵素處理,使 微粒子完全溶解。又,比較例1的凝膠(0.25 mL凝膠) 中加入〇.75mL含有0.5單位Hyaluronidase SD (生化學 工業製)之PBS ΡΗ 7·4,於25t:下進行1天的酵素處理 ,使凝膠完全溶解。將〇 · 1 5 mL的酵素處理後之溶液作爲 試料溶液。對試藥溶液進行逆相色層(RP 一 HP LC )測定 ,以0.1 m g / m L的Ε Ρ Ο水溶液作爲標準溶液,由標準溶 液與試料溶液的吸收峰區域比算出試料溶液中的EP 0濃 度。對於所添加的EP◦量(0.1 mg/凝膠1個)由Rp一 HPLC所求得之EPO量作爲回收率。 經逆相管柱之高速液體層析(RP - HPLC )的分析, 使用W at e r s 6 0 0 s控制者、7 1 7 ρ 1 u s自動採樣機、4 8 6紅外 線吸收測定器(Water公司製作),以下述條件進行。 管柱:C4(粒子徑 5//m,尺寸 4.6x250mm) 移動相 A ··水/乙腈/三氟乙酸=400 / 1 〇〇/ :[ B:水/乙腈/三氟乙酸= 100/400/1 流速:lmL /分鐘,移動相 A/B=65/35〜0/ioo 分段式溶離出。 管柱溫度:室溫附近 取樣溫度:41 檢測波長:UV 2 80nm 解析軟體:M i 11 e n i u m 3 2 v e r · 3.2 1 對於裝入由上述方法所測定的EPO之回收率如下述 -34- 200526253 (32) 實施例1〜4 : 90%〜95% 實施例5及6: 80%〜85% 實施例7及8 : 75%〜80% 比較例1及2 : 90%〜95% 由上述結果可確認添加STT、界面活性劑時可改善回 收率。 〔試驗例3〕由EPO封入HA水凝膠調製之EPO緩釋 實施例3的20 mg微水凝膠與比較例1的全凝膠( 2 5 0 // L )於2 m L的P B S中進行3 7 °C的恆溫培養,經時性 地採樣200 // L樣品。以RP — HPLC定量釋出於緩衝液中 之EPO量。 凝膠調製後馬上以透明質酸酶進行分解’經回收的 EPO作爲1 00%時,由凝膠之EPO釋出性如圖1所示。且 ,9天後添加透明質酸酶(Hase)。 凝膠內的EPO並未變性,而比較例1的凝膠因交聯 密度較爲低故EPO釋出較爲快,實施例3的微水凝膠因 交聯密度較高,故5天左右釋放出3 0 %左右,由上得知 40%的EPO無法由擴散釋出,係藉由酵素分解而釋出。 -35- 200526253 (33) 藉由使用上述實施例所列舉的藥物封入透明質酸交聯 體中之藥物載持微粒子時,維持蛋白質或肽等藥物生物活 性下,可將此進行原位(in situ )交聯、乾燥,調製出凝 膠微粒子之中封入蛋白質或肽等長時間釋出之可注射用藥 物緩釋製劑。 〔實施例9〕
〔實施例9 一 1〕導入醯肼基(HZ )之透明質酸衍生物Η A
混合溶劑法)
將76.0 mg的分子量2x105道爾頓之HA (電氣化學 工業股份有限公司製作)溶解於蒸餾水/ EtOH = 50/ 50 至〇· 1 %濃度,以5N鹽酸調製pH爲4·7〜4·8。將1 一乙 基〜3 一 (3 —二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC )與己二酸二醯肼基(ADH),添加至ΗΑ的單位(1單 位=重複單位之Ν -乙醯基葡糖胺—葡糖醛酸):EDC : -36- 200526253 (34) ADH=1: 4: 40莫耳比,以5 N鹽酸保持PH爲4.7〜4.8 下於室溫反應2小時。對於大量過剩的1 〇 〇 m Μ氯化鈉溶 液、25%乙醇溶液、蒸餾水之順序進行透析(光譜pore 7 ,部份分子量(MWCO ) : 12k — 14k道爾頓),冷凍乾燥 後得到57.0 mg之標題的導入醯肼基(HZ基)之透明酸 (HA - HZ )。所得之 HA — HZ中的 HZ基導入率作爲 ADH導入率以質子NMR法定量(HA: N —乙醯基(1.85 ppm ),比較HZ:來自ADH的4個伸甲基(1.5、2_1及 2.25 ppm) ) 。HZ 導入率爲 47%。 〔實施例9 一 2〕導入氫硫基(S Η )之透明酸衍生物Η A - HZ— SH合成 HA-HZ -卜
]00 mg的與實施例9 — 1相同方法所合成之HA - HZ 、溶解5 mL的100 mM磷酸緩衝液(pH 8 ) ( HA - HZ : 2% w/ v )、添加(HZ/ITL=l/2莫耳比)亞胺四氫噻 吩(ITL ),室溫下攪拌2小時進行反應。以乙醇沈澱、 洗淨3次、乾燥。所得之HA — HZ - SH中的SH基導入率 以質子NMR法定量,結果SH導入率爲37.5莫耳%。( 比較 HA 及 HA - HZ — SH 的 N —乙 基(1.9 Ppm,3H) 、HA — HZ — SH的來自1TL部份之伸甲基(2· 1 ppm與 -37- 200526253 (35) 2 · 7 ppm,各 2H))。 〔實施例1 0〕導入甲基丙烯醯基(MA )的透明質酸衍生 ΗΑ·ΗΖ 物HA — HZ— ΜΑ之合成
HA的分子量爲2 χ 1 04道爾頓以外,以與實施例1 — i 的批組3相同方法所合成之HA — HZ ( HA的羧酸爲63% HZ化)溶解於蒸餾水後,添加1 μ磷酸緩衝液(pH 8.8 ) ,調製出HA濃度爲50 mg/ mL的0.1M磷酸緩衝液。滴 入添加甲基丙烯酸酐至HZ的20倍當量,室溫下攪拌1 晚使其反應。以四氫呋喃沈澱後回收乾燥。沈澱物溶解於 蒸餾水,再次以四氫呋喃沈澱、乾燥後將乾燥物溶解於蒸 餾水中,進行冷凍乾燥得到標題Η A - HZ - Μ A。 甲基丙烯醯基的導入率由質子NMR算出(比較HA : N—乙醯基的甲基質子(1.8〜1.9 ppm) 、ΜΑ:甲基丙烯 醯基之CH2= (5.5〜6.1 ppm) ) 。ΜΑ導入率爲22%。 〔實施例Π〕
〔實施例1 1 一]〕導入胺基(AM )之透明質酸衍生物Η A —A Μ的合成 •38- 200526253 (36)
Η
分子量2.ΟχΙΟ5道爾頓之透明質酸鈉(ΗΑ)(電氣 化學工業股份有限公司製作)使用藉由四丁基銨氫氧化物 (Sigma-Aldrich公司)使四丁基銨(TBA )氯化之 DOWEX 50WX8 — 400 ( Sigma-Aldrich 公司)進行 TBA 氯 化。 將透明質酸四丁基銨鹽(HA - TBA )溶解於DMSO ( 和光純藥股份有限公司)至2.0 mg/ mL濃度後,以EDA 、BOP的順序添加至HA單位/ BOP (和光純藥股份有限 公司)/ 伸乙基二胺(EDA) (Sigma-Aldrich 公司)=1 /2.5/50 ( mo 1/mol/mol)之當量比,室溫下攪拌反應 一晚。其後添加反應溶液的1 / 2量之氯化鈉水溶液後, 加入5N HC1使pH降至3,再以2N NaOH進行中和。大 量過剩的〇 · 3 Μ氯化鈉水溶液、蒸餾水之順序進行透析純 化(光譜P〇re 7,部份分子量(MWCO ) : 1 2k - 1 4k道爾 頓),經超過濾後冷凍乾燥得到標題之導入胺基之透明質 -39- 200526253 (37) 酸(H A - A Μ )。 胺基的導入率由質子NMR算出(比較HA ·· N -乙醯 基的甲基質子(1 · 8〜1 · 9 p p in )、A Μ :伸乙基二胺部份的 伸甲基質子(2.9〜3· 1 ppm ))。導入率分別爲88.5%。 〔實施例1 1 一 2〕導入氫硫基(S Η )之透明質酸衍生物 HA— AM— SH的合成 HA-AM -卜
上述所得之HA - AM溶解於碳酸緩衝液(pH 9 )至2 mg/ mL,加入對HA單位爲0.5,或1倍等量之亞胺四氫 噻吩(皮亞司公司),於室溫反應4 5分鐘。反應後,以 0.005N HC1 水溶液平衡化的 PD—10 管柱(Sigma-Aldrich 公司)進行純化。其後藉由冷凍乾燥除去溶劑後,所得之
聚合物以過剩的乙醇洗淨後進行減壓得到HA — AM — SH 〇 氫硫基的導入率係由含有還原劑的三(2 -羧基乙基 膦)鹽酸鹽(TCEP )之狀態下藉由質子NMR算出(比較 HA : N —乙醯基的甲基質子(1 .8〜].9 ppm ) 、SH :氫硫 基的鄰近伸乙基質子(2·4〜2·7 ppm ))。導入率分別爲 16.5% 、23.5%。 -40- 200526253 (38) 〔實施例1 1 一 3〕導入甲基丙烯醯基(ΜΑ )之透明質酸 衍生物HA — AM — MA的合成 HA-AM -卜
將上述所得之HA- AM溶解於磷酸緩衝溶液(pH 7 )至10 mg/mL後,添加對HA單位爲0.5、1.0、2.0倍 當量之以1 一乙基一 3— (3—二甲基胺基丙基)碳化二亞 胺鹽酸鹽(ED C )活化之甲基丙烯酸後室溫下反應2小時 。反應後,以〇. 3 Μ氯化鈉水溶液、蒸餾水的順序進行透 析(光譜pore 4,部份分子量(MWCO) :12k — 14k道爾 頓),進行純化。冷凍乾燥後得到上述聚合物。 甲基丙烯醯基的導入率由質子NMR算出(比較HA : N —乙醯基的甲基質子(1·8〜1.9 ppm) 、MA:甲基丙嫌 醯基的(^2=(5.5〜6.1叩1〇)。導入率分別爲]4.8% 、31.9%、68.9%。 〔實施例1 2〕微粒子的熱處理效果(抑制腫脹) 100 mg之由實施例9— 2所合成的SH基導入率爲 37.5莫耳%之HA — HZ - SH溶解於8.5 mL的蒸餾水。於 此添力0 1】n L的】0 0 m Μ磷酸緩衝液p Η 7 ( P B ),且溶解 -41 - 200526253 (39) 5 mg的Tween— 80,添加對SH基爲l/io莫耳倍比之 2.3 mg的S TT。將此溶液與實施例1 一 3相同的條件(溶 液迗出速度爲 0.5 mL / 分鐘,Aspiration speed = 100% ) 下進行噴霧乾燥’得到微粒子。該微粒子於5 〇艽恆溫槽 中(YAMAT0科學製作DN 一 42)進行硫化,於24小時 後、72小時後進行採樣。 〔試驗例4〕 於實施例1 2採樣的各試料之粒子水含量以tgA測定 。其結果如圖1 2所示。又,使用顯微鏡的畫像解析,隨 機選出各試料的3 0 0個粒子並測定其粒徑(乾燥時的粒子 徑)。且於採樣的粒子裡添加含有Tween 一 8 0 ( 0.05 %) 之PB S溶液後使其膨潤,同樣地測定其濕潤時的粒徑。 其結果如圖1 3所示。其結果,確認24小時的恆溫培養可 抑制膨潤率。此可考慮爲5 0 °C,2 4小時的恆溫培養下粒 子內的交聯增加。 〔實施例13〕HA— HZ - MA交聯微凝膠的調製 1〇〇 nig之實施例1〇所合成的HA — HZ - MA溶解於6 m L的蒸餾水,於此添加溶解1 1 g的d T T、及3 2 · 5 // L的 TEA之1 ml的100 mM磷酸緩衝液pH 8.5 ( PB ),再加 入3 2.5 // L的蒸館水進行混合。該溶液以與實施例1 2相 同的條件下(排氣溫度6 5 t )進行噴霧乾燥,得到微粒 子。該微粒子於50°C恆溫槽(YAMAHA化學DN — 42 )下 -42- 200526253 (40) 硫化約72小時後得到粒子。 〔試驗例5〕 實施例1 3所得之粒子放置於預備台上,於此添加pH 7的P B S溶液,以顯微鏡觀察其粒子狀態時,粒子並未溶 解於P B S溶液中。藉由此觀察結果,確認實施例1 3所得 之微粒子’其氫硫基與不飽和鍵之間的加成反應形成交聯 〔產業上可利用性〕 本發明的藥物緩釋載體爲,可維持蛋白質或肽等藥物 的生物活性下,將此進行原位(i n s i t u )化學交聯、乾燥 ’可封入HA凝膠中,可優良的回收率下將蛋白質、肽等 藥物經長時間緩釋之可注射用微粒子。 【圖式簡單說明】 〔圖1〕交聯HA - SH微水凝膠微粒子以顯微鏡拍 照之照片例子。 〔圖2〕以P B S中膨潤後之交聯Η A — S Η微水凝膠微 粒子以顯微鏡拍照之照片例子。 〔圖3〕對於封入ΕΡΟ的交聯HA — SH微水凝膠進 行熱重量分析結果之例子。 〔圖4〕顯示由實施例1 一 4所得之交聯ΗΑ — SH微 水凝膠微粒子回收的ΕΡΟ量之RP — HPLC分析結果例子 -43- 200526253 (41) 圖,由下表示實施例1、實施例2、實施例3、實施例4 所得之微粒子所示者。
〔圖5〕由實施例3與比較例1所得HA凝膠之EPO 的緩釋性顯示圖。 〔圖6〕實施例9 一 1所得之透明質酸衍生物(Η A — HZ )之1H— NMR測定結果例子。 〔圖7〕實施例9 一 2所得之透明質酸衍生物(Η A — HZ- SH )之1Η — NMR測定結果例子。 〔圖8〕實施例1 0所得之透明質酸衍生物(Η A — HZ —M A )之1 Η - N M R測定結果例子。 〔圖9〕實施例1 1 一 1所得之透明質酸衍生物(Η A -A Μ )之】Η — N M R測定結果例子。 〔圖1 〇〕實施例Π - 2所得之透明質酸衍生物(Η A 一 AM — SH )之1H — NMR測定結果例子。 〔圖1 1〕實施例1 1 一 1所得之透明質酸衍生物(HA 一 AM — MA)之1H — NMR測定結果例子。 〔圖1 2〕實施例1 2所得之粒子藉由載持的水份量變 化圖。 〔圖1 3〕實施例1 2所得之粒子藉由載持的膨脹抑制 效果。 -44-

Claims (1)

  1. 200526253 (1) 十、申請專利範圍 1 · 一種交聯多醣微粒子的製造方法,其特徵爲含有 a )調製含有具可交聯官能基的多醣衍生物之稀薄溶 液的步驟; b )將該溶液分散於微粒子狀液滴之步驟;及 c )藉由含於該液滴的溶液濃縮而進行該多醣衍生物 的交聯反應之步驟。 2 ·如申請專利範圍第1項之製造方法,其中多醣爲 透明質酸。 3 ·如申請專利範圍第1項或第2項之製造方法,其 中該步驟b )爲藉由噴霧該溶液而分散於微粒子狀液滴之 步驟。 4 ·如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之製造 方法,其中所得微粒子的平均粒子徑爲〇 . 0 1 // m〜1 5 0 // m 〇 5 .如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之製造 方法,其中所得之微粒子爲藥物載體。 6 ·如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之製造 方法,其中所得之微粒子爲藥物緩釋載體。 7.如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之製造 方法,其中交聯反應前的稀薄溶液含有藥物,該藥物被載 持於交聯反應後所得之微粒子中。 8 .如申請專利範圍第7項之製造方法,其中該交聯 反應爲既使於藥物共存下亦不會使藥物變性之交聯方法。 -45- 200526253 (2) 9. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之製造 方法,其中可交聯的官能基爲氫硫基’該交聯反應爲藉由 二硫化物鍵結而形成交聯之反應° 10. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之製造 方法,其中該交聯反應爲,藉由氫硫基與不飽和鍵結之間 的加成反應而形成交聯之反應。 11. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之製造 方法,其中該交聯反應爲,藉由醯肼基與活性羧酸酯之間 的反應而形成交聯之反應。 12. —種交聯多醣微粒子,其特徵爲由含有 a )調製含有具可交聯官能基的多醣衍生物之稀薄溶 液的步驟; b )將該溶液分散於微粒子狀液滴之步驟·,及 c )藉由含於該液滴的溶液濃縮而進行該多醣衍生物 的交聯反應之步驟 的製造方法所調製。 1 3 ·如申請專利範圍第1 2項之交聯多醣微粒子,其 中多醣爲透明質酸。 1 4 ·如申請專利範圍第1 2項或第1 3項之交聯多醣微 粒子’其中該步驟b )爲藉由噴霧該溶液而分散於微粒子 狀液滴之步驟。 1 5 .如申請專利範圍第1 2項至第1 4項中任一項之交 聯多醣微粒子’其平均粒子徑爲〇. 〇 1 # m〜1 5 0 m。 1 6 ·如申請專利範圍第1 2項至第1 5項中任一項之交 46 200526253 (3) 聯多醣微粒子,其爲藥物載體。 1 7 ·如申請專利範圍第1 2項至第! 6項中任一項之交 聯多醣微粒子,其爲藥物緩釋載體。 1 8 .如申請專利範圍第丨2項至第1 7項中任一項之交 聯多醣微粒子,其中交聯反應前的稀薄溶液含有藥物,該 藥物被載持於交聯反應後所得之微粒子中。 1 9.如申請專利範圍第1 8項之交聯多醣微粒子,其 中該交聯反應爲既使於藥物共存下亦不會使藥物變性之交 聯方法。 2 0.如申請專利範圍第12項至第19項中任一項之交 聯多醣微粒子,其中可交聯的官能基爲氫硫基,該交聯反 應爲藉由二硫化物鍵結而形成交聯之反應。 2 1 .如申請專利_圍第1 2項至第1 9項中任一項之交 聯多醣微粒子,其中該交聯反應爲,藉由氫硫基與不飽和 鍵結之間的加成反應而形成交聯之反應。 2 2 .如申請專利範圍第1 2項至第1 9項中任一項之交聯 多醣微粒子,其中該交聯反應爲’藉由醯肼基與活性竣酸 酯之間的反應而形成交聯之反應。 - 47-
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