Claims (3)
ข้อถือสิทธฺ์ (ทั้งหมด) ซึ่งจะไม่ปรากฏบนหน้าประกาศโฆษณา :แก้ไข 5 ส.ค. 2562 หน้า 1 ของจำนวน 3 หน้า ข้อถือสิทธิ 1. กระบวนการสำหรับนำกลับคืนโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินจากเซล โปรคารีโอทที่เลี้ยงไว้ ซึ่งโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปาริน คือ แฟคเตอร์ของการเจริญของเยื่อบุในเส้น เลือด (VEGF) ซึ่งยึดเหนี่ยวเฮปปาริน ซึ่งกระบวนการประกอบด้วยขั้นตอนของ (a) การแยกโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินดังกล่าวออกจากเพอริพลาสซึมของ เซลโปรคารีโอทที่เลี้ยงไว้ดังกล่าว; (b) การดีเนเจอร์โปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินดังกล่าวในสารละลายบัฟเฟอร์ที่ หนึ่งที่ประกอบด้วยสารเปลี่ยนแปลงการเรียงตัว (chaotropic agent) และสารรีดิวซ์ (c) การบ่มโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินดังกล่าวในสารละลายบัฟเฟอร์ที่สองที่ ประกอบด้วย สารเปลี่ยนแปลงการเรียงตัว และสารโพลีแอนไอออนิคที่เติมหมู่ซัลเฟตแล้ว เป็นเวลาที่และใน สภาพที่การพับตัวใหม่ของโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินเกิดขึ้น และ (d) การนำกลับคืนโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินที่พับตัวใหม่แล้วดังกล่าว ซึ่งมี การเพิ่มโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินที่พับตัวใหม่แล้วที่นำกลับคืนได้ 2 ถึง 5 เท่าเมื่อเทียบกับการบ่ม ที่ไม่มีสารโพลีแอนไอออนิคที่เติมหมู่ซัลเฟตแล้ว -------------------------------------------------------------------------- 1. กระบวนการสำหรับแยกเอาโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินจากเซลโปรคารีโอทที่ เลี้ยงไว้กระบวนการประกอบด้วยขั้นตอนของ (a) การแยกโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินดังกล่าวออกจากเพอริพลาสซึมของ เซลโปรคารีโอทที่เลี้ยงไว้ดังกล่าว; (b) การดีเนเจอร์โปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินที่แยกได้ดังกล่าวในสารละลาย บัฟเฟอร์ที่หนึ่งที่ประกอบด้วยสารเปลี่ยนแปลงการเรียงตัวและสารรีดิวซ์ (c) การบ่มโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินที่ดีเนเจอร์แล้วดังกล่าวในสารละลาย บัฟเฟอร์ที่สองที่ประกอบด้วย สารเปลี่ยนแปลงการเรียงตัว และสารโพลีแอนไอออนิคที่เติมหมู่ ซัลเฟตแล้วเป็นเวลาที่และในสภาพที่การพับตัวใหม่ของโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินเกิดขึ้น และ (d) การแยกเอาโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินที่พับตัวใหม่แล้วดังกล่าว ซึ่งมีการ เพิ่มโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินที่พับตัวใหม่แล้วที่แยกได้ประมาณ 2 ถึง 5 เท่าเมื่อเทียบกับการบ่มที่ ไม่มีสารโพลีแอนไอออนิคที่เติมหมู่ซัลเฟตแล้ว 2. กระบวนการของข้อถือสิทธิที่ 1 ซึ่งโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินคือ แฟคเตอร์ ของการเจริญที่ยึดเหนี่ยวเฮปปาริน 3. กระบวนการของข้อถือสิทธิที่ 2 ซึ่งแฟคเตอร์ของการเจริญที่ยึดเหนี่ยวเฮปปาริน คือ แฟคเตอร์ของการเจริญของเยื่อบุในเส้นเลือด (VEGF) 4. กระบวนการของข้อถือสิทธิที่ 3 ซึ่ง VEGF คือ VEGF165 5. กระบวนการของข้อถือสิทธิที่ 1 ซึ่งสารโพลีแอนไอออนิคที่เติมหมู่ซัลเฟตแล้ว มีน้ำหนักโมเลกุลระหว่างประมาณ 3,000 ดาลตัน ถึง 10,000 ดาลตัน 6. กระบวนการของข้อถือสิทธิที่ 3 ซึ่งสารละลายบัฟเฟอร์ที่สองดังกล่าว ประกอบด้วย เดกซ์เตรนซัลเฟต 7. กระบวนการของข้อถือสิทธิที่ 3 ซึ่งสารละลายบัฟเฟอร์ที่สองดังกล่าว ประกอบด้วย โซเดียมซัลเฟต 8. กระบวนการของข้อถือสิทธิที่ 3 ซึ่งสารละลายบัฟเฟอร์ที่สองดังกล่าว ประกอบด้วย เฮปปาริน 9. กระบวนการของข้อถือสิทธิที่ 6 ซึ่งเดกซ์แตรนซัลเฟตมีน้ำหนักโมเลกุลระหว่าง ประมาณ 8,000 ถึง 10,000 ดาลตัน 1 0. กระบวนการของข้อถือสิทธิที่ 3 ซึ่งสารละลายบัฟเฟอร์ที่หนึ่งและที่สอง ดังกล่าวประกอบด้วย HEPPS pH 8.0 1 1. กระบวนการของข้อถือสิทธิที่ 1 ซึ่งสารละลายบัฟเฟอร์ที่สองดังกล่าวมีส่วน เพิ่มเติมที่ประกอบด้วย สารรีดิวซ์ 1 2. กระบวนการของข้อถือสิทธิที่ 1 ซึ่งสารละลายบัฟเฟอร์ที่สองดังกล่าวมีส่วน เพิ่มเติมที่ประกอบด้วย ซิสเตอีนและ DTT ร่วมกัน 1 3. กระบวนการของข้อถือสิทธิที่ 1 ซึ่งสารละลายบัฟเฟอร์ที่สองดังกล่าวมีส่วน เพิ่มเติมที่ประกอบด้วย ดีเทอร์เจนท์ที่ไม่ถือประจุ 1 4. กระบวนการของข้อถือสิทธิที่ 1 ซึ่งสารละลายบัฟเฟอร์ที่สองดังกล่าวมีส่วน เพิ่มเติมที่ประกอบด้วย อาร์จินีน และ/หรือ ไลซีน 1 5. กระบวนการของข้อถือสิทธิที่ 1 ซึ่งขั้นตอนของการแยก (d) ดังกล่าว ประกอบด้วย การสัมผัสตามลำดับระหว่างโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินที่พับตัวใหม่แล้วดังกล่าวกับ สารรองรับทางโครมาโตกราฟีที่เป็นไฮดรอกซีอาปาไทท์, สารรองรับทางโครมาโตกราฟีแบบ อันตรกิริยาของส่วนที่ไม่ชอบน้ำที่หนึ่ง, สารรองรับทางโครมาโตกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออนประจุ บวก, และสารรองรับมาโครมาโตกราฟีแบบอันตรกิริยาของส่วนที่ไม่ชอบน้ำที่สอง และการชะ โปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินออกอย่างเลือกสรรจากสารรองรับแต่ละชนิด 1 6. กระบวนการของข้อถือสิทธิที่ 15 ซึ่งสารรองรับทางโครมาโตกราฟีแบบ อันตรกิริยาของส่วนที่ไม่ชอบน้ำที่หนึ่งดังกล่าวเลือกได้จากกลุ่มที่ประกอบด้วย บิวทิล, โปรปิล-, ออดทิล- และอาริล-อากาโรสเรซิน 1 7. กระบวนการของข้อถือสิทธิที่ 15 ซึ่งสารรองรับทางโครมาโตกราฟีแบบ อันตรกิริยาของส่วนที่ไม่ชอบน้ำที่หนึ่งดังกล่าวคือ สารรองรับที่เป็นบิวทิล-อากาโรสเรซิน และ สารรองรับทางโครมาโตกราฟีแบบอันตรกิริยาของส่วนที่ไม่ชอบน้ำที่สองดังกล่าวคือ สารรองรับ ที่เป็นเฟนนิลอากาโรสเรซิน 1 8. กระบวนการของข้อถือสิทธิที่ 1 ซึ่งขั้นตอนของการแยก (d) ดังกล่าว ประกอบด้วย การสัมผัสตามลำดับระหว่างโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินที่พับตัวใหม่แล้วดังกล่าวกับ สารรองรับที่แลกเปลี่ยนไอออนประจุบวก, สารรองรับทางโครมาโตกราฟีแบบอันตรกิริยาของส่วนที่ ไม่ชอบน้ำ และสารรองรับทางโครมาโตกราฟีที่แลกเปลี่ยนไอออน และการซะโปรตีนที่ยึดเหนี่ยว เฮปปารินออกอย่างเลือกสรรจากสารรองรับแต่ละชนิด 1 9. วิธีการสำหรับแยกเอาโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินจากเซลโปรคารีโอทที่เลี้ยง ไว้วิธีการประกอบด้วยขั้นตอนของ (a) การแยกโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินดังกล่าวออกจากเพอริพลาสซึมของ เซลโปรคารีโอทที่เลี้ยงไว้ดังกล่าว; (b) การดีเนเจอร์โปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินที่แยกได้ดังกล่าวในสารละลาย บัฟเฟอร์ที่หนึ่งที่ประกอบด้วยสารเปลี่ยนแปลงการเรียงตัวและสารรีดิวซ์ (c) การบ่มโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินที่ดีเนเจอร์แล้วดังกล่าวในสารละลาย บัฟเฟอร์ที่สองที่ประกอบด้วย สารเปลี่ยนแปลงการเรียงตัว และสารโพลีแอนไอออนิคที่เติมหมู่ ซัลเฟตแล้วเป็นเวลาที่และในสภาพที่การพับตัวใหม่ของโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินเกิดขึ้น ซึ่งมี การเพิ่มโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินที่พับตัวใหม่แล้วที่แยกได้ประมาณ 2 ถึง 5 เท่า เมื่อเทียบกับการ บ่มที่ไม่มีสารโพลีแอนไอออนิคที่เติมหมู่ซัลเฟตแล้ว และ (d) การสัมผัสตามลำดับระหว่างโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินที่พับตัวใหม่แล้ว ดังกล่าวกับสารรองรับทางโครมาโตกราฟีที่เป็นไฮดรอกซีอาปาไทท์, สารรองรับทางโครมาโตกราฟี แบบอันตรกิริยาของส่วนที่ไม่ชอบน้ำที่หนึ่ง, สารรองรับทางโครมาโตกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออน ประจุบวก และสารรองรับทางโครมาโตกราฟีแบบอันตรกิริยาของส่วนที่ไม่ชอบน้ำที่สองและการชะ โปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินออกอย่างเลือกสรรจากสารรองรับแต่ละชนิด 2 0. วิธีการสำหรับทำให้โปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินบริสุทธิ์ วิธีการประกอบด้วย ขั้นตอนของการสัมผัสตามลำดับระหว่างโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินที่พับตัวใหม่แล้วกับสารรองรับ ทางโครมาโตกราฟีที่เป็นไฮดรอกซีอาปาไทท์, สารรองรับทางโครมาโตกราฟีแบบอันตรกิริยาของ ส่วนที่ไม่ชอบน้ำที่หนึ่ง, สารรองรับทางโครมาโตกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออนประจุบวก และสาร รองรับทางโครมาโตกราฟีแบบอันตรกิริยาของส่วนที่ไม่ชอบน้ำที่สอง และการชะโปรตีนที่ยึดเหนี่ยว เฮปปารินออกอย่างเลือกสรรจากสารรองรับแต่ละชนิด 2Disclaimer (all) which will not appear on the advertisement page: Amendment 5 Aug. 2019 Page 1 of 3 pages. Claims 1. Process for the recovery of protein bound heparin from cells. Raised prokaryotes The protein that binds hpparin is a vascular endothelial growth factor (VEGF) that binds heparin. This process consists of a process of (a) the separation of the protein binding hpparin from the periplasm of Cultured cell prokaryotes; (b) Determination of proteins binds such heparin in a buffer solution that One containing a chaotropic agent and a reducing agent (c) curing the protein binding of the hpparin in a second buffer containing a coagulant. And poly anionic additives with sulfate groups added It is time and in The condition in which the re-folding of the hpparin-binding protein occurs and (d) the recovery of such hpparin-binding proteins, which is added to the hpparin-binding protein that is folded. New and then 2 to 5 times recoverable compared to curing Without sulfate-added polymorphic polyphenols -------------------------------------------------- ------------------------ 1. Process for extracting protein binding of heparin from cell prokaryotes. The process consists of a process of (a) the separation of the protein binding hpparin from the periplasm of Cultured cell prokaryotes; (b) Determination of proteins binds such isolated heparin in solution. A first buffer containing a collation modifier and reducing agent (c) the curing of the protein binded to hydrolyzed heparin in solution. The second buffer contains Composition change substance And poly anionic additives that add groups Sulfate is the time when and in the condition in which new folding of the hpparin-binding protein takes place, and (d) the separation of such re-folded heparin-binding protein, which is added to the Bonds the extracted newly folded heparin approximately 2 to 5 times compared to the 2. The process of claim 1 in which the hpparin-binding protein is a growth factor that binds the hpparin. 3. The process of the joint. The second right is that the heparin-bound growth factor is the intravascular endothelial growth factor (VEGF). 4. The process of the 3rd claim, where VEGF is VEGF165. Holds the first right, which is an ionic compound containing sulfate groups It has a molecular weight between approximately 3,000 Dalton and 10,000 Dalton. 6. The process of claim 3, in which the second buffer contains dextransulfate. 7. The process of claim 3, in which the second buffer consists of. Sodium sulphate 8. The process of claim 3, in which the second buffer contains heparin 9. The process of claim 6, in which dextran sulfate has a molecular weight between approximately 8,000 and 10,000 Dalton 1.0. The process of claim 3, in which the first and second buffers It consists of HEPPS pH 8.0 1 1. Process of claim 1, in which the second buffer is involved. 2. The process of claim 1, in which the second buffer is involved. The addition of cysteine and DTT together 1 3. Process of claim 1 in which the second buffer is involved. Additional that contains Non-ionic detergent 1 4. The process of claim 1 in which the second buffer is involved. The addition of arginine and / or lysine 1 5. Process of claim 1, where the separation phase (d) consists of sequential contact between the protein bound hpparin collapsed. New and then mentioned with Hydroxyapatite chromatographic support, type chromatographic support Reaction of the first hydrophobic fraction, cation exchange chromatography supports, and reactive macromatography supports of the second hydrophobic fraction and elution. Heparin-binding proteins are selectively released from each substrate 1 6. Process of claim 15, in which the chromatographic stabilizer The interaction of the first hydrophobic part is selected from a group consisting of butyl, propyl-, odtyl- and aryl-agarosin 1 7. The process of the claim at 15 of which the chromatographic support The interaction of the first hydrophobic part is The butyl-agarosin substrate and the interacting chromatographic substrate of the aforementioned hydrophobic substrate is fennyl agarosin 1. 8. Process of claim 1, in which the aforementioned separation phase (d) consists of sequential contact between the aforementioned folded heparin binding protein and Cation-exchanging supports, reactive chromatographic supports of the hydrophobic fraction and ion exchange chromatographic supports. And the binding of proteins Heparin is selected for each substrate. The method consists of a procedure of (a) the separation of the protein binding hpparin from the periplasm of the Cultured cell prokaryotes; (b) Determination of proteins binds such isolated heparin in solution. A first buffer containing a collation modifier and reducing agent (c) the curing of the protein binded to hydrolyzed heparin in solution. The second buffer contains Composition change substance And poly anionic additives that add groups Sulfate was the time when and in the condition where new folding of the hpparin-binding protein occurred, where two to 5 times the addition of the isolated hpparin-binding protein, compared with The Cured without sulfate-added polyionic compounds and (d) sequential contact between proteins binded to newly folded heparin. Such as hydroxyapatite chromatography support, chromatographic support Interaction models of the first hydrophobic fraction, cation exchange chromatography supports and reactive chromatography supports of the second hydrophobic fraction, and Washing Heparin-binding proteins are selected carefully from each substrate. 2 0. Methods for purifying the heparin binding proteins. Method consists of The sequential contact phase between the newly folded hpparin binding protein and the receptacle. Hydroxyapatite chromatography, interaction chromatographic substrate of First hydrophobic fraction, cation exchange chromatography supports and reactive chromatography supports of second hydrophobic fraction. And leaching of binding proteins Heparin is carefully released from each substrate 2
1. วิธีการสำหรับแยกเอาโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินจากเซลโปรคารีโอทที่เลี้ยง ไว้วิธีการประกอบด้วยขั้นตอนของ (a) การแยกโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินดังกล่าวออกจากเพอริพลาสซึมของ เซลโปรคารีโอทที่เลี้ยงไว้ดังกล่าว; (b) การดีเนเจอร์โปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินที่แยกได้ดังกล่าวในสารละลาย บัฟเฟอร์ที่หนึ่งที่ประกอบด้วยสารเปลี่ยนแปลงการเรียงตัวและสารรีดิวซ์ (c) การบ่มโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินที่ดีเนเจอร์แล้วดังกล่าวในสารละลาย บัฟเฟอร์ที่สองที่ประกอบด้วย สารเปลี่ยนแปลงการเรียงตัว และสารโพลีแอนไอออนิคที่เติมหมู่ ซัลเฟตแล้วเป็นเวลาที่และในสภาพที่การพับตัวใหม่ของโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินเกิดขึ้น ซึ่งมีการ เพิ่มโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินที่พับตัวใหม่แล้วที่แยกได้ประมาณ 2 ถึง 3 เท่าเมื่อเทียบกับการบ่มที่ ไม่มีสารโพลีแอนไอออนิคที่เติมหมู่ซัลเฟตแล้ว และ (d) การสัมผัสตามลำดับ ระหว่างโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินที่พับตัวใหม่แล้ว ดังกล่าวกับสารรองรับที่แลกเปลี่ยนไอออนประจุบวก; สารรองรับทางโครมาโตกราฟีแบบอันตร กิริยาของส่วนที่ไม่ชอบน้ำ และสารรองรับทางโครมาโตกราฟีที่แลกเปลี่ยนไอออน และการชะ โปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินออกอย่างเลือกสรรจากสารรองรับแต่ละชนิด 21. Method for extracting protein binding of heparin from cultured cells prokaryotes. The method consists of a procedure of (a) the separation of the protein binding hpparin from the periplasm of the Cultured cell prokaryotes; (b) Determination of proteins binds such isolated heparin in solution. A first buffer containing a collation modifier and reducing agent (c) the curing of the protein binded to hydrolyzed heparin in solution. The second buffer contains Composition change substance And poly anionic additives that add groups Sulfate was the time when and in the condition where new folding of the hpparin-binding protein occurred, where 2 to 3 times the addition of the isolated hpparin-binding protein, compared with Incubation at No sulfate-added poleanionic compounds and (d) exposure, respectively. Between the proteins that bind the newly folded heparin Such with a supporting agent that exchanges cation ions; Harm chromatographic support The action of the hydrophobic part And selective ion exchange chromatography and leaching of heparin binding proteins from each substrate 2
2. วิธีการของข้อถือสิทธิที่ 19 หรือ 21 ซึ่งสารโพลีแอนไอออนิคมีน้ำหนักโมเลกุล อยู่ระหว่างประมาณ 3,000 ดาลตันถึง 10,000 ดาลตัน 22. Methods of claim 19 or 21 in which poly anionic substances have molecular weight. It is between approximately 3,000 Dalton and 10,000 Dalton 2.
3. วิธีการสำหรับทำให้โปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินบริสุทธิ์ วิธีการ ประกอบด้วย ขั้นตอนของการสัมผัสตามลำดับระหว่างโปรตีนที่ยึดเหนี่ยวเฮปปารินที่พับตัวใหม่แล้ว กับสารรองรับที่แลกเปลี่ยนไอออนประจุบวก; สารรองรับทางโครมาโตกราฟีแบบอันตรกิริยาของ ส่วนที่ไม่ชอบน้ำและสารรองรับทางโครมาโตกราฟีที่แลกเปลี่ยนไอออน และการชะโปรตีนที่ ยึดเหนี่ยวเฮปปารินออกอย่างเลือกสรรจากสารรองรับแต่ละชนิด3. Method for Purification of Heparin Binding Protein The method consists of sequential contact steps between the newly folded hpparin binding proteins. With supports that exchange cation ions; Reactive chromatography support of Hydrophobic portion and ion exchange chromatography support And leaching of the proteins Selective binds Heparin from each substrate.