TW200523361A

TW200523361A - Canine specific growth hormone releasing hormone

Info

Publication number: TW200523361A
Application number: TW093122465A
Authority: TW
Inventors: Ruxandra Draghia-Akli
Original assignee: Advisys Inc
Priority date: 2003-08-04
Filing date: 2004-07-27
Publication date: 2005-07-16
Also published as: WO2005016964A3; US7361642B2; CA2575926C; EP1660530A2; US20050032737A1; US20080221034A1; WO2005016964A2; CA2575926A1

Description

200523361 九、發明說明：相關申請案本申請案請求美國臨時專利申請案60/492,427號之優先權，其案名為「犬的特異性生長激素釋放激素」，申請曰為2003年8月4曰，以Draghia-Akli為發明人，其全部内容以參考資料合併於本文。【發明所屬之技術領域】本發明係關於增加犬或狗之生長激素（growth hormone，GH)值之經單離之組成物及方法。詳言之，本發明係關於犬·或狗-的特異性生長激素釋放激素（dog-specific growth hormone releasing hormone，dGHRH)，或其功能上之生物等同物。該dGHRH係一種經單離之組成物或核酸分子，其可編碼dGHRH或其功能上之生物等同物。本發明之另一觀點包含將本發明之組成物遞送至受者體内之方法，其中該dGHRH可增加受者（例如犬或狗）體内生長激素（GH)之分泌程度。【先前技術】於美國，約有60百萬隻寵物犬。然不欲受限於理論，由於較好的營養以及較佳之健康照顧選擇，近十年來這些犬類的平均壽命增加。即使犬類之一般疾病資料及壽命通常係具有種特異性（species-speciHe)，於多數哺乳動物中仍具有共通的疾病相關特徵以及老化相關特徵。例如，哺乳 200523361 動物之老化，該GHRH_GH-IGF-I主軸歷經相當程度之衰減，使GH分泌及IGF-I產量之減少而造成骨骼肌質量下降 (肌肉貧乏症，sarcopenia)、骨質疏鬆症、脂肪累積增加、瘦肌肉組織之質量減少、以及其他病症。於人類及其他哺乳動物之研究已證實此等改變之發展可藉由重組生長激素 (GH)療法加以消除。本發明之一優點可觀察到將狗的特異性生長激素釋放激素（dGHRH)組成物遞送至犬受者體内時’可k升該犬受者體内GH分泌之程度。本發明另一觀點係關於該dGHRH分子或其功能上之生物等同物。該組合物亦可為編碼該dGHRH或其功能上之生物等同物之核酸分子。可將該dGHRH界定為一種具有生物活性之多肽，其經生物工程製作而含有與一般GHRH多肽相較下具有相似或經改善生物活性之不同的胺基酸序列。對犬受者投予該 dGHRH化合物之其他優點係說明於較佳具體實施例以及匕β ·增加類胰島素生長因子I (insulin_Hke growth factor I ’ IGF-I) ’增加紅血球之生產以及血紅素濃度，以及改進蛋白質代謝。於人類及其他哺乳動物中，該GH途徑之經調節的表現，以及碳水化合物、蛋白質、以及脂肪代謝之體内平衡係視為達到理想的線性成長所需。GH之合成及其自腦下垂體刚葉之脈動性分泌作用係由GHRh所刺激以及由體抑素所抑制，皆為下視丘激素（Fr〇hman等人，1992)。GH可增加類胰島素生長因子UWFq)之產量，主要係於肝臟，以及其他標的器官。及Gh會回饋至下視丘以及腦下垂 200523361 體以抑制GHRH之釋放及GH之分泌。GH分泌之内因性律動可受強迫之外因性GHRH之率動而調節（Caroni及 Schneider，1994)。然不欲受限於理論，於廣範圍之情形下，人類、農場動物、以及寵物之線性生長速度及身體組成皆顯示係GH 或GHRH替代療法之結果。類似地，與不同疾病及病況有關之貧血可經由生理性刺激該GHRH主轴而予以治療 (Draghia-Akli 等人，2002a ; Draghia-Akli 等人，2003a)。然而，此等病況之原因非常顯著，例如，於缺乏50%之人類GH時該GHRH-GH-IGF-I主轴於功能上係完整的，但是於其標的組織中不會引起適當的生物反應。類似的表現型，以及於非-GH-缺陷之身材矮小係由沿著GH主轴上不同點之基因缺陷（Parks等人，1995)所產生。於人類，此等非_GH-缺陷會造成身材倭小，例如透納氏徵候群（Turner syndrome) (Butler等人，1994)、軟骨生成減退 (hypochondroplasia) (Foncea 等人，1997)、克隆氏病（Crohn’s disease) (Parrizas 及 LeRoith，1997)、子宮内生長遲滯 (intrauterine growth retardation) (Hoess 與 Abremski，1 985) 或慢性腎功能不足（Lowe，Jr.等人，1989)皆可以GHRH或 GH療法予以有效治療（Gesundheit與Alexander，1995)。而寵物中，例如狗，只有少數或無法使用之療法，且已證明重組蛋白質療法係無效的（Kooistra等人，1998 ; Kooistra 等人，2000 ; Rijnberk 等人，1993)。於老化之哺乳動物中，該GHRH-GH-IGF-I主軸歷經相 200523361 當程度之衰減’使GH分泌及IGF-I產量之減少而造成骨赂肌質量下降（肌肉貧乏症）、骨質疏鬆症、脂肪累積增加、以及瘦肌肉組織之質量減少（Caroni與Schneider，1994 ; Veldhuis等人1997)。已證實，此等改變之發展可藉由重組 GH療法加以消除。臨床上可廣泛地將gh替代療法用於小孩及老年人身上。然而，目前之GH療法具有數種缺點，包含經常性之皮下或靜脈注射、胰島素阻抗以及葡萄糖耐受性不良（Rabinovsky等人1992);亦會對小孩造成早熟的骨艇閉合（epiphyseal cl〇sure)以及骨骨頭之滑脫（sHppage 〇f the capital femoral epiphysis)(Liu 及 LeRoith，1999)。已發展出GH之「緩釋」劑型（得自Genentech)，僅需要每l4 天注射一次。然而，此GH產物顯示出擾亂正常生理上脈動性GH之側繪，以及經常發生副作用。亦可將各種GH與GHRH療法用於家畜。例如，GHRH 及GH之投予可刺激乳產量，增加飼料換乳率。此療法主要係藉由增加瘦肌肉組織之質量，全面性地改善飼料利用率而加強生長（Lapierre等人，1991;van Rooij等人2000)。 GHRH及GH之投予可增加熱及冷凍屠體之重量以及減少屠體液體（軟-組織質量之比例）（Ethert〇I1 et al.，ι986)。已有報導指出為了增加GH釋放之目的，可投予新穎之GHRH類似物蛋白質（美國專利第5,847,〇66、5846,936、 5,792,747、5,776,901、5,696,089、5,486,505、5，137,872、 5,〇84,442、5,036,045、5,023,322、4,839,344、4,410,512、 RE33,699號）或者投予合成之或自然產生之qhrh胜肽片 200523361 段（美國專利第 4,833，166、4,228，158、4,228，156、 4,226,857 ' 4,224,316、4,223,021、4,223,020、4,223,019 號）。已有報導（美國專利第5,846,936號）指出含有下列突變之GHRH類似物：位置1之Try突變為His ;位置2之Ala 突變為Val、Leu、或其他胺基酸；位置8之Asn突變為Gin、 Ser或Thr ;位置15之Gly突變為Ala或Leu ;位置27之 Met突變為Nle或Leu ;以及位置28之Ser突變為Asn。 GHRH類似物係美國專利申請案第6,551，996號（簡稱為’996號專利）所揭示之主題，於2003年4月22日核准，發明人為Schwartz等人。該，996號專利教示含有突變之 GHRH類似物之應用，其可改進引起gh釋放之能力。此外，該，996號專利係關於治療生長缺陷；改進生長表現；相對於正常生長，於動物中刺激產生較多的GH ;以及利用投予GH釋放激素類似物而加強生長，此處該專利以參考資料合併於本文。於人類羊或豬之研究顯示出持續注入重組之guru 蛋白質可〖灰復正㊉的GH分)必模式，而不會使ghrh受體不敏感或耗盡GH的供給，由於此系統具有回饋作用，因而於 GH 療法中廢除（Dubreuil 等人，1990 ; Vance，199〇 ;

Vance等人，1985)。雖然（}1^11蛋白質療法可刺激正常，環GH分泌而實質上不具副作用（Corpas f人，1993)，疋該刀子於/舌體内之半生期短，需要經常（―天一至三力經由靜脈、皮下或鼻内(需要300倍之高劑量)投予。二作為慢性療法，重組GHRH0f投予係、不實際的。然而 200523361 顱外分泌之GHRH，如成熟或經截斷之多肽，經常係具有生物活性的（Thorner等人，1984)，以及低濃度的血清ghrh (100pg/ml)可刺激GH分泌（Corpas等人，1993)。此等特性使GHRH成為基因產物之質體中介補充作用中絕佳之候選物0 基...因遞送以及體内表現：欲受限於理論，可將特定轉殖基因遞送至體組織以矯正天生的或後天缺陷與不均衡。相對於投予重組蛋白質，以基因為主之藥物遞送提供了許多優點。這些優點包含原本蛋白質結構之轉變、改善生物活性、避免全身性毒性、以及避免感染以及毒性物質。由於蛋白質係合成的且持續分泌至血液循環中，質體中介之療法於治療範圍下可延長該蛋白質之生產。反之，使用重組蛋白質之主要限制係每次投予後蛋白質之可利用性受到限制。於以質體為主之表現系統中，除了編碼治療性基因產物之核酸外，非-病毒性基因載體可組成合成性基因遞送系統。於此方法中，可避免關於使用多數病毒載體之風險，包含病毒蛋白質之表現可引起免疫反應對抗標的組織以及 DNA突變之可能性或致癌基因之活化。由於使用「特殊種」之成分作為基因遞送，該非-病毒性表現載體產物通常 /、有低毋性’該非-病毒性表現載體可使與病毒載體相關之免疫陸風險最小化。此外，至今並未有報導指出於活體内將質體序列整合至宿主染色體，因此，此形式之核酸載體療法不會活化致癌基因也不會使腫瘤抑制基因失去活性。 200523361 至於存在於染色體外之游離基因體系統（epis〇mal system) ’質體具有已確定的藥物動力學以及消除侧繪而使標的組織中之基因表現持續期間受限。

直接質體DNA基因轉移法係目前許多新興的核酸治療策略之基礎且其不需要病毒成分或脂質粒子（Aihara及 Miyazaki，1998 ; MUramatsu 等人，2〇〇1)。由於骨骼肌纖維具有較長的生命期限且可經由環狀DNA質體（此質體可於具有免疫能力之宿主中表現）轉導，故可將骨骼肌作為標的組織（Davis 等人，1993; Tripathy 等人，1996)。質體 DNA 構築體係直接於受者骨骼肌療法中具有吸引力之候選物，這係因為該構築體係經良好界定之實體，具有生物化學穩疋性且已成功地使用數年（Acsa(ji等人，1991 ; Wolff等人，1990)。於直接注射質體dNA後所達到之相當低濃度之經編碼產物之表現有些時候係足以使分泌之胜肽標示出生物活性（Danko 及 Wolff，1994 ; Tsurumi 等人，1996)。先前的報導於小鼠中證實人類GHRH cDNA可經由可注射之肌生性表現載體遞送至肌肉中，其於肌肉中瞬間刺激Gh 分泌且延長至超越兩週之期間（Draghia-Akli等人，1997)。為了加強質體DNA遞送至細胞所進行之物理方法包含電穿孔法（electroporation)、超音波所產生之細胞膜通透性增加（sonoporation)、以及壓力。然不欲受限於理論，藉由電穿孔法來投予核酸構築質體係涉及脈衝式電場之應用俾於細胞膜上創造出瞬間孔洞而不會對細胞產生永久性的傷害，因此可引入外生性分子（Smith及Nordstrom，2000)。 11 200523361 經由調整由電穿孔系統產生之電子脈衝，核酸分子可穿過細胞上由上述程序產生之通道或孔洞。美國專利第 5,704,908號說明一種電穿孔儀器，其可於病患體腔中之選定的位置將分子遞送至細胞。類似的脈衝電壓注射裝置亦揭示於美國專利第5,439,440與5,702,304號，以及PCT WO 96A2520、96/12006、95/19805、以及 97/07826，其以參考資料合併於本文。近來，利用電穿孔技術在增強質體於體内之遞送及接續使經分泌之蛋白質達到生理程度上可得到顯著的進展。電穿孔法已成功地用於在注射質體後轉染腫瘤細胞（Lucas 等人，2002 ; Matsubara等人，2001)或者將抗-腫瘤藥物平陽黴素（bleomycin)遞送至人類皮膚或皮下腫瘤（Gehl等人，1998 ; Heller等人，1996)。電穿孔法亦已廣泛地應用於小鼠（Lesbordes 等人，2002 ; Lucas 等人，2001 ; Vilquin 等人，2001)、大鼠（Terada 等人，2001 ; Yasui 等人，2001)、以及狗（Fewell等人，2001)，俾遞送可編碼多種激素、細胞激素、或酵素之治療性基因。先前使用GHRH之研究顯示結合電穿孔之質體療法係可行的且表示其於大型動物及人類中係可誘導蛋白質之生產及調節分泌之大有可為的方法（Draghia-Akli 等人，1999 ; Draghia-Akli 等人，2002c)。電穿孔法亦已廣泛地用於嚙齒類及其他小型動物（Bettan等人，2000 ; Yin及Tang， 2001)。已發現電極之配置會影響電場的分布以及接著的結果（Gehl等人，1999 ; Miklavcic 等人’ 1998)。然不欲受限於理論，於大型動物模式中，與 12 200523361 外部卡式電極（external caliper electrode)相較下針狀電極可得到一貫再現性之結果。已證實’電穿孔具有增強骨骼肌攝取質體之能力。此外’發現具有聚麩胺酸（PLG)或聚乙烯比咯烷酮（PVP)設計之質體可加強質體之轉染作因而增加所欲之轉殖基因的表現。例如，發現具有PLG或PVP設計之質體可於小鼠、大鼠、及狗之骨骼肌中增強高達10倍之基因表現（Fewell 等人’ 2001 ; Mumper等人，1998)。然不欲受限於理論，該陰離子性聚合物鈉PLG可於低質體濃度下增強質體之攝入’以及降低任何可能由該程序對組織所造成之傷害。PLg 係一種穩定之化合物且可抗高溫（D〇inik等人，1993)。PLG 可用於增加抗-癌藥物之穩定性（Li等人，2〇〇〇)以及作為「黏著劑」以於受傷及組織修復時閉合傷口或防止組織出血 (Otani等人，1996 ; Otani等人，1998)。先前PLG係用於疫田製劑中增加穩定度（Matsuo等人，1994)且不會增加免疫性（immunogenicity)。PLG亦可作為吸入抗原或暴露於臭氧後之抗·毒素（Fryer及Jacoby，1993)。然不欲受限於理論，PLG於進行電穿孔過程期間不僅藉由穩定該質體DNA與促進穿過細胞膜孔洞之細胞内運送’且亦經由主動機制來增加質體之轉染作用。例如，細胞上帶正電之表面蛋白質經由蛋白質-蛋白質間之交互作用而與連接至質體DNA之帶負電的Plg形成複合物。當施加電場時，該表面蛋白質的方向反轉且主動地攝入該 DNA分子，此方法實質上可增加轉染作用的效果。再者， 13 200523361 PLG可防止與活體内質體遞送相關之肌肉傷害 (Draghia-Akli等人，2002b)以及於注射前增加質體於體外之穩定度。已有關於真核細胞以線形DNA進行之電穿孔法的研究（McNally 等人，1988 ; Neumann 等人，1982) (Toneguzzo 等人，1988) ( Aratani 等人，1992 ; Nairn 等人， 1993 ; Xie 及 Tsong，1993 ; Yorifuji 及 Mikawa，1990)，這些實例闡明細胞懸浮液、細胞培養等之轉染作用，並未提出體組織中之轉染的細胞。美國專利第4,956,288號係關於製備重組宿主細胞之方法，該宿主細胞包含高重複數量（copy number)之外來 DNA，其係藉由於外來DNA存在下使細胞群進行電穿孔而得，接著培養細胞、以及殺死具有低重複數量外來DNA之細胞。然不欲受限於理論，經由可注射之肌生性表現載體，可將GHRH cDNA遞送至小鼠及人類之肌肉中，其於肌肉中瞬間刺激GH分泌且超越兩週之期間（Draghia-Akli等人，1 997)。此可注射之載體系統係藉由合併有力之合成性肌肉啟動子（Li等人，1999)予以最佳化，該啟動子與一新穎之蛋白酶-抗性GHRH分子相連，該分子實質上具有較長之半生期以及較大之GH分泌活性（pSP-HV-GHRH) (Draghia-Akli等人，1999)。將高效率電穿孔技術最佳化以將核酸構築體遞送至動物之骨骼肌（Draghia-Akli等人， 2002b) 〇利用載體設計與電脈衝質體遞送方法之組合，發明人於豬（Draghia-Akli 等人，1999 ; Draghia-Akli 等人， 200523361 2003b)及齧齒類（Draghia_Akli等人，2〇〇2c)中發現生長增加以及較佳之經修飾之身體組成。該經修飾之ghrh核酸構築體可於患有癌症及與癌症治療相關之貧血的陪伴動物體内增加紅血球產量（Draghia-Akli等人，2〇〇2a)。於豬，可得到之數據顯示該經修飾之豬的HV_GHRH於促進生長及正向之身體組成改變上，較野生型之豬的ghrh更具效力（Draghia-Akli等人，1999)。本發明之一方面係說明種_ 特異性之dGHRH表現載體，其包括比蛋白酶抗性 HV-GHRH分子更有效之組成以增加犬受者之紅血球生產。【發明内容】雖然犬類族群之一般疾病側繪及壽命通常係具有品種特異性，於多數哺乳動物中仍具有共通之疾病相關特徵以及年齡相關特徵。於哺乳動物中之研究已證實經由重組生長激素（GH)療法可抵消血液（hematological)改變之進展。本發明包括於犬類中增加GH值之組合物及方法。本發明之一方面包括一種犬或狗之特異性生長激素釋放激素（dGHRH)或其功能上之生物等同物。於一特定具體實施例，當該dGHRH或其功能上之生物等同物遞送至受者體内時，其可增加生長激素（GH)。該經遞送之dGHRH或其功能上之生物等同物可改善受者體内之血液參數 (hematological parameter)，其中該血液參數包括··紅血球汁數、血紅素濃度、以及平均紅血球血紅素含量。本發明之另一方面包括可編碼該dGHRH或其功能上 15 200523361 之生物等同物之核酸構築體。於第二特定具體實施例，當該dGHRH或其功能上之生物等同物於受者體内表現時，其可增加GH。經表現之dGHRH或其功能上之生物等同物可改善受者體内之血液參數，其中該血液參數包括：紅血球计數、血紅素濃度、以及平均紅血球血紅素含量。於第三特定具體實施例，該核酸表現構築體進一步包括；合成性或真核細胞之啟動子；聚_腺苷酸化訊號；選擇性標記基因啟動子；核糖體結合位置；選擇性標記基因序列；以及複製起點。於此種配置中，由該合成性或真核細胞之啟動子、編碼該dGHRH或其功能上之生物等同物之核酸序列、以及聚_腺苷酸化訊號組成該核酸表現構築體之治療性元件。該治療性元件係經操作性連結且位於第一操作性-連結之配置中。類似地，該選擇性標記基因啟動子、核糖體結合位置、選擇性標記基因序列、以及複製起點組成該核酸表現載體之複製元件，其係經操作性連結且位於第二操作性-連結之配置中。該第一-操作性_連結之配置與第二-操作性_ 連結之配置組成該核酸表現構築體之環狀結構，其係用於質體中介之基因補充作用。本發明dGHRH核酸表現構築體之實例包含質體pAV0221與pAV00215。本發明之又另一方面係於受者體内增加GH值之方法。該方法包括將重組dGHRH或其功能上之生物等同物遞送至受者體内。該重組dGHRH包括一生物活性多肽，以及 dGHRH之重組功能上之生物等同物包括一多肽，其係經生物工程製作而含有與一般dGHRH多肽相較下具有相似或 200523361 經改善生物活性之不同的胺基酸序列。增加GH值係與增加受者之血液參數相關，其中該受者體内具有經遞送之重組dGHRH或其功能上之生物等同物。本發明之再一方面係於受者體内增加GH值之方法。該方法包括將核酸表現構築體遞送至受者體内，該核酸表現構築體可表現出dGHRH或其功能上之生物等同物。於第四特定具體實施例，該核酸表現構築體係經由電穿孔法遞送至受者之細胞内。可接受該核酸表現構築體之細胞包括體細胞、幹細胞、或生殖細胞。該dGHRH或其功能上之生物等同物係表現於受者之組織特異性細胞（例如肌肉細胞）。此方法所使用之核酸表現構築體之實例包含質體 pAV〇221與pAVO〇215。於第五特定具體實施例，遞送該 dGHRH核酸表現構築體之方法復包括利用轉染促進多狀 (transfection_facilitating polypeptide)，其中該轉染 _促進多肽包括帶電荷之多肽（例如聚-L-麵胺酸， poly-L-glutamate)。增加GH值係由增加受者之血液參數所反應，其中該受者體内具有經遞送之重組dGHRH或其功能上之生物等同物。【實施方式】名詞定義：本文中所使用之「類似物」包含GHRH之任何突變物，或合成的或自然產生的GHRH之胜肽片段。本文中「犬」及「狗」可交互使用。 17 200523361 本文中所使用之「密碼子係沪 ^ , 」係才日於給定之信息RNA分中任何三個相連為一組之核苷酸 ^ ，或可產生特定胺暴酉夂之DNA之編碼股，或轉譯作用用之起始或終止訊號。「密碼子」亦指DNA股中三個一組之驗基。本文中所使用之「編碼區」係指DNA序列中之任何部分’其可轉錄成信息RNA(mRNA)然後轉譯出特定多肽之胺基酸序列。本文中所使用之「遞送」係指在有壓力或無壓力存在下，利用化學或生物程序、注射、混合、電穿孔、音波、或此等組合之手段將物質引入至受者體内、細胞中、或任何接受者之方法。本文中所使用之「經編碼之GHRH」係一種生物活性多肽。本文中所使用之GHRH之「功能上之生物等同物」係種夕肽，該多肽係經生物工程製作而含有與Ghrh多肽相較下同時具有相似或經改善生物活性之不同的胺基酸序列。本文中所使用之「生長激素（GH)」係指一種與生長相關之激素且係作為一種化學傳令員以於標的細胞發揮其作用。 ’ 本文中所使用之「生長激素釋放激素（GHrh)」係指一種可促進或刺激GH釋放之激素，以及狹隘的其他腦下垂體激素，例如泌乳激素。本文中所使用之「異種核酸序列」係指包括不同調節 200523361 及表現元件之DNA序列。本文中所使用之「單離之」係指合成或重組之分子製備物，其呈經純化、或濃縮，或者兩者皆是之形式，且實質上不含非所欲之性質。本文中所使用之「經修飾之GHRH」係一種多肽，該多肽係經生物工程製作而含有與野生型GHRh多肽相較下同時具有相似或經改善生物活性而與野生型ghrh多狀不同的胺基酸序列。該野生型GHRH多肽係受者、細胞或經

L飾之0脱11之任何接受者自然產生之種_特異性即狀多肽。本文中所使用之「核酸表現構築體」係指任何形式基因構築體，包含可趟轉錄出RNA之核酸。然後經轉錄之 RNA可轉譯成胜肽、多夕狀或蛋白質。「表現載體」可與r 現質體」交互使用。本文中所使用之「接夸去你此& / 接又者」係指接受治療或組合物者本文中所使用之「香去 4t ^ m 物狗等）

又者」係才日動物界中任何種類之: 息含人類。於較佳呈辦杳 1 ，、體實方也例中特定係指犬類。本文中所使用之「經動丨盖* ^ ^ 、、、辱丨養之動物」係指：寵物（例如貓專），勞動（例如馬、牛、笪、· 午專），食物（雞、魚、羊、豬以及所有此技藝中已知之其他動物。本文中所使用之「握物从、*让 ,^ ^ 操作性連結」係指核酸序列中之. 番 — 技此加以連接而非自然存在的/ 置0該元件或結構可經由姓M展、由所欲之刼作而完成或者該元件、、々構係以經由所欲之择 & '、元成為特徵。熟於此技藝之, 19 200523361 士應了解核酸序列中相鄰之順序加以連結之元件或結構在操作上不需以串聯或 ,啟動子」係指-種與基因轉錄作用相關之DNA序列。啟動子可指導原核或真核基因之轉: 用。啟動子可為「誘發性」，亦即 Μ 用，ϋ α 丨使用誘發劑起始轉錄作 =或者，相反地，啟動子可為「本質性」，亦無法調節轉錄作用之速率。啟動子可以「組織·特異性=

「組織-較佳性」之方法加以調節，使其僅於特定組織類型或典型中具有活性轉譯經操作性連結之編碼區。本文中所使用之「複製元件」包括可使質體於特定宿主中進行複製之核酸序列。熟於分子生物領域之人士皆了解該複製元件包含，但非限於，選擇性標記基因啟動子、核糖體結合位置、選擇性標記基因序列、以及複製起點。

本文中所使用之「治療元件」包括可在活體中表現經編碼之基因產物之核酸序列。熟於分子生物領域之人士皆了解該治療元件可包含，但非限於，啟動子序列、轉殖基因、聚[Α]序列（p〇ly [a] sequence)、或者 3,或 5，UTR。本文中所使用之「載體」係指任何可將核酸送入細胞或有機體中之媒介。其實例包含質體載體、病毒載體、微脂粒、或陽離子基脂質（cationic iipid)。本文使用之一個及三個字之胺基酸標準縮寫如下：丙胺酸，A，ala ;精胺酸，r，arg ;天冬醯胺酸，N，_ ; 天冬胺酸，D，asp ;半光胺酸，c，cys ;麩醯胺酸，q，gln ; 麵月女酸，E，glu，甘胺酸，g，gly ;組胺酸，Η，his ;異 20 200523361 白胺酸’ I，lie ;白胺酸，L，leu ;離胺酸，κ，lys ;甲硫胺酸，Μ，met ;***酸，F，phe ;脯胺酸，p，pr〇 ;絲胺酸，S，ser ·，酥胺酸，T，thr ;色胺酸，w, trp ;酪胺酸， Y，tyr ;纈胺酸。於較佳具體實施例中，本發明之核酸構築體或載體係一種質體，其包括合成之肌生性（肌肉_特異性）啟動子、編碼dGHRH或其類似物之合成性核苷酸序列、以及3，未轉譯區（3’UTR)。 _子以及增強子。「啟動子」係核酸序列中之控制序列，其可控制轉錄作用之起始以及速率。其可包含調節作用之蛋白質以及分子（例如RNA聚合酶以及其他轉錄作用因子）可結合之基因元件。「操作性定位」、「操作性連結」、「經控制」、以及「經轉錄作用控制」等係指啟動子係位於核酸序列中之正確的功能位置以及/或方向，以控制轉錄作用之起始以及/或該序列之表現。啟動子可與「增強子」相連或不相連，於核酸序列之轉錄活化作用中，「增強子」係一種順式·作用調節序列。啟動子可為位於編碼片段以及/或外子（”〇11)上游之天生-編碼序列之一者。此等啟動子可稱為「内生性」啟動子。同樣地，增強子可為天生與核酸序列相關者，其可位於核 I序列之下游或上游。此外，可經由在控制下將編碼序列加上重組之或異種的啟動子而獲得某些優點，亦即啟動子於其自然環境中非為天生與核酸序列相關者。重組之或異種的增強子係指該增強子於其自然環境中非為天生與核酸 21 200523361 序列相關者。此等啟動子或增強子可包含其他基因之啟動子或增強子，以及單離自任何其他原核細胞、病毒、或真核細胞之啟動子或增強子，又非「自然產生」之啟動子或增強子，亦即包含不同轉錄調節區之不同元件以及或突變者，其可改變表現作用。除了以合成方式產生啟動子及增強子之核酸序列外，亦可使用重組選殖及/或核酸增幅技術 (包含PCRtm)產生序列。再者經思忖後，亦可使用於非_核胞器（例如粒腺體、葉綠體等）中指導序列之轉錄作用及/或表現作用之控制序列。當然’重要的是於所選擇進行表現作用之細胞型態、胞器、或有機體中採用可有效指導DNA片段表現的啟動子及/或增強子。熟於分子生物學之人士皆明瞭利用啟動子、增強子、以及細胞型態之組合以表現蛋白質。所採用之啟動子了為構成性的、組織-特異性的、誘發性的，及/或於適當條件下可指導經引入之DNA片段進行高度之表現作用，此係大規模產生重組蛋白質及/或胜肽之優點。啟動子可為外來的或内生性的。於特定具體實施例中該啟動子係合成之肌生性啟動子（Seq. ID No. 11)。組織-特異性啟動子或元件之辨識，以及區別其活性之分析方法係為熟於此技藝者所知悉。此領域之非限制性實例包含人類LIMK2基因、體抑素受體2基因、鼠附睪八酸 •結合基因、人類CD4、鼠α2 (χι)膠原、mA多巴胺受體基因、類胰島素生長因子Π、以及人類血小板内皮細胞黏附分子-1。 22 200523361 為了使編碼序列進行有效的轉譯作用（合成經編碼之蛋白質），需要特定的起始訊號。這些訊號包含ATG起始密碼子或相鄰序列。亦 · 需提供外源性轉譯作用控制訊號（包含atg起始密碼子）。熟於此技藝者可輕易地決定起始訊號且提供所需之訊號。已知所欲之編碼序列之閱讀架必須具有起始密碼子，以確保該完整的***序列可進行轉譯作用。外源性轉譯作用控制訊號及起始密碼子可為自然產生的或是合成的。表現作用之效力可經由加入適當的轉錄作用增強子元件予以加 · 強。本發明之某些具體實施例中，利用核糖體内入位置 (internal ribosome entry sites，IRES)產生多基因 (multigene)、或多順反子（polycistr〇nie)信息。ires 元件可省略5’甲基化帽依賴型轉譯作用（Cap心卩⑶心加 translation)之核糖體掃描模式而於内部位置開始進行轉 #。如同哺乳動物之IRES信息，已經揭示小核糖核酸病毒春 (picornavirus)家族中之兩類成員（小兒麻痺及心肌炎病毒）之IRES元件。IRES元件可連接至異種之開放閱讀架 (heterologous open reading frames)。可同時轉錄多個以 IRES分開之開放閱讀架，而產生多順反子信息。由於元件之優點，核糖體可進入各開放閱讀架以有效進行轉譯作用。因此使用單一啟動子/增強子轉錄單一信息，即可有效表現多個基因。多重選殖位置（Multiple Cloning Sites)。,體可包含多 23 200523361 重選殖位置（multiple cloning site ，MCS)，其係含有多個限制酶位置之核酸區域，任何Mcs皆可結合標準重組技術來切割該載體。「限制酶切割」係指核酸分子以酵素進行^ 催化性切割，該酵素僅作用於核酸分子中之特定位置。許多限制酶係市售可得者。熟於此技藝者皆了解此等酵素之用法。通常，係使用限制酶將載體直線化或切成片段，該酵素會切開MCS，使外來的序列能接合至載體中。「接合」係指於兩核酸片段間形成磷酸二酯鍵（ph〇sph〇diester匕⑽幻之作用，此兩片段彼此可相鄰或不相鄰。限制酶及接合反馨應所涉及之技術皆為熟於重組技術者所知悉。 JL接位置（Spl_icing Sites)。多數經轉錄之真核細胞 RNA分子會進行RNA剪接以自原始的轉錄物移除内子 (intron)。含有基因體真核細胞序列之載體可能需要提供 (donor)以及/或受體（accept〇r)剪接位置，以確保可適當處理轉錄物進行蛋白質表現。里.._腺苷酸化於表現系統中，典型地會包含聚腺鲁苷酸化訊號以使轉錄物產生適當的聚腺苷酸化作用。咸信，聚腺苷酸化訊號之性質非為成功地實行本發明之重要條件，及/或可採用任何一種此等序列。較佳具體實施例包含牛或人類GH聚腺苷酸化訊號，其於各種標的細胞中皆為使用方便且功能已知者。於特定具體實施例中該聚腺苷酸化訊號係人類生長素激素之3，utr的片段ID ν〇· 12)。亦將轉錄作用終止位置視為表現卡匣之元件。此等元件可用於加強信息程度及/或使卡匣讀至其他序列最小化。 24 200523361 複製之起KOrigins of Replication)。為了於宿主細胞中增殖載體，可於載體中包含一或多個複製位置起點（經常稱為ori)，其係特殊之核酸序列，於此處開始進行複製。於特定具體實施例中該複製之起點係PUC-1 8複製起點 (Seq· ID No. 16)。此外，若宿主細胞係酵母菌時，亦可採用自主複製序列（autonomously replicating sequence，ARS)。遷擇性及篩選性標記。太發明之某些具體實施例中，含有本發明核酸構築體之細胞可經由在表現載體中含有標記而於活體外或活體内進行鑑別。此等標記會授與該細胞一種可鑑別之改變，以輕易地鑑別含有該表現載體之細胞。通常’選擇性標記係提供一種用於選擇之性質。陽性選擇性標記係指應挑選出現該標記者，然而陰性選擇性標 η己係扣避免挑選出現該標記者。陽性選擇性標記之實例為藥物抗性標記，例如質體構築體上之抗生素抗性基因（例如康黴素（kanamycin)、氨比西林（ampicylin)、慶大黴素 (gentamycin)、四環素、或氣黴素（chl〇ramphenic〇1))。於特疋具體實施例中該選擇性標記係康黴素抗性標

記（Seq· ID

No. 15) 〇通常，藥物選擇性標記係用於幫助轉形物之選殖及鑑別，例如，對新黴素（ne〇mycin)、嘌呤黴濕黴素（hygromycin)、DHFR、GpT、柔新（ze〇cin)、及組胺醇（histidinol)具有抗性之基因係常用之選擇性標記。除了基於所執行之條件，標記可用於識別轉形物之表現型外，亦可考慮其他類型之標記，包含篩選性標記，例如， 25 200523361 其係一種根據比色之分析法。此外，亦可使用篩選性酵素。熟於此技藝者了解如何使用免疫標記，可能係與facs分析法結合。使用何種標記並不重要，只要該標記可同時= 編碼基因產物之核酸一起表現即可。選擇性及篩選性標記之其他實例皆為熟於此技藝者所知悉。 ϋ GHRH :在哺乳動物之循環系統中，GHRH的半生期相當短（Frohman等人，1984)。該HV-GHRH超級-類似物係揭示於美國專利申請案S.N· 1〇/021，403號，申請日為2〇〇1 年12月12日’其案名為「對雌性動物投予核酸序列以加強後代之生長」，發明人為Schwartz等人，以及美國專利第6,5 51，996號（簡稱‘996專利），2003年4月22日核准，發明人為Schwartz等人。該，996號專利教示含有突變之 GHRH類似物之應用，其可改進引起GH釋放之能力。此外’該’ 996號專利係關於治療生長缺陷；改進生長表現；相對於正常生長，刺激動物體内產生較多的GH ;以及利用才又予GH釋放激素類似物而加強生長，此處該專利以參考資料合併於本文。為了選殖出該dGHRH，產生狗之下視丘資料庫且進行篩選。藉由參照下列實施例應可更加了解本發明，該等實施例係本發明某些具體實施例之代表，而非欲以限制本發明。實施例實施例1 DNA/質體構築體：將GHRH cDNA構築體引入至pAV 質體骨幹中，如美國專利申請案SN : 60/396，247號所述， 26 200523361 其申請曰為2002年7月16曰，其案名為「密碼子經理想化之合成性質體」，發明人為Draghia_Akli等人。各表現載體元件係經操作性連結且併入肌生性GHRH表現載體。例如，利用該pAV質體載體測試dGHRH之生物效力，該pAV 質體載體係經生物工程加工利用合成性肌肉啟動子， SPc5-12 (Li等人1999)，以及225-bp之dGHRH片段而可產生高表現程度之骨骼肌-特異性基因表現，該225-bp之 dGHRH片段可編碼出30個胺基酸之訊號胜肽以及成熟胜肽形式之dGHRH (Tyrl-Gly40)接著為人GH (hGH)之3，端未轉譯區。包含肌肉特異性合成性啟動子之序列（Seq. ID No. 11)以及人生長激素之3，UTR片段之序列（Seq. ID No. 12)。其他構築體含有經修飾之豬的HV-GHRH(作為陽性對照組），或其他功能上之生物等同物。野生型及經突變之豬的GHRH cDNA係經由將GHRH cDNA經定點突變而產生 (於活體外突變系統中改變Sites II，Promega，Madison， WI)，且將其選殖至pSPc5-12之BamHI/ Hind III位置，俾分別產生 pSP-wt-GHRH，或 pSP- TI -GHRH。GH 之 3’端未轉譯區（3 ^JTR)係經選殖至GHRH cDNA之下游。所得之各個質體含有野生型GHRH之編碼區或突變型之GHRH之編碼區。然不欲受限於理論，某些所得之突變的胺基酸序列係非自然地存在於哺乳動物中。狗GHRH之選殖-特製之cDNA資料庫係由Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA所構築。該資料庫所採用之組織係收集自狗之下視丘（4.7克），該狗自出生至死亡期 200523361 間係飼養於密閉之實驗設備中（NIH規章），且將該下視丘儲存於-80°C。該cDNA資料庫係由PCR進行篩選，而該PCR 之5’引子係使用選自HV-GHRH之Bam/Hind III片段以及 3 ’引子係選自牛GHRH之Exon 5序列。

Bam/Hind III 5,引子：ATG GTG CTC TGG GTG TTC TT SeqlD No. 07

Exon 5 3,引子：TTC ATC CTT GGG AGT TCC TG SeqlD

No. 08 PCR之條件如下·· DNA(資料庫）3微升、10X Accutaq緩衝液 5 微升、DMSO 1 微升、dNTP’s (lOmM) 1 微升、Exon3-5’ 引子（50毫微克）1微升、Exon5_3’引子（50毫微克）1微升、水3 7.5微升、Accutaq 0.5微升、以及下列循環參數：94°C 10分鐘、94°C 30秒、55°C 30秒、68°C 30秒進行35個循環，接著於68 °C循環5分鐘。將所產生之PCR片段，約200bp，利用TOPO套組進行次選殖（sub cl one)以及進行定序。發現選殖株# 13可完全與其他GHRH序列，如人類GHRH，比對及相比。設計具有特定突變之引子，引入限制酶切割位置以幫助次-選殖至表現載體中：選殖株#13中含有Ncol、Hind III 位置以及2個停止密碼子以利於***至新的pAV骨架。預期新產生之片段的寬帶大小約為240bp。狗之 Hindlll B 5’引子 CGGCCGAAAGCTTACTATGCTCCT SeqlD No. 09

狗之 Ncol B 3’ 引子 ATTCGCCCCCATGGTGCTCTGGG 200523361

SeqlD No. 10 PCR之條件如下·· DNA(選殖株#13) 10毫微克、10X Accutaq 緩衝液 5 微升、DMSO 1 微升、dNTP’s (10mM) 1 微升、5’引子（50毫微克）1微升、3’引子（50毫微克）1微升、水40.5微升、Accutaq 0.5微升。循環參數如下：95°C 3分鐘、94°C 30秒、52°C 30秒、68°C 30秒進行30個循環，接著於68 °C進行延長5分鐘。將PCR反應混合物以Ncol及Hindlll進行切割且利用塔卡拉接合酶（Takara ligase)接合至新的骨架；然後將選殖株進行定序俾確定已***該限制酶切割位置以及停止密碼子。將肌肉細胞（Sol 8’s)以所得之載體進行轉染以及以北方點墨法確認種特異性RNA之存在。 HV-GHRH與dGHRH編碼序列之比對顯示於第1圖中，以及相對應之胺基酸序列之比對顯示於第2圖。如下所示，該經編碼之GHRH胺基酸序列係不同的：豬的序列（pGHRH): YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNQEQGA -OH SEQID NO.01 經突變之豬的序列（HV-GHRH):

HVDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA -OH SEQID NO.02 犬或狗之特異性序列（dGHRH): YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNREQGA -OH SEQID NO.03 200523361 然不欲受限於理論，治療GH不足之疾病或貧血的效果最終係取決於所需激素之循環濃度。通常，該經編碼之 dGHRH或其功能上之生物等同物係下列通式：

XADAIFTNSYRKVLXsQLSARKLLQDIXJsRQQGERNRE QGA SEQID NO.04 其中：Χί係選自由酪胺酸（“Y”）或組胺酸（“Η”）所組成群之胺基酸D-或L-異構物；X2係選自由丙胺酸（“a”）、顯胺酸 (“V”）、或異白胺酸（“Γ〇所組成群之胺基酸D_或^異構物； X3係選自由丙胺酸（“A”）或甘胺酸（“(}，，）所組成群之胺基酸 D-或L·異構物’ X4係選自由曱硫胺酸（“μ”）或白胺酸（“l”) 所組成群之胺基酸D _或L-異構物；Xs係選自由絲胺酸（“ $，，) 或天冬醢胺酸（“N”）所組成群之胺基酸或^異構物。第3圖所示之pAV0221質體及Seqm Ν〇· 〇5包括 dGHRH之編碼區。第4圖所示之pAV〇〇215質體及Seqm Ν〇 06包括突變之HV-GHRH的編碼區。上述質體並未包含聚連接子（polylinker)、基因、骨骼肌^^肌動蛋白啟動子或骨骼肌α-肌動蛋白3, UTR/NCR。再者，此等質體係藉由肌肉注射’接著藉由下述之活體内電穿孔法引入。熟於此技藝之人士應了解「功能上之生物等同物」包含於「生物上之功能等同物」蛋白質及/或聚核㈣之定義中其概心係可於分子之限定部份中產生有限數目之改變，而使該分子保有可接受程度之等同物生物活性。本文進步界定v亥功月b上之生物等同物為其中特定胺基酸（或密碼子)可經取代之蛋白質(及聚核*酸）。包括種特異性 200523361 GHRH之功能上之生物等同物的胜肽係一種多肽，該多狀係經生物工程製作而含有與GHRH多肽相較下同時具有相似或經改善生物活性而與GHRH多肽不同的胺基酸序列。例如’ GHRH其中一種生物活性係幫助受者體内gh之分泌。功能上之生物等同物之另一實例係具有生物活性之胜肽或核酸序列，其與相關之SeqlD編號1-1〇中任一者具有至少95%之相似性。實施例2 實驗動物：將九隻狗分成三組，每組3隻動物。所有狗之年齡相近（± 1 -2個月），至少1歲大，以及彼此的體重在5。/。内。I組於第i天注射水且作為陰性對照組。π組於第1天注射1毫克之狗-GHRH質體且作為試驗組。ΙΠ組於第1天注射1毫克之HV-GHRH質體且作為陽性對照組。注射用之質體配方或水於第i天係藉由肌内注射投予接著進行電穿孔。測量血液學、血清化學以及激素參數之血液樣本係於第-6天及第1天投予劑量前進行身體檢查時收集得。之後每星期收集一次其他的血液樣本至研究結束。收集各個動物之尿液且於第丨天投予劑量前以及研究結束時進行尿液分析。於注射第丨天、第2天及之後每星期進行身體檢查時檢查注射位置（大腿中間）是否出現紅斑及水腫之症狀。於指定之時間點測量下列血液參數：紅血球計數 (RBC)血谷比（hematocrit)、血紅素、總白血球計數（wbc)、 Μ及個別之白血球計數（嗜中性白血球、淋巴球、單核白血東θ伊、、工白血球、以及嗜驗性細胞）、血小板計數、MC V、 31 200523361 MCH、MCHC。紅血球產量。如第5圖所示，相較於基值，以編碼該 dGHRH (□)之質體處理之狗很快地於注射後第7天顯示出紅血球計數之增加（Ρ<〇·〇5)。比較起來，以編碼該經修飾之豬的HV-GHRH(A)分子之質體處理之狗，證實其於注射後可長時間刺激造血（hematopoiesis)，但於第7天時未顯示出任何改善血液參數之作用。血紅素產量。如第6圖所示，以編碼該dGHRH (□)之質體進行注射之米格魯犬，於注射後第14天顯示出增加之血紅素產畺（Ρ<0·05)。此外，如第7圖所示，以編碼該dGHRH (□)之質體進行注射之米格魯犬的平均紅血球血紅素含量亦增加（Ρ<0·01)。如第8圖所示，與以編碼該dGHRH之質體處理組中的基值比較時，該平·均紅血球血紅素濃度增加 (P < 0.002)。反之，以編碼該經修飾之豬的分子之質體處理之狗，證實其於注射後可長時間刺激造血，但未顯示出任何改善血液參數之作用。然而不欲受限於理論，調節性激素（例如ghrh& gh) 經常包含複雜之回饋，節途徑，其於慢性疾病(例如癌症、免疫不全症候群、以及其他）中更加複雜。若無針對 _或生物等同物之實驗(其係用於質體中介之補充作用），熟於此技藝之人士無法預測有利之療效而決定何種修飾對、為馬之GHRH或其功能上之生物等同物產生所欲之結果】如先刚之貫驗已指出經修飾之哺乳動物HV_GHRH 較豬的野生型GHRH可快速產生所欲之作用⑼啦心Akn 32 200523361 等人，1999)。如上述實施例所示，該dGHRH可較經修飾之哺乳動物HV-GHRH快速且有效地改善犬之血液參數。本發明包含該組成物、說明、及探究可編碼dGHRH或其生物等同物之不同的核酸序列之種特異性所需實驗之結果，本發明係無法由先前技藝所推知。熟於此技藝之人士可輕易了解所揭示之本發明可用於貫行所提及與固有之目標。本文所述之GH、GHRH、經修飾之生長激素釋放激素或功能上之生物等同物、質體、載體、醫藥組成物、處理、方法、程序以及技術係以代表性之較佳具體實施例呈現且非欲以該等實施例限制本發明之範疇。因此，熟於此技藝之人士所發現之其他用途係包含於本發明之精神及範疇下。【圖示簡單說明】第1圖顯示HV-GHRH與dGHRH編碼序列之排列，以及該共同序列；第2圖顯示HV-GHRH與dGHRH胺基酸序列之排列，以及該共同序列；應注意於狗之特異性序列中該5，訊號胜肽包含30個胺基酸，而於HV-GHRH (為經修飾之豬的 GHRH，其具有較長之半生期）中包含31個胺基酸；第3圖顯示含有dGHRH序列之pAV0221質體載體之序列，第4圖顯示含有HV-GHRH之pAV00215質體載體之序列； 33 200523361 第5圖顯示經種特異性dGHRH處理之狗的平均紅血球計數，相對於對照組以及以經修飾之豬的HV-GHRH處理之狗（第7天，P<0.05相對於經dGHRH處理之狗的基值）；第6圖顯示經種特異性dGHRH處理之狗的平均血紅素，相對於對照組以及以經修飾之豬的HV-GHRH處理之狗（第14天，Ρ<0·05相對於經dGHRH處理之狗的基值）；第7圖顯示經種特異性dGHRH處理之狗的平均紅血球血紅素含量，相對於對照組以及以經修飾之豬的HV-GHRH 處理之狗（第14天，Ρ<0·01相對於經dGHRH處理之狗的基值）；以及第8圖顯示經種特異性dGHRH處理之狗的平均紅血球血紅素濃度，相對於對照組以及以經修飾之豬的HV-GHRH 處理之狗（第14天，Ρ<0·002相對於經dGHRH處理之狗的基值）。 200523361 序列表 <110> 愛德維西斯股份有限公司 <120> 狗之特異性生長激素釋放激素（dGHRH) <130> 108328.00199 <140> TW093122465 <141> 2004-7-27 <150> <151> US 60/492,427 2003-08-04 <160> 16 <170> Patentln version 3.1 <210> <211> <212> <213> 1 40 PRT 人造序列 <220> <223> <400> 此為豬的GHRH胺基酸序列 1

Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gin 15 10 15

Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp 工le Met Ser Arg Gin Gin Gly 20 25 30

Glu Arg Asn Gin Glu Gin Gly Ala 35 40 <210> <211> <212> <213> 2 40 PRT 人造序列 <220> <223> 此為GHRH經修飾之胺基酸序列 <400> 2

His Val Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gin 15 10 15

Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Leu Asn Arg Gin Gin Gly 20 25 30 200523361

Glu Arg Asn Gin Glu Gin Gly Ala 35 40 〈210〉 3 <211> 40 <212> PRT <213〉人造序列 <220> <223> 此為犬的GHRH胺基酸序列 <400> 3

Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly 1 5 10 15 Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Met Ser Arg Gin Gin 20 25 30 Glu Arg Asn Arg Glu Gin Gly Ala 35 40

Gin

Gly <210> 4 <211> 40 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223〉此為犬的GHRH之一般胺基酸序列 <220>

<221> MIS C_FE AT URE <222> (1).:(1) <223〉位置1之Xaa可為酪胺酸或組胺酸 <220> < 2 21 > MI S C_FEATURE <222> (2).7(2) <223〉位置2之Xaa可為丙胺酸、纈胺酸、或異白胺酸 <220> <221> MIS C一 FE AT URE <222〉 (15)7. (15) <223〉位置15之Xaa可為丙胺酸、纈胺酸、或異白胺酸 <220> <221> MIS C一FE AT URE <222> (27)7.(27) <223〉位置27之Xaa可為曱硫安酸或白胺酸 2 <220> 200523361 < 2 21 > MI SC一FEATURE <222> (28)7.(28) <223〉位置28之Xaa可為絲胺酸或天門冬醯胺酸 <400> 4

Xaa Xaa Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Xaa Gin 15 10 15

Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Xaa Xaa Arg Gin Gin Gly 20 25 30

Glu Arg Asn Arg Glu Gin Gly Ala 35 40 <210> 5 <211〉 2716 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉pAV0221係具有dGHRH序列之表現質體造序列 <400> 5 ccaccgcggt ggcggccgtc cgccctcggc accatcctca cgacacccaa atatggcgac 60 gggtgaggaa tggtggggag ttatttttag agcggtgagg aaggtgggca ggcagcaggt 120 gttggcgctc taaaaataac tcccgggagt tatttttaga gcggaggaat ggtggacacc 180 caaatatggc gacggttcct cacccgtcgc catatttggg tgtccgccct cggccggggc 240 cgcattcctg ggggccgggc ggtgctcccg cccgcctcga taaaaggctc cggggccggc 300 ggcggcccac gagctacccg gaggagcggg aggcgccaag cggatcccaa ggcccaactc 360 cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct ctgggtgttc 420 ttcctggtga tcctcaccct cagcagtggt tcccactctt ccccgccatc cctgcccatc 480 agaatccctc ggtatgcaga cgccatcttc accaacagct accggaaggt gctgggccag 540 ctgtccgccc gcaagctcct scaggacatc atgagccggc agcagggaga gagaaaccgg 600 gagcaaggag catagtaagc ttatcggggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc 660 tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt 720 gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat 780 ggagcaaggg gcaagttggg aagacaacct gtagggctcg agggggggcc cggtaccagc 840 ttttgttccc tttagtgagg gttaatttcg agcttggtct tccgcttcct cgctcactga 900 ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 960 200523361 acggttatcc aaaggccagg tgacgagcat aagataccag gcttaccgga acgctgtagg accccccgtt ggtaagacac gtatgtaggc aacagtattt ctcttgatcc gattacgcgc cgctcagcta tcgggagcgg tcagcaatat ccacagtcga tcgccatgag agttcggctg gcttccatcc gtagccggat gcaggagcaa tcccttcccg agccacgata ttgacaaaaa ccgattgtct cctgcgtgca gatcttgatc cagggcttcc cataaaaccg acagaatcag aaccgtaaaa cacaaaaatc gcgtttcccc tacctgtccg tatctcagtt cagcccgacc gacttatcgc ggtgctacag ggtatctgcg ggcaaacaaa agaaaaaaag gcgctcagaa cgataccgta cacgggtagc tgaatccaga tcacgacgag gcgcgagccc gagtacgtgc caagcgtatg ggtgagatga cttcagtgac gccgcgctgc gaaccgggcg gttgtgccca atccatcttg ccctgcgcca caaccttacc cccagtctag gggataacgc aggccgcgtt gacgctcaag ctggaagctc cctttctccc cggtgtaggt gctgcgcctt cactggcagc agttcttgaa ctctgctgaa ccaccgctgg gatctcaaga gaactcgtca aagcacgagg caacgctatg aaagcggcca atcctcgccg ctgatgctct tcgctcgatg cagccgccgc caggagatcc aacgtcgagc ctcgtcctgc cccctgcgct gtcatagccg ttcaatcatg tcagatcctt agagggcgcc caactgttgg aggaaagaac gctggcgttt tcagaggtgg cctcgtgcgc ttcgggaagc cgttcgctcc atccggtaac agccactggt gtggtggcct gccagttacc tagcggtggt agatcctttg agaaggcgat aagcggtcag tcctgatagc ttttccacca tcgggcatgc tcgtccagat cgatgtttcg attgcatcag tgccccggca acagctgcgc agttcattca gacagccgga aatagcctct cgaaacgatc ggcggcaaga ccagctggca gaagggcgat atgtgagcaa ttccataggc cgaaacccga tctcctgttc gtggcgcttt aagctgggct tatcgtcttg aacaggatta aactacggct ttcggaaaaa ttttttgttt atcttttcta agaaggcgat cccattcgcc ggtccgccac tgatattcgg gcgccttgag catcctgatc cttggtggtc ccatgatgga cttcgcccaa aaggaacgcc gggcaccgga acacggcggc ccacccaagc ctcatcctgt aagccatcca attccggttc cgtgtaatac aaggccagca tccgcccccc caggactata cgaccctgcc ctcatagctc gtgtgcacga agtccaaccc gcagagcgag acactagaag gagttggtag gcaagcagca cggggtctga gcgctgcgaa gccaagctct acccagccgg caagcaggca cctggcgaac gacaagaccg gaatgggcag tactttctcg tagcagccag cgtcgtggcc caggtcggtc atcagagcag ggccggagaa ctcttgatca gtttactttg gcttgctgtc gactcactat 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 agggcgaatt ggagct 2716 200523361 <210〉 6 <211> 2739 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> PAV0215係HV-GHRH之表現質體 <400> 6 ccaccgcggt ggcggccgtc cgccctcggc accatcctca cgacacccaa atatggcgac 60 gggtgaggaa tggtggggag ttatttttag agcggtgagg aaggtgggca ggcagcaggt 120 gttggcgctc taaaaataac tcccgggagt tatttttaga gcggaggaat ggtggacacc 180 caaatatggc gacggttcct cacccgtcgc catatttggg tgtccgccct cggccggggc 240 cgcattcctg ggggccgggc ggtgctcccg cccgcctcga taaaaggctc cggggccggc 300 ggcggcccac gagctacccg gaggagcggg aggcgccaag cggatcccaa ggcccaactc 360 cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct ctgggtgttc 420 ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc ccctttgacc 480 ctcaggatgc ggcggcacgt agatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa ggtgctggcc 540 cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg agagaggaac 600 caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg ggtggcatcc 660 ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag tgcccaccag 720 ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct tctataatat 780 tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa cctgtagggc 840 tcgagggggg gcccggtacc agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt tcgagcttgg 900 tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 960 tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 1020 aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 1080 tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 1140 tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 1200 cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 1260 agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 1320 tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 1380 aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 1440 ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 1500 200523361 cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 1560 accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 1620 ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 1680 ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag ctagcgctca gaagaactcg tcaagaaggc 1740 gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt 1800 cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat 1860 agcggtccgc cacacccagc cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca 1920 ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat gagtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca 1980 tgcgcgcctt gagcctggcg aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca 2040 gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt 2100 tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat 2160 cagccatgat ggatactttc tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg 2220 gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg 2280 cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat 2340 tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc 2400 ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc 2460 tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg 2520 atcctcatcc tgtctcttga tcagatcttg atcccctgcg ccatcagatc cttggcggca 2580 agaaagccat ccagtttact ttgcagggct tcccaacctt accagagggc gccccagctg 2640 gcaattccgg ttcgcttgct gtccataaaa ccgcccagtc tagcaactgt tgggaagggc 2700 gatcgtgtaa tacgactcac tatagggcga attggagct 2739 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉選自 HV-GHRH 之 Bam/Hind III 片段之 5，引子 <400> 7 atggtgctct gggtgttctt 20

<210> 8 <211〉 20 <212> DNA 20 200523361 <213〉人造序列 <220> <223〉選自牛GHRH之Exon 5中之序列之3 1引子 <400> 8 ttcatccttg ggagttcctg <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223> 經設計具有特定突變之引子 <400> 9 cggccgaaag cttactatgc tcct <210> 10 <211〉 23 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223> 經設計具有特定突變之引子 <400> 10 attcgccccc atggtgctct ggg <210> <211> <212> <213> <220> <223> 11 323

DNA 人造序列合成之真核細胞啟動子SPC5-12之核酸序列 <400> 11 60 120 180 240 300 cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcg

<210〉 12 <211> 190 <212> DNA 323 200523361 <213〉人造序列 <220> <223> 人類生長激素聚A尾部之核酸序列 <400> 12 gggtqqcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 60 gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc 120 ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca 180 acctgtaggg 190 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉原核細胞之選擇性標記基因啟動子PNEO <400〉 13 accttaccag agggcgcccc agctggcaa 29 >>>> 0 12 3 1111 2 2 2 2 < < < < 14 5

DNA 人造序列 <220> <223> NEO核糖體結合位置 <400> tcctc 14 <210> 15 <211> 795 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223> 抗生素抗性基因康黴素之序列 <400> 15 atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc 60 ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca 120 gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg 180 caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg 240 ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 300 gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 360 200523361 cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc 420 atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa 480 gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac 540 ggcgaggatc tcgtcgtgac tcatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat 600 ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac 660 atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc 720 ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt 780 gacgagttct tctga 795 <210> 16 <211> 782 <212> DNA <213〉人造序列 <220> <223〉質體pUC-18複製起點之序列 <400> 16 tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 60 tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 120 aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 180 tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 240 tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 300 cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 360 agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 420 tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 480 aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 540 ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 600 cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 660 accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 720 ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 780 tt 782

Claims

200523361 十、申請專利範圍： 1 · 一種組成物，其包括可編碼犬的特異性生長激素釋放激素（dGHRH)或其片段之核酸表現構築體，其與SeqlD No. 04 具有至少95%之相似性： X1X2DAIFTNSYRKVLX3QLSARKLLQDIX4X5RQQGERNR EQGA 其中：Xi係選自由酪胺酸（“Y”）或組胺酸（“H”）所組成群之胺基酸D-或L-異構物；X2係選自由丙胺酸（“A”）、纈胺酸（“V”）、或異白胺酸（“I”）所組成群之胺基酸D-或l-異構物；X3係選自由丙胺酸（“A，，）或甘胺酸（“G”）所組成群之胺基酸D-或L-異構物；χ4係選自由曱硫胺酸（“μ”）或白胺酸（“L”）所組成群之胺基酸〇_或l-異構物；χ5係選自由絲胺酸（“S”）或天冬醯胺酸（“Ν”）所組成群之胺基酸d—或l-異構物。 2·如申請專利範圍第1項之組成物，其中該dGHRH可於受者體内增加生長激素（GH)。 3 ·如申晴專利範圍第1項之組成物，其中該dGHRH可改善受者體内之血液參數。 4·如申叫專利範圍第1項之組成物，其中該dGHRH可增加雙者體内之紅血球數值。 •如申吻專利範圍第1項之組成物，其中該dGHRH可增加受者體内之血紅素值。如申叫專利範圍第1項之組成物，其中該dGHRH可增加受者體内之平均紅血球血紅素值。 35 200523361 7. 如申請專利範圍第i項之組成物，其中該核酸表現構築體復包括： > 〇)合成性或真核細胞之啟動子； ' (b)聚腺苷酸化訊號； (e)選擇性標記基因啟動子； (d) 核糖體結合位置； (e) 選擇性標記基因序列；以及 (f) 複製之起點；其中，該合成性或真核細胞之啟動子，編碼dGHRH或其 _ 功能上之生物等同物之核酸序列、以及該聚腺苷酸化訊號組成該核酸表現構築體之治療元件；該治療元件係經操作性連接且位於第一操作性-連接配置；該選擇性標記基因啟動子、核糖體結合位置、選擇性標記基因序列、以及複製之起點組成該核酸表現構築體之複製元件；該複製元件係經操作性連接且位於第二操作性_連接配人置；該第一操作性-連接配置以及第二操作性_連接配置 _ 組成一環狀結構之核酸表現構築體；以及該核酸表現構築體係用於質體中介之基因補充作用。 8. 如申請專㈣圍第7項之組成物，€包括經操作性連接至第一操作性-連接配置之5，未轉譯區（UTR)。 9·如申請專利範圍第7項之組成物，其中該3，未轉譯區 (UTR)包括部分人類生長激素3，UTR。 ι〇_—種核酸表現構築體pAV0221，包括與SeqiDN〇. 〇5具有至少95 %相似性之序列。 36 200523361 11 · 一種核酸表現構築體pAV00215，包括與SeqlD No. 06 具有至少95%相似性之序列。 12·—種於受者體内增加生長激素（GH)值之方法，包括：將犬的特異性生長激素釋放激素（dGHRH)或其片段之經單離之組成物遞送至受者體内，其與SeqlD No. 04具有至少95%之相似性： X1X2DAIFTNSYRKVLX3QLSARKLLQDIX4X5RQQGERNR EQGA 其中： Χι係選自由酪胺酸（“Y”）或組胺酸（“H”）所組成群之胺基酸D-或L-異構物；X2係選自由丙胺酸（“a”）、纈胺酸 (“V”）、或異白胺酸（“I”）所組成群之胺基酸仏或L_異構物；X3係選自由丙胺酸（“A”）或甘胺酸（“g”）所組成群之胺基酸D-或L-異構物；X4係選自由甲硫胺酸（“M”）或白胺酸（“L”）所組成群之胺基酸〇_或L_異構物；&係選自由絲胺酸（“S”）或天冬醯胺酸（“Ν”）所組成群之胺基酸D_ 或L-異構物。 13·如申請專利範圍第12項之方法，其中該重組（^111111係一生物活性多肽，以及該dGHRH之重組之功能上的生物等同物係一多肽，其係經生物工程製作而含有與dGHRH 多肽相較下具有相似或經改善生物活性之不同的胺基酸序列。 14·如申請專利範圍第12項之方法，纟中於具有經遞送之重組dGHRH核酸表現構築體之受者體内增加之血液參 37 200523361 數可反應出增加之GH值。 15·如申請專利範圍第μ項之方法，其中該血液參數係紅血球計數、血紅素濃度、或平均紅血球血紅素。 · 16.—種於受者體内增加生長激素（GH)值之方法，包括··將編碼犬的特異性生長-激素-釋放-激素（dGHRH)或其片段之核酸表現構築體遞送至受者之細胞中，其與No. 04具有至少95%之相似性： X1X2DAIFTNSYRKVLX3QLSARKLLQDIX4X5RQQGERN REQGA 鲁其中： Χι係選自由酪胺酸（“Y”）或組胺酸（“H”）所組成群之胺基酸D-或L-異構物；X2係選自由丙胺酸（“a”）、纈胺酸 (“V”）、或異白胺酸（“r’）所組成群之胺基酸仏或L_異構物’ X3係選自由丙胺酸（“A”）或甘胺酸（“g”）所組成群之胺基酸D-或L-異構物；X4係選自由曱硫胺酸（“M”）或白胺酸（“L”）所組成群之胺基酸！)_或^異構物；χ5係選自由絲胺酸（“S”）或天冬醯胺酸（“Ν”）所組成群之胺基酸D_ 或L-異構物。 17 ·如申凊專利範圍第16項之方法，其中係經由電穿孔法將核酸表現構築體遞送至受者之細胞。 18·如申請專利範圍第16項之方法，其中受者之細胞係體細胞、幹細胞、或生殖細胞。 19·如申清專利範圍第16項之方法，其中該核酸表現構築體係 SeqlD No. 05、或 SeqlD No. 06。 38 200523361 20. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該核酸表現構築體復包括轉染-促進多肽。 21. 如申請專利範圍第2〇項之方法，其中該轉染-促進多肽包括帶電荷之多肽。 22. 如申請專利範圍第2〇項之方法，其中該轉染_促進多肽包括聚麵胺酸。 23·如申請專利範圍第16項之方法，其中該d(}HRH係表現於受者之組織-特異性細胞中。 24·如申請專利範圍第23項之方法，其中受者之組織_特異性細胞包括肌肉細胞。 25.如申請專利範圍第16項之方法，其中於具有經遞送之核酸表現構築體之受者體内增加之血液參數可反應出增加之GH值。 26_如申請專利範圍第25項之方法，其中該血液參數係紅血球計數、血紅素濃度、或平均紅血球血紅素。 27·—種組成物，其包括經單離之犬的特異性生長激素釋放激素（dGHRH)或其片段，其與SeqlD No· 04具有至少95% 之相似性： X1X2DAIFTNSYRKVLX3QLSARKLLQDIX4X5RQQGERNR EQGA 其中：Xi係選自由赂胺酸（“Y”）或組胺酸（“Η”）所組成群之胺基酸D-或L-異構物；Χ2係選自由丙胺酸（“Α”）、纈胺酸（“V”）、或異白胺酸（“I”）所組成群之胺基酸D-或L-異構物；Χ3係選自由丙胺酸（“Α”）或甘胺酸（“G”）所組成 39 200523361 群之胺基酸D-或L-異構物；X4係選自由甲硫胺酸（“Μ”) 或白胺酸（“L”）所組成群之胺基酸D-或L-異構物；Χ5係選自由絲胺酸（“S”）或天冬醯胺酸（“Ν”）所組成群之胺基酸D-或L-異構物；以及該經單離之dGHRH係一生物活性多肽，其經生物工程製作而含有不同之胺基酸序列。 28·如申請專利範圍第27項之組成物，其中經單離之 dGHRH可於受者體内增加生長激素（GH)。 29·如申请專利範圍第27項之組成物，其中經單離之 dGHRH可改善受者體内之血液參數。 30. 如申請專利範圍第27項之組成物，其中經單離之 dGHRH本身可增加受者體内之紅企球值。 31. 如申請專利範圍第27項之组成物，其中經翠離之 dGHRH本身可增加受者體内之血紅素。 32·如申請專利範圍第27項之組成物，其中經單離之 dGHRH可增加受者體M +