SU889003A1

SU889003A1 - Способ получени диагностической псевдотуберкулезной сыворотки

Info

Publication number: SU889003A1
Application number: SU792773922A
Authority: SU
Inventors: Валерия Евгеньевна Сидорова; Валентина Владимировна Колесникова; Майя Фоминична Дзадзиева
Original assignee: Владивостокский Научно-Исследовательский Институт Эпидемиологии И Микробиологии
Priority date: 1979-06-01
Filing date: 1979-06-01
Publication date: 1981-12-15

Description

I

Изобретение относитс к микробиологии и касаетс получени диагностических препаратов.

Известен способ получени диагностической псевдотуберкулезной сыворотки путем выращивани псевдотуберкулезных микробов на питательной среде с последующей иммунизацией животныхпродуцентов: и отделением сыворотки крови 0.

Однако известный способ не обеспечивает , получени сыворотки с высокой специфичностью.

Целью изобретени вл етс повышение специфичности сыворотки.

Эта цель достигаетс тем, что способ получени диагностической псевдотуберкулезной сыворотки осуществл ют .путем выращиёани псевдотуберкулезных микробов на питательной среде с последующей иммунизацией животныхпродуцентов и отделением сыворотки крови, псевдотуберкулезный микроб выращивают при 10-12 С, выдел ют специфический поверхностный, антиген и иммунизацию провод т однократно в дозе 0,1-0,15 мл с содержанием белка 100 мкг/мл физиологического раствора .

Согласно предлагаемому способу получени псевдотуберкулезных сывороток дл иммунизации используют высокоспецифический поверхностный антиген , полученный из микробной клетки ;У. pseudotuberpulosiS без нарушени его природной структуры. Выделенный комплекс вл етс сильным антигенным раздражителем способным даже при однократной иммунизации вызывать ги1S периммунный ответ макроорганизма. Дл иммунизации кроликов выдел ют поверхностную субстанцию псевдотуберкулезного микроба наиболее щад щим способом - механической дезинтегра20 цией, что обеспечивает сохранение вещесТ:ва в нативной форме. Далее из поверхностной субстанции осаждают высокомолекул рную фракцию центрифугированием при 35000 q. Эту фракцию затем перераствор ют в небольшом, объеме низкомолекул рной фракции (супернатанте ). Иммунизаци кроликов смесью этих фракций с превалированием высокомолекул рного компонента обеспечивает острый иммунный ответ животных.

Дл иммунизации кроликов используют антиген в низких концентраци х по белку (10-15 мкг) дл одноразового внутривенного введени вещества. Антиген, вз тый в дозе менее 10 мкг, гуморального ответа не вызывает. .Использование же антигена в дозе, превышающей 15 мкг, вызывает иммунологический паралич. Дл получени специфических диагностических псевдотуберкулезных сывороток оптимальной дозой вводимого препарата вл етс 10-15 мкг в 0,1 мл физиологического раствора.

Пример. Материалом дл иммунизации кроликов служит комплекс поверхностных антигенов псевдотуберкулезного микроба. Чтобы получить его культуру микроба выращивают в течение 2-3 суток на м со-пептонном агаре при 10-12 С, что позвол ет сохранить микроорганизмы в S-форме (в стабильном состо нии). Затем культуру смывают физиологическим раствором с фосфатным буфером (рН 7 , 2-7 ,) .центрифугируют при 5500-6000 g об/мин в течение 30 мин и двукратно отмывают этим же раствором, центрифугируют культуру по 30 мин. Надосадочну жидкость удал ют. Осадок ресуспендируют до концентрации 200 в физиолгическом растворе с фосфатным буфером (рН 7,,), а поверхностный антиген отдел ют на механическом дезинтеграторе в течение 15 мин, дающий 3000 колебаний в минуту. После отделени поверхностной субстанции бактерии осаждают центрифугированием при босо об/мин в течение 30 мин и удал ют. Суспернатант консервируют мертиолатом натри (1:5000-1:10000, экспозици 1 ч при 4°С) и вновь центрифугируют при 9000 об/мин (дл удалени единичных бактерий). Осадок удал ют, а супернатант центрифугируют при 37000 q в течение 2-х часов при 4°С. Полученный осадок (высокомолекул рную фракцию поверхностного антигена) перераст.вор ют в минимальном количестве (1/5 часть) суспер- нанта (низкомолекул рна фракци ),

определ ют количество белка по Лоури и развод т до концентрации 100 мкг белка в 1 мл физиологическим раствором .

Схема иммунизации животных. Кроликов весом 2, кг однократно иммунизируют внутривенно в краевую ушную вену в дозе 0,1 мл (10-15 мкг белка) препарата, растворенного в 0,1 мл физиологического раствора. Через 8 дней провод т пробное вз тие крови и определ ют титр гемагглютининов . 8 зависимости от индивидуальной чувствительности животных титры антител колеблютс в пределах 1/6 00-1/51300. Дл иммунизации животных используют антиген, приготовленный согласно предлагаемому способу , который развод т физиологическим раствором до концентрации 100 мкг белка, определенного методом Лоури. После установлени титра антител животных обескровливают, отдел ют сыворотку , лиофильно сушат и хран т в холодильнике при °С. Срок хранени (срок наблюдени ) более года.

Специфичность сывороток проверили в реакции непр мой гемагглютинации с чумным антигенным диагностикумом и в реакции агглютинации с живыми культурами S. enteritidis, S. paratyphi Е, Е. coli 0-12, с вакцинным штаммом чумного микроба (EV) и диагностикумом брюшного тифа.

Сыворотки, приготовленные по известному способу, давали положительные РИГА и РА с чумным эритроцитарным антигенным диагностикумом и вакцинным штаммом чумного микроба (EV/) в разведении 1:50. Сыворотки,приготовленные предложенным способом, имеют положительные РИГА и РА с указанными диагностикумами в разведени х 1:АО и 1:20 соответственно. С остальными культурами реакции оказались отрицательными .

Полученные диагностические превдотуберкулезные сыворотки обладают до.статочной чувствительностью, высокой специфичностью, имеют высокую концентрацию антител и найдут широкое применение в баклаборатори х санэпидстанций с целью диагностики псевдотуберкулеза и установлени серологической принадлежности возбудител заболевани . Сроки получени этих сывороток в 2раза короче известного ранее способа, что экономически более выгодно.

58890034

Claims

Формула изобретени выращивают при 10-12°С, выдел ют

Способ получени диагностической и иммунизацию провод т однократно псевдотуберкулезной сыворотки путем в дозе 0,1-0,15 мл с содержанием белвыращивани псевдотуберкулезных мик- s ка 100 мкг/мл физиологического растробов на питательной среде с после- вора.

дующей иммунизацией животных-проду-Источники информации,

центов и отделением сыворотки крови, прин тые во внимание при экспертизе отличающийс тем, что, 1, Королюк A.M. Серологическа с целью повышени специфичности сы- (в диагностика псевдотуберкулеза. Канд. воротки, псевдотуберкулезный микроб дис. Л., 1971.

специфический поверхностный антиген