SU1430888A1 - Method of stereospecific analysis of triacylglycerols - Google Patents

Description

0000

оabout

СХ) СХ)CX) CX)

схsc

Изобретение относитс  к масложи- ровой промышленности и касаетс  способа стереоспе1 (ифического анализа триацилглицеролов.The invention relates to the oil and fat industry and relates to the stereoscopic method (an mythical analysis of triacylglycerols.

Целью изобретени   вл етс  повышение точности анализа путем повышени  глубины фосфорилировани  и повышени  чистоты разделени  продуктов фосфолиполиза.The aim of the invention is to improve the accuracy of the analysis by increasing the depth of phosphorylation and increasing the purity of the separation of phospholipolysis products.

Способ осуществл етс  следующим образом.The method is carried out as follows.

В коническую колбу на 50 мл помещают навеску триацилглицеролов 1 г и добавл ют 4 мл t%-Horo раствора поливинилового спирта, 1 мл 22%-ного раствора хлористого калыц1 ,7 мл аммиачного буфера ( + IN , рН 8). Смесь вьщерживают в термостате 10 мин при 40°С, перемешива  содержимое мешалкой, и затем внос т в колбу 0,25 г предварительно обезжиренной ацетоном панкреатической липазы. Реакцию ведут 20-30 мин при 40 С, посто нно перемешива  и добав- л   через каждые 10 мин 1 каплю 4М гидроокиси аммони . Дл  контрол  глубины гидролиза через каждые 10 ми и последующие 5 мин реакции отбирают пробу и анализируют ее тонкослойной хроматографией в системе растворителей петролейный зфир (40-60 С): ди- этиловый эфир 7:3 (по объему). После подъема фронта растворителей и высу- .шивани  пластинки на воздухе про вл ют п тна продуктов гидролиза в парах иода, обраща  внимание на интенсивность п тна Sn-1,2-(2,3)-ди- aцилглицepoлoв, подвижность которого характеризуетс  коэффициентом ,3 При высокой активности липазы врем  гидролиза уменьшают до 5-10 мин, чтобы не допустить расщеплени  ди- .ацилглицеролов до свободных жирных, кислот и глицерина.A 50 ml sample of triacylglycerols is placed in a 50 ml conical flask and 4 ml of a t% -Horo polyvinyl alcohol solution, 1 ml of a 22% solution of Kalitsi chloride, 7 ml of ammonia buffer (+ IN, pH 8) are added. The mixture was kept in a thermostat for 10 minutes at 40 ° C, stirring the contents with a stirrer, and then 0.25 g of pancreatic lipase, previously defatted with acetone, was introduced into the flask. The reaction is carried out for 20-30 minutes at 40 ° C, constantly stirring and adding 1 drop of 4M ammonium hydroxide every 10 minutes. To control the hydrolysis depth, a sample is taken every 10 minutes and the next 5 minutes and analyzed by thin layer chromatography in a solvent system of petroleum sfir (40-60 ° C): 7: 3 diethyl ether (by volume). After raising the solvent front and dividing the plate in air, the spots of hydrolysis products in iodine vapors appear, paying attention to the intensity of the Sn-1,2- (2,3) -diacylglycerol stain, whose mobility is characterized by a factor of 3 With high lipase activity, the hydrolysis time is reduced to 5–10 min in order to prevent the de-acylglycerols from being cleaved to free fatty acids, glycerol.

По достижении желаемой глубины гидролиза реакцию прерывают и добавл ют к реакционной смеси 1-1,5 мл 4N сол ной кислоты и продукты вьщел ют трехкратной экстракцией (по 10 мп) диэтиловым эфиром, эфирные выт жки объедин ют, промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции, сушат безводным сульфатом натри , растворитель удал ют на роторном испарителе .When the desired hydrolysis depth is reached, the reaction is interrupted and 1-1.5 ml of 4N hydrochloric acid is added to the reaction mixture and the products are extracted three times by extraction (10 mp) with diethyl ether, the ether extracts are combined, washed with distilled water until neutral. dried with anhydrous sodium sulfate; the solvent is removed on a rotary evaporator.

Продукты гидролиза раздел ют препаративной тонкослойной хроматографией на пластинках (20x20 см) с силиThe hydrolysis products are separated by preparative thin layer chromatography on plates (20x20 cm) with silica.

00

00

00

5 five

кагелем, содержащим 5% гипса (8 г сорбента на 1 пластинку), в системе петролейный эфир (40-60 С): диэтило- вьй эфир 60:40 (по объему).kagel containing 5% gypsum (8 g of sorbent per plate), in the system of petroleum ether (40-60 C): diethyl ether 60:40 (by volume).

К остатку гидролизата после удалени  диэтилового эфира добавл ют 10 МП хлороформа и по 1 мл этого раствора нанос т на 10 пластинок. В системе растворителей гидролизат раздел етс  на следующие компоненты: нерасщепившиес  триацилглицеролы (Rf 0,6), свободные жирные кислоты, отщепившиес  от Sn-1- и Sn-3-поло- 5 жений (Rf 0,6), сумму Sn-1,2(2,3)- -диацилглицеролов (Rf 0,3) и 2-мо- ноацилглицеролы (Rf 0,07). Про вл ют вещества, опрыскива  край пластинки 50%-ной серной кислотой и нагрева  его или в парах йода.After removal of diethyl ether, 10 MP of chloroform are added to the residue of the hydrolyzate and 1 ml of this solution is applied onto 10 plates. In the solvent system, the hydrolyzate is divided into the following components: uncleaned triacylglycerols (Rf 0.6), free fatty acids, cleaved from Sn-1 and Sn-3 positions (Rf 0.6), the sum of Sn-1, 2 (2,3) -Diacylglycerols (Rf 0.3) and 2-monoacylglycerols (Rf 0.07). They are shown by spraying the edge of the plate with 50% sulfuric acid and heating it or in iodine vapor.

Зоны силикагел  с веществом счищают с пластинок, перенос т на воронку Шотта с фильтром № 4 и с помощью водоструйного насоса смывают липиды с силикагел  несколькими порци ми диэтилового эфира. Часть каждой фракции отбирают, жирные кислоты анализируют ГЖХ.Zones of silica gel with the substance are cleaned from the plates, transferred to a SCHOTT funnel with filter No. 4, and the lipids from the silica gel are washed off with a water-jet pump with several portions of diethyl ether. A part of each fraction is taken, fatty acids are analyzed by GLC.

Равенство кислотных составов нерасщепившихс  и исходных триацилглицеролов служит доказательством того, что липазный гидролиз не сопровождаетс  изомеризацией. Совпадение состава выделенных дл  Sn-1,2 (2,3)-ди- ацилглицеролов с рассчитанным теоретически доказывает их репрезентативность , т.е. отражает распределение кислот в исходных триацилглице- ролах.The equality of the acidic compositions of non-degraded and parent triacylglycerols indicates that lipase hydrolysis is not accompanied by isomerization. The coincidence of the composition selected for Sn-1,2 (2,3) -diacylglycerols with the calculated theoretically proves their representativeness, i.e. reflects the distribution of acids in the starting triacylglycerols.

Теоретический расчет состава Sn- -1,2(2,3)-диацилглицеролов % X в Sn-1,2(2,3)-диацилглицеролах равно 3/4 % X в ТАГ + 1/4 % X в Sn-2-моно- ацилглицеролах, где X - жирна  кислота . . . ,The theoretical calculation of the composition of Sn- -1,2 (2,3) -diacylglycerols% X in Sn-1,2 (2,3) -diacylglycerols is 3/4% X in TAG + 1/4% X in Sn-2- mono-acylglycerols, where X is a fatty acid. . . ,

5five

00

5five

00

5five

Жирнокислотный состав Sn-2-моно- ацилглйцеролов характеризует набор кислот Sn-2-положени .The fatty acid composition of the Sn-2-monoacylglycerols characterizes the set of acids in the Sn-2 position.

Дл  .фосфорилировани , Sn-1,2(2,3)- -диацилглицеролов используют свежеперегнанный фенилдихлорфосфат. Навеску 0,07-0,12 г Sn-1,2(2,3)-диaцил- глицеролов раствор ют в 0,5-1,0 мл безводного диэтилового эфира и охлаждают в льдосолевой смеси до (-10)- (-15) С. Охлажденный раствор вещества по капл м шприцем приливают к предварительно охлажденной до (-10)-For phosphorylation, Sn-1,2 (2,3) -diacylglycerols, freshly distilled phenyldichlorophosphate is used. A weighed 0.07-0.12 g of Sn-1,2 (2,3) -diacyl-glycerols is dissolved in 0.5-1.0 ml of anhydrous diethyl ether and cooled in ice-salt mixture to (-10) - (- 15) C. A cooled solution of the substance is dripped with a syringe to the pre-cooled to (-10) -

314314

(-15) С смеси 2 мл безводпс го пнри- ,иина и 0,25-0,50 r-ui сисжеперег нанно- го .гторфосфата в атмосфере азота при изб : точнсм даплекии 0,15 MIfa. Реактивную смесь после встр хипани  оставл ют в этих услови х на 8-10 ч при 3-8°С,(-15) With a mixture of 2 ml of water-free dosing, and 0.25–0.50 r-ui, desiccated nanophosphate under nitrogen at a gig: duplei and 0.15 MIfa. After stirring, the reaction mixture is left under these conditions for 8-10 hours at 3-8 ° C,

Затем в Т йакциоин к) смесь L и 1)-фосфат ;лилфсноло 3 при охлал дении добавл ют 5 мл пиридина, 3 нл диэти- лопого гофира и 5-7 капель дистиллированной воды., перенос т в целительную воронку,, запо.гп-шнную 30 мл мет анола, 25 MJt дистиллирова)5иой воды 30 млThen, in T yaktsioin k) a mixture of L and 1) phosphate; lylsnolo 3 is added with cooling 5 ml of pyridine, 3 nl of diethyl gopher and 5-7 drops of distilled water., Transferred to the healing funnel, -shnnuyu 30 ml met anola, 25 MJt distilled) 5th water 30 ml

ХЛОПОгЬорМЯ II 1 млCHILDREN II 1 ml

натри  Спп 5 мл), Хлопофор; ;нь м растsodium sppe 5 ml), clapofor; ny m rast

вер фосфЕ1Т иП г,;:-:ОТГ0.1Н|;-; О : } -:--У 1 У - отver fosfE1T uP g,;: -: OTG0.1N |; - -; О:} -: - У 1 У - from

промыпИ(,1х вод, хлор 5;ю1 1- N V ар;-;вг1 iOT п роторио;- испарителе тс-мггаратуре ие пьпие 5О С,a solution (, 1x water, chlorine 5; u1 1- N V ar; -; vg1 iOT p rotoro; - evaporator ts-mg heating and pipie 5O С,

Дл  опрсче; енч  побочны продуктовFor the best; ench side products

фосфорьЛИрОБаНИ5{ ;- О ЧИС- КИ Т.- :-1 1)Phosphorus LIBBY5 {; - ABOUT CHISSY T.-: -1 1)

-(i) о рф g ти д е п ол о у с г и i гьгй хл OD о фор;.;:1ь;й 1)ап нот1 г1:осЛ)г ; ИгЛ1,лтанолов пропускаю1 лерс : колонку аалолненаую ;,nJi iKa:i ejieM ohico va колонк;; 12 см,- (i) about the Russian Federation g ty depol o y s g and i gjhy hl OD o form;.;: 1b; th 1) apnote 1 g1: osL) g; IgL1, lantals skip 1 ler: a column of aalified;; nJi iKa: i ejieM ohico va column ;; 12 cm

Г;Ка,;1Г р 1 СГпри заполпепр -; колонтл на верхний слой сорбента насыпают небольшой слой (2--3 мм) сухого карбоната нат- .ри , внос т хлороформный раствор фос фатидилфенолов, Колонку про1-:ъ ва от хлороформом5 отдел   непрореа.гировав- шие Sn-1,2(2,3)-диацилглицеролыэ затем системой растворителей xпopoфop i: метанол 9:1 (по объегп,) вымывают сумму L- и D фосфатидилфенслов, Чистоту продуктов контролируют тонкослойной хроматографией в систаме хлороформ :метанол ;25%-на  гидроокись ам мони  80:20:2 (по объему) В этой системе сумма L- и В-фосфатидилфено- лов имеет Rf О 56.Г; Ка,; 1Г p 1 СГП topol - A small layer (2--3 mm) of dry sodium carbonate is poured onto the top layer of the sorbent, and a chloroform solution of phosphatidylphenols is added to the top layer. The product column is: - from chloroform; 5, the non-prodigious Sn-1 (2 , 3) -diacylglycerol and then with solvent system xopopopi i: methanol 9: 1 (in terms of), wash out the sum of L- and D phosphatidylphensov. The purity of the products is controlled by thin-layer chromatography in chloroform: methanol system; 25% ammonium hydroxide 80:20: 2 (by volume) In this system, the sum of L- and B-phosphatidylphenols has Rf O 56.

Про вл ют фосфатидипфенолы реактт - вом ВаськовскогО; что слу атт одно-временно качественной реакцией на фосфор.They exhibit phosphatidiphenol reactants of VaskovskO; that att simultaneously with a qualitative response to phosphorus.

Фосфолиполиз L-- и 1)-фосфати,цклфе нолов провод  , лобавп   к 50-100 мг фосфатщц-шфенолон в ч О мл диэтипово- го эфира 0,2 мл 0,1 М раствора хлористого капык  и растпор 20 мг  да гюрзы (йюсфопипаза в 1 мл/трис- -буфера с рН 5,0, Полноту гидролиза контролируют тонкослойной хроматогра88фмей на силикаг-епе в системе хлоро- формгметаиол:25%-на  гидроокись аммони  (80:20:2).Phospholipolysis of L-- and 1) -phosphati, tskfe nolov wire, additive to 50-100 mg of phosphate phosphate shphenolone per hour About ml of diethyl ether 0.2 ml of 0.1 M solution of Kapyk chloride and raspor 20 mg and gurzy (yusfopipaza in 1 ml / Tris-buffer with pH 5.0, the complete hydrolysis is controlled by thin-layer chromatography on silica gel in the system chloroform metaiol: 25% ammonium hydroxide (80: 20: 2).

R Л Казанной системе продукты фос- R L Kazanny system products phos-

фо 1иполиза имеют следующую хроматограГпгческую подвижность: нерасщенив- шиес  D-фосфатид гтфенолы - Rf 0,6, свободные кислоты, отщепившиес  изPhytopolyses have the following chromatographic mobility: unsaturated D-phosphatide gtphenols — Rf 0.6, free acids cleaved from

Sri--2 .положени  L-фосфатидилфенолов - Rf 0,4, лизофосфолипиды - Rf 0,05.Sri - 2. Positions of L-phosphatidylphenols - Rf 0.4, lysophospholipids - Rf 0.05.

Фосфалипо.пиз заканчивают после нрекрапшки  роста выхода свободных л нрных кислот и лизoфocфoлIш щoв,Phosphalipo. Piz finish after the growth of the growth of the output of free lnarny acids and lysofolol schich,

Реакционную ,смесь упаривают на ро T-opiiOM испарителе при температуре ие nj.iLie -iO С, добавл5т  неОолыаие партии исизо :п длл уд;;лй ;пл в виде азеотро- n;i основного кол .пчества воды. ЗатемThe reaction mixture is evaporated on a rotated T-opiiOM evaporator at a temperature of nj.iLie -iO С, and added a non-solubilized batch and iso: p dll beats ;; li; azeotro- n; i main water quality. Then

остаток продуктов фосфолиполиза после даленмг Д 5этилоного эфира и воды раствор ют в смеси, состо щей из Oj5 K-i хлорофор ма и 0,5 мл метанола и ;;аз;тслгс:пт препаративной тонкослой- the residue of the phospholipolysis products after dalenmg D 5 ethyl ether and water is dissolved in a mixture consisting of Oj5 K-i chloroform and 0.5 ml of methanol and; az; tslgs: fr preparative thin layer-

ИО11 хроматографией последовательно в л,пух с:;сте.ах: 1) гексан:диэтиловьй зфир (60;- iO по объему), вьдел ют сво- (Ч}тг1П: е жирные кислоты, имеющие хро 1-; гс1Грпф1 ческую подвижность в этойIO11 chromatography is carried out sequentially in l, fluff with:; stax. 1) hexane: diethyl sfir (60; - iO by volume), its own (F) tglp: e fatty acids having chromium mobility; in this

ci -vrei-;e (Rf - 0.6). 2) шороформ:ке- таиол:20%-на  гидроокись аммони  в соотношении 80:20:2 (по объем О. В этой систеьге выдел ют пол рные фракции: Л153ОФОСФОЛИПИДЫ (Rf 0,2) иci -vrei-; e (Rf - 0.6). 2) shoroform: ketaiol: 20% ammonium hydroxide in a ratio of 80: 20: 2 (by volume O. The polar fractions are separated in this system: L153OFOSFOLIPIDA (Rf 0.2) and

ijspacFienHBiiniecH D-фосфатидилфенолыijspacFienHBiiniecH D-phosphatidylphenols

(Rf 0,6У,(Rf 0.6U,

Зоны сорбента, содержащие свободные жирные кислоты, счищают и десор- бируют нескольк11ми порци ми диэтнлового эфира. Элюат осушают, метилируют -: анализиру от газожидкостной хроматографией .Sorbent zones containing free fatty acids are stripped and desorbed with several portions of diethyl ether. The eluate is dried, methylated -: by analyzing by gas-liquid chromatography.

Полосы селикагел  с D-фосфатидил- фенола№1 и с лизофосфолинидами счиiiiaioT в отдельные колбы и добавл ютStrips of silica gel with D-phosphatidyl-phenol No. 1 and with lysophospholine sciiiiiaioT into separate flasks and add

кадсцую по 3 МП 0,5 М метанольного раствора гидроокиси кали . Спуст  15 мин к ммлам добавл ют по 1 мл 1N сол ной кислоты и полученные частично метилированные жирные кислоты выдел ют экстракцией петролейным эфиром (АО--60 с) (3 раза по 5 in) . 3 MP 0.5 M methanol solution of potassium hydroxide. After 15 minutes, 1 ml of 1N hydrochloric acid was added to the mlam and the obtained partially methylated fatty acids were separated by extraction with petroleum ether (AO - 60 s) (3 times 5 in).

Сгчесь фильтруют через фильтр № 4 воронки Шотта, из приемной колбы пипеткой отбирают в другую колбу слой петропейногс эфира, содержащего жир- нъ е кис,лоты, растворитель упаривают, кислоты дометилируют диазометаном и анализируют П1(Х,The slurry is filtered through filter No. 4 from a Schott funnel, from the receiving flask a layer of petropain ether containing fatty acid and lots is removed by pipette into another flask, the solvent is evaporated, the acids are housetilated with diazomethane and analyzed by P1 (X,

Состав свободных жирных кислот, полученных при расщеплении лизофос- фатидилфенолов, не должен отличатьс  от состава кислот Sn-2-моноацил- глицеролов, полученных при липолити- ческом гидролизе. Совпадение состав ов подтверждает отсутствие изомеризации в процессе выделени  Sn-1,2(2,3)-ди- ацилглицеролов и, следовательно, их репрезентативность.The composition of free fatty acids obtained by the cleavage of lysophosphatidylphenols should not differ from the composition of Sn-2-monoacylglycerol acids obtained by lipolytic hydrolysis. The coincidence of the composition of ovs confirms the absence of isomerization in the process of isolating Sn-1,2 (2,3) -dacylglycerols and, therefore, their representativeness.

Из двух продуктов фосфолиполиза состав кислот лизофосфатидилфенолов непосредственно отражает набор жирных кислот 1 положени  триацилглицеролов. Набор кислот в Sn-3-положении получают расчетным путем двум  способами: 1) Sn-3-З (исходные триацилгли- церолы) - (лизофосфатиды) - (2-моноПараллельно проводили эксперимент по режимам, указанным в прототипе (табл. 1).Of the two products of phospholipolysis, the composition of lysophosphatidylphenol acids directly reflects the set of fatty acids of the 1 position of triacylglycerols. A set of acids in the Sn-3 position is obtained by calculation in two ways: 1) Sn-3-З (initial triacylglycerols) - (lysophosphatides) - (2-mono-Parallel), the experiment was performed according to the modes indicated in the prototype (Table 1).

Из результатов, приведенных в табл. 1, видно, что при избыточном давлении в атмосфере азота при снижении температуры в начальный период фосфорилировани  до -10 С и разделеНИИ продуктов фосфолиполиза последовательно в двух системах глубина фосфорилировани  увеличиваетс  на 25%, содержание продуктов деструкции г уменьшаетс  на 20%, длительностьFrom the results given in table. 1, it can be seen that under overpressure in a nitrogen atmosphere with a decrease in temperature in the initial phosphorylation period to -10 ° C and separation of the phospholipolysis products successively in two systems, the phosphorylation depth increases by 25%, the content of degradation products g decreases by 20%, the duration

процесса сокращаетс  на 8 ч и обеспечиваетс  полное разделение продуктов фосфолиполиза..process is reduced by 8 hours and ensures complete separation of the products of phospholipolysis ..

Пример 2. 0,1г 1,2(2,3)- -диацилглицеролов, полученных путемExample 2. 0.1 g of 1.2 (2,3) - -diacylglycerols, obtained by

ацилглицерины), 2) Sn-3-2 (D-фосфати- 20 гидролиза триацилглицеролов панкреа- дилфенолы)-(2-моноацилглицеролы). тической липазой, фосфорилировали фенилдихлорфосфатом в токе азота при давлении 0,13 МПа, температуре - 11 С выдержали смесь при +7°С в течение фосфорилировани  и образование побоч- 25 9 ч до завершени  реакции. Продуктыacylglycerols), 2) Sn-3-2 (D-phosphati-20 hydrolysis of triacylglycerols pancreatylphenols) - (2-monoacylglycerols). tonic lipase, was phosphorylated by phenyldichlorophosphate in a stream of nitrogen at a pressure of 0.13 MPa, at a temperature of –11 ° C, and the mixture was kept at + 7 ° C during phosphorylation and the formation of 25–9 hours before the completion of the reaction. Products

При выбранных режимах обеспечиваетс  увеличение глубины фосфорилировани , снижение деструкции субстратаUnder the selected modes, an increase in the phosphorylation depth, a decrease in the substrate destruction is provided.

ных продуктов реакции, уменьшение продолжительности анализа, повышение чистоты выдел емых продуктов фосфо-, липолиза. Избыточное давление нейт- /reaction products, reducing the duration of the analysis, increasing the purity of the released products of phospho-, lipolysis. Neutral overpressure /

рального газа над реакционной средой, с Rally gas over the reaction medium, with

одной стороны, предотвращает окислительные процессы в продолжительной реакции фосфорилировани , а с другой преп тствует конденсации влаги в реакционную смесь из газового состава колбы, что улучшает полноту фосфорилировани . Двухстадийный температур- ньй режим фосфорилировани  обеспечивает отсутствие побочных продуктов реакции на первой стадии и повьппение глубины на второй стадии. При выходе за пределы параметров способа точность анализа остаетс  не уровне прототипа .. .on the one hand, it prevents oxidative processes in the long phosphorylation reaction, and on the other hand, it prevents the condensation of moisture into the reaction mixture from the gas composition of the flask, which improves the completeness of phosphorylation. The two-stage temperature phosphorylation regime ensures the absence of reaction by-products in the first stage and the depth of the second stage. When going beyond the parameters of the method, the accuracy of the analysis remains at the level of the prototype ...

Пример 1. О,1 г 1,2 (2,3)- -диацилглицеролов, полученных путем гидролиза триацилглицеролов панкреатической липазой, фосфорилировали фенилдихлорфосфатом в токе азота при давлении 0,10 МПа, температуре - ЮС выдерживали до завершени  реакции при +5 С в течение 8 ч. Полученные фосфолипиды после фосфолиполиза раздел ли тонкослойной хроматографией последовательно в двух системах растворителей гексан:диэтиловый эфир (60:40), хлороформ:метанол:20%-на  гидроокись аммони  (80:20:2).Example 1. About 1 g of 1,2 (2,3) - -diacylglycerols, obtained by hydrolysis of triacylglycerols with pancreatic lipase, was phosphorylated by phenyldichlorophosphate in a stream of nitrogen at a pressure of 0.10 MPa, temperature — JC was kept until the reaction was completed at +5 C per for 8 hours. The phospholipids obtained after phospholipolysis were separated by thin layer chromatography successively in two solvent systems: hexane: diethyl ether (60:40), chloroform: methanol: 20% ammonium hydroxide (80: 20: 2).

фосфолиполиза последовательно раздел ли в системах растворителей гексангдиэтиловый зфир (60:40), хлороформ: метанол :20%- на  гидроокись амПараллельно проводили эксперимент ло режимам, указанным в прототипе (табл. Г).phospholipolysis were successively separated in solvent systems hexane diethyl sfir (60:40), chloroform: methanol: 20% - on the am hydroxide. In parallel, experiments were carried out using the regimes indicated in the prototype (Table D).

Из данных, приведенных в табл. 2, 35 видно, что при названных услови х глубина фосфорилировани  увеличиваетс  на 25%, содержание продуктов деструкции снижаетс  на 10%, длительность процесса фосфорилировани  сок- 40 ращаетс  на 9ч, обеспечиваетс  абсолютное разделение продуктов фосфо- липолиза.From the data given in table. 2, 35, it is clear that under these conditions the depth of phosphorylation increases by 25%, the content of degradation products decreases by 10%, the duration of the phosphorylation process decreases to 9 hours, absolute separation of the products of phospholipolysis is provided.

П р и м е р 3. 0,1 г 1,2(2,3)-ди 45 ацилглицеролов, полученных путем гидролиза триацилглицеролов панкреатической липазой, фосфорилировали I нилдихлорфосфатом в токе азота приEXAMPLE 3: 0.1 g of 1,2 (2,3) -di 45 acylglycerols, obtained by hydrolysis of triacylglycerols with pancreatic lipase, were phosphorylated with nitrochlorophosphate I in a stream of nitrogen at

давлении 0,15 МПа, температуре - 12 С 50 вьщерживалй при в течение 10 ч до завершени  реакции, продукты фосфолиполиза последовательно раздел ли в системах растворителей: гексан:ди- этиловый эфир (60:40), хлороформ:ме- 55 танол:20%-на  гидроокись аммони  (80:20:2).pressure of 0.15 MPa, temperature - 12 C 50 held for 10 hours before completion of the reaction, the products of phospholipolysis were successively separated in solvent systems: hexane: diethyl ether (60:40), chloroform: methanol 55: 20 % ammonium hydroxide (80: 20: 2).

Параллельно проводили эксперимент по режимам, указанным в прототипе (табл. 3).In parallel, an experiment was conducted on the modes indicated in the prototype (Table 3).

Из результатов, приведенных в табл. 3 видно, что в данном случае глубина фосфорилировани  увеличиваетс  на 25%, содержание продуктов дест рукции снижаетс  на 20%, длительност процесса снижаетс  на 8 ч, обеспечиваетс  абсолютное разделение продуктов фосфолипсшиза,From the results given in table. 3 it can be seen that in this case the depth of phosphorylation is increased by 25%, the content of the decomposition products is reduced by 20%, the duration of the process is reduced by 8 hours, absolute separation of the products of phospholipsis is provided,

Пример 4. 0,1 г 1,2(2,3)- -диацилглицеролов, полученных путем гидролиза триацилглицеролов панкреатической липазой, фосфорилировали фе нилдихлорфосфатом в токе азота при давлении 0,09 МПа, температуре С выдерживали при 10 С до завершени  реакции в течение 7 ч, продукты фос- фолиполиза последовательно раздел ли в системах гексан:диэтш1овый эфир (50:50), хлороформ:метанол (75:25). Параллельно проводили эксперимент по режимам, указанным в прототипе Стабл. 4).Example 4. 0.1 g of 1,2 (2,3) - -diacylglycerols, obtained by hydrolysis of triacylglycerols with pancreatic lipase, were phosphorylated with phenyldichlorophosphate in a stream of nitrogen at a pressure of 0.09 MPa and kept at a temperature C at 10 ° C until the reaction was completed 7 hours, the phospholipolysis products were successively separated in the systems hexane: diethyl ether (50:50), chloroform: methanol (75:25). In parallel, they conducted an experiment on the modes specified in the Stable prototype. four).

Из результатов,приведенных в табл. 4, видно, что при осуществле- НИИ метода по режимам, в.ыход щим за оптимальные значени , из поставленны целей достигаетс  только одна - снижение содержани  продуктов деструкции , в то врем  как глубина фосфори- лировагда , чистота разделени  продукта остаетс  на уровне прототипа.From the results given in table. 4, it can be seen that with the implementation of the scientific research institute according to the regimes beyond the optimal values, only one goal is achieved - reduction of the content of degradation products, while the depth of phosphorylation, the purity of the product separation remains at the level of the prototype.

Пример 5. 0,1 г 1,2(2,3)- -дйацилглицеролов, полученных путем гидролиза триацилглицеролов панкреа- тической липазой, фосфорилировали фе нилдихлорфосфатом в токе азота при давлении 0,20 МПа, температуре , вьцт,ерживали реакционную смесь при +5 С в течение 14 ч, продукты фосфо- липолиза последовательно раздел ли в системах гексан-диэтиловый эфир (70:30), хлороформ:метанол (85:15).Example 5. 0.1 g of 1,2 (2,3) - -dacylglycerols, obtained by hydrolysis of triacylglycerols by pancreatic lipase, were phosphorylated with phenyldichlorophosphate in a stream of nitrogen at a pressure of 0.20 MPa, temperature, highest, at + 5 C for 14 hours, the products of phospholipolysis were successively separated in the systems hexane-diethyl ether (70:30), chloroform: methanol (85:15).

Параллельно проводили эксперимент по режимам, указанным в прототипе (табл. 5).In parallel, an experiment was conducted on the modes indicated in the prototype (Table 5).

Из результатов, приведенных в . табл. 5, видно,что при осуществлении метода по режимам, выход пц1м за границы оптимальных режимом, не дости- гаютс  чистота разделени  продуктовFrom the results given in tab. 5, it can be seen that in the implementation of the method according to the regimes, the release of pc1m beyond the limits of the optimal regime, the purity of the separation of products is not achieved.

фосфолиполиза и глубина фосфорилировани .phospholipolysis and depth of phosphorylation.

Claims (1)

Формула изобретени Invention Formula Способ стереоспецифического анализа триап лглицеролов, включающий гидролиз пробы панкреатической липазой , вьщеление из продуктов гидроли- за 2-моноацилглицеролов и смеси 1,2 (2,3)-диацилглицеролов препаративной тонкослойной хроматографией, определение жирно-кислотного состава 2-моноацш1Глицерс1ЛОВ в 2-положении газожидкостной хроматографией, фос- форилирование смеси 1,2 (2,3)-диацил глицеролов фенилдихлорфосф|атом при . отрицатепьных температурах с последующим нагревом до положительных температур и выдержкой в течение нескольких часов, вьщеление из продуктов реакции смеси L- и D-фосфати- диЛфенолов колоночной хроматографией , их гидролиз фосфолипазой Aj, выделение из продуктов фосфолиполиза L-лизофосфатидилфенолов препаративной тонкослойной хроматографией в системе растворителей хлороформ:метанол , определение их жирно-кислот- ,ного состава в 1-положении газожид- костной хроматографией и определение жир но-кислотного состава в 3-поло- жении расчетным путем, о т л и ч а - ю щ и и с   тем, что, с целью повышени  точности анализа путем .увеличени  глубины фосфорилировани  и повышени  чистоты разделени  продуктов фосфолиполиза, фосфорилирование ведут в атмосфере азота под давлением 0,10-0,15 МПа при температуре (-10) - (-12) С и нагрев ведут до TeMnepaTy ры 5-8 С, при вьщелении продуктов фосфолиполиза в систему растворителей хлороформ:метаНОЛ дополнительно ввод т 20%-ную гидроокись аммони , а в качестве второй системы растворителей используют гексан и диэтиповый эфир при соотношении растворителей 80:20:2 и 60:40 по объему соответственно .The method of stereospecific analysis of tripolyglycerols, including the hydrolysis of a sample of pancreatic lipase, extracting 2-monoacylglycerols from hydrolysis products and 1,2 (2,3) -diacylglycerols hydrolysis products, determination of 2-monoacetic acid-2-fatty acid composition of 2-chyro-chi-chi-chi-h1-2-chromosome-2-monoacylglycerols; chromatography, phosphorylation of a mixture of 1,2 (2,3) -diacyl glycerols phenyldichlorophosphate | atom at. negative temperatures followed by heating to positive temperatures and aging for several hours : methanol, determination of their fatty acid composition in the 1-position by gas-liquid chromatography and determination of the fatty acid composition in the 3-position calculated in order to increase the accuracy of the analysis by increasing the phosphorylation depth and increasing the purity of the separation of phospholipolysis products, phosphorylation is carried out in a nitrogen atmosphere under a pressure of 0.10-0.15 MPa at a temperature of (-10) - (-12) C and heating is carried out to TeMnepaTy ry 5-8 C, when phospholipolysis products are introduced into the solvent system, chloroform: methanol additional 20% ammonium hydroxide is added, and the second solvent system is used hexane and diethipovy ether with a ratio of solvents 80: 20: 2 and 60:40 by volume, respectively. Глубина фосфорилировани , % от суммы диа1Д1лглицероловDepth of phosphorylation,% of the amount of dia1D1glycerols Содержание продуктов деструкции , %The content of degradation products,% Длительность процесса фосфорилировани , чThe duration of the phosphorylation process, h Чистота разделени  продуктов фосфолиполиза, %Pure separation of phospholipolysis products,% Глубина фосфорилировани , % от суммы диацилглицероловDepth of phosphorylation,% of the amount of diacylglycerols Содержание продуктов деструкции , % The content of degradation products,% Длительность процесса фосфорилировани , чThe duration of the phosphorylation process, h Чистота разделени  продуктов фосфолиполиза, %Pure separation of phospholipolysis products,% Т а б л и ц а 1Table 1 6565 9090 2525 10ten 70-8070-80 100100 Таблица 2table 2 6565 9090 2525 1515 7070 100100 .Способ.Way Прототип Предлагаемый при Р 0,15 МПа t -}2°С t +8 СPrototype Offered at Р 0,15 MPa t -} 2 ° С t +8 С I . - .I. -. и , % лов 65 90and% catch 65 90 25 .525 .5 фосфо18 10phospho 18 10 дуктовduktov 70 10070 100 Т а б л и ц а 4T a b l and c a 4 СпособWay Прототип Предлагаемый при Р 0,09 Ша t t н-Ю сPrototype Offered at Р 0,09 Sha t t n-Y с Глубина фосфорилировани ,Depth of phosphorylation, % от суммы диацилглицеролов % of the amount of diacylglycerols Содержание пр1одуктовProduct Content деструкхщи, %Destrukhschki,% Длительность процесса фосфорилировани , чThe duration of the phosphorylation process, h Чистота разделени  продуктов фосфолиполиза, %Pure separation of phospholipolysis products,% 6565 1818 7070 1313 ПоказателиIndicators Глубина фосфорилировани ,Depth of phosphorylation, % от суммы диацилглицеролов % of the amount of diacylglycerols Содержание продуктовProduct content деструкции, 7,destruction, 7, Длительность процессов фосфорилировани , чThe duration of the phosphorylation processes, h Чистота разделени  продуктов фосфолиполиза, %Pure separation of phospholipolysis products,% Редактор М.ЦиткинаEditor M. Tsitkina Составитель В.ГордеевCompiled by V.Gordeev Техред л,Сердюкова Корректор М.ВасильеваTehred l, Serdyukov Proofreader M.Vasilyeva Заказ 5338/47Order 5338/47 Тираж 847Circulation 847 ВНИИПИ Государственного комитета СССРVNIIPI USSR State Committee по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., д. 4/5for inventions and discoveries 113035, Moscow, Zh-35, Raushsk nab., 4/5 14308881430888 14 Таблица 514 Table 5 СпособWay Предлагаемый при Р 0,2 МПа t -З С t Offered at Р 0,2 MPa t -З С t 6565 1515 1414 7070 ПодписноеSubscription