SU840102A1 - Method of indicating intracell virus - Google Patents

Description

лированной водой (в цел х удалени  несв аавшейс  сыворотки) и подвергают не гативному контрастированию.water (to remove unbound serum) and undergo non-contrasting contrast.

При необходимости вы влени  и идентификации вирусов в ткан х и органах небольшие кусочки (около 1 мм ) последних помещают на металлическую пластинку , подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию, добавл ют 1-2 капли разведенной антисыворотки, ресуспендируют в ней лизированную ткань КО1ЩОМ пастеровской пипетки, снова подвергают трехкратному замораживанию . и оттаиванию и далее обрабатывают так же, как клетки культуры ткани.If it is necessary to detect and identify viruses in tissues and organs, small pieces (about 1 mm) of the latter are placed on a metal plate, subjected to threefold freezing and thawing, 1-2 drops of diluted antisera are added, the lysed tissue is resuspended with a SUSHIN Pasteur pipette, again subjected to a triple freeze. and thawing and further processed in the same way as tissue culture cells.

Пример. Вы вление и идентификаци  вируса Синдбис в культуре клеток почек китайского хом ка.Example. Identification and identification of Sindbis virus in Chinese Homulus kidney cell culture.

Вирус Синдбис обычным образом выращивают в культуре клеток почек китайкого хом ка в 1ОО мл флаконах при 37 С. Исходный титр вируса, используемого дл  заражени , составл ет 5-15 БОЕ/мл. Спуст  24 ч после заражени  клетки механически снимают со стекла и центрифугируют вместе с культуральной жидкостью в течение 5 мин при 100О об/мин. Над осад очную жидкост сливают, ее следы удал ют фильтровальной бумагой. К клеточному осадку добавл ют 1-2 капли иммунной сыворотки в разведении 1:10 и ресуспендируют в ней клетки концом пастеровской пипетки . Каплю полученной взвеси перенос т на металлическую пластинку диаметром 1-3 см и подвергают трехкратному замораживанию ц оттаиванию попеременным помещением пластинки на поверхность сухого льда и ладони руки. После этого каплю взвеси лизированных в результате замораживани  и оттаивани  и ресуспен- дированных в сыворотке клеток помещаю на предметное стекло и инкубируют в течение 15-ЗО мин во влажной камере (чашка Петри со смоченной водой фильтровальной бумагой). Затем на каплю накладывают предметные сетки, покрытые формваром и углеродом спуст  1-3 мкк ополаскивают юс дистиллированной водой и нанос т каплю фосфорновольфрамовой кислоты с рН 6,5, избыток которой удал ют краем фильтровальной бумаги. После этого сетки просматривают в электроном микроскопе при увеличении 4ОООО5О ООО. Вы5 вл ют одиночные или аггре- гированные вирусные частицы покрытые ареолом антител сыворотки. Контролем специф1гчности реакции служат клетки ресуспендированные в дистиллированной .The Sindbis virus is grown in the usual way in Chinese chicken cell culture in 1OO ml vials at 37 ° C. The initial titer of the virus used for infection is 5-15 PFU / ml. 24 hours after infection, the cells are mechanically removed from the glass and centrifuged together with the culture fluid for 5 minutes at 100 O rpm. Above the precipitate, the liquid is drained; its traces are removed with filter paper. 1-2 drops of immune serum are added to the cell pellet at a dilution of 1:10 and the cells are resuspended in it with the end of a Pasteur pipette. A drop of the obtained suspension is transferred onto a metal plate with a diameter of 1-3 cm and subjected to a threefold freezing and thawing by alternately placing the plate on the surface of dry ice and palm of the hand. After that, a drop of the suspension of cells lysed as a result of freezing and thawing and resuspended in serum is placed on a glass slide and incubated for 15 minutes in a moist chamber (Petri dish with water moistened filter paper). Then, subject grids are applied to the drop, coated with formvar and carbon after 1-3 μC are rinsed with distilled water and a drop of phosphorotungstic acid of pH 6.5 is applied, the excess of which is removed by the edge of the filter paper. After that, the grids are viewed in an electron microscope at 4OOOO5O magnification. You5 are single or aggregated viral particles coated with areola serum antibodies. The specificity of the reaction was controlled by cells resuspended in distilled.

воде, нормальной или 1етерологичной сыворотке.water, normal or 1terological whey.

П р и м е р 2 . Вы вление и вдентификаци  вируса клещевого энцефалита в культуре клеток почек эмбриона свиньиPRI me R 2. Detection and identification of tick-borne encephalitis virus in kidney cell culture of a pig embryo

Вирус клещевого Э1щефалита (штамм 718) выращивают обычным образом в пробирочной культуре клеток почек эмбрина свиньи. На 2-ые сутки после заражени  клеточный монослой механически снимают со стекла пробирки и далее обрабатывают согласно примеру 1, за исключением того, что иммунна  сыворотка используетс  в разведении 1:4. При электронномикроскопическом изучении в препаратах вы вл ют аггрегаты полных и пустых вирусных частиц.The tick-borne Eschefalitis virus (strain 718) is grown in the usual way in a test tube of pig embryonic kidney cells. On the 2nd day after infection, the cell monolayer is mechanically removed from the glass of the tube and further processed according to Example 1, except that the immune serum is used at a dilution of 1: 4. In electron microscopic studies, aggregates of complete and empty virus particles are revealed in the preparations.

П р и м е р 3 . Вы вление и идентификаци  вируса Западного Нила в культуре клеток комаров AedeBoeg vpti. Культуру клеток комаров А ciegvpti выращивают в 5О мл флаконах на обогащенной среде С-45 с 10% нормальной тел чьей сыворотки и инкубируют при 26°С После сформировани  моносло  клетки заражают вируссодержащей суспензией мозга новорожденных белых мыщей с титром .вируса 7,5-8,0 2.D 5О мл.PRI me R 3. Detection and identification of West Nile virus in AedeBoeg vpti mosquito cell culture. The ciegvpti mosquito cell culture is grown in 5O ml bottles on C-45 enriched medium with 10% normal bovine serum and incubated at 26 ° C. After the monolayer is formed, the cells are infected with a virus-containing suspension of the brain of newborn white mice with virus titer 7.5-8 0 2.D 5O ml.

После адсорбции вируса его удал ют из флаконов,клетки промывают ростовой сред9Й, добавл ют среду С-45 с 5% нормальной тел чьей сыворотки. Перевивки зараженной культуры провод т каждые 5-6 сут. После трех субку ьти- вирований зараженные культуры помещаю в услови  субоптимальной температуры (1О-20 с) на ЗО сут, мен   затем температурный режим на оптимальный (2бС). Дл  анализа берут материал на третьи сутки после заражени , на ЗО сут инкубации при субоптимальной температуре и на первом- пассаже после изменени  температурного режима на оптимальный. Обработку материала ведут согласно примеру 1. Иммунную сыворотк используют в разведении 1:5. В препаратах вы вл ют агрегаты покрытых антителами вирусных частиц.After adsorption of the virus, it is removed from the vials, the cells are washed with growth medium, C-45 medium is added with 5% normal bovine serum. Transformations of the infected culture are carried out every 5-6 days. After three days of treatment, the infected cultures are placed in suboptimal temperature conditions (10 ~ 20 s) for 30 days, then the temperature regime is at the optimum (2 ° C). For analysis, the material was taken on the third day after infection, on the DUT day of incubation at suboptimal temperature and on the first passage after changing the temperature to the optimum one. Material processing lead according to example 1. Immune serum is used at a dilution of 1: 5. Aggregates of antibody-coated viral particles are detected in the preparations.

П р и м е р 4 . Вы вление и идентификаци  вируса Западного Нила в мозгу йоворожденных белых мышей. Дл  заражени  используют слив культуральной жидкости с культуры- клеток комаров , хронически инфицированной вирусом Западного Нила, О ОЗ мл культуральной Ж1ЩКОСТИ ввод т в мозг новорождеш ых белых мьшей. На 3 сут после зарешени  мышей забивают, выдел ют небольшие кусочки (около I мм)PRI me R 4. Identification and identification of the West Nile virus in the brain of born white mice. For infection, the culture fluid from cultured cells of mosquitoes chronically infected with West Nile virus is used, OO ml of cultured culture is injected into the brain of newly born white mice. On day 3 after gauging, the mice are sacrificed, small pieces are isolated (about I mm)

коры головного мозга, помещают их на металлическую пластинку и подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию . Затем на кусочки ткани нанос т каплю неразведенной иммунной сыворотки ресуспендируЕот в ней частично лизнрован Ную ткань концом пастеровской пипетки, снова подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию и далее обрабатывают согласно примеру 1. При просмотре препаратов в электронном микроскопе вы вл ют аггрегированные сывороткой скоплени  вирусных частиц. Контролем специфичности реакции служат кусочки мозговой ткани ресуспендированной в иммунной сыворотке против вируса клещевого энцефалита.cerebral cortex, put them on a metal plate and subjected to a threefold freezing and thawing. Then, a drop of undiluted immune serum is placed on the tissue pieces and resuspended. The tissue is partially lined with the end of a Pasteur pipette, subjected to triple freezing and thawing again, and further processed according to Example 1. Serum aggregates of viral particles are detected by scanning the electron microscope. The specificity of the reaction is controlled by pieces of brain tissue resuspended in immune serum against tick-borne encephalitis virus.

П р к м е р 5 . Вы вление и индентификаци  вирусов, изолированного из москитов P1lEeboi:.oiiiU9 &РВирусом , изолированных из москитов Р п беЪоtowus Рзаражают интрацеребрально новорожденных белых мышей. На 3 сут после заражени  при про влении вьфаженных клинических 1физнаков заболевани  мышей забивают, вьщел ют кусочки коры головного мозга, которыеобрабатывают согласно примеру 4. В качестве иммунной сыворотки используют асцитную жидкость иммуннизированных вирусом белых мьпией. При просмотре препаратов в электронном микроскопе вы вл ют аггрегированные сывороткой частицы, характерные дл  группы рабдовирусов.EXAMPLE 5. Detection and identification of viruses isolated from P1lEeboi mosquitoes: .oiiiU9 & RVirus, isolated from mosquitoes Pnbotowus They infect intracerebrally newborn white mice. For 3 days after infection in the development of high-grade clinical diseases, mice are slaughtered, pieces of the cerebral cortex are prepared, which are processed according to Example 4. Ascites fluid immunized with white virus mopia is used as immune serum. When viewing drugs in an electron microscope, serum-aggregated particles characteristic of the rhabdovirus group are revealed.

Предлагаемый способ позвол ет проводить в отличии от существующих, вы вление и идентификацию внутриклеточного вируса как в клетках тканевых культур различного происхождени , так и в ткан х органов зараженных животныхThe proposed method allows, unlike the existing ones, the detection and identification of the intracellular virus both in cells of tissue cultures of various origins and in the tissues of organs of infected animals.

Способ  вл етс  быстрым, так как препараты готовы дл  просмотра и изучени  в электронном микроскопе через ЗО-5О мин после вз ти  материала, что в 3-5 раз быстрее способа иммунноэлоктронномикроскопического вы влени  вtфyсов с использованием высокоскоростного центрифугировани .The method is fast, as the preparations are ready for viewing and studying in an electron microscope through SO-5O min after taking the material, which is 3-5 times faster than the method of immunoelectronic microscopic detection of tfys using high-speed centrifugation.

Способ не требует использован|1  какого-либо специального оборудовани  или реактивов и может быть осущ€;ствленThe method does not require the use of any special equipment or reagents and can be carried out

на базе любой электронномикроскопичес- кой лаборатории.on the basis of any electron microscope laboratory.

Предлагаемый способ  вл етс  специфичным , так как аггрегаци  вирусных частиц имеет место лишь щзи использовании гомологичной иммунной сыворотки и отсутствует при ресуспевдировании клеток и тканей в дистиллированной воде, нормальной или гетерологичной сыворот ке. The proposed method is specific, since the aggregation of viral particles takes place only by using homologous immune serum and is not available when cells and tissues are resuspended in distilled water, normal or heterologous serum.

Claims (2)

Формула изобретени Invention Formula Способ индикации внутриклеточного вируса путем разрушени  вируссодержа25 щих клеток или кусочков органного материала замораживанием и оттаиванием, отличающийс  тем, что, с целью повышени  чувствительности и упрощени  способа, перед замораживани30 ем клетки или кусочки органного материала ресуспенаируют в иммунной сывороткеA method for indicating an intracellular virus by destroying vaccinated cells or pieces of organ material by freezing and thawing, characterized in that, in order to increase the sensitivity and simplify the method, before freezing, cells or pieces of organ material are resuspended in immune serum Источники информации, прин тые во внимание при экспертизеSources of information taken into account in the examination l.Doane F.W Ddentificoiticw of MIruse .s bv lynmunoebect-von ynicroscopv ViraC im unodiagnosis,Accid.l.Doane F.W Ddentificoiticw of MIruse .s bv lynmunoebect-von ynicroscopv ViraC im unodiagnosis, Accid. One N&wJovV,19l4,p..One N & wJovV, 19l4, p .. 2. Практическа  вирусологи . Под ред. Сюрина В. Н., М., Колос 1970, с. 9О-91.2. Practical virologists. Ed. Syurin V.N., M., Kolos 1970, p. 9O-91.