SU794507A1 - Method of analysis in paper and thin-layer chromatography - Google Patents

Description

1one

Изобретение относитс  к аналитической химии, в частности к способам анализа методом бумажной и тонкослойной хроматографии .This invention relates to analytical chemistry, in particular to methods for analyzing by paper and thin layer chromatography.

Известны способы детектировани  п тен веществ на бумажных и тонкослойных хроматограммах после проведени  разделени  анализируемых смесей, сушки хроматограмм , а в отдельных случа х и обработки хроматограмм специальными реагентами (например, с целью визуализации или закреплени ).Methods are known for detecting spots of substances on paper and thin-layer chromatograms after separation of the analyzed mixtures, drying the chromatograms, and in some cases processing the chromatograms with special reagents (for example, for the purpose of visualization or fixation).

Известны также следующие способы: сканирование бумажных хроматограмм пучком ионизирующего излучени ; сканирование световым лучом в видимом диапазоне длин волн или УФ-диапазоие; сканирование хроматограмм соединений, меченных радио-активными изотопами, с помощью специальных радиометрических сканеров.. The following methods are also known: scanning paper chromatograms with an ionizing radiation beam; light beam scanning in the visible wavelength range or UV range; scanning of chromatograms of compounds labeled with radioactive isotopes using special radiometric scanners ..

Известен способ количественного изм.ерени  хроматографических п тен с помощью фотометрического устройства с раздвоителем светового пучка, четырех фотоумножителей , системы слежени  и обработки данных . Способ предполагает сканирование сухих хроматограмм, причем один из двух лучей просматривает область хроматограммы вне зоны п тен. Фоновый сигнал вычитаетс  из суммарного сигнала при ирохождении луча через хроматографические п тна 1.A known method for quantitative measurement of the chromatographic spots using a photometric device with a splitter of a light beam, four photomultipliers, a tracking and data processing system. The method involves scanning dry chromatograms, with one of the two rays viewing the chromatogram area outside the spot area. The background signal is subtracted from the sum signal when the beam passes through the chromatographic spot 1.

Описанный способ анализа тонкослойных хроматограмм, основанный на их сканировании в режимах оптической денситометрии , поглощени  или отражени  рентгеновского и Излучени  имеют принципиальный недостаток - нестабильность уровн  фона, вызванную неоднократностью сло  сорбента по его дине. Эта неоднородность, неизбежна  при нанесении сло  сорбента самыми лучшими аппликаторами, не сказываетс  на самом процессе разделени .The described method of analyzing thin-layer chromatograms based on their scanning in the modes of optical densitometry, absorption or reflection of X-ray and Radiation has a fundamental disadvantage - the instability of the background level caused by the repeated layer of the sorbent along its length. This heterogeneity, inevitable when applying a layer of sorbent with the best applicators, does not affect the separation process itself.

Известен также способ анализа в бумажной и тонкослойной хроматографии, заключающийс  в разделении смеси веществ при перемещении элюента по сорбенту и регистрации разности сигналов детекторов при прохождении через один из них анализируемых веществ 2.There is also known a method of analysis in paper and thin-layer chromatography, which consists in separating a mixture of substances when moving eluent along the sorbent and registering the difference in the signals of the detectors as the analytes 2 pass through one of them.

Недостатком описанного способа детектировани   вл етс  плоха  воспроизводимость результатов, получаемых при сканировании различных хромотограмм, и длительность анализа.The disadvantage of the described detection method is the poor reproducibility of the results obtained by scanning various chromatograms, and the duration of the analysis.

Целью изобретени   вл етс  сокращение времени анализа.The aim of the invention is to reduce the analysis time.

Поставленна  цель достигаетс  тем, что одновременно с разделением исследуемой смеси на параллельной пластине раздел ютThe goal is achieved by the fact that simultaneously with the separation of the studied mixture on a parallel plate,

эталонную смесь с тем же качественным составом компонентов, но с известной концентрацией и в процессе разделени  непрерывно регистрируют моменты полного разделени  определ емых веществ, после регистрации которых провод т их количественное определение и регенерацию сорбента. ное определение и регенерацию собента.A reference mixture with the same qualitative composition of the components, but with a known concentration, and during the separation process, the moments of complete separation of the detected substances are continuously recorded, after which they are quantified and the sorbent is regenerated. Node definition and regeneration soben.

Реализаци  предлагаемого способа при определении одного илн нескольких веществ по поглощению света достигаетс  путем выполнени  последовательности следующих операций:The implementation of the proposed method in determining one or several substances by the absorption of light is achieved by performing a sequence of the following operations:

1.Приготовление сло  сорбента, обеспечивающего отсутствие гидравлической св зи между трем  участками (дорожками) на длине сло , обеспечивающей разделение анализируемой смеси (например, бумага с разрезами).1. Preparation of a layer of sorbent, ensuring the absence of a hydraulic connection between the three sections (tracks) along the length of the layer, ensuring separation of the analyzed mixture (for example, paper with cuts).

2.Подготовка раствора свидетел  с заданной концентрацией каждого из искомых веществ.2. Preparation of the witness solution with a given concentration of each of the desired substances.

3.Подготовка хроматографической системы - установлени  непрерывного потока элюнрующей жидкости по трем дорожкам.3. Preparation of the chromatographic system — establishing a continuous flow of the eluting liquid along three tracks.

4.Одновременный ввод на гидравлически независимые участки сорбирующего сло  раствора-свидетел  (с известными концентраци ми искомых веществ) и пробы анализируемой смеси.4. Simultaneous input to the hydraulically independent areas of the sorbing layer of the witness solution (with known concentrations of the desired substances) and samples of the analyzed mixture.

5.Поиск максимума поглощени  зоны искомого вещества по дорожке с пробой и в растворе-свидетеле посредством перемещени  вдоль направлени  движени  хроматографических зон источника и приемника света (или при перемещении хроматографической системы относительного детектора).5. Search for the maximum absorption of the area of the desired substance along the track with the sample and in the witness solution by moving along the direction of the chromatographic zones of the source and the light receiver (or when moving the chromatographic system of the relative detector).

6.Поиск максимума поглощени  искомого вещества на дорожке с анализируемой смесью в той ее части, котора  соответствует обнаруженному (на дорожке с раствором-свидетелем ) максимуму поглощени .6. Search for the maximum absorption of the desired substance on the track with the analyzed mixture in the part that corresponds to the maximum absorption detected (on the track with the witness solution).

7.Определение количественного содержани  искомого вещества по отнощению интенсивностей поглощени  (за вычетом поглощени  чистого элюента, идущего по отдельной контрольной дорожке) в анализируемой смеси и в растворе-свидетеле.7. Determination of the quantitative content of the desired substance by the ratio of the absorption intensities (minus the absorption of the pure eluent going along a separate control track) in the analyzed mixture and in the witness solution.

8.Регенераци  хроматографической системы сразу же после количественного определени  содержани  искомого вещества8. Regenerate the chromatographic system immediately after quantifying the content of the desired substance.

в анализируемой смеси (не ожида  прохождени  этой и всех остальных хроматографических зон до конца сло  сорбента) посредством подачи элюента с нарастающей концентрацией дл  промывки зон ввода.in the analyzed mixture (do not wait for this and all other chromatographic zones to pass to the end of the sorbent layer) by introducing an increasing concentration of eluent for washing the injection zones.

Иллюстрацией предложенного способа может служить работа экспериментальной установки, разработанной и построенной в СКВ аналитического приборостроени  АН СССР в пор дке выполнени  служебного задани  по плановой теме.An illustration of the proposed method can be the work of an experimental setup designed and built in the SCR of analytical instrumentation of the Academy of Sciences of the USSR in the order of fulfilling an official task on a planned topic.

На фиг. 1 изображена экспериментальна  установка, реализующа  предлагаемый способ; на фиг. 2 - функциональна  схема установки.FIG. Figure 1 shows an experimental setup that implements the proposed method; in fig. 2 - functional installation diagram.

Экспериментальна  установка седержит подложку 1, слой сорбента 2, покровна  пластина (стекло) 3, фильтр 4 дл  вывода элюирующей жидкости, радиолюминесцентный источник (РЛИ) света 5, рычаг 6, устройство 7 дл  перемещени  РЛИ, направл юща  щтанга 8, зона 9 детектировани  вещества анализируемой смеси, зона 10 детектировани  вещества эталонной смеси (свидетелей), зона 11 сравнени  (измерени  светопоглощени  элюента), микрощприц 12 дл  нанесени  эталонной смеси, микрощприц 13 дл  нанесени  анализируемой смеси, фитили 14 ввода элюирующей жидкости, маска 15 с трем  щелевыми диафрагмами , подвижный светоприемник 16, емкость 17 с элюирующей жидкостью.Experimental installation holds substrate 1, sorbent layer 2, cover plate (glass) 3, filter 4 for outputting the elution liquid, radioluminescent source (RLI) of light 5, lever 6, device 7 for moving RLI, guide pole 8, substance detection zone 9 the analyzed mixture, the zone 10 of the detection of the substance of the reference mixture (witnesses), the comparison zone 11 (measurement of the light absorption of the eluent), the microspray 12 for applying the reference mixture, the microspray 13 for applying the analyzed mixture, the wicks 14 enter the elution liquid, mask 15 with three slit diaphragms, a movable light detector 16, a capacitance 17 with an eluting fluid.

На кварцевой пластине-подложке 1 нанесен слой сорбента 2, закрытый второй покровной кварцевой пластиной 3. Между пластинами зажаты фитиль 4 дл  вывода элюирующей жидкости и фитили 14 дл  ввода элюирующей жидкости. Радиолюминесцентный источник света 5 установлен на рычаге 6, укрепленном на оси устройства .дл  перемещени  источника света 5, подвижно сочлененного со щтангой 8. Иглы микрощприцов 12 и 13 пропущены через отверсти  в покровной пластине 3. Маска с трем  щелевыми диафрагмами установлена на фотокатод фотоэлектронного умножител  (ФЭУ) 16 (подвижный светоприемник). .Фитили 14 опущены в емкость 17 с элюирующей жидкостью.A layer of sorbent 2, covered with a second quartz cover plate 3, is applied on the quartz plate-substrate 1. A wick 4 is clamped between the plates to remove the eluting fluid and the wicks 14 to introduce the eluting fluid. The radioluminescent light source 5 is mounted on a lever 6 fixed on the axis of the device to move the light source 5 movably coupled to the shtanga 8. The needles of the micro-syringes 12 and 13 are passed through holes in the cover plate 3. The mask with three slit apertures is mounted on the photocathode of the photoelectron multiplier ( PMT) 16 (movable light receiver). The wicks 14 are lowered into the tank 17 with the elution liquid.

Вс  система помещена в светонепроницаемый кожух, а подвижный источник света 5 с двигателем 7 жестко св заны с подвижным светоприемником 16, поскольку их движение синхронно.The entire system is housed in a light-tight casing, and the movable light source 5 with the engine 7 is rigidly connected to the movable light receiver 16, since their movement is synchronous.

Установка содержит также вычислительную управл ющую систему 18, устройство дл  формировани  градиента свойств элюирующей жидкости 19, устройство 20 дл  вывода информации.The installation also contains a computing control system 18, a device for forming a gradient of the properties of the eluting fluid 19, a device 20 for outputting information.

Вычислительна  управл юща  система электрически соединена с устройством дл  перемещени  источника света 7, подвижным светоприемником 16, устройством 19 дл  формировани  градиента и устройством 20 дл  вывода информации.The computational control system is electrically connected to the device for moving the light source 7, the movable light receiver 16, the device 19 for forming a gradient and the device 20 for outputting information.

Устанавливают подложку 1 со слоем сорбента 2, покровным стеклом 3 и фитил ми на маску 15 светоприемника (фотокатода ФЭУ). Три подающих фитил  14погружают в емкость с элюирующей жидкостью. Устанавливают непрерывный поток элюирующей жидкости через слой сорбента в направлении фитил  4, где испар ют элюирующую жидкость. С помощью микрощприца 13 через отверстие в пластине 3 ввод т смесь анализируемых веществ, а с помощью микрощприца 12 одновременно ввод т одно или несколько веществ - свидетел.ей. Закрывают хроматографическую систему светонепроницаемым кожухом и включают детектор . Детектор производит поиск зоны вещества-свидетел , дл  чего подвижный светоприемник 16, механически св занный с устройством 7 дл  перемещени  РЛИ соверщает возвратно-поступательное движение вдоль направлени  движени  хроматографических зон. При этом устройство 7 с той же амплитудой совершает возвратнопоступательное движение и скользит вдоль направл ющей щтанги 8. Радиолюминесцентный источник света 5 занимает положение , при котором он перемещаетс  над областью движени  одной или нескольких хроматографических зон веществ-свидетелей . Амплитуда этого движени  определ етс  в каждый момент времени шириной хроматографической зоны (зон) веществасвидетел , так как прекращение поглощени  света источника 5 веществом-свидетелем служит сигналом к изменению направлени  движени  источника света и светоприемника на противополох ное. Через определенный , заранее выбранный интервал времени (1/4-1/100 общего ожидаемого времени анализа) устройство 7 перемещает радиолюминесцентный источник 5 в область, расположенную над траекторией движени  хроматографических зон веществ анализируемой смеси. Перемещение происходит в момент, когда в своем возвратно-поступательном движении источник света и светоприемник проходит через точку максимума поглощени  зоны вещества-свидетел . При этом область детектировани  оказываетс  в точке максимума пика вещества анализируемой смеси, соответствующего веществусвидетелю . Устройство 7 и светоприемник 16 продолжают совершать возвратно-поступательное движение, амплитуда которого определ етс  тем же соотношением, что и ранее, то есть, прекращение поглощени  света веществом (веществами) анализируемой смеси служит сигналом к смене направлени  движени . При этом вычислительна  управл юща  система 18 непрерывно анализирует профиль распределени  вещества вдоль хроматографических зон анализируемой смеси до тех пор, пока зона (зоны) вещества, соответствующего веществу-свидетелю , не будет отделена от прочих компонентов анализируемой смеси в соответствии с критерием разделени  (например , не хуже 4), введеином в пам ть управл ющей вычислительной системы до начала анализа. При достижении нужной степени разделени  управл юща  вычислительна  система останавливает возвратнопоступательное движение фотоприемника и устройства перемещени  источника света и подает команду устройству перемещени  переместить источник света в зону 11, где происходит поток чистой элюирующей жидкости, не содержащей веществ-свидетелей и анализируемых веществ. При этом регистрируемый сигнал соответствует вкладу поглощени  света элюирующей жидкостью , которое может быть довольно значительным . Вычислительна  система проводит интегрирование площадей пиков веществасвидетел  и соответствующего ему вещества анализируемой смеси, вычитает из этих значений вклад поглощени  элюирующей жидкости и сравнивает величины площадей. На основании этих данных и введенных в пам ть системы значени , соответствующих количеству вещества-свидетел , вычислительна  система рассчитывает количество анализируемого вещества, и выдает это значение на устройство 20 дл  вывода информации в цифровой форме.Install the substrate 1 with a layer of sorbent 2, cover glass 3 and the wicks on the mask 15 of the light receiver (photocathode PMT). Three feed wicks 14 are immersed in a tank with an eluting fluid. A continuous flow of the elution liquid is established through the sorbent layer in the direction of the wick 4, where the elution liquid is evaporated. Using a microsyringe 13, a mixture of the analyzed substances is introduced through a hole in the plate 3, and using a microsyringe 12, one or several substances are simultaneously introduced — a witness. Close the chromatographic system with an opaque cover and turn on the detector. The detector searches for the zone of the witness substance, for which the moving light detector 16 mechanically coupled with the device 7 for moving the XRD performs a reciprocating motion along the direction of movement of the chromatographic zones. At the same time, the device 7 with the same amplitude makes a reciprocating movement and slides along the guide bar 8. The radioluminescent light source 5 takes a position in which it moves over the area of movement of one or several chromatographic zones of witness substances. The amplitude of this movement is determined at each moment of time by the width of the chromatographic zone (zones) of the witness, since the cessation of the absorption of light from source 5 by the witness substance serves as a signal to change the direction of movement of the light source and the light receiver to antislip. After a certain, pre-selected time interval (1 / 4-1 / 100 total expected analysis time), device 7 moves the radioluminescent source 5 to the area located above the trajectory of the chromatographic zones of the substances of the analyzed mixture. The movement takes place at the moment when, in its reciprocating movement, the light source and the light receiver pass through the maximum absorption point of the witness substance zone. In this case, the detection area is at the maximum point of the peak of the substance of the analyzed mixture, corresponding to the substance of the witness. The device 7 and the light receiver 16 continue to perform a reciprocating motion, the amplitude of which is determined by the same ratio as before, i.e., the cessation of light absorption by the substance (s) of the analyzed mixture serves as a signal to change the direction of motion. At the same time, the computing control system 18 continuously analyzes the distribution profile of the substance along the chromatographic zones of the analyzed mixture until the zone (s) of the substance corresponding to the witness substance is separated from the other components of the analyzed mixture in accordance with the separation criterion (for example, worse than 4), entered into the memory of the control computer system prior to the analysis. When the desired degree of separation is achieved, the control computing system stops the reciprocating movement of the photodetector and light source moving device and commands the moving device to move the light source to zone 11, where there is a flow of clean elution liquid that does not contain any witness substances and analyzed substances. In this case, the recorded signal corresponds to the contribution of light absorption by the eluting fluid, which can be quite significant. The computing system integrates the peak areas of the witness substance and the corresponding substance of the analyzed mixture, subtracts the absorption from the elution liquid from these values, and compares the area values. Based on these data and the values entered into the system memory, corresponding to the amount of the witness substance, the computer system calculates the amount of the analyzed substance, and outputs this value to the device 20 to output information in digital form.

После количественного определени  искомого вещества (веществ) управл юща  вычислительна  система посылает сигнал устройству формировани  градиента элюирующей жидкости подать в емкость 17 реагент, позвол ющий быстро промыть слой сорбента от веществ-свидетелей и веществ анализируемой смеси. В качестве такого реагента может быть использована высокопол рна  жидкость при адсорбционной хроматографии на силикагеле или раствор с высокой ионной силой в случае ионнообменной хроматографии . Дл  завершени  цикла регенерации устройство формировани  градиента подает в емкость 17 жидкость с теми свойствами , которые необходимы в начальной стадии анализа. Через промежуток времени, достаточный дл  промывки областей, в которые ввод т пробы щприцами 12 и 13, хроматографическа  система готова к проведению следующего цикла анализа. Суммарное врем  подачи всех промывных растворов может не превосходить времени нужного дл  прохождени  подвижной фазы вдоль всего сло  сорбента, то есть значительно меньше времени анализа.After the quantitative determination of the desired substance (s), the controlling computing system sends a signal to the device for forming the gradient of the eluting fluid to supply the tank 17 with a reagent that allows you to quickly flush the sorbent layer from the witness substances and substances of the analyzed mixture. As such a reagent, a high-polar liquid can be used in silica gel adsorption chromatography or a solution with high ionic strength in the case of ion exchange chromatography. In order to complete the regeneration cycle, the gradient forming device supplies fluid 17 into the container 17 with the properties that are necessary in the initial stage of the analysis. After a period of time sufficient to flush the areas into which the samples are introduced with syringes 12 and 13, the chromatographic system is ready for the next analysis cycle. The total delivery time of all the washing solutions may not exceed the time needed for the mobile phase to pass along the entire sorbent layer, i.e., significantly less than the analysis time.

В процессе получени  количественной записи источник света с определенной частотой поочередно устанавливаетс  над трем  дорожками (дл  эталонного образца, дл  элюета и дл  анализируемой смеси). Поскольку в поле зрени  детектора попадают одни и те же участки сорбента каждой дорожки, погрешности за счет разной толщины сло  сорбента не возникают, хроматографические м тна проход т как бы через измерительные  чейки одной кюветы. Вычислительна  машина подсчитывает площади пиков при прохождении п тен через посто нную зону, просвечиваемую источником света, и производит расчет концентрации по соотношению площадей пиков в дорожке с эталоном и в дорожке с анализируемой смесью, за вычетом поглощени  от элюента в контрольной дорожке.In the process of obtaining a quantitative recording, a light source with a certain frequency is alternately mounted over three tracks (for a reference sample, for an elute, and for the analyzed mixture). Since the same areas of the sorbent of each track fall into the field of view of the detector, errors due to the different thickness of the sorbent layer do not occur, the chromatographic passes pass, as it were, through the measuring cells of one cell. The computer calculates the peak areas when the spots pass through the constant zone illuminated by the light source and calculates the concentration by the ratio of peak areas in the track with the reference and in the track with the analyzed mixture minus the absorption from the eluent in the control track.

Тестова  стандартна  смесь красителей (азобензол, азотолуол, судан П1, виктори  - синий и судан R), вз тых в различных соотношени х, раздел лась в слое силикагел  Silperl толщиной 0,2 мм с 2% гипса . Элюент - смесь бензола с ацетоном в отношении 97:3. Дл  количественной оценки были приготовлены бензольные растворы-свидетели Судана R и азотолуола, содержащие 10 мг вещества в 1 см с точностью ±0,3%.The test standard mixture of dyes (azobenzene, azotoluene, Sudan P1, Victorian Blue and Sudan R), taken in various ratios, was separated in a 0.2 mm thick Silperl silica gel layer with 2% gypsum. Eluent - a mixture of benzene with acetone in the ratio of 97: 3. For a quantitative assessment, we prepared benzene solutions-witnesses of Sudan R and azo-toluene, containing 10 mg of substance per cm with an accuracy of ± 0.3%.

Пробы анализируемой смеси и растворовсвидетелей имели объем 1 мкл и наносились процензионным шприцем фирмы Hamilton с воспроизводимостью не хуже 0,5%.The samples of the analyzed mixture and the witness solutions had a volume of 1 μl and were applied with a Hamilton protractor syringe with a reproducibility no worse than 0.5%.

Обработка экспериментальных материалов показала, что значени  концентраций азотолуола и Судана R анализируемой смеси определ ютс  с точностью не хуже ±1,7%.Processing of the experimental materials showed that the concentrations of azo-toluene and Sudan R of the analyzed mixture are determined with an accuracy of no worse than ± 1.7%.

Так, например, при трехкратном анализе пробы, содержащей 12,3X10- г Судана R и 7,51X10- г азотолуола были получены следующие значени : 12,6X10- ; 12,4x1012 ,2Х10-« дл  Судана и 7,55x10-6, 7,53х XICH, 7,49X10- дл  азотолуола.For example, a three-fold analysis of a sample containing 12.3 x 10 g of R Sudan and 7.51 x 10 g of N-toluene gave the following values: 12.6 x 10-; 12.4x1012, 2X10- "for Sudan and 7.55x10-6, 7.53x XICH, 7.49X10- for azotoluene.

8eight

Claims (2)

1.Патент Франции № 2089172, 1972, G ОШ 31/08.1.Patent of France No. 2089172, 1972, G OSH 31/08. 2.Патент США № 3562539, кл. 250-227, 1971 (прототип).2. US patent number 3562539, cl. 250-227,1971 (prototype). /4/four 1717