SU1449014A3 - Способ получени сиропа, содержащего глюкозу и фруктозу - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к технологии получени  глюкозно-фруктозных сиропов. Цель изобретени  - уменьшение образовани  продуктов распада Сахаров в гидролизате и повышение стабильности фермента в процессе изомеризации . Способ получени  сиропа, содержащего глюкозу и фруктозу, предусматривает пригбтовление крахмаль ной суспензии, ожижение последней при рН 5,2-5,4, последующее ферментативное осахаривание при рН 4-75 и температуре 54-62°С дл  получени  гидролизата, содержащего не более 100 ч./млн. ионов кальци  в расчете на массу сухого крахмала и с мол рным отношением неферментативно образуемых кетозных Сахаров 0-2 моль на 100 моль гексозных единиц. Дл  ожижени  используют глюкоамилазу, имеющую пониженную зависимость от ионов кальци . Содержание ионов кальци  не более 100 ч./млн обеспечивают путем хелатировани  избытка кальци  перед изомеризацией, Осахаренный раствор подвергают изомеризации при необходимой теьшера туре контактированием его с глюкозоизомеразой, адсорбиг рованной или св занной с ДЕАЕ целлюлозой или анионообменной смолой. 4 з.п. ф-лы., 10 табл. СО t

Description

Изобретение относитс  к технологии получени  глюкозно-фруктозных сиропов .

Цель изобретени  - уменьшение образовани  продуктов распада сахароз в гидролизате и повышение стабильности фермента в процессе изомеризации .

Способ получени  сиропа, содержащего глюкозу и фруктозу, заключаетс  в следующем.

Крахмал, полученный из обычного

источника, например влажньм измельчением зерна, промывают и готов т из него водную пульпу - суспензию, содержащую 30-35% сухого крахмального вещества. Предпочтительнее, чтобы суспензи  обладала низким ионимм содержанием , т.е. не более 0,2% сухого остатка в сульфатирова нпой золы В качестве источников крахмала используютс  клубни или злакоЕые, включа  картофель, тапиоку, пшеницу, сор1Д

го и кукурузу.

Глюкозосодержащий крахмальньпг гидролизат может быть получен с помощью кислотно-ферментного процесса или фермент-ферментного процесса. В кислотно-ферментном процессе кра.мал сжижают сперва м гкой кислотной обра боткой, после чего примен ют фермент дл  превращени  ожиженнюго крахмала в глюкозу. В обычном фермент-ферментном процессе крахмал ожижают обры- боткой ОС-амилазой, после чего примен ют глюкоамилазу дл  превращени  сжиженного крахмала в глюкозу. Предпочтительно использовать фермент-ферментный способ получени  крахмальног гидролизата, содержащего глюкозу.

Производство крахмального гидролизата , содержащего глюкозу, который н будет подвергатьс  очистке перед последующей обработкой иммобилизи- рованной глюкозной изомсрапой, требует тщательного контрол  условий реакции во врем  ожижени  и псахариваии  Дотаспы примен тьс  такие температуры врем  реакции и величины рИ, чтобы ингибировать образование значительны количеств таких веществ, которые пагубно вли ют на стабильность глюкозной изомеразы.

Также необходимым  вл етс  сведе

нис к минимуму содержание ионов кальци  при изомеризации субстрата. Некоторые составы 1Эу-амилазы требуют присутстви  высокого содержани  ионов

10

15

30

35

Q

е д . , х 490142

кальци  дл  достижени  активности во врем  стадии ожижени . В том случае, когда во врем  ожижени  имеетс  высока  концентраци  ионов кальци , то перед изомеризацией следует его удалить из гидролизата. Могут примен тьс  любые известные дл  этой цели способы, такие как обработка глюко- зосодержащей суспензии щавелевой кислотой с последующим фильтрованием ок- салатов кальци .

Поэтому предпочтительнее использовать вид 0 -амилазы, который не требует высокой концентрации ионов кальци  дл  поддержани  активности и тepмocтaбильнotти фермента. Удовлетворительные результаты получаютс  при использовании 0 -амилазы, производимой Bacillus licheniformis (Тег- , mamyl- 60L о -амилаза Novo Enzyme Corp.). Зтот фермент отличаетс  высокой термостабильностью и активностью в широком интервале рН, одновре- он имеет пониженную зависимость от присутстви  ионов кальци . Другим типом подход щей о(-амилазы, который быть использован дл  данной цели,  вл ютс  Tako-Therm (Miles la- ,1Г.огу, Elkhart, indiana) и ni- Tr:ini.ase (Biocon I no., Lexington,

KP- :I.UCky) .

Ирем , в течение которого осу- щсспзл етс  ожижентге крахмала, за- от примен емой тем11ерату)Ь . Если крахмальна  суспе 1зи  нагреваетс  при низких температурах   течение очень короткого времени, то -ъ. кет остатьс  зп -штельиое ко;;гг:сг1 но более термоустойчивых частиц крахма20

25

55

ла, которые не будут подпер л .с  воздействию {(-амилазы, как э го требуетс  дл  сниженрт  БЛЗКОСПи суспен- ,зии. Применение низких п eMnc p;vi ур , ожижени , а именно тте ЪС°С лл  зернового крахм.ала, приводит к н. гудоз- летворительным результатам и з-за оставшегос  иежелатинизироваин м большого количества крахмала и таким образом практически неприспособленного к воздействию фермента. В том случае, когда ожижение осуществл етс  в присутствии о(-амилазы, то примен - et-tbie темпср;1туры не должны быть столь высоки, чтобы пагубно сказатьс  на активности примен емого фермента .

Особенно важным оказываетс  под- держание таких условий реакции, чтобы

во врем  о ошени  и осахаривани  не осуществл ть химического или неферментативного образовани  кетосахаров. В частности, услови  реакции должны поддерживатьс  такими, чтобы обеспечить получение гидролизата с концентрацией ионов кальци  не более 100 ч./млн. в основе на массу сухого крахмального вещества и мол рным отношением неферментативно образуемых кетозных Сахаров по отношению к гек- созам менее 2.

Предпочтительно также, чтобы гид- ролизат содержал ионы кальци  в концентрации не более 30 ч./млн и мол рное отношение неферментативно образуемых кетосахаров было менее 1. Мол рное отношение выражает количество молей неферментативно производимы кетосахаров на 100 моль гексоз. Поскольку вли ние температур, времени и величины рН во врем  ожижени  взаимозависимы , то эти параметры должны контролироватьс  внутри сравнительно узкого интервала.

Полимерна  структура гранулированного крахмала не подвержена сильному воздействиюci-амилазы до тех пор, пока гранулы не подвергнутс  желати1 изации. Желатинизаци  осуществл етс  при нагревании крахм.гла в воде до температурного интервала, при котором гранулы набухают, и силы , св зывающие молекулы крахмала вместе, достаточно ослабевают, что вызывает желатинизацию. Поскольку о(-амилаза термочувствительна и имеет тенденцию денатурироватьс  при температурах Bbmje 100°С, то дл  пролонгировани  эффективного действи  фермента дл  ожижени  примен ютс  температуры ниже 100°С. Поскольку силы, св зывающие молекулы крахмала в гранулы, различны по величине, то некоторые гранулы желатинизируютс  при температурах ниже 100°С и станов тс  восприимчивыми к действию о(-амилазы, в то врем  как другие остаютс  нежелатинизированными и поэтому достаточно устойчивыми к воздействию этого фермента. В результате этого предпочтительно ожижать крахмал о(-амилазой в две стадии с очень короткой промежуточной обработкой в автоклаве. Во врем  первой стадии крахма1л частично желатинизи- руетс  и ожижаетс  в ограниченной степени с получением частичного гидролизата . Целью стадии автоклави- ровани   вл етс  дальнейша  желати- низаци  гранул крахмала, устойчивых к воздействию обработки на первой стадии ожижени . Крахмальный гидроли- зат затем разжижают на второй стадии до требуемого уровн .

Ожижение провод т в две стадии

при рН в интервале от 5,2 до 5,4 и при температурах желатинизации крахмала , подход щих дл  ферментативного ожижени  крахмала. В случае влажно-измельченного зернового крахмала обычно необходимо доводить ве- личи(Гу рН до требуемого диапазона ожижени . Соединени  кальци , как например гашена  известь или карбонат кальци , обычно используют дл 

доведени  величины рН на стадии ожижени  (Ч-аьтл аз ой, особенно в реакци х , где примен ютс  о(-амилазные составы , завис щие от кальци . Поскольку кальций отрицательно вли ет на активность глюкозной изомеразы, то предпочтительно избегать избыточного добавлени  источника ионов кальци  к гидролизату. Однако если ионы кальци  все-же добавлены, то их следует удалить до стадии изомеризации, Хот  существует цельш р д веществ, которые могут устанавливать необходимую величину рН во врем  стадии ожижени , однако предпочтительнее использовать дл  этой цели растворимые соединени  магни , поскольку глюкозные изомеразы, выделенные из многих микроорганизмов, требуют магний дл  оптимизации их активности.

Количество оС-амилазы, введенной

в пульпу, зависит от набора факторов, однако обычно определ етс  по активности ферментативного состава, концеитрации крахмала в пульпе и степени требуемой амилолитической конверсии . Обычно в системе двухстадий- ного ожижени  ввод т }.д вторую стадию такое же количествп или несколько

меньшее СУ -амилазы, чем на первую стадто. Когда межп;у стади ми осуществл ют автокланирорание, то остаточна  активность о -амилазы на первой стадии практически разрушаетс . Обычно на первой стадии добавл етс  6-10 ед. о -амилазной активности на 1 г сухого крахмала и 5- 10 ед. на 1 г сухого крахмала на второй стадии ожижени .

U49014

Примен емые температуры ожижени  на обоих стади х предпочтительно ниже , более предпочтительными  вл ютс  температуры в интервале 82-95°С и наиболее предпочтительным оказываетс  диапазон между 84 и . При ожижении при температурах внутри вышеуказанных интервалов удовлетворительные результаты достигаютс  при нагревании в течение 1-3 ч.

Перва  стади  ожижени  обеспечивает получение частичного гидроли- зата со степенью упругости от около 6 до около 12. После первой стадии ожижени  пульпу можно подвергнуть автоклавной обработке дл  получени  частичного гидролизата, который практически свободен от нежелатини- зированного крахмала. Более- продолжительное воздействие на частично ожиженный крахмал в автоклаве приводит к образованию веществ, которые нежелательны дл  глюКозной изомера- зы и которые необходимо удал ть перед стадией изомеризации дл  удлинени  срока действи  фермента. Таким образом, врем  автоклавировани  и

ли, представл ет собой глюкоамилазу (также обозначаемый как амилоглюкози даза, глюкоамилаза, глюкогенный фермент и т.д.). Глюкоамилаза, вырабаты ваема  р дом микроорганизмов, представл ет собой экзо-амилолитический фермент, который катализирует последовательный гидролиз глюкозных час10 тей из невосстановленных концов крахмала или амилодекстриновых молекул. Среди микроорганизмов, производ щих глюкоамилазу, имеютс  определенные

штаммы грибков, относ щихс  к роду

15 Aspergillus, штаммы рода Rhizopus и штаммы рода Endomyces.

Осахаривание ожиженного крахмального состава осуществл ют в услови х, которые привод т к высокой степени

20 превращени  крахмала в глюкозу.

Предпочтительно, чтобы гидролизат содержал более 92% глюкозы и более предпочтительно, чтобы содержание глюкозы было более 94%. Услови  так25 же должны быть такими, чтобы не про- мотировать повторный синтез олигоса- харидов из молекул освобожденной глюкозы, как это известно случаетс 

при реакци х осахаривани  с использотемпература не должны превышать 2 мин 30 ванием глюкоамилазы. и соответственно. Предпочти- Обработку глюкоамилазрй осуществ- тельнее проводить автоклавирование при л ют при разбавлении ожиженнои крах- температуре около , и продолжи- мальной суспензии, если это необ тельности 1 мин.ходимо, до содержани  твердьгх веПоскольку Ы -амилаза, присутствую- 35 около 30% и достижении рН ре ,, W лт /I П ПП r VOnrV

ща  на первой стадии ожижени , практически инактивнруетс  за врем  автоклавной обработки, то необходимо ввести дополнительное количество фермента на вторую стадию ожижени . Обычно вводимое количество о(-амилазы на второй стадии приблизительно равно тому, которое примен лось на первой стадии. Во врем  второй стадии практически все желатинизированные гранулы крахмала готовы взаимодействовать с ферментом в тех же услови х с образованием уточненного гидролизата , имеющего степень упругости от 14 до 20, и который практически свободен от исходного непрореагировавшего крахмала. Обычный гидролизат имеет степень упругости около 16.

Ожиженный крахмальный состав затем обрабатьгоают глюкогенным ферментом при подход щих услови х дл  ферментативного превращени  частично гидро- лизованного крахмала в глюкозу. Обычно фермент, примен емый дл  этой цеакционной среды от 4,0 до около 5,0, предпочтительно рН 4,6. Затем добавл ют достаточное количество г люко- амилазного состава дл  обеспечени  о

40 0,12 до 0,30 глюкоамнлазиык единиц на 1 г сухого крахмального субстрата после чего суспензию нагревают до температуры 54-62°С в течение времени , достаточного дл  получени  не45 обходимой степени конверсии. Предпочтительным  вл етс  период от около 58 до около 60 ч дл  обработки суспензии гидролизованного крахмала .

Дл  получени  субстрата, пригодного дл  изомеризации, гидролизат затем фильтруют дл  удалени  некрахмального остатка и фильтрат предпочтительнее упаривают до около 50% сухого вещества. Может быть добавлена растворима  соль или соли,  вл ющиес  активаторами глюкозной изомеразы, к концентрированному гидролизату, после чего уровень рН

50

55

9014

ли, представл ет собой глюкоамилазу (также обозначаемый как амилоглюкози даза, глюкоамилаза, глюкогенный фермент и т.д.). Глюкоамилаза, вырабаты ваема  р дом микроорганизмов, представл ет собой экзо-амилолитический фермент, который катализирует последовательный гидролиз глюкозных час0 тей из невосстановленных концов крахмала или амилодекстриновых молекул. Среди микроорганизмов, производ щих глюкоамилазу, имеютс  определенные

штаммы грибков, относ щихс  к роду

15 Aspergillus, штаммы рода Rhizopus и штаммы рода Endomyces.

Осахаривание ожиженного крахмального состава осуществл ют в услови х, которые привод т к высокой степени

20 превращени  крахмала в глюкозу.

Предпочтительно, чтобы гидролизат содержал более 92% глюкозы и более предпочтительно, чтобы содержание глюкозы было более 94%. Услови  так25 же должны быть такими, чтобы не про- мотировать повторный синтез олигоса- харидов из молекул освобожденной глюкозы, как это известно случаетс 

около 30% и достижении рН ре ,, W лт /I П ПП r VOnrV

акционной среды от 4,0 до около 5,0, предпочтительно рН 4,6. Затем добавл ют достаточное количество г люко- амилазного состава дл  обеспечени  от

0,12 до 0,30 глюкоамнлазиык единиц на 1 г сухого крахмального субстрата, после чего суспензию нагревают до температуры 54-62°С в течение времени , достаточного дл  получени  необходимой степени конверсии. Предпочтительным  вл етс  период от около 58 до около 60 ч дл  обработки суспензии гидролизованного крахмала .

Дл  получени  субстрата, пригодного дл  изомеризации, гидролизат затем фильтруют дл  удалени  некрахмального остатка и фильтрат предпочтительнее упаривают до около 50% сухого вещества. Может быть добавлена растворима  соль или соли,  вл ющиес  активаторами глюкозной изомеразы, к концентрированному гидролизату, после чего уровень рН

7

довод т от 7 О до 8,5 добавлением раствора гидроокиси натри . Обычно гидролизат нагревают до температуры 50-70 С и выдерживают в течение 20-60 мин, после чего осадок отфильтровывают и удал ют суспендированные твердые вещества, которые моли образоватьс  при более высоких уровн х рН, Предпочтительными услови ми  вл етс  нагревание при температуре около 60°С и выдержка в течение около 30 мин перед стадией повторного фильтровани . Следует избегать более продолжительного нагревани  осахаренного раствора или нагревание при температурах выше до стадии изомеризации и особенно не следует доводить значение рН в щелочную область. В щелочлих услови х такое нагревание гидролиза та перед его изомеризадией может привести к разложению вещества и образованию продуктов, которые подавл ют активность глюкозной изо- меразы.

Изомеризаци  неочищенного субстрата преимущественно проводитс  в непрерывном режиме путем пропускани  субс трата при подход пшх услови х через колонну или колонны, содержащие слои иммобили оваиной глюкозной изомеразы.

Таким образом, при поддержании условий ожижени  и осахаривани  дл  минимального производства нефермен- тативно по :, чаемьп: кетосахаров происходит максимальное превращение крахмала в глюкозу. Также в результате поддержани  низкого содержани  з олы в исходной крах тальной пульпе и во врем  последопателт Ных стадий процесса потребуетс  меньша  емкость ион-обменной смолы дл  деминерализации конечного глюкозно-фрукто ного продукта.

Декстрозный эквивалент.

Декстрозный эквивалент (ДЕ) обозначает концентрацию присутствующих редуцирующих Сахаров таких, как дектроза , и рассчитанньЕС как процент от сухого вещества. Определ етс  с помощью методики Е-26, ог Т1санной в Standard Analytical Methods of the Member Companies of Corn Industry Research Foundation, Inc. 1001, Connecticut Ave, N.W. Washington, B.C. 20036.

A90148

Активность бактериологической 0(-амилазы.

Активность составов бактериологи- 5- ческой 0 -амилазы определ ют с помощью модифицированной стандартной методики испытаний ААТСС 103-1965 Bacterial Alpha Amylase Enzyme Used in De- sizing, Assay,of опубликованной в 10 1967 году издательством Технической Документации Американской Ассоциации Текстильных Химиков и Химиков-красителей , т, 43, с. В-17Д,и В-175,

Модификации этого опубликованного 15 теста заключаютс  в следующем.

Бу фферный раствор крахмального субстрата приготовл ют растворением 25,3 г сухого едкого натра и 340 г сухого гранулированного калийдигидро- 20 фосфата в поде и разбавлением раствора до 2 л.

К охлажденному и растертому в пасту крахмальному субстрату добавл ют 125 мл буферного раствора, после 25 чего субстрат довод т до 500 мл объема.

Определ ют величину рН крахмального субстрата и при необходимости величину рН довод т до 6,,05, 30 0,025 М раствор хлорида кальци  используют разбавлени  образца фермента. Его готов т растворением i1,1 г безводного гранулированного хлорида кальци  в воде и доведением 35 жидкости до объема в 4 л.

Формула перевода единиц - ВАИ в ликвофоиы:

БАИх2,65 ликвофоны, 40 Активность глюкоамилазы.

Единицы активности Г11юкоамилазы (СИ) обозначают количество фермента, которое катализирует получение 1 г декстрозы в 1 ч при и рН 4,3 в 45 нижеописанной методике.

10 мл 10%-ного раствора частично гидролизованного крахмала (такого как Maltrin-10, продукт Grain Processing Co., Muscatiiie, Jowa) , co- 50 держащего 20 мМ ацетатного буфера с рН 4,5, перенос т пипеткой в закрытый реактор,, подлержипаемый при 60°С. 1 мл глюкоамилазиого раствора, содержащего 0,03-0,15 Gil, добавл ют в ре- 55 актор и перемешивают содержимое , после чего смесь оставл ют сто ть Т5 течение 1 ч при 60°С, В конце первого часа периода инкубации воздействие фермента прекращают добавлением предварительно определенного объема 1 М раствора едкого натра так, чтобы довести величину рН до 8,5-10,5. После этого смесь охлаждают до комнатной температуры.

Полученный таким образом образец гидролизата объемом в 2,5 мл перенос т в 25 мл раствора Фелинга, приготовленного как описано в случае определени  ДЕ. Смесь затем нагревают до кипени  и оттитровывают стандартным декстрозным раствором, содержащим 5 г декстрозы на 1 л, приготовленным в соответствии с методикой определени  ДЕ, Контрольную смесь готов т и оттитровывают аналогичным образом как и дл  образца вышеуказанного гидролизата за исключением того, что к субстрату добавл ют 1 мл раствора глюкоамилазы после одночасовой инкубации и после добавлени  раствора едкого натра. Активность глюкоамилазы рассчитывают спедук дим образом

СИ

г

0,002«V

W

где V - общий объем o6pa3ifa гидролизата (обычно 11,2 мл) ,мл ,

С - объем стандартного декст- розного раствора, примен емого дл  титровани  контрольной смеси, мл1

А - объем стандартного декст- розного раствора, примен емого дл  титровани  образц гидролизата, мл,

W - масса фермента на 1 мл разбавленного ферментного раствора.

Активность иммобилизированной из меразы.

Активность иммобилизированной из меразы определ ют согласно следующе методики.

Образец иммобилизированной изоме разы, содержащий 1400-2200 1СТИ, взвешивают. Этот образец промывают 250-миллиметровой колбе 125 мл декс розного раствора (предварительно нагретого до ) и 10 мл 0,1 М раствора трис-(гидроксиметил)амино

метана (ТНАМ) с рН 7,8. Образец дек

строзного раствора содержит 3,33 М декстрозы, 20 мМ сульфата магни , 10 мМ сульфита натри , 100 мМ ТНАМ 1 мМ хлорида кобальта (рН 7,8). При

А49014

10

30

40

этот раствор имеет рН около 7,0. Колбу помещают на вод ную баню при 65°С и встр хивают в течение 1 ч. Смесь затем отфильтровывают в вакууме через 45-миллиметровую грубую керамическую воронку, набитую стекловолокном , предварительно покрытым 1 г ускорител  фильтровани . Колбу

JQ и фермент Промывают небольшой алик- вотой по 100 мл 100 мМ буферного раствора ТНАМ (рН 7,6).

Промытый фермент перенос т в 250- миллиметровую колбу, содержащую

15 125 мл раствора декстрозы (предварительно нагретого до 65 С). Промытый фермент затем количественно промывают внутри колбы 10 мл 10 мМ раствора ТНАМ буфера (рН 7,8), после

20 чего колбу встр хивают 60 мин. Затем добавл ют 12,0 мл лед ной уксусной кислоты и подкисленный раствор встр хивают еще 15 мин. Смесь отфильтровывают под вакуумом через 45-милли25 метровый керамический фильтр со стекловолокном , покрытым предварительно 1 г ускорител  фильтровани . Колбу и содержимое воронки промывают деминерализованной водой до тех пор, пока не соберут около 400 мл фильтрата. Фильтрат охлаждают до и разбавл ют до 500 мл. Оптическое вращение раствора определ ют в 2-дециметровой кювете при 25 С и обозначают RQ. Хо2с лостой опыт провод т аналогичным образом за исключением того, что не добавл ют фермента. Оптическое вращение в холостом опыте определ ют также при и обозначают как R. Степень изомеризации рассчитывают с помощью следующего соотношени 

(R ) S . CD 1

где

Ы изменение удельного вращени , когда фруктоза полностью превращаетс  в декстрозу ,

концентраци  сахара в растворе (0,15 г/мп); длина пол риметрической трубки (2 дм).

Фиксированные единицы активности (РАИ) изомеразы рассчитывают следуюСр 1 FAH/r IC/Kp-tW,

где К - константа скорости реакции

(1,21 1 РАИ мг глюкозы).

t - врем  реакции, ч (1 ч)} W - масса образца, ri С - начальна  концентраци  на 125 мл реакционной смеси

1Д4901412

(75,000 мг глюкозы), мг; I - вьфажение, определ емое следующим образом:

fl. 1) 12 ф . 1)1 ln() - I,I( - I),

е С„ е Кр J lei Р

I СтК ргде Ig - степень изомеризации

1 мол  фруктозы при равновесии (0,513); степень изомеризации в мол рной фракции фруцтозы, начальна  мол рна  концент раци  глюкозы (3,33 М)j константа Михаэлиса дл  глюкозы (0,7 М); константа Михаэлиса дл  фруктозы (1,43 М). Одна ИС1И равна 15,8 РАИ. IGIH - это сокращение Международной Единицы Глюкозной Изомеразы и составл ет количество фермента, которое превратит 1 микромоль глюкозы во фруктозу в 1 мин в растворе, преварительно содержащем 2 моль глюкоз в 1 л, 0,02 моль сульфата магни  и 0,001 моль хлорида кобальта в 1 л раствора при рН 6,84-6,85 (0,2 М малеат натри ) и при 60°С. Определение глюкозной изомеразы осуществл ют с помощью способа, описанного N.Е.Ллойдом и др. в журнале Cereal Chem, 49, № 5, стр. 544-553 (1972). Определение сахаридов. Анализы гидролизатов глюкозы, фруктозы, мальтозы и других сахаридов осуществл ют с помощью жидкостной хроматографии высокого давле- ни . Методика описана в Standard Analytical Methods, Corn Refiner s Association, Inc, Method E-61.

Степень изомеризации (% фруктозы Процент фруктозы, получаемый в результате изомеризации, определ ют следующим образом.

Аликвоту в 5 мл субстрата (неочищенного гидролизата до его изомеризации ) перенос т пипеткой в 100-мил лиметровую мерную колбу и разбавл ют деионизированной водой до концентрации около 2,5 г сухлго вещества в 100 мл раствора. Аликвоту в 5 МП жидкости, вытекающей из колонн содержащей иммобилизованную глюкоз- ную изомеразу, через которую протекает субстрат, также разбавл ют деионизированной водой. Дл  разбав

ленных субстратов и стока из колонны определ ют оптическое вращение.

Константу (К) вычисл ют следующим образом

К -г

dxlOO

где

d - разбавление 20,

L - длина пол риметрической

кюветы 0,2000 дм изменение удельного вращени  при превращении чистой глюкозы в чистую фруктозу, измеренное с помощью ртутной лампы, : эта величина равна 169,3°; К 59,08.

Отсюда % фруктозы в сухом весе - 59,08(,

где oij - наблюдаемое вращение суб- страта, ° ;

наблюдаемое вращение стока

из колонны, , С - количество сухого вещества

в 1 мл субстрата, г. Определение стабильности глюкозной изомеразы.

Определение скорости реакции (К) и периода полураспада фермента (С). Стабильность или период полураспада фермента реакций изомеризации определ ли соответствующим уравнением

1с

I

)

-4693t/t

CR

где Ig - степень изомеризации в

поступающем в реактор потоке, F/(F + G)-,

F - масса фракции фруктозы в

расчете на общую массу сухого углеводного субстрата}

G - масса фракции глюкозы в расчете на общую массу сухого углеводного субстрата

I - степень изомеризацюс в выход щем из реактора стоке, F/(F/G);

13 - 1АД901А1

Ig - величина 1 при равновесии, сухого вещества крахмала 33%, рН 0,514 при 65°С при 0,505 при пульпы довод т до 5,2 добавлением 60°С;MgO и достаточного количества d К , - константа скорости начальной амилазы (Termamyl-60L), чтобы соз- (

Et С

R Т

t реакции , г (F+G) ч -IGIH , активность фермента, IGIH; концентраци  субстрата, глюкоза , г/мл;

скорость потока, мл/ч период пол фаспада фермента , ч;

врем  работы реактора, ч, Величины К| - константу скорости начальной реакции и вел1гчину с можно рассчитать; преобра:гу  вышеуказанное уравнение в следующую форму:

1 , Гн п(---) 1ой- ;;-- - О ,301Q2t/

i е

Зависимость графика логарифма

RlnC---} относитель ю времени I (3 - I -J

равно -О.ЗОЮЗ/ с , следовательно величина L О, 30102/ наклои. Интерполиру  ис-чи.-гину (XQ) по времени О, из графика можно получить

Le - 1о

дать активность, -амилазы на 1 г сухого крахмала 7 ед. Пульпу помещают в змеевик из нержавеющей стали и вьщерживают при 8б с в течение 10 2,5 ч. После этой первой стадии термообработки пульпу перекачивают в другой змеевик при температуре в интервале 115-130 с и давлении 3,5- 7,0 кг/см в течение приблизительно

Rln(:

- I

)

. а : 1

.К

1Л1011 скорости реакцил oo;)ei.iOM,

С1 С -ll

ЁГ

35

начальной скорости ре- акщи (Кг) и фактор, вьфажающий период полураспада фермента (t), обеспечивают подход щее указание общей эффективности всего процесса. Чем выше значение, получаемое дл  К,Т, тем больше эффективность всего про- . цесса в терминах скорости превращени  глюкозы во фруктозу и воздействие всего процесса на период полураспада примен емого фермента.

Пример 1. Нилюстрирует предлагаемый способ в неирерывиом режиме, Показана высока  стабильность глю- коизомеразы, котора  достигаетс  при осуществлении предлагаеьюго способа, Глюкоизомераза, использованна  в этом и последующих примерах, иммобилизиро- вана на ЕАЕ целлюлозе.

Зерновой крахмал, выделенный из зерна при мокром помоле, промывают деионизированной водой и получают таким образом пульпу с содержанием

15 1 мин. Затем пульпу охлаждают до температуры приблизительно 36 С, добавл ют такое же количество of- -амилазы, как и на первой стадии термообработки , и направл ют пульпу на третью 20 стадию термообработки. В этом змеевике , характеристики которого совпадают с характеристиками первого змеевика, пульпу выдерживают при 86 С в течение 2 ч.

25 Ожижениый крахмал разбавл ют до содержани  твердого вещества 30% деи- они; ированной водой и подвергают осахариваиию в многоступенчатой системе реакторов, представл ющих собой 30 рот фвуары с мешалками. Добавл ют ускиритель фильтровани  (Dicalite i Cl --t75, GPvKFCO, INC) в количеств

ГС la сухое вещество, и затеп довод т рН до 4,5 добавлением НС1. Ожи/ .енный крпу.мальыый состав т г. ер- вый реактор п реакционной системе, добавл ют достаточное количест1ю глюкоа№ лазы (AMG-150, Batch SN 3075, Novo Enzyme Corp,) с тем, чтобы концентраци  единиц глюкоамилазы (СИ) составл ла 0,27 на 1 г сухого крахмала . Содержимое реактора нагревают до 58 С и затем порци ми пропускают через семь дополн1 тельных резисторов при той же температуре. Среднее врем  пребывани  в реакторе- составл ет 7,5 ч. В конце цикла осахарива- ни  пpoдyl т ,ии или раствор пропускают через фильтр, предварительно 5Q покрытьй ускорителем фильтровани 

при пониженном давлении, 254 мм рт.ст. дл  удалени  любых присутствуюп их некрахмальных остатков.

Дл  получени  вещества, пригод- 55 ного дл  изомеризации с глюкозоизо- меразой, раствор концентрируют до со- дерл1:а 1и  сухого вещества приблизи- тельно 50% в

40

45

непрерывном испарителе. Сначала раствор нагревают до 86 С

амилазы (Termamyl-60L), чтобы создать активность, -амилазы на 1 г сухого крахмала 7 ед. Пульпу помещают в змеевик из нержавеющей стали и вьщерживают при 8б с в течение 2,5 ч. После этой первой стадии термообработки пульпу перекачивают в другой змеевик при температуре в интервале 115-130 с и давлении 3,5- 7,0 кг/см в течение приблизительно

Дл  получени  вещества, пригод- ного дл  изомеризации с глюкозоизо- меразой, раствор концентрируют до со- дерл1:а 1и  сухого вещества приблизи- тельно 50% в

непрерывном испарителе. Сначала раствор нагревают до 86 С

фильтровывают и фильтрат довод т до содержани  Mg(HSOj) 0,0025 М. рН этого субстрата довод т до 6,0 с помощью MgO, а затем до 7,8 с помощью NaOH. Субстрат С готов т, раствор   достаточное количество кристаллической декстрозы в деионизированной воде, при этом получают раствор, содержащий 50% сухой декстрозы. Раствор довод т до содержани  Mg(HSO,),j 0,0025 М и рН 6,0 с помощью MgO, а затем до рН 7,8 с помощью NaOH.

Затем субстраты подвергают изомеризации пропусканием их через стекл нные колонки, оборудованные

Т а о .п и

Вли ние условий ожижени  и ic ахаривании га состав сахари зов а иных г.убстратоп и устоГ МИ1 : глюкоз сиз омера г-ы

Глюкоза, % сухой массы 96,6

Мальтоза, % сухой массы

1 Сетоза, мол рное отношение

Константа скорости, i

Период полураспада фермента,

Эффективность фермента , С К

г (G+F) IGIH -ч

.

г (G+F) IGIH

Данные табл.3 свидетельствуют о том, что наивысша  устойчивость ферментов и эффективность конверсии достигаетс  в том случае, когда не- очищенньБ 1 субстрат содержит малое количество мальтулозы. Существенно более низкие значени  дл  устойчивости и эффективности получаютс  при использовании неочищенного субстрата В, содержащего большее количество мальтулозы и приготовленного при более высоких значени х рН и вы

рубашкой при 65 С. Кажда  содержит около 800 IGIH иммобилизованной глю- коизомеразы. Субстраты ввод т в колонки сверху вниз при скорости потока 0,3 МЛ/МЗ-1Н. Изомеризацию осуществл ют непрерывно а прот жении 17 дней. ЕЬкедневно тбирают образцы субстратов и растворов, выход щих из колонки, с целью определени  концентраций фруктозы и глюкозы в субстратах и вычисл ют кинетические : параметры реакций изомеризации. Ни субстрат А, пи субстрат В не подвергают процессам счистки перед осу- ществ Ле шем изомеризации.

Результагы приведены в табл.3.

L; а

3

96,6

99,8

0,

0.

0.05

0,iS

0,0/5

0,022 0,02

7000

470

585

17,4

10,1

U,7

с оких температурах пьтоклаиирог аии .

сн занных : Vf.-i,iJ .i, п.лучен- г ,-чу:., г.чтьг реак

иг 1,.. ЧОГК1;|ИСМ .прозы ;; FuT4fCTТ .е. при

с ИCПOЛЬЗOвaИl . А

ной из в,subti1i: . uvnt H3OMepii3nu n . кристаллической JH ве субстрата указ: этот материал не быч свободе от р,.и, пода;:ЛЯ.ЮЕШХ активность гпю.оз ииог гразы и, таким образом, поз) еыо раз подчерк21 1449014-22

нуть важность условий, при которых жают, использу  Tennamyl-60L ot-ами- готовитс  неочишенмый субстрат. лазу по днухстадийному способу при

Пример 3. Иллюстрирует вли ние рН и температуры автоклави- ровани , используемых во врем  ожижени  крахмала, на стабильность изоме- ризукщих ферментов и на эффективность реакции конверсии.

П ть одинаковых образцов зернового ю табл.4.

крахмала (33% сухого вещества) ожиТаблица 4

JlClJjr 114 Д V- л щыг- - f

различных значени х рН и услови х автоклавировани .

Образцы ожижают при услови х (продолжительности, температуре, содержании фермента), приведенных в

. «

Количество фер мента (ликво- фоны в -амилаПримечание . Врем  автоклавировани  между стади ми 1 мин.

Растворы анализируют на содержание глюкозы и мальтозы и мол рное отношение кетосахаров.

20 л каждого из ожиженных.образцов крахмала осахаривали с использованием глюкоамилазного состава (АИС-150 Batch SN 3068, Novo Ensyme Corp.) при концентрации 0,41 СИ . Образюоадово- , д т до рН 4,3 и нагревают при 58 С те- чёние 32 ч. Осахаренные растворы отфильтровывают и упаривают до содержани  сухого вещества 50%, рН довод т до 6,5 с помощью MgO. Затем в каждом образце создают концентрацию MgCHSOj) . . 0,0025 М и наконец довод т рН до 7,8 Результаты изомеризации приведены

(определено при 25 С) с помощью NaOH. в табл.5.

Таблица 5

Вли ние рН ожижени  и температуры автоклавировани  на стабильность глюкозной изомеразы и на эффективность

превращени 

Неочищенные растворы изомеризуют 35 пропусканием через стекл нные колонки , наход щиес  при 60°С и содержащие иммобилизованную глюкозоизомера- зу при скорости потока 0,3 мл/мин . активность фермента в каждой колонке составл ет 800 IGIH.

жают, использу  Tennamyl-60L ot-ами лазу по днухстадийному способу при

табл.4.

JlClJjr 114 Д V- л щыг- - f

различных значени х рН и услови х автоклавировани .

Образцы ожижают при услови х (продолжительности, температуре, содержании фермента), приведенных в

. «

. . Результаты изомеризации приведены

Неочищенные растворы изомеризуют 35 пропусканием через стекл нные колонки , наход щиес  при 60°С и содержащие иммобилизованную глюкозоизомера- зу при скорости потока 0,3 мл/мин . активность фермента в каждой колонке составл ет 800 IGIH.

U490U

16

глюкозоизомеразы. Количество глюкозо- изомеразной активности в каждом реактора измен етс  в пределах от 2,300 g до 5,000 IGIH, Реакторы работают следующим образом. Отработанные реакторы , сто щие в начале цепи, удал ютс  и замен ютс  чистыми реакторами, сто щими в конце цепи. Изомеризацию

15

и выдерживают при этой температуре в течение 4 мин, затем осуществл ют упаривание при 58 с и давлении 625 мм рт.ст. Добавл ют Mg(HSOj) в таком количестве, чтобы концентраци  его составл ла 0,002 моль, затем довод т рН раствора до 7,8 (определено при ) раствором NaOH. Затем

раствор перекачивают через смеситель- ю осуществл ют при скорости введени  ный змеевик и фильтр с фильтровальной потока 2,4 мл вещества в 1 мин, при бумагой при 58 С.этом концентраци  фруктозы в конечном

Изомеризацию осуществл ют, перека- вытекающем потоке составл ет 42-А6%. чива  отфильтрованный субстрат через После заверщени  времени пребывани  четыре реактора со сло ми катализато- 15 в каадом реакторе отбирают пробу вира , соединенных сери ми, и наход щих- текаюй1его потока дп  получени  срав- с  при 60 С. Реакторы представл ют нительных данных.

собой стекл нные колонки диаметром Результаты изомеризации неочищен- 2,54 СМИ длиной 15,24 см, содержащие ного гидролизата представлены в переменные количества иммобилизованной табл.1.

Таблица

Непрерывный процесс ферментативной изомеризации гидролизатов; вли ние на стабильность фермента

г (G+F).4- V г (G+F)IGIH ;

Реактор 1 убрали из начальной позиции в /20 ч работы и после этого в конец цепи реактор 5.

Периодический анализ изомеризо- ванного раствора дает следующие значени  в расчете на массу сухого вещества:

U490U

16

глюкозоизомеразы. Количество глюкозо- изомеразной активности в каждом реактора измен етс  в пределах от 2,300 до 5,000 IGIH, Реакторы работают следующим образом. Отработанные реакторы , сто щие в начале цепи, удал ютс  и замен ютс  чистыми реакторами, сто щими в конце цепи. Изомеризацию

осуществл ют при скорости введени  потока 2,4 мл вещества в 1 мин, при этом концентраци  фруктозы в конечном

Фруктоза, % 44,3 Глюкоза, % 51,6 DPj (включает ди- и полисаха17

1449014

41 30

0,28 48,6

РИДЫ), %

Кальций, ч/млнСульфатированна 

зола, %

Сухое вещество.

Приведенные данные, а также данные, приведенные в табл,1, указывают , что глюкоэно-фруктозный си- роп, содержащий большой процент фрук тозы, можно получить, подверга  неочищенный крахмальный гидролизат, полученный при описанных услови х, изомеризации с иммобилизованной глюкозоизомеразой. Эти данные указывают также, что при описанных услови х ферменты имеют высокую устойчивость или период полужизни () и высокую степень ферментной активности

().

Пример 2. Иллюстри рует действие различных условий на ожижение и осахаривание крахмала, на образование неферментно полученных кетозосахаров в глюкозосодержащем субстрате и на устойчивость глюко- зоизомеразы, используемой дл  изомеризации глюкозы в фруктозу.

Крахмал ожижают в отдельных опытах , в одном из которых используют ei-амилазный состав, полученньй из B.licheniformis, и в другом опыте используютлй-амилазный состав, полученный из B43ubtilus, активность которого в. большей степени зависит от содержани  кальци . Ожижение производ т в две стадии при ферментной обработке с промежуточным автоклави- рованием с целью получени  частичног гидролизата, практически свободного от гранулированного или нежелатинизи рованного крахмала.

Готов т две идентичные крахмальные пульпы, кажда  из которых содержит 33% сухого вещества. Одну пульпу субстрат А, обрабатываютot-амилазой полученной из B.licheniformis, при услови х ожижени , описанных в изобретении . Другую пульпу, субстрат В, обрабатываютоС-амилазой, полученной из B.subtilis (Dex-Lo-HC. Wallerste Со), и ожижение осуществл ют в тех

Дл  изомеризации с иммобилизованной Глюкозоизомеразой готов т три субстрата. Субстрат А был 0,0025 М по Mg(HSO:j) и рН довод т до 7,8 с помощью раствора NaOH. Субстрат В сначал

услови х, которые обычно используютс 

дл  ожижени  крахмала с использовани- 55 обрабатьгоают стехиометрическим количество щавелевой кислоты при рН 4,8. Содержание кальци  в субстрате понижают до 30 ч/мпн в расчете на сухое вещество. Раствор затем повторно отем ферментного состава.

Услови , в которых осуществл ют ожижение, показаны в табл.2.

18

Т а б л и

Ц а

рн

рН устанавливали

Перва  стади 

Ликвофо- ны,

Температура ,с

5.2 MgO

14 86

6,6

СаО

33

88

Врем , ч Автоклавирование

Температура , с

125

150

10

11

Температура , с

86

88

Врем , ч

Каждый из ожиженных крахмальных составов разбавл ют до содержани  сухого вещества 30%, рН довод т до 4,3 и добавл ют 0,41 ОИ г глюко- амилазы. Осахаривание осуществл ют при 58 С в течение 32 ч (дл  субстрата А) и 55 ч (дл  субстрата В). Осахаренные растворы отфильтровывают и упаривают до содержани  сухого вещества 50% в вакууме при 35°С.

Дл  изомеризации с иммобилизованной Глюкозоизомеразой готов т три субстрата. Субстрат А был 0,0025 М по g(HSO:j) и рН довод т до 7,8 с помощью раствора NaOH. Субстрат В сначала

обрабатьгоают стехиометрическим количество щавелевой кислоты при рН 4,8. Содержание кальци  в субстрате понижают до 30 ч/мпн в расчете на сухое вещество. Раствор затем повторно отМолей кетозы на 100 моль дегидрогексозы; г (G+F) IGIH- .

Содержание мальтозы в субстратах зависит как от значени  рН при ожижении , так и от температуры автоклави- ровани . Как показано данными табл.5 содержание мальтулозы измен етс  противоположно периоду полураспада изо- меразы, что указывает на то, что услови  ожижени , промотирукицие неферментное образование предшественников мальтулозы, неблагопри тно сказываютс  на устойчивости фермента. Эти данные свидетельствуют также о том, что количество глюкозы, образующеес  во врем  осахаривани , уменьшаетс  с увеличением содержани  мальтозы.

Пример 4. Иллюстрирует вли - ние температуры, при которой выдерживают неочищенный субстрат до изомеризации на устойчивость глюкозоизо- меразы и эффективность реакции изомеризации .

Крахмал ожижают при услови х, приведенных в примере 3. Осахарениый раствор фильтруют с использованием ускорител  фильтровани  Dicalite, фильтрат упаривают до содержани  сухого вещества 50%. К сконцентриро35

ванному раствору добавл ют такое количество 5%-ного раствора Mg(HSOj) чтобы субстрат бып 0,0025 М, и рН довод т до 7,8 при с помощью

30 NaOH.

Раствор порци ми перекачивают через колонку с рубашкой, поддерживаемую при какой-либо температуре, указанной в табл.6. После 30-минутногс пребывани  в колонке при одной из указанных температур субстраты охлаждают , отфильтровывают и анализируют на содержание глюкозы и ке- тосахаров. Аналогично анализируют

Q порцию щелочного субстрата, которую не подвергают нагреванию.

Порции субстрата изомеризуют по отдельности без предварительной очистки пропусканием через стекл н g ные колонки с рубашками, поддерживаемые при температуре 65°С, кажда  из которых содержит слой иммобилизованной глюкозоизомеразы с активностью 800 IGIHi Изомеризацию осуществл ют

gQ в течение 500 ч при скорости введени  потока в колонку 0,3 мл/мин. Результаты приведены в табл.6.

Таблиц

Вли ние температурной обработки субстрата на стабильность глюкозной изомеразы и на эффективность превращени 

«Молей кетоэы на. 100 моль дегндрогексозыг (G+F) IGIH

Данные табл.6 свидетельствуют о том, что более высокотемпературна  обработка промотирует образование нефермеитативио-образованных кетоса- харов, в частности фруктозы, в субстратах , приготовленных в соответсг- ВИ31 с предпочтительнымз. услови ми ожижени  и осахаривани . Соответственно понижаетс  содержание глюкозы в субстрате.

Пример 5. Иллюстрирует зависимость устойчивости глюкозоизоме- разы и эгЙсктивности конверсии изоме30

3i

торых пульпа находитс  при 105-107 С в течение 7 мин. Затем пульпу охлаждают до и вьщерживают при этой температуре в течение 1,5 ч во втором ; меевике. Частичный гидролизат (, сухого, вещества) , имеюп1ий DE U,6 и свободный от сырого крахмала, что было установлено тестом на иод, перед осахариванием выдержииают при .

0/шкенный крахмал разКчвп к.т до содержани  су:сого вещества 30%, рН довод т до значени  4,5 и добавл ют

и ci dbl t1 - -lJUJt rv i,riUiiwv-i. -.г-

ризации при использовании неочищенно- ,о такое соз- го .lьнoгo гидро.шзата, полу- состава (Hovo,

дать концентрацию U,2b ьи а i рамм dss. Обрабатываемое впдестпо нагревают в течение 48 ч при 60 С при сохранении указанного выше значени  рН. Затем осахаренньш раствор отфильтровывают с использованием ускорител  фильтровани  Dicalite СР-175,

ченного известным способом.

Способ получени  крахмального гид- ролизата подчеркивает, что во врем  очистки субстрата необходимо удалить из него вещества, ингибирующие активность глюкозоизомеразы.

Крахмал, полученный из зерна при мокром номоле, суспендируют в деиони- зированной воде до концентрации сухого вещества 33%, рН пульпь : довод т до 6,5 с помощью MgO и добавл ют та-- кое количествоoi-амилазного состава, полученного из В,licheniformis (Termamyl-60L), чтобы ее концентраци  составл ла 20 ликвофон 20 . dss. Ожижение осуществл ют перекачиванием пульпы со скоростью 12 мл/мин через змеевики из нержавеющей стали, в ко45

50

55

фильтрат концентрируют до содержани  сухого вещества 49,6% в вакуумном испарителе при 43 С. Анализ раствора свидетельствует, что содержание глюкозы составл ет 95%, а содержание мальтулозы составл ет около 0,2%.

Дл  приготовлени  субстрата дл  изомеризации готов т раствор 0,002 М по Mg(HSO,).j и довод т рН до 7,9 с помощью раствора NaOH. Раст

торых пульпа находитс  при 105-107 С в течение 7 мин. Затем пульпу охлаждают до и вьщерживают при этой температуре в течение 1,5 ч во втором ; меевике. Частичный гидролизат (, сухого, вещества) , имеюп1ий DE U,6 и свободный от сырого крахмала, что было установлено тестом на иод, перед осахариванием выдержииают при .

дать концентрацию U,2b ьи а i рамм dss. Обрабатываемое впдестпо нагревают в течение 48 ч при 60 С при сохранении указанного выше значени  рН. Затем осахаренньш раствор отфильтровывают с использованием ускорител  фильтровани  Dicalite СР-175,

0

5

фильтрат концентрируют до содержани  сухого вещества 49,6% в вакуумном испарителе при 43 С. Анализ раствора свидетельствует, что содержание глюкозы составл ет 95%, а содержание мальтулозы составл ет около 0,2%.

Дл  приготовлени  субстрата дл  изомеризации готов т раствор 0,002 М по Mg(HSO,).j и довод т рН до 7,9 с помощью раствора NaOH. Раст27

вор выдерживают при в течение 20 мин и затем отфильтровьгеают.

Субстрат подвергают изомеризадии иммобилизованной глюкозоизомеразой без предварительного рафинировани  или очистки. Изомеризацию осуществл ют пропусканием субстрата через колонку, наход щуюс  при 65 С и соТаблица

Вли ние предварительной очистки гидролизата на стабильность глюкозной изомеразы и эффективность превращени  без очистки

Контроль

99,8

,10

Молей кетозы на 100 моль дегидрогексозы; (G+F) ч- ;

««

г (G+F) IGIH .

Результаты свидетельствуют о том что субстрат с низким содержанием кальци  и неферментативно образуемыми кетозосахарами не требует глубокого рафинировани  перед изомеризацией . Этот факт находитс  в пр мом противоречии с ранее известным в данной области.

Пример 6. Иллюстрирует изомеризацию нерафинированного крахмального гидролизата, приготовленного способом кислотно-ферментативного превращени .

Крахмал, полученньй из зерна путем мокрого помола, суспендирова- ли в деионизированной воде до содержани  сухого вещества 33%, рН пульпы довод т до 2,2 концентрированной сол ной кислотой. Ожижение осуществл ют перекачиванием пульпы под давлением через змеевик из нержавеющей стали со скоростью 22 мл/мин, пульпа при этом находитс  при температуре 135-140 С в течение приблизительно 4 мин, затем давление привод т к атмосферному. рН довод т до

14490U .

Держащую слой иммобилизованной глю- козоизомеразы с активностью 1000 IGIH со скоростью потока 0,4 мл/мин. Изомеризацию осуществл ют в течение 570 ч. Раствор кристаллической декстрозы изомеризуют при тех же усло- ни х в качестве контрольного опыта. Результаты приведены в табл.7.

0,05

0,026

528

13,7

значени  4,0-4,4 непрерывным добавлением гидроокиси натри  и температуру понижают до 60°G. Среднее значение D.E. ожиженного крахмала составл ет 18.

Приблизительно 70 л ожиженного

крахмала осахаривают, фильтруют и концентрируют, как описано в примере 5, за исключением того, что значение рН поддерживают на уровне 4,4, а общее врем  осахаривани  составл ет 62 ч. Осахаренный раствор с содержанием сухого вещества 50,3% довод т до значени  MgCHSO) , чтобы концентраци  последнего составл ла 0,002 моль, затем рП довод т до

значени  7,8 с помощью раствора гидроокиси натри . Осахаренный раствор подвергают дальнейшей термообработке, ильтруют и изомеризуют в услови х, описанных в примере 5. Изомеризацию

осуществл ют в течение 667 ч.

Результаты, приведенные в табл.8, сравнивают субстрат изомеризованной кристаллической декстрозы с неочиенным кислотно-ферментативным суб- 29

стратом. Эти результаты свидетельствуют о том, что крахмальный гидролиз at, полученный способом кислотно-ферментативного превращени , дшо- Изомеризаци  неочищенного гидролизата крахмапа, обработанного

кислотой и ферментом

Кристаллическа за

ка  декстро-„ „ г, mj: ; )« п 7

(контроль) 99,8- COJO 0,05 0,026 528 13,7

Кислотно- ферментативна  обработка

90,6 0,10 0,05 0,023 551

Молей кетозы на 100 моль дегидрогексозы; г (G+F) ч 1СЛИ- -, (G+F) .

Пример. Иллюстрирует использование глюкозоизомеразы, полученной из Bacillus coagulans микроорганизмов дл  изомеризации глюкозы в фруктозу в соответствии с предлагаемым способом.

Готов т два крахмальных гидролизата в тех случа х, которые бьши описаны в примере 3, за исключением значени  рН ожижени  и температуры автоклавировани . Эти услови , использованные дл  каждого из составов А и В, приведены в табл.9.

Таблица 9

I-. - -.- - -- - - Состав А Состав В

Значение рН ожижени 

5,2

6,7

Температура автоклавировани ,Ч 125 150-160

1АД9014-

щего низкий выход неферментно полученных кетосахаров, можно успешно подвергать изомеризации без предварительного рафинировани .

Таблица 8

12,7

35

Результаты анализов крахмальных гидролизатов на содержание мальтуло- зы дают 0,1% дл  состава А и среднее значение 1,10% дл  состава В.

Каждый состав отфильтровывают и концентрируют до содержани  сухого вещества 50% в вакууме, затем создают концентрацию 0,0025 М по MgCHSOj) после чего рН довод т до значени  40 7,9 с помощью раствора гидроокиси . натри . Оба состава неочищенных крахмальных гидролизатов непрерь.вно пропускают через змеевик, наход щийс  при , со скоростью 0,Д мл/мин, 45 врем  прохождени  змеевика составл ет 20 мин. Составы фильтруют и затем подвергают изомеризации пропусканием через стекл нную колонку с рубашкой, поддерживаемую при 65°С при скорости потока 0,4 мл/мин. Кажда  колонка содержит слой иммобилизованной глюкозоизомеразы (Sweetzyme-Type S.Batch № 70122, производимой фирмой Novo Inductrie, Denmark), обладающей 55 общей активностью 800.

Результаты приведены в табл.10.

50

Иг

If

Молей кетозы на 100 моль дегидр

IGIH ,-I

(G+F) г (G+F) IGIH

Данные табл.10 показывают важность поддержани  условий, привод щи к низкой концентрации мальтулозы в нерафинированном гидролизате.

Позитивное воздействие на стабильность глюкозоизомеразы и на эффективность общей конверсии, происход щие вследствии использовани  реакции изомеризации крахмального гид- ролизата, полученного по предлагаемому способу, позвол ет избежать необходимость рафинировани  гидролизат до стадии изомеризации. При тщатель

ном контроле условий ожижени  крахма- 30 неферментатиино образуемых кетозных

ла, сахарификации и хранени  получают субстраты, дл  которых уровень веществ, вредно вли ющих на устойчивость глюкозоизомеразы, таков, что становитс  возможным экономичное получе}ше глюкозно-фруктозных сиропов из нерафинированных гидролизатов

Фо. рмула изобретени 

Claims (5)

1. Способ получени  сиропа, содержащего глюкозу и фруктозу, предусматривающий ферментативное ожижение исходной крах 1альной суспензии, ферментативное осахаривание ожиженной суспензии, улаление из гидроли- зата нерастворенньЕх частиц и изомеризацию гидролизата путе;. контактировани  его с иммобилнзмрованной глюкозоизомеразой при температуре, достаточной дл  его осуществлени .

отличающийс  тем, что, с целью уменьшени  продуктов распада Сахаров в гидролизате и повышени 

стабильности фермента в процессе изомеризации , процесс ферментативного ожижени  крахмальной суспензии осуществл ют при рН 5,2-5,4, а ферментативное осахаривание ожиженной суспензии - при рН 4-5 и температуре 54-62 С дл  получени  гидролизата, содержащего не более 100 ч,/млн.ионов кальци  в расчете на массу сухого крахмала и с мол рным отношением

Сахаров менее 2 моль на 100 моль гексозных ед,

2.Способ ПОП.1, отличающийс  тем, что дл  ожижени 

используют глюкоамилазу, имеющую по Н1тженную зависимость от ионов кальци .

3.Способ по п.1, о т л и ч а- ю щ и и с   тем, что содержание

ионов капьци  не более 100 ч./млн обеспечивают путем хелатировами  избытка кальци  перед изомеризацией.

4.Способ ПОП.1, отличающийс  тем, что процесс ожижени 

провод т при содержании ионов кальци  не более 30 ч./млн.

5.Способ поп.1,отличаю- щ к и с   тем, что дл  изомеризации используют глюкозоизомеразу, адсорбированную или св занную с ДЕАЕ целлюлозой или анионообменной смолой.