Изобретение относитс к микробио логической промышленности, а именно к способу получени рибофлавина (В,). Витамин В, 2 пмроко используетс в сельском хоз йстве, в основном в качестве кормовых добавок сельскохоз й ственным животным, а кристаллический рибофлавин примен етс в пищевой и фармацевтической промышленности. Рибофлавин ползгчают химическим способом , а также путем микробиологического синтеза. Известен способ микробиологического производства рибофлавина путем использовани культуры гриба Егеmothecium ashbyii на соевой ферментационной среде, содержащей тидрол и кукурузный экстракт f 1J. За 96 ч процесса ферментации накапливаетс до 2000 мг/л В,. К недостаткам такого способа следует отнести длитель ный период роста культуры, вследстви чего увеличиваетс продолжительност . ферментации,и поБЬЩ1енную чувствитель кость к загр знению посторонней микрофлорой. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту вл етс способ получени рибофлавина витамина Bj путем культивировани его продуцентов-микроорганизмов вида Bacillus subtilis на питательной среде, содержащей 8% глюкозы в качестве источника углерода, мине-раль ные соли и источники ростовых вещес дрожжевой экстракт, пептон, глутами новую кислоту, препараты РНК, пурины и аналоги пуринов 2 . За 44 ч процесса ферментации накапливалось до 560 мг/л рибофлавина. Недостатками способа вл етс сравнительно низкий уровень активно ти, достигаёмьй культурой Bacillus .subtilis и необходимость в дорогосто щих и дефицитных компонентах фермен тационной и ростовой сред. Целью изобретени вл етс повышение выхода рибофлавина. Поставленна цель достигаетс тем, что в способе получени рибофл вина, предусматривающем глубинное культивирование продуцирующих его . микроорганизмов вида Bacillus subtilis в услови х аэрации на питател ной среде, содержащей источник угле рода, азота, необходимые минеральны соли в присутствии источников ростовых веществ, в качестве продуци22 . рующих рибофлавин микроорганизмов из вида Bacillus ,subtilis используют| штамм Bacbillus subtilis ВНИИгёнетика-304 или ВНИИгенетика-304а. При этом культивирование ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода сахар-сырец или мелассу, а в качестве источников ростовых факторов используют белково-витаминный концентрат или его гидролизат или автолизат, или пищевые дрожжи, или дрожжевой экстракт. Используемые штаммы-сверхсинтетики сконструированы генетическими методами из независимо полученных мутаций, кажда из которых приводит к сверхсинтезу витамина: ros - ribc - AGR (устойчивость к розеофлавину ros, мутаци в генерегул торе ribs, устойчивость к 8-азагуанину AGH). Затем проводилась мутагенна обработка нитрозогуанидином , нитрозометйлмочевйной , облучение ультрафиолетом и селекци активных вариантов на ферментационной среде. Штамм ВНИИгенетика-304-прототроф, штамм ВНИИгенетика-304а - ауксотроф с неидентифицированной ростовой потребностью. Оба штамма олигоспорогенные , на всех средах количество спор по сравнению с исходным штаммом снижено на 3-4 пор дка. Способ осуществл ют следующим образом. Культуру ВНИИгенетика-304 или ВНИИгенетика-304а выращивают на агаризованной среде Хоттингера или м со-пептонном агаре (МИЛ) в течение 1-2 суток при температуре 28-37С. Затем суспензию клеток передают в колбы с посевной средой, содержащей мелассу, БВК и минеральные соли, либо в картофельную посевную среду, либо МПБ. Посевной материал выращивают в течение 17-24 ч на качалке 200 об/мин. Затем посевной материал передают в количестве 5-10% в основную ферментационную среду. Процесс ферментации осуществл ют в колбах Эрленмейера на качалке, либо в ферментере при интенсивном перемеши вании и аэрации в течение 46-50 ч при температуре , рН 6,5-7,5 (в начале ферментации) на питательной среде, содержащей источники углерода, например глюкозу, сахароЗУ , сахар-сырец, Мелассу, крахмал; источники минерального азота, например соли аммони , мочевины нитра ты;, соли фосфора, например, фосфата кали , аммони и другие соли; соли (MnCl2, MnSO), а также источники ростовых факторов, например, биомассу кормового дрожжевого белка (БВК), гидролизаты и автолизаты БВК пищевые дрожжи, дрожжевой экстракт, кукурузную и соевую муку, кукурузньш экстракт., гидролизат казеина, пептон. Через 46-50 часов ферментации в культуральной жидкости накапливаетс 700-1000 мг/л рибофлавина. Пример 1. Односуточную кул туру Bacillus subtilis ВНИИгенетика-304 , вьфащенную на кос ках МПА, пересеивают на жидкую посевную среду , содержащую 6% мелассы, 1% БВК и минеральные соли .Посевна среда готовитс разведением пополам стериль ной водой ферментационной среды, состав которой приведен ниже. Вьфащивание посевного материала провод т в колбах Эрленмейера, объемом 750 МП (объемсреды 25-100 мп), на качалке 200 об/мин при в течение 17 часов и передают в количестве 10% в ферментационную среду следующего состава, %: Меласса БВК . (NH)2SO 0,2 1,4 0,6 КН2Р04 0,01 , (цитрат Na) 0,1 РН 7,0-7,2. Ферментацию осуществл ют в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл (объем среды 25 мл) на качалке 209 ПР 37°С. Через 48 ч фер ментации культуральна жидкость содержит 700-1000 мг/л рибофлавина. Пример 2. Аналогичен приме
ру 1, только используют штамм Bacilfus subtilis-304a.
Пример 3. В качестве продуцента также 1спользуют штаммы ВНИИгенетика/304. Ферментационна среда и услови ферментации, как указано в примере 1. Отличием вл етс состав посевной среды, котора готовитс следующим образом. Картофель очищают от кожуры, режут на куски и заливают небольшим количеством воды, после чего стерилизуют при 0,8-1 атм. Посевную среду заМаксимальный выход рибофлавина в предлагаемом способе составл ет 1000 мг/л за 48 ч роста культуры на синтетических или комплексных средах, что на 40% превосходит активность штаммов-прЗдуцентов в прототипе . Кроме того, в отличие от указанного прототипа, используют более простые среды, не содержапще дорогосто щих компонентов.
Получение рибофлавина прехшагаемым способом обладает р дом преимуществ по сравнению с действую- 24 севагот с кос ков МПА, культура растет в колбах на 750 мл (объем среды 50-100 мл) на качалке при 37С в течение 24 ч. Ферментацион-о ную среду засевают 10% посевного материала, ферментацию провод т, как в примере 1. Через 48 ч ферментации культуральна жидкость содержит 700-1000 мг/л рибофлавина. Пример 4. Так же как в примере 3, только используют щтамм Bacillus subtilis-304a. Пример 5. Культура, посевна среда, услови ферментации, как в примерах 1,2 и 3. Отличием вл етс состав ферментационной среды,%: . Сахароза (или сахар-сырец) 12-14 БВК.,,. 3-4 Минеральные соли, как в примере 1. Через 48 ч ферментации культуральна жидкость содержит 7001000 мг/л рибофлавина. Пример 6. Односуточную культуру штамма ВНИИгенетика-304 с кос ков МПА перенос т в посевную среду МПБ, на которой 8-10 ч на качалке при готовитс -посевной материал. В количестве 10% посевной материал переноситс в ферментационную среду, имеющую состав , %: Глюкоза 8 Дрожжевой экстракт Гидролизат казеина или пептон Минеральные как в примере 1. рН 7,1-7,2. Ферментаци длитс 44-50 ч при в колбах на качалке 200 об/мин. Через 48 ч ферментации культуральна жидкость содержит 700-1000 мг/л рибофлавина. щими в насто щее врем произвол- ством рибофлавина с помощью аскомицета Eremotheaum ushbyii (базоВЫ4 способом). Помимо уже упоминавшейс меньшей требовательнос к составу питательных сред в пред лагаемом способе почти вдвое сокращаетс врем ферментации (48 ч
Культурапьно-морфологическа характеристика штаммов-продуцентов рибофлавина Вас. subtilis ВНИИгенетика-304 и ВНИИгенетика-304а. Штамм ВНИИгенетика-304 Морфологи под микроскопом Морфологи на разных средах М со-пептонный агар (МПА) М со-пептонный бульон (МПБ)
На 2 сутки роста обрасреда глюкозой зует колонии диаметром 2-3 мм, рко-желтого цвета, флоурисцируют в УФ-лучах желтым цветом, колонии круглые с гладким краем- , блест пще Физиологические свойства
Не растет на минимальной среде Штамм ВНИИгенетика-304а Спорообразующа граммположительйа палочка длиной 2-3 На 1-2 сутки роста при 28-37 с образует колонии с неровным краем, звездчатые,диаметром 3-4 мм, поверхность гладка , блест ща , цвет желтоватьй. Рост по уколу умеренный, в основном на поверхности среды -. Рост без качани на поверхности бульона в виде пленки. Растет при 20-42 С, оптимум 37С рН 5,0-9,0, оптимум 7,0-8,О. Углеводы: хорошо утилизируют глюкозу, сахарозу , крахмал. Спирты: утилизируют этанол, сорбитол Источники азота: хорошо усваивает аммоний, мочевину, нитраты. Желатину разжижает. вместо 72-96 ч), а также уменьшаетс возможность загр знени культуры посторонней микрофлорой. По сравнению с прототипом предлагаемый способ характеризуетс более высоким 5фовнем выхода прод1гкта и возможностью использовать простые и доступные по составу среды.