SU884576A3 - Способ получени д-фенилглицина и его производных - Google Patents
Способ получени д-фенилглицина и его производных Download PDFInfo
- Publication number
- SU884576A3 SU884576A3 SU792770401A SU2770401A SU884576A3 SU 884576 A3 SU884576 A3 SU 884576A3 SU 792770401 A SU792770401 A SU 792770401A SU 2770401 A SU2770401 A SU 2770401A SU 884576 A3 SU884576 A3 SU 884576A3
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- derivatives
- carbamoyl
- amino acid
- hydrolysis
- cells
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
1
Изобретение относитс к технике ,получени 0-фенилглицина и его произiводных и может быть использовано в микробиологической и фармацевтической 5 промышленности.
Известен способ получени оптически активных аминокислот путем ферментативного гидролиза их производных, например фенилглицина или его произ- tO водного микроорганизма Agotobactes СИОднако известный способ сложен и не предусматривает высокого выхода целевого продукта с необходимой оптической чистотой.
Известен также способ получени 0фенилглицина и его производных путем ферментативного гидролиза рацематов 5-фенилгидантоина и его производных 2.
Однако процесс ферментативногогид-2о ролиза по этому способу сложен, так как он ведетс в несколько стгщий.
Цель изобретени - упрощение процесса .
Поставленна цель достигаетс тем,25 что согласно предлагаемому способу получени 0-фенилглицина и его производных путем ферментативного гидролиза рацематов 5-фенилгидантоина и его производных, ферментативный гидролиз о
рацематов 5-фенилгидантоина и его производных осуществл ют штаммом Agrobacterium sp. NRRL В 11291. Способ осуществл ют следующим обра:3Ofj| .
Ферментативный гидролиз рацематов 5-фенилгилантоина и его производных осуществл ют штаммом Адrobacteriurn sp. NRRL В 11291.
Штамм Agrobacteriurn sp.NRRL В 11291 имеет следугацие свойства.
Микроскопическа морфологи обра- зована дискретными стержн ми, иногда спаренными, грамм-отрицательный, 0,8х х1,5-2,0 мк, капсулы и споры отсутствуют , передвижение с помощью перитрихиальных жгутиков. Макроскопическа морфологи образована колони ми на агаровой питательной среде, выпуклые кра равные, кремового цвета, прозрачные, диаметр 0,5-1 мм, поверхность гладка , буйный рост на кальций глицерофосфат-маннит-агаре с побурением и образованием гало.
Биохимические свойства. Выращивание от 4°С до 39°С на всех простых лабораторных средах без ростовых факторов и аминокислот, использу NH, jNO или аминокислоты в качестве единственного источника азота, оксидаза - положительно, каталаза - положительно , нитриты получены из нитратов . Лакмусовое молоко - серо-коричневое . Усвоение карбогидратов - окисление . Штамм Адrobacteriurn sp. NRRL В 11291 выделен Северным региональным научно-исследовательским центром Пеории , шт. Иллинойс (CIiIAj . Микроорганизмы рода Адrobacteriurn выращивают в аэробных услови х в куль туральной среде, содержащей источни|Ки азота, углерода, фосфора и мине- , ральных солей при температуре от 20 до 40°С, предпочтительно от 26 до 35°С, в течение от 10 до 48 ч, предпочтительно от 20 до 30 ч, при рН 6,0-8,0, предпочтительно от 7 до 7,5 В качестве источников углерода ис пользуют глюкозу, лактат, ацетат, лактозу и жидкость дл замачивани зерна. Источниками азота служат м сные гидролизаты, гидролиздты казеина и соевых бобов, соли аммони и мочевина , гидантоины и N-карбамоильные про изводные аминокислот. Культуральна среда содержит следующие ингредиенты, г: м сной пентон 5, м сной экстракт 5, глюкоза 5 и во да дистиллированна 1000 мл, рН равно 7,0-7,2. D-аминокислоты получают непосредственно в ферментативной среде, содержащей OL-гидантоин или ОL-N-кар бамоильные производные аминокислот как в виде единственных источников азота, так и совместно с обычными и точниками азота. О-аминокислоты получают также пу тем использовани микробной суспенз в виде поко щихс клеток или ее экс рактов . Экстрагирование из бактериальной суспензии ферментативных комплексов осуществл ют известным способом, прин тым в ферментологии. Клетки ра рушают в соответствующем аппарате, например во французском прессе с да чиком давлени , гомогенизаторе Монт на Галинга, вращательных дезинтегра TOpaXj а также с помощью ультразвуковых вибраторов. Гидролиз гидантои нов или Н-карбамоильнвх производны аминокислот осуществл ют путем доба лени в реакционную- смесь фермента в следующих формах; свежие клетки; клетки, выпущенные при температуре ниже 0°С, модифицированные клетки ацетоновый порошок, либо .серые или очищенные экстракты. Пример. Готов тбулЬон, содержащий следующие ингредиенты, г м сной пентон 5; м сной экстракт 3) глюкоза 5 и дистиллированна вода 1000 мл. G помощью соды рН среды овод т до 7,2, после чего кульуральную среду раздел ют на порции о 100 мл и каждую помещают в колбу 500 мл емкостью.. Стерилизуют 30 мин при 110°С и в колбы заседают культуру штамма: № 1302 из бкошенного агара, содеращего ту же среду с добавлением 2%-ного агара (OJFCO) и выращивают 24 ч при с перемешиванием при скорости вращени мешалки 220 об/мин. Из этой предкультуры (Д.О. при 550 нм: 0,250ддХ1:10 высевают 1 мл в п ть колб по 500 мл, содержащих 100 мл той же среды, после чего культуру выращивают при 30°С и перемешивании при 220 .об/мин в течение 24 ч (Д.О. при 550 нм - 0,.250 дл 1:10. Затем эти клетки собирают, промы вают в физиологическом растворе и суспендируют в 100 мл пирофосфатного буферного раствора (0,1 м рН 1,1) , содержащего 10 г 0,ь-5-фенилгидантоина , при 40°С под слоем азота Y PP., Через 200 Ч выращивани при этих услови х осуществл ют полный гидролиз с образованием аминокислоты(Гфенилглицин ), что отмечено посредством пол риметрического анализа реакционной смеси и тонкослойной хроматографии (проведенной в соответствии с методикой, описанной Сузуки в Джорнал ов хроматографи 80, 1973,. 199204 ). О-фенилглицин выдел ют из реакционной смеси путем осаждени белков с помощью трихлоруксусной кислоты и отделени их центрифугированием, при этом рН довод т до изоэлектрической точки 5,8. Осадок промывают водой и высушивают в вакууме. Идентичность 0-фенилглициновой аминокислоты подтверж даетс инфракрасным спектром и спектром дерного магнитного резонанса. .Удельна оптическа сила равна ( ( в 1 н растворе НС1) по сравнению с величиной D, равной -157,8 дл чистой амин.окислоты (по литературным данным). П р и м е р 2. Клетки, полученные , как описано в примере 1, из 100 мл бульонной культуры суспендируют в 10 мл пирофосфатного буферт , iHoro раствора (0,1 М, рН - 7,7} и подвергают гомогенизации под воздействием ультразвука 10 мин при 5 С. Полученный гомогенат добавл ют к 500 мл раствора Д, L-N-кapбaмилфeнилглиl инa (20 мл) в пирофосфатном буферном растворе (0,1 М, рН-7,7) выращивают при 65 С. Кинетику реакции контролируют путем отделени аммони , высвобожденного в процессе гидролиза N-карбамоила с использованием фенол-гипохлоридного метода. После выращивани в течение 40 ч NHt-ион достигает концентрации 10 млмоль/Л, дсшее увеличени не
наблюдаетс . Реакционную смесь концентрируют в вакууме при . до 100 мл. Добавлением НС1 рН довод т до 5,8 и осадок собирают на фильтрат .е, а затем его раствор ют в 1 н растворе НС1, повторно осаждают с помощью Nci(7H при рН 5,8 и высушивают . Далее определ ют оптическое вращение , которое равно - . Инфракрасный спектр подтверждает идентичность аминокислоты.
Из фильтрата, значение рН которого осторожно довод т до 2,5 добавлением Зн нормального раствора нее в ванне со льдом, получают осадок, который затем шлпаривают до сухого состо ни и экстрагируют абсолютно 1КИПШЦИМ этанолом. После охлаждени используют спиртовой раствор, получа кристаллический осадок, который затем высушивают и исследуют методом тонкослойной хроматографии и инфракрасного спектра. Анализ подтверждает наличие чистого N-карбсииоилфенилглицина .
Удельное оптическое вращение равно ( 34° в 1 н растворе NaOH по сравнению с известным (данны литературы дл U - энантиомера..
П р и м е р 3. Из предкультуры, полученной, как описано в примере 1, засевают п ть колб по 500 мл, в каждой из которых содержитс 100 мл среды, состо щей из 5%-ного раствора жидкости дл замачивани зерна. Значение рН довод т едким натром до 7,8 и стерилизуют при 121°С 30 мин.
Культуру выращивают 24 ч при 30°С и перемешивании при 220 . Клетки отдел ют центрифугированием, промывают пирофосфатным буферным раствором (0,1 М, рН 7,7), а затем суспендируют в 100 мл такого же буферного раствора, содержащего Юг 5-параокси-О,L-фенилгидантоина, и выращивают при 40с под слоем азота VPP. Через 160 ч выращивани осущестл етс полный гидролиз с образованием аминокислоты (параоксифенилглицин -0(-)), что подтверждаетс пол рометрическим исследованием реакционной смеси тонкослойной хроматографией по методике Сузуки.
Аминокислоту вьадел ют осаждением белков с помощью трихлоруксусной кислоты , которые затем удал ют центрифугированием при рН 5,2, доведенном до изоэлектрической точки. Осадок промывают водой и вьасушивают в вакууме .
Идентичность аминокислоты подтвердаетс на основании инфракрасного спектра и спектра дерного магнитного резонанса. Удельное оптическое вращение равно(.с1lP -156 ,5 ( в 1 н растворе НС1) по сравнению с -161,2® дл чистой аминокислоты по литературным данным).
П р и м р 4. Используют клетки штамма Agrobacteriurn, полученные из 100 мл бульонной культуры, содержа™ щей в основе жидкость дл замачивани зерна и приготовленной, как описано в примере 1.
Пролитые клетки суспендируют в 10 мл пирофосфатного буферного раствора (0,1 М, рН 7,7)и модифицируют толуолом 15 мин при комнатной температуре и перемешивании. Суспензию
o добавл ют к 500 мл раствора N-карбамоил-1 ,L-параоксифенилглицина 20 мм пирофосфатном буферном растворе (0,1 М, рН 7,7 и выращивают при 65 С под слоем азота VPP. Кинетику
5 реакции контролируют определением алвкюни , высвобождаемого в результате гидролиза К-карбамоильного производного в соответствии с методом фенол-гипохлорита, как описано в примере 1. Через 18 ч выращивани
0 NH -ионы достигают концентрации 10 млмоль/л. Реакционную смесь концентрируют в вакууме при до конечного объема 100 мл. Концентрированной НС1 рН довод т до 5,2
5 образовавшийс осадок собирают на фильтре.
i 0-аминокислоту и Ы-карбамоил-1 вьщел ют и идентифицируют, как описано в примере 2.
0
Удельное оптическое вращение равно -157,2° и +171° по сравнению с известньали значени ми -161,2° и +175,4 дл чистых продуктов (по литературным данным.
5
П р и м е р 5. Клетки штамма Адrobacterium sp. готов т, как описано в примере 1. Несколько грамм cycneVзии влажных клеток взвешивают в пирофосфатном буферном растворе (0,1 М,
0 рН 7,7} и обрабатывают ацетоном на холоде. Ацетон удал ют фильтрованием , ацетоновый состав высушивают в вакууме при 35С до посто нного ве са. Высушенный материал гомогенизируют в ступке и порошок используют
5 дл испытаний ферментативной активности . Ацетоновый порошок анализируют на следующих субстратах: N-карбамоил-й {-)-аланин,Ы -карбамоил-D (-)валин, Ы-карбамоил-О (-)глутамино0 ва кислота; М-карбамоил Ь-(-) параоксифенилглицин, М-карбамоил0 (-) парамётоксифенилглицин, N-карбамоил L(+)-фeнилглицин N-карбамоил- О{-)-фенилаланин N-карбамо5 иЛ-С(+) - глутаминова кислота и Nкарбамоил-О (-)(2-тиенил -глицин.
Таким образом, получают 20 мл раствора каждого карбамоильного производного в пирофосфатном буферном растворе 0,1 М, рН 7,7, после чего к 10 мл
0 каждого раствора добавл ютс соответствук дее количество порошка, одинаковое дл каждого субстрата. Выращивание провод т под слоем азота VPP при 40°С и перемешивании в течение
5
1 ч; после чего измер ют количество образовавшейс аминокислоты, определ емое измерением в реакционных смес х концентрации NH -иона с помощью метода фенол-гипохлорида, как описано в примере 2.
При испытани х за 100 принимают гидролитическую активность в отношении к N-карбамоил -D(-) -параксифенилглицина .
Результаты испытаний приведены в таблице.
Примере. Готов т культуральную среду следукнцего состава,г: MgSO. 0,2; Nan НРО. - 1 ZHI) 6; 3; NH4.C1 2; NaCL 0,5; глицерин - 5, 5-фенил-1),ь-гидантоин0 ,1; дрожжевой экстракт 0,1 и дистиллированна вода 1000 мл.
По 100 мл среды помещают в колбы 500 мл емкостью, стерилизуют при 30 мин. Гидантоин стерилизуют фильтрованием. ,
Из предкультуры, полученной, как описано в примере 1, засевают 5 мл на колбу, после чего эту культуру выращивают 36 ч при и перемешивании при 220 об/мин мешалки. Затем клетки отдел ют центрифугированием и из надрсадочной жидкости выдел ют аминокислоту путем ее концентрировани и доведени до изоэлектрической точки.
Из 10 л обработанного таким образом бульона получают 11,2 г D (-) фенилглицина с удельным оптическим вращением (d-)i -156° ( в 1 н растворе НС1) по сравнению с извесным , равным - 157,8дл чистой аминокислоты (по литературным данным).
Пример. Готов т культуралную среду состава,г: MgSO. 0,2; .. 12Hij O 6; 3; 5-метил-гидантоин 2, NnCe 0,5, глюкза 1; дрожжевой экстракт 0,1 и дист лированна вода 1000 мл) рН 7.
Наименование субстрата
Ь(-)-аланин
N-Карбамоил0 .(-)-валин N-КарбамоилD (-)глутаминова М-КарбамоилL (+)глутаминова N-КарбамоилD (-)-параметокси Н-КарбамоилО (-)-фенилглицин N-Карбамоил1 (+)-фенилглицин N-Карбамоилч
D(-)-(2-тиенил)г N-Карбамрил . D(-)-фен илаланин N-КарбамоилКультуральную Ъреду порци ми по 100 мл помещают в колбы емкостью 500 мл, стерилизуют при 116°С 20 мин, метилгидантоин стерилизуют отдельно.
с из предкультуры, полученной, как описано в примере 1, высекают по 5 мл на колбу, после-чего культуру выращивают при и перемешивании при 220 об/мин мешалки в течение 24 ч.
Клеточную суспензию отдел ют центрифугированием из 100 мл среды, промывают в фосфатном буферном растворе (рН 7,5) и повторно суспендируют в 100 мл такого же буферного раствора, содержащего 4 г D ,L-5- 2-тиенил -гидантоина.
Реакционную смесь выращивают под слоем азота YPP при 40°С. Через 30 ч реакции гидролиз завериаетс с образованием aминoкиcлoтыБC- -(2тиенил-глицер на , которую выдел ют путем концентрировани реакционной смеси до объема 20 мл и рН до 5,6.
Идентичность аминокислоты подтвеждаетс инфракрасным спектром и спектром магнитного резонанса. ,
Удельное оптическое вращение(«1г -72,6° ( в ) по сравнению с -73,7° дл чистой аминокислоты (по литературным данным).
Таким образом, штамм Agrobacterlum продуцирует ферментный комплекс, который вызывает как гидролиз гидантоина до карбамильного производного целевой аминокислоты, так и гидролиз такого производного в соответствующую D -аминокислоту.
Предлагаемый способ получени Dфенилглицина и его производных обеспечивает получение последних одностадийно , что упрощает процесс, по сравнению с известными решени ми той же задачи.
Активность,%
57,5
34,25
21,7
О
100,0
81,25
О
40,7
50,0
Ы-Карбамоил-О (-) - паратоксифени51глицин
40,0
9884576 10
Claims (1)
- Формула изобретени на и его производных осуществл ютСпособ получени D-фенилглицина11291.и ..его п)оизводных путем ферментатив-Источники информации,(Нбго гидролиза рацематов 5-фенилгидан-тгрин тые во внимание при экспертизе,тоина и его производных, о т л и-5 1. Патент Японии 45-8635,ч щ и и с тем, что, с цельюкл. С 12D 13/06, опублик.1970.упрощени процесса. Ферментативный2, Патент СССР по за вкегидролиз рацематов 5-фенилгидрантои- 2381854/28-13, 1976.штаммом Agrobacterfurn sp. NRRL В
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU792770401A SU884576A3 (ru) | 1979-05-22 | 1979-05-22 | Способ получени д-фенилглицина и его производных |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU792770401A SU884576A3 (ru) | 1979-05-22 | 1979-05-22 | Способ получени д-фенилглицина и его производных |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU884576A3 true SU884576A3 (ru) | 1981-11-23 |
Family
ID=11257299
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU792770401A SU884576A3 (ru) | 1979-05-22 | 1979-05-22 | Способ получени д-фенилглицина и его производных |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU884576A3 (ru) |
-
1979
- 1979-05-22 SU SU792770401A patent/SU884576A3/ru active
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2589693B2 (ja) | L−2−アミノー4−(ヒドロキシメチルホスフイニル)−酪酸の製造法 | |
CS211400B2 (en) | Method of microbiological enzymatic production of d-aminoacids | |
FR2644178A1 (fr) | Micro-organisme de l'espece bacillus coagulans et procede utilisant ce micro-organisme pour produire de l'acide l(+)lactique optiquement pur | |
US5294546A (en) | Method for production of a growth factor for Bifidobacterium sp. | |
SU695565A3 (ru) | Способ получени клавулановой кислоты и ее солей | |
JPS6156086A (ja) | α−オキシ酸およびその塩の微生物学的製造法 | |
SU579901A3 (ru) | Способ получени 7-( - -аминофенилацетамидо)-дезацетоксицефалоспорановой кислоты (цефалексина) | |
SU884576A3 (ru) | Способ получени д-фенилглицина и его производных | |
SU1124889A3 (ru) | Способ получени производных @ -карбамилфенилглицина | |
SU952111A3 (ru) | Способ получени @ -галактозидазы | |
JPH01187090A (ja) | ε−ポリリシンの製造方法およびε−ポリリシン生産菌 | |
JPS6319158B2 (ru) | ||
CA1334741C (en) | Method for production of a growth factor for bifidobacterium sp | |
JPH03277292A (ja) | 光学活性な2―ヒドロキシカルボン酸の製造法 | |
JPS6291177A (ja) | セレン含有微生物菌体 | |
PL82808B1 (ru) | ||
KR100312637B1 (ko) | 발효에의한히알우론산의제조방법 | |
US4877734A (en) | Microbiologically produced α-acetylamino cinnamic acid acylase, method of its production and its use | |
SU622282A1 (ru) | Способ получени ферментного препарата N-ацетил-глюкозаминидазы | |
JPH01137973A (ja) | アシルアミノ酸ラセマーゼ、その製造法および用途 | |
SU306736A1 (ru) | Способ получени L-лизина | |
KR880002315B1 (ko) | 히아론산과 스트렙토 키나제를 동시에 생산하기 위한 스트렙토코커스속 미생물의 배양방법 | |
JPS6356278A (ja) | シユウドモナス属ns214菌及びd−アミノ酸の製造方法 | |
SU1111723A1 (ru) | Способ получени белкового гидролизата эритроцитарной массы | |
JPH02245187A (ja) | スーパーオキシドディスムターゼの製造法 |