SU1032401A1

SU1032401A1 - Способ определени глюкозы

Info

Publication number: SU1032401A1
Application number: SU823374891A
Authority: SU
Inventors: Юозас Юозович Кулис; Вальдас-Станисловас Альгимантович Лауринавичюс; Видуте Витовна Гурявичене; Марите Винцовна Песлякене; Виктор Липович Калихман; Анатолий Борисович Галицкий; Юрий Васильевич Чирков
Original assignee: Институт биохимии АН ЛитССР; Предприятие П/Я Г-4444
Priority date: 1982-01-05
Filing date: 1982-01-05
Publication date: 1983-07-30

Description

Изобретение относитс к исследованию и анализу материалов путем определени электрохимических параметров , а точнее, к электрохимическим методам анализа физиологически активных соединений в присутствии ферментов,

Известен способ определени глюкозы с использованием ферментов, заключающийс в измерении параметров чейки Ьри проведении электролиза в растворе 1 .

Недостаток способа св зан с одноразовым использованием ферментов и применением сложной аппаратуры. Определение глюкозы в крови требует удалени -белков.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому вл етс способ определени глюкозы с использованием глюкооксидазной мембраны , заключающийс в измерении параметров чейки при проведении электролиза в растворе, содержащем анализируемое вещество 2j.

Недостатки известного способа зак/ ючаютс в том, что при погруже нии электрода в исследуемый раствор глюкоза, проникает в мембрану, где под действием фермента образуетс перекись водорода, электрохимическое окисление которого осуществл етс при 0,9 В. Способ недостаточно селективен и точен, так как при этом потенциале окисл ютс также другие вещества, наход щиес в реальных биологических растворах (аскорбинова кислота, мочева кислота, аминокислоты и т.д.) .

Цель изобретени - повышение точности измерений.

Поставленна цель достигаетс тем что согласно способу определени глюкозы с использованием глюкооксидазной мембраны, заключающемус в измерении параметров чейки при проведении электролиза в растворе, содержащем анализируемое вещество, перед измерением в глюкооксидазную мембрану ввод т дополнительно пероксидазу а электролиз провод т в слабощелочном растворе, в который ввод т ферроцианид в концентрации, соответствующей предельному току.

Пример 1. 30 мг глюкооксидазы , 50 мг пероксидазы и 100 мг альбумина раствор ют в 1 мл 0,01М фосфатного буферного раствора рН

7,2; О,Ж КС1. Смесь обрабатывают 0,08 мл 25 -ного глутарового альдегида и 0,75 мл выливают на стекл нную подложку площадью 25 см. Высшенную мембрану толщиной 0,1 мм и диаметром 2 мм накладывают на токоподвод щий электрод и покрывают диализной мембраной.

Результаты определени глюкозы при помощи мембраны, содержащей глюкооксидазу и пероксидазу, в буферных растворах (0,01 М фосфатный буфер рН 7,2; 1 мМ ферроцианида кали , 25 С) представлены в табл.-1 .

Пример 2. Каталитическую мембрану изготавливают из 30 мг глюкооксидазы и 30 мг пероксидазы как в примере 1.

Результаты определени глюкозы н платиновом электроде в буферном растворе в зависимости от концентрации ферроцианида кали ( рН 7,2; 25 С; концентраци глюкозы 1,2 мМ; 0,1 В) представлены в табл.2.

Данные табл.2 показывают, что резка зависимость от концентрации ферроцианида кали наблюдаетс до 1 мМ.

П р .и м е р 3- Смесь изготавливают из 30 мг глюкооксидазы и 0 мг пероксидазы аналогично примеру 1, но поливают не на стекл нную подложку , а на диализную мембрану. Высушенную мембрану толщиной 0.05 мм накладывают пр мо на токоотвод щий материал и прикрепл ют резиновым кольцом. Определ ют количество глюк дес тикратно разбавленной 0,01 мМ ффатным буфером ( рН 7,2; 0,1 М КС1) крови. Дл определени остаточного тока в крови 2 мл дес тикратно разбавленной крови обрабатывают 1 мг глюкооксидазы и 1 мг каталазы до полного удалени глюкозы в течение 20 мин. Определение глюкозы провод как в других примерах.

Результаты определени глюкозы в крови (стеклоуглеродный электрод, 08, концентраци (CN) 1 мМ; 0,01 М фосфатный буфер рН 7,2; п 5) представлены в табл. табл.З видно, что величина остаточного тока не превышает II, так как основные электрохимически активные вещества - аскорбинова , мочева кислоты - не окисл ютс при нулевом потенциале. Способ определени глюкозы обладает высокои точностью, коэффициент вариации не превышает 2% при п 5. Пример . Ферментную мембра ну из 30 иг глюкооксидазы и 50 мг пероксидазы изготавливают и накладывают на платиновый электрод аналогично примеру 3. Мембрану по прототипу готов т в отсутствии перокси дазы. Предлагаемый способ определени глюкозы по сравнению с прототипом предлагаемый способ - 1мМ ферроцианида кали , ОВ,стеклоуглеродный электрод)отличаетс селективностью и точностью. Данные табл. показывают, что согласно предлагаемому способу аскорби -нова и мочева кислоты не мешают определению глюкозы, тогда как согласно прототипу концентраци глюкозы , определенна в смес х, в три раза превышает в буферных растворах. В глюкооксидазной мембране, содержащей пероксидазу и ферроцианид кали , происход т следующие процессы: Глюкоза + 02+ Глюкооксидаза - Глю- конолактон + ,ч 2 Fe(CN) + ZH- -+Пероксидаза - Fe(CN) + . Восстановление образующегос ферроцианида приводит к генерации тока в чейке.Катодный ток восстановлени ферроцианида мало мен етс (до 0,1В), однако резко падает при более высоки значени х потенциала. Это определ ет наибольший потенци ал Со, 18) действи чейки. Нало;; ение отрицательного потенциала, к примеру 0,1 В, приводит к катодному восстановлению кислорода, поэтому вл етс значительным остаточный ток, величина которого мен етс от концентрации глюкозы. Именно этим определ етс по 014 тенциал действи чейки 0-0,1 8 отн. насыщенного Ag/AgCl электрода. Так как потенциал Ag/AqC1 электрода мен етс при изменении концентрации КС 1 от насыщенного раствора до О,Ж в интервале 0,201-0,31 В отн.и.в.э., то требование проведени электрол 1за при нулевом потенциале отн. Aq/AgCl электрода полностью и однозначно задает услови реализации способа. Очевидно, вместо Aq/AgCt электрода могут быть применены другие электроды: каломельный, водородный и т.д. Но тогда способ будет (еализован, когда электролит выполн етс при 0, (нормальный, каломельный электрод), + 0,201 В (нормальный водородный электрод)и т.д. Выбор рН 7,2 обусловлен физиологическим значением этого параметра. Способ применим и при более высоких рН. однако в более щелочной области уменьшаетс каталитическа активность ферментов. С этим св зано уменьшение тока.Так,если при рН 7,2 и 0,8 мМ глюкозы ток чейки равен мкА/см , то при рН 7,3б он равен 8,7 мкА/см, а при рН 7р5 6,3 мкА/см. Ток чейки, реализующий предлагаемый способ, зависит от концентрации ферроцианида кали . Из данных табл.2. видно, что при увеличении концентрации ферроцианида до 1 мМ ток увеличиваетс , а при концентраци х соединени выше 1 мМ практически перестает мен тьс . Дл того, чтобы ток чейки не зависел от концентрации медиатора, примен ютс такие его количества, которые соответствуют предельному определении глюкозы в проточных датчиках с целью экономии реагента примен етс 1 мМ раствор, но система также хорошо-действует с использованием 2 или 3 мМ ферроцианида. Таблица 1

8.7

10,1 10,1

8.7

1С,1 ,8

9,0

0,8

-0,1 -0,2

Х )

1 мМ; Концентраци

Концентраци

0,125 0,25 0,50 1,02,0 3,0 ферроцианида кали , мМ Ток чейки,мкА/см 2,64 6, 7,92 10,32

Продолжение табл.1

5,5 7,5

Таблица

5,0 10,0 10,68 11,04 11,10 11,10 Таблица 3

Claims

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ с, использованием глюкооксидазной мембраны, заключающийся в измерении параметров ячейки при проведении электролиза в растворе, содержащем анализируемое вещество, отличающийся тем, что, с целью повы- . шения точности измерений, перед измерениями в глюкооксидазную мембрану вводят дополнительно пероксидазу, а электролиз проводят в слабощелочном растворе, в который вводят ферроцианид калия в концентрации, соответствующей предельному току.