SU423026A1 - METHOD FOR DETERMINING HISTONES - Google Patents

Description

1one

Изобретение относитс  к медицине и может быть использовано в цитологии, генетике и биохимии.This invention relates to medicine and can be used in cytology, genetics and biochemistry.

Известен способ определени  гистонов путем их электрофоретического разделени  и вы влени  белковых зю.п (Красителем амидочерным . Однако этом способ ,не позвол ет выдел ть фракции с определенным аминокислотным составом.The known method of determining histones by their electrophoretic separation and the detection of protein s.p. (Amidocher dye. However, this method does not allow the isolation of fractions with a specific amino acid composition.

Целью изобретени   вл етс  обнаружение фракции гистонов, богатой лизипом. Дл  этого электрофореграммы, отмытые от избытка амидо-черного, обрабатывают в растворе частич«о полимеризованного красител  тиазинового р да, например, толуидинового синего.The aim of the invention is the detection of a histone fraction rich in lysypus. To do this, electrophoregrams, washed from an excess of amido black, are treated in solution with particles of a polymerized dye of the thiazine series, for example, toluidine blue.

Пример 1. На первом, этапе известным образом получают электрофореграмму гистонов на 15%-ном полиакриламидном геле, которую окрашивают в 1%-ном растворе амидо-черного в смеси :метанол-уксусна  кислота-вода (в соотношении 5; 1:5) в, течение часа при комнатной температуре. Затем блок гел  с про вленной электрофореграммой отмывают от избытка амидо-чериого в 1н. растворе уксусной кислоты в течение 24-48 час, мен   экстрагирующую среду через каждые 3-4 час. Конец экстракции определ ют визуально по достижению бесцветного фона.Example 1. At the first, stage, a histone electrophoregram is obtained on a 15% polyacrylamide gel, which is stained in a 1% solution of amido black in a mixture of: methanol-acetic acid-water (5; 1: 5) in for one hour at room temperature. Then, the gel block with the developed electrophoregram is washed from the excess amido black in 1N. Acetic acid solution for 24-48 hours, change the extracting medium every 3-4 hours. The end of the extraction is determined visually by reaching a colorless background.

Дальнейшую обработку провод т следуюш ,ИМ образом.Further processing is carried out in the following way.

22

В 100 мл дистиллированной воды внос т 50 мг толуидинового синего (ЧДА) и перемешивают при нагревании или выдерживают при комнатной температуре несколько суток. В полученный 0,05%-ный раствор микронипеткой по капле внос т 0,15-0,20 мл 0,1%--ного раствора рибонуклеиновой кислоты (РНК) в 0,05 М ацетатом буфере (рН 5,5) встр хива  до выпадени  частично полимеризованного на РНК красител  в виде фиолетово-синих хлопьев. Суспензию выдерживают в течение часа прм комнатной температуре, после чего осадок отдел ют центрифугированием, дважды промывают водой, заливают осадок 1 в.In 100 ml of distilled water, 50 mg of toluidine blue (PSA) are added and stirred under heating or kept at room temperature for several days. To the resulting 0.05% solution a 0.15-0.20 ml of a 0.1% solution of ribonucleic acid (RNA) in 0.05 M acetate buffer (pH 5.5) shake is added dropwise with a micropipette. before the dye partially polymerized on RNA precipitates in the form of violet-blue flakes. The suspension is kept at room temperature for one hour, after which the precipitate is separated by centrifugation, washed twice with water, and the precipitate is poured over 1 in.

раствором уксусной кислоты и через 1-2 час смесь BiHOBb центрифугируют, отбрасыва  осадок . Полученный прозрачный -раствор roroiB к использованию дл  о.К1раски электрофореrpaiMiM .Acetic acid solution and after 1-2 hours the mixture BiHOBb centrifuged, discarding the precipitate. The resulting clear roroiB solution is suitable for use for o.K1 electrophore rpaiMiM colors.

В указанный раствор погружают блок полиакриламидного гел , полученного на первой стадии, на 1-2 часа, отмывают в 1 н. растворе уксусной кислоты в течение 12-24 час, мен   среду через каждые 3-4 час, « используют дл  анализа известным образом. Богатые ЛИЗИ1НОМ фракции гистонов имеют красно-фиолетовый цвет на фоне темно-синих зон, свидетельствующих о присутствии прочих белков. Пример 2. Все операции но подготовкеIn this solution, immerse the block of polyacrylamide gel, obtained in the first stage, for 1-2 hours, washed in 1 n. Acetic acid solution for 12-24 hours, change medium every 3-4 hours, "used for analysis in a known manner. Histone-rich fractions of histones have a red-violet color against a background of dark blue zones indicating the presence of other proteins. Example 2. All operations but preparation

электроферограммы, окрашеппой амидо-черным , и их обработке раствором частично полимеризованного красител  тиазинового р да производ т, как в примере 1.electropherograms, amide-black dyestuffs, and their treatment with a solution of a partially polymerized dye of the thiazine series are produced as in Example 1.

Раствор красител  приготовл ют следующим образом (по экспресс-методу). Известным образом готов т блоки чистого 10-15%ного полиакр ламидного гел  объемом 2000- 2500 мм в виде пр моугольных параллелепипедод (В данном случае размер 60x20X2 мм), которые в течение 30-60 ми  пропитывают 0,5%-ным раствором РНК в ацетатном буфере , после чего быстро споласкивают водой. Затем эти блоки на 20 мин -погружают в 0,05%-ный водный раствор толуидииового синего и вновь споласкиВают водой. После выдержива и  в течение часа 0|бработа:нных таким образом блоков в 1 н. уксусной кислоте получают требуемый |реакти1В в .виде раствора.The dye solution is prepared as follows (by the express method). In a known manner, blocks of pure 10–15% polyacrylamide gel with a volume of 2000– 2500 mm are prepared in the form of rectangular parallelepipeds (In this case, the size is 60x20X2 mm), which are soaked with 30% to 60% RNA in acetate buffer, then quickly rinsed with water. Then these blocks for 20 minutes are immersed in a 0.05% aqueous solution of toluidium blue and rinsed again with water. After aging and for an hour 0 | working: thus blocks in 1 n. with acetic acid, the required reagent 1B is obtained in the form of a solution.

В этом случае  ркость окраски по сравнению с результатами обработки по примеру 1 повышаетс . Упрощаетс  и ускор етс  процесс подготовки окрашивающего раствора. Срок хранени  в среднем 3-4 недели, возможно использование в течение трех .мес цев.In this case, the brightness of the coloration increases compared to the results of the treatment of Example 1. Simplifying and speeding up the process of preparing the staining solution. Shelf life is on average 3-4 weeks, can be used for three months.

Готовые электрофореграммы хран т в 1 н. растворе уксусной кислоты.The finished electrophoregrams are stored at 1N. acetic acid solution.

Предмет изобретени Subject invention

Способ определени  гистонов путем их электрофоретического разделени  и вы влени  бел1ковых зон красителем амндо-черным, отличающийс  тем, что, с целью обнаружени  фракции гистонов, богатой лизином, электрофореграммы, отмытые от избытка амидо-черного , обрабатывают в растворе частично полимеризованного красител  тиазинового р да , например, толуидинового синего.The method of determining histones by electrophoretic separation and detecting the white zones with an amndo-black dye, characterized in that, in order to detect a histone fraction rich in lysine, electrophoregram washed from an excess of amido black, is treated in a solution of a partially polymerized dye of the thiazine series, for example, toluidine blue.