TR201812130T4 - Herbisitlere karşı dirençli şeker pancarı bitkilerini geliştirmek için yöntem. - Google Patents

Abstract

Herbisitlere karşı dirençli bir şeker pancarı bitkisi üretilmesi için bir yöntem olup, bir şeker pancarı bitkisinden izole edilen stomatal koruyucu hücrelerinden protoplastların elde edilmesi, bir ALS herbisitini söz konusu hücreler için ölümcül olan bir konsantrasyonda içeren bir bileşimin hücrelere uygulanması ve sağ kalan hücrelerden şeker pancarı bitkilerinin rejenere edilmesi adımlarını içermektedir.

Description

TARIFNAME HERBISITLERE KARSI DIRENÇLI SEKER PANCARI BITKILERINI GELISTIRMEK IÇIN YÖNTEM Bulusun Alani Mevcut bulus, herbisitlere, örnegin asetohidroksiasit sentaz enzimi (ALS) inhibitörlerine karsi dirençli olan seker pancari bitkilerini üretmek için bir yöntemle ilgilidir.

Mevcut bulus ayrica, bu yöntemle elde edilen bitkilerle ilgilidir.

Seker pancari, iliman ve subtropik bölgelerde önemli bir tarimsal mahsuldür.

Modern tarimda, yabani ot çogalmasini yönetmek için herbisitler yaygin olarak kullanilmaktadir.

ALS inhibitörleri gibi herbisitlere karsi dirençli olan seker pancari bitkilerinin gelistirilmesi transgenik yaklasimlar kullanilarak yapilabilmektedir.

Aslinda, bir herbisite karsi direnç kazandiran bir geni tasiyan yabanci DNA'nin uygulanmasi, seker pancari dahil olmak üzere çesitli tarla mahsullerinde basarili bir sekilde gerçeklestirilmistir.

WO 95/10178 sayili belge, Bialaphos herbisitine karsi transgenik olarak uyarilmis direnci açiklamaktadir. Direnoi kodlayan gen, seker pancarindan alinan koruyucu hücrelerin protoplastlarina uygulanmis, ardindan bu protoplastlar seker pancari bitkileri olarak rejenere edilmistir. Bu bitkiler kimyasal fosfinotrisine ve bunun türevi glufosinata karsi da dirençlidir.

Transforme edilmemis bitkiler Bialaphos'a karsi direnç kazanmamistir.

En iyi durumda, 28 adet transforme edilmis kallus 83000 protoplasttan rejenere edilmistir; en kötü durumda, 1 kallus 190 000 protoplasttan rejenere edilmistir.

Akabinde, bu kalluslarin bazilari somatik embriyogenez gösterebilmektedir ve seker pancari fidelerini %1 verimlilikle ve oldukça avantajli bir özellik olarak görülen sekilde Bununla birlikte, yaygin olarak embriyo gibi seker pancari organlarindan ve/veya yaprak disklerinden elde edilen eksplantlardan alinan kalluslarin daha dogrudan transformasyonuna dayali olan bu yaklasim alanda yaygin olarak kullanilmamaktadir.

Seker pancari mahsulünde oldugu gibi, DNA vektörlerine ve/veya yabanci genlerin yerlestirilmesine dayali olmayan, herbisitlere karsi dirençli bitkilerin gelistirilmesi için önemli bir ihtiyaç halen bulunmaktadir.

Diger yandan, ALS inhibitörleri gibi herbisitlere karsi dirençli seker pancari bitkisinin gelistirilmesi teorik olarak, dogal olusumlu bir direnç geni içerecek olan bir seker pancari bitkisi ile klasik yetistiricilikle yapilabilmektedir. Ancak bu yaklasim zaman alicidir ve basvuru sahibinin bilgisine göre, dogal olusumlu ALS inhibitörüne karsi dirençli bitkiler belgelenmis olmasina ragmen, en azindan çesitli yabani ot türü dahil olmak üzere seker pancari disindaki türler için basarili sonuçlanmamistir. Özellikle bir ikili mutantin (yani ayni ALS geninde iki mutasyona sahip bir bitkinin) dogada olusmasi pek mümkün degildir.

WO 98/0252? sayili patent basvurusu, sülfonilüre herbisitleri gibi bazi ALS inhibitörlerine karsi dirençli olan seker pancari bitkisinin üretimi için bir yöntemi açiklamakta olup, bu yöntem B. vulgari's eksplantlarindan elde edilen kalluslarin sülfonilüreye tabi tutulmasi ve bu herbisitin varliginda büyüyebilen birkaç spontan mutanttan bitkilerin rejenere edilmesi adimlarini içermektedir.

Bu yöntem, ALS geninde bir mutasyona sahip bir bitki vermis olup, burada kodlanmis ALS enzimindeki 188. pozisyondaki (Arabidopsi's thaliana ALS enzimindeki 197. pozisyona karsilik gelmektedir) prolin bir serinle ikame edilmistir. Ancak bu mutant ticari olarak kullanilmamaktadir çünkü tercih edilen modern sülfonilüreler olan ALS herbisitleri (örn. foramsülfuron) ise islemler gerekli doz oraninda tarla çalismalarinda bir miktar fitotoksisite sergilemektedir. istisna B. vui'garfs eksplantlarindan elde edilen kalluslarin foramsülfurona tabi tutulmasi ve dolayisiyla foramsülfuron dahil olmak üzere birkaç ALS inhibitörüne karsi dirençli seker pancari bitkisi ile sonuçlanmasidir.

Bu yöntem, ALS geninde bir mutasyona sahip bir bitki vermis olup, burada kodlanmis ALS enzimindeki 569. pozisyondaki (Arabidopsi's iha/fena ALS enzimindeki 574. pozisyona karsilik gelmektedir) triptofan bir Iösinle ikame edilmistir.

Bu homozigot 569/569 mutantinin tarla çalismalari, foramsülfurona, iyodosülfurona (bir baska ALS inhibitörü) ve farkli ALS inhibitörlerinin karisimlarina karsi iyi direnç göstermistir.

Bu yayinlanan yöntemlerin her ikisi de embriyolar gibi bagimsiz eksplantlardan gelen kalluslarin izole edilmesine iliskin oldukça yerlesik adimlardan faydalanmaktadir. Ancak bu, zaman alici bir yaklasim olup, (i) fazla sayida taze embriyonun izole edilmesini, (ii) bunlarin agar ile katilastirilmis kültür ortaminda yinelemeli kültürünü ve (iii) morfolojik seçme yaklasimlarini kullanarak rejenere edilebilir kalluslarin seçilmesini kapsama ktadir.

Seker pancarina genetik özellikler aktarilmasinin diger stratejileri gelistirilmis olup, bunlar baslangiç malzemesi olarak (stomatal koruyucu hücre protoplastlarindan farklidir olan) mesofil protoplastlarina dayanmaktadir (Krens ve ark., 1990, Theor. appl. Genet., cilt 79, syf. 390-396). biyoteknoloji uygulamalarini açiklamaktadir. Yedi farkli in vitro kültür teknigi açiklanmaktadir. Bunlarin arasinda, ya transformasyon amacina yönelik stomatal koruyucu hücrelerini ya da solmus hipokotil ekSpIantlarindan gelen kirilgan kallusu köken alan protoplastlarin kültürü yer almakta olup, ikincisi çok daha verimlidir. Ancak protoplastlarin kullanildigi bu yaklasim büyük zorluklarla iliskilendirilmistir. deneyi gerçeklestirmek için 500000 stomatal koruyucu hücre protoplastinin kültürünü kullanmistir. Transformasyon verimliligi %2'den fazla olmustur. Diger taraftan, bitkilerin in vitro kültürünün stomatal bozulma ile iliskili oldugu bildirilmis olup, ilgili hücrelerde sorunlara ve dolayisiyla bir mutasyonel olayi içeren bir yöntemin gerçeklestirilmesi için gereken miktarlar gibi çok yüksek miktarda stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin üretimine isaret etmektedir.

Bulusun Özeti Genis bir yönde mevcut bulus, bir herbisite karsi dirençli olan bir mutant seker pancari bitkisi üretilmesi için, asagidaki adimlari içeren bir yöntemi açiklamaktadir: - bir seker pancari bitkisinden izole edilen stomatal koruyucu hücrelerinden . bu protoplastlarin in vitro kültürüne, bu herbisiti in vitro kültürlenmis hücrelerin uygulanmasi ve . bu in vitro kültürlenmis hücrelerin sag kalan hücrelerinden seker pancari bitkilerinin rejenere edilmesi, . muhtemelen, bu herbisitin hedefledigi peptidi/peptitleri kodlayan gende bir mutasyona sahip olan rejenere edilmis seker pancari bitkilerinin seçilmesi, burada bu stomatal koruyucu hücre protoplastlari bir seker pancari bitkisi olarak rejenere olma kapasitelerine göre önceden seçilmekte olup, burada önceden seçilmis protoplastlarin %10”dan fazla olan (büyüyen protoplastlarin sayisi:kültüre koyulan toplam protoplast sayisi) bölünme ve canli kallus olarak rejenere olma olasiligi vardir, burada söz konusu protoplastlardan elde edilen kalluslarin %10*dan fazla olan (filiz veren kallus sayisi:toplam kallus sayisi) filiz gelistirme kapasitesi vardir ve burada bu herbisit bu protoplastlarin 20 000 OOO'dan fazlasina uygulanmaktadir.

Mevcut yöntemde kullanilan herbisit ALS genini hedef almayan bir herbisit olabilmektedir.

Tercih edilen herbisitler (ALS'yi hedef almayan) asagidakilerden olusan gruptan seçilmektedir: - 4-HPPD inhibitörleri (mesela mezotrion, izoksaflutol, pirasülfotol, benzobisiklon, benzofenap, pirazolinat, pirazoksifen, tembotrion, topramezon, sulkotrion ve sulkotrion), karotenoid biyosentez inhitörleri (mesela flurtamon, fluridon, flurokloridon, beflubutamid, norflurazon, pikolinafen ve diflufenikan); - EPSP sentaz inhibitörleri (mesela glifosat veya glifosat-trimesyum); fotosistem ll inhibitörleri (mesela Fenil-karbamatlar, örnegin fenmedifam veya desmedifam, Piridazinonlar (örnegin kloridazon = pirazon), Triazinler (örnegin siyanazini remtal, eglinazin-etil, proglinazin-etil, ametrin, atrazin, desmetrin, dimetametrin, prometon, prometrin, propazin, simazin, simetrin, terbumeton, terbütilazin, terbütrin, metoprotin), Triazinonlar (örnegin metamitron, metribuzin, hekzazinon), Urasiller (bromasil, lenasil, terbasil), Üreler (dimefuron, izoproturon, linuron, monolinuron, etidimuron, metabenztiyazuron, tebutiuron, diuron, fenuron, neburon, siduron, izouron, klorobromuron, klorotoluron, kloroksuron, fluometuron, metobromuron, metoksuron, tiyazafluron, monuron, sikluron, monolinuron) veya amikarbazon, solan, propanil, bentazon, bromoksinil. ioksinil, bromofenoksim, piridat, piridafol; fotosistem I inhibitörleri (mesela dikuat veya parakua): hücre bölünmesi inhibitörleri (mesela karbetamid, klorprofam, profam, naproanilid, difenamid, napropamid, butenaklor, metazaklor, dietatiI-etil, asetoklor, alaklor, butaklor, propaklor Monsanto, propizoklor, dimetaklor, dimetenamid, metolaklor, pretilaklor, S-metolaklor, petoksamid, tenilklor, anilofos, kafenstrol, indanofan, bromobutid, piperofos, flufenaset, mefenaset, fentrazamid): mikrotübül düzeneginin inhibitörleri (mesela propizamid = pronamid, tebutam, klortal-dimetil = DCPA, flukloralin, pendimetalin, butralin, benefin=benfluralin, etalfluralin, orizalin, trifluralin, prodiamin, dinitramin, butamifos, ditiyopir, tiyazopir); protoporfirinojen oksidaz inhibitörleri (mesela Difenileterler (asiflorfen-sodyum, bifenoks, etoksifen-etil, klornitrofen, floroglikofen-etil, oksiflorfen, klometoksifen, flordifen, fomesafen, Iaktofen, nitrofen, aklonifen), N-fenilftalimidler (sinidon-etil, flumiklorak-pentil, flumioksazin), Oksadiazoller (oksadiargil, oksadiazon) Oksazolidinedionlar, (pentoksazon), Fenilpirazoller (fluazolat, piraflufen-etil), Pirimidindionlar (saflufenasil, benzfendizon, butafenasil), Tiyadiazoller (tidiazimin, flutiaset-metil), Triazolinonler (azafenidin, karfentrazon-etil sülfentrazon), piraklonil, profluazol, flufenpir-etil ); . Asetil CoA karboksilaz inhibitörleri (mesela Ariloksifenoksipropiyonatlar (mesela klodinafop-proparjil, sihalofop-bütil, diklofop-metil, fenoksaprop-P-etil, fluazifop-P- bütil, haloksifop-etotil, haloksifop-metil, haloksifop-P-metil, propakuizafop, kuizalofop-P-etil veya kuizalofop-P-tefuril), Sikloheksandionlar (mesela alloksidim, bütroksidim, kletodim, sikloksidim, profoksdim, setoksidim, tepraloksidim veya tralkoksidim), Fenilpirazolin (pinoksaden)); - hücre çeperi sentez inhibitörleri (mesela indaziflam, izoksaben, klortiamid, diklobenil, kuinklorak, flupoksam); . glutamin sent(et)az inhibitörleri (glufosinat-amonyum veya bialafos=bilanafos) ve . sentetik oksin (mesela TBA, dikamba, kloramben, benazolin-etil 4, diklorprop-P, mekoprop-P, 2,4,5-T (weedar) 2,4-D (Weedar), 2,4-DB (Bütirol), diklorprop, MCPB, mekoprop, MCPA-tiyoetil, klomeprop, Agrokson 4, aminopiralid, klopiralid, fluroksipir, halauksifen-metil, pikloram, triklopir, kuinklorak, kuinmerak), daha tercihen 4-HPPD inhibitörleri, karotenoid biyosentez inhibitörleri, EPSP sentaz inhibitörleri, fotosistem ll inhibitörleri, fotosistem I inhibitörleri, mikrotübül düzenegi inhibitörleri, protoporfirinojen oksidaz inhibitörleri ve sentetik oksinden olusan gruptan seçilmektedir.

Son derece tercih edilen bir baska herbisit ise bir ALS inbihitörüdür.

Bu nedenle, mevcut bulus asetohidroksiasit sentaz enziminin (ALS) bir veya daha fazla inhibitörüne karsi dirençli olan bir mutant seker pancari bitkisinin üretilmesi için, asagidaki adimlari içeren bir yöntemle ilgilidir: . bir seker pancari bitkisinden izole edilen stomatal koruyucu hücrelerinden . söz konusu protoplastlarin in vitro kültürüne, bir veya daha fazla ALS inhibitörünü in vitro kültürlenmis hücreler için (bunlarin %99'undan daha fazlasi için (tercihen olan (yine de bazi mutantlarin kaçmasina izin veren) bir konsantrasyonda içeren bir bilesim uygulanmasi ve . söz konusu in vitro kültürlenmi's hücrelerin sag kalan hücrelerinden seker pancari bitkilerinin rejenere edilmesi, burada söz konusu stomatal koruyucu hücre protoplastlari bir seker pancari bitkisi olarak rejenere olma kapasitelerine göre önceden seçilmekte olup, burada önceden seçilmis protoplastlarin %10'dan fazla olan (büyüyen protoplastlarin sayisizkültüre koyulan toplam protoplast sayisi) bölünme ve canli kallus olarak rejenere olma olasiligi vardir, burada söz konusu protoplastlardan elde edilen kalluslarin %10'dan fazla olan (filiz veren kallus sayisiztoplam kallus sayisi) filiz gelistirme kapasitesi vardir ve burada söz konusu ALS inhibitörleri söz konusu protoplastlarin 20 000 000'undan fazlasina ve hatta 50 000 000'undan fazlasina uygulanmaktadir.

Tercihen bu yöntem, farkli genotiplerdeki seker pancari bitkilerinden gelen stomatal koruyucu hücrelerinin izole edilmesi ve her genotip için, söz konusu protoplastlar kültüre koyuldugunda söz konusu protoplastlarin büyüyen oraninin ölçülmesi alt adimlarini içermektedir.

Tercihen bu yöntem ayrica, avantajli bir biçimde ALS geninde bir mutasyonu tespit etmek için ve/veya ALS geninde bir veya daha fazla, tercihen bir, iki veya daha fazla mutasyonu olan rejenere edilmis seker pancari bitkilerini seçmek için, sag kalan in vitro kültürlenmi's hücrelerden gelen rejenere bitkilerin genomunun sekanslanmasi adimini içermektedir.

Arjinin 372, Serin 648 ve Glisin 649`dan olusan gruptan seçilen amino asitleri kodlayan pozisyonlarda ALS geninde bir veya birkaç mutasyonu olan seker pancari mevcut bulusun yöntemi ile elde edilmektedir ve/veya seçilmektedir. 188. pozisyondaki Prolinde ve 569. pozisyondaki Triptofanda bir mutasyonu olan bir baska tercih edilen seker pancari bitkisi mevcut bulusun yöntemi ile elde edilmektedir ve/veya seçilmektedir.

Tercihen, iki veya daha fazla mutasyon olan seker pancari bir allelde iki mutasyonu sahip olup, kodlanmis peptidin ALS inhibitörlerine karsi (özellikle birkaç ALS inhibitörü içeren bilesimlere karsi) direnç için sinerji olusturan iki mutasyonu barindirdigi anlamina gelmektedir. En Çok tercih edilen seker pancarinin bir örnegi bir allelde 188. pozisyondaki Prolinde ve 569. pozisyondaki Triptofanda bir mutasyonu olan (ve muhtemelen ikinci allelde ayni mutasyonlari olan; alternatif olarak, ikinci allel farkli mutasyonlari barindirmaktadir) seker pancaridir.

Alternatif olarak, iki mutasyona sahip olan seker pancarinin her allelde bir mutasyonu Mevcut bulusun yöntemi, Prolin 1881 kodlayan pozisyonlarda ALS geninde bir olarak mutasyona ugramistir), Fenilalanin 573, Serin 648 ve Glisin 649”u kodlayan pozisyonlarda ALS geninde bir veya daha fazla mutasyona sahip bir seker pancari bitkisinin rejenere edilmesine olanak vermektedir. Tercih edilen seker pancarinin bir örnegi, 188. pozisyondaki Prolinde bir mutasyona ve ayni allelde bir baska mutasyona (muhtemelen triptofan 569 veya Trp569Gly degil) sahip bir seker pancaridir.

Mevcut bulusun yöntemi, Triptofan 569'u (tercihen Lösin olarak mutasyona ugramistir) kodlayan pozisyonda ALS geninde bir mutasyona ve Glisin 112, Alanin 113, Metiyonin pozisyonlarda ALS geninde bir veya daha fazla mutasyona sahip bir seker pancari bitkisinin rejenere edilmesine olanak vermektedir.

Tercih edilen seker pancarinin bir örnegi, 569. pozisyondaki triptofanda bir mutasyona ve ayni allelde bir baska mutasyona (muhtemelen Prolin 188 veya Pro188Ser degil) sahip bir seker pancaridir.

Mevcut bulusun yöntemi, ALS geninde bir veya daha fazla mutasyona sahip bir seker pancari bitkisinin rejenere edilmesine olanak vermekte olup, burada söz konusu bir Triptofan 569, Serin 648 ve Glisin 649'dan olusan gruptan seçilmektedir, burada söz konusu Alanin 113 Valin veya Treonin olarak mutasyona ugramistir, burada söz konusu Prolin 188 Treonin, Arjinin, Lösin, Glutamin veya Alanin olarak mutasyona ugramistir, burada söz konusu Alanin 198 Valin olarak mutasyona ugramistir, burada söz konusu Aspartat 371 Glutamat olarak mutasyona ugramistir, burada söz konusu Arjinin 372 Histidin olarak mutasyona ugramistir, burada söz konusu Triptofan 569 Glisin olarak mutasyona ugramistir, burada söz konusu Serin 648 Treonin olarak mutasyona ugramistir ve burada söz konusu Glisin 649 Aspartat olarak mutasyona ugramistir.

Tercihen, bu spesifik mutasyonlardan ikisine veya daha fazlasina sahip seker pancari bir allelde iki mutasyona sahip olup, kodlanmis peptidin ALS inhibitörlerine karsi (özellikle birkaç ALS inhibitörü içeren bilesimlere karsi) direnç için sinerji olusturan iki mutasyonu barindirdigi anlamina gelmektedir.

Mevcut bulusun yöntemi, ALS geninde Prolin 188'i kodlayan pozisyonda bir mutasyona ve ALS geninde Triptofan 5691u kodlayan pozisyonda bir mutasyona sahip bir seker pancari bitkisinin rejenere edilmesine olanak vermektedir.

Avantajli bir biçimde, bu yöntem bir veya daha fazla ALS inhibitörünün bilesimin (bir veya daha fazla ALS inhibitörü içerir) in vitro kültürlenmis hücrelerin en az %99'u (tercihen en az %99.9'u ve hatta %99.99'u) için ölümcül oldugu konsantrasyonunun çikarimda bulunulmasi ön adimini içermektedir.

In vitro kültürlenmis stomatal koruyucu hücre protoplastlarina eklenecek olan bilesimde bulunan tercih edilen ALS inhibitörü (söz konusu bilesim ilaveten, tercihen sülfonilüre ALS inhibitörü, mesela tienkarbazon-metilden baska bir siniftan olan bir baska ALS inhibitörü içermektedir) tercihen 10'9 mol/l ila (daha tercihen) 10"6 mol/l arasi bir konsantrasyonda olan foramsülfurondur.

In vitro kültürlenmis stomatal koruyucu hücre prot0plastlarina eklenecek olan bilesimde bulunan bir baska uygun ALS inhibitörü etoksisülfürondur (muhtemelen bu bilesim ayrica diger ALS inhibitörlerini içermektedir).

Mevcut bulusun ilgili bir yönü, mevcut bulusun yöntemi ile elde edilebilen mutasyona ugramis bir seker pancari bitkisidir, mesela triptofan 569 ve/veya prolin 188lde bir mutasyona sahip bir seker pancaridir.

Mevcut bulusun bir baska ilgili yönü, SEKANS TANIM No:3 (veya SEKANS TANIM No:4) ve/veya SEKANS TANIM No:5 (veya SEKANS TANIM NO:6)”yi içeren mutasyona ugramis bir seker pancari bitkisidir. saklanan ürüne karsilik gelmektedir.

Mevcut bulus ayrica, bulusa ait mutasyona ugramis bitkiden elde edilen doku veya bitki parçasi (örnegin stomatal koruyucu hücreleri veya yaprak seritleri) veya tohumlarin yani sira bunlarin bir baska genetik özelligin takdimi için kullanimlari ile ilgilidir.

Mevcut bulus ayrica, mevcut bulus kapsaminda gelistirilen (iyi biçimde rejenere olan) stomatal koruyucu hücre protoplastlarini ALS inhibitörlerine direnç disinda bir baska genetik özelligin takdimi için kullanimi ile ilgilidir.

Bulusun Detayli Açiklamasi Bulus sahipleri, bir stomatal koruyucu hücre protoplastindan bir seker pancari bitkisinin rejenerasyonunun çok zor olmasina ve düsük düzeyde olusmasina ve alanda olagan sekilde kullanildigi gibi eksplantlardan elde edilen kalluslardan dogrudan rejenerasyona göre daha uzun ve daha karmasik prosedürler gerektirmesine ragmen, seker pancarinin stomatal koruyucu hücresinden gelen protoplastlarin ALS inhibitörleri gibi herbisitlere karsi direnci tetiklemek için iyi bir baslangiç maddesini temsil ettigini kesfetmislerdir.

Aslinda, eksplantlardan gelen kallus (kalluslar) farklilasmamis (veya genel hale getirilmis) hücrelerin bir kitlesi olup, bunlar, uygun kültür kosullarinda farklilasacak (veya yeniden farklilasacak) ve tamamen fonksiyonel bir seker pancari bitkisini rejenere edecektir. Bu yöntemde, tohumlar büyük miktarlarda toplanmakta, ardindan kolayca sterilize edilmekte eksplantlar bu sekilde büyük miktarlarda elde edilmektedir. Bu yöntem, isin büyük bir kisminin steril bir ortamin zorluklari olmadan gerçeklestirilmesine olanak sagladigindan elverislidir.

Diger taraftan, stomatal koruyucu hücreleri bitkide iyi sekilde tanimlanmis bir düzene sahiptir ve bunlarin bitki dokusundan izolasyonu tek tek hücrelere, ardindan bir islemden sonra tek tek protoplastlara yol açmaktadir.

Mevcut bulusun yönteminde, fideler in vitro olarak büyütülmeli ve steril kosullarda muhafaza edilmelidir, ardindan stomatal koruyucu hücreleri bu küçük fidelerden izole edilmektedir ve steril kosullar muhafaza edilirken protoplastlar elde edilmektedir, ardindan bu tek tek protoplastlar tekrar hücre çeperlerini üretmeleri, ilk önce mikro- kalluslar olarak, ardindan bir seker pancari bitkisi olarak büyümeleri için uyarilmaktadir.

Seker pancarinin stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin çok hassas olduklari, bunun da bunlarin uygulama kapsamini azalttigi bulunmustur: örnegin bir mutajenin eklenmesinin, istenen genetik özelligin ortaya çikmasini desteklemek yerine çogu durumda protoplastlar için ölümcül oldugu bulunmustur.

Bir baska deyisle, mutasyonla istenen genetik özelligi kazanmis olan bir seker pancari bitkisini gelistirmek için baslangiç maddesi olarak stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin kullanilmasinda basarili olmasi tamamen beklenmedik bir durumdur.

Ayrica, bulus sahipleri stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin bölünme kapasitesinin seker pancari genotiplerine oldukça bagli oldugunu bulmustur: genotiplerin çogunlugundan gelen stomatal koruyucu hücre protoplastlari çok düsük (neredeyse sifir) bölünme (büyüme) kapasitesi sergilerken, bazi spesifik genotiplerden gelen protoplastlarin in vitro büyümek için oldukça büyük bir kapasitesi vardir.

Bulus sahipleri, bu stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin oldukça büyük miktarlarinin oldugu kati ortam üzerindeki (polimer içeren ortam, mesela aljinat veya agaroz benzerini içeren ortam) kültürün, ardindan kültürlenmis maddenin (normalde rejenere edilmis kallus formundadir) ALS inhibitörleri gibi herbisitlere maruz birakilmasinin, eklenen mutajenler olmadan spontan mutasyonlarin çok nadir oldugu bilinmesine ve yöntemin bir veya daha fazla ALS inhibitörüne karsi istenen direnci sergileyen halihazirda var olan bir mutant bitkinin seçilmesinde bir popülasyon içerisindeki genetik çesitlilikten faydalanamamasina ragmen bu herbisit molekülüne karsi dirençli olan bazi mutasyona ugramis hücrelerin seçilmesi ile sonuçlandigini saptamistir.

ALS inhibisyonu gibi herbisitlere karsi direnç kazanmis olan mutasyona ugramis bu hücrelerin bazilari ayrica canli seker pancari bitkileri olarak rejenere olabilmistir.

Protoplastlarin pratikte kullanilmasi çok zor olmasina ragmen, mevcut bulus yine de herbisite karsi direnç kazanmis olan çok hizli sekilde stabil olan mutantlar vermistir.

Mevcut bulusun yöntemi, muhtemelen bu gende en az bir mutasyona ve/veya diger genlerdeki diger mutasyonlara ek olarak herbisitin, örnegin bir ALS inhibitörünün hedefi olan enzimde bir veya birkaç mutasyon (mesela ALS geninde bir mutasyon, burada ALS geni, Arabidopsis thaliana ALS”nin 574. pozisyonuna karsilik gelen ALS proteininin 569. pozisyonunda triptofandan farkli bir amino asit içeren bir ALS proteinini kodlamaktadir) dahil olmak üzere bir veya birkaç mutasyona sahip olan herbisitlere karsi dirençli (ALS inhibitörüne dirençli) seker pancari bitkilerinin üretilmesine olanak vermektedir.

Bu nedenle mevcut bulusun bir yönü, bir veya daha fazla ALS inhibitörüne karsi dirençli olan seker pancari bitkisinin (Beta vulgari's; dolayisiyla ayrica Beta vulgari's mari'tima ssp) üretilmesi için, asagidaki adimlari içeren bir yöntemdir: . (ALS inhibitörlerine karsi hassas) bir seker pancari bitkisinden izole edilen stomatal koruyucu hücrelerinin (bunlarin protoplastlarinin) elde edilmesi; . bu in vitro kültürlenmis hücrelere, bir veya daha fazla ALS inhibitörü içeren bir bilesimin bu in vitro kültürlenmis hücreler için ölümcül olan bir konsantrasyonda uygulanmasi ((yabani tip) hücrelerin en az %99'u ALS inhibitörü tarafindan öldürülmektedir, ancak bazi mutantlar islemden kaçabilmektedir) ve sag kalan hücrelerden seker pancari bitkilerinin rejenere edilmesi.

Bu yöntem, (örnegin WO 95/10178 sayili belgede açiklanan) bir transgenin takdimine bir alternatif olarak görülebilir. Ancak endojen genlerin mutasyonuna dayali olan bir yöntem transgenik yaklasima göre daha zahmetlidir. Aslinda, bir transgenik (mutasyona ugramis) genin takdimi çok daha hizli, esnek ve öngörülebilirdir.

Transgen ile uyarilmis direncin olmamasi, ALS inhibitörlerine karsi kazanilmis direncin, bir (yabanci) DNA'nin, örnegin ALS inhibitörlerinin toksisitesini lokal olarak azaltan bir protein (örn. ALS inhibitörlerini parçalayan veya intraselüler konsantrasyonunu azaltan bir enzim) veya ihhibitörlerin varliginda bile önemli aktivite ve fonksiyonelligi koruyan bir ALS mutant enzimi gibi ALS inhibitörlerine karsi dirençli bir ALS proteini gibi dogrudan ALS inhibitörlerine karsi direnç saglayan bir proteini kodlayan bir (yabanci) DNA'nin, stomatal koruyucu hücre protoplastlarina (veya bundan elde edilen hücrelere) in vitro insersiyonundan dogrudan kaynaklanmadigini belirtmektedir.

Ancak bulusun yöntemi ile elde edilen bitki ayrica bu soyda bir baska genetik özelligi toplamak için bir transgenik bitki ile melezlenebilir. Mevcut bulusla elde edilen bitki (veya bunun bir parçasi) ayrica (mevcut bulusun yönteminde elde edilen genetik özellikten farkli olan) bir baska genetik özelligi takdim etmek için müteakip bir transgenik yöntemde kullanilabilir.

Muhtemelen, bu yöntem ayrica izole edilmis stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin kültürüne bir mutajen ajani eklenmesi adimini içermektedir.

Uygun mutajen ajanlari fiziksel (mesela UV veya X-isini) maruziyeti veya kimyasal hatta %2.5,te) maruziyettir. Ancak, protoplast viyabilitesinin mesela %0.2,den fazla EMS ile islem gibi alisilagelmis sekilde gerçeklestirilen bazi mutajenez islemlerinden zararli bir biçimde etkilendigi gösterilmistir.

Alternatif olarak, bu yöntem bu nedenle bir mutajen ajan eklenmesi adimini içermemektedir.

Mevcut bulus baglaminda, bir herbisit tercihen, belirli bir dozda uygulandiginda yabani ot kontrolü için kullanilan herhangi bir molekülü belirtmektedir.

Mevcut yöntemde (bu herbisite karsi dirençli seker pancari bitkilerini gelistirmek için) kullanilan tercih edilen herbisitlerin bir peptitde spesifik bir bilinen aktivitesi vardir (böylece ilgili gendeki tek bir mutasyon bu herbisite karsi direnç kazandirabilmektedir).

Bir baska deyisle, tercih edilen herbisitler (çogunlukla spesifik biçimde bir bitki enziminin aktivitesini inhibe eden) bir peptit hedefi için spesifiktir ve/veya (hedef gendeki bir mutasyon için dirençli seker pancarini taramak için bir pozisyonda olmasi amaciyla) bunlarin hedef peptidi bilinmektedir.

Mevcut bulus baglaminda, bir ALS inhibitörü ALS geninin fonksiyonunu inhibe eden herhangi bir molekülü ifade etmektedir.

Tercihen, mevcut bulusta kullanilan ALS inhibitörleri ALS disindaki diger (seker pancari) enzimlerini (büyük ölçüde) inhibe etmemektedir.

Avantajli bir biçimde, ALS inhibitörleri yabani tip ALS enziminin fonksiyonunun fazlasinin) inhibe edildigi, ancak ilgili olmayan enzimlerin fonksiyonunun büyük ölçüde etkilenmedigi bir konsantrasyonda mevcut bulusta seçilmekte ve kullanilmaktadir.

(Bulusu gerçeklestirmek için) uygun ALS inhibitörleri sülfonilüre herbisitleri, sülfonilaminokarboniltriazolinon herbisitleri, imidazolinon herbisitleri, triazolopirimidin herbisitleri ve pirimidinil(tiyo)benzoat herbisitlerinden olusan gruptan seçilmektedir.

Avantajli bir biçimde, herbisit bilesimi en az bir sülfonilüre herbisiti ve en az bir triazolopirimidin içermektedir.

(Bulusu gerçeklestirmek için) tercih edilen ALS inhibitörleri foramsülfuron, amidosülfuron, tienkarbazon-metil, etoksisülfuron ve bunlarin karisimidir (özellikle tienkarbazon-metil ve ya foramsülfuron ya da amidosülfuron içeren bir bilesim); ancak, rejenere edilen seker pancari mutanti avantajli bir biçimde birkaç ALS inhibitörüne karsi dirençlidir.

(ALS inhibitörlerinin karisimlari dahil) diger ALS inhibitörleri kullanilabilir ve teknikte uzman kisi hangi mutasyonun belirli bir ALS inhibitörüne karsi güçlü direnç sagladigini bilir (örn. 569. pozisyonda triptofanin mutasyonunun foramsülfuron direnci ile iliskili oldugu bilinmektedir); dolayisiyla, mevcut yöntemin esnekligi ve verimliligi göz önünde bulunduruldugunda, teknikte uzman kisi birkaç mutasyon ve dolayisiyla ALS inhibitörlerine (örn. ALS inhibitörlerinin karisimlarina) karsi daha genis direnç kazanilmis olan seker pancari bitkilerini tasarlayabilir.

Daha tercihen, bu yöntem stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin tamamen fonksiyonel bir seker pancari bitkisine rejenere olma kapasitesi açisindan bir seker pancari bitki genotip (hatti) seçilmesi ön adimini içermektedir ve/veya mevcut bulusun yöntemi iyi rejenere olan seker pancari genotiplerinden (hatlarindan) izole edilen stomatal koruyucu hücre protoplastlari üzerinde gerçeklestirilmektedir.

(Stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin bir seker pancari bitkisi olarak rejenere olma yetenegi açisindan seker pancari bitki genotiplerinin seçilmesine iliskin) uygun bir ön adim, (farkli genotip geçmislerinden gelen) en az 10 farkli seker pancari bitki genotipinin, tercihen en az 15 farkli genotipin ve hatta en az 30 farkli genotipin, stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin bir seker pancari bitkisi olarak rejenere olma kapasitesi açisindan (çok daha tercihen in vitro büyüme ve/veya kallus olusturma kapasiteleri açisindan) karsilastirilmasini (verim veya parazitik enfeksiyonlara karsi direnç gibi olasi avantajli özelliklerinden bagimsiz olarak) ve mevcut bulusun yöntemini gerçeklestirmek için iyi rejenere olan bir genotipin (hattin) seçilmesini kapsamaktadir.

Mevcut bulus baglaminda, iyi rejenere olan stomatal koruyucu hücre protoplastlari, (büyüme:toplam) bölünme ve/veya büyüme ve/veya canli seker pancari kallusu olarak rejenere olma (uygun kültür ortaminda ve mevcut bulusun yönteminde uygulanacak toksik molekül/herbisit gibi ekzojen seleksiyon basinci olmadan büyütüldügünde) olasiligi olan protoplastlari belirtmektedir.

Kallus (kalluslar) farklilasmamis hücrelerin bir kitlesini ifade etmektedir. Teknikte kalluslar, embriyo gibi eksplantlardan ya da yaprak veya kotiledon kökenli parenkimden elde edilen eksplantlardan elde edilebilmektedir. Ancak, mevcut bulus baglaminda, kalluslar (iyi rejenere olan) stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin büyümesinin sonucudun Bu iyi rejenere olan protoplastlarla elde edilen kalluslarin %10'dan fazla (filiz veren kallus sayisi : toplam kallus sayisi; filizztoplam), tercihen %20'den fazla (filiz:toplam) ve hatta %30'dan fazla (filiz:toplam) filiz gelistirme kapasitesi vardir.

Tercihen, iyi rejenere olan seker pancari stomatal koruyucu hücre protoplastlari, fazla) olan canli seker pancari bitkisi olarak rejenere olma kapasitesine sahip protoplastlari ifade etmektedir.

Bu yöntemde herbisiti (örn. bir veya daha fazla ALS inhibitörü) içeren bilesim bu (iyi rejenere olan) seker pancari stomatal hücre protoplastlarinin 20 000 OOO'dan daha fazlasinin in vitro kültürüne uygulanmaktadir.

Tercihen, (bir veya daha fazla) ALS inhibitörünü içeren bilesim bu (iyi rejenere olan) seker pancari stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin 50 000 OOO'undan daha fazlasinin in vitro kültürüne uygulanmaktadir. stomatal koruyucu hücre protoplastlari, polimer içeren ortam (mesela aijinat veya agaroz içeren ortam) üzerinde büyütülmüstür.

Muhtemelen, bu (iyi rejenere olan) seker pancari stomatal koruyucu hücre protoplastlari, (bir veya daha fazla) ALS inhibitörünü (mesela foramsülfuron ve muhtemelen tienkarbazon-metil) içeren bilesimin uygulanmasindan önce polimer (aljinat) içeren ortamda en az yaklasik 1 hafta (tercihen yaklasik 3 hafta ve/veya 4 haftadan az) büyütülmektedir.

Tercihen, bu yöntem ayrica mutasyona ugramis stomatal koruyucu hücresinin büyümesinin ve yabani tip stomatal koruyucu hücresinin (ve/veya saf ve/veya henüz herbisitle islem görmemis) ALS inhibitörü içermeyen bir ortamda büyümesinin karsilastirilmasi ve muhtemelen ilgili yabani tip hücrenin en az %75 büyümesini, tercihen en az %90 büyümesini koruyan mutantlarin seçilmesi adimini içermektedir.

Tercihen veya ilaveten, bu yöntem ayrica mutasyona ugramis hücreden rejenere edilmis seker pancarinin büyümesinin ve/veya veriminin ve yabani tip (ve/veya saf vei'veya henüz ALS inhibitörü ile islem görmemis) seker pancarinin sera testlerinde ve herhangi bir ALS inhibitörü olmadan agronomik kosullarda büyümesinin karsilastirilmasi ve muhtemelen yabani tip seker pancarinin en az %75 büyümesini ve/veya verimini, tercihen en az %90 büyümesini ve/veya verimini koruyan ALS inhibitörüne dirençli mutant(lar) olan seker pancari bitkilerinin seçilmesi adimini içermektedir.

Tercihen, bu yöntem ayrica sag kalan protoplastlardan rejenere edilmis bitkilerin sekanslanmasi ve/veya herbisite (örn. bir veya daha fazla ALS inhibitörüne) karsi dirençle iliskili olan (olabilen) bir veya birkaç mutasyonun tanimlanmasi adimini içermektedir.

Mevcut bulus baglaminda, “mutasyon” terimi tercihen, elde edilen bitkinin ALS inhibitörleri gibi herbisitlere karsi bir direnç kazanmis olacagi sekilde ilgili amino asitte bir degisikligine neden olan, herbisitin (örn. ALS proteininin) hedefledigi peptidi kodlayan nükleotid sekansindaki bir (tek bir) degisikligi ifade etmektedir.

Bir baska deyisle, mevcut bulus baglaminda, “mutasyon” tercihen herbisite (ALS inhibitörüne) karsi bir dirence olanak veren “nokta mutasyonuna” esdeger olarak anlasilmaktadir. Bu dogrultuda, “birkaç mutasyon” tercihen, mevcut bulusta bir (yigin) çoklu nokta mutasyonunu ifade etmekte olup, her bir nokta mutasyonu bir herbisite (örn. bir ALS inhibitörüne ve/veya ALS inhibitörü olmayan bir herbisite) bir direnç saglamak üzere kodlanmis amino asitte bir degisiklige neden olmaktadir. Bu nedenle, tercihen, mevcut bulus baglaminda “mutasyon”, nükleotid sekansinda kodlanmis proteini modifiye etmeyen bir degisikligi (mesela kodlama üçlüsünün üçüncü amino asidindeki bir degisikligi), herbisit (mesela ALS inhibitörü) direnci ile iliskili olmayan amino asitlerdeki bir degisikligi ve nükleotid sekansindaki çoklu eszamanli degisiklikleri içermemektedir.

Avantajli bir biçimde, (bir veya daha fazla) ALS inhibitörüne karsi dirençle iliskili mutasyonlarin (tercihen ALS genindeki bir veya iki mutasyonun) tanimlanmasi adimi bu mutasyonu kapsayan oligonükleotid primerlerinin gelistirilmesi ile baglantilidir.

Avantajli bir biçimde, bu ALS genindeki mutasyonlari tanimlama adimini, yabani tip ve mutasyona ugramis ALS genlerinin kodladigi proteinin (in vitro) enzimatik aktivite ölçümleri takip etmektedir.

Tercihen, yabani tip ALS enziminin ve mutasyona ugramis ALS enziminin bu enzimatik ölçümleri bir veya daha fazla ALS inhibitörü varliginda (bir inhibisyon egrisini elde etmek için bir veya birkaç konsantrasyonda) gerçeklestirilmektedir.

Muhtemelen, yabani tip enzimin ve mutasyona ugramis enzimin bu enzimatik ölçümü (ayrica) ALS inhibitörü olmadan gerçeklestirilmektedir (mutasyona ugramis enzimin enzimatik aktivitesini karsilastirmak için; tercihen ALS inhibitörü olmadan, mutasyona ugramis enzim yabani tip enzimin aktivitesinin en az %50'sini, daha tercihen en az korumaktadir).

Tercihen, mevcut bulusun yöntemi farkli konsantrasyonlarda bir veya daha fazla ALS inhibitörü içeren bilesimlerin karsilastirilmasi ve ALS inhibitörünün ve/veya bu bilesim içerisinde özel bir formülasyondaki ALS inhibitörünün seker pancari bitkisinden izole edilen stomatal koruyucu hücre protoplastinin (mesela en az bir hafta süreyle aljinat üzerinde büyütülen stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin) in vitro kültürü için ölümcül oldugu konsantrasyonun çikarimda bulunulmasini adimini içermektedir. Örnegin, (bir veya daha fazla) ALS inhibitörünün seker pancari bitkisinden izole edilen stomatal koruyucu hücre protoplasti için ölümcül oldugu konsantrasyonun çikarimda bulunulmasi adimi, yabani tip seker pancari bitkisinden (ve/veya saf ve/veya henüz ALS inhibitörü ile islem görmemis) izole edilen stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin in vitro kültüründe gerçeklestirilmektedir.

Mevcut bulus baglaminda, (bir veya daha fazla) ALS inhibitörü içeren bilesimin ölümcül konsantrasyonu, kültürlenmis hücrelerin en az %99'unu, tercihen en az %99.9,unu, daha tercihen en az %99.99tunu öldürmek için yeterli olan (yine de bazi mutantlarin bu islemden kaçmasina olanak veren) bir konsantrasyonu ifade etmektedir.

Alternatif olarak veya ilaveten, bu (bir veya daha fazla) ALS inhibitörünün seker pancari bitkisinden izole edilen stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin in vitro kültürü için ölümcül olan konsantrasyonun çikarimda bulunulmasi adimi (ayrica) mutasyona ugramis stomatal koruyucu hücrelerin in vitro kültüründe (ALS geninde bir mutasyon kazanmis olan ve ALS inhibitörlerine karsi dirençli olan hücrelerde) gerçeklestirilmektedir.

ALS inhibitörünün ölümcül konsantrasyonunun (bu ALS inhibitörünü içeren bir bilesimde) saf ve mutasyona ugramis hücreler üzerinde karsilastirmasi avantajli bir biçimde bir oran olarak (veya test edilen ALS inhibitörü basina bir oran olmak üzere birkaç oran olarak) ifade edilmistir.

Tercihen, bir ALS inhibitörü için, saf hücrelerde ölümcül konsantrasyon mutasyona ugramamis hücrelere göre 50 kat daha düsüktür, daha tercihen saf hücrelerde ölümcül konsantrasyon mutasyona ugramis hücrelere göre 200 kat daha düsüktür, yine daha tercihen saf hücrelerde ölümcül konsantrasyon mutasyona ugramis hücrelere göre 1000 kat daha düsüktür.

(Mevcut bulusun yönteminde kullanilan) herbisit, foramsülfuron gibi en az bir ALS inhibitörü içeren (inhibitörlerin) bir karisim olabilir.

Muhtemelen, bulusun yönteminde kullanilan ALS inhibitörü sülfonilüre (örn. foramsülfuron) ve iyodosülfuron, amidosülfuron ve tienkarbazon-metilden olusan gruptan seçilen bir baska ALS inhibitörü gibi ALS inhibitörlerinin bir karisimidir.

Tercihen, bulusun yönteminde kullanilan ALS inhibitörü, foramsülfurondur (veya bunu içermektedir), örnegin aljinat içeren bir ortamda protoplastlarin bir haftalik (veya üç haftalik) in vitro kültürüne (daha tercihen bu kültürlenmis protoplastlardan rejenere konsantrasyonda hücrelerin in vitro kültürü sirasinda muhafaza edilen foramsülfurondur (veya bunu içermektedir).

Mevcut bulusun ilgili bir yönü, (örnegin bu yöntem bir veya daha fazla herbisit (ALS inhibitörü degil) kullanimini veya bir veya daha fazla ALS inhibitörünün kullanimini içerdiginde ya da bir ALS inhibitörünün ve bir ALS inhibitörü olmayan bir herbisitin kullanimini içerdiginde) bu yöntemle elde edilebilen mutasyona ugramis bir seker pancari bitkisidir.

Fenilalanin 573, Serin 648 ve Glisin 649'den olusan gruptan seçilen amino asitleri kodlayan pozisyonlarda ALS geninde bir veya birkaç mutasyona sahip (mevcut bulusun yöntemi ile elde edilebilen) bir seker pancaridir.

Tercih edilen (mevcut bulusun yöntemi ile elde edilebilen) seker pancari Alanin 113 (örn. Valin veya Treonin olarak mutasyona ugramistir), Treonin, Arjinin, Lösin, Glutamin veya Alanin olarak mutasyona ugramis olan Prolin 188, Alanin 196 (örn. Valin olarak mutasyona ugramistir), Aspartat 371 (örn. Glutamat olarak mutasyona ugramistir), Arjinin 372 (örn. Histidin olarak mutasyona ugramistir), Glisin olarak mutasyona ugramis Triptofan 569, Serin 648 (örn. Treonin olarak mutasyona ugramistir) ve Glisin 649'dan (örn. ASpartat olarak mutasyona ugramistir) olusan gruptan seçilen amino asitleri kodlayan pozisyonlarda ALS geninde bir veya birkaç mutasyona sahiptir.

Mevcut bulusun ilgili bir yönü, ALS geninde, kodlanmis ALS enziminde 569. pozisyondaki (Arabidopsis thaliana ALS enziminde 574. pozisyona karsilik gelmektedir) triptofanin bir baska amino asitle (örnegin lösin) sübstitüe edildigi bir mutasyonu ve muhtemelen bir baska (bir veya birkaç) mutasyonu, tercihen ALS geninde bir baska (bir veya birkaç) mutasyonu, örnegin ALS geninde bir baska amino asit sübstitüsyonuna neden olan bir mutasyonu içeren mutasyona ugramis bir seker pancaridir (veya seker pancarindan izole edilmis bir mutasyona ugramis stomatal koruyucu hücre gibi bir mutasyona ugramis seker pancari bitki hücresidir).

Bir baska tercih edilen seker pancari bitkisi 569. pozisyonda Triptofanin Lösin olarak bir 648 ve Glisin 649'dan olusan gruptan seçilen amino asitleri kodlayan pozisyonlarda ALS geninde bir veya birkaç mutasyona sahiptir.

Tercih edilen (mevcut bulusun yöntemi ile elde edilebilen) bir seker pancari 569. pozisyonda Triptofanin Lösin olarak bir mutasyonuna ve Alanin 113 (örn. Valin veya Treonin olarak mutasyona ugramistir), Treonin, Arjinin, Lösin, Glutamin veya Alanin olarak mutasyona ugramis olan Prolin 188, Alanin 196 (örn. Valin olarak mutasyona ugramistir), Aspartat 371 (örn. Glutamat olarak mutasyona ugramistir), Arjinin 372 (örn.

Histidin olarak mutasyona ugramistir), Serin 648 (örn. Treonin olarak mutasyona ugramistir) ve Glisin 649'dan (örn. Aspartat olarak mutasyona ugramistir) olusan gruptan seçilen amino asitleri kodlayan pozisyonlarda ALS geninde bir veya birkaç mutasyona sahiptir.

Bu mutasyona ugramis seker pancari bitkisi sülfonilüre (öm. foramsülfuron) gibi bir veya birkaç ALS inhibitörüne ve avantajli bir biçimde tercihen iyodosülfuron, amidosülfuron ve tienkarbazon-metilden olusan gruptan seçilen diger ALS inhibitörlerine karsi dirençlidir.

Mevcut bulusun ilgili bir yönü, ALS geninde, kodlanmis ALS enziminde 188. pozisyondaki prolinin (Arabi'dopsi's thali'ana ALS enziminde 197. pozisyona karsilik gelmektedir) bir baska amino asitle (mesela serin) sübstitüe edildigi bir mutasyonu içeren bir mutasyona ugramis seker pancari bitkisidir (veya seker pancarindan izole edilen mutasyona ugramis bir stomatal koruyucu hücre gibi bir mutasyona ugramis seker pancari bitki hücresidir).

Alternatif olarak, (mevcut bulusun yöntemi ile elde edilebilen) tercih edilen bir seker pancari bitkisi 188. pozisyonda Prolinin Serin olarak bir mutasyonuna ve Glisin 112, olusan gruptan seçilen amino asitleri kodlayan pozisyonlarda ALS geninde bir veya birkaç mutasyona sahiptir.

Tercih edilen bir seker pancari bitkisi (mevcut bulusun yöntemi ile elde edilebilir) ALS geninde 188. pozisyonda Prolinin Serin olarak bir mutasyonuna ve ALS geninde Alanin 113'ün (örn. Valin veya Treonin olarak mutasyona ugramistir), Aspartat 371 (örn.

Glutamat olarak mutasyona ugramistir), Arjinin 372 (örn. Histidin olarak mutasyona ugramistir), Glisin olarak mutasyona ugramis Triptofan 569, Serin 648 (örn. Treonin olarak mutasyona ugramistir) ve Glisin 649iu (örn. Aspartat olarak mutasyona ugramistir) kodlayan pozisyonlarda bir veya birkaç mutasyona sahiptir.

Mevcut bulusun bir baska ilgili yönü, ALS enziminde 569. pozisyonda triptofanin bir mutasyonunu ve ALS enziminde 188. pozisyondaki profilin bir mutasyonunun yani sira muhtemelen bir baska (bir veya birkaç) mutasyonu, tercihen ALS geninde bir baska (bir veya birkaç) mutasyonu içeren mutasyona ugramis bir seker pancari bitkidir (veya seker pancarindan izole edilen mutasyona ugramis bir stomatal koruyucu hücre gibi mutasyona ugramis bir seker pancari bitki hücresidir).

Tercihen, bu mutasyona ugramis seker pancari bitkisinin ALS geni (bunun bir alleli) SEKANS TANIM No:3 veya SEKANS TANIM NO:5”e karsilik gelmektedir.

Avantajli bir biçimde, mevcut bulusun mutasyona ugramis seker pancari bitkisi SEKANS TANIM No:3 (bir allelde) ve SEKANS TANIM NO:5'i (ikinci allelde) içermektedir.

Muhtemelen, mevcut bulusun mutasyona ugramis seker pancari bitkisi SEKANS TANIM NO:3'ü (bir allelde) ve ya SEKANS TANIM No:1 ya da SEKANS TANIM NO:7'yi (ikinci allelde) içermektedir.

Mevcut bulusun bir baska ilgili yönü, bir veya daha fazla mutasyonu kapsayan bir nükleotid fragmanidir (en az 20 veya en az 25 ardisik nükleotidden, ancak 200'den az ardisik nükleotidden, tercihen 50'den az ardisik nükleotidden 0lusmaktadir); muhtemelen bu fragman, bir primer veya prob olarak kullanima yöneliktir (örnegin nükleotidik olmayan bir parça ile ya da radyoaktivite kullanilarak ya da seker pancarinin ALS genine yabanci olan bir nükleik asit sekansi ile etiketlenmis bir probla ayrica etiketlenmis bir nükleotid prob içermektedir).

Mevcut açiklamanin bir baska ilgili yönü, toksik moleküle (herbisit) karsi direnci olan seker pancari bitkilerinin marker destekli seçimine yönelik mutasyonu kapsayan bu nükleotid fragmaninin kullanimidir. Örnekler Karsilastirmali örnek ALS herbisitinin yabani tip seker pancari eksplantlari olan kalluslara eklenmesi sonrasinda mutasyona ugramis seker pancari alanda basarili bir sekilde üretildiginden elde edilen seker pancari genotipini (hattini) seçmis ve bunlarin stomatal koruyucu hücrelerinden protoplastlari izole etmistir.

Bu protoplastlarin birkaç milyonu (deneysel olarak ortalama yaklasik 2 ila yaklasik 5 milyon ve 11 milyona kadar; toplamda ALS herbisiti yaklasik 150 milyon protoplasta uygulanmistir) WO 95/10178 sayili belgedeki gibi izole edilmis, aljinat içeren kültür ortamina yerlestirilmis ve 10'9 ila 10'6 mol/l foramsülfuron içeren MS kültür ortami ile islemden geçirilmistir.

Bulus sahipleri daha sonra, WO 95/10178 sayili belgede açiklanan protokolü izleyerek seker pancarini rejenere etmis ve yalnizca birkaç kallusun ALS inhibitörü karsisinda sag kaldigini gözlemlemistir. Ancak, bir istisna olarak, bu rejenere edilmis kalluslarin hiçbiri seker pancari bitkisi olarak gelisememistir. Rejenere edilen tek seker pancari bitkisi ALS geninde (foramsülfuron hedef enzimini kodlayan) mutasyon göstermemistir.

Bu nedenle, parental hattinin, (bir eksplant kökenli) kalluslarin bir herbisite dogrudan maruz birakilmasi temelinde, bu herbisite karsi mutasyondan kaynakli direnç kazandigi gösterilmis olan bu seker pancari hatti, bu yöntem stomatal koruyucu hücre protoplastlarini kapsadigi zaman ayni amaç için faydali olmamistir. Örnek 1 Iyi rejenere olan protoplastlar için seker pancari genotiplerinin (hatlarinin) seçilmesi Bulus sahipleri daha sonra, stomatal koruyucu hücre protoplastlarindan rejenerasyon kapasiteleri bakimindan birkaç seker pancari bitki genotipini karsilastirmistir.

Bulus sahipleri, yaklasik %001 (ve hatta daha az) rejenere olma kapasitesine sahip genotipler ve %0.1 'den fazla rejenere olma kapasitesine sahip birkaç genotip bulmustur.

Bulus sahipleri ayrica, protoplastlarin büyümesi (bunlarin büyüme ve in vitro bölünme kapasiteleri), filiz olusturmak üzere kalluslarin büyüme kapasitesi ve bir bitkiyi rejenere etmek üzere büyüyen kalluslarin orani arasinda bir ayrim olusturmustur.

Tablo 1: bazi seker pancari genotiplerinin karsilastirilmasi Genotip protoplastlarlgram Büyüyen Filiz Elde edilen hücrelerin olusturma bitkilerin yüzdesi yüzdesi yüzdesi Bir bütün olarak alindiginda stomatal koruyucu hücre protoplastinin tam bir seker pancari bitkisi olarak rejenere olma kapasitesini yansitan degerler “Rel1” hücre hatti için daha yüksek olmasina ragmen, bu hücre hattinin mevcut bulusun yürütülmesi için yeter ölçüde faydali olmadigi düsünülmüstür.

Bulus sahipleri ayrica "büyüyen hücre yüzdesi” parametresinin mevcut bulusu yürütmek için diger parametrelerden çok daha önemli oldugu sonucuna varmistir.

Bulus sahipleri in vitro büyüyebilen stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin Örnek 2 Protoplastlarin herbisit islemi Bulus sahipleri karsilastirmali Örnek'teki ile ayni yaklasimi uygulamis, ancak iyi büyüyen stomatal koruyucu hücre protoplastlarini temel almistir (örnegin Örnek 1'de büyüyen stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin yüksek bir oranina sahip diger seker pancari bitkileri de kullanilabilir).

Toplamda, yaklasik 68 milyon iyi büyüyen stomatal koruyucu hücre protoplasti 10'6M'ye kadar foramsülfuron içeren bir ALS herbisit bilesimi ile islemden geçirilmistir.

Bulus sahipleri 46 kallus elde etmistir.

Birkaç rejenere edilmis bitki hedef gen olan ALS geninde bir mutasyon göstermektedir: her durumda 569. pozisyonda triptofana yönelik kodonda bir mutasyon (W569L; Arabio'opsis thaiiana'da 574. pozisyondaki triptofana karsilik gelmektedir). Bu mutantin ALS genlerindeki iki alIeI SEKANS TANlM No:3 ve SEKANS TANlM No:7 ile kodlanmaktadir. Diger büyüyen kalluslar sekanslanmistir ve ALS geninde mutasyonlara sahiptir (diger pozisyonlarda mutasyonlar da dahil) ancak bitki olarak rejenere olamamistir.

Bulus sahipleri böylece mevcut bulusun yönteminin, özellikle bu yöntem yabanci DNA kullanimini kapsamadigi ve/veya genetik elemanlari kodlayan DNA vektörlerinin takdiminin ALS inhibitörlerine karsi direnç kazandirdiginin zaten bilindigi ve yalnizca birkaç ay içinde pozitif sonuçlar verdigi için bir herbisite karsi dirence neden olan gelistirilmis mutasyonlari olan bitkiler gelistirmek için çok faydali oldugu sonucuna varmistir.

Bulus sahipleri daha sonra bu yöntemi tekrarlamis ve mutasyonlarin sayisini artirmak için protoplastlara bir mutajen (% uygulamistir. Örnek 3 Seker pancarlarinin ALS inhibitör islemi Bulus sahipleri. mutasyona ugramis SEKANS TANIM NO:3'e (bu mutasyon için heterozigot) ve yabani tip (saf) seker pancari ticari türüne sahip rejenere seker pancarlarinin davranisini karsilastirmistir.

(Heterozigot) mutasyona ugramis tür, etkisini güçlendirmek için herbisit bir organik bilesikle (25 g/sa kolza tohumu metil ester) birlestirildiginde dahi Foramsülfurona (12.5 g/sa; 3 uygulamaya kadar) iyi direnç göstermistir.

Beklendigi gibi, yabani tip (saf) bitki birinci uygulamadan sonra dahi Foramsülfurona karsi çok hassas olmustur.

Ayni deney amidosülfuron (15 g Isa) kullanilarak gerçeklestirilmis ve mutasyona ugramis bitkilerde ayni direnç seviyesini vermistir.

Diger taraftan, yabani tip (saf) bitkiler özellikle organik bilesikle birlestirildiginde ve/veya birkaç amidosülfuron uygulamasindan sonra amidosülfurona karsi çok hassas olmustur.

Ayni deney iyodosülfuron (3.5 g/sa) kullanilarak gerçeklestirilmis ve iyodosülfuron eklendiginde mutasyona ugramis bitkilerde iyi bir direnç seviyesi göstermistir, ancak bu direnç iyodosülfuron organik bilesikle birlikte uygulandiginda azalmistir.

Beklendigi gibi, yabani tip (saf) bitki bir uygulamadan sonra dahi ve organik bilesik olmadan iyodosülfurona karsi çok hassas olmustur.

Ayni deney 7.5 g/sa tienkarbazon-metil kullanilarak gerçeklestirilmis ve mutasyona ugramis bitkilerde iyodosülfuron için olanla yaklasik ayni direnç seviyesini vermistir.

Yabani tip (saf) bitki test edilen konsantrasyonlarda ve organik bilesik eklemesine bakilmaksizin tienkarbazon-metile karsi çok hassas olmustur.

Bulus sahipleri, yabani tiple karsilastirma yoluyla, SEKANS TANlM NO:3'ü (Budapeste Anlasmasi NCIMB 42051 kapsaminda saklanmistir) içeren mutasyona ugramis seker pancari bitkisinin foramsülfurona karsi en iyi direnci sundugu sonucuna varmistir.

Bulus sahipleri ayrica, bu (heterozigot) mutasyona ugramis bitkinin ayrica diger kimyasal siniflara ait olan inhibitörlere karsi direnç dahil olmak üzere diger ALS inhibitörlerine karsi (kismen olsa da) biraz direnç kazanmis oldugu sonucuna varmistir. Örnek 4 ALS geninde diger mutasyonlara sahip seker pancarlarinin ALS inhibitör Bulus sahipleri daha sonra SEKANS TANlM No:3 ve SEKANS TANIM NO:5'i (iki farkli allelde) içeren mutasyona ugramis bir seker pancari bitkisi gelistirmistir. Ortaya çikan bu ikili mutant Budapeste Anlasmasi kapsaminda NClMB 42050 altinda saklanmistir. Hem SEKANS TANlM No:3 hem de SEKANS TANlM NO:5'i içeren bir bitki örnegin tek mutant NCIMB 42051'e uygulanan bir müteakip mutajenez adimini içeren birkaç teknige dayali olarak üretilebilmektedir.

Bulus sahipleri daha sonra bu ikili mutant bitkinin (amino asit 569'da bir allelde bir mutasyon ve amino asit 188'de diger allelde bir mutasyon) direncini tekli mutant (569. pozisyonda bir mutasyon) seker pancari ile karsilastirmistir.

Ikili mutant bitki hatti en azindan, Örnek 3'teki direnç özelliklerinin tümünü korumustur ve ayrica organik bilesiklerle bilesim haline getirildiginde bile tienkarbazon-metile karsi ve amidosülfuron islemlerine karsi iyi bir direnç (tarla uygulamasi ile uyumlu) kazanmistir.

Bu nedenle, bu ikili mutant bitki tekli mutant bitkisine (ALS geninde 569. pozisyonda) atfedilen dirençle kiyaslandiginda birkaç ALS inhibitörüne karsi gelistirilmis, sinerjik direnç göstermektedir. Örnek 5 Sera çalismalari: Dogrudan karsilastirmada farkli seker pancarlarinin ALS inhibitör islemi Mevcut bulusa göre (yukarida Örnek 4'te açiklandigi gibi, “Hat A”) SEKANS TANIM No:3 ve SEKANS TANIM NO:5'i (iki farkli allelde) içeren mutasyona ugramis seker pancari bitkileri, kodlanmis ALS enzimindeki 569. pozisyonunda triptofanin bir lösinle sübstitüe edildigi seker pancari bitkileri (“Hat B"), kodlanmis ALS enzimindeki 188. pozisyondaki prolinin bir serinle sübstitüe edildigi WO 98/02527”de açiklanan seker pancari bitkileri (“Hat C”) ve 569 ve 188 pozisyonlarda bir mutasyona sahip olmayan geleneksel tür (yabani tip) seker pancari bitkileri (“Hat WT") ile dogrudan karsilastirmada farkli ALS inhibitörleri ile islemden geçirilmistir.

Bahsedilmis olan dört farkli seker pancari bitkisinin tohumlarinin birkaç grubu serada ayri ayri dikilmistir ve monographie "Entwicklungsstadien mono- und dikotyler Pflanzen", 2nd edition, 2001, ed. Uwe Meier, Biologische Bundesanstalt für Land und Forstwirtschaft kaynagina göre Beta vulgari's L. ssp. Vulgaris (örn. 4 yaprak (ikinci çift) katlanmamis) için BBCH 14 evresine kadar büyütülmüstür. Akabinde, seker pancari bitkilerinin elde edilen ayri gruplarinin her biri tek tek Tablo 2'de belirtilen miktarlarda (g/sa) bir ALS inhibitörü (ALS-in) ile islemden geçirilmistir.

Ilgili ALS inhibitörünün uygulanmasindan 14 gün sonra, her seker pancari bitkisi için hasar (yani fitotoksisite) %0 (yani hasar yok, fitotoksisite yok) ila %100 (yani bitkiler tamamen ölmüstür) skalasinda puanlanmistir. puanlama Tablo 2'de gösterilmistir.

Foramsülfu ron Iyodosülfuron-metil-Na Amidosülfuron Tienkarbazon-metil Bisbyribac-Na Metosulam ALS-in g/sa Hat A Bitkilerin her grubu için ortalama ilaveten, her seker pancari bitkisi için tipik erken fenotip tienkarbazon-metil ve foramsülfuron içeren bir karisimla islemden geçirildikten sonra incelenmistir. Her Hat için temsili bir erken fenotip Sekil 1'de gösterilmistir (Sekil 1).

Sekil 1 ayrica, mevcut bulusa göre seker pancari bitkilerinin (“Hat A") gelistirilmis ALS inhibitör direnci gösterdigini ortaya koymaktadir, yani diger erken fenotiplere kiyasla üstün büyüme ve daha az fitotoksisite etkileri gözlemlenmistir. Örnek 6 Tarla çalismalari: Dogrudan karsilastirmada farkli seker pancarlarinin ALS inhibitör islemi Tablo 3: ALS inhibitörlerinin seker pancari bitkisine etkisi. Degerler, ölçülen hasarin ortalama yüzdesini temsil etmektedir.

ISLEMDEN GEÇIRILMEMIS 2Sg/HA (Foramsülfuron) (Tienkarbazon) (iyodosülfuron) (mesosülfuron) HOESTAR 30g/Ha (amidosülfuron) (etoksisülfuron) RAPTOR 40 g/Ha (imazamoks) TACCO SOg/Ha (metosulam) NOMINEE 50g/Ha (bispyribac) MOTlVELL 60 g/Ha (nikosülfuron) CROPPER SX 8 g/Ha (metosülfuron) 574 ve 574 197 homo LEXUS 50 DF10g/Ha 70 (flupirsülfuron) ATTRIBUT 70 g/Ha 91 (propoksikarabazon) SlMPLlClTY 509/Ha (pirksisulam) 97 PRlMUS 10 nga (florasulam) 99 POlNTER SX 309/Ha (tribenuron) 98 CATO 13 g/Ha (rimsülfuron) 68 MONITOR 80 WG 109/Ha 93 (sülfosülfuron) DEBUT YX115 g/Ha 0 (triflusülfuron) EVEREST 40g/Ha (flukarbazon) 93 HARMONY 7.5 nga (tiensülfuron) 98 574 ve 574 197 homo Bulus sahipleri, ticari bilesimleri yabani otlarin yok edilmesine olanak veren dozda test etmistir.

Hassas kontrol (yani ALS geninde mutasyonu olmayan seker pancari) biri hariç tüm herbisitler tarafindan öldürülmüstür. Bulus sahipleri kontrol (islem görmemis) bitkisine az hasar ölçmüs olup, bu bazi durumlarda %35'e ve hatta %40'a varmaktadir. Bu Diger taraftan, 569. pozisyonda (574) heterozigot olan seker pancari bitkisi birkaç herbisit bilesimine karsi kismen dirençli hale gelmistir. Her iki allelde 569 mutasyonunu (574) içeren ve dolayisiyla (569/569) homozigot olan bitki daha da artirilmis bir dirence sahiptir: yalnizca 7 herbisit bilesimi orta derecede toksiktir (%5'ten %35'e kadar).

ALS geninin bir allelinde 569. (574) pozisyonda mutasyonu ve ALS geninin ikinci allelinde 188. (197) pozisyonda bir mutasyonu içeren bir seker pancari bitkisi de gelistirilmis direnç kazanmistir, çünkü 9 herbisit bilesimi orta derecede toksiktir ve yalnizca 3'ü oldukça toksiktir. Sasirtici bir biçimde, ALS inhibitörüne karsi güçlü direnç (569) saglayan bir mutasyonun kayboldugu ve yalnizca zayif direnç (188) saglayan bir mutasyonun eklendigi böyle bir bitki bu tarla testinin 3 farkli kosulunda homozigot (5691569) bitkiye göre daha da iyi direnç saglamaktadir.

Bilgisayar Çiktisi (Elektronik Form olarak Orijinal) (Bu belge uluslararasi basvuru belgesinin bir parçasi degildir ve uluslararasi basvuru belgesi olarak sayilmamaktadir) 0-1 Saklanan Mikroorganizma(lar) veya Diger Biyolojik Madde ile ilgili Form PCT/ROM 34 (SAFE) Bildirimleri (PCT Yönetmeligi mükerrer M. 13) 0-1-1 Sunlarla hazirlanmistir PCT Çevrimiçi Basvuru Versiyon 35.000.235 MTIFOP 1-3-1 1-3-2 1-3-3 1-3-4 Uluslararasi Basvuru No. dosya referansi Asagidaki bildirimler, saklanan mikroorganizma(lar) veya tarifnamede asagidaki yerlerde anilan diger biyolojik maddeler ile Paragraf numarasi Saklanan ürünün tanimlamasi Saklayan kurumun adi Saklayan kurumun adresi Saklama tarihi Erisim Numarasi Ek Bildirimler Bildirimlerin Yapildigi Tanimlanan BPSESSOO1OPC NCIMBNCIMB Ltd.

Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, Birlesik Krallik Tüm tanimlamalar 2-3-1 2-3-2 2-3-3 2-3-4 SADECE KABUL OFISI KULLANIMI IÇINDIR 0-4 Bu form, uluslararasi Asagidaki bildirimler, saklanan mikroorganizma(lar) tarifnamede asagidaki yerlerde anilan diger biyolojik maddeler ile Paragraf numarasi Saklanan ürünün tanimlamasi Saklayan kurumun adi Saklayan kurumun adresi Saklama tarihi Erisim Numarasi Ek Bildirimler NCIMBNCIMB Ltd.

Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, Birlesik Krallik Bildirimlerin Yapildigi Tanimlanan Tüm tanimlamalar alinmistir: (evet veya hayir) basvuru ile birlikte 0-4- Yetkili memur lsabelle 1 Aoustin YALNIZCA ULUSLARARASI OFISIN KULLANIMI IÇINDIR 0-5 Bu form, uluslararasi Ofis tarafindan alinmistir: 0-5-1 Yetkili memur SEKANS LISTESI <110> SES <130> SESSOO1O <160> 8 <170> Patentln version 3.5 <210>1 <211> 1995 <212> DNA <213> Beta vulgaris <220> <221> CDS <222>(1yr1995) <223> 4D6834 WT all <400> 1 <210>2 <211>664 <212> PRT <213> Beta vulgaris <400> 2 (3111 1.311 371:- (3111 <210> 3 <211> 1995 <212> DNA <213> Beta vulgaris <220> <221› misc_feature <222> (1)..(1994) A511. <220> <221> CDS <222>(1y41995) <400> 3 <210>4 <211> 664 <212> PRT <213> Beta vulgaris <400> 4 Met Aia Ala Thr Phe Thr Asn Pro Thr ?ne Ser Pro Ser Ser Thr Pro Leu Thr Lya Thr Leu Lys Ser Gln Ser Ser Ile Ser Ser Thr Leu Pro <210> 5 <211> 1995 <212> DNA <213> Beta vulgaris <220> <221 misc_feature <222> (1)..(1994) <223> Pro Mutant <220> <221CDS <222>(1y41995) <400> 5 13519 <210>6 <211>664 <212> PRT <213> Beta vulgaris <400> 6 Arg Vai Ser Asn Vai Ala Asp Leu Azg Ala Ala Iie 610 615 Asp Thr Pro Giy Pro Tyr Lou Lou Asp Va] Ile Val 625 630 His Val Leu Pro Met :Je Pro Ser Gly Ala Gly Phe 645 650 Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Ser <210> 7 <211> 1995 <212> DNA <213> Beta vulgaris <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1994) <223> 4D6834 al2 WT <220> <221> CDS <222> (1)..(1995) <400> 7

Claims (13)

ISTEMLER

1. Asetohidroksiasit sentaz enziminin (ALS) bir veya daha fazla inhibitörüne karsi dirençli olan bir mutant seker pancari bitkisinin üretilmesi için bir yöntem olup, asagidaki adimlari içermektedir: - bir seker pancari bitkisinden izole edilen stomatal koruyucu hücrelerinden - söz konusu protoplastlarin in vitro kültürüne, bir veya daha fazla ALS inhibitörünü in vitro kültürlenmis hücrelerin %99'undan fazlasi için ölümcül olan bir konsantrasyonda içeren bir bilesim uygulanmasi ve - söz konusu in vitro kültürlenmis hücrelerin sag kalan hücrelerinden seker pancari bitkilerinin rejenere edilmesi, burada söz konusu stomatal koruyucu hücre protoplastlari bir seker pancari bitkisi olarak rejenere olma kapasitelerine göre önceden seçilmekte olup, burada söz konusu önceden seçilmis protoplastlarin %10'dan fazla olan (büyüyen protoplastlarin sayisi:kültüre koyulan toplam protoplast sayisi) bölünme ve canli kallus olarak rejenere olma olasiligi vardir, burada söz konusu protoplastlardan elde edilen kalluslarin %10idan fazla olan (filiz veren kallus sayisiztoplam kallus sayisi) filiz gelistirme kapasitesi vardir ve burada söz konusu ALS inhibitörleri söz konusu protoplastlarin 20 000 OOO'undan daha fazlasina uygulanmaktadir.

2. Istem 1'deki yöntem olup, burada seker pancari bitkisi olarak rejenere olabilen stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin seçilmesi, farkli genotipleri olan seker pancari bitkilerinden stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin izole edilmesi ve her genotip için, söz konusu protoplastlar in vitro kültüre koyulduklarinda söz konusu protoplastlarin büyüyen oraninin ölçülmesi alt adimlarini içermektedir.

3. Istem 1 veya 2'deki yöntem olup, ayrica sag kalan in vitro kültürlenmis hücrelerden rejenere bitkilerin genomunun sekanslanmasi ve/veya ALS geninde bir mutasyonu tanimlamak için ALS geninin sekanslanmasi adimini içermektedir.

4. Önceki istemlerden herhangi birine göre yöntem olup, ayrica ALS geninde bir mutasyonu olan rejenere seker pancari bitkilerinin seçilmesi adimini içermektedir.

5. Önceki istem 3-4'ten herhangi birine göre yöntem olup, burada rejenere seker Serin 648 ve Glisin 649'dan olusan gruptan seçilen amino asitleri kodlayan pozisyonlarda ALS bir veya birkaç mutasyona sahiptir.

6. Önceki istem 3-4tten herhangi birine göre yöntem olup, burada rejenere seker pancari bitkisi ALS geninde Prolin 188'i kodlayan pozisyonda bir mutasyona ve/veya ALS geninde Triptofan 569”u kodlayan pozisyonda bir mutasyona sahiptir.

7. Önceki istemlerden herhangi birine göre yöntem olup, bir veya daha fazla ALS inhibitörünü içeren bilesimin in vitro kültürlenmis hücrelerin en az %99'u için ölümcül oldugu konsantrasyonun çikarimda bulunulmasini ön adimini içermektedir.

8. Önceki istemlerden herhangi birine göre yöntem olup, burada bir veya daha fazla ALS inhibitörü stomatal koruyucu hücre protoplastlarinin 50 000 ODO'undan fazlasinin in vitro kültürüne uygulanmaktadir.

9. Önceki istemlerden herhangi birine göre yöntem olup, burada bir veya daha fazla ALS inhibitörünü içeren bilesim foramsülfuron içermektedir. tercihen burada foramsülfuron 10'9 mol/I ila 10'6 mol/I araliginda bir konsantrasyondadir ve/veya etoksisülfuron içermektedir.

10.Bir herbisite karsi dirençli olan bir mutant seker pancari bitkisinin üretilmesi için bir yöntem olup, asagidaki adimlari içermektedir: - bir seker pancari bitkisinden izole edilen stomatal koruyucu hücrelerinden - söz konusu protoplastlarin in vitro kültürüne, söz konusu herbisiti in vitro kültürlenmis hücrelerin %99'undan daha fazlasi için ölümcül olan bir konsantrasyonda içeren bir bilesim uygulanmasi ve - söz konusu in vitro kültürlenmis hücrelerin sag kalan hücrelerinden seker pancari bitkilerinin rejenere edilmesi, ve - söz konusu herbisitin hedefledigi peptidi kodlayan gende bir mutasyona sahip olan rejenere edilmis seker pancari bitkilerinin seçilmesi, burada söz konusu stomatal koruyucu hücre protoplastlari bir seker pancari bitkisi olarak rejenere olma kapasitelerine göre önceden seçilmekte olup, burada söz konusu önceden seçilmis protoplastlarin %10'dan fazla olan (büyüyen protoplastlarin sayisi:kültüre koyulan toplam protoplast sayisi) bölünme ve canli kallus olarak rejenere olma olasiligi vardir, burada söz konusu protoplastlardan elde edilen kalluslarin %10'dan fazla olan (filiz veren kallus sayisiztoplam kallus sayisi) filiz gelistirme kapasitesi vardir, ve burada söz konusu herbisit söz konusu protoplastlarin 20 000 OOO'undan daha fazlasina uygulanmaktadir, burada herbisit 4- HPPD inhibitörleri, karotenoid biyosentez inhibitörleri, EPSP sentaz inhibitörleri, fotosistem lI inhibitörleri, fotosistem I inhibitörleri, hücre bölünmesi inhibitörleri, mikrotübül düzenegi inhibitörleri, protoporfirinojen oksidaz inhibitörleri, Asetil CoA karboksilaz inhibitörleri, hücre çeperi sentez inhibitörleri, glutamin sentetaz inhibitörü ve sentetik oksinden olusan gruptan seçilmektedir.

11.ALS geninde bir allelde SEKANS TANIM NO:3,ü ve ALS geninde ikinci allelde SEKANS TANIM NO:5*i içeren mutasyona ugramis bir seker pancari bitkisi olup, burada mutasyona ugramis seker pancari bitkisi yalnizca esasen biyolojik bir prosesle elde edilmemektedir.

12.Istem 11'deki mutasyona ugramis bitkiden izole edilen stomatal koruyucu hücre protoplasti.

13.Bir veya daha fazla baska genetik özelligin takdimi için istem 12”deki protoplastlarin kullanilmasi.