SU1464088A1 - Method of assessing specific sensitization of the organism to allergens - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к клинической медицине, . точнее к клинической аллергологии и иммунологии, и предназначено дл  вы влени  специфической сенсибилизации к аллергенам у больных с аллергической патологией.The invention relates to clinical medicine,. more precisely to clinical allergology and immunology, and is intended for the detection of specific sensitization to allergens in patients with allergic diseases.

Цель изобретени  - повышение точности определени  специфической сен- сибилиза1 1и к аллергену.The purpose of the invention is to improve the accuracy of determining the specific sensitization of the allergen.

Способ осуществл ют следующим образом .The method is carried out as follows.

Моноциты и полинуклеары вьщел ют из периферической крови путем центрифугировани  на двойном градиенте фиколл-верографин. После троекратного отмывани  средой 199 клетки инкубируют в. концентрации 10 /мл s течение 60 мин в пробирках сапожках . Культуру клеток, прилипших к стеклу.Monocytes and polynuclears were isolated from peripheral blood by centrifugation on a double gradient of ficoll-verographin. After washing three times with medium 199, cells are incubated. concentration of 10 / ml s for 60 min in test tubes boots. The culture of cells adhering to the glass.

. 2. 2

отмывают от лимфоцитов, добавл ют аллергены (специфические и неспецифические ), инкубируют в течение 45- 75 мин. Определ ют индекс cyм apнoй люминесценции лизосом в моноцитах и клеточное соотношение Мц/Нф. При увеличении процента прилипших моноцитов более чем в 1,5 раза и повышении лизосо- мальной активности мононуклеаров более чем в 1,7 раза по сравнению с контропем диагностируют специфическую сенсибилизацию к аллергену.washed from lymphocytes, allergens (specific and nonspecific) are added, incubated for 45-75 minutes. The index of the lumosome luminescence index in monocytes and the cell ratio Mc / Nf are determined. With an increase in the percentage of adherent monocytes by more than 1.5 times and an increase in the lysosomal activity of mononuclear cells by more than 1.7 times compared with the contour, specific sensitization to the allergen is diagnosed.

Пример 1, Изучали способность моноцитов и нейтрофилов периферической крови больного бронхиальной астмой атопической формой отвечать на воздействие специфического аллергена (аллерген домашней пыли) in vitro. С этой целью вьщел ют граФExample 1, We studied the ability of monocytes and neutrophils in the peripheral blood of a patient with bronchial asthma of the atopic form to respond to the effects of a specific allergen (house dust allergen) in vitro. For this purpose, the graph

0000

нулоциты и мононуклеары из периферической крови путем це нтрифугировани  на двойном градиенте фиколл-верогра- фин.Peripheral blood from nucocytes and mononuclear cells by centrifuging on a ficoll-verographer double gradient.

, На границе между плазмой и раствором фиколл-верографин образовалось кольцо, содержащее 10-15% моноцитов, 10-18% нейтрофилов, 67-80% лимфоцитов . После вьщелени  клеточную взвесь - суспензию трижды отмывают средой 1Р9. Клетки инкуе5ируют в концентрации в течение 60 мин при 37 С в пробирках сапожках, на дне которых находились покровные стекла. Затем клетки, прилипшие к стеклу, отмьюают от лим зоцитов средой 199 и используют их дл  изучени  специфической сенсибилизации к аллергену .On the border between plasma and ficoll-urografin solution, a ring was formed containing 10-15% monocytes, 10-18% neutrophils, 67-80% lymphocytes. After separation, the cell suspension is washed three times with 1P9 medium. The cells are incubated in concentration for 60 min at 37 ° C in test tubes and boots, at the bottom of which there were cover glasses. Cells adhering to the glass are then removed from the limocyte by medium 199 and used to study specific sensitization to the allergen.

Исследование провод т двойным слепым методом. Испытатель и учетчик не знали, какой аллерген  вл етс  специфическим. Клетки инкубируют в среде 199 с добавлелием 200 -РПИ/мл двух аллергенов, один из которых бьш специфическим (аллерген домашней пыли - опыт), а другой .неспецифическим (аллерген пыльцы деревьев - контроль 2). Общим контролем служили клетки, инкубированные без аллергенаThe study was conducted in a double-blind fashion. The tester and accountant did not know which allergen was specific. Cells are incubated in medium 199 with an added 200-FIR / ml of two allergens, one of which was specific (house dust allergen is experience) and the other non-specific (tree pollen allergen control 2). Common controls were cells incubated without allergen.

00

5five

00

5five

(контроль 1) в течение того же времени . Специфичность аллергена подтверждалась многократными кожными пробами. По истечении срока инкубации и в опыте и в контроле подсчитывали соотношение моноцитов и-нейтрофилов , прилипших к стеклу (моноцит /нейтрофил) . В мазках подсчитывали не менее 100 клеток. В оставшихс  сапо.жках клетки отмьтали от аллергена средой 199 и инкубировали с акридином оранжевым в концентрации 2 мкг/мп в течение 20 мин, после чего определ ли суммарный индекс люминесценции (СИЛ) лизосом полуколичественным методом по формуле(control 1) for the same time. The specificity of the allergen was confirmed by repeated skin tests. After the incubation period, the ratio of monocytes and neutrophils adhered to glass (monocyte / neutrophil) was calculated both in the experiment and in the control. At least 100 cells were counted in smears. In the remaining sap cells, cells were removed from the allergen with medium 199 and incubated with acridine orange at a concentration of 2 µg / mp for 20 minutes, after which the total luminescence index (SIL) of lysosomes was determined by a semi-quantitative method according to the formula

СИЛ 1а + ЗЬ + 10с, где аSIL 1a + 3b + 10c, where a

b количество клеток, содержащих единичные лизосомы; количество клеток, лизосомы в которых занимают 50-70% цитоплазмы;b the number of cells containing single lysosomes; the number of cells, lysosomes in which occupy 50-70% of the cytoplasm;

колич.естйо клеток, цитоплаз-, ма которых полностью заполнена лизосомами.number of cells, cytoplasm, which is completely filled with lysosomes.

30thirty

Дл  облегчени  учета реакции проводили подсчет индекса сенсибилизации (ИС) по формулеTo facilitate consideration of the reaction, a sensitization index (IS) was calculated using the formula

соотношение Мц/Нф в опыте (или контроле 2)the ratio of MC / NF in the experience (or control 2)

соотношение в контроле 1ratio in control 1

(или в контроле 2) СИЛ в контроле 1  (or in control 2) STR in control 1

где ИС - соотношение ютеточных элегг where IP is the ratio of current Aleg

ментов;cops;

ИС - соотношение СИЛ лизосбм активных моноцитов.IP is the ratio of FORC lysosm active monocytes.

У больного К.В.И. щ)оцент моноцитов в среде 199 составил 38%, со- ответственно М,/Нф 0,,61; при инкубации с неспецифическим аллергеном (смесь пыльцы деревьев): 47% моноцитов , а соотношение Мц/Нф 0,89; cd специфическим аллергеном (аллер- ген домашней пыли): 70% моноцитов, Нц/Нф 2,33. Соответственно ИС со специфическим аллергеном ИС 3,82, с неспецифическим аллергеном ИС . Patient K.V.I. y) the percentage of monocytes in medium 199 was 38%, respectively M, / Nf 0,, 61; incubated with a non-specific allergen (a mixture of tree pollen): 47% monocytes, and the Mc / Nf ratio is 0.89; cd specific allergen (house dust allergen): 70% of monocytes, Nc / Nf 2.33. Accordingly, the IP with a specific IP allergen is 3.82, with a non-specific IP allergen.

СИЛ лизосом в моноцитах при инкубации в среде 199 составил 168 .ЕДр со специфическим аллергеном - 375 ЕД, с неспецифическим аллергеном -208.ВД.The strength of lysosomes in monocytes during incubation in medium 199 was 168. EDR with a specific allergen - 375 U, with a non-specific allergen -208.VD.

Соответственно ИС со специфически аллергеном составил ИС 2,23, а с неспецифическим ИС - 1 ,24.Accordingly, IP with a specific allergen was IP 2.23, and with non-specific IP - 1, 24.

Пример 2. Больной Х.А.И. Диагноз: туберкулез легких.Example 2. Patient H.A.I. Diagnosis: pulmonary tuberculosis.

ИзучсШи способность моноцитов и нейтрофилов периферической крови у больного в фазе выраженной активности процесса отвечать на воздействие специфического аллергена (туберкулина ). Исследование проводили аналогично осуществлению способа в примере 1. В качестве специфического аллергена использовали стандартный сухой туберкулин.Studying the ability of monocytes and peripheral blood neutrophils in a patient in the phase of a pronounced process activity to respond to the effects of a specific allergen (tuberculin). The study was carried out similarly to the implementation of the method in example 1. As a specific allergen used standard dry tuberculin.

Содержание ампулы разводили в 1 мл среды 199. В реакции использовали 0,1 МП полученного раствора туберкулина. Неспецифическим аллергеном служил бруцеллин (0,1 ми).The content of the ampoule was diluted in 1 ml of medium 199. The reaction used 0.1 MP of the resulting tuberculin solution. Brucellin (0.1 mi) served as a non-specific allergen.

Процент моноцитов у данного больного в среде 199 составил 43%, соответственно Мц/Нф 0,75, при инкубации с неспецифическим аллергеном (бруцеллином) содержание моноцитов 53%, а соотношение 1,12, со специфическим аллергеном (туберкулином ) - 76% моноцитов,Мц/Н ф 3,17.The percentage of monocytes in this patient in environment 199 was 43%, respectively, MC / NF 0.75, while incubating with a nonspecific allergen (brucella) the content of monocytes was 53%, and the ratio 1.12, with a specific allergen (tuberculin) - 76% of monocytes, Mc / H f 3.17.

ИС со специфическим аллергеном равен 4,2, ИС, с неспецифическим аллергеном равен 1,4.IP with a specific allergen is 4.2, IP, with a non-specific allergen is 1.4.

СИЛ лизосом в моноцитах при инкубации в среде 199 составил 273 ЕД, со специфическим аллергеном 418 ЕД, а с неспецифическим аллергеном 306 ЕД Соответственно ИС со специфическим аллергеном составил 1,53, а с неспецифическим аллергеном 1,12.The SIL of lysosomes in monocytes during incubation in medium 199 amounted to 273 U, with a specific allergen 418 U, and with a non-specific allergen 306 U. Accordingly, the IP with a specific allergen was 1.53, and with a non-specific allergen 1.12.

Проведение исследований в соответ ствии с известным способом дало следующие результаты: при инкубации клеток в среде 199 дл  подсчета 100 лейкоцитов просмотрено 27 полей зрени , при инкубации с неспецифическим аллергеном - 44 пол  зрени , при инкубации со специфическим аллергено м- 31 поле зрени .Conducting studies in accordance with a known method yielded the following results: when cells were incubated in medium 199, 27 fields of view were scanned to count 100 leukocytes, 44 fields of view were incubated with a nonspecific allergen, and 31 fields were incubated with a specific allergen.

Соответственно ИС со специфическим аллергеном составил 1,14, а с не специфическим 1,6.Accordingly, the IP with a specific allergen was 1.14, and with a non-specific 1.6.

Таким образом, известный способ не позвол ет оце нить наличие специфической сенсибилизации, так как снижение прилипаемости более выражено с неспецифическим аллергеном, а не со специфическим. С помощью предлагаеThus, the known method does not allow to assess the presence of specific sensitization, since the decrease in adherence is more pronounced with a nonspecific allergen, and not with a specific one. With the help of the offer

00

5five

0 5 0 5

о about

5five

мого способа можно точно определить, какой аллерген  вл етс  специфическим . В данном примере специфическа  реакци  определ етс  на туберкулин, что соответствует иммунной реактивности при заболевании туберкулезом.In this method, it is possible to determine exactly which allergen is specific. In this example, the specific response is determined for tuberculin, which corresponds to the immune reactivity of the disease of tuberculosis.

Положительньй эффект заключаетс  в том, что уменьшаетс  количество ложноположительных результатов с 40% до О, т.е. точность возрастает на 40%.The positive effect is that the number of false-positive results decreases from 40% to 0, i.e. accuracy increases by 40%.

Claims (1)

Формула изобретени Invention Formula Способ определени  специфической сенсибилизации организма к аллергенам , включающий забор крови, выделение лейкоцитов, инкубацию их в приг сутствии аллергена с последующей оценкой адгезивной активности лейкоцитов , отличающийс  тем, что, с целью повышени  точности способа , из лейкоцитарной взвеси вьще- ;л ют моноциты и нейтрофилы, инкубируют с аллергеном в течение 45-75 мин,, далее определ ют процент прилипших моноцитов и нейтрофилов и лизосомаль- ную активность моноцитов и при увеличении процента прилипших моноцитов более чем в 1,5 раза при одновременном снижении процента прилипших нейтрофилов и Повышении лизосомальной активности моноцитов более чем в 1,7 раза по сравнению с пробой без аллергена диагностируют специфическую сенсибилизацию к аллергенам.The method for determining the specific sensitization of an organism to allergens, including blood sampling, isolation of leukocytes, incubation of them in the presence of an allergen and subsequent evaluation of leukocyte adhesive activity, characterized in that, in order to improve the accuracy of the method, leukocyte suspension will improve monocytes and neutrophils , incubated with the allergen for 45-75 min, then determine the percentage of adherent monocytes and neutrophils and the lysosomal activity of monocytes and with an increase in the percentage of adherent monocytes more than 1.5 times When simultaneous reduction percentage of adherent neutrophils and monocytes Rise lysosomal activity more than 1.7 times compared with the sample without a specific diagnose allergen sensitization to allergens.