SU824054A1

SU824054A1 - Способ разделени липидов рыбьегожиРА HA фРАКции

Info

Publication number: SU824054A1
Application number: SU782600196A
Authority: SU
Inventors: Александр Иванович Демченко; Галина Анатольевна Заварзина; Геннадий Васильевич Стариков
Original assignee: Иркутский Государственный Медицинскийинститут
Priority date: 1978-04-05
Filing date: 1978-04-05
Publication date: 1981-04-23

Description

(54) СПОСОБ-РАЗДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ РЫБЬЕГО ЖИРА НА ФРАКЦИИ

колонки этилового эфира и метанола позвол ет элюировать нейтральные липиды и фосфолипиды. Дл элюировани неэстерифидированных жирных кислот, адсорбированных на силикагеле,примен ют 2% раствор муравьиной кислоты в эфире. Это позвол ет получить хро- 5 матографически чистую фракцию неэстерифицированных жирных кислот.

Применение дл элюировани фракции нейтральных липидов и фосфолипидов на второй хроматографической ко- Q лонке в качестве растворителей смеси . гексан-диэтиловый эфир в определенных соотношени х с воэрастаюшей долей пол рного компонента (за счет последо .вательного увеличени количества ди- е этилового эфира) позвол ет получать фракции липидов со все возрастающей пол рностью. Предлагаемые соотношени растворителей обеспечивают четкое разделение компонентов анализируемой .. смеси. Так, смесь растворителей гексан-диэтиловый эфир, вз тые в соотношении 98:2, позвол ет выделить наименее пол рную фракцию - эфиры стеринов . Промывание колонки этой же смесью растворителей, но вз той в 25 соотношении 90:10, где увеличена дол пол рного компонента (диэтилового эфира), позвол ет выделить более пол рную, по сравнению с предыдущей фракцией, фракцию триглицери- 30 дов, Использование же вышеуказанной системы растворителей в соотношении 80:20 еще более увеличивает пол рность смеси и позвол ет выделить близкие по пол рности фракции холе- 35 стерина и диглицеридов. Промывание хроматической колонки только диэтиловым эфиром в количестве 100-120 мл позвол ет элюировать моноглицериды наиболее пол рную фракцию. В послед- ... нюю очередь хроматографическую колонку промывают системой растворителей хлороформ-метанол (в соотношении 20:80), что обеспечивает выделение пол рных липидов (фосфолипидов).

Пример. В качестве объекта 45 исследовани берут навеску липидов медицинского рыбьего жира в количестве 80 мг, раствор ют в 2 мл хлороформа и нанос т на колонку 1. Предварительно выполн ют подготовку ко- 50 лонки 1, а именно: хроматографическую стекл нную колонку диаметром 1,2 см, высотой 30 см заполн ют силикагелем, предварительно обработанным следующим образом: силикагелБ дл колоночной 55 хроматографии обрабатывают 0,5 н. раствором едкого натра путем настаивани в течение 12 ч. Затем промывают водой до нейтральной реакции (по фенолфталеину), высушивают на воздухе и активируют при температуре в течение 12 ч. Навеску обработанного щелочью силикагел в количестве Б г суспендируют в 20 мл гексана и перенос т в хрюматографическую колонку. Дл стабилизации ко- 65

лонки пропускают 100 мл гексана под давлением. 2 мл раствора липидов в хлороформе нанос т на подготовленную щелочную хроматографическую к6лонку и ггосле поглощени раствора верхним слоем сорбента начинают раз деление липидов на фракции. Вначале отдел ют неэстерифицированные жирны кислоты от нейтральных липидов и фосфолипидов, пропуска через хрома тографическую колонку этиловый эфир в количестве 200 мл, который элюирует нейтральные липиды и часть фосфолипидов . Затем через колонку пропускают метанол в количестве 100 мл который освобождает неэстерифицированные жирные кислоты от фосфолипидо Скорость элюировани составл ет 2-3 мл в мин под давлением. Полученные элюаты, содержащие нейтральные и пол рные (фосфолипиды) липиды, объедин ют и растворители отгон ют- под вакуумом. Остаток липидов перераствор ют в 2 мл гексана и подвергают дальнейшему разделению на второй хроматографической колонке.

Неэстерифицированные жирные кислоты , адсорбировавшиес на щелочном силикагеле в виде солей, извлекают с первой хроматографической колонки

путем промывани ее 120 мл 2% раст ,вора муравьиной кислоты в эфире.За тем растворитель отгон ют под вакуумом , остаток перераствор ют .в минимальном количестве хлороформа (0,5 мл) и используют дл дальнейшего анализа. Смесь нейтральных липидов и фосфолипидов, освобожденную от неэстерифицированных жирных кислот , подвергают дальнейшему фракционированию на второй хроматографической колонке. Подготовку второй хроматографической колонки осуществл ют следующим образом: 5 г силикагел дл колоночной хроматографии активируют при в течение 12 ч, суспендируют в 20 мл гексана и взвесь перенос т в стекл нную хроматографическую колонку диаметром 1,2 см, высотой 30 см. Хроматографическую колонку кондиционируют путем пропускани 100 мл гексана.

Смесь нейтральных липидов и фосфолипидов , растворенную в 2 мл гексана , полученнук) с первой хроматографической колонки, нанос т на вторую хроматографическую колонку. После поглощени раствора липидов верхним слоем сорбента приступают к элюированию фракций.

Вначале колонку промывают 100 мл .смеси гексан-двэтиловый эфир (98:2) под давлением так, чтобы скорость элюировани составл ла 2-3 мл/мин, собира первую фракцию на выходе из колонки, вторую фракцию цолучают путем пропускани через хроматографическую колонку 120 мл смеси гександизтиловый эфир (90:10). Промыва колонку 120 мл смеси гексан-диэтиловый эфир, вз тых Б соотношении 80:20 получают третью фракцию. Затем через хроматографическую колонку пропу |кают 120 мл диэтилового эфира, собира четвертую фракцию. В последнюю очередь колонку промывают 100 мл сме «си хлороформ-метанол (20:80) и получают п тую.фракцию. Все полученные элюаты поочередно концентрируют путем отгонки раствори тел под вакуумом и используют в дальнейшем анализе. Дл идентификации полученных фракций, их чистоты и качества разде лени используют метод тонкослойной хроматографии на закрепленном слое силикагел , использу стекл нные пластинки размером 9x12 см. Пред;1агаемый пособ обеспечивает возможность повышени точности раз .делени липидов рыбьего жира на фрак ции, что улучшает качество и чистоту получаемых фракций.

Claims

Формула изобретени

Способ разделени липидов рыбьего жира на фракции путем нанесени его

Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1. Жейтс М. Техника липидологии. М., 1975, с. 121-135. на силикагель с последукицим элюированием фракций липидов органическими растворител ми-, отличающийс тем, что, с целью повышени точности способа, силикагель предварительно обрабатывсцот раствором щелочи, из нанесенного образца последовательно вначале этиловым эфиром, затем метанолом элюируют смесь нейтральных липидов и фосфолйпидов, после чего 2% раствором муравьиной кислоты в эфире элюируют неэстерифицированные жирные кислоты, далее смесь элюатов нейтральных липидов и фосфолйпидов концентрируют, помещают йа силикагель смесью гексана с диэтиловым эфиром, вз тых в соотношении 98:2, элюируют фракцию эфиров стеринов,после чего теми же элюэнтами в соотношении 80г20 э;поируют холестерин и, диглицериды, из оставшегос на силикагеле адсорбата вначале диэтиловым эфиром вымывают моноглицерйды, а затем смесью хлороформа и метанола в соотношении 20:80 элюируют фракцию фосфолйпидов.