SU721450A1 - Method of isolating acetylcholine esterases - Google Patents

Description

1one

Изобретение относитс  к области биотехнологии , в частности к способам очистки ферментных препаратов - к способу выделени  ацетилхолинэстеразы (КФ 3.1.1.7) из  да сред}1еазиатской кобры.The invention relates to the field of biotechnology, in particular, to methods for the purification of enzyme preparations - to a method for isolating acetylcholinesterase (EC 3.1.1.7) from and among the media of the Iranian cobra.

Целевой продукт может быть использован в качестве лекарственного средетва , например, при лечении шоковых состо ний, а также как компонент систе дл  определени  низких концентраций фосфорорганических инсектицидов.The target product can be used as a drug, for example, in the treatment of shock conditions, and also as a component of a system for determining low concentrations of organophosphate insecticides.

Известны способы выделени  ацетилхолинэстеразы из животных тканей, например из ткани мозга tilИзвестен способ выделени  ацетилхопинэстеразы (АХЭ) из  да среднеазиатской кобры путем двухступенчатой колоночной хроматографии на сульфоэтилпроизводном декстрана в буферных растворах 2.There are known methods for isolating acetylcholinesterase from animal tissues, for example, from brain tissue til. A method for isolating acetylhopine esterase (AChE) from Central Asian cobra is known by using two-step column chromatography on sulfoethyl derivative of dextran in buffer solutions 2.

Преимуществом этого способа  вл етс  использование в качестве источника фермента  Да среднеазиатской кобры , отличающегос  высоким содержанием АХЭ (около 200ОО Е/г сухого  да).The advantage of this method is to use as a source of the enzyme Yes of the Central Asian cobra, which is characterized by a high content of ache (about 200 OU / g dry da).

Непосгаткн известного способа состо т в низкой удельной активности по-лучаемого препарата (61 Е/мг белка) и в низком выходе 41ермента (13%). Эти недостатки обусловлены тем, что используемса р качестве ионообменного сорбента сильнокислое сульфоэтилпроизводное декстрана вызьшает в процессе вььделени  значительную денатурацию фермента .The known method consists in a low specific activity of the resulting preparation (61 U / mg protein) and in a low yield of the enzyme (13%). These disadvantages are due to the fact that the highly acid sulfoethyl derivative of dextran is used as an ion exchange sorbent during the process of significant denaturation of the enzyme.

Целью предлагаемого способа  вл етс  устранение недостатков известного способа, а именно получение из  да кобры АХЭ с высокой удельной активноЬтью и с высоким выходом. Другой целью  вл етс  комплексное использование  да.The aim of the proposed method is to eliminate the drawbacks of the known method, namely, to obtain from AChE and cobra with high specific activity and high yield. Another goal is the complex use of yes.

Согласно изобретению выделение фермента из  да кобры провод т ступеН чатой колоночной хроматографией с истгользованием на первом этапе слабокислого ионообменника, карбоксиметилпроизводного декстрана, в буферном растворе. На этом этапе нар ду с АХЭ удаетс  получить препараты п ти низкомолекул рных физиологически активных пептидов, что приводит к более полному использованию дефицитного сырь . Последующую очистку целевого продукта провод т последовательной хроматографией на колонках с диэтиламиноэтилпроизводным декстрана и с гранулированным гидроксиапатитом в буферных растворах, содержащих в качестве стабилизатора активности фермента глицерин- в количестве Ю вес.%.According to the invention, the isolation of the enzyme from cobra is carried out by step column chromatography using at the first stage a weakly acidic ion exchanger, a carboxymethyl derivative of dextran, in a buffer solution. At this stage, along with AChE, it is possible to obtain preparations of five low molecular weight physiologically active peptides, which leads to a more complete use of the scarce raw material. Subsequent purification of the target product is carried out by sequential chromatography on columns with diethylaminoethyl derivatives of dextran and granular hydroxyapatite in buffer solutions containing glycerol as an activity stabilizer in an amount of 10 wt.%.

Согласно изобретению предлагаетс  способ выделени  ацетилхолинэстеразы из  да среднеазиатской кобры с высокой удельной активностью фермента и высоки ВЫХОДОМ; при комплексном использовании сырь  путем ступенчатой колоночной хроматографии с использованием на первой ступени карбоксиметилпроизводного декстрана , на второй ступени - диэтиламино- этилпроизводного декстрана, а на третьей - гидроксиапатита. Способ осуществл ют в присутствии буферов и-предпочтительно при 2 - . Элюцию ацетилхолинэстеразы на первой ступени осуществл ют обычно линейным градиентом, образованным смешиванием 0,01 М уксусно-аммонийного буфера рН 5,0 fc 1,0 М уксусно-аммонийным буфером рН 7,0. Злюцию АХЭ на второй ступени осуществл ют обычно линейньщ градиентом , образованным смешиванием 0,01 М трис- HCft буфера рН 7,8 с 0,5 М раствором . NaCft в том же буфере.According to the invention, there is provided a method for isolating acetylcholinesterase from and Central Asian cobra with a high specific enzyme activity and high OUTPUT; in the case of complex use of raw materials by step column chromatography using dextran at the first stage of carboxymethyl derivative, at the second stage of dextran diethylamine-ethyl derivative, and at the third stage hydroxyapatite. The method is carried out in the presence of buffers and preferably at 2 -. The elution of the acetylcholinesterase in the first stage is usually carried out with a linear gradient formed by mixing 0.01 M acetic ammonium buffer pH 5.0 fc 1.0 M acetic ammonium buffer pH 7.0. The second stage of AChU is usually carried out with a gradient line formed by mixing 0.01 M tris-HCft buffer pH 7.8 with a 0.5 M solution. NaCft in the same buffer.

Элюцию АХЭ на третьей ступени осуществл ют обычно 0,5 М раствором NoOB в 0,01 М Л/а-фосфатном буфере рН 7,6The elution of AChE in the third step is usually carried out with a 0.5 M NoOB solution in 0.01 M L / a-phosphate buffer pH 7.6

Буферные растворы на второй и третьей ступен х содержат глицерин; в количестве 10 вес.%.Buffer solutions on the second and third steps contain glycerin; in the amount of 10 wt.%.

Предпочтительно процесс выделени  АХЭ провод т следующим образом.Preferably, the isolation process of the AChE is carried out as follows.

Обессоленный  д среднеазиатской кобры наслаивают на колонку с карбоксиметилпроизводным декстрана, уравновешенным уксусно-аммонийным буфером рН 5,0. Элюцию св завшегос  материала производ т линейным (по мол рности буферных растворов) градиентом, образованным смешением уравновешивающего буфера с 1,0 М уксусно-аммонийным буфером рН 7,0. При этом нар ду с i препаратом t- АХЭ удаетс  получить препараты п ти .низкомолекул рных физиологически активных пептидов. Использование на первом этапе очистки АХЭ слабокислого производного декстрана поз- вап ет снизить денатурацию фермента, наблюдаемую при использовании сильнокислого производного декстрана. Последующа  очистка целевого продукта проводитс  на диэ.тиламиноэтилпроизводном декстрана. Дл  снижени  денатурации АХЭ с этого этапа очистки в буферньюDemineralized Central Asian cobras are layered on a carboxymethyl derivative of dextran, balanced with acetic ammonium buffer pH 5.0. The elution of this material is carried out with a linear (by the molarity of the buffer solutions) gradient formed by mixing the equilibrium buffer with 1.0 M acetic ammonium buffer pH 7.0. In addition, along with the i-t Ache preparation, it is possible to obtain preparations of five low molecular weight physiologically active peptides. The use of the weakly acid derivative of dextran in the first stage of purification of the ache allows to reduce the denaturation of the enzyme observed with the use of the strongly acidic dextran derivative. Subsequent purification of the target product is carried out on the diethylaminoethyldextran derivative. To reduce the denaturation of the AChE from this purification step in the buffer

растворы добавл ют глицерин (10% по объему). Элюцию АХЭ с колонки с диэтиламиноэтилпроизводным декстрана, уравновешенным 0,01 М трис-НС4 буфером рН 7,8, содержащим 10% глицерина , провод т линейным градиентом, образованным смешением уравновешивающего буфера с 0,5 М НаСС э том же буфере. Последний этап .очистт состоит в хроматографии АХЭ на колонке с гранулированным гидроксиапатитом, уравновешенным 0,01 М Na -фосфатным буфером рН 7,6, содержащим 1.0% глицерина . Элюцию фермента провод т О,5 Мthe solutions add glycerin (10% by volume). The elution of the AChE from the column with diethylaminoethyldextran derivative, equilibrated with 0.01 M tris-HC4 buffer pH 7.8, containing 10% glycerol, was performed with a linear gradient formed by mixing the equilibrium buffer with 0.5 M HAC e same buffer. The final stage of purification consists in chromatography of AChE on a column with granular hydroxyapatite, balanced with 0.01 M Na-phosphate buffer pH 7.6, containing 1.0% glycerol. The elution of the enzyme is carried out Oh 5 M

MnCd в том же буфере. Этот этап выделени  позвол ет в еще большой степени очистить и сконцентрировать целевой пропукт. Замена на этом этапе трис-НС( буфера на фосфатный облегчает определение концентрации белка методомMnCd in the same buffer. This extraction step allows an even greater degree of purification and concentration of the target product. The replacement of Tris-HC at this stage (buffer with phosphate buffer facilitates the determination of protein concentration by the method

Лоури,Lowry,

Полученный препарат АХЭ, как следует из результатов электрофоретического анализа, гомогенен. Молекул рный вес фе эмента 1ЮООО ± 1ОООО. Ферментгидролизует ацетилхолин АТХ (К 1,3х х1Ом), мехолин {К„-2,2х10 М) и практически не гидролизует бутирилхолин. Высокие концентрации ацетилхолина и мехолина угнетают активность фермента. Величины констант второго пор дка взаимодействи  препаратов АХЭ с фосфорорганическими ингибитопами АХЭ состав-1The resulting preparation of ache, as follows from the results of electrophoretic analysis, is homogeneous. The molecular weight of the reaction is 1UOO ± 1OOOO. The enzyme hydrolyzes acetylcholine ATX (K 1,3x x1Om), mecholine {K „-2.2x10 M) and practically does not hydrolyze butyrylcholine. High concentrations of acetylcholine and meholin inhibit the activity of the enzyme. The magnitudes of the second-order constants of the interaction of drugs AChE with organophosphorus inhibitors AChE composition-1

-i-i

л ют (0,85-6,7) X l (0.85-6.7) x

минmin

что в 2 раза выше констант взаимодействи  этих же соединений с препаратом АХЭ из эритроцитов человека (АХЭЧ). Разбавленный раствор фермента (1Е/ил) в забуференном растворе (0,02 М натрийфосфат рН 7,6) альбумина (0,2%) или глицерина (10%) инактивируетс  при на 10% за I ч, а при (4-6)°С на 10% за 1 сут. Температурный оптимум гидролиза АТХ ферментом, разбавленным 0,15 М NaCO, составл ет 2О°С, а фермента , разбавленного раствором альбумина (0,2%) или глицерина (10%) .which is 2 times higher than the constant of interaction of the same compounds with the drug AChE from human erythrocytes (AChEC). The diluted enzyme solution (1E / yl) in a buffered solution (0.02 M sodium phosphate pH 7.6) albumin (0.2%) or glycerol (10%) is inactivated at 10% for I h, and at (4-6 ) ° С by 10% for 1 day. The optimum temperature of ATH hydrolysis by the enzyme diluted with 0.15 M NaCO is 2 ° C, and that of the enzyme diluted with albumin solution (0.2%) or glycerol (10%).

Claims (5)

Формула изобретенияClaim 1. Способ выделения ацетилхолинэсгеразы из яда среднеазиатской кобры путем ступенчатой колоночной хроматографии на производных декстрана в буферных растворах, о тличающийс я тем, что, с целью получения ацетилхолинэстеразы с высокой удельной активностью и увеличения выхода целевого продукта, а также с целью комплексного использования яда, колоночную хроматографию осуществляют в три ступени, в качестве производного декстрана на первой ступени применяют карбоксиметилпроизводное декстрана, на второй - диэтиламиноэтилпроизводное декстрана, а хроматографирование на третьей ступени осуществляют на гидроксиапатите, причем буферные растворы на второй и третьейсту— пеняхсодержат глицерине количестве-10%.1. A method for the isolation of acetylcholinesterase from Central Asian cobra venom by step column chromatography on dextran derivatives in buffer solutions, characterized in that, in order to obtain acetylcholinesterase with high specific activity and to increase the yield of the target product, as well as for the complex use of poison, a column chromatography is carried out in three steps, the carboxymethyl derivative of dextran is used as the derivative of dextran in the first step, and diethylaminoethyl derivative in the second on, and the third chromatography step is performed on the hydroxyapatite, wherein the buffer solutions for the second and glycerol treteystu- penyahsoderzhat amount of 10%. 2. Способ по π. 1, о т л и чающий с я тем, что выделение ацетилхоЛинэстеразы проводят при 2-8 С.2. The method according to π. 1, with the fact that the allocation of acetylcholinesterase is carried out at 2-8 C. 3. Способ по пп. 1 и 2, отличающий с я тем, что элюцию ацетилхолинэстеразы с колонки с карбоксиметил— производным декстрана проводят линейным (по молярности буферных растворов) градиентом, образованным смешиванием 0,0 1 М уксусно-аммонийного буфера pH 5,0 с 1,0 М уксусно-аммонийным буфером pH 7,0.3. The method according to PP. 1 and 2, characterized in that the elution of acetylcholinesterase from a column with a carboxymethyl derivative of dextran is carried out by a linear gradient (by molarity of buffer solutions) formed by mixing 0.0 1 M acetic ammonium buffer pH 5.0 with 1.0 M acetic ammonium buffer pH 7.0. 4. Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что элюцию ацетилхолинэстеразьт с колонки с диэтил аминоэтилпроизводным декстрана проводят линейным градиентом, образованным смешиванием 0,01 М трис - НС? буфера pH 7,8 с 0,5 М раствором NoC? в том же буфере.4. The method according to PP. 1-3, characterized in that the elution of acetylcholinesterase from a column with a diethyl aminoethyl derivative of dextran is carried out by a linear gradient formed by mixing 0.01 M Tris - HC? pH 7.8 buffer with 0.5 M NoC? in the same buffer. 5. Способ по пп. 1 - 4, о т л и чающийся тем, что элюцию ацетил.холинэстеразьг с колонки с гранулированным гидроксиапатитом проводят 0,5 М раствором Na С? в 0,01 М5. The method according to PP. 1 - 4, which consists in the fact that the elution of acetyl.cholinesterase from a column with granular hydroxyapatite is carried out with a 0.5 M solution of Na C? in 0.01 M No —фосфатном буфере pH 7,6.No — phosphate buffer pH 7.6.