SU1469856A1 - Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей синтез полипептидных субстанций против гепатита А - Google Patents

Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей синтез полипептидных субстанций против гепатита А Download PDF

Info

Publication number
SU1469856A1
SU1469856A1 SU864102079A SU4102079A SU1469856A1 SU 1469856 A1 SU1469856 A1 SU 1469856A1 SU 864102079 A SU864102079 A SU 864102079A SU 4102079 A SU4102079 A SU 4102079A SU 1469856 A1 SU1469856 A1 SU 1469856A1
Authority
SU
USSR - Soviet Union
Prior art keywords
fragment
plasmid
hav
protein
proteins
Prior art date
Application number
SU864102079A
Other languages
English (en)
Inventor
Ю.А. Овчинников
Е.Д. Свердлов
С.А. Царев
Е.И. Фролов
Т.О. Рохлина
В.М. Ростапшов
Т.Л. Ажикина
С.Г. Арсенян
Е.В. Снешков
С.В. Маркова
И.Е. Коврига
Ю.Ю. Кусов
Т.А. Насташенко
Н.М. Вальяно
М.С. Балаян
С.Г. Дроздов
В.Е. Чижиков
Н.А. Петров
С.К. Василенко
Г.Г. Приходько
В.М. Блинов
О.И. Серпинский
И.Х. Урманов
В.В. Кравченко
О.Г. Анджапаридзе
В.И. Чернос
Т.П. Антонова
Original Assignee
Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина
Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР
Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Молекулярной Биологии
Московский научно-исследовательский институт вирусных препаратов
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина, Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР, Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Молекулярной Биологии, Московский научно-исследовательский институт вирусных препаратов filed Critical Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина
Priority to SU864102079A priority Critical patent/SU1469856A1/ru
Priority to PCT/SU1987/000085 priority patent/WO1988000973A1/ru
Priority to EP19870905562 priority patent/EP0276330A4/de
Priority to JP50498387A priority patent/JPH01500485A/ja
Application granted granted Critical
Publication of SU1469856A1 publication Critical patent/SU1469856A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32411—Hepatovirus, i.e. hepatitis A virus
    • C12N2770/32422—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32411—Hepatovirus, i.e. hepatitis A virus
    • C12N2770/32434—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

терферон человекав слитый с белками ВГЛ, в бактериапьФт клетках, или плаамиду pSPUU, встраиваемую в вектор оеповакцн ы ЛИВП,- обеспечивающую синтез полипептидов   живоп к клетках,
iviK плазмиду pSPUU, встраиваемую и вирус осповакцины ЛИВП, обеспечивающую синтез полипептидов в ораганизмах животных.
Изобретеиие относитс  к генетической инженерии и биотехнологии и может быть использовано дщ  получени  генно-инженерной вакцины против гепатита А.
I Целью изобретени   вл етс  получе- ; ние погшпептидных субстанций, способных вызывать образование антител при введе ЕИИ их в организм животных.
В качестве генома вируса гепатита А (ВГА) используют фрагмент длиной I 4296 п.о., содержащий I фрагмент длиной 3372 и.о., коди- , 1 уюп1ий все структурные. и некоторые
неструктурные белки ВГА, И; фрагмент длиной 924 п.о., коди- . рузрщий вирусную протеазу, способную расщепл ть синтезируемый вирусным
ts
20
25
30
геномом непрерывный полипептид на Отдельные белки,
или фрагмент длиной 3372 п.о., кодирующий все структурные и некоторые неструктурные белки ВГА;
или фрагмент длиной 1243 п.о., кодирующий подипептидную цепь, содержащую фрагменты белков UP3 со ПО по 233 а.к. и UP1 с 1 по 271 а.к.;
или фрагмент длиной 389 ПоО,, кодирующий фрагмент белка UP1 с 4 по 129 а.к.;
или фрагмент.длиной 144 п .о., кодирующий фрагмент белка UP1 с 4 по 57 а.к.;
или синтетический фрагмент ДНК, кодирующий фрагмент белка UP1 с II по 25 а.к., имеющий следующую структуру: AATTCACAGTTAGTACTGAACAAAATGTACCAGATCCACAGGTAGGTATTGCG
GTGTCAATCATGACTTGTTTTACATGGTCTAGGTGTCCATCCATAACGCCTAG,
слитые с у5-галактозидазой фрагмен- ты белков ВГА или плазмиды pIFN-ful и pIFN-fu2, состо щие из большего Е. coRI-Pstl фрагмента плазмиды pBR 322, гена зрелого 1-интерферона человека, наход щегос  под контролем trp-npoMOTopa Е. coli, в котором терминирующий кодон убран с помощью эндонуклеазы рестрикации Hinf1 и заменен синтетическими фрагментами ДНК, имеющими следующую структуру:
а в -качестве экспрессирующих векторов используют любой экспрессирую- щий вектор,обеспечивающий синтез требуемых вирусных белков в бактериальных или животных клетках , в частности плазмиды pUR 291 и pUR 292, которые обеспечивают синтез полипептидных субстанций в бактериальных клетках, например, в штаммах Ё. coli К12. ГСолипептид- ные субстанции представл ют собой
40
AS
AGT GAG ATG GTG ТТТ CAA GGT GGA AGA GCA TCC GAG ACT GGA GTC TAG GAG AAA GTT CGA GGT TGT GGT AGG GTC TG
AGT GAG ATG GTG TTT GAA GGT GGA AGA GGA TGG GAA GAT GTG GA GTG TAG GAG AAA GTT GGA GGT TGT GGT AGG GTT СТА G
Пример)о 5 мкг плазмиды pUR 291 расщепл ют в стандартных ус- лови х эндонуклеазой рестрикции Pstl. Реакционна  смесь содержит 10 ьй1 трис-НС1, 10 MM.MgCl, 10 viM. 2-меркаптозтанола,5 мкг плазмидной ДНК и 5 е.а. фермента. Инкубацию осуществл ют при 37°G в течеиие 1ч.
геномом непрерывный полипептид на Отдельные белки,
или фрагмент длиной 3372 п.о., кодирующий все структурные и некоторые неструктурные белки ВГА;
или фрагмент длиной 1243 п.о., кодирующий подипептидную цепь, содержащую фрагменты белков UP3 со ПО по 233 а.к. и UP1 с 1 по 271 а.к.;
или фрагмент длиной 389 ПоО,, кодирующий фрагмент белка UP1 с 4 по 129 а.к.;
или фрагмент.длиной 144 п .о., кодирующий фрагмент белка UP1 с 4 по 57 а.к.;
или синтетический фрагмент ДНК, кодирующий фрагмент белка UP1 с II по 25 а.к., имеющий следующую структуру: GATCCACAGGTAGGTATTGCG
Требуемый фрагмент элюируют феноль- ной экстракцией после электрофореза в низкоплавкой агарозе. Полученный фрагмент лигируют с Pstl фраг- ментом длиной 389 п.о., вьщеленным из плазмиды pHAU22. Лигазной смесью трансформируют компонентные клетки штамма Е. coli ВМН 71-18.
Клоны, содержащие плазмиды с нуж- ой ориентацией фрагмента, наращива- , т в ЪБ-среде с ампициллином и IPTG, интезируемый гибридный белок, со- ; ержаЕ ий полную /5-гапактозидазу фрагмент 5елка UP1 ВГА (с 4 по 129.а.к.), выдел ют из бактериальных клеток и используют дл  иммунизации морских свинок и кроликов.
Через несколько недель после завершени  курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестирзтот на содержание антител, способных св зыватьс  с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами .
В результате иммунизации у одной из трех морских свинок и у одного из трех кроликов в сыворотке были обнаружены антитела, способные св зыватьс  с нативным ВГА.
Пример2. 5 мкг плазмиды pUR 292 расщепл ют в стандартных услови х эндонуклеазой рестрикции Pstl. Реакционна  смесь содержит 10 мМ трис-HCl, 0 мМ MgCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 5 мкг плазмидной ДКК и 5 е.а. фермента. Инкубацию осуществл ют при 37°С в течение 1 ч. Требуемый фрагмент элюируют феноль- ной экстракцией после электрофореза в низкоплавкой агарозе. Полученный фрагмент лигируют с Pstl фрагментом длиной 3372 По о., выделенным из плазмиды pHAU23 (ДАН СССР, 1985, т. 285, 1014) в реакционной смеси, содержащей 0,1 мкг векторной ДНК, 0,1 мкг ДНК-вставки в вьшшприведенном буфере в присутствии гАТР (0,1 мМ). Лигаз- ной смесью трансформируют компонентные клетки штамма Е. coli ВИН 71-18 в клонах, содержащих плазмиду со ; встроенным фрагментом, определ ют ориентацию последнего с помощью эн- донуклеазы рестрикции BamHl.
Клоны, содержащие плазмиды с нужной ориентацией фрагмента, наращивают в LB-среде с ампициллином и IPTG, синтезируемый гибридный белок, содержащий полную д-галактозидазу, все структурные (начина  с 38 а.к. балка UP4) и часть неструктурных белков ВГА, выдел ют из бактериальных клеток и используют дл  иммунизации морских свинок.
Через несколько недель после завершени  курса иммунизации сыворот- ку морских свинок тестируют на содержание антител, способных св зыватьс  с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами .
В результате иммунизации у одной из четырех свинок в сыворотке были обнаружены антитела, способные св зыватьс  с нативным ВГА,
ПримерЗоЗ мкг плазмиды pIFN-ful расщепл ют в стандартных услови х эндонуклеазной рес рикции Pstl, как описано в примере 1. Полученный фрагмент лигируют с Pstl
фрагментом длиной 389 п.о., выделенным из плазмиды pHAU22. Лигазной смесью трансформируют компетентные кпетки штамма Е. coli НВ 101 и в клонах , содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определ ют ориентацию последнего с помощью эндонуклеаз рестрикции Bgl11 и ВашН.
Клоны, содержащие плазмиды с нужной ориентацией фрагмента, наращивают в среде М-9 с тетрациклином и бе- та-индолилакрШ1овой кислотой. Синтезируемый гибридный .6 ело к, со держащий полный гамма-интерферон человека и фрагмент белка UP1 ВГА (с 4 по
129 а.к.), выдел ют из бактериальных клеток и используют дл  иммунизации - морских свинок и кроликов.
Через несколько недель после завершени  курса иммунизации сыворотку
морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных св зыватьс  с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами .
Многие из иммунизированных морских свинок и кроликов содержали антитела , способные св зыватьс  с нативным вирусом.
Пример4. 5 мкг плазмиды
pIFN-ful pHAU22 расщепл ют в стандартных услови х эндонуклеазой рестрикции Bgl11 и затем Pstl, как описано в примере 1. Полученный больший фрагмент лигируют с Bgl II - (/iPuuII)Pstl
фрагментом длиной 1243 п.о., выделенным из плазмиды pHAU23. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е. .coli НВ 101 ив клонах, содержащих плазкиду со встроенным фрагментом, .определ ют ориентацию последнего с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI и Baml.
Кпоны, содержащие плазмиды с нужной ориентацией фрагмента, наращивают
в среде М-9 с; тетрациклином и л-индЬ- липакриловой кислотой, синтезируемый гибридный белок, содержащий полный Т интерферон человека и фрагменты е)ел-, ков UP3 (со 110 по 23 а.к.) и UP1 (с 1 по 271 а.к.) ВГА, выдел ют из бактериальных клеток и используют дл  иммунизации морских свинок и кроликов .
20
25
30
Через несколько недель после за- вершени  курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных св зыватьс  с нативным ВГА в конкурент- 15 ной реакции с человеческими антителами . .
Большинство иммунизированных морских свинок и кроликов содержали анти- тела .в достаточно высоких концентрг ци х , способные св зыватьс  с нативным вирусом.
Пример5.5 мкг плазмиды p(FN-fu2 расщепл ют в стандартных услови х зндонуклеазной рестрикции Pstl, как описано в примере 1. Полу- ченньй фрагмент лигируют с Pstl фрагментов длиной 3372 п.о.,, вьзделенным из плазмиды pHAU23. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е. coli НВ 10.1 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определ ют ориентацию последнего с помощью эндонуклеаз рестрикции Bglll и EcoRl.
Клоны, содержаш 1е плазмиды (piFN- fu2-pHAU23) с фрагментом в нужной ориентации, наращивают в среде М-9 с тетрациклином и -индолилакрило- вой кислотой, Синтезируемьй гибрид- - ный белок, содержащий полный «-интер- ферон человека и все структурные (начина  с 38 а. к о ЦРА) и часть неструк--. турных белков ВГА, выдел ют из бактериальных клеток, используют дл  . иммунизации морских свинок и кроликов .
Через йесколько недель после завершени  курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на соде | жа1ше антител, способных св зыватьс  с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими ;ан- ителами.
Большинство им1«унизированШ)1х морских свинок и кроликов содержали анти- тела в достаточно высоких концентраци х , способные св зыватьс  с натив-/ ным вирусом.
10
50
40
,
0
5
0
5
.
Примерб, 5 мкг плазмиды i pTFN-ful расщепл ют в стандартных услови х зндонуклеазой рестрикции Pstl, как описано в примере 1. Полу- ченньй фрагмент лигируют с Pstl- BamHl фрагментом длиной 144 п.о., кодирующим фрагмент блока UP 1 с 4 по 57 а.к,, выделенным из плазмиды 0 PHAU22, и синтетическим адаптором, имеющий следующую структуру:
GAT ССА GTT ТАА CTG СА СТ САА АТТ G
Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е. coli НВ 101 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определ ют ориентацию последнего с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoR) и Baml,
Клоны, содержащие плазмиды с нужной ориентацией фрагмента, нарагцива- ют в среде М-9 с- тетрациклином и . д- индолилакриловой кислотбй. Синтезируемый гибридный белок, содержащий полный 1 -интерферон человека и фрагмент UP1 белка ВГА (с 4 по 57 а,к.) выдел ют из бактериальных клеток, используют дл  иммунизации морских свинок и кроликов.
Через несколько недель после завершени  курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных св зьтатьс  с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами.
Большинство иммунизированных- морских свинок и кроликов содержали антитела в достаточно высоких концентра- ци х, способные св зыватьс  с нативным вирусом, ,
Приме, р 7, 5 мкг плазмиды ptFN-ful расщепл ют в стандартных услови х зндонуклеазой рестрикции Pstl, как описано в примере К Полученный фрагмент лигируют с синтети ческим фрагментом ДНК, кодирующим 0 фрагмент белка UP1 с 11 по 25 а,к.
и адапторным фрагментом, имеющим следующую структуру:
0
G GGT ТСС G АС GTC ест AGG СТТ АА
Клоны, содержащие фрагменты в нужной ориентации, наращивают в
среде М-9 с тетрациклином и й-индо- лилакриловой кислотой. Синтезируемый гибридный белок, содержащий полный Y -интерферон человека и фрагмент бел- ка UP1 ВГА с 11 по 25 а.к., выдел ют из бактериальных клеток, используют дл  иммунизации морских свинок и кроликов
Через несколько недель после за- вершени  курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных св зыватьс  с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими ан- тителами.
Некоторые из иммунизированных морских свинок и кроликов содержали антитела в достаточно высоких концентраци х , способные св зыватьс  с нативным вирусом.
Примере, 5 мкг плазмиды pSPUU расщепл ют в стандартных услови х эндонуклеазой рестрикции BamHl, как описано в примере 1. Полученный фрагмент лигируют с Pstl фрагментом длиной 3372 По о., вьщеленным из плазмиды pHAU23, с синтетическим фрагментом ДНК следующей структуры:
GATCCT АТС AGG ACT GCA . СА TAG ТСС tC
Лпгазной смесью трансформируют компонентные клетки Е. coli ДН1 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определ ют ориентацию последнего.
Б ДНК плазмид, содержащих фрагменты в нужной ориентации, определ ют структуру сочленени  методом Макса ма-Гилберта.
ДНК плазмиды pSP-UU-HAU-D с подтвержденным сиквенсом сочленением, кодирующую синтез полипептида, содер жащего все структурные (начина  с 38 а.к. белка UP/O .и некоторые неструктурные белки ВГА, используют дп  трансформации клеток почек зеленой мартьшки линии CUl, зараженных вирусом осповакцины штамма ЛИВП. Урожай вируса после трансформации высевают на эмбриональные фибро- бласты крысы перевиваемой линии RAT2 tk-фенотипа. В присутствии бром дез оксиуридина клонируют рекомби- . нантные вирусы. Клоны вируса осповакцины , содержащие в ДНК последовательности ВГА (ЛИВП-рЗР-Ш-НАи-П),
0
5
наращивают на клетках RAT2 .на среде Dulbecco 8 MEM с 5% сыворотки новорожденных тел т. Синтезируемый .белок ВГА в виде клеточных лизатов используют дп  иммунизации морских свинок и кроликовс
Через несколько недель после завершени  курса иммунизации сыворотку морских свинок и кроликов тестируют на содержание антител, способных св зыватьс  с нативным ВГА в конкуг рентной реакции с человеческими антителами .
Большинство иммунизированных морских свинок и кроликов содержали антитела в достаточно высоких концентраци х , способные Л зьшатьс  с нативным вирусом.
Пример9. 5 мкг плазмиды pSP-UU-HAU-D, содержащей фрагмент генома ВГА длиной 3372 п.о., расщепл ют частично Pstl, как описано в примере 1, Полученную линейную форму плазмиды лигируют с Pstl фрагментом 924 п.о., вьзделенным из плазмиды pHAU5-prot кодирующим вирусную про- теазу.
Лигазной смесью трансформируют компонентные клетки Е. coli ДН1 и в клонах, содержащих плазмиду со встроенным фрагментом, определ ют ориентацию последнего с помощью эндонукпе- аз рестрикции Вага Н(, Puuf , Hind III.
В ДНК плазмид, содержащих фрагменты в нужной ориентации, определ ют структуру сочленений методом Максама-Гилб ерта.
(
ДНК плазмиды pSP-UU-HAU-D-protea с подтвержденным сиквенсом сочленением , кодирующую синтез полипептида, содержащего все структурные (начина  с 38 а.к. белка UP4) и некоторые неструктурные белки ВГА, используют дп  трансформации клеток почек зеленой мартьшки линии GUI, зараженных вирусом осповакцины штамма ЛИВП. Урожай вируса после трансформации высевают на змбриональные фиб- робласты крысы перевиваемой линии RAT2 tk-фенотипа, В присутствии бромдезоксиуридина клонируют реком- бинантные вирусы. Клоны вируса осповакцины , содержащие в ДНК последовательности ВГА, (miBn-pSP-UU-HAU-D- protea), наращивают на клетках RAT2 на среде Dulbecco s MEM с 5% сыворотки новорожденных тел т. Сиитезируемый белок ВГА г виде клеточ- ных лиэатов используют дл  иммунизации морских свинок и кроликов.
Через несколько недель после за- вершени  курса иммунизации сыворотку морских свинок н кроликов тестируют на содержание антител, способных св зыватьс  с нативным ВГА в конкурентной реакции с человеческими антителами.
Болыпинство иммунизированных морских свинок и кроликов содержали антитела в достаточно высоких концентраци х , способные св зыватьс  с натив ным вирусом.
П р и м е р 10. Все операции проделывают , как в примере 8,, но вместо иммунизации кроликов клеточным лизатом осзщеетвл ют их вакцинацию очищенным рекомбинантньп вирусом осповакцины с титром частиц/мл
На боку кролика выбривают поверхность 5 ct/ и скарифицируют. На зту поверхность нанос т 0,1-0,2 мл вируса . На 3-А день возникает специфическа  воспалительна  реакци . К 20 дню поверхность кожи очищаетс . Че-( рез 3-4 недели после заражени  отбирают сыворотку. Ее титр против осповакцины составл ет 1:640, 1:1280.
Сьшоротка также содержит антитела против ВГА.
Таким образом, изобретение позвол ет получать генно-инженерные продукты, которые могут быть использованы как субстанции, потенциально пригодные дл  приготовлени  генно- инженерных вакцин, поскольку они вызывают образование у животных антител , св зывающих вирус гепатита А.

Claims (1)

  1. СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ
    AATTCACAGTTAGTACTGAACAAAATGTACCAGATCCACAGGTAGGTATTGCG
    GTGTCAATCATGACTTGTTTTACATGGTCTAGGTGTCCATCCATAA или фрагмент длиной 4296 п.о,, содержащий фрагмент; длиной 3372 п.о., кодирующий все структурные и некоторые неструктурные белки ВГА, и фрагмент длиной 924 п.о., кодирующий вирусную апротеазу, способную расщеплять синтезируемый вирусным геномом непрерывный полипептид на отдельные белки, а в качестве экспрессирующего вектора используют плазмиду pUR__
    РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК, КОДИРУЮЩЕЙ СИНТЕЗ ПОЛИПЕПТИДНЫХ СУБСТАНЦИЙ ПРОТИВ ГЕПАТИТА А, включающий встраивание фрагмента генома вируса .гепатита А в экспрессирующий вектор, отличающийся т.ем, что, с целью получения полипептидных субстанций, способных вызывать образование антител при введении их в организм животных, в качестве фрагмента генома вируса гепатита А используют фраГмен- длиной 389 п.о., кодирующий фрагмент белка UPI с 4 по 129 а.к., или фрагмент длиной 3372 п.о., кодирующий все структурные белки, начиная с 38 а.к. белка UP4, и неструктурные белки ВГА, или фрагмент длиной 1243 п.о., кодирующий полипептидную цепь, содержащую Фрагменты белков UP3 со 110 по 233 а.к. и UPI с 1 по 271 а.к., или фрагмент длиной 144 п.о., кодирующий фрагмент белка UP1 с 4 по 57 а.к., или синтетический фрагмент ДНК, кодирующий фрагмент белка UP 1 с 11 по 25 а.к., имеющий следующую структуру:
    CGCCTAG,
    291, обеспечивающую синтез полипептидов, содержащих полную β -галактозидазу, слитую с белками ВГА, в бактериальных клетках, или плазмиду pUR292, обеспечивающую синтез полипептидов, содержащих полную д-галактозидазу, слитую с белками ВГА, в бактериальных клетках, или плазмиду pIFN-ful, обеспечивающую синтез полипептидов, содержащих полный γ-ин·
    SU „„ 1469856 терферои человека, слитый с белками ВГА, в бактериальных клетках, или плазмиду pSPUU, встраиваемую в вектор осповакцины ЛИВП, обеспечивающую синтез полипептидов в животных клетках, или плазмиду pSPUU, встраиваемую и вирус осповакцины ЛИВП, обеспечивающую синтез полипептидов в ораганизмах животных.
SU864102079A 1986-07-31 1986-07-31 Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей синтез полипептидных субстанций против гепатита А SU1469856A1 (ru)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU864102079A SU1469856A1 (ru) 1986-07-31 1986-07-31 Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей синтез полипептидных субстанций против гепатита А
PCT/SU1987/000085 WO1988000973A1 (en) 1986-07-31 1987-07-31 Recombinant plasmid dnas, coding for synthesis of polypeptide substances for a vaccine against hepatitis a
EP19870905562 EP0276330A4 (de) 1986-07-31 1987-07-31 Rekombinante plasmid-dns, kodierend für die synthese von polypeptidsubstanzen für einen impfstoff gegen hepatitis-a.
JP50498387A JPH01500485A (ja) 1986-07-31 1987-07-31 Ａ型肝炎に対するワクチンのためのポリペプチド物質の合成をコードする組換プラスミドｄｎａ

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU864102079A SU1469856A1 (ru) 1986-07-31 1986-07-31 Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей синтез полипептидных субстанций против гепатита А

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SU1469856A1 true SU1469856A1 (ru) 1990-09-30

Family

ID=21250735

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU864102079A SU1469856A1 (ru) 1986-07-31 1986-07-31 Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей синтез полипептидных субстанций против гепатита А

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP0276330A4 (ru)
JP (1) JPH01500485A (ru)
SU (1) SU1469856A1 (ru)
WO (1) WO1988000973A1 (ru)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9002387D0 (en) * 1990-02-02 1990-04-04 St Marys Hospit Med School Improvements relating to the prevention of hepatitis
US5294548A (en) * 1990-04-02 1994-03-15 American Biogenetic Sciences, Inc Recombianant Hepatitis a virus
HRP950097A2 (en) 1994-03-08 1997-06-30 Merck & Co Inc Hepatitis a virus culture process
CU23202A1 (es) * 2003-01-31 2007-05-18 Ct Ingenieria Genetica Biotech ANTIGENOS RECOMBINANTES DEL VIRUS DE LA HEPATITIS A OBTENIDOS EN CéLULAS VEGETALES
CA2573532C (en) 2004-07-13 2014-01-07 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detection of hepatitis a virus nucleic acid

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3112338C2 (de) * 1981-03-28 1995-02-23 Klaus Von Der Helm Verwendung von Hybridisierungssonden zum Nachweis von HAV
EP0154587B1 (en) * 1984-03-02 1991-05-15 Merck & Co. Inc. Fragments of dna which encode peptides capable of inducing in vivo the synthesis of anti-hepatitis a virus antibodies
US4596674A (en) * 1984-09-11 1986-06-24 Merck & Co., Inc. Immunogenic HAV peptides
CA1324094C (en) * 1985-04-03 1993-11-09 Dino Dina Hepatitis a virus vaccines

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ЕР О 154 587 А2, кл. С 12 N 15/00, опублик. 1985. .(54)(57) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ AATTCACAGTTAGTACTCAACAAAATGTACCAGATCCACAGGTAGGTATTGCG . GTGTCAATCATGACTTGTTTTACATGGTCTAGGTGTCCATCCATAA CGCCTAG, или фрагмент длиной 4296 п.о,, содержащий фрагмент; длиной 3372 п.о., кодирующий все структурные и некоторые неструктурные белки ВГА, и фрагмент длиной 924 п.о., кодирующий вирусную апротеазу, способную расщепл ть синтезируемый вирусным геномом непрерьшный полипептид на отдельные белки, а в качестве экспрессирующе- го вектора используют плазмиду pUR 291, обеспечивающую син тидов, содержащих полну зидазу, слитую с белкам териальных клетках, или pUR292, обеспечивающую пептидов, содержащих по лактозидазу, слитую с б в бактериальных клетках ду pIFN-ful, обеспечива прлипептидов, содержащи РЕКОМБИНАНТНОЙ Ш1АЗМИДНОЙ ДНК КОДИРУЮЩЕЙ СИНТЕЗ ПОЛИПЕПТИДНЫХ СУБСТАНЦИЙ ПРОТИВ ГЕПАТИТА А, включающий встраивание фрагмента генома вируса .гепатита А в экспрессирушц-м вектор, отличающийс т.ем, что, с целью получе *

Also Published As

Publication number Publication date
JPH01500485A (ja) 1989-02-23
EP0276330A1 (de) 1988-08-03
EP0276330A4 (de) 1988-11-24
WO1988000973A1 (en) 1988-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20030175296A1 (en) Chimaeric hepadnavirus core antigen proteins
DK175291B1 (da) Rekombinant virus
EP0431668B1 (en) Recombinant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof
US5770212A (en) Recombinant poxviruses with foreign DNA in essential regions
US10227385B2 (en) Chimeric poly peptides and the therapeutic use thereof against a flaviviridae infection
JPH04503904A (ja) 組換えポックスウイルス宿主選択系
KR970000595B1 (ko) 재조합 종두 비루스
EP0486170B1 (en) Baculoviral expression system comprising procaryotic leader sequence
JPH05501206A (ja) ワクチン製造に用いる組み換えヘルペスウィルスと、その製造方法と、その過程で得られるプラスミドと、得られたワクチン
CA2250041A1 (en) Parapoxvirus vectors
US20030053987A1 (en) Synthetic hepatitis c genes
EP0261940A2 (en) Pseudorabies vaccines and DNA vectors for recombination with pox viruses
EP0117657A1 (en) Rabies immunogenic polypeptides and vaccine using them, DNA sequences, expression vectors, recombinant cells, and cultures therefor, and processes for their production
JPH01501357A (ja) ヒト呼吸器系ウイルス用ワクチン
SU1469856A1 (ru) Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей синтез полипептидных субстанций против гепатита А
HU196625B (en) Process for producing hepatitis b virus vaccine
DE69534162T2 (de) Fusion-glykoprotein von hcmv und hsv
JPS61502095A (ja) 第９因子を発現するベクタ−、該ベクタ−により変換された細胞及び第９因子の製造方法
EP0389034A1 (en) Hog cholera virus vaccine and diagnostic
WO1988002757A1 (en) Hybrid proteins or polypeptides
CA2047585A1 (en) Herpesvirus-based viral vector which expresses a foot and mouth disease virus epitope on the surface of virus-infected cells and on the surface of virus particles, and vaccine against foot and mouth disease containing the same
HUT56136A (en) Process for producing vaccine against infectious bronchitis virus
JPS63500637A (ja) 組換えウイルス
KR20010086357A (ko) 재조합 ｃｅｌｏ 바이러스 및 ｃｅｌｏ 바이러스 ｄｎａ
JPH05502996A (ja) 組換え型産児調節用ワクチン