SU1131507A1 - Method of obtaining insulin - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА , включающий в себ  инкубацию компонентов крови и последующее выделение целевого продукта, отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода и активности инсулина, инкубации подвергают отмытые эритроциты крови человека, которые выдерживают в течение 90-120 мин в растворе, содержащем физиологический раствор и этанол при соотношении эритроциты-физиологический раствор и этанол 1:1:0,007- 0,014, затем эритроциты отдел ют от супернатанта и выделение инсулина провод т путем гель-фильтрации ,супернатанта на сефадексе или осаждением с последующей кристаллизацией.A method for producing insulin, which includes the incubation of blood components and the subsequent isolation of the target product, characterized in that, in order to increase the yield and activity of insulin, human erythrocytes are incubated and incubated for 90-120 minutes in a solution containing saline and ethanol at a ratio of erythrocytes-physiological solution and ethanol 1: 1: 0.007-0.014, then the erythrocytes are separated from the supernatant and the insulin is secreted by gel filtration, the supernatant on Sephadex Silt precipitation followed by crystallization.

Description

00 СП00 SP

о about

Изобретение относитс  к биологии и меицине , и может быть использовано в пракических цел х дл  разработки способа промышленного получени  наиболее эффективого дл  медицинских целей лечебного препарата инсулина человека; в научных цел х д  изучени  . механизмов интернализации, епонировани  и транспорта инсулина эритроцитами; дл  диагностического вы влени  резервов гормона в , форменных элементах крови лиц, подозреваемых в возможном развитии диабета и других эндокринных расстройств; дл  изготовлени  человеческого стандарт-инсулина и стандартных инсулинов различных животных.The invention relates to biology and meicin, and can be used for practical purposes to develop a method for the industrial production of a human insulin treatment most effective for medical purposes; for scientific purposes. mechanisms for the internalization, eponation and transport of insulin by the erythrocytes; for the diagnostic detection of hormone reserves in the blood cells of persons suspected of developing diabetes and other endocrine disorders; for the manufacture of human insulin standard and standard insulin of various animals.

Известен способ получени  как гормона инсулина, так и медицинского препарата из поджелудочной железы путем экстракции его подключенным 70° спиртом с последующей многоэтапной очисткой экстракта от примесей белков и липидов .A method is known for producing both insulin hormone and a pancreatic drug by extracting it with connected 70 ° alcohol, followed by a multistage purification of the extract from impurities of proteins and lipids.

Однако известный способ не пригоден дл  получени  инсулина человека.However, the known method is not suitable for obtaining human insulin.

.Известен также способ получени  инсулина из крови или компонентов крови теплокровных животных, при этом кровь или форменные элементы предварительно разбавл ют 0,5-0,4 объемами гидрофильного разбавител , довод т рН полученного раствора от 2-4 до 8-10 и инкубируют обработанную таким образом кровь при 15- 40°С по крайней мере несколько часов. Далее кровь охлаждают до 10°С, диализуют после нейтрализации через мембрану, проницаемую дл  молекул с мол. мае. 6000 и из диализата выдел ют органические пептидсодержащие вещества, имеющие мол. мае 350-6000 и инсулиноподобную активность 14-40 мкед/мг твердого вещества.A method of obtaining insulin from the blood or blood components of warm-blooded animals is also known, the blood or the shaped elements being previously diluted with 0.5-0.4 volumes of hydrophilic diluent, the pH of the resulting solution is adjusted from 2-4 to 8-10 and the treated thus blood at 15-40 ° C for at least several hours. Next, the blood is cooled to 10 ° C, dialyzed after neutralization through a membrane permeable to molecules with mol. May 6000 and organic peptide-containing substances having a mol. May 350-6000 and insulin-like activity of 14-40 mked / mg of solid matter.

Практическое применение способа позволило получить в среднем из 100 л крови животных до 320 г целевого продукта, активность которого равна 14-40 мкед/мг при определении ее по биологическому действию на выделенных адипоцитах 2.Practical application of the method made it possible to obtain, on average, from 100 liters of animal blood up to 320 g of the target product, the activity of which is equal to 14-40 μed / mg in determining its biological effect on the isolated adipocytes 2.

Таким образом, техника извлечени  по этому способу инсулина дает малый выход, сложна, трудоемка и продолжительна, требует при операци х изменени  рН и температуры . После инкубации из смеси извлекаетс  далеко не весь гармон, а только тыс чна  его часть. Форменные элементы и плазма крови после получени  инсулина не могут быть использованы в гематологии и дл  научных целей.Thus, the technique of extraction according to this method of insulin gives a small yield, is complex, laborious and time consuming, requires a change in pH and temperature during operations. After incubation, far from all the harmony is extracted from the mixture, but only a thousand of its parts. The formed elements and blood plasma after receiving insulin cannot be used in hematology and for scientific purposes.

Цель изобретени  - повышение активности и выхода инсулина.The purpose of the invention is to increase the activity and release of insulin.

Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу получени  инсулина, включающему в себ  инкубацию компонентов крови и последующее выделение целевого продукта, инкубации подвергают отмытые эритроциты кров.и человека, которые выдерживают в течение 90-120 мин в растворе, содержащем физиологический раствор и этанол при соотнощении эритроциты-физиологический раствор и этанол 1:1:0,007- 0,014, затем эритроциты отдел ют от супернатанта и выделение инсулина провод т путем гель-фильтрации супернатанта на сефадексе или осаждением с последующей кристаллизацией.The goal is achieved by the fact that according to the method for producing insulin, which includes the incubation of blood components and the subsequent isolation of the target product, the erythrocytes are subjected to incubation of blood and human blood, which is kept for 90-120 minutes in a solution containing physiological saline and ethanol erythrocytes physiological saline and ethanol 1: 1: 0.007-0.014, then the erythrocytes are separated from the supernatant and the insulin is released by gel filtration of the supernatant on sephadex or precipitation followed by crystallization.

Способ осуществл ют следующим образом .The method is carried out as follows.

Отдел ют эритроциты от плазмы крови путем отсто  или центрифугировани . К эритроцитарной массе добавл ют изотонический раствор хлористого натри  (9 г. на литр) в соотнощении 1:10. Смесь перемещивают и центрифугируют при 2000 об в минуту .(g 800) в течение 10 мин. Супернатант отбрасывают. Эритроцитарную массу промывают, таким образом, три раза.Red blood cells are separated from blood plasma by sludge or centrifugation. An isotonic solution of sodium chloride (9 g per liter) in a ratio of 1:10 is added to the erythrocyte mass. The mixture is transferred and centrifuged at 2000 rpm. (G 800) for 10 minutes. The supernatant is discarded. The RBC mass is washed, thus, three times.

После отмывани  к эритроцитам добавл ют изотонический раствор NaCl, содержащий этанол так, чтобы соотношение объемов эритроциты , физиологический раствор, этанол, составл ло 1:1:0,007-0,014. ИнкубациюAfter washing, an isotonic NaCl solution containing ethanol is added to the erythrocytes so that the volume ratio of the erythrocytes, saline, ethanol is 1: 1: 0.007-0.014. Incubation

полученной смеси провод т при 20°С и полиэтиленовой емкости. Врем  инкубации 90- 120 мин. Затем путем центрифугировани  (g 800; 10 мин) отдел ют супернатант. Эритроциты и отделенна  вначале процесса плазма крови годны дл  дальнейщего использовани  в гематологии. Полученный супернатант подвергают биохимическому фракционированию дл  выделени  инсулина. Инсулин получают путем гель-фильтрации на колонке с сефадексом Г-5.л высотой 80 см и диаметром 1,5 см. В качестве элюирующего раствора примен ют дистиллированную воду. Скорость элюции дл  препаративных целей 0,3 мл/мин, дл  аналитических - 0,06 мл/мин. Собирают фракции 2,37-2.75 Ve/Vo. Собранные фракции при необходимости дополнительно обессаливают на сефадексе Г-10.the resulting mixture was conducted at 20 ° C and a polyethylene container. Incubation time 90-120 min. Then, the supernatant was separated by centrifugation (g 800; 10 min). The erythrocytes and the blood plasma separated at the beginning of the process are suitable for further use in hematology. The resulting supernatant is subjected to biochemical fractionation to isolate insulin. Insulin is obtained by gel filtration on a Sephadex G-5 column with a height of 80 cm and a diameter of 1.5 cm. Distilled water is used as the eluting solution. The elution rate for preparative purposes is 0.3 ml / min, for analytical, 0.06 ml / min. Collect fractions of 2.37-2.75 Ve / Vo. The collected fractions, if necessary, additionally desalted on Sephadex G-10.

Полученный раствор инсулина можно подвергнуть дальнейшей очистке и получить кристаллический порошок, с этой целью осаждают аморфный цинкинсулин с добавлением 10% CHjCOO/2 Zn, довод  рН до 6,0 и осажда  гормон при 4°С в течение 24 ч. Осадок отдел ют и раствор ют в 0,1 н лимонной кислоте, добавл ют 5% Zn Clj и ацетон, поддержива  рН 6,0. ПроцессThe resulting insulin solution can be further purified and a crystalline powder can be obtained. For this purpose, amorphous zincinsulin is precipitated with the addition of 10% CHjCOO / 2 Zn, pH is adjusted to 6.0, and the hormone is precipitated at 4 ° C for 24 hours. The precipitate is separated and the solution in 0.1 N citric acid, 5% Zn Clj and acetone are added, maintaining the pH at 6.0. Process

кристаллизации продолжают при 4°С в течение 46 ч, после чего отдел ют выпавшие кристаллы гормона. Кроме того, оказалось возможным, примен   указанную .методику, осадить инсулин и без предварительного отделени  балластных белков на колонке,crystallization is continued at 4 ° C for 46 hours, after which the precipitated crystals of the hormone are separated. In addition, it was possible, using the above method, to precipitate insulin without first separating the ballast proteins on the column,

хот  в этом -случае степень очистки гормона ниже и не образовывались кристаллы инсулина, выпавший .осадок содержит ИНСУЛИН .Although in this case the degree of purification of the hormone is lower and insulin crystals did not form, the precipitated precipitate contains INSULIN.

Claims (1)

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА, включающий в себя инкубацию компонентов крови и последующее выделение целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и активности инсулина, инкубации подвергают отмытые эритроциты крови человека, которые выдерживают в течение 90—120 мин в растворе, содержащем физиологический раствор и этанол при соотношении эритроциты-физиологический раствор и этанол 1:1:0,007— 0,014, затем эритроциты отделяют от супернатанта и выделение инсулина проводят путем гель-фильтрации .супернатанта на сефадексе или осаждением с последующей кристаллизацией.METHOD FOR PRODUCING INSULIN, which includes incubation of blood components and subsequent isolation of the target product, characterized in that, in order to increase the yield and activity of insulin, washed human blood red blood cells are incubated, which are kept for 90-120 minutes in a solution containing physiological solution and ethanol at a erythrocyte-saline to ethanol ratio of 1: 1: 0.007-0.014, then the red blood cells are separated from the supernatant and insulin is isolated by gel filtration of the supernatant on Sephadex or precipitation denia followed by crystallization. *-* ω с* - * ω s