SU578892A3 - Способ получени производных иммуноглобулина - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНА

двухвалентной меди, при котором селективно расщепл ютс  межкепочечиые дисульфидные св зи, соедин ющие две т желые полипептидные цепи (Н-неПи) и две легкие полипептидные цепи (Ьцепн) в имму1юглобулш1е, или, кроме указанных межцепочечных днсульфидных св зей, расщепл етс  часть внутрицепочечных дисульфидных св зей , а подвергнутые расщеплению дисульфидные группы подвергаютс  дальше сульфитолизу. Полученные таким способом производные иммуноглобулина имеют пониженную антикомплементар|гут& активность и сохран ют высокую антителькую активность в организме животных в течение длительного периода.

Способ получени  указанных препаратов заключаетс  в том, что иативный иммуноглобулин ввод т во взаимоденстане в водной .среде с соединеш1ем (а), способным давать тетратионат-анионы, и соединением (б), способным давать сульфитшшоны , чтобы подвертуть расщепле}гию от 3 до 5 межцепочечлых днсульфшщых св зей, или меж- и внутрицепочечных днсульфидных св зей нативного иммуноглобулина с последующим S - сульфонированисм (-З-ЗОзИ) образушихихс  тиольных остатков .

В качестве соединени  (а), которое допускает образование тетрагаонат-иона, предпочтительным  вл етс  тетрапюнова  кислота, ее соли щелочных металлов, такие, как тетратеонат натри , тетратионат кали , и т.д., и ее водорастворимые соли, например тетратионат аммони . Но могут быть использованы любые другае соединени , которые образуют тетрапюнат-ион в воде.

Примерам соедине шн (б), которые могут образовывать сульфит-анион в воде  вл ютс  серниста  кислота, сульфит натри  шш кали , бисульфит натри , но мoжef быть использовано любое другое соединение, способное образовьшать сульфит-ион в воде.

Соединение (а), которое допускает образование тетратпонат-иона в воде, действует как окислитель. Соеданение (б), которое образует Сульфит-ион в воде действует как восстановитель и агент S-сульфош1роваю1 . ;

Мол рные количества сульфит-иона и тетратипнат-иона , каждые по отдельности, должны не менее, чем в два раза, превьпиать количество подвергаемых расщеплению дисульфидных св зей. Концентраци  этих ионов может в 100 и более раз превыщать количество подвергаемых расщеплению св зей.

Предпочтительно, соединени  (а) и (6), в в особенности (б), раствор лись в воде или в буферном растворе перед добавлением itx в реакционную смесь.

Способ согласно изобретению осуществл ют предло1гштельно при температурах, не превышаюидах 50° С, в частности при 10-50° С, хот  можно проводить, процесс и при более низких температурах . Врем  реакции зависит от таких факторов,

как тип иммуноглобулина, концентраци  реагентов , температура реакции и наличие денатурирующих агентов, таких как мочевина и т.д- Величина рН реакционной смеси может колебатьс  в пределах от 3,5 до 10, предпочтительно от 6 до 9. Пор док прибавлени  реагентов в реакционную систему несущественен . После реакции смесь подвергают последовательному диализу против воды и подход щего буферного раствора, например 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,4) и 2,5% глицина. Кроме того, HOBbie производные иммуноглобулина согласно насто щему изобретению могут быть разделены иаН-цепн и L-цепи с помощью колоночной хроматографии , например с помощью колонки с Сефадексом д-75 в 1 М растворе пропионовой кислоты.

Примен емые в способе в качестве исходных веществ препараты  вл ютс  продажными продуктами или могут быть получены известными из литературы способами.

Целевые продукты вьщел ют из реакционной среды известными методами.

Пример. Соотношени  условий реакции с

числом расщеш1е1п ых дисульфидных св зей. Условие 1.

К 51 мг человеческого, иммуноглобулина П, 36мг NajSOa, меченного 35S, к 22мг NajSAO прибавл ют водный раствор 0,1 М трис - HCI (рН

8,2), чтобы довести обьем образца до 5 мл, который нагревают до 45° С, и реакцию провод т при указанной температуре. Немедленно после начала реакци , а затем через 30 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 7, 4 ч, и 24 ч от начала реакции производ т отбор по 0,5 мл

смеси. Каждый из образцов смешивают с 10мл 50%-ного насыщенного раствора сульфата аммони  при 0°С, выдерживают в течение 15 мин при 0°С. Осадок отдел ют центрифугированием. После промьшани  дополнительным количеством 50%-ного

насыщенного раствора сульфата аммони  бьша измерена радиоактивность осадка с помощью жидкостного сцинтилл ционного счетчика и на основании полученного результата было .вычислено число -S -ЗОзН-групп, содержащихс  в осадке.

Условие 2.

Реакцию начинают как описано в условии 1, но без отбора проб по мере протекани  реакции. Через 4 ч от начала реакции к реакционной смеси прибавл ют водный 10М раствор мочевины, чтобы довести концентрацию мочевины в системе до 4М. Спуст  5 и 6 ч после начала реакции (т.е. через 1 и 2 ч после прибавлени  мочевины) отбирают по 0,5 мл реакционной смеси и обрабатьшают подобно пробам в условии 1.

Условие 3.

Повтор ют реакцию и обработку проб по уело-. ВИЮ 1, но реакцию провод т при температуре ОС. Условие 4. Повтор ют реакцию и обработку проб по услоВИЮ 1, но реакцию провод т при температуре 25°С. Условие 5. Повтор ют реакцию и обработку проб по условию 1, но NajS4O6 2HjО не используют. Результаты реакций при вышеупом нутых услови х 1,2,3, 4 и 5 представлены в табл. 1. Число расщепленных дисульфидных св зей соотвёгствует половине числа -S-SOjH-групп. Из результатов, представленных в табл. 1, можно сделать следуюишй вьшод. Если предлагаемый способ осуществл етс  в присутствии тетратионата и сульфита натри  при 45°С при условии 1, то через 0,5 ч расщепл ютс  приблизительно 3 дисульфидных св зи. Число расщепленных св зей достигает в среднем примерно 4,5 в ходе реакции от 1 до 7 ч и примерно 5,2 через 24 ч от начала реакции. Если реакцию провод т при условии 4, то число расщепленных дисульфидных св зей уменьшаетс  и достигает в средаем примерно 4,3,после 24 ч реакции. Есл  реакцию провод т при условии 3, то среднее число расщепленных дисульфидных св зей еще более уменьшаетс . В отсутствие тетратионата натри  (условие 5) расщепление д 1сульфидных св зей не ускор етс . Если в реакционную смесь добавл ют мочевину (условие 2), то среднее число расщепленных дисульфидных св зей после прибавлени  мочевины быстро увеличиваетс . П р и м е р 2. Сравнение качества и физических свойств препаратов при использовании в качестве окислител  N828406 или Условие I. К 2,0 г выщеуказаиного человеческого иммуноглобулина Q, 1,42 г NajSOa и 0,8ъ г N828406 2HjO прибавл ют водный 0,1 М раствор трис-НС (рН8,2), чтобы довести объем смеси до 200мл. Реакцию провод т при температуре 45° С. Немедленно после 1«ачала реакции и далее через 30 мин, 1 ч, 2 ч и 4 ч отбирают каждый раз по 15 мл реакционной смеси. .Клсле п того отбора пробы немедленно к остатку цегакционной смеси прибавл ют 10 М раствор мочевины,, чтобы довести концентрацию мочевины в смеси до 4 М, и продолжают проведенне реакции. Через 5 и 6 ч после начала реакции. (т.е. через 1 и 2 ч после прибавлени  мочевины) отбирают по 22,5 мл реакционной смеси, к пробам прибавл ют 22,5 мл охлажденного льдом насыщенного раствора )ата аммони , после чего вьшержввают в тече1ше 30 мин при 0°С. Осадок отдел ют Есентрифугированием , промьшают 509 ным раствором сульфата аммони  и подвергают диализу в тече1ше 24 ч прошв буферного солевого раствора прн рН 7,4. После диализа каждого из образцов отбирают требуемое дл  проведени  аналнза количество, разбавл ют буферным солевым раствором при рН 7,4, содержащим 2,5% глицина, а затем анализнруют. Услюие 2. Повтор ют реакцию   обработку проб по условию 1, за исключением того, что N328406 2HiO замен ют на 50 мг CuSO4 и реакцию завершают к концу четвертого часа. Полученные таким образом растворы tipoH-iBojuiiii.x нммуиоикЛу.Иша подвергают следующим испытани м и иимерсииим. а)Сопоставление времени реакции и числа -S-ЗОзН-групп , Число -S -БОзНтрупп в образцах, окисленных тетратионатом 2HjО), представлено на фиг. 1, совместно с подобными данными, полученными при услови х и 2 примера J. Данные ;UIH образцов, которые были подвергнуты реакции и обработаны при идентичных услови х 1 примера I, но при замене N828406 2HjO на 50мг CuS04 5Н2О, также представлены на фиг. 1. б)Сопоставление времени реакщ(Н и антикомплементной активности по выщеука анному методу, приведены на фиг. 2. На фиг. 2 представлены также ангикомплементныеактивностнооразцов , окисленных ионами DJ по условию 2. Из фиг. 2 можно заключить, что антикомплементные активности всех образцов уменьшены приблизительно до 30% после 30 мин от начала реакции. в)Сопоставление времени реакции и титра противодафтерийной композиции. Образец, использованный выше в пункте (б, был подвергнут трехкратному анализу дл  определени  его тигра против дифтерингс помощью указанного выше метода. Усредненные значени  представлены на фиг. 3. Из графика можно сделать заключенне, что образцы, окисленные ионами Си показывают титр не более, чем 0,3 м.е. уже поел 30 мин от начала реакции. г)Сопоставление времени реакции н величкны оптического вращени . На фиг. 4 представлены результаты измерени  оптической активности тех же образцов, которые быть использованы выше в пункте (б) дл  измерени  антикомплементной активности (концентраци  белка 2,5%). Из представленных результатов можно сделать заключение, что присутствие иона двувалентной меди в реакшюнной смеси вызывает постепенную денатурацию по мере протекани  реакции и что присутствие мочевины содействует денатурации, о чем свидетельствует заметное изменение оптической активности. В данном случае оптическое врашенне измерено при 25°С в 1 см кювете. д)Сопоставление времени реакции и мутности после термообработки. Те же образцы, которые использованы дл  измерени  антикомплементной актнвностн в пункте (б), были подвергнуты термообработке на воздухе в теченне 4ч прн 50°С, при концентрации 2,5%. Результаты представлены на фиг. 5. Как видно из фиг. 5, присутствие даже очень незначительного количества ионов двувалентной меди вызывает ухудшение термостабильности и содействует тен денцин к агрегации. е)Сопоставление времени реакции и содержа ни  меди.. На фиг. 6 представлены результаты определени  содержанн  ионов двувалентной мсди с помощью

томно-адсорбционною анализа в тех же образцах, которые были использованы в пункте (б) дл  измерени  антикомплементной активности. Из приведенных результатов можнЪ сделать заключение, что когда примен ют ионы двувалентной меди, то промьшаиие и диализ образца не привод т к удалению ионов двувалентной меди. .

ж) Разделе1ше Н-цепей и L-цепей.

Тот же самый образец вместе с образцом, отобранным после двухчасовой реакции в условии 1 примера 2, подвергают диализу в течение 24 ч против 1 н. раствора пропионовой кислоты, содержащего 6 М мочевину, и подвергают колоночной хроматографии (Сефадекс G 200, колонка диаметром 1,5см и д;шной 80см), уравновешенной укаэшным Bbujie водным раствором. Результаты представлены на фиг. 7.

Первый пик слева одной и той же кривой соответствует Н Lj-цел м, которьш не подверглись разделению, второй пик соответствует Н-цеп м, а третий пик - L-цеп м. Диаграмма элюцни свидетельствует о том, что образец может быть разделен на Н-цепи и L-цеди.

Резюмиру  результаты , представленные на фиг. 1-7, можно сделать следующие вьшодь.

I) Из (тезультатоо опыта по условию 1 в примере 1 следует, что, когда предлагаемый способ осуществл ют в присутствии тетратионат- и сульфитионов , то при любой продолжительности времени реакции в пределах от I до 4 ч среднее число расШепленных дисульфидных св зей составл ет примерно 4, 5, а образующиес  атомы среды подвергаютс  S-сульфонированию (среднее число S-сульфонатных групп составл ет примерно 9) с образованием S-сульфонированного иммуноглобулина (фиг. 1), который можно разделить на Н-цепи и L-иепи с помощью, например, хроматографии на колонке с Сефадексом G 200 (фиг. 7). Такое производное имеет, в основном, одинаковую с нативнь1м иммуноглобулином оптическую активность (фиг, 4).

Из выщепрнведенных результатов можно с уверенностью предположить, что новое производное иммуноглобулина образуетс  главным образом путем расщеплени  только межцепочечных дисульфидных св зей нативного иммуноглобулина с последующим S-сульфонированнем образующихс  тиольных групп, учитьгаа  тот факт, что число межцепочечных дисульфидных св зей в нативном иммуноглобулине составл ет в среднем 4,5.

Такое производное иммуноглобулина имеет антикомплементную активность, пониженную приблизительно до 10% по сравнению с натнвным иммуноглобулином (фиг. 2), но про вл ет тнтр против дифтерии не Меньщий, чем нативный иммуноглобулин , как это следует из приблизительно равной антиген-св зывающей активности. Как показано на фиг. 3, при концентрации 10 вес.% производное иммуноглобулина сохран ет -по крайней мере 1,0 м.е./мл антиген-св зывающей активности.

2)Те 5-сульфоиирован1(ые произвоушые иммуноглобулина , которые образуютс  расщеплением менее или более, чем 4,5 дисульфидных св зей нативного иммуноглобулина, имеют до некоторой степени меньшее понижение их антикомплементарной активности и имеют худ1аую антиген-св зывающую активность по сравне1шю с таковыми предпочтительного производного иммуноглобулина, onMcaiffloro выше в пункте (1) (фиг. 2 и 3).

3)Если тетратионат ион в качестве окис/штел 

0 замен етс  на ион двувалентной меди, то получающиес  производные иммуноглобулина содержат ионы двувалентной меди, концентраци  которых имеет тенденцию к увеличению по мере увелн юни  времени реакции (фиг. 6). Кроме того, с увеличе5 нием времени реакции увеличиваетс  число расщепленных дисульфидных св зей нативного иммуноглобулина (фиг. 1) и поэтому трудно получить целевое стабильное производное иммуноглобулина с количеством расщепленных дисульфидных св зей

9 равных приблизительно 4,5.

Кроме того, производные иммуноглобулина, получе}шые с использованием ионов двувалентной меди, имеют пониженную антикомплементарную активность (фиг. 2), но ошювременно заметно

25 уменьшаетс  их противодифтерийный титр по сравнению с титром нативного иммуноглобулина. Таким образом, сильно уменьшаетс  их аитиген-св зьюающа  активность (фиг. 3), С другой стороны, такие производные иммуноглобулина про вл ют

30 отличную от нативного иммуноглобулина оптическую активность, что свидетельствует о наличии стрзтст рных изменений белка.

4)Подобные изменени  оптического вращени 

Э5 наблюдаютс  также у производных иммуноглобулина , полученных согласно предлагаемому способу, когда в ходе проведени  реакции в реакционную смесь добавл ют мочевину. По зтой причине рекомендуетс , чтобы в реакционной среде отсутствова0 ли мочевина, гуанидин и подобные им соединени .

П р и м е р 3, Селективное расщепление межцепочных дисульфидных св зей.

2 мл водного раствора, содержащего 20 мг человеческого иммуноглобулина 1,80мг S 5 -N82 5Оз (8,22 10 имп/мин на 1 моль) и 40 мг NaiS4Oe 2Н2О, довод т до рН 7,2 с помощью уксусной кислоты и провод т реакцию при 39°С в течение 2 ч. .Цалее реакционную смесь подвергают диализу против 5 л воды в течение 24 ч. Затем

0 медленно прибавл ют в систему мочевину и прошюиовую кислоту до конечной концентрации 4 М и 1 к. соответственно. Отбирают дл  хроматографического разделени  0,1 мл раствора. Диаграмма злюции представлена на фиг. 8. Остаток реакцион5 ной смеси подвергают хроматографии, использу  колонку с Сефадексом G 200 (диаметром 1,5 см и длиной 100см), уравновешенной 1н раствором прописновой кислоты, содержащим 4 М мочевюш. (диоактивность образцов определена с помощью жидкого сюштилл ционвого счепика и  эмерением оптической плотности при 280км (ООцо) каждой фракции. Результаты представлены на фиг. 8.

П р и м е р4. Фракционирование т желых и легких цепей.

К водаому раствору, содержащему 100 мг человеческого 7 глобулина1, прибавл ют 0,4 г NajSOs и 0,2 г Naj 84 Oft 2Н20 и рН системы довод т до 9,0 с помощью 1 н HCI. после чего подвергают реакции при комнатной температуре в течение 48 ч. После реакции незначитетиное количество нерастворимого вещества, образующегос  в системе, удал ют центрифугированием. Затем реакционную смесь подвергают даализу против 2,5л воды при в течение 15ч и далее против 2,5л водного раствора I н. пропионовой кислоты при 5° С в течение 28ч. Диализат подвергают хроматографии, использу  колонку с Сефадексом G 75 (диаметром 3,5 см и длиной 111 см), уравновешенной 1 н. раствором пропионовой кислоты. Диаграмма элюции представлена на фиг. 9. На кривой наблюдаетс  три пика, которые, как подтверждаетс  пор дком уьеличиван цегос  молекул рного веса, соответствуют нерасфракционированному S- сульфоннрованному иммуиоглобу;шну, S-сульфонированным Н-цеп м и S-сульфонированным L-цеп м. Идентификацию осуществл ют иммунологическими методами, такими , как метод Оухтерлони н иммуно-электрофорез , а также химическими методами, такими как аминокислотный анализ, определение содержани  гекозы и т.д.

Из результатов, предстаьленных на и9, можно сдел ть следующие выводы.

1)Так как первый пик на фиг. 9 соответствует иерасфрак1шонированному S-сульфонированному иммуноглобулину, второй пик соответствует S-сульфонированиым Н-цеп м, а третий пик - S сульфонированным L-цеп м, согласно иммунологическим н химическим методам анализа, то логично сделать вьюод, что подобным образом три пика на фиг. 8 (слева направо) могут быть отиесены к нерасфракционированному В-сульфонированному

иммуноглобулину, S-сульфонированным Н-цеп м и Б-сульфонированным L-цеп м соответственно. Различи  между хроматограммами обусловлены Л жсутствием мочевиаы в системе первого исследованного образца.

2)Из количества белка в L-4enH x, образующих третий .пик (фиг. 8), вычислена шл рна  концентраци , а иэ мо  рйой концентрации и величин рцдиоактивности найдено, что Ьцепн, образующие ipemfi пик, содержит 1,0 группу. Таким же образом было вычислено ч с о S-SOjH rpjrai в Н-цеп х BTOfWFo п ка, которое составл ло /, 4. S нер сфракожмшрованном S-сульфонированном иммуноглобулине их ч сж равно 8,8, а в смеси до фракцио  ровани  на зфоматографической колсиь КС - 8,6. Н-цепь и и-цвль св заны одной дисульфиднс св эыо, тогда как мижру дбум  Н-цеп мк cyiliecT&yeT среднем 2,5 дисульфиднь х св эеб.

Следовательно, адловеческий иммуноглобулин содержнт в среднем 4,5 дисульфидных св зей (межцепочечных ).

3) Согласно хроматограмме представленной на фиг. 8 больша  часть S-сульфонированного иммуноглобулина , содержащего в средаем 8,6 S-SOs Н групп, раздел ютс  на Н-цепи и L-цепи. Позтому можно предположить, что расщеплению подвергаютс  в основном межцепочечные д}1сульфщц1ые св зи, тогда как внутрицепочечныё дисульфидные св зи остаютс , в основном, неизменными.

П р и м е р 5. 133 мл человеческого у-глобулин 1 раствор ют в 1667 мл фосфатного буфера (рН 8,2), содержащего 2,5% глицина. К раствору прибавл ют 7,0 г Naj 80з, растворенного в 100 мл того же буфера, и 4,4 г Nsa 84 О 2Н2 О, растворенного В 100 мл того же буфера, и провод т реакщ1ю при 45° С в течение 3 ч. Реакционную смесь подвергают диализу в течение 6 ч против 20 л буферного солевого раствора, состо щего из натриевой соли, использу  химический стакан фирмы Dow Chemicals и ультрафильтр типа в/HFV-l. Добавл емую извне жидкость дл  диализа замен ют через кажда1е ч. Диализат концентрируют до объема 180 мл с помощью того же фильтра и затем к Диализату прибавл ют 50 г ошцина.

Раствор отфилыровьшают в стерильных услови х через мембрану с дааметром пор 0,25 мк, сливают в бутылочки объемом 10мл по 5мл в каждую и лиофилизуют. Антикомплементна  активность CHso стерильного раствора при 50%-ной концентрации составл ет 4,3%.

П р и м е р 6. Сравнение активности антител по отношению к антигенам в опытах с использованием Naa 84 Oj или Cuj в качестве окислител . Условие 1.

К 67 мл человеческого у-гпобу)тн&1, 7,1 г N32 ЗОэ и 0,43 г N62 S4 О« 2Hj О прибавл ют 0,1 М трис-НС1 буферный растворJсодержащий 2,5% глицина , чтобы довести общий объем смеси до 1,0л. После трехчасовой реакщ1и при 45° С реакционную жидкость подвергают диализу, использу  химический стакан фирмы Dow Chemical н ультрафильтр типа B/HFV-1, и диализат концентрируют до объема 200 мл, отфильтровывают в стерильных услови х через 0,25 мк -фильтр Seitz, лиофилнзуют , добавл ют 2,5 г глицина и разбавл ют водой до 5,0%-ного раствора.

Условие 2..

Повтор ют реакцию и обработку по условию 1, :ИО измен ют те1Ш1ературу (25° С) и врем  реакции (24ч).

Условие 3.

Повтор ют реакцию и обработку по условию., ГВй Ма ЗдОс Н О замен ют на 0,16 г СиЗОд

StifO.

Растворы производных иммуноглобулина, по учвшюе йо услови м 1-3, были испытаны иа

про вление ими антктелыюй активности к раэличI ным штигенам. Результаты представлены в табл. 2

Из данных, представленных в таблш1е 2, можно сделать следующие выводы;

1)Если используют тегратионат (условие ),то дифтерийный титр S-сульфонированного иммуноглобулина эквивалентен титру нативного иммуногжЛулина , но если используют нон двувалентной меди (условие 3), то пронзвОдное иммуноглобулина почти не про вл ет активности.

2)Ои1исительно титра кори S-сульфонированный иммуноглобулин, который был окислен тетратнонатом (услови  1 и 2), сохран ет более чем 60% титра нативного иммуноглобулина. Производное иммуноглобулина, окисленное ионом двухвалентной меди (условие 3). имеет значительно более низкую активность (менее чем 30%). Из этих данных следует, что понижение антительной активности при использовании иона двyiвaлeнтнoй меди более значительно, чем при использовании тетратионата .

Пример. Испытание S -сульфонированного глобулина в животном организме на а}гтиком 1лементарную активность.

Человеческий S -сульфонированнын иммуноглобулин также, как и в условии 1 примера 6.

3 мл 5%-ного буферного солевого раствора, содержащего 2,5% г и1шиа (рН 7,4), 3 мл буферного солевого раствора без добавок (дл  контрол ) и I мл 15%-ного необработанного человеческого иммуноглобулина в буферном солевом растворе, содержащем 2,5% глицина, также дл  контрол , ввод т внутривенно самкам морских свинок с живым весом 200-300 г и реакцию организма на уровень сыворотопгаго комплемента определ ют с помощью сывороток по 1,0 мл кажда , извлеченных пункцией сердца при определенных интервалах. Результаты представлены на фиг. 10, откуда следует , что наблюдаетс  резкое понижение уровн  сывороточного комплемента после внутривенной ИН1ЛКЦНИ необработанного человеческого иммуноглобулина , которое отсутствует при подобном введении человеческого S -сульфонированного иммуноглобулина . У морских свинок досле инъекции необработанного иммуноглобул 1на врем  от времени наблюдаетс  также дгюжь, котора  отсутcieyeT у живЬтных, которым вводи.ли внутривенно S -сульфонированный иммуноглобулин.

Примере. Стойкость кроличьего SсуЛьфойнрованного иммуноглобулина в живом организме и повторное образование дисульфидных св зей.

а) Получение кроличьего анти БСА-ДНФ антиTerta:

Бьиий сьшороточный альбумин (БСА) реагирует с ди1ттрофторфенолом с образованием соединени , которое в дальнейщем будет обозначатьс 

сокращенно БСА-ЛПФ. БСА-ДНФ ввод т кроликам (вид новозеландский белый, О ) через их подуилечки на ланке ног вместе с полным стимул тором Фрейнда. На 30-1 день после инъекции отбирают кровь у кроликов из коронарной артерии. Полученную антисьшоротку обрабатьшают по н вестному способу путем осаждени  45%-ным раствором сульфата аммони  и получают кроличий анти БСА-ДНФ иммуноглобулин.

б) Получение образцов:

Условие 1.

Анти БСА-ДНФ иммуноглобулин гидролизуют при 37°С в течение 24 ч вместе с 1 вес.% пепсина по отношению к иммуноглобулину. Гидролизат подвергают хроматографии на колонке с Сефадексом G 50 и получают остаток О (ас )2. Условие 2.

250 мг анта БСА-ДНФ иммуноглобулина, 80мг NajSOs и 79 мг N828406 2HjO раствор ют в 25 мл 0,1 М трис-НС(, содержащего 2,5% глицина (рН 8,2), и провод т реакцию при 37°С в течение 4 ч. Реакционную смесь подвергают диализу в течение 24 ч против буферного солевого раствора (рН7,4).

Получают кролнчнй S -сульфонированный иммуноглобулин .

Условие 3.

БСА-ДНФ иммуноглобулин используют без дальнейшей обработки.

в) Определение скорости удалени  и стойкости.

Вышеуказанные образцы приготовлены (каждый в отдельности) в виде растворов 5%-ной концентрации .

Испытуемые растворы ввод т внутривенно

кроликам (вид новозеландский белый, о , образец 1 ввод т трем кроликам, образец 2 - трем кроликам иобразец3 - двум кроликам) дозой примерно 3 мл. У испытуемых животных при заранее определенных интервалах отбирают кровь -и

извлекают из нее плазму. Анти БСА-ДНФ активность в плазме определ ют реакцией пассивной гемагглютннашш, при которой БСА-ДНФ фиксируетс  на овечьих красных кров ных клежах, с помощью глутарового альдегида и примен ют метод микротитра. Результаты представлены на фиг. 11, откуда следует, что скорость удалени  из организма фрагментов О (ас ) 2 весьма высока, (через указанные в табл. 3 интервалы извлекают по 0,5 мл плазмы). Радиоактивность плазмы опредет

л ют с помошью жидкостного сцкнтилл цнониого анализа. Результаты представлены в табл. 3.

На основании полученных результ1тов можно предположить, что-S-SOj И гр)ттпы в S-супьфонированном иммуноглобулине расщепл ютс  в крови.

Т а б л и II а I

Формула  эобретевк 

1. Способ цолучеюн производных  ммуног о буп н, отличающий с   тем, что с nenuo полу ченм продукта, ие содержащего лоио двума е твой меди, натив ый ш муноглобули  ввод т во взаимодействие в воююй среде одновреме1шо или последователь о в любом пор дке с соедввевюм, способным дават тетратионатные ионы (а),

Таблица 3

соединением, способным давать сульфит-ионы (6), дл  расщеплени  3-4,5 межцрпочечмлх или 3-5 меж- и внутрицепочечных дисульфндных св зей

иммуноглобулина и сульфоннровани  образующихс  1НОЛЫ1ЫХ групп, причем ионы тетратисиата и суль4нпа присутствуют в реакционной сусле в мольном количестве, по крайней мере в {ша раза превышающем количество щссульфнаных сп эей.

которые должны быть подвергнуты расщеплению.

2.Соособ no п. 1, о г л н ч ю щ н и с   пм, что качестве соединений (а) примен ют тетратноиовую KKcnoiy или твтрп шит натри , калн  шш аммони , а в качестве соединени  (б) - сернистую кислоту, сульфнт натри , сульфит калн  или бн-. сульфнт натри .

3.Способ по пп. 2, отличающийс  тем,, что соеданени  (а) н (б) перед пооведеннем реакцнн с иммуноглобулином раствор ют в воде или в буферном растворе.

4.Способ по пп. 1-3, отличающийс  тем. что температуру во врем  рвакщш поддерживают в пределах JO-50C.

5.Способ по пп. 1-4, отличающийс  тем, что рИ во врем  реакщш поддерживают в пределах 3,5-Ш.

итиквнплвнвнтнав активность 100 Г(У,

О

Фиг.2

О 1/Z f

fff

/ff %Тг + Мочевина Раствор

Pui.3 ff 3 2, It facmtop ФисЛ б

QD6SO т 0.3

O.Z

U, О,

о оО

NaiSitOg

Си

2,f % /г Раствор

Фи1.5

-Си

Г.0

ftf

го 30 ito

Г(7

Fr.Me.

Фмг.7

cfpm

- sooo

2000

Гг. Wo.

yff

Fr.Ne.

фабЛ

0.5

3040

Zff

10

SOSO

Fr.Ne.

фиг.9

I

V. si

H

i .

f

V

:

о /ввИ

м

:J