SU1338859A1 - Method of producing corpusgular immunogenic fraction of tuberculosis mycobacteria - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к ветеринарной иммунологии и может быть использовано в лаборатори х и НИИ, изучающих механизмы формировани  противотуберкулезного иммунитета. Целью изобретени   вл етс  повьшение эффективности способа получени  корпускул рной иммуногенной фракции микобак- терий туберкулеза. Сущность предлагаемого способа состоит в дезинтеграции микобактерий в конце логарифмической стадии роста (через 16 - 19 ч от момента начала культивировани ). При этом концентрирование и очистка полученной иммуногенной фракции осуществл етс  в оптимальных режимах промывани  и центрифугировани . Полученные при реализации предлагаемого способа иммуногенные фракции.микобактерий туберкулеза обладают выраженным протективным действием при их однократном подложном введении морским свинкам. 3 табл. а S (Л сThe invention relates to veterinary immunology and can be used in laboratories and research institutes studying the mechanisms for the formation of tuberculosis immunity. The aim of the invention is to increase the efficiency of the method for producing the corpuscular immunogenic fraction of mycobacterium tuberculosis. The essence of the proposed method consists in the disintegration of mycobacteria at the end of the logarithmic growth stage (16 to 19 hours after the start of cultivation). At the same time, the concentration and purification of the obtained immunogenic fraction is carried out in optimal washing and centrifuging regimes. Obtained during the implementation of the proposed method, the immunogenic fractions. Mycobacterium tuberculosis have a pronounced protective effect when they are once bogus injected into guinea pigs. 3 tab. and S (L with

Description

Изобретение относитс  к ветеринарной иммунологии и может быть использовано в лаборатори х и НИМ, изучаю- пщх механизмы формировани  противотуберкулезного иммунитета.The invention relates to veterinary immunology and can be used in laboratories and BAT, studying the mechanisms of formation of tuberculosis immunity.

Цель изобретени  - повышение эффективности способа получени  корпускул рной иммуногенной фракции ми- кобактерий туберкулеза.The purpose of the invention is to increase the efficiency of the method for producing the corpuscular immunogenic fraction of mycobacterium tuberculosis.

Пример 1. Провод т посев микобактерий туберкулеза (после 3-5 пассажей) на жидкую (например, Сото- на) и плотную (например, Левенштейна Йенсена) питательные среды, причем в последнем случае в большом разведении (1:640 - 1:1280) и помещают в термостат ().Example 1. Mycobacterium tuberculosis was sown (after 3-5 passages) in liquid (for example, Soto- nian) and dense (for example, Levenshteyn Jensen) culture media, and in the latter case in large dilution (1: 640 - 1: 1280 ) and placed in a thermostat ().

Ежедневно определ ют количество колоний, и по log2 от среднего числа колоний стро т крршую размножени  (табл.1).The number of colonies is determined daily, and log2 from the average number of colonies is harvested (2).

Основные стадии роста микобактерий туберкулеза бычьего вида приведены в табл. 1 .The main stages of the growth of mycobacterium tuberculosis of bovine species are given in table. one .

В соответствир с полученными результатами бакмассу Б15К дл  дезинтеграции берут через 16 сут роста, а бакмассу М. bovis (данного штамма) - через 19 сут роста.In accordance with the obtained results, the B15K bakmass is taken for disintegration after 16 days of growth, and the M. bovis bakis (of this strain) is taken after 19 days of growth.

Дл  получени  фракции оболочек микобактерий в конце лог-периода роста подвергают механической дезинтеграции в соответствии с параметрами, приведенными в табл.2. .To obtain the fraction of mycobacterial membranes at the end of the growth log period, they are subjected to mechanical disintegration in accordance with the parameters given in Table 2. .

В качестве среды дл  суспендиро- вани  используют физиологический раствор (р Н 7,0 - 7,2), в который внос т .бакмассу, после чего бактериальную суспензию посещают в камеру дезинтегратора, куда добавл ют стекл нные бусы. Камеру дезинтегратора охлалодают в лед ной бане и провод т разрушение микобактерий туберкулеза в непрерывном режиме работы. По окончании процедуры разрушени  надосадок перенос т в сборный сосуд, стекл нные бусы .дважды промывают физиологическим раствором и объедин ют с ранее полученным дезинтегратором. Неразрушенные микобактерий и крупные конгломераты удал ют центрифугированием при 2000g в течение 20 мин. Надосадок собирают, -осадок ресуспенди- руют в физиологическом растворе и вновь центрифугируют при тех же режи мах. Эту процедуру повтор ют дважды, полученные надосадки об7зедин ют ицеит A physiological solution (p H 7.0–7.2) is used as a suspension medium, into which the bulk is added, after which the bacterial suspension is visited into the disintegrator chamber, to which glass beads are added. The disintegrator chamber is cooled in an ice bath and mycobacterium tuberculosis is destroyed in continuous operation. At the end of the procedure, the destruction of the supernatants is transferred to a collecting vessel, the glass beads are washed twice with saline and combined with the previously obtained disintegrator. Intact mycobacteria and large conglomerates are removed by centrifugation at 2000g for 20 minutes. The supernatant is harvested, the precipitates are resuspended in physiological solution and centrifuged again in the same modes. This procedure is repeated twice, the supernatants obtained are consolidated by its

рифугируют при 15000g 60 мин. Надосадок отбрасывают, осадок ресуспендируют в 0,5%-ном растворе тритона Х-100 в соотношении 1:50 при посто нном перемешивании в течение 10 ч (дл  БЦЖ) и 18 ч (дл  М,bovis) при 4 С.rifled at 15000g 60 min. The supernatant is discarded, the precipitate is resuspended in a 0.5% Triton X-100 solution in a ratio of 1:50 with constant stirring for 10 hours (for BCG) and 18 hours (for M, bovis) at 4 C.

Цитоплазматические структуры удал ют путем центрифугировани  суспензии при ISOOOg в течение 20 мин. Надосадок отбрасывают, осадок ресуспендируют в 1М растворе хлористого натри  в соотношении 1:50 при посто нном перемешивании в течение 13чCytoplasmic structures are removed by centrifuging the suspension at ISOOOg for 20 minutes. The supernatant is discarded, the precipitate is resuspended in a 1M solution of sodium chloride in a ratio of 1:50 with constant stirring for 13 hours.

5 (дл  БЦЖ) и 18 ч (дл  М. bovis) при . Обработанную суспензию центрифугируют при 16000g 20 мин. Надосадок отбрасывают, осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и центQ рифугируют при l6000g 20 мин. Процедуру отмывани  клеточных оболочек повтор ют дважды.5 (for BCG) and 18 hours (for M. bovis) at. The treated suspension is centrifuged at 16000g for 20 minutes. The supernatant is discarded, the precipitate is resuspended in distilled water, and the center Q is rigged at l6000g for 20 minutes. The cell washing procedure is repeated twice.

Чистоту полученной фракции оболочек контролируют цитологически и бак5 териологически. Оболочки лиофилизи- руют известным способом.The purity of the shell fraction obtained is controlled cytologically and bacteriologically. Shells are lyophilized in a known manner.

Пример 2. Приготовление масл но-водной эмульсии оболочек ми- - кобактерий дл  иммунизации животных. А. 10 мг лиофилизированных оболочек микобактерий туберкулеза тщательно перемешивают с 0,25 мл стерильного вазелинового масла в гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком и по капл м добавл ют 9,75 мл 0,5%- ного Твипа-80 в .физиологическом растворе .Example 2. Preparation of an oil-in-water emulsion of the membranes of mycobacteria for immunization of animals. A. 10 mg of lyophilized mycobacterium tuberculosis are thoroughly mixed with 0.25 ml of sterile vaseline oil in a Teflon pestle Potter homogenizer and 9.75 ml of 0.5% Tvip-80 in physiological saline is added dropwise.

В результате в 10 мл масл но-водной эмульсии содержитс  10 мг оболочек , соотношение масла и воды 1:39.As a result, 10 mg of shells are contained in 10 ml of an oil-in-water emulsion, the ratio of oil and water is 1:39.

Б. 10 мг лиофилизированных оболочек микобактерий тщательно перемешивают с 0,20 мл стерильного вазелино-. вого масла в гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком и по капл м добавл ют 9,8 мл 0,5%-ного раствора Твина-80 в физиологическом растворе. В 10 мл масл но-водной эмульсии содержитс  10 мг оболочек, соотношение масла и воды 1:49.B. 10 mg of lyophilized mycobacterial membranes are thoroughly mixed with 0.20 ml of sterile vaseline -. of a new oil in a Potter homogenizer with a Teflon pestle and 9.8 ml of a 0.5% solution of Tween 80 in physiological saline are added dropwise. 10 ml of an oil-in-water emulsion contains 10 mg of membranes, the ratio of oil and water is 1:49.

00

5five

00

5five

00

5555

Пример 3. Изучение протек- тивного эффекта оболочек БЦЖ и М. bovis на морских .свинках.Example 3. Study of the protective effect of BCG and M. bovis membranes on marine pigs.

Приготовленную масл но-водную эмульсию оболочек БЦЖ и М. bovis ввод т подкожно морским свинкам в область медиальной поверхности бедра однократно в разных дозах.The prepared oil-in-water emulsion of BCG and M. bovis membranes is administered subcutaneously to guinea pigs in the region of the medial surface of the thigh once in different doses.

Протективный эффект противотуберкулезной иммунизации морских свинокThe protective effect of tuberculosis immunization of guinea pigs

приведены в табл.3.are given in table 3.

II

Одновременно животньпс тем же способом иммунизируют целыми живыми и убитыми БЩ. Через 2 мес всех животных подвергают контрольному заражению вирулентными микобактери ми туберкулеза и регистрируют падеж в экспериментальных группах в течение последующих 3 мес. Протективный эффект оцениваю,т по средней продолжи- тельности жизни. Как следует из табл.3, оболочки БЦЖ в дозе 0,1 мг на животное и оболочки М.bo- vis в дозе 0,37 мг на животное индуцируют противотуберкулезную резистентность, не уступающую по средней продолжительности жизни иммунизации вакциной БЩ в дозе 1 мг на животное при однотипном способе введени , в чем про вл етс  им- муногенность полученной по предлагае способу фракции оболочек мико- бактерий туберкулеза. Сама по себе масл но-водна  эмульси , целые живые и убитые Б1Щ в масл но-водной эмульсии не защищают животных от заражени  туберкулезом. Оболочки М. bovisAt the same time, animals in the same way are immunized with whole living and killed BSH. After 2 months, all animals are subjected to control infection with virulent mycobacteria tuberculosis and mortality is recorded in the experimental groups over the next 3 months. I estimate the protective effect, t by the average life expectancy. As follows from Table 3, the BCG envelope at a dose of 0.1 mg per animal and M. bovis envelopes at a dose of 0.37 mg per animal induce anti-tuberculosis resistance, which is no less than the average life expectancy of immunization with the BSH vaccine at a dose of 1 mg per an animal with the same type of administration method, which shows the immunogenicity of the fraction obtained for the method of the mycobacterium tuberculosis shells. By itself, an oil-water emulsion, whole live and killed B1SCH in an oil-water emulsion does not protect animals from infection with tuberculosis. Shell M. bovis

в дозе 0,03 мг на животное не обладают протективным эффектом . at a dose of 0.03 mg per animal do not have a protective effect.

Б1Щ1-1112-16С17B1SchCH1-1112-16C17

MycobacteriumMycobacterium

bovis 81-n12-19С20bovis 81-n12-19С20

Таблица2Table 2

Стекл нные бусы,Glass beads,

диаметрdiameter

Соотношение бакмасса: физиологической раствор :бусыThe ratio of Bakmass: saline: beads

3885938859

Claims (1)

Формула изобретени Invention Formula Способ получени  корпускул рной иммуногенной фракции микобактерий туберкулеза , включающий выращивание ми- кобактерий туберкулеза на питательной среде, сбор бакмассы микобакте- рий, их механическую дезинтеграцию, осаждение неразрушенных микобактерий, концентрирование и очистку фракции клеточных оболочек с последующей лио- филизацией целевого продукта, о т- л и. чающийс  -тем, что, с целью повышени  эффектности способа,A process for preparing a particulate immunogenic fractions of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis comprising growing in a nutrient medium, collecting bakmassy mycobacteria, their mechanical disintegration, precipitation of intact mycobacteria, concentration and purification fraction of cell membranes, followed by the desired product lio- filizatsiey of m- l and. in particular, in order to increase the effectiveness of the method, - сбор.бакмассы микобактерий осуществл ют с помощью бус в физиологическом растворе с рН 7,0 - 7,2 в течение 60...90 мин при соотношении бак- масса: бусы: физиологический раствор 1:2:1 ... 1,2:2,2:1,3, осаждение неразрушенных микобактерий осуществл ют трехкратным центрифугированием при 2000g в течение 15...20 мин, концентрирование провод т путем центрифугиg ровани  надосадочной жидкости при 15000g в течение 60...90 мин, а по- следз/ющую очистку фракции клеточных оболочек провод т путем посто нного перемешивани  осадка с 0,4...0,5%-ным раствором тритона Х-100, добавл емого в соотношении 1:40...1:50, и последующего отмывани  корпускул рной фракции дистиллированной водой с двухкратнь1м центрифугированием при 15000...16000g в течение 20 мин.- collection of mycobacterial bacteria is carried out with the help of beads in a physiological solution with a pH of 7.0 - 7.2 for 60 ... 90 minutes at a ratio of buck to weight: beads: saline 1: 2: 1 ... 1, 2: 2.2: 1.3, the deposition of intact mycobacteria is carried out by three-fold centrifugation at 2000g for 15 ... 20 minutes, the concentration is carried out by centrifuging the supernatant at 15000g for 60 ... 90 minutes, and The cell sludge sludge cleaning is carried out by constantly mixing the precipitate with 0.4 ... 0.5% solution of Triton X-100, added 1:40 ... 1:50, and the subsequent washing of the corpuscular fraction with distilled water with two-fold centrifugation at 15000 ... 16000g for 20 minutes. Таблица 1Table 1 00 00 Скорость вращени  бус 4000 об/мин Врем  дезинтеграции 60-90 минThe speed of rotation of the beads is 4000 rpm. The disintegration time is 60-90 minutes. Таблица 3Table 3 Вакцина БЦЖBCG vaccine Живые Б1РК в масл но-вод- ной эмульсииLive B1RK in oil-in-water emulsion Убитые нагреванием БЦЖ в масл но-водной эмульсииKilled by heating BCG in an oily-water emulsion Оболочки Б1Щ в масл ноРедактор Н. ТупицаShells B1SCH in oil. N. Edge Editor. Dumb Составитель С. СветльппевCompiled by S. Svetlpev Техред Л.Олейник Корректор М. МаксимипшнецTekhred L.Oleynik Proofreader M. Maximipschnets 4159/44159/4 Тираж 594ПодписноеCirculation 594 Subscription ВНИИПИ Государственного комитета СССРVNIIPI USSR State Committee по делам изобретений и открытий 133035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., д. 4/5for inventions and discoveries 133035, Moscow, Zh-35, Raushsk nab., 4/5 Производственно-полиграфическое предпри тие, г. Ужгород, ул. Проектна , 4Production and printing company, Uzhgorod, st. Project, 4 82,4 t 13,4082.4 t 13.40 73,8 t 5,31 73.8 t 5.31 66,6 ± 3,4966.6 ± 3.49