SU1731066A3

SU1731066A3 - Method of creatine amidinohydrolase preparation

Info

Publication number: SU1731066A3
Application number: SU884355715A
Authority: SU
Inventors: Шумахер Гюнтер; Букель Петер
Original assignee: Берингер Маннхайм Гмбх (Фирма)
Priority date: 1987-05-12
Filing date: 1988-05-11
Publication date: 1992-04-30
Also published as: DD289560A5; UA12993A; ZA883324B

Abstract

Изобретение относитс к генетической инженерии и касаетс получени креатина- мидиногидролазы, котора стабильнее, чем нативный фермент, и поэтому более пригодна дл определени содержани креатини- на в сыворотке, плазме или моче. Целью изобретени вл етс повышение стабиль1- ности фермента. Конструируют плазмиды рВТ 109 и рВТ 119, содержащие ген креати- намидиногидролазы. в котором произошла аминокис потна замена в положении 109, а в случае рВТ 119 также в положении 355 - замена Val на Met. Благодар секвенсированию рВТ 119 установлено, что в положении 1063 последовательности в кодирующей нити G заменена A/G - А/ так, что триплет СТА превращен вАТб. В результате трансформации штаммов-реципиентов полученными плазмидами созданы штамм Е. col DSM 4105, содержащий плазмиду р ВТ 109 и штамм Е. col I DS М 4106, соде ржа- щий плазмиду рВТ 119, конститутивно экс- прессирующие креатинамидиногидролазу. 4 табл.The invention relates to genetic engineering and relates to the production of creatine-imidine hydrolase, which is more stable than the native enzyme, and therefore more suitable for determining creatinine content in serum, plasma or urine. The aim of the invention is to increase the stability of the enzyme. The plasmids pBT 109 and pBT 119 are constructed containing the creatinamine hydrolase gene. in which the amino acid substitution occurred at position 109, and in the case of rVT 119 also at position 355, Val is replaced by Met. Due to sequencing of pBT 119, it has been established that at position 1063 of the sequence in the coding string G is replaced by A / G - A / so that the CTA triplet is turned into ATB. As a result of the transformation of the recipient strains, the obtained plasmids created the E. col DSM 4105 strain, containing the plasmid p BT 109 and the strain E. col I DS M 4106, containing the plasmid pBT 119, constitutively expressing creatinine hydrolase. 4 tab.

Description

Изобретение относитс к генетической инженерии и касаетс получени креатина- мидиногидролазы,котора стабильнее, чем нативный фермент, и поэтому более пригодна дл определени содержани креатини- на в сыворотке, плазме или моче.The invention relates to genetic engineering and relates to the production of creatine-imidine hydrolase, which is more stable than the native enzyme, and therefore more suitable for determining creatinine content in serum, plasma or urine.

Фермент креатинамидиногидролаза ЕС 3.5.3.3 находит промышленное применение дл определени креатинина. Его используют дл диагноза заболеваний почек, при которых в сыворотке или моче содержание креатинина отклон етс от таковых здорового организма.The enzyme creatinine hydrolase EC 3.5.3.3 finds industrial application for the determination of creatinine. It is used for the diagnosis of kidney diseases in which serum or urine creatinine content deviates from those of a healthy organism.

Известны микроорганизмы, которые при индукции за счет креатина в состо нииMicroorganisms are known that upon induction with creatine in the state

вырабатывать креатинамидиногидролазу в достаточном дл переработки количестве.produce creatinine hydrolase in sufficient quantity for processing.

Однако достигаемый выход и стоимость фермента представл ют собой лимитирующий фактор дл промышленного применени фермента.However, the yield achieved and the cost of the enzyme are a limiting factor for the industrial use of the enzyme.

Известен также способ получени данного фермента, при котором удалось выделитьген ,кодирующий креатинамидиногидролазу из Pseudomonas putlda, клонировать его рВР 322. После трансформации микроорганизмов вида Е, coll или полученной рекомбинантной ДНК удалось получить конститутивно креатинамидиногидролазу .There is also known a method of obtaining this enzyme, in which it was possible to isolate the gene encoding creatine disodium hydrolase from Pseudomonas putlda, to clone it with pBP 322. After transformation of microorganisms of type E, coll or obtained recombinant DNA, it was possible to obtain constitutively creatine disodium hydrolase.

ОABOUT

Этот способ с помощью генной инженерии креатинамидиногидролазы эффективнее и легче в осуществлении, чем выделение из индуцированного, не содержащего никакого плазмида микроорганизма.This method using genetic engineering of creatinine hydrolase is more efficient and easier to implement than the isolation from an induced microorganism that does not contain any plasmid.

Однако получаемый с помощью данного способа фермент естественного типа обладает только ограниченной детергентной и термической стабильностью и, таким образом , оптимально непригоден дл использовани в клиническом тест-способе.However, the natural type enzyme obtained by this method has only limited detergent and thermal stability and, thus, is optimally unsuitable for use in the clinical test method.

Цель изобретени - повышение стабильности фермента.The purpose of the invention is to increase the stability of the enzyme.

Получены креатинамидиногидролазы, которые катализируют реакцию: .Creatinamine hydrolases were obtained which catalyze the reaction:.

Креатин + НаО - саркозин + мочевина.Creatine + NaO - sarcosine + urea.

В отличие от нативного фермента в полученном белке происходит замена аминокислоты в положении 109. Аминокислота аланин замен етс валимом. Полученный фермент обладает намного лучшей стабильностью , чем нативный фермент.Unlike the native enzyme, the resulting protein replaces the amino acid at position 109. The amino acid alanine is replaced by valim. The resulting enzyme has much better stability than the native enzyme.

Сконструированы плазмиды рВТ 109 и рВТ 119, содержащие ген креатинамидиногидролазы , в котором произошла аминокислотна замена в положении 109, а в случае рВТ 119 также в положении 355 заменена Val и Met. Благодар секвенсированию рВТ 119 установлено, что в положении 1063 последовательности в кодирующей нити G заменен на A (G А), тзк что триплет GTG npcBpaajen в АТС. В результате трансформации штаммов рецинентом полученными плазммдами созданы штаммы Е. coll, DSM 4105, содержащие плазмиду рВТ 109, и штамм Е. coll, DSM 4106, содержащий плазмиду рВТ 119, конститутивно экспрессиру- ющие креатинамидиногидролазу.The plasmids pBT 109 and pBT 119 were constructed, containing the creatinine hydrolase gene, in which the amino acid substitution occurred at position 109, and in the case of pBT 119 also replaced position 355 with Val and Met. Due to sequencing of pBT 119, it was established that in position 1063 of the sequence in the coding thread G is replaced by A (G A), which is a GTG triplet npcBpaajen in the ATC. As a result of the transformation of strains by the recipient, the plasmds obtained by strains created E. coll, DSM 4105, containing the plasmid rWT 109, and the strain E. coll, DSM 4106, containing the plasmid rWT 119, constitutively expressing creatine dinosine hydrolase.

Пример. Клетки Е. coll DSM 4105, Е. coll DSM 4106 и дл сравнени Е. coll DSM 3143 выращивают в течение ночи в фермен- торах на 1 л.Example. E. coli DSM 4105, E. coli DSM 4106 cells and for comparison E. coli DSM 3143 cells are grown overnight in 1 liter fermenters.

Среда - полна (дрожжи, пентоновый экстракт); 0,4% глюкозы; 100 ммоль/л фосфатного буфера.The medium is full (yeast, pentone extract); 0.4% glucose; 100 mmol / l phosphate buffer.

После 15-минутного центрифугировани при 8000 об/мин клетки перевод т в удобную дл переработки форму в French- прессе и креатинамидиногидролазу очищают путем фрекцинированил через молекул рное сито (Софакрил S 200). Полученные ферменты инкубируют при указан- ных в табл. 3 услови х и затемAfter a 15-minute centrifugation at 8000 rpm, the cells are transferred to a form that is convenient for processing in a French press and the creatine hydrolase is purified by freccinating through a molecular sieve (Sofacryl S 200). The resulting enzymes are incubated at the table below. 3 conditions and then

осуществл ют определение фермента при применении тест-комбинации Мочевина (ВМ определение № 124770, табл. 4).enzyme determination is carried out using the urea test combination (BM Definition No. 124770, Table 4).

Табл. 1 воспроизводит характер стабильности предлагаемых в изобретении мутантов креатинамидиногидролазы по сравнению с ферментом полученным способом-прототипом при 37°С, причем тест- смесь 1 из тест-комбинацииTab. 1 reproduces the nature of the stability of the creatinine hydrolase mutants proposed in the invention as compared with the enzyme obtained by the prototype method at 37 ° C, and the test mixture 1 from the test combination

креатинин-РАР (ВМ - определение № 839 434); исходна активность: 12 У(мл) 100%. Результаты сравнени констант Mlchaells (Км) при 37°С, 0,1 моль/л Трио- HCI, рН 8,0 (оптимальные тест-услови ) приведены в табл. 2.creatinine-PAP (BM - definition No. 839 434); initial activity: 12 W (ml) 100%. The results of the comparison of the Mlchaells constants (Km) at 37 ° C, 0.1 mol / l Tri-HCl, pH 8.0 (optimal test conditions) are given in Table. 2

Тест-услови : фосфатный буфер 20 ммоль/л; рН 8,0;Test conditions: phosphate buffer 20 mmol / l; pH 8.0;

Нативна креатинамидиногидролиза 1,05 мг белка/мл (8,0 V/мг)..Native creatine disodium hydrolysis 1.05 mg protein / ml (8.0 V / mg) ..

Полученна креатинамидиногидролаза 1,10 мг белка/мл (8,7 V/мг), (аминокислотаThe resulting creatine amino hydrolase 1.10 mg protein / ml (8.7 V / mg), (amino acid

109 Val)109 Val)

Фермент инкубируют при указанных тест-услови х и затем осуществл ют определение фермента при тест-комбинаци х Мочевина (ВМ определение № 124770).The enzyme is incubated under the indicated test conditions and then the enzyme is determined by the test combinations Urea (BM Definition No. 124770).

Полученный фермент обладает большей стабильностью и с помощью данной креатинамидиногидролазы можно избежать потерь активности фермента при определении креатинина и осуществл ть надежно такиеThe resulting enzyme is more stable and with the help of this creatine dihydrolase, it is possible to avoid the loss of enzyme activity in the determination of creatinine and to reliably carry out such

определени также через более длительные промежутки времени, на основании улучшенных свойств также возможно уменьшение количества фермента в креагинин-тесте.determination also at longer intervals, on the basis of improved properties, it is also possible to reduce the amount of the enzyme in the craaginine test.

Форму л а изобретени Formula of invention

Способ получени креатинамидиногидролазы , предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей креатинамидиногидролазы,A method for preparing creatinamide hydrolase involving the construction of recombinant plasmid DNA encoding creatine single hydrolase,

трансформацию полученной ДНК штамма бактерий Escherichla coll, культивирование трансформированного штамма, выделение и очистку целевого продукта, отличающийс тем, что, с целью повышени стабильности фермента, конструируют рекомби- нантную плазмидную ДНК рВТ 109 или рВТ 119, трансформации подвергают штамм E.coll DSM 4105, или DSM 4106. при этом плазмидой трансформируют штамм Е. colltransformation of the obtained DNA of the Escherichla coll bacteria strain, cultivation of the transformed strain, isolation and purification of the target product, characterized in that, in order to increase the stability of the enzyme, recombinant plasmid DNA pBT 109 or pBT 119 is transformed, E.Coll DSM 4105 strain is transformed, or DSM 4106. with this plasmid transform the strain E. coll

DSM 4105, а плазмидой рВТ 119 - штамм Е. COII4106.DSM 4105, and the pBT 119 plasmid, strain E. COII4106.

Таблица 1Table 1

Стабильность полученной креатинамидиногидролазы по сравнению с известнымThe stability of the resulting creatinine hydrolase compared with the known

ферментомan enzyme

Константа Михасталиса ферментовConstant Mihastalis enzymes

Определение остаточной активности фермента при оптимальных услови х при различных температурахDetermination of residual enzyme activity under optimal conditions at various temperatures

Определение фермента при 37 СDetermination of the enzyme at 37 ° C

Врем , Креатинэмидиногидролаза oi-т мин(патент ФРГ V 350018 t A1)Time, Creatine imidine hydrolase oi-t min (German patent V 350018 t A1)

(Д5М ) Сравнение(D5M) Comparison

О3,3 V/мл (активность 100%)O3.3 V / ml (100% activity)

151,9 V/мл (остаточна активность 59$)151.9 V / ml (residual activity $ 59)

300,6 V/мл (остаточна активность - 18%)300.6 V / ml (residual activity - 18%)

600,2 V/мл (остаточна активность 6$)600.2 V / ml (residual activity is $ 6)

О3,3 V/мл (активность « 100%)O3.3 V / ml (activity "100%)

Таблица 2table 2

Таблица 3Table 3

Таблица1)Table 1)

за мутанта ) for the mutant)

ию 100%)yy 100%)

активassets

ктивketiv

100%)100%)

Тест-услови Test conditions

Тест-смесь I иэ тест-комбинацииTest mix I and test combinations

Креатииин-РАР (ВМ н- 839 i3 t)Creatine-PAP (BM n-839 i3 t)

В 125 ммоль/л фосфатного буфера I детергентIn 125 mmol / l phosphate buffer I detergent

Claims

Формула изобретенияClaim

Способ получения креатинамидиногидролазы, предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей креатинамидиногидролазы, трансформацию полученной ДНК штамма бактерий Escherichia coll, культивирование трансформированного штамма, выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности фермента, конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК рВТ 109 или рВТ 119, трансформации подвергают штамм E.coll DSM 4105, или DSM 4106, при этом плазмидой трансформируют штамм Е. coll DSM 4105, а плазмидой рВТ 119 - штамм Е. coll 4106.A method of producing creatinidinohydrolase, comprising constructing a recombinant plasmid DNA encoding creatinidinohydrolase, transforming the DNA of a bacterial strain of Escherichia coll, culturing a transformed strain, isolating and purifying the target product, characterized in that, in order to increase the stability of the enzyme, a recombinant plasmid p or plasmid DNA 119, E. collo strain DSM 4105, or DSM 4106 is transformed, with E. col DSM 4105 being transformed with plasmid and E. co strain with plasmid pBT 119. ll 4106.

Стабильность полученной креатинамидиногидролазы по сравнению с известным ферментом ~The stability of the obtained creatinamidinohydrolase compared with the known enzyme ~

Таблица 1Table 1

Креатинамидиногидролаза из Е. coll (кодирующий плазмид) Creatinamidinohydrolase from E. coll (coding plasmid) Остаточная активность, %, спустя, мин Residual activity,%, after, min 15 fifteen 30 thirty 45 45 60 60 DSM 3143(рВТ2а-1 DSM3148P) DSM 3143 (rBT2a-1 DSM3148P) 69 69 51 51 39 39 27 27 DSM 4105(рВТ 109 DSM4108P) DSM 4105 (rBT 109 DSM4108P) 96 96 90 90 84 84 84 84 DSM 4106(рВТ119 DSM4107P) DSM 4106 (rBT119 DSM4107P) 102 102 102 102 102 102 102 102

Таблица 2table 2

Константа Михасталиса ферментовMihastalis Constant Enzymes

Креатинамидиногидролаза из Е. coll (кодирующий плазмид) Creatinamidinohydrolase from E. coll (coding plasmid) К_т, ммоль/лK _t , mmol / l DSM 3143 (рВТ2а-1 DSM 3148 Р) DSM 3143 (rVT2a-1 DSM 3148 P) 25 25 DSM 4105 (рВТ 109 DSM 4108 Р) DSM 4105 (rBT 109 DSM 4108 R) 20 20 DSM 4106 (рВТ 119 DSM 4107 Р) DSM 4106 (rVT 119 DSM 4107 R) Тб Tb

Таблица 3Table 3

Определение остаточной активности фермента при оптимальных условиях при различных температурахDetermination of residual enzyme activity under optimal conditions at various temperatures

Температу- Temperature Остаточная активность, %, к Residual activity,%, k реатиназы и reatinases and инкубация, мин incubation, min ра, °C Ra, ° C (DSM3143) (DSM3143) (DSM4105) (DSM4105) 30 thirty 60 60 120 120 30 thirty 60 60 120 120 37 37 100 100 86 86 80 80 100 100 96 96 90 90 42 42 87 87 36 36 13 thirteen 84 84 73 73 63 63 г 47 g 47 1 1 0,4 0.4 0 0 42 42 2 2 0 0 Л.,..: L., ..: 0 0 - - - - 3 3 - - - -

Т эбли ц а 4T ebley a 4

Определение фермента при 37°СDetermination of the enzyme at 37 ° C

Время, мин Time min Креатинамидиногидролаза об-типа (патент ФРГ 4- 3500184 А1) (ASM 3143) Сравнение Ob-type creatinamidinohydrolase (FRG patent 4-3500184 A1) (ASM 3143) Comparison Креатинамидиногидролаза мутанта (аминокислота 109“val) (ДЭН <1105) Согласно изобретению Mutant creatinamidinohydrolase (amino acid 109 “val) (SS <1105) According to the invention Тест-условия Test conditions 0 0 3,3 V/мл (активность = 100%) 3.3 V / ml (activity = 100%) 3,0 V/мл (активность » 100%) 3.0 V / ml (activity "100%) Тест-смесь I из тест-комбинации Test mixture I from the test combination 15 fifteen •1,9 V/мл (остаточная активность = 59%) • 1.9 V / ml (residual activity = 59%) 3,0 V/мл (остаточная активность « 100%) 3.0 V / ml (residual activity "100%) Креатинин-РАР Creatinine-PAP 30 thirty 0,6 V/мл (остаточная активность = 18%) 0.6 V / ml (residual activity = 18%) 2,7 V/мл (остаточная активность = 91 %) 2.7 V / ml (residual activity = 91%) (ВМ Г 839^34) (VM G 839 ^ 34) 60 60 0,2 V/мл (остаточная активность = 6%) 0.2 V / ml (residual activity = 6%) 2,5 V/мл (остаточная активность) 2.5 V / ml (residual activity) 0 0 3,3 V/мл (активность « 100%) 3.3 V / ml (activity "100%) 3,0 V/мл (активность = 100%) 3.0 V / ml (activity = 100%) В 125 нмоль/л фосфатного буфера I детергент In 125 nmol / L phosphate buffer I detergent 15 fifteen 0,7 V/мл (остаточная активность = 21%) 0.7 V / ml (residual activity = 21%) 2,7 V/мл (остаточная активность « 91%) 2.7 V / ml (residual activity "91%) зо zo 0,0 V/мл (остаточная активность = 0%) 0.0 V / ml (residual activity = 0%) 2,7 V/нл (остаточная активность » 91 ί) 2.7 V / nl (residual activity »91 ί) 60 60 0,0 V/мл (остаточная активность = 0%) 0.0 V / ml (residual activity = 0%) 2,1 V/мл (остаточная активность = 71 ί) 2.1 V / ml (residual activity = 71 ί)

Примечание: ферменты инкубируют при указанных условиях и затем осуществляют определение фермента при применении тест-комбинаций.Мочевина¹¹ , .Note: the enzymes are incubated under the indicated conditions and then the enzyme is determined using test combinations. Urea ¹¹ ,.

(ВМ определение V 12^770)·(VM definition V 12 ^ 770)