SU943280A1 - Process for preserving immobilized enzymes - Google Patents

Abstract

A process of conservation of immobilized proteins for the purposes of their long-term preservation and transportation to be used in the food, microbiological and medical industries. The process consists in the freeze-drying of the immobilized proteins in presence of an inert water-soluble filler such as inorganic salts, amino acids, carbohydrates, polysaccharides, water-soluble polymers, polyalcohols.

Description

Изобретение относитс  к способшл ксжсервации иммобилизованных ферментов , позвол ющим избежать существенной потери активности при длительном хранении и транспортировке промьшшенно изготовленных препара-. тов иммобилизованных ферментов. Способ консервации может найти широкое применение при изготовлении препаратов иммобилизованных ферментов дл  использовани  их в пищевой , химической и микробиологической промышленности.This invention relates to a method of preserving immobilized enzymes, which helps to avoid a significant loss of activity during long-term storage and transportation of industrial preparations made. comrades of immobilized enzymes. The preservation method can be widely used in the manufacture of preparations of immobilized enzymes for use in the food, chemical and microbiological industries.

Известно, что дл  длительного хранени  белков и ферментов используют лиофильное высушивание, которое в большинстве случаев обеспечивает стопроцентное сохранение активности и нативности препаратов. В случае потерь активности при лиофилизации в раствор фермента перед высушиванием добавл ют различные инертные наполнители, растворимые в воде 1.It is known that for long-term storage of proteins and enzymes, freeze drying is used, which in most cases provides one hundred percent preservation of the activity and originality of preparations. In case of loss of activity during lyophilization, various inert fillers that are soluble in water 1 are added to the enzyme solution before drying.

Лиофильное высушивание иммобилизованных ферментов также широко примен етс  дл  получени  форм препаратов , выдерживающих длительное хранение , однако часто сопровождаетс  частичной потерей активности.Freeze drying of immobilized enzymes is also widely used to obtain forms of drugs that can withstand long-term storage, but often is accompanied by a partial loss of activity.

Наиболее близким к предлагаемому  вл етс  способ консервации иммобилизованных ферментов путем лиофильного высушивани  суспензии иммобилизованного фермента, в частности пепсина, в воде или буфере, который имеет тот недостаток, что в зависимости от использованного дл  иммобилизации носител , при высу10 шивании тер етс  от 10 до 90% активности 2 .The closest to the proposed method is the preservation of immobilized enzymes by freeze drying the suspension of the immobilized enzyme, in particular pepsin, in water or buffer, which has the disadvantage that, depending on the carrier used for immobilization, 10 to 90% is lost during drying. Activity 2.

Цель изобретени  - уменьшение потерь активности фермента при высуши15 вании.The purpose of the invention is to reduce the loss of enzyme activity during drying.

Цель достигаетс  тем, что согласно способу консервации иммобилизированных ферментов путем лиофольного вы20 сушивани  их суспензии в воде или буфере, у суспензии добавл ют инертный растворимЛ) наполнитель при соотношении фермент;наполнитель 1:(1-20).The goal is achieved in that, according to the method of preserving immobilized enzymes by lyophilizing drying their suspension in water or buffer, an inert soluble additive is added to the suspension at an enzyme ratio; 1: (1-20).

7575

В качестве инертного наполнител  используют неорганические соли, например поваренную соль.Inorganic salts, for example, table salt, are used as inert fillers.

В качестве инертного наполнител  используют аминокислоты, например As an inert filler use amino acids, for example

JO глицин.JO glycine.

В качестве инертного наполнител  используют углеводы, например глюкозу , сахарозу.As the inert filler use carbohydrates, such as glucose, sucrose.

В качестве инертного наполнител  используют водораствори у1ые полисахариды , например декстран.Water-soluble polysaccharides, for example, dextran, are used as inert fillers.

В качестве инертного наполнител  используют полиспирты, например полиэтиленгликоль .Polystools, for example polyethylene glycol, are used as the inert filler.

В качестве инертного наполнител  используют водорастворимые синтетические полимеры, например поливинилпирролидон .Water-soluble synthetic polymers, for example polyvinylpyrrolidone, are used as the inert filler.

Перед высушиванием к суспензии иммобилизованного фермента в воде или буфере добавл ют инертный растворимый в воде наполнитель , который предохран ет препарат иммобилизованного фермента от потери активности при лиофильном высушивании и легко может быть удален перед использованием препарата иммобилизованного фермента путем отмывани  водой.Before drying, an inert water-soluble filler is added to the suspension of the immobilized enzyme in water or buffer, which protects the immobilized enzyme preparation from activity loss during freeze drying and can be easily removed before using the preparation of the immobilized enzyme by water washing.

Препараты иммобилизованных ферментов сохран ют активность, превышающую в несколько раз (в р де случаев в 8 раз) активность препаратой подвергнутых лиофильному высушиванию без наполнител .Preparations of immobilized enzymes retain activity exceeding several times (in a number of cases 8 times) the activity of the preparation subjected to freeze-drying without filler.

Перед последующим использованием фермента наполнитель может быть легко удален отмыва 1ием буфером или центрифугированием.Before the subsequent use of the enzyme, the filler can be easily removed by washing it with 1 buffer or centrifugation.

Пример. 20 мг пепсина свиньи , иммобилизованного на аэросиле, суспендируют в 1 мл воды, содержаще инертный растворимый наполнитель в весовом соотношении к препарату иммобилизованного фермента от 1:1 до 20:1. Смесь -лиофильно высушивают Перед использованием препарат суспендируют в 0,01 М ацетатном буфере , рН 4,5 и удал ют наполнитель путем отмывани  буфером на колонке или с помощью центрифугировани . Активность препаратов, определенна  по гемоглобину в качестве субстрата , приведена ниже в виде процентного отношени  активности лиофильно высушенных препаратов к активности исходного препарата до лиофилизации Без наполнител 9Example. 20 mg of pepsin of a pig immobilized on aerosil are suspended in 1 ml of water containing inert soluble filler in a weight ratio to the preparation of immobilized enzyme from 1: 1 to 20: 1. The mixture is lyophilized dried. Before use, the preparation is suspended in 0.01 M acetate buffer, pH 4.5 and the filler is removed by washing with a buffer on a column or by centrifugation. The activity of the preparations, determined by hemoglobin as a substrate, is given below as a percentage of the activity of lyophilized preparations to the activity of the original preparation prior to lyophilization Without filler 9

С глицином в соотношении 10:116 20:125 С глюкозой в соотношении 1:150 10:153 С сахарозой в соотношении 1:144 20:1 .63 .С поливинилпирролидоном (MB 25000) 1:167 10:175 С декстраном . (MB 500000)With glycine in the ratio 10: 116 20: 125 With glucose in the ratio 1: 150 10: 153 With sucrose in the ratio 1: 144 20: 1 .63. With polyvinylpyrrolidone (MB 25000) 1: 167 10: 175 With dextran. (MB 500,000)

. 1:125 . 1: 125

С полиэтиленгликолем (МБ 3000) 1:178With polyethylene glycol (MB 3000) 1: 178

С NaCE в соотношении 1:1 21With NaCE in the ratio 1: 1 21

10:1 31 20:1 3510: 1 31 20: 1 35

Пример 2. 20 мг куриного пепсина, иммобилизованного на диатомите , консервируют аналогично иммобилизованному пепсину свиньи.Example 2. 20 mg of chicken pepsin immobilized on diatomite, canned similarly immobilized pepsin pigs.

Активность по гемоглобину лио0 фильно высушенных препаратов, %: Без наполнител 50Hemoglobin activity of lyophilized preparations,%: Without filler 50

С глицином в соотнс иении 1:160With glycine in a ratio of 1: 160

10:16710: 167

5 Пример 3. 20 мгпротосубтилина , иммобилизованного на сфероне АгА 1000, .суспендируют в 1 мл 0,01 М фосфатного буфера, рН 8,0 и консервируют аналогично консервации и;«пиобилизованного пепсина. Активность лиофильно высушенных препаратов по гемоглобину, %:5 Example 3. 20 mg protosubtilin immobilized on SpheroAAA 1000 is suspended in 1 ml of 0.01 M phosphate buffer, pH 8.0, and preserved similarly to preservation and; “pyobilized pepsin. The activity of freeze-dried preparations for hemoglobin,%:

Без наполнител 80Without filler 80

С глюкозой в соотношении 1:193 С полиэтиленгликолем (MB 3000) 1:1 86 Пример 4. 20 мг протосубтилина , иммобилизованного на энзакриле АА, консервируют аналогично консервацииWith glucose in the ratio 1: 193 With polyethylene glycol (MB 3000) 1: 1 86 Example 4. 20 mg of protosubtilin immobilized on AA enzacryl can be preserved similarly to preservation

протосубтилина, иммобилизованного на сфероне. Активность лиофильно высушенных препаратов по гемоглобину , %:Protosubtilin immobilized on spherone. The activity of freeze-dried preparations for hemoglobin,%:

Без наполнител 74Without filler 74

5 с глюкозой в соотношении 1:1100 С полиэтиленгликолем (MB 3000) 1:1935 with glucose in the ratio 1: 1100 With polyethylene glycol (MB 3000) 1: 193

Claims (6)

1.Способ консервации иммобилизованных ферментов путем лиофильного1. The method of preservation of immobilized enzymes by lyophilic высушивани  их суспензии в воде или буфере, отличающийс  тем, что, с целью уменьшени  потери активности фермента при высушивании, к суспензии добавл ют инертный растворимый наполнитель при соотношении фермент:наполнитель 1:(1-20).drying their suspension in water or a buffer, characterized in that, in order to reduce the loss of enzyme activity upon drying, an inert soluble filler is added to the suspension at an enzyme: filler ratio of 1: (1-20). 2.Способ по П.1, отличающий с   тем, что в качестве инертного наполнител  используют неорганические соли, например поваренную2. The method according to claim 1, characterized in that inorganic salts are used as an inert filler, for example, cooking соль.salt. 3.Способ по П.1, отличающийс  тем, что в качестве инертного наполнител  используют аминокислоты , например глицин.3. A method according to claim 1, characterized in that amino acids, for example glycine, are used as the inert filler. 4. Способ по П.1, отличающийс  тем, что в качестве инертного наполнител  используют углеводы , например глюкозу, сахарозу.4. A method according to claim 1, characterized in that carbohydrates, such as glucose, sucrose, are used as the inert filler. 5. Способ по П.1, отличающ и и с   тем, что в качестве инер594328065. The method according to Claim 1 is also distinguished by the fact that, as iner59432806 тного наполнител  используют водораст- Источники информации,tolnogo filler use water sources. Information sources воринфле полисахариды, например дек-прин тые во внимание при экспертизе стран.Vorinfle polysaccharides, for example, Dec-taken into account in the examination of countries. 6.Способ по п. 1, отличаю- 1. Патент США 3133001,6. The method according to claim 1, characterized by- 1. US patent 3133001, щ и и с   тем, что в качестве инер-кл. 195-68, опублик. 12.05.64.u and with the fact that as inerkl. 195-68, published. 12.05.64. THot-o напсшнител  используют поли- 5THot-o pickups use poly- 5 спирты, например полиэтиленгликоль. 2, Крылова ГО.И., Козлов Л.В., Ан7 .Способ ПОП.1, отличаю-тонов В.К. Гаина Б.С., Датунашвили щ и и с   тем, что в качестве инерт-Е.Н., Павленко Н.М. Иммобилизаци  ного наполнител  используют водораст-кислых протеиназ. - Виоорганичесворимые синтетические полимеры, ю хими  , 1976, вып.2, с.273 например псливинилпирролидон,(прототип).alcohols, for example polyethylene glycol. 2, Krylova GO.I., Kozlov L.V., An7. Method POP.1, distinguished tones V.K. Gaina B.S., Datunashvili, and with the fact that, as inert-E.N., Pavlenko N.M. Immobilization fillers use water-acid protease. - Vioorganic synthetic polymers, Yu Chem., 1976, issue 2, p. 273 for example psylvinylpyrrolidone, (prototype).