SU953561A1 - Homoserin determination method - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ОПгеДЕЛЕНИЯ ГОМОСЕРИНА(54) METHOD FOR MAKING HOMOSERIN

Изобретение относитс  к аналитической химии, а именно к способам определе ни  гомосерина. Известен способ определени  гомосе- рина методом тонкослойной хроматографии на силуфоловых пластинках, основанный на различной степени средства аминокислот к неподвижному носителю i. Недостатком способа  вл етс  мала  точность и длительность анализа (3-6 ч) Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам  вл етс  способ количественного определени  аминокислот, в том числе гомосерина газожидкостной хроматографией (ГЖХ) летучих Ы -трифторацетилметиловых эфиров аминокислот, получаемых реакцией ацетипировани  аминокислот триэтанопамином и метиптрифторацетатом в метаноле 2. Недостатком способа  вл етс  мала  точность и длительность анализа (4-5 ч) Цепь.изобретени  - повышение точности определени  и сокращение времени про ведени  анализа. Поставленна  цель достигаетс  тем, что, согласно способу определени  гомосе- рина, включающему газожидкостную хроматографию летучих производных гомосерина анализируемую пробу обрабатывают трифторуксусным ангидридом в ацетоне при 15-30°С н в случае определени  синтетического гомосерина дополнительно обрабатывают диазометаном с последующей газожидкостной хроматографией образующихс  летучих производных. В качестве летучих производных используют N, 0-трифторацетилпроизводное гомосерина (при определении гомосерина в биологических объектах) или метиловый эфир N ,О-трифторацетилгомосерина (при определении гомосерина в синтетических продуктах). При определении гомосерина в биологических объектах N ,0-трифторацетилпроизводные гомосерина получают реакцией ацетилировани  гомосерина трифторуксусным ангидридом при концентрации 5О - lOO мас.% в среде ацетона и температуре 15-30 С в течение 3-5 мин. При опредепении гомосерина в синтети ческом продукте N ,О-трифторацетиппроиз Бодное гомосерина получают реакцией аце тит1ровани  трифторуксусным ангидридом при концентрации 10-25 мас.% в среде ацетона при 15-30 С в течение 3-5 мин Метиповый эфир N,0-трифторацетипгомо- сернна получают метилированием диазоме таком в эфире & течение 0,5-2 мин, В качестве внутреннего стандарта при мен ют высшие спирты и.эфиры моно-.и дикарбоновых органических киспот, Газохроматографический анализ провод т на любом типе хроматографа с ппаменно-ионизационным детектором. Хроматографическа  колонка из нержавеющей отапи {50-ЗОО см длиной и внут ренним диаметром О,2-О,4 см) запопнена 0,5-6,0%-ной полиэфирной жидкой фазой на инертном носителе, например полиэтиленгликольадипинат на хроматоне M-AW- HMD5-Газ-носитель - любой инертный газ, например азот. При опредепении гомосерина в продукте , полученном химическим методом, используют режим с линейным программированием при изменении температуры от 50 до 20ОС (I-IO С/мин) или изотермический при 120° С. При определении гомосерина в биологических продуктах используют режим с линейным программированием при изменеши температуры от 20 до 200°С (l-g Ю С/мин) или изотермический при 160С Относительна  ошибка определени  . При определении гомосерина в биологи ческих и синтетических продуктах, содержащих значительные количества примесей в частности нейтральные кисл(5ты и неорганические кисло1Ъ1, необходимо очищать ромосерин с помощью катионообменной смолы, например КУ-2-8 в Н -форме, элюиру  гомосерин 4 н. раствором аммиака . Смола переводитс  в ЬТ -форму одним из обычных способов. Пример 1. Определение гомосеоина в модельных растворах, содержащих химически чистый гомосерин, в синтетическом гомосерине, полученном химическимо методом. Количественный анализ определени  гомосерина провод т по высоте пиков на хроматограмме методом калибровки по описанной ниже методике. Дл  учета возможных механических потерь гомосерина при очистке проб с помощью ионообменных смол калибровочный график стро т С использованием раствора химически чистой аминокиспоты, котора  выдел етс  также ионробменнь1ми смолами в идентичных услови х. 5,ОООО г синтетического гомосерина взвешивают на аналитических весах с точностью до четвертого знака, раствор ют дистиллированной водой в мерной копбе на 25 мл. 3 г подготовленного катионита влажностью 50% заливйют 1 мл пробы, добавл ют 5 мл дистиллированной воды дл  лучшего перемешивани  и провод т сорбцию аминокислоты в течение 15 мин при интенсивном перемешивании содержимого с помощью магнитной мешалки. Смолу, содержащую аминокислоты, промывают во взвешенном слое дистиллированной водой до рН 7. Катионит отдел ют от жидкости на фильтре Шотта, .при этом хорошо отсасывают межчастичную воду. Содержание воды в смоле. 50%, что составл ет 1,5 мл. Смолу количественно перенос т в стакан, добавл ют 2,5 мл 4 н. ЗH,JOH и провод т элюирование гомосерина в течение 15 мин. После оседани  смолы надосадочный раствор объемом 1 мл внос т в колбу с притертой йробкой дл  упарива - ни . К остатку добавл ют 0,5 мл 1О%-ного раствора трифторуксусного ангидрида в ацетоне. Реакцию ацетилировани  провод т в течение 5 мин при . Остаток реагентов удал ют холодным воздухом в течение 5 мин. К остатку добавл ют 1 мл диазометана , встр хивают в течение 0,5 мин, удал ют диазометан холодным .воздухом, добавл ют 1 мл О,2%-ного раствора додеканового спирта в ацетоне (внутренний стандарт ). Пробу ввод т в испаритель хроматографа . Общее врем  анализа 45 60 мин. Врем  газохроматографического анализа 15-20 миН. Расчет процентного содержани  гомосерина в анализируемом образе ведут по формуле г- m де С- процентное содержание гомосе- рина в. анализируемом образце; YO - содержание гомосерина по Kami6ровочному графику, мг/мл; Vvl - навеска синтетического гомосери- на, мг; 4 - содержание аммиака и воды в смоле, мл; 25 - общий объем после разведени ; 1ООпроценты . 3 97 Пример расчета: С - 5ООО 100; С 7.95%. . Примеры 2, 3 и результаты определени  гомосерина в модепьных растворах, синтетическом гомосерине, полученном химическим методом, приведены в табл.1 Пример 4. Определение гомосерина в модельных растворах, содержащих химически чистый гомосерин в биопогиче ких объектах. Методика выделени  гомосерина из биологических объектов аналогична описанной в примере 1. 1 мл аммиачного раствора гомосерина внос т в колбочку с притертой пробкой дл  упаривани . К сухому остаГтку до , бавп ютО,4 мл 50%-ного раствора трифторуксусного ангидрида в ацетоне. РеакThis invention relates to analytical chemistry, and specifically to methods for determining either homoserine. A known method for the determination of homoserine by thin layer chromatography on Sil-fold plates, based on varying degrees of means of amino acids to the fixed carrier i. The disadvantage of the method is the low accuracy and duration of the analysis (3-6 hours). The closest to the technical essence and the achieved results is the method of quantitative determination of amino acids, including homoserine by gas-liquid chromatography (GLC) of volatile S-trifluoroacetylmethyl ether of amino acids obtained by the acetylation reaction of amino acids triethanopamine and methyptrifluoroacetate in methanol 2. The disadvantage of the method is the low accuracy and duration of the analysis (4-5 hours). The circuit of the invention improves the accuracy of determination. and reducing analysis time. The goal is achieved by the fact that, according to the method for determining homoserine, which includes gas-liquid chromatography of volatile homoserine derivatives, the analyzed sample is treated with trifluoroacetic anhydride in acetone at 15-30 ° C. In the case of determining synthetic homoserine, it is further treated with diazomethane followed by gas-liquid chromatography. N, 0-trifluoroacetyl derivative of homoserine (in the determination of homoserine in biological objects) or methyl ester of N, O-trifluoroacetylhomoserine (in the determination of homoserine in synthetic products) are used as volatile derivatives. When determining homoserine in biological objects, N, 0-trifluoroacetyl homoserine derivatives are obtained by acetylation of homoserine with trifluoroacetic anhydride at a concentration of 5O - lOO wt.% In acetone and temperature 15-30 C for 3-5 minutes. With the determination of homoserine in the synthetic product N, O-trifluoroacetate, Bodic homoserine is obtained by acetic titration with trifluoroacetic anhydride at a concentration of 10-25 wt.% In acetone at 15-30 ° C for 3-5 minutes. N-0-trifluoroacetyphoxy methyl ester chamois is obtained by methylation of such a diazo in ether & for 0.5-2 minutes. As an internal standard, higher alcohols are used, and mono-and dicarboxylic organic acids are used. Gas chromatographic analysis is performed on any type of chromatograph with a memory-ionization detector. Stainless chromatographic column {50-ZOO cm long and internal diameter О, 2-О, 4 cm) is filled with 0.5-6.0% polyester liquid phase on an inert carrier, for example polyethylene glycol adipate on the chromatone M-AW- HMD5-Carrier gas - any inert gas, for example nitrogen. In the determination of homoserine in a product obtained by a chemical method, a linear programming mode is used with a temperature change from 50 to 20 ° C (I-IO C / min) or isothermal at 120 ° C. When determining homoserine in biological products, the linear programming mode is used when changing temperatures from 20 to 200 ° C (lg S / min) or isothermal at 160 ° C Relative determination error. When determining homoserine in biological and synthetic products containing significant amounts of impurities, in particular neutral acids (5 tons and inorganic acids), romoserine must be purified using a cation exchange resin, for example, KU-2-8 in the H form, and homoserine is eluted with 4N ammonia solution The resin is converted to the LT-form by one of the usual methods. Example 1. Determination of homoceoyin in model solutions containing chemically pure homoserine in synthetic homoserine obtained by a chemical method. Quantitative analysis the homoserine is measured by the height of the peaks on the chromatogram using the calibration method described below: To take into account possible mechanical losses of homoserine during sample cleaning using ion exchange resins, the calibration schedule is constructed using a chemically pure amino acid solution, which is also released by identical ion resins under identical conditions 5, OOOO g of synthetic homoserine is weighed on an analytical balance with an accuracy of four digits, dissolved with distilled water in a 25 ml measuring copb. 3 g of the prepared cation exchanger with a humidity of 50% is poured over 1 ml of the sample, 5 ml of distilled water is added for better mixing, and the amino acid is sorbed for 15 minutes with vigorous stirring of the contents using a magnetic stirrer. The resin containing amino acids is washed in the suspended layer with distilled water to a pH of 7. The cation exchanger is separated from the liquid on the Schott filter, while the interparticle water is well sucked off. Water content in resin. 50%, which is 1.5 ml. The resin is quantitatively transferred to a beaker, 2.5 ml of 4 N are added. H, JOH, and elution of homoserine for 15 minutes. After the resin settles, a 1 ml supernatant is introduced into a flask with a ground glass for evaporation. To the residue is added 0.5 ml of a 1O% aqueous solution of trifluoroacetic anhydride in acetone. The acetylation reaction is carried out for 5 minutes at. The residue was removed with cold air for 5 minutes. To the residue was added 1 ml of diazomethane, shaken for 0.5 minutes, the diazomethane was removed with cold air, and 1 ml of O, 2% dodecane alcohol in acetone (internal standard) was added. The sample is introduced into the chromatograph evaporator. Total analysis time 45 60 min. The gas chromatographic analysis time is 15-20 min. The calculation of the percentage of homoserine in the analyzed image is carried out according to the formula g - m de C - the percentage of homoserine c. analyzed sample; YO is the homoserine content according to the Kami6 blending schedule, mg / ml; Vvl — weight of synthetic homoserine, mg; 4 - the content of ammonia and water in the resin, ml; 25 — total volume after dilution; 1 percent. 3 97 Calculation example: С - 5ООО 100; From 7.95%. . Examples 2, 3 and the results of the determination of homoserine in model solutions, synthetic homoserine obtained by a chemical method, are given in Table 1. Example 4. The determination of homoserine in model solutions containing chemically pure homoserine in biopogical objects. The method for isolating homoserine from biological objects is similar to that described in Example 1. A 1 ml ammonium solution of homoserine is introduced into a flask with a ground glass stopper for evaporation. Dry dry to, with 4 ml of a 50% solution of trifluoroacetic anhydride in acetone. Reak

Примечание. Ошибка опродспеин  предлагаемого метоаа не препышает 3,3%.Note. The error obspespain of the proposed method does not cause 3.3%.

Модельный водный раствор, содержащий 5 г/п химически чистогр гомосеринаModel aqueous solution containing 5 g / p chemically pure homoserine

Гомосвринова  купыурапькав жидкость, полученна  с помощью микроорганизмовGomosvrinov kupyurapkav liquid obtained using microorganisms

Образец (по п, 2) с добавкой 5 г химически чистого гомосерина на 1 п образцаSample (according to claim 2) with the addition of 5 g of chemically pure homoserine per 1 n sample

Т а б R н п « цию ацетилировани  провод т в течение 3 мин при . Остаток реагентов удал ют холодным воздухом в течение 0,51 мин. К остатку добавл ют 1 мп 0,1%ного раствора дибутипфталата в ацетоне (внутренний стандарт). Расчет ведут аналогично примеру 1. Примеры и результаты определени  гомосерина в модепьных растворах приведены в табп. 2. Использование предлагаемого способа определени  гомосерина методом газожидкостной хроматографии по предложенной методике повышает в 1,5-2 раза точность определени  и сокращает врем  проведени  анализа до 45 мин, т.е. в 68 раз. Табпика 1T a b R n p "acetylation" is carried out for 3 min at. The residue was removed with cold air for 0.51 minutes. To the residue is added 1 mp of a 0.1% solution of dibutyl phthalate in acetone (internal standard). The calculation is carried out analogously to Example 1. Examples and results of the determination of homoserine in modepic solutions are given in tab. 2. The use of the proposed method for the determination of homoserine by gas-liquid chromatography using the proposed method increases by 1.5–2 times the accuracy of determination and shortens the analysis time to 45 minutes, i.e. 68 times. Table 1

Примечание, Ошибка определенн  не превышает 3,1% (относительных). ормупа изобретени  Способ определени  гомосерина, включающий гааожидкостную хроматографию летучих производных гомосерина, о т п и ч аю щ и и с   тем, что, с цепью повышени  точности способа и сокращени  времени анализа, анализируемую пробу обрабатывают трифторуксусным ангидридом в ацетоне при 15-ЗОС и в случае опредепени  синтетического гомосерина Note Error definitely does not exceed 3.1% (relative). Formula of the Invention A method for determining homoserine, including the liquid-phase chromatography of volatile derivatives of homoserine, is carried out so that, with a chain of increasing the accuracy of the method and reducing the time of analysis, the analyzed sample is treated with trifluoroacetic anhydride in acetone at 15-AIA and case of synthetic homoserine

Г слолжр  с гаЛл. .2 дополнительно обрабатывают диазомета- ном с последующей газожидкостной хроматографией образующихс  петучих проИЗВОДШ1Х Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1.Шталь Э. Хроматографи  в тонких сло х. М., Мир, 1965, с, 393. 2.Берчфипд Г., Сторрс Ж. Газова  хроматографи  в биохимии. М., Мир, 1964, с. 534-536 (прототип).G slojr with gall. .2 is additionally treated with diazomethine followed by gas-liquid chromatography of the resulting roedemic derivatives. Sources of information taken into account in the examination 1.Stal E. Chromatography in thin layers. M., Mir, 1965, p. 393. 2. Berchfipd G., Storrs J. Gas chromatography in biochemistry. M., Mir, 1964, p. 534-536 (prototype).

Claims (1)

Формула изобретения ²®The claims ² ® Способ определения гомосерина, включающий газожидкостную хроматографию летучих производных гомосерина, отличающийся тем, что, с целью ^5 повышения точности способа и сокращения времени анализа, анализируемую пробу обрабатывают трифторуксусным ангидридом в ацетоне при 15-30°С и в случае определения синтетического гомосерина дополнительно обрабатывают диазометаном с последующей газожидкостной хроматографией образующихся летучих производных.A method for determining homoserine, including gas-liquid chromatography of volatile derivatives of homoserin, characterized in that, in order to increase the accuracy of the method and reduce the analysis time, the analyzed sample is treated with trifluoroacetic anhydride in acetone at 15-30 ° C and, if synthetic homoserine is determined, it is further treated with diazomethane followed by gas-liquid chromatography of the resulting volatile derivatives.