SU1253439A3 - Способ определени @ -глутамилтранспептидазы - Google Patents

Abstract

Изобретение касаетс  аналитической химии, в частности способа определени  f -глутамилтранспептида- зы (ГТП), используемой дл  диагностики заболеваний печени. Дл  интенсификации процесса используют другое бо- лее растворимое замещенное f-глута- мил-п-анилида - -глутамил-3-суль- фо (или карбокси)-п-аншгад (ГА). Определение ГТП ведут обработкой ГА глицинолицином при добавлении человеческой сьгооротки. Далее определ ют изменение оптической плотности (ОП) и скорость образовани  гидролизованно- го продукта. По разности ОП в минуту, берут средние значени  и рассчитывают показатель энзимной активности. Снижаетс  в два раза продолжительность определени , максимальна  концентраци  ГА составл ет 6-8 ммоль против 2,9. О) (2 сл С«9 4 :л 1C с/1

Description

Изобретение относитс  к усовер- шествовакному способу определени  1 -глутамилтранспептидазы, котора  используетс  в клинико-химических лаборатори х дл  диагностики заболева- НИИ печени.

Цель изобретени  - интенсификаци  процесса.

Поставленна  цель достигаетс  за счет использовани  в качестве суб- страта f--глутамилгЗ-сульфо-Сили карбокси) п-анилида.

Пример 1. Получение Y-ГЛУ- тамил-п-нитроанилид-З-карбоновой кислоты (GLU РА 3-карбоновой кислоты)

9,1 г 2- нитро 5-аминобенэойной кислоты (50 мг-моль) н 14,2 ангидрида фталоилглутаминовой кислоты (55 мг-моль) раствор ют в 50 мл абсолютного диоксана с добавлением 13 мл трибутиламина. Реакционную смесь кип т т в течение 2 ч гфи обратном потоке. После охлаждени  в реакционную смесь добавл ют 100 мл 2 н аммиака и извлекают взбалтыванием вы- ;релившнйс  трибутиламин с эфиром. Водный раствор концентрируют досуха, раствор ют в метиловом спирте и с помощью гидраэингидрата устанавлийают рН tO. Реакционный раствор вьщерживают около 20 ч при комнатной температуре. При этом частично выдел етс  продукт, который затем фильтруют и промывают метиловым спиртом. Метанольный фильтрат концентрируют досуха и раствор ют остаточное масло приблизительно в 300 мл дистиллированной водьт.

Этот водный раствор хроматоргра- фируют над колонкой с 100 мл Довекс (Dowex) 4 ормиатной формой, промьгеают 300 МП дистиллированной воды, градуиру  2 л воды 0,5 н.раствора карбоната аммон1м. Элюат собирают 100 мл фракци ми и исследуют методом тонко- слойной хроматографии в системе бута нол: лед на  уксусна  кислота 5 вода в соотношении 50j15:t5 (про вление хроматограмм: в ультрафиолетовом свете синие п тна или после увлажнени  нинги рином и последующего нагрева - коричневые п тна зон,содержащих ами- нокиелоту)«Фракции,содержащие продук глутамннова  кислота -нитроанилид -3-карбонова  кислота (значение R 0,25),собирают и концентрируют в ваку- уме досуха .Оставшийс  порошок перемешивают в абсолютном спирте,фильтруют И В вакууме над хлористым кальцие

Выход 7 г If-глутамил-п-нитро-- анилид-3-карбоновой кислоты, моно- aм юниeвa  соль (58% теоретического).

Ультрафиолетовый спектр: А 317 нм, е 11,7 см/моль/при 317 нм.

Пример 2. Применение у -глу- тамил- -нитроанилид-3-карбоновой кислоты (GLU РА-карбоновой кислоты) дл  определени  ,-глутамилтранспеп- Ti-щазы ( 1 - GT) .

При энзиматическом расщеплении высвобождаетс  2-нитро-5-аминобензой- на  кислота.

Проведение измерени ,

В кювету ввод т пипеткой 1 М трис- -буфер, 100 мг-моль глицилглицина, рН 8,25-2,8 мл 130 мг-моль GLU РА-3- -карбоновой кислоты в указанном буфере 0,2 мл, нагревают до , определение начинают при добавлении человеческой сыворотки 0,2 мл, смешивают , оптическую плотность отсчитывают при 405 им, одновременно включают хронометр. Через 1,2 и 3 мин отсчет повтор ют.

По разности оптических плотностей в минуту (аЕ/мин) берут средние значени  и ввод т его в расчет.

Расчет ведут следующим образом.

Международна  единица U  вл етс  энзимной активностью, котора  при- переводит 1 ммоль субстрата в 91инуту. Это будет отнесено к 1 мл жидкости тела, например, сыворотки. Дл  расчета энзимной активности на мл (А) используют общую формулу

мин €- d V

йЕ(ми/мл)

,, 5

Коэффициент экстинкции (€)3-ка1 - бокси 4-нитроанилина составл ет в услови х опыта при 405 нм 9,4 /ммоль. Толщина (d) сло  кюветы 1 см, объем используемой сыворотки (V) 0,2 мл, сумма объемов (v) 3,2мл. Измерение затухани  Е осуществл етс  через промежутки в 1 мин. При этом

А 4Е(405 нм)/мин х 1702 (ми/мл).

Пример 3. Получение -глу- тамил-4-нитроанилид-З-сульфоновой кислоты.

115 г аннпин-т-4-нитро-3 сульфоновой кислоты и 150 г ангидрида фталоилглутаминовой кислоты суспендируют в 2 л абсолютного диметилформамнда и затем нагревают на масл ной бане до . .При достижении этой температуры сус10

15

пензию выдерживают в течение 1 ч при 145°С и затем охлаждают. Осадок от-. филь ровывают и концентрируют фильтрат досуха. Масл нистый остаток раствор ют в метаноле и устанавливают рН 9 80%-ной гидроокисью гидразина. Через 24 ч отсасывают образовавшиес  кристаллы и промывают небольшим количеством метилового спирта. Фильтрат сушат и при охлаждении осторожно разлагают охлажденным ацетоном. Образующийс  при этом осадок отсасывают, промывают хорошо ацетоном и раствор ют остаток в воде при перемешивании . Нерастворимый в воде остаток отфильтровывают и с помощью аммиака устанавливают рН раствора 7,5. Путем добавлени  ацетона выкристаллизовываетс  аммониева  соль у-глутамил- -Д-нитроанилид-3-сульфоновой кислоты.20 Продукт очень хорошо кристаллизуетс  в светло-желтые кристаллики. Т.пл. 186-187°С.

Максимум поглощени  спектра при 290 нм 4,57 см /ммоль.

Выход около 115-120 г, причем 15-20 г можно еще получить из кристаллизационного маточного раствора.

Общий выход около 135 г соответствует 70% теоретического.

Растворимость соединени  при комнатной температуре хороша  и достигает около 160% степени превращени  У -глутамил-п-нитроанилида при одинаковых услови х.

Пример 4. Применение GLU РА-3-сульфоновой кислоты дл  определени  -с :,

При энзиматическом расщеплении

25

30

35

Международна  единица U  вл ет энзимной активностью, котора  при 25 С превращаетс  1 ммоль субстрат в минуту. Это будет отнесено к 1 мл жидкости тела, например сыворотки. Дл  расчета энзимных активностей на мл (А) используют общую формулу

V.1000

.

Коэффициент экстинкции (б) м-ни роанилгзд-З-сульфоновой кислоты в услови х опыта при 405 нм составл е 5,45-см /моль. Толщина (d) сло  кюветы 1 см, объем введенной сыворотк ( V) 0,2 мл, сумма объемов (v) 3,2. Измерение оптической плотности 6 ос ществл ют через промежутки в 1 мин.

Отсюда полгучают

А дЕ(405 нм)/мин х 2936 (ми/мл)

Предлагаемый способ определени  у-глутамилтранспептидазы, предусмат ривающий использование в качестве субстрата -глутамин-3-сульфо(или ,карбокси)- 1-анилид по сравнению с известным, где в качестве субстрата используют У глутамшт-ь-нитроанш1Вд позвол ет значительно интенсифицировать процесс. Максимальна  скорост реакции достигаетс  при концентрации лищь в интервале 6-8 ммоль, что осуществимо лишь с субстратом согласно изобретению благодар  его хо- рощей растворимости. Максимально достигаема  концентраци  при использовании известного субстрата составл ет 2,9 ммоль, в СВЯЗИ с

соединени  по предлагаемому способу ограниченной его. растворивысвобозедаетс  « -нитроанилид-3-суль- мостью. фонова  кислота.

В соответствии с изобретением при использовании карбоксильного производного достигают увеличение скорости реакции на 20%, а в случае J производного сульфокислоты в два раза больше скорость; Это значит, что продолжительность определени  может быть уменьшена вдвое.

Проведение измерени .

Пипеткой ввод т в кювету 0,1 трис- -буфер, 150 мг-моль шлицилглицина 45 рН 8,5 - 2,8 мл 130 мг-моль GLU РА- -3-сульфоновой кислоты в вьшеприве- денном буфере 0,2 м.п, нагревают до 25°С, определение начинают добавкой человеческой сыворотки 0,24 мл, пере-50 ешивают, оптическа  плотность отсчи-- тываетс  при 405 ми, одновременно включают хронометр. Точно через 1, 2 и 3 мин повтор ют отсчет.

По разност м оптических плотное- SS тей в 1 мин (лЕ/мин) наход т среднее значение и ввод т его в расчеты.

Расчет ведут следующим образом.

10

15

, 20

25

0

5

Международна  единица U  вл етс  энзимной активностью, котора  при ; 25 С превращаетс  1 ммоль субстрата в минуту. Это будет отнесено к 1 мл жидкости тела, например сыворотки. Дл  расчета энзимных активностей на мл (А) используют общую формулу

V.1000

.

Коэффициент экстинкции (б) м-нит- роанилгзд-З-сульфоновой кислоты в услови х опыта при 405 нм составл ет 5,45-см /моль. Толщина (d) сло  кюветы 1 см, объем введенной сыворотки (V) 0,2 мл, сумма объемов (v) 3,2. Измерение оптической плотности 6 осуществл ют через промежутки в 1 мин.

Отсюда полгучают

А дЕ(405 нм)/мин х 2936 (ми/мл).

Предлагаемый способ определени  у-глутамилтранспептидазы, предусматривающий использование в качестве субстрата -глутамин-3-сульфо(или ,карбокси)- 1-анилид по сравнению с известным, где в качестве субстрата используют У глутамшт-ь-нитроанш1Вд, позвол ет значительно интенсифицировать процесс. Максимальна  скорость реакции достигаетс  при концентрации лищь в интервале 6-8 ммоль, что осуществимо лишь с субстратом согласно изобретению благодар  его хо- рощей растворимости. Максимально достигаема  концентраци  при использовании известного субстрата составл ет 2,9 ммоль, в СВЯЗИ с

мостью.

В соответствии с изобретением при использовании карбоксильного производного достигают увеличение скорости реакции на 20%, а в случае J производного сульфокислоты в два раза больше скорость; Это значит, что продолжительность определени  может быть уменьшена вдвое.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ определени  f -глутамил- транспептидаэы путем обработки замещенного -глутамил-п-анилида гли- цилглицином при добав{сении челове- ческой сыворотки и измерени  скорост образовани  гидролизованного продукS12 )14Ч96

   та, отличающийс  тем.Приоритет п г) признакам:

   что, с целью интенсификации процесса.О). 12.71 исходным продукт - в качестве замещенного у-глутамил--глутамил-3-карбокси-и -анилида используют t- глута -h -аинпид.

   мил-3- сульфо (или карбокси ) - VI-ани-03.07.73 исходный продукт - глута- лид,мин-3-сульфо- 1 - -анилид.