SU681918A1 - Способ получени противоопухолевогоАНТибиОТиКА - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к микробиологической промьшшенности и касаетс получени  противоопухолевого антибиотика . Предложенный антибиотик  вл етс  новым и способ его получени  в патентной и научно-технической литературе не описан. Целью изобретени   вл етс  получение противоопухолевого антибиотика Эта цель достигаетс  тем,что штам Actinomyces coerulescens 1072/76 ёсаращивсиот на питательной среде, содержсццей источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением и очисткой целевого продукта. Противоопухолевый антибиотик 107 представл ет собой кристаллы желтого цвета с температурой плавлени  251-253°С| в состав которого вход т два компонента с молекул рным весе 482+2 и 494±2 (масс-спектрометричес ки) . Найдено, %: С 63,01; 62,91; Н 5,50;5,65. Л. 249,9±20°(с 0,133%, в ДМСО) Г 315,1±20°(с 0,011%, JS лед ной уксусной кислоте). Антибиотик 1072 растворим в диметилформамиде , Д11метилсульфоксиде, пиридине, трудно растворим (при нагревании ) в метаноле, этаноле, бутаноле бензоле хлорюформе, ацетоне, не раствор етс  в серном и петролейном эфирах, гексане, в воде, разбавленных водных pacTBOpajf кислот, в 10%-ном водном растворе едкого натра раствор етс  медленно с темнофиолетовьал окрашиванием. В УФ-спектре антибиотика (в мб.танольном растворе) наблюдаютс  максимумы поглощени  при 245,266,275, 285,393 нм (Е| 811, 548, 640, 503, 274 соответственно). В ИК-спектре (в КВг-диске) имеютс  полосы поглощени  3400 см (-ОН-группы) , 1685 см (-С-О-группа) , 1620 см (-С О-группа хинона, св занна  водородными св з ми). Характер УФ-спектра и наличие поглощени  в области 1685 и 1620 см в ИК-спектре позвол ют предположить, что частью структуры антибиотика 1072  вл етс  свободна  хиноидна  группировка и хиноидна  группировка, св занна  водородными св з ми. В ЯМР-спектре силнловых эфиров антибиотика (в CCl,) имеютс  сигналы четырех метоксильных групп, метильных групп, групп и четырнадцати ароматических протонов.

Противоопухолева  активность антибиотика 1072 in vivo изучалась в опытах на K&mtax с перевиваемыми опухол ми: асцитными (карцинома Эрлиха лимфаденоз Фишера) и плотньлми (карцинома 755, саркома 180). Способ введени  - внутрибрюшинно в двух режимах: с .1 по 9 день (1 9)9) и на 1,5 и 9 день (1,5,9) после заражени .

Противоопухолева  активность .антибиотика 1072, введенного внутрибрюшинно , представлена в табл. 1.

Антибиотик 1072, примененный в двух режимах,вызывал торможение асцных опухолей на 100%; солидных опухлей на 40%(саркома 180) и 60%(карцинома 755) .

Антибиотик 1072 характеризуетс  большой широтой химиотерапевтического действи : МИД дл  однократного введени  больше однократной лечебной дозы в 50-250 раз,

Антибиотик 1072 активен по отношению к грамположительным бактери м включа  штампы, резистентные к антибиотикам , широко примен аиым в медицинской практике (табл. 2).

Культурально-морфологическа  и физиологическа  характеристика культуры 1072/76.

Минеральна  среда № 1 Гаузе.

Воздушньай мицелий пушистый или бархатистый, бледно-голубой. Спороносцы спиральные, cj 3-5 завиткйМи. Споры шаровидные, овальные с шиповидной оболочкой.

Субстратный мицелий бесцветный, среда не окрашена.

Крахмальный агар.

Рост хороший, воздушный мицелий пушистый голубой. Субстратный мицелий бесцветный, среда окрашена На синтетических средах наблюдаетс  хороший рост, колонии и среды не окрашены.

Воздушный мицелий бархатистый, голубой.

Овс ный агар.

Воздушный мицелий хорошо развит, голубовато-серый, бархатистый, пушистый . Субстратный мицелий бурый, среду окрашивает в бурий цвет.

Соева  среда.

Воздушный мицелий пушистый, слабо развит, голубовато-серого цвета. Субстратный мицелий буроватый, в среду проникает бурый пигмент.

Картофельный агар.

Воздушный мицелий голубой. Колонии в среде бесцветные.

Органическа  среда 2 Гаузе. Воздушный мицелий слабо развит, голубоватого цвета. Субстратный мицеЛИЙ бурый, среду окрашивает в бурый цвет.

Физиологические свойства.

Желатину разжимает медленно, молоко свертывает и пептонизирует. Крахмал гидролизует, нитраты восстадавливает , сахарозу инвертирует. На клетчатке не растет.Среда Траснера-Данга чернеет. Ассимилирует глюкозу, манозу, сахарозу, инозит. Не усваивает рамкозу, сорбит, мальтозу , инулин..

Антогонистическое действие в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

Получают антибиотик следующим образом.

Штамм Act. coerulescens 1072/76 выращивают на среде, содержащей основные источники углерода, азота и минеральные соли. Антибиотик экстрагируют из мицели  органическим растворителем, экАракт упаривают, из полученного водного остатка антибиотик отдел ют фильтрацией или извлекают органическим растворителем . После отгонки получают антибиотик 1072 в смеси с сопутствующими антибиотиками и неактивнЕ и примес ми . Отделение от последних осуществл ют хроматографированием, а также кристаллизацией из органических растворителей и их смесей.

Дл  хроматографии (в тонком слое и колоночной) используют силикагель марок ЛС 5/40 , Л /40|и , Л40/100;и и окись алюмини .

Хроматографическа  однородность антибиотика установлена методом тонкослойной хроматографии в системах . растворителей:

1. Метанол: CHClo, : ацетон 2:11:1 RfO,6, силикагель ЛС 5/40jU, закрепленный слой фосфатно-цитратный, буфер с рН 7. 2. СНС1 : метонал-9:1. R,;0,3 силикагель Л 5/40|u. 3. Метанол:СНСl,j : : ацетон -,2:11:1. RfO,6 (), про вление при дневном свете по желтой окраске, в УФ-свете по жел- той флуоресценции или парами .

Пример. Культурой Act.coerulesceus 1072/76 с агаризованной среда; Гаузе-1 засевают колбы Эрленмейра , содержащие 125 мл ферментационQ но  среды следующего состава,%: глю .коза 1; со  1; NaCl 0,5; СаСО. 0,25; рН 7,2-7,4. Инкубируют при 27-28ОС 48 ч на поступательной качалке со скоростью вращени  230-250 об/мин.

Глубинным мицелием засевают партию колб с той же средой и выращивают 96 ч. Полученную культуральную жидкость с активностью 1:1280 ед, разведени  используют дл  выделени  антибиотика 1072.

П р и м е р 2. Процесс глубинного биосинтеза осуществл ют по примеру 1 ;На среде состава, 2:глицерин 20, соева  мука 5, сернокислый аммоний 1,5,

5 NaCl 3, мел 3. рН 6,8 - 7,0. Активность культуральной жидкости 1:20 ед разведени .

П р и м е р 3. Процесс глубинного биосинтеза осуществл ют по примеру 1 на среде состава, 2 : кукурузный экстракт 10, мел 5, сернокислый амморий 3,5, NaCl 5, глюкоза 10, крахмал 15 рН 6,8-7,0. Активность культуральной жидкости 1:20 ед. разведени .

П р и м е р 4. Процесс глубинного биосинтеза осуществл ют по примеру 1 на среде состава: соева  мука 30,, сернокислый аммоний 3, NaCl 3, мел 7 крахмал 50, кобальт 0,3 мг/л, рН 6,97 ,0. Активность культуральной жидкости 1:20 ед. разведени .

Пример5. От 4,5л глубинной культуры, полученной по примеру 1, отдел ют мицелий («0,4 кг). Из мицели  антибиотики извлекают экстракцией 1,2л ацетона. Экстракт упаривают в вакууме до л-аоо мл, ,из полученного водного остатка антибиотики извлекают этилацетатом, при концентрировании этилацетатного экстракта получают кристсшлический осадок в виде желтых или зеленоватожелтых игл, который отдел ют и пропивают этилацетатом. Вес воздушного сухого осадка 140 мг. После перекристаллизации из метанола и высушивани  в вакууме при получают 85 мг жетпих игл с т.пл. 2512530с , «249,90 (с 0,133%, в ДМСО), ctjp 315,1° (с 0,011% в лед ной уксусной кислоте).

Найдено, %: С 63, 01; 62,91; fe 5,56; 5,65.

В масс-спектре имеютс  два пика молекул рных ионов 482+2 и 494±2,

в масс-спектре силиловых эфиров молекул рные пики и 782±2, от-, вечающие молекул рным весам компонентов с четырьм  триметилсилильными группами.

П р и м е р 6. Антибиотик экстрагируют из мицели  по примеру 5, экстракт упаривают до водного остатка , из которого антибиотик выпадает в виде желтого осадка. Осадок отде0 л ют, высушивают (310 мг) и перикристаллизовывают из метанола или смеси растворителей метанол: СНС1,,: :ацетон-2:11:1. Получают 138 мг антибиотика 1072.

5

П р и м е р 7. Антибиотик экстрагируют из мицели  по примеру 5, экстракт упаривают до водного остатка и антибиотик извлекают этилаце0 татом. Органическую фаэу упаривают досуха (1,5 г), раствор ют в смеси - э| ганических растворителей и нанос т на силикагель марки Л 40/100, высушивают , внос т в колонку с силикагелем , которую сначала промывают

5 хлорофОЕ мом, затем элюируют системой метонол :СНС1гт,:ацетон-2:11:1. Хрюматографически однородные фракций объедин ют, упаривают растворитель и кристаллизуют из метанола

0 . или смеси растворителей. Получают 74 мг антибиотика 1072.

Предлагаемый способ обеспечивает получение противоопухолевого анти5 биотика, обладающего широким спект- ром противоопухолевого-действи , кото5 )ый может найти применение в медицине .

Таблица 1

1,0

1. Staphanreus 209-р

60

Таблица

0,12

0,12

0,06

0,12

Тест-культура

2.Bac.mycoides 537

3.E.coli 67S

4.Psendomonas aeruginosa

5.Protens inlgaris

о

6.Klebsiella pneumonial

7.Provldensia

8.Coiranomohas

Claims (1)

1. 9.Candida Формула изобретени  Способ получени  противоопухолевого антибиотика, отличающийс   TBMj, что штамм Actinomyces сое-

   Продолжение табл. 2

   Минимальна  подавУстойчивость л юща  концентраци  мкг/мл

   0,12

   рицину 0,0б О, 12 0,12 0,12 0,12 оО,12 0,06 0,12 0,12 0,12 0,12 0,49 500 500 250 500 500 31,2 500 45 rulescens 1072/76 выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные. соли, с последующим вьщелением и очисткой целевого продукта.