SU1622821A1 - Method of determining activity of catalase in blood plasma - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биохимии и медицине и позвол ет определ ть активность каталазы плазмы крови в норме и при гипербилнрубинемин. Цель изобретени  - сокращение времени определени  при одновременном создании возможности определени  активности ка- талаэы в плазме при гнпербнлирубине- мии. Готов т стандартную и исследуемую пробы. В стандартную пробу к плазме крови добавл ют в конечной концентрации 0,009-0,09%-ный растпор азида натри  и перекись водорода, а з исследуемую пробу - перекись водорода. После инкубации в течение 55-60 с в исследуемую пробу плазмы крови внос т азид натри , а затем в обе пробы - молибдат аммони . Спектрофотометричес- ки определ ют разность экстинкций и рассчитывают активность каталаэы плазмы крови. КЛThe invention relates to biochemistry and medicine and allows the determination of the activity of blood plasma catalase in normal conditions and with hyperbilnubinemine. The purpose of the invention is to reduce the time of determination while at the same time making it possible to determine the activity of catalay in plasma during gnperbnlirubinemia. Prepare standard and test samples. In a standard sample, 0.009-0.09% raspor sodium azide and hydrogen peroxide are added to the final blood plasma in a final concentration, and hydrogen peroxide is added to the test sample. After incubation for 55-60 seconds, sodium azide is added to the plasma sample to be tested, and then ammonium molybdate is introduced into both samples. Spectrophotometrically determine the difference in extinction and calculate the activity of catalae of blood plasma. CL

Description

Изобретение относитс  к биохимии и медицине и может быть использовано в эксперименте и клинике дл  определени  активности каталазы плазмы крови .The invention relates to biochemistry and medicine and can be used in experiment and clinic to determine the activity of catalase in blood plasma.

Цель изобретени  - сокращение времени и создание возможности определени  активности каталазы в плазме при гипербилирубинемии.The purpose of the invention is to reduce the time and make it possible to determine the activity of catalase in plasma in hyperbilirubinemia.

Способ осуществл етс  следующим образом.The method is carried out as follows.

Венозную кровь(3 мл) центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин, при этом в. качестве антикоагул нта используют гепарин из расчета 50 ЕД/мл крови, Дл  приготовлени  стандартного образца к 0,1 мл плазмы крови добавл ют 0,1 мл раствора азида натри  0,2-2%- ной концентрации и 2 мл 0,03%-ногоVenous blood (3 ml) is centrifuged for 10 minutes at 3000 rpm, c. Heparin is used as an anticoagulant at the rate of 50 U / ml of blood. To prepare a standard sample, 0.1 ml of sodium azide solution of 0.2-2% concentration and 2 ml of 0.03% are added to 0.1 ml of blood plasma. foot

раствора перекиси «одорода (Нг02). В исследуемой пробе к 0,1 мл плазмы крови добавл ют 2,0 мл 0,03%-ного раствора . Обе пробы став т на инкубацию при 25°С на 55-60 с, После минутного инкубировани  в исследуемую пробу добавл ют О,1 мл раствора азида натри  0,2-2/Ј-ной концентрации с целью ингибировани  реакции разложени  H20jj каталазои плазмы крови (конечна  концентраци  азида 0,009-0,09%). В стандартную и исследуемую пробы внос т 1,0 мл 4%-ного раствора молиб- дата аммони , который с непрореагиро- вавшей Н2О2 образует окрашенный комплекс Интенсивность цветной реакции измер ют спектрофотометрически на приборе Specol 21 (BIIP) при длине волны 410 нм. Определ ют разницу экстинкоa solution of peroxide "hydrogen (Нг02). In the test sample, 2.0 ml of a 0.03% solution is added to 0.1 ml of blood plasma. Both samples were incubated at 25 ° C for 55-60 s. After a minute incubation, O, 1 ml of a 0.2-2 / Ј-nd concentration of sodium azide solution was added to the test sample in order to inhibit the decomposition of blood plasma H20jj (final azide concentration 0.009-0.09%). 1.0 ml of a 4% ammonium molybdate solution which, with unreacted H2O2 forms a colored complex, is introduced into the standard and test samples. The color reaction intensity is measured spectrophotometrically using a Specol 21 instrument (BIIP) at a wavelength of 410 nm. Determine the difference of extinko

1C ГС1C HS

0000

кto

ции между стандартной и опытной пробами и производ т расчет активности каталазы плазмы крови по формуле .between standard and experimental samples and calculates the activity of plasma catalase by the formula.

UE-M-K ,UE-M-K,

А BUT

где А - активность каталазы, мкмоль -с л ;where a is the activity of catalase, μmol -c l;

ДЕ - разность экстинкций контрольной и опытной проб;DE - the difference of extinction of the control and experimental samples;

V - объем пробы, мл (3,2);V - sample volume, ml (3.2);

К - коэффициент пересчёта на 1 лK - conversion factor for 1 l

ллазмы крови (10000); Ј - коэффициент мол рной экстинкций перекиси водорода, мкмоль (22,2); t - врем  инкубации проб, с (60).blood plasma (10,000); Ј — molar extinction coefficient of hydrogen peroxide, μmol (22.2); t is the incubation time of the samples, s (60).

Дл  определени  оптимальной инги- бирующей концентрации азида натри  (в 0,1 мл раствора) проведено исслеование , результаты которого показывают , что 0,2%-ный раствор азида натри  обладает максимальной ингиби- рующей способностью и превышение указанного верхнего предела концентрации азида натри  не приводит к большему угнетению активности фермента, а влечет повышенный расход данного реактива . Использование концентраций азида натри  меньше 0,2% приводит к снижению ингибировани  каталазы. Следовательно , 0,2-2%-ный раствор азица натри   вл етс  оптимальной концентрацией данного вещества в цел х достаточного угнетени  каталазы плазмы крови (конечна  концентраци  азида 0,009-0,09%).In order to determine the optimal inhibitory concentration of sodium azide (in 0.1 ml of solution), an investigation was carried out, the results of which show that a 0.2% solution of sodium azide has the maximum inhibitory ability and the excess of the specified upper limit of sodium azide does not lead to to greater inhibition of enzyme activity, and entails an increased consumption of this reagent. The use of sodium azide concentrations of less than 0.2% leads to a decrease in catalase inhibition. Therefore, a 0.2–2% solution of azithium sodium is the optimal concentration of this substance in order to sufficiently suppress catalase of blood plasma (the final azide concentration is 0.009-0.09%).

Проведенное изучение выраженности ингибирующего эффекта азида натри  показывает , что полна  каталазна  активность плазмы крови (без добавлени  азида натри ) равна 0,50 + . + 0,06 мкмоль л а остаточна  (после добавлени  0,2-2%-ного раствора азида натри ) 0,016 + +. 0,003 мкмоль-с - л что составл ет 3,34% от полной. Следовательно, выраженность ингибируюгцего эффекта азида натри  на каталазу плазмы крови достигает 96,66%.A study of the severity of the inhibitory effect of sodium azide shows that the full catalase activity of blood plasma (without the addition of sodium azide) is equal to 0.50 +. + 0.06 µmol L and residual (after adding 0.2-2% sodium azide solution) 0.016 + +. 0.003 µmol-s - which is 3.34% of the total. Consequently, the severity of the inhibitory effect of sodium azide on plasma catalase reaches 96.66%.

Дл  выбора оптимального времени инкубации изучена кинетика активности каталазы. Линейна  зависимость активности фермента от времени инкубации сохран етс  в течение 55-60 с, При дальнейшем увеличении времени инкубации скорость разложени  перекиси водорода каталазой плазмы крови постепенно снижаетс ,, Сокращение времени инкубации менее 55 с ведет к уменьшению разницы экстинкций контрольной и опытной проб, а при увеличении врь- мени инкубации более 60 с зависимость активности каталазы от времени инкубации тер ет линейный характер.To select the optimal incubation time, the kinetics of catalase activity has been studied. The linear dependence of the enzyme activity on incubation time is maintained for 55-60 s. With a further increase in incubation time, the rate of decomposition of hydrogen peroxide by catalase of the blood plasma gradually decreases. A decrease in incubation time of less than 55 s leads to a decrease in the extinction difference of the control and experimental samples, an increase in incubation time of more than 60 s, the dependence of catalase activity on the incubation time loses linear character.

Пример 1. 3 мл венозной кровиExample 1. 3 ml of venous blood

практически здорового человека (общий билирубин 14,7 мкмоль/л), вз той с использованием гепарина из расчета 50 КД/мл, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Полу5 ченную плазму крови отсасывают в чистую пробирку. Дл  приготовлени  стандартного образца к 0,1 мл плазмы добавл ют 0,1мл 0,2%-ного раствора азида натри  (конечна  концентраци a practically healthy person (total bilirubin 14.7 µmol / l), taken using heparin at a rate of 50 kD / ml, is centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes. The resulting blood plasma is aspirated into a clean tube. To prepare a standard sample, 0.1 ml of a 0.2% solution of sodium azide is added to 0.1 ml of plasma (the final concentration is

0,004) и мл 0,03%-ной перекиси водорода . В исследуемой пробг к 0,1 мл плазмы крови - 2,0 мл 0,031-ного раствора перекиси водорода (). Обе пробы став т на инкубацию при (0,004) and ml of 0.03% hydrogen peroxide. In the test run to 0.1 ml of blood plasma - 2.0 ml of a 0.031% solution of hydrogen peroxide (). Both samples were incubated at (

на 60 с. После выдерживани  1 мин при этой температуре в исследуемую пробу добавл ют 0,1 мл 0, раствора азида натри . Затем как а стандартную , так и и исследуемую пробыfor 60 s. After 1 minute at this temperature, 0.1 ml of sodium azide solution was added to the test sample. Then both a standard and the test sample

д внос т по I , U мл 4/о-но о раствора мо- лгбд та аммони . После 2-минутного центрифугировани  при 3000 об./мин измер ю экстинкцию стандартном и опытной проб на спектрофотометре Specol 21 (ВНР) при длине волны 410 нм. Разница экстинкций ( Д1 ) между контрольной и опытной пробами в конкретном случае равна 0,042. Использу  указанную формулу, определ ют акQ тивность каталазы плазмы крови:d are added in accordance with I, U ml 4 / o-but o solution of molgbd and ammonium. After 2 minutes of centrifugation at 3000 rpm, the extinction of a standard and experimental sample was measured on a Specol 21 spectrophotometer (BHP) at 410 nm. The difference of extinction (D1) between the control and experimental samples in a particular case is equal to 0.042. Using the above formula, the potency of plasma catalase is determined:

. AK-V-K-1 -1. AK-V-K-1 -1

А р 1,009 мкмоль С «л .And p 1,009 micromol C "l.

II р и м е р 2. Вз тие крови и полу- 5 чение плазмы крови здорового человека провод т идентично примеру 1. Дл  приготовлени  стандартной пробы к 0,1 мл плазмы крови добавл ют 0,1 мл 1%-ного раствора азида натри  (ко- д нечна  концентраци  0,) и 2,0 мл 0,03%-ного раствора . Исследуемую пробу готов т как в примере 1, Обе пробы став т на инкубацию при 25 С на 58 с. После инкубации в исследуемую пробу добавл ют 0,1 мл 1%- ного раствора азида натри . Затем в стандартную и опытную пробы внос т по 1,0 мл 4%-ного раствора молибдата . аммони . Последующие опррацни прово5II p u m e r 2. Blood sampling and blood plasma production from a healthy person is carried out identically to Example 1. To prepare a standard sample, 0.1 ml of 1% sodium azide solution is added to 0.1 ml of blood plasma. (code concentration 0,) and 2.0 ml of 0.03% solution. The test sample is prepared as in Example 1. Both samples are set for incubation at 25 ° C for 58 s. After incubation, 0.1 ml of a 1% solution of sodium azide is added to the test sample. Then 1.0 ml of 4% molybdate solution is added to the standard and experimental samples. ammonium. Subsequent Failures

лц т как в примере 1, Разница экстинк- ций между стандартной и исследуемой пробами в данном случае 0,040. Активность каталаэы плазмы кровиlts t as in example 1, the difference of extinctions between the standard and test samples in this case is 0.040. Plasma katalaea activity

А BUT

. К E7t . K E7t

0,994 мкмоль-с 0.994 µmol-s

Пример 3. У здорового челове129 ,4 мкмоль/л) провод т забор крови и выдел ют плазму как в примере 1. 1п  приготовлени  стандартной пробы 5 к 0,1 мл плазмы крови добавл ют 0,1мл 1%-ного раствора азида натри  и 2,0 мл 0,03%-ного раствора H,j02 , Исследуемую пробу готов т как в примере 1. Обе пробы став т на инкубацию при наExample 3. A healthy human, 4 µmol / l) was sampled and plasma was extracted as in Example 1. 1p preparing a standard sample 5 to 0.1 ml of blood plasma was added 0.1 ml of 1% sodium azide solution and 2.0 ml of a 0.03% solution of H, j02. The test sample is prepared as in Example 1. Both samples are incubated for

ка провод т забор венозной крови и вы-Ю 58 с. После инкубации в исследуемую дел ют плазму как в примере 1. Дл пробу добавл ют О,1 мл 1%-ного раствоприготовлени  стандартной пробы к 0,1 мл плазмы крови добавл ют 0,1 мл 2%-ного раствора азида натри  (конечна  концентраци  0,09%) и 2,0 мл 0,03%-ного раствора . Исследуему пробу готов т как в примере 1. Обе пробы став т на инкубацию при 25 С, на 55 с. После инкубации в исследуемую пробу добавл ют 0,1 мл 2%-ного раствора азида натри . В стандартную и опытную пробы внос т по 1,0 мл 4%-ного раствора молибдата аммони . Последующие операции провод т как в примере 1. Разница экстинкций между стандартной и исследуемой пробами в данном случае 0,ОЗЙ. Активность ка- талазы плазмы кровиka carried out the collection of venous blood and you-u 58 p. After incubation, the plasma to be tested is divided as in Example 1. O, 1 ml of 1% solution of the preparation of a standard sample is added to the sample. 0.1 ml of 2% sodium azide solution is added to 0.1 ml of blood plasma (final concentration 0.09%) and 2.0 ml of a 0.03% solution. The test sample is prepared as in Example 1. Both samples are set for incubation at 25 ° C for 55 s. After incubation, 0.1 ml of a 2% sodium azide solution is added to the test sample. 1.0 ml of 4% ammonium molybdate solution is added to the standard and experimental samples. Subsequent operations are carried out as in example 1. The difference of extinctions between the standard and the samples under investigation in this case is 0, OYZ. Blood plasma catalase activity

А BUT

ДЕ. у.к Ј-сDE. w.k с s

0, 99t мкмоль -с 0,99t micromol -c

И р и м е р 4. У больного стедне- т желой формой вирусного гепатита В (общий билирубин плазмы крови 129,4 мкмоль/л) провод т забор крови и выделение плазмы способом, описанным в примере 1. Дл  приготовлени  стандартной пробы к О, 1 мл плазмь. крови добавл ют 0,1 мл 0,2/-ногораствора азида натри  и 2,0 мл 0,03%-но- го раствора Н202. Исследуемую пробу готов т как в примере 1. Обе пробы став т на инкубацию при 25 С на 60 с. После инкубации в исследуемую пробу добавл ют 0,1 мл 0,2%-ного раствора азида натри . В стандартную и опытную пробы внос т по 1,0 мл 4%-ного раствора молибдата аммони . Последующие операции провод т как в примере 1. Разница экстинкцми между стандартной и опытной пробами в данном случае 0,08. Активность каталазы плазмы кровиExample 4. In a patient with a steadfast form of viral hepatitis B (total plasma bilirubin 129.4 mol / l), blood is taken and plasma is released in the manner described in Example 1. To prepare a standard sample for O , 1 ml of plasma. 0.1 ml of a solution of sodium azide and 2.0 ml of a 0.03% solution of H2O2 are added to the blood. The test sample is prepared as in Example 1. Both samples are set for incubation at 25 ° C for 60 s. After incubation, 0.1 ml of a 0.2% sodium azide solution is added to the test sample. 1.0 ml of 4% ammonium molybdate solution is added to the standard and experimental samples. Subsequent operations are carried out as in Example 1. The difference in extinction between the standard and experimental samples is 0.08 in this case. Plasma Catalase Activity

А BUT

UE- ----1 ,92 мкмоль сUE- ---- 1, 92 μmol s

ИримерЗ. У больного средне- т желой формой вирусного гепатита В (общий билирубин плазмы кровиIrimerZ. A patient has a moderate form of viral hepatitis B (total bilirubin in blood plasma

129 ,4 мкмоль/л) провод т забор крови и выдел ют плазму как в примере 1. 1п  приготовлени  стандартной пробы 5 к 0,1 мл плазмы крови добавл ют 0,1мл 1%-ного раствора азида натри  и 2,0 мл 0,03%-ного раствора H,j02 , Исследуемую пробу готов т как в примере 1. Обе пробы став т на инкубацию при на129, 4 µmol / l) blood is drawn and plasma is extracted as in example 1. 1p of preparation of a standard sample 5 to 0.1 ml of blood plasma are added with 0.1 ml of 1% sodium azide solution and 2.0 ml of 0 , 03% solution of H, j02. The test sample is prepared as in Example 1. Both samples are incubated for

ра азида натри . В стандартную и опытную пробы внос т по 1,0 мл 4%-ного раствора молибдата аммони . Последу- ющие операции провод т как в примере 1. Разница экстинкций между стандартной и опытной пробами в данном случае 0,077. Активность каталазы плазмыsodium azide. 1.0 ml of 4% ammonium molybdate solution is added to the standard and experimental samples. Subsequent operations are carried out as in Example 1. The difference of extinction between the standard and experimental samples in this case is 0.077. Plasma Catalase Activity

кровиof blood

1,91 мкмоль -с 1.91 µmol -s

-I-I

лl

II р и м е р 6. У этого же больного провод т вз тие крови и получениеII p and me R 6. In the same patient, blood was drawn and

плазмы крови как в примере 1. Дл  приготовлени  стандартной пробы к 0,1 мл плачмы крови добавл ют 0,1 мл 2%-ного рлствора атида натри  и 2,С мл 0,03%-ного раствора . Исследуемуюblood plasma as in example 1. To prepare a standard sample, 0.1 ml of 2% sodium acetate solution and 2 ml of 0.03% solution are added to 0.1 ml of blood plasma. Researched

пробу готов т как в примере 1. Обе пробы став т на инкубацию при 25 С на 55 с. После инкубации в исследуемую пробу добавл ют О, 1 мл 2%-ного раствора лчида натри . Затем в обеA sample is prepared as in Example 1. Both samples are incubated at 25 ° C for 55 s. After incubation, O, 1 ml of 2% sodium lhid solution is added to the test sample. Then both

пробы внос.т по 1,0 мл 4%-ного раствора молиОдата аммони . Последующие операции осуществл ют как в примере 1. Разница экстинкций между стандартной и исследуемой пробами в данном случае 0,073, что позвол ет определить активность каталазы плазмы крови:Samples contribute 1.0 ml of a 4% solution of ammonium ammonium hydroxide. Subsequent operations are carried out as in Example 1. The difference in extinction between the standard and test samples in this case is 0.073, which makes it possible to determine the activity of plasma catalase:

А BUT

йк -у-кyk-to-k

еe

1,91 мкмоль-с л 1.91 µmol-s l

Использу  известный и предлагаемый способы изучена активность каталазы крови больных вирусным гепатитом В (ВГВ) различной степени т жести иUsing the known and proposed methods, the activity of blood catalase in patients with viral hepatitis B (HBV) of varying degrees of severity and

50 практически здоровых доноров в сопоставлении с уровнем билирубинемии. Исследовани , аналогичные предлагаемому способу, проведены с использованием и других известных ингибиторов50 practically healthy donors in comparison with the level of bilirubinemia. Studies similar to the proposed method were carried out using other known inhibitors.

55 каталаэы.i55 katalaei.i

Результаты определени  активности данного фермента с применением в качестве ингибиторов азида натри  и цианида кали  приведены в таблице.The results of determining the activity of this enzyme using sodium azide and potassium cyanide as inhibitors are shown in the table.

Полученные данные свидетельствуют о практической идентичности активности каталазы в одинаковых группах обследованных лиц при использовании различных ингибиторов предлагаемого способа (учитыва  очень высокую токсичность цианида кали , в лаборатор- .ной практике следует отдать предпоч- (. тение азиду натри ) .The obtained data testify to the practical identity of catalase activity in the same groups of examined individuals using various inhibitors of the proposed method (taking into account the very high toxicity of potassium cyanide, laboratory practice should be given preference (sodium azide).

Использу  предлагаемый способ в плазме крови больных ВГВ средней и -т желой формами активность каталаэы была значительно повышенаf однако при известном способе такого повыше- ни  обнаружено не было, что указывает на неадекватность известного технического решени ,Using the proposed method in the blood plasma of HBV patients of medium and severe forms, the activity of katalaea was significantly increased; however, this method was not found with the known method, which indicates the inadequacy of the known technical solution

Существенно, что у отдельных больных с высокой-билирубинемией опреде- лить активность каталазы плазмы крови известным способом оказалось невозможным , что подтверждаетс  следующим наблюдением.It is significant that in individual patients with high bilirubinemia, it was impossible to determine the activity of plasma plasma catalase in a known manner, which is confirmed by the following observation.

Пример. Больна  Ч., 48 лет, находилась на лечении в Гродненской областной инфекционной больнице в 1988 году. Биохимическое исследование крови показало, что уровень обгде- го билирубина равен 260 ммоль/л-ч (норма - до 20,5), активность аланин- аминотрансферазы 4,5 ммоль/л ч (норма - до 0,7), обнаружен поверхностный антиген вируса гепатита В. Поставлен диагноз: вирусный гепатит В, т жела  формас При использовании известного способа определение активности каталазы провести не удалось, поскольку экстинкци  (0,475) холостой пробы (с максимальной концентрацией окрашенногExample. Ill Ch., 48 years old, was treated at the Grodno Regional Infectious Diseases Hospital in 1988. Biochemical blood tests showed that the level of bilirubin is 260 mmol / lh (the norm is up to 20.5), the activity of alanine aminotransferase is 4.5 mmol / lh (the norm is up to 0.7), the surface antigen is detected Hepatitis B virus diagnosis. The diagnosis was made: viral hepatitis B, tuberculosis. When using the known method it was not possible to determine the activity of catalase, since the extinction (0.475) is a single sample (with a maximum concentration of

комплекса перекиси водорода с молиб- датом аммони ) оказалась меньше экстинкции опытной пробы (0,), содержащей плазму крови больной Ч. Однако предлагаемым способом активность каталазы была успешно определена (2,16 мкмоль-с ч л ).the hydrogen peroxide complex with ammonium molybdate) turned out to be less than the extinction of the experimental sample (0,) containing the blood plasma of patient H. However, the proposed method showed that catalase activity was successfully determined (2.16 μmol – h h).

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает по сравнению с известным сокращение срока инкубации в 10 раз, тем самым в 3 раза уменьша  длительность определени , более высокую специфичность и адекватность исследовани 1 за счет создани  возможности определени  активности каталазы в плазме крови при гипербилирубинемии.Thus, the proposed method provides a 10-fold reduction in the incubation period by 10 times, thereby reducing the duration of the determination by 3 times, the higher specificity and adequacy of the study 1 by making it possible to determine the plasma catalase activity in hyperbilirubinemia.

Claims (1)

Формула изобретени Invention Formula Способ определени  активности каталазы в плазме крови путем инкубации контрольной пробы, содержащей перекись водорода, и опытной пробы, содержащей плазму и перекись водорода, с последующим добавлением к обеим пробам молибдата аммони  и регистрацией оптической плотности, отличающийс  тем, что, с целью сокращени  времени при одновременном создании возможности определени  при гипербилирубинемии, в контрольную и опытную пробы дополнительно ввод т азид натри  в конечной концентрации 0,009-0,09%, причем в контрольную про бу азид натри  ввод т перед началом инкубации, в опытную пробу - после окончани  инкубации перед введением молибдата аммони , а инкубацию провод т в течение 55-60 с.A method for determining plasma catalase activity by incubating a control sample containing hydrogen peroxide and an experimental sample containing plasma and hydrogen peroxide, followed by the addition of ammonium molybdate to both samples and recording the optical density, characterized in that creating the possibility of determining during hyperbilirubinemia, sodium azide is additionally introduced into the control and experimental samples in a final concentration of 0.009-0.09%, and in the control sample sodium azide is added before the start of incubation, into the experimental sample after the end of incubation before the introduction of ammonium molybdate, and the incubation is carried out for 55-60 s. 16,5+3,1 0,56+0,0616.5 + 3.1 0.56 + 0.06 41,2+9,65 0,84 + 0,0741.2 + 9.65 0.84 + 0.07 1,01+0,07 1,44+0,091.01 + 0.07 1.44 + 0.09 0,98+0,0/ 1,39+0,080.98 + 0.0 / 1.39 + 0.08 41,2+9,65 0,84 + 0,0741.2 + 9.65 0.84 + 0.07 114,6+17,3 192,4+21,7 0,35+0,06 0,03+0,004114.6 + 17.3 192.4 + 21.7 0.35 + 0.06 0.03 + 0.004 1,9110,13 2,4210,181.9110.13 2.4210.18 1,92 + 0,15 2,5Ц-0,201.92 + 0.15 2.5TS-0.20