SK92799A3 - Vitronectin receptor antagonists, process for their preparation, pharmaceutical composition them containing, their use and intermediates - Google Patents

Vitronectin receptor antagonists, process for their preparation, pharmaceutical composition them containing, their use and intermediates Download PDF

Info

Publication number
SK92799A3
SK92799A3 SK927-99A SK92799A SK92799A3 SK 92799 A3 SK92799 A3 SK 92799A3 SK 92799 A SK92799 A SK 92799A SK 92799 A3 SK92799 A3 SK 92799A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
mmol
formula
compound
dibenzo
vitronectin
Prior art date
Application number
SK927-99A
Other languages
English (en)
Inventor
William H Miller
William E Bondinell
Fu Thomas W Ku
Original Assignee
Smithkline Beecham Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Smithkline Beecham Corp filed Critical Smithkline Beecham Corp
Publication of SK92799A3 publication Critical patent/SK92799A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/72—Nitrogen atoms
    • C07D213/74—Amino or imino radicals substituted by hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/66—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety
    • C07C69/73—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety of unsaturated acids
    • C07C69/734—Ethers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/66—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety
    • C07C69/73—Esters of carboxylic acids having esterified carboxylic groups bound to acyclic carbon atoms and having any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, acyloxy, groups, groups, or in the acid moiety of unsaturated acids
    • C07C69/738—Esters of keto-carboxylic acids or aldehydo-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D213/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D213/04—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D213/60—Heterocyclic compounds containing six-membered rings, not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom and three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having no bond between the ring nitrogen atom and a non-ring member or having only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D213/72—Nitrogen atoms
    • C07D213/75—Amino or imino radicals, acylated by carboxylic or carbonic acids, or by sulfur or nitrogen analogues thereof, e.g. carbamates

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Pyridine Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Antagonisti/ receptora vitronektínu, spôsob ich výroby, farmaceutický prostriedok s ich obsahom, ich použitie a medziprodukty
Oblasť techniky
Vynález sa týka farmaceutický aktívnych látok, ktoré inhibujú receptor vitronektínu a sú užitočné na liečenie zápalov, rakoviny a kardiovaskulárnych porúch, ako sú napríklad ateroskleróza a restenóza, a ochorení, pri ktorých je faktorom resorpcia kosti, ako je napríklad osteoporóza.
Doterajší stav techniky
Integríny sú veľkorodina bunkových adhéznych receptorov, ktorými sú transmembránne glykoproteíny exprimované rôznymi bunkami. Tieto bunkové povrchové adhézne receptory zahŕňajú gpllb/llla (fibrinogénový receptor) a ανβ3 (vitronektínový receptor). Fibrinogénový receptor gpllb/llla je exprimovaný na povrchu krvných doštičiek, a sprostredkuje agregáciu krvných doštičiek a tvorbu hemostatickej zrazeniny na mieste krvácajúceho poranenia. Philips a spol., Blood, 1988, 71, 831. Vitronektínový receptor ανβ3 je exprimovaný mnohými bunkami, vrátane endotelových, hladkého svalstva, osteoklastov a tumorových buniek, a teda má rôzne účinky. ανβ3 receptor exprimovaný membránou osteoklastových buniek sprostredkuje adhéziu osteoklastov na matricu kosti, kľúčový krok pri procese resorpcie kostí. Ross a spol., J. Biol. Chem.,1987, 262, 7703. Ochorenie charakterizované nadmernou resorpciou kosti je osteoporóza. ανβ3 receptor exprimovaný ľudskými bunkami hladkého svalstva aorty sprostredkuje ich migráciu do neointima, čo je proces, ktorý môže viesť k restenóze po perkutánnej koronárnej angioplastike. Brown a spol., Cardiovascular Res., 1994, 28, 1815. Okrem toho Brooks a spol., Celí, 1994, 79, 1157 zistili, že ανβ3 antagonistické látky sú schopné podporovať regresiu tumoru pomocou indukovania apoptózy angiogenetických krvných ciev. Teda činidlá, ktoré blokujú receptor vitronektínu, by boli užitočné na
-2liečenie chorôb, ako je napríklad osteoporóza, restenóza a rakovina.
O vitronektínovom receptore je teraz známe, že zodpovedá trom rôznym integrínom, označovaným ανβ, ανβ3 a ανβ5. Horton a spol., Int. J. Exp. Pathol., 1990, 71, 741. viaže fibronektin a vitronektín. ανβ3 viaže veľké množstvo ligandov, zahrnujúcich fibrín, fibrinogén, laminín, trombospondín, vitronektín, von Willebrandov faktor, osteopontín a kostný sialoproteín I. ανβ5 viaže vitronektín. Ukázalo sa, že receptor vitronektínu ανβ5 je zahrnutý pri bunkovej adhézii rôznych bunkových typov, vrátane endotelových buniek mikrociev, (Davis a spol., J. Celí. Biol., 1993, 51, 206), a bola potvrdená jeho úloha pri angiogenéze. Brooks a spol., Science, 1994, 264, 569. Tento integrín je exprimovaný krvnými cievami v ľudskom poranenom granulačnom tkanive, ale nie v normálnom povrchu.
Je známe, že receptor vitronektínu sa viaže na proteíny kostnej matrice, ktoré obsahujú troj-peptidový Arg-Gly-Asp (alebo RGD) motív. Horton a spol., Exp. Celí Res. 1991, 195, 368, zistili, že RGD-obsahujúce peptidy a anti-receptorové vitronektínové protilátky (23C6) inhibujú resorpciu dentínu a rozprestretie buniek osteoklastami. Okrem toho, Sato a spol., J. Celí Biol. 1990, 111, 1713 zistili, že echistatín, peptid hadieho jedu, ktorý obsahuje RGD sekvenciu je silný inhibítor resorpcie kostí v tkanivovej kultúre, a inhibuje pripojenie osteoklastov na kosť.
Teraz sa zistilo, že určité látky sú účinnými inhibítormi ανβ3 a ανβ5 receptorov. Konkrétne bolo zistené, že tieto látky sú účinnejším inhibítorom receptora vitronektínu ako receptora fibrinogénu.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu sú látky, ktoré majú farmakologickú aktivitu na inhibovanie vitronektínového receptora a sú užitočné na liečenie zápalov, rakoviny a kardiovaskulárnych porúch, ako sú napríklad ateroskleróza a restenóza, a ochorení, u ktorých je faktorom resorpcia kosti, ako je napríklad osteoporóza.
Ďalším uskutočnením vynálezu je farmaceutický prostriedok, obsahujúci látky podľa vynálezu a farmaceutický nosič.
-3Ďalším uskutočnením vynálezu je použitie látok podľa vynálezu na liečenie ochorení, ktoré sú sprostredkované receptorom vitronektínu. V konkrétnom uskutočnení sú látky podľa tohto vynálezu užitočné na liečenie aterosklerózy, restenózy, zápalov, rakoviny a ochorení, u ktorých je faktorom resorpcia kosti, ako je napríklad osteoporóza.
Vynález zahrnuje nové látky, ktoré sú účinnejšími inhibítormi receptora vitronektínu ako receptora fibrinogénu. Nové látky zahrňujú dibenzocyklohepténové jadro, v ktorom je na jednom z aromatických šesťčlenných kruhov dibenzocyklohepténu prítomný substituent, obsahujúci dusík a alifatický substituent obsahujúci kyslú väzbu je prítomný na sedemčlennom kruhu dibenzocyklohepténu. Predpokladá sa, že dibenzocyklohepténový kruhový systém orientuje substituenty bočných reťazcov na šesť a sedemčlenných kruhoch tak, že tieto môžu interagovať výhodne s receptorom vitronektínu. Je výhodné, ak existuje okolo dvanásť až štrnásť vložených kovalentných väzieb prostredníctvom najkratšej intramolekulovej dráhy medzi kyslou skupinou na alifatickom substituente sedemčlenného kruhu dibenzocyklohepténu a dusíkom dusík-obsahujúceho substituenta na jednom z aromatických šesťčlenných kruhov dibenzocyklohepténu.
Výhodné látky podľa tohto vynálezu sú:
kyselina (±)-10,11-dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]-cykloheptén-10-octová;
kyselina (±)-10,11-dÍhydro-3-[2-[6-(etylamino)-2-pyridyl]-1-etoxy]-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-octová; a kyselina (±)-10,11-dihydro-3-[3-(4-metyl-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]-cykloheptén-10-octová;
alebo ich farmaceutický prijateľné soli.
V prípadoch, kde látky podľa tohto vynálezu môžu mať jedno alebo viac chirálnych centier, pokiaľ nie sú špecifikované, tento vynález zahŕňa každú jednu neracemickú látku, ktorá môže byť syntetizovaná a rozložená na optické izoméry konvenčnými postupmi.
V tomto vynáleze sú tiež zahrnuté prekurzory látok podľa tohto vynálezu. Za prekurzory sa považujú všetky kovalentne viazané nosiče, ktoré uvoľňujú účinné
-4základné liečivo (látky podľa tohto vynálezu) in vivo.
Látky podľa tohto vynálezu inhibujú viazanie vitronektínu a ďalších RGDobsahujúcich peptidov na receptor vitronektínu. Inhibícia receptora vitronektínu na osteoklasty inhibuje osteoklastickú resorpciu kosti a je užitočná pri liečení ochorení, pri ktorých je s patológiou spojená resorpcia kosti, ako sú napríklad osteoporóza a osteoartritída.
V ďalšom aspekte, tento vynález poskytuje metódu na stimuláciu tvorby kosti, ktorá zahŕňa podávanie látky, ktorá spôsobuje zvýšenie uvoľňovania osteokalcínu. Zvýšená tvorba kosti je jasným ziskom pri chorobných stavoch, pri ktorých je nedostatok mineralizovanej kostnej hmoty, alebo ak je požadovaná prestavba kosti, ako je napríklad liečba fraktúr a prevencia fraktúr kostí. Z takejto liečby môžu tiež mať prospech ochorenia a metabolické poruchy, ktorých dôsledkom je strata kostnej štruktúry. Napríklad môže úžitok z podávania látok podľa tohto vynálezu byť pri hyperparatyreoidizme, Pagetovej chorobe, hyperkalcémii zhubného nádoru, osteolytických léziách spôsobených metastázami kosti, strate kosti spôsobenej znehybnením alebo nedostatkom pohlavného hormónu, Behcetovej chorobe, osteomalácii, hyperostóze a osteopetróze.
Okrem toho, pretože látky podľa tohto vynálezu inhibujú receptory vitronektínu na množstve rôznych typov buniek, môžu tieto látky byť užitočné pri liečbe zápalových ochorení, ako sú napríklad reumatoidná artritída a psoriáza, a kardiovaskulárnych ochorení, ako sú napríklad ateroskleróza a restenóza. Látky podľa tohto vynálezu môžu byť užitočné pri liečbe alebo prevencii ďalších ochorení, ktoré zahrnujú, ale neobmedzujú sa na ne, tromboembolické poruchy, astmu, alergie, syndróm respiračnej nedostatočnosti dospelých, ochorenia transplantát proti hostiteľovi, odmietnutie transplantovaných orgánov, septický šok, ekzémy, kontaktnú dermatitídu, zápalové ochorenie čreva, a ďalšie autoimunitné ochorenia. Látky podľa tohto vynálezu môžu byť tiež užitočné hojení poranení.
Látky podľa tohto vynálezu môžu byť užitočné pri liečbe, vrátane prevencie, angiogenetických porúch. Pojem angiogenetické poruchy, ako je používaný v tomto dokumente, zahŕňa stavy, v ktorých je zahrnutá abnormálna neovaskularizácia. Tam kde rast nových krvných ciev je príčinou alebo prispieva k patológii spojenej s
-5ochorením, bude inhibícia angiogenézy znižovať zhubné účinky ochorenia. Ako príklad takéhoto cieleného ochorenia je diabetická retinopatia. Tam kde je potrebný rast nových krvných ciev na podporu rastu zhubného tkaniva, inhibícia angiogenézy bude znižovať prívod krvi do tkaniva a tým bude prispievať k redukcii hmoty tkaniva na základe požiadaviek na prívod krvi. Príklady zahŕňajú rast tumorov, kde neovaskularizácia je kontinuálnou požiadavkou rastu tumoru a vzniku tuhých ' tumorových metastáz. Látky podľa tohto vynálezu teda inhibujú angiogenézu tumorového tkaniva, tým zabraňujú metastázam tumoru a rastu tumoru.
Teda podľa metód tohto vynálezu, inhibícia angiogenézy použitím látok podľa tohto vynálezu môže zlepšiť symptómy ochorenia a v niektorých prípadoch, môže ochorenie liečiť.
Ďalšie terapeutické ciele pre látky podľa tohto vynálezu sú očné ochorenia charakterizované neovaskularizáciou. Takéto očné ochorenia zahŕňajú korneálne neovaskulárne ochorenia, ako sú napríklad korneálna transplantácia, herpetická keratitída, luetická keratitída, pterýgium a neovaskulárny panus spojený s používaním kontaktných šošoviek. Ďalšie očné ochorenia tiež zahŕňajú makulárne degenerácie spojené s vekom, predpokladané očné histoplasmózy, retinopatiu nedonosených detí a neovaskulárny glaukóm.
Tento vynález ďalej poskytuje spôsob inhibície rastu tumoru, ktorý zahŕňa 5 postupné podávanie alebo podávanie vo fyzikálnom spojení, látky podľa tohto vynálezu a antineoplastického činidla, ako je napríklad topotekan a cisplatina.
Tento vynález tiež poskytuje spôsob prípravy látky vzorca (I)
(D ktorý zahrnuje redukciu látky vzorca (II)
-6(II)
Ďalším uskutočnením tohto vynálezu je spôsob prípravy látky vzorca (II)
(II) ktorý zahrnuje cyklizáciu látky vzorca (III)
(III)
Tento vynález ďalej poskytuje nové medziprodukty vzorca (IV), (V), (VI) a (II):
(IV)
CO2C1<alkyl (V)
-7(IV)
(II)
Ako je používaný v tomto dokumente, C^alkyl zahrnuje metyl, etyl, npropyl, izopropyl, n-butyl, izobutyl, terc-butyl, pentyl, n-pentyl, izopentyl, neopentyl a hexyl a ich jednoduché alifatické izoméry.
Určité činidlá sú v tomto dokumente skrátené. DCC znamená dicyklohexylkarbodiimid, DMAP znamená dimetylaminopyridín, DIEA znamená diizopropyletylamín, EDC znamená N-etyl-N'-(dimetylaminopropyl)-karbodiimid. HOBt znamená 1hydroxybenzotriazolu, THF znamená tetrahydrofurán, DMF znamená dimetylformamid, NBS znamená N-bróm-sukcínimid, Pd/C znamená katalyzátor paládium na uhlíku, DPPA znamená difenylfosforylazid, BOP znamená benzotriazol-1yloxytris(dimetylamino)fosfóniumhexafluórfosfát, HF znamená kyselinu fluorovodíkovú, PPA znamená kyselinu polyfosforečnú, TEA znamená trietylamín, TFA znamená kyselinu trifluóroctovú, PCC znamená pyridíniumchlórchromát.
Látky podľa tohto vynálezu sú pripravené spôsobmi opísanými v Bondinell a spol., PCT publikácia č. WO 97/01540 (medzinárodná prihláška č. PCT/US96/11108), publikovaná 16. januára 1997, ktorého celý opis je zahrnutý v tomto dokumente ako odkazu.
Ďalej sa látky podľa tohto vynálezu pripravujú analogickými spôsobmi, ako sú spôsoby opísané v nižšie uvedených schémach.
-8Schéma 1
ho2c
a) Tf2O, 2,6-lutidín, CH2CI2; b) alyltributylcín, LiCI, (Ph3P)2PdCI2, DMF; c) RuCI3, H5IO6, CCI4, CH3CN, H20; d) PPA; e) EtOAc/LiHMDS, THF; f) H2, 10 % Pd/C, koncentrovaná HCI, AcOH; g) EtSH, AICI3, CH2CI2; h) Tf2O, 2,6-lutidín, CH2CI2; i) CO, Pd(OAc)2, KOAc, dppf, DMSO.
2-benzyl-4-metoxyfenol (J. Am. Chem. Soc. 1949, 71, 64) sa konvertuje na zodpovedajúci trifluórmetánsulfonátový ester, látka 2-Schéma 1 (napríklad látka 12) reakciou s anhydridom kyseliny trifluórmetánsulfónovej (Tf2O) v prítomnosti vhodnej zásady, napríklad 2,6-lutidínu, v inertnom rozpúšťadle, obyčajne CH2CI2
-9Reakcia látky 1-2 s alyltributylcínom v prítomnosti LiCI a paládiového katalyzátora, napríklad bis(trifenylfosfín)paládium(ll) chloridu ((Ph3P)2PdCl2), v inertnom rozpúšťadle, ako je napríklad DMF, spôsobom opísaným Tilleyom (J. Org. Chem. 1990, 55, 906), poskytne látku 1-3. Oxidačné štiepenie olefínu 3-Schéma 1, ktoré poskytne priamo karboxylovú kyselinu 1-4, môže byť uskutočnené reakciou s vhodným oxidačným činidlom, klasicky KMnO4, vo vhodnom vodnom rozpúšťadle, ako je napríklad vodný roztok acetónu alebo vodný roztok kyseliny octovej. Výhodne je však oxidačné štiepenie olefínu v látke 1-3, ktoré poskytne priamo karboxylovú kyselinu 1-4, vedené podľa všeobecnej metódy Sharplessa (J. Org. Chem. 1981,46, 3936; J. Org. Chem. 1985, 50, 1560, poznámka pod čiarou 4), kde RuO4 je vyrobené v situ reakciou RuCI3 alebo RuO2 s NalO4 alebo H5IO6 v zmesi rozpúšťadiel CCI4, CH3CN a H2O. Alternatívne môže byť oxidácia vedená v dvoch operáciách, zahŕňajúc v prvom stupni oxidačné štiepenie olefínu na zodpovedajúci aldehyd, ktoré môže byť uskutočnené postupmi dobre známymi odborníkom skúseným v tejto oblasti, nasledované oxidáciou aldehydu na karboxylovú kyselinu použitím, napríklad NaCIO2, ako je opísané Pinnickom (Tetrahedron 1981, 37, 2091) alebo Dalcanalom a Montanarim (J. Org. Chem. 1986, 51, 567). Cyklizácia látky 1-4 na látku 1-5 môže byť uskutočnená použitím kyseliny polyfosforečnej, spôsobom opísaným Proctorom, Renfrewom a Savageom (J. Chem. Soc. (C) 1969, 1000). Alternatívne môže byť látka 1-4 prevedená na látku 1-5 cez zodpovedajúci chlorid kyseliny 1-4, ktorý môže byť pripravený postupmi dobre známymi odborníkom skúseným v tejto oblasti. Opracovanie tohoto chloridu kyseliny s vhodným Friedel-Craftsovým katalyzátorom, ako je napríklad AICI3 alebo SnCI4, v inertnom rozpúšťadle, ako je napríklad CH2CI2 alebo CS2, poskytne cyklický ketón 1-5. Reakcia látky 1-5 v aldolovom type reakcie s enolátom etylacetátu, ktorý môže byť vyrobený z etylacetátu expozíciou vhodnou amidovou bázou, napríklad lítiumdiizopropylamidom (LDA) alebo lítium bis(trimetylsilyl)amidom (LiHMDS), poskytne látku 1-6. Často sa ako rozpúšťadlo pre aldolové reakcie volí THF, hoci sa často požíva THF v prítomnosti rôznych aditív, napríklad HMPA alebo TMEDA. Redukcia látky 1-6 na látku 1-7 môže byť uskutočnená hydrogenolýzou nad vhodným katalyzátorom, napríklad kovovým paládium na aktívnom uhlí (Pd/C), vo vhodnom
- 10rozpúšťadle, ako je napríklad kyselina octová, v prítomnosti minerálnej kyseliny, napríklad HCI. Alternatívne môže táto redukcia byť uskutočnená opracovaním látky 1-6 s trietylsilánom v prítomnosti éterátu fluoridu boritého všeobecnou metódou Orphanopoulosa a Smonua (Synth. Commun. 1988, 833). Odstránenie metyléteru z látky 1-7, čím sa poskytne látka 1-8, môže byť uskutočnené s BBr3 v inertnom rozpúšťadle, napríklad CH2CI2, reakciou s etántiolom a AICI3 v inertnom rozpúšťadle, výhodne CH2CI2 Ďalšie užitočné metódy na odstránenie metyléteru sú opísané v Greenovej knihe Protective Groups in Organic Synthesis (publikované vydavateľstvom John Wiley and Sons). Látka 1-9, trifluórmetánsulfonátový ester 18, pripravený postupom opísaným skôr pre konverziu látky 1-1 na látku 1-2, reaguje s oxidom uhoľnatým v prítomnosti octanu draselného, 1,ľ-bis(difenylfosfino)ferocénu (dppf) a paládiového katalyzátora, napríklad octanu paladnatého (Pd(OAc)2) vo vhodnom rozpúšťadle, výhodne DMSO, podľa všeobecnej metódy opísanej Cacchim a Lúpim (Tet. Lett. 1992, 33, 3939), poskytne látku 1-10,
Schéma 2 ukazuje spájaciu metódu tvorby väzby, ktorá môže byť použitá na tvorbu éterových štruktúr.
Schéma 2
<3)
CO2Et
- 11 Schéma 2 - pokračovanie
a) 2-[(3-hydroxy-1-propyl)amino]pyridín-N-oxid, DEAD, (Ph)3P, DMF; b) cyklohexén, 10% Pd/C, 2-propanol; c) 1,0 mol/l NaOH, EtOH, potom okyslenie.
Látka 1 Schéma 2 (látka 2-1) sa nechá zreagovať s 2-[(3-hydroxy-1-propyl)amino]pyridín-N-oxidom v Mitsunobuovom type spájacej reakcie (Organic Reactions 1992, 42, 335 až 656; Synthesis 1981, 1 až 28), čím poskytne látku 2-2. Reakcia je sprostredkovaná pomocou komplexu tvoreného medzi dietylazidokarboxylátom a trifenylfosfínom, a vedie sa v aprotickom rozpúšťadle, napríklad THF, CH2CI2, alebo DMF. Pyridín-N-oxidová skupina látky 2-2 sa redukuje na zodpovedajúci pyridín 2-3 za podmienok hydrogenácie za použitia paládiového katalyzátora, výhodne kovového paládia na aktívnom uhlí v inertnom rozpúšťadle, napríklad metanole, etanole, alebo 2-propanole. Cyklohexén, 1,4-cyklohexadién, kyselina mravčia, a soli kyseliny mravčej, ako napríklad mravčan draselný alebo mravčan amónny, sú bežne používané ako činidlo prenosu vodíka v tomto type reakcie. Etylester 2-3 sa saponifikuje, ako je opísané v Schéme 1, čím sa poskytne látku 2-4.
Alternatívne metódy na prípravu niektorých medziproduktových látok opísané skôr v tomto dokumente sa uskutočňujú tak, ako je uvedené nižšie v Schémach 3 a 4.
Schéma 3
a) 10 % Pd/C, HOAc; b) SOCI2, toluén; c) AICI3 CH2CI2
- 12Schéma 3 sumarizuje zmenenú metódu na prípravu látky Schéma 1, vzorec 5 (látka 1-5). Podľa tejto schémy sa látka 3-1 (J. Med. Chem., 1981, 24, 998) hydrogenuje v atmosfére plynného vodíka pri vhodnom tlaku, napríklad 345 kPa (50 psi), v prítomnosti paládiového katalyzátora, napríklad 10 % Pd/C, vo vhodnom rozpúšťadle, napríklad ľadovej kyseline octovej, pri vhodnej teplote, napríklad 25 °C, čím sa poskytne látka 3-2. Cyklizácia látky 3-2 na látku 3-3 sa uskutočňuje najprv konvertovaním látky 3-2 na zodpovedajúci chlorid kyseliny v prítomnosti vhodného chloračného činidla, napríklad tionylchloridu, vo vhodnom rozpúšťadle, napríklad benzéne, pri vhodnej teplote, napríklad 85 °C. Opracovanie tohto chloridu kyseliny vhodným Friedel-Craftsovým katalyzátorom, napríklad AICI3, vo vhodnom rozpúšťadle, napríklad CH2CI2, pri vhodnej teplote, napríklad 25 °C poskytne látka 6-3.
a) LiN(TMS)2, etylbrómacetát; b) Jonesovo činidlo, OsO4; c) H2, 10 % Pd/C, HOAC; d) C2O2CI2, DMF; e) AICI3, CH2CI2, RT; f) H2, 10 % Pd/C, HOAC
-13Schéma 4 sumarizuje alternatívny spôsob prípravy Schémy 1, vzorec 7 (látka 1-7) látok. Podľa tejto Schémy, látka 4-1 (J. Med. Chem., 1981, 24, 998) reaguje s etylbrómacetátom v prítomnosti vhodnej zásady, napríklad LiN(TMS)2, vo vhodnom rozpúšťadle, napríklad THF, pri vhodnej teplote, napríklad -78 °C, čím poskytne látku 4-2. Látka 4-2 sa oxidačné štiepi v prítomnosti vhodnej zmesi oxidačných činidiel, napríklad OsO4/Jonesovo činidlo, vo vhodnom rozpúšťadle, napríklad acetóne, pri vhodnej teplote, napríklad 25 °C, čím poskytne látku 4-3 (J. Org. Chem., 1993, 58,4745). Látka 4-3 sa ďalej hydrogenuje v atmosfére plynného vodíka pri vhodnom tlaku, napríklad 345 kPa (50 psi), v prítomnosti paládiového katalyzátora, napríklad 10 % Pd/C, vo vhodnom rozpúšťadle, napríklad ľadovej kyseline octovej, pri vhodnej teplote, napríklad 25 °C, čím poskytne látku 4-4. Cyklizácia látky 4-4 na látku 4-5 sa uskutočňuje najprv konvertovaním látky 4-4 na zodpovedajúci chlorid kyseliny v prítomnosti vhodného chloračného činidla, napríklad oxalylchloridu, v prítomnosti katalytického množstva prídavku, napríklad DMF, vo vhodnom rozpúšťadle, napríklad CH2CI2, pri vhodnej teplote, napríklad 25. °C. Opracovanie tohto chloridu kyseliny vhodným Friedel-Craftsovým katalyzátorom, napríklad AICI3, vo vhodnom rozpúšťadle, napríklad CH2CI2, pri vhodnej teplote, napríklad 25 °C, poskytne látku 4-5. Látka 4-5 sa ďalej hydrogenuje v atmosfére plynného vodíka pri vhodnom tlaku, napríklad 345 kPa (50 psi), v prítomnosti paládiového katalyzátora, napríklad 10% Pd/C, vo vhodnom rozpúšťadle, napríklad ľadovej kyseline octovej, pri vhodnej teplote, napríklad 25 °C, čím poskytne látku 4-6.
Kyslé adičné soli látok sa pripravujú štandardným spôsobom vo vhodnom rozpúšťadle z materskej látky a prebytku kyseliny, ako napríklad kyseliny chlorovodíkovej, bromovodíkovej, fluorovodíkovej, sírovej, fosforečnej, octovej, trifluóroctovej, maleínovej, jantárovej alebo metánsulfónovej. Niektoré z týchto látok tvoria vnútorné soli alebo zwitterióny, ktoré môžu byť prijateľné. Katiónové soli sa pripravujú opracovaním materskej látky s prebytkom alkalického činidla, ako napríklad hydroxidu, uhličitanu alebo alkoxidu, obsahujúceho príslušný katión; alebo s príslušným organickým amínom. Katióny, ako napríklad Li+, Na+, K+, Ca++ Mg++ a NH/, sú konkrétnymi príkladmi katiónov prítomných vo farmaceutický
- 14prijateľných soliach.
Tento vynález tiež poskytuje farmaceutickú zmes, ktorá zahrnuje látku podľa toho, ako je opísané v tomto dokumente a farmaceutický prijateľný nosič. Podľa toho, sa látky podľa tohto vynálezu môžu používať na výrobu liečiv. Farmaceutické zmesi látok podľa tohto vynálezu, pripravené ako je uvedené skôr v tomto dokumente, môžu byť upravené ako roztoky alebo ako lyofilizované prášky na parenterálne podávanie. Prášky sa môžu rekonštituovať pridaním vhodného zrieďovadla alebo iného farmaceutický prijateľného nosiča pred použitím. Kvapalné prípravky môžu byť ako pufrované izotonické vodné roztoky. Príklady vhodných zried’ovadiel sú normálny izotonický soľný roztok, štandardný roztok 5 % hmotnostných dextrózy vo vode alebo pufrovanom roztoku octanu sodného alebo amónneho. Takéto prípravky sú zvlášť vhodné na parenterálne podávanie, ale môžu sa tiež použiť na orálne podávanie alebo zahrnuté v odmeranej dávke inhalátora alebo rozprašovača na insufláciu. Môže byť žiadúce pridať vehikulá, ako napríklad polyvinylpyrolidón, želatínu, hydroxycelulózu, arabskú gumu, polyetylénglykol, manitol, chlorid sodný alebo citran sodný.
Alternatívne sa tieto látky môžu zapuzdriť, tabletovať alebo sa môžu pripraviť v emulzii alebo sirupe na orálne podávanie. Môžu sa pridať farmaceutický prijateľné tuhé alebo kvapalné nosiče na zlepšenie alebo stabilizáciu zmesi alebo na uľahčenie prípravy kompozície. Tuhé nosiče zahrnujú škrob, laktózu, dihydrát síranu vápenatého, sádrovec, stearan horečnatý alebo kyselinu stearovú, mastenec, pektín, arabskú gumu, agar alebo želatínu. Kvapalné nosiče zahrnujú sirup, podzemnicový olej, olivový olej, soľanku a vodu. Nosič môže tiež zahrnovať materiál na spomalené uvoľňovanie, ako napríklad glycerylmonostearát alebo glyceryldistearát, samotný alebo s voskom. Množstvo tuhého nosiča sa mení, ale výhodne bude medzi okolo 20 mg až okolo 1 g na dávkovú jednotku. Farmaceutické prípravky sa vyrábajú podľa konvenčných techník farmácie zahrnujúc mletie, zmiešavanie, granuláciu, a lisovanie, ak je potrebné, na tabletové formy; alebo mletie, zmiešavanie a plnenie do formy tvrdých želatínových kapsulí. Keď sa používa kvapalný nosič, prípravok bude vo forme sirupu, elixíru, emulzie alebo vodnej alebo nevodnej suspenzie. Takéto kvapalné prípravky sa môžu podávať priamo p.o. alebo plnené do mäkkej želatínovej kapsuly.
Pre rektálne podávanie sa látky podľa tohto vynálezu môžu tiež kombinovať s vehikulami, ako je napríklad kakaové maslo, glycerín, želatína alebo polyetylénglykoly, a formovať na čapiky.
Látky opísané v tomto dokumente sú antagonistami receptora vitronektinu a sú užitočné na liečenie chorôb, pri ktorých základná patológia je priraditeľná ligandu alebo bunke, ktoré interagujú s receptorom vitronektinu. Napríklad sú tieto látky užitočné na liečenie chorôb, pri ktorých vytvára patológiu strata kostnej matrice. Teda tieto látky sú užitočné na liečenie ostoeporózy, hyperparatyreoidizmu, Pagetovej choroby, hyperkalcémie pri malignite, osteolytických lézií tvorených kostnými metastázami, straty kosti v dôsledku nepohyblivosti alebo nedostatku pohlavného hormónu. Predpokladá sa, že látky podľa tohto vynálezu majú tiež použitie ako antitumorové, anti-angiogenetické; protizápalové a anti-metastázové činidlá, a sú užitočné na liečenie aterosklerózy a restenózy.
Tieto látky sa podávajú buď orálne alebo parenterálne pacientovi takým spôsobom, že koncentrácia liečiva je dostatočná na inhibovanie resorpcie kostí, alebo inej takejto indikácie. Farmaceutická zmes obsahujúca túto látku sa podáva v orálnej dávke medzi okolo 0,1 až okolo 50 mg/kg spôsobom konzistentným so stavom pacienta. Výhodne by orálne dávky boli okolo 0,5 až okolo 20 mg/kg. Na akútnu terapiu je výhodné parenterálne podávanie. Intravenózna infúzia peptidu v 5% dextróze vo vode alebo normálnom soľnom roztoku, alebo podobnom prípravku s vhodnými vehikulami, je najúčinnejšia, hoci intramuskulárna bolusová injekcia je tiež užitočná. Typicky bude parenterálna dávka okolo 0,01 až okolo 100 mg/kg; výhodne medzi 0,1 a 20 mg/kg. Tieto látky sa podávajú jeden až štyri krát denne s hladinou na dosiahnutie celkovej dennej dávky okolo 0,4 až okolo 400 mg/kg/deň. Presná hladina a spôsob, ktorým sa tieto látky podávajú, sa ľahko určí odborníkom v tejto oblasti pomocou porovnania hladiny činidla v krvi s koncentráciou požadovanou na to, aby mala terapeutický účinok.
Tento vynález ďalej poskytuje spôsob liečenia osteoporózy alebo inhibovania straty kosti, ktorý zahrnuje postupné podávanie alebo podávanie vo fyzickom spojení látky podľa tohto vynálezu a iných inhibítorov resorpcie kostí, ako
-16napríklad bisfosfonátov (t.j. alendronát), hormonálnej terapie, anti-estrogénov, alebo kalcitonínu. Okrem toho, tento vynález poskytuje spôsob liečenia za použitia látky podľa tohto vynálezu a anabolického činidla, ako napríklad kostného morfogenického proteínu, iproflavónu, užitočného na prevenciu straty kosti a/alebo na zvýšenie kostnej hmoty.
Okrem toho tento vynález poskytuje spôsob inhibovania rastu tumoru, ktorý zahrnuje podávanie postupne alebo podávanie vo fyzickom spojení látky podľa tohto vynálezu a antineoplastického činidla. Látky triedy kamptotecínových analógov, ako napríklad topotekan, irinotekan a 9-aminokamptotecín, a platinové koordinačné komplexy, ako napríklad cisplatina, ormaplatina a tetraplatina, sú dobre známou skupinou antineoplastických činidiel. Látky triedy kamptotecínových analógov sú opísané v U.S. patentoch č. 5,004,758, 4,604,463, 4,473,692, 4,545,880 4,342,776, 4,513,138, 4,399,276, v EP patentových prihláškach č. 0418099 a 0088 642, Wani, a spol, J. Med. Chem, 1986, 29, 2358, Wani, a spol, J. Med. Chem., 1980, 23, 554, Wani, a spol., J. Med. Chem, 1987, 30, 1774, a Nitta, a spol., Proc. 14th International Congr. Chemotherapy, 1985, Anticancer Section 1, 28, ktorých úplný opis je tu včlenený pomocou odkazu. Platinový koordinačný komplex, cisplatina, je dostupný pod menom Platinol® od Bristol Myers-Squibb Corporation. Užitočné prípravky cisplatiny sú opísané v U.S. patentoch č. 5,562,925 a 4,310,515, ktorých úplný opis je tu včlenený pomocou odkazu.
Pri spôsobe inhibovania rastu tumoru, ktorý zahrnuje podávanie postupne alebo podávanie vo fyzickom spojení látky podľa tohto vynálezu a antineoplastického činidla, sa platinová koordinačná látka, napríklad cisplatiny, môže podávať za použitia pomalej intravenóznej infúzie. Výhodným nosičom je roztok dextróza/soľanka obsahujúci manitol. Dávkový rozvrh platinovej koordinačnej látky môže byť na základe od okolo 1 do okolo 500 mg na štvorcový meter (mg/m2) plochy povrchu tela na beh liečenia. Infúzie platinovej koordinačnej látky sa môžu dávať jeden až dva krát týždenne, a týždenné liečenia sa môžu opakovať niekoľko krát. Za použitia látky triedy analógov kamptotecínu pri parenterálnom podávaní, všeobecne použitý beh terapie je od okolo 0,1 až okolo 300,0 mg/m2 plochy povrchu tela na deň počas okolo päť postupne nasledujúcich dní. Najvýhodnejšie je použitý beh terapie pre topotekan od okolo 1,0 do okolo 2,0 mg/m2 plochy povrchu tela na deň počas okolo päť postupne nasledujúcich dní. Výhodne sa beh liečenia opakuje pajmenej jedenkrát po asi sedem dňovom až asi dvadsaťdňovom intervale.
Farmaceutická zmes môže byť upravená tak, že aj látka podľa tohto vynálezu aj antineoplastické činidlo sú v rovnakom kontajneri, ale výhodné sú prípravky s rôznymi kontajnermi. Keď sa obe činidlá poskytujú v roztokovej forme, môžu byť obsahom infúzneho/injekčného systému pre simultánne podávanie alebo v tandemovom usporiadaní.
Pre pohodlné podávanie látky podľa tohto vynálezu a antineoplastického činidla v rovnakom alebo v rôznych časoch sa pripravuje kit, obsahujúci, v jednom kontajneri, ako napríklad krabica, kartón alebo v inom kontajneri, individuálne fľašky, vrecká, liekovky alebo iné kontajnery, pričom každý má účinné množstvo látky podľa tohto vynálezu na parenterálne podávanie, ako je opísané vyššie, a účinné množstvo antineoplastického činidla na parenterálne podávanie, ako je opísané vyššie. Takýto kit môže obsahovať napríklad obe farmaceutické činidlá v oddelených kontajneroch alebo vtom istom kontajneri, voliteľne ako lyofilizovanú tabletu, a kontajnery roztokov na rekonštitúciu. Variáciou je zahrnutie roztoku na rekonštitúciu a lyofilizovanej tablety v dvoch komorách jediného kontajnera, pričom môžu byť privedené k zmiešaniu pred použitím. Pri takomto usporiadaní sa antineoplastické činidlo a látka podľa tohto vynálezu môžu baliť oddelene, ako v dvoch kontajneroch, alebo lyofilizované spolu ako prášok a poskytnuté v jedinom kontajneri.
Keď sú obe činidlá poskytnuté v roztokovej forme, môžu byť obsahom infúzneho/injekčného systému pre simultánne podávanie alebo v tandemovom usporiadaní. Napríklad môže látka podľa tohto vynálezu byť v i.v. injektovateľnej forme, alebo v infúznom vrecku spojenom do série pomocou hadičky s antineoplastickým činidlom v druhom infúznom vrecku. Za použitia takéhoto systému môže pacient dostať počiatočnú injekciu bolusového typu alebo infúziu látky podľa tohto vynálezu po čom nasleduje infúzia antineoplastického činidla.
Látky sa môžu testovať v jednej z viacerých biologických skúšok, aby sa určila koncentrácia látky, ktorá sa vyžaduje na to, aby mala daný farmakologický účinok.
Inhibícia viazania vitronektínu
Viazanie tuhá-fáza [3H]-SK&F-107260 na ανβ3; ανβ3 ľudskej placenty alebo ľudských krvných doštičiek (0,1 - 0,3 mg/ml) v pufri T (obsahujúcom 2 mmol/l CaCI2 a 1 % hmotnostné oktylglukozidu) sa zriedil s pufrom T obsahujúcim 1 mmol/l CaCI2, 1 mmol/l MnCI2, 1 mmol/l MgCI2 (pufer A) a 0,05 % hmotnostného NaN3, a potom sa ihneď pridal do 96-kalíškových ELISA platní (Corning, New York, NY) s 0,1 ml na kalíšok. Pridalo sa 0,1 až 0,2 pg ανβ3 na kalíšok. Platne sa inkubovali počas noci pri 4 °C. V čase experimentu sa kalíšky premyli jeden raz s pufrom A a inkubovali sa s 0,1 ml 3,5 % albumínom hovädzieho séra v rovnakom pufri počas 1 hodiny pri laboratórnej teplote. Po inkubácii sa kalíšky úplne odsali a premyli sa dva krát s 0,2 ml pufra A.
Látky sa rozpustili v 100 % DMSO, čím sa poskytol 2 mmol/l zásobný roztok, ktorý sa zriedil s viazacím pufrom (15 mmol/l Tris-HCI (pH 7,4/ 100 mmol/l NaCI, 1 mmol/l CaCI2, 1 mmol/l MnCI2, 1 mmol/l MgCI2) na konečnú látkovú koncentráciu 100 pmol/l. Tento roztok sa potom zriedil na požadovanú konečnú látkovú koncentráciu. Do kalíškov sa pridali rôzne koncentrácie neoznačenej antagonistickej látky (0,001 až 100 pmol/l) v troch opakovaniach, nasledovalo pridanie 5,0 nmol/l [3H]-SK&F- 107260 (2,40.1012 až 3,18.1012 Bq/mmol (65 až 86 Ci/mmol)).
Platne sa inkubovali počas 1 hodiny pri laboratórnej teplote. Po inkubácii sa kalíšky úplne odsali a premyli sa jeden krát s 0,2 ml ľadovo studeného pufra A v usporiadaní kalíšok po kalíšku. Receptory sa solubilizovali s 0,1 ml 1 % SDS a viazaný [3H]-SK&F-107260 sa určil pomocou detekcie kvapalným scintilátorom s pridaním 3 ml roztoku Ready Safe v Beckman LS kvapalnom scintilačnom detektore so 40 % účinnosťou. Nešpecifické viazanie [3H]-SK&F-107260 sa určilo v prítomnosti 2 μιτιοΙ/Ι SK&F-107260 a bolo konzistentne menej než 1% z celkového vstupného rádioligandu. Hodnota IC50 (koncentrácia antagonistickej látky na
-19inhibovanie 50 % viazania [3H]-SK&F-107260) sa určila pomocou programu nelineárnej metódy najmenších štvorcov na spracovanie kriviek, ktorý sa modifikoval z LUNDON-2 programu. Hodnoty Kj (disociačná konštanta antagonistickej látky) sa vypočítali podľa rovnice: K| = IC50(1 + L/Kd), kde L a Kd boli koncentrácia a disociačná konštanta [3H]-SK&F-107260.
Látky podľa tohto vynálezu sa tiež testovali na in vitro a in vivo resorpciu kostí v skúške štandardnej v tejto oblasti na vyhodnotenie inhibície tvorby kostí, ako napríklad skúška tvorby jamky opísaná v EP 528587, ktorá sa môže tiež uskutočniť za použitia ľudských osteoklastov namiesto potkaních osteoklastov, a model ovarektomizovaných potkanov, opísaný Wronskim a spol., Celí and Materials 1991, Sup. 1, 69 až 74.
Skúška migrácie vaskulárnych buniek hladkého svalstva
Použili sa bunky potkanieho alebo ľudského aortického hladkého svalstva. Migrácia buniek sa monitorovala v Transwell komore na bunkové kultúry za použitia polykarbonátovej membrány s pórmi 8 um (Costar). Nižší povrch filtra sa pokryl s vitronektínom. Bunky sa suspendovali v DMEM doplnenom s 0,2 % hovädzím sérovým albumínom pri koncentrácii 2,5 až 5,0.106buniek/ml, a predopracovali sa s testovanou látkou pri rôznych koncentráciách počas 20 minút pri 20 °C. Rozpúšťadlo samotné sa použilo na kontrolu. 0,2 ml bunkovej suspenzie sa umiestnilo v hornom oddelení komory. Dolné oddelenie obsahovalo 0,6 ml DMEM doplneného s 0,2 % hovädzieho sérového albumínu. Inkubácia sa uskutočnila pri 37 °C v atmosfére 95 % vzduch/5% CO2 počas 24 hodín. Po inkubácii sa nemigrované bunky na hornom povrchu filtra odstránili pomocou jemného zoškrabania. Filter sa potom fixoval v metanole a vyfarbil sa s 10 % Giemsa farbivom. Migrácia sa merala buď pomocou a) sčítania počtu buniek, ktoré migrovali na dolný povrch filtra alebo pomocou b) extrahovania vyfarbených buniek s roztokom 10 % hmotnostných kyseliny octovej, po čom nasledovalo určenie absorbancie pri 600 nm.
-20Model tyroparatyroidektomizovaných potkanov
Každá experimentálna skupina pozostáva z 5 až 6 dospelých samcov Sprague-Dawley potkanov (250 až 400 g telesná hmotnosť). Potkany sa tyroparatyroidektomizovali (predajcom, Taconic Farms) 7 dní pred použitím. Všetky potkany obdržali náhradnú dávky tyroxínu každé 3 dni. Po obdržaní potkanov sa merali hladiny obehového ionizovaného vápnika v krvi ihneď po tom, ako bola odobratá do heparinizovaných skúmaviek pomocou napichnutia chvostovej žily. Potkany sa zahrnujú do pokusu, ak hladina ionizovaného Ca (merané s CibaCorning model 634 analyzátorom vápnik pH) je <1,2 mmol/l. Každý potkan je vybavený s trvalo prítomným žilným a arteriálnym katétrom na dodávanie testovaného materiálu a na vzorkovanie krvi. Potom sa potkany dajú na bezvápnikovú diétu a deionizovanú vodu. Odmerali sa základné línie Ca hladín a každému potkanovi sa podávajú buď kontrolné vehikulá alebo ľudský paratyroidný hormón 1-34 peptid (hPTH1-34, dávka 1,25 ug/kg/hod. v zmesi soľanka/1% hovädzí sérový albumín, Bachem, Ca) alebo zmes hPTH1-34 a testovaného materiálu, pomocou kontinuálnej intravenóznej infúzie cez žilný katéter za použitia externej piestovej pumpy. Kalcemická odozva potkanov sa merala v dvojhodinových intervaloch počas infúzie po dobu 6 až 8 hodín.
Skúška resorpcie a adhézie ľudských osteoklastov
Jamková resorpčná a adhézna skúška sa vyvinuli a štandardizovali za použitia normálnych ľudských osteoklastov získaných z osteoklastómového tkaniva. Skúška 1 sa vyvinula na meranie objemov jamky osteoklastov pomocou laserovej konfokálnej mikroskopie. Skúška 2 sa vyvinula tak, že ako výkonnejšia kontrola, pri ktorej sa kolagénové fragmenty (uvoľnené počas resorpcie) merali pomocou konkurenčnej ELISA-metódy.
Skúška 1 (za použitia laserovej konfokálnej mikroskopie) • Alikvóty suspenzie ľudských osteoklastómových buniek sa odobrali z uskladnenia v kvapalnom dusíku, rýchlo sa zahriali na 37 °C a premyli sa x1 v RPMI-1640 médiu pomocou centrifugácie (1000 ot/min, 5 minút pri 4 °C).
• Médium sa odsalo a nahradilo sa myšacou anti-HLA-DR protilátkou, potom sa zriedilo 1:3 s RPML-1640 médiom. Suspenzia sa inkubovala počas 30 minút na ľade a často sa premiešavala.
• Bunky sa premyli x2 so studeným RPMI-1640, po čom nasledovala centrifugácia (1000 ot./min., 5 minút pri 4 °C) a bunky sa potom preniesli do sterilnej 15 ml centrifugačnej skúmavky. Počet mononukleárnych buniek sa spočítal v zlepšenej Neubauerovej počítacej komore.
• Dostatok magnetických perličiek (5 I mononukleárnych buniek), pokrytých s kozím anti-myším IgG (Dynal, Great Neck, NY) sa odobral z ich zásobnej fľaše a umiestnil sa do 5 ml čerstvého média (tieto sa premyli od toxickej azidovej konzervačnej látky). Médium sa odstránilo pomocou imobilizovania perličiek na magnete a nahradilo sa čerstvým médiom.
• Perličky sa zmiešali s bunkami a suspenzia sa inkubovala počas 30 minút na ľade. Suspenzia sa často miešala.
• Bunkami pokryté perličky sa imobilizovali na magnete a zostávajúce bunky (frakcia bohatá na osteoklasty) sa dekantovali do sterilnej 50 ml centrifugačnej skúmavky.
• K bunkami pokrytým perličkám sa pridalo čerstvé médium na uvoľnenie zachytených osteoklastov. Tento premývací proces sa opakoval χ10. Bunkami pokryté perličky sa vyhodili.
• Životaschopné osteoklasty sa spočítali v sčítacej komore, za použitia fluoresceíndiacetátu na označenie živých buniek. Na pridanie vzorky do komory sa použila plastová Pasteurova pipeta s veľkým vypúšťacím otvorom.
• Osteoklasty sa peletovali pomocou centrifugácie a hustota sa nastavila na príslušný počet v EMEM médiu (počet osteoklastov je variabilný od tumoru k tumoru), doplnenom s 10 % fetálnym teľacím sérom a 1,7 g/liter hydrogenuhličitanu sodného.
• 3 ml alikvóty bunkovej suspenzie (na sledovanú látku) sa dekantujú do 15 ml centrifugačných skúmaviek. Bunky sa peletovali pomocou centrifugácie.
• Do každej skúmavky sa pridali 3 ml príslušnej sledovanej látky (zriedenej na umol/l v EMEM médiu). Zahrnuli sa tiež príslušné vehikulové kontrolné vzorky, pozitívna kontrola (myšacia monoklonálna protilátka [87MEM1] pre anti-receptor vitronektínu zriedená na 100 ug/ml) a izotypová kontrola (lgG2a zriedený na 100 ug/ml). Vzorky sa inkubovali pri 37 °C počas 30 minút.
• 0,5 ml alikvóty buniek sa naočkovali na sterilné dentínové plátky v 48kalíškovej platni a inkubovali sa pri 37 °C počas 2 hodín. Každé opracovanie sa sledovalo štvormo.
• Plátky sa premyli šiestimi výmenami teplého PBS (10 ml/kalíšok v 6kalíškovej platni) a potom sa umiestnili do čerstvého média obsahujúceho vzorku sledovanej látky alebo kontrolnú vzorku. Vzorky sa inkubovali pri 37 °C počas 48 hodín.
Metóda vínan-rezistentnej kyslej fosfatázy (TRAP) (selektívne vyfarbenie pre bunky osteoklastového pôvodu) • Plátky z kosti obsahujúce naviazané osteoklasty sa premyli vo fosfátom pufrovanej soľanke a fixovali sa v 2 % glutaraldehyde (v 0,2 mol/l kakodyláte sodnom) počas 5 minút.
• Potom sa premyli s vodou a inkubovali sa počas 4 minút v TRAP pufri pri 37 °C (0,5 mg/ml naftol AS-BI fosfát rozpustený v Ν,Ν-dimetylformamide a zmiešaný s 0,25 mol/l citranovým pufrom (pH 4,5), obsahujúcom 10 mmol/l vínanu sodného.
• Po premytí studenou vodou sa plátky ponorili do studeného octanového pufra (0,1 mol/l, pH 6,2) obsahujúceho 1 mg/ml farbiva „fast red garnet“ a inkubovali sa pri 4 °C počas 4 minút.
• Prebytok pufra sa odsal a plátky sa po premytí vo vode vysušili na vzduchu.
• TRAP pozitívne osteoklasty (tehlovo červená/purpurová zrazenina) sa vyčíslili pomocou mikroskopie s ostrým sveteľným poľom a potom sa odstránili z povrchu dentínu pomocou opracovania ultrazvukom.
• Objemy jamky sa určili za použitia konfokálneho mikroskopu Niko/Lasertec
ILM21W.
-23Skúška 2 (za použitia odčítania typu ELISA)
Ľudské osteoklasty sa obohatili a pripravili na sledovanie látok tak, ako je opísané v počiatočných 9 krokoch Skúšky 1. Pre objasnenie sú tieto kroky opakované nižšie v tomto dokumente.
• Alikvóty bunkových suspenzií získaných z ľudských osteoklastov sa odobrali z uskladnenia v kvapalnom dusíku, rýchlo sa zahriali na 37 °C a premyli sa x1 v RPMI-1640 médiu pomocou centrifugácie (1000 ot./min., 5 minút pri 4 °C ).
• Médium sa odsalo a nahradilo sa myšacou anti-HLA-DR protilátkou, potom sa zriedilo 1:3 s RPML-1640 médiom. Suspenzia sa inkubovala počas 30 minút na ľade a často sa premiešavala.
• Bunky sa premyli x2 so studeným RPMI-1640, po čom nasledovala centrifugácia (1000 ot./min., 5 minút pri 4 °C) a bunky sa potom preniesli do sterilnej 15 ml centrifúgačnej skúmavky. Počet mononukleárnych buniek sa spočítal v zlepšenej Neubauerovej počítacej komore.
• Dostatok magnetických perličiek (5 I mononukleárnych buniek), pokrytých s kozím anti-myším IgG (Dynal, Great Neck, NY) sa odobral z ich zásobnej fľaše a umiestnil sa do 5 ml čerstvého média (tieto sa premyli od toxickej azidovej konzervačnej látky). Médium sa odstránilo pomocou imobilizovania perličiek na magnete a nahradilo sa čerstvým médiom.
• Perličky sa zmiešali s bunkami a suspenzia sa inkubovala počas 30 minút na ľade. Suspenzia sa často miešala.
• Bunkami pokryté perličky sa imobilizovali na magnete a zostávajúce bunky (frakcia bohatá na osteoklasty) sa dekantovali do sterilnej 50 ml centrifugačnej skúmavky.
• K bunkami pokrytým perličkám sa pridalo čerstvé médium na uvoľnenie zachytených osteoklastov. Tento premývací proces sa opakoval x10. Bunkami pokryté perličky sa vyhodili.
• Životaschopné osteoklasty sa spočítali v sčítacej komore, za použitia fluoresceíndiacetátu na označenie živých buniek. Na pridanie vzorky do komory sa použila plastová Pasteurova pipeta s veľkým vypúšťacím otvorom.
• Osteoklasty sa peletovali pomocou centrifugácie a hustota sa nastavila na príslušný počet v EMEM médiu (počet osteoklastov je variabilný od tumoru k tumoru), doplnenom s 10 % fetálnym teľacím sérom a 1,7 g/liter hydrogenuhličitanu sodného.
V kontraste so spôsobom opísaným vyššie v Skúške 1, sa látky sledujú pri 4 dávkach, čím sa získajú IC50, ako je uvedené nižšie:
• Preparáty osteoklastov sa predinkubovali počas 30 minút pri 37 °C s testovanou látkou (4 dávky) alebo kontrolnými vzorkami.
• Potom sa očkovali na plátky hovädzej kortikálnej kosti v kalíškoch 48kalíškovej tkanivovej kultivačnej platne a inkubovali sa počas ďalších 2 hodín pri 37 °C.
• Plátky kosti sa premyli sa šiestimi výmenami teplej fosfátom pufrovanej soľanky (PBS), čím sa odstránili nezachytené bunky, a potom sa vrátili do kalíškov 48 kalíškovej platne obsahujúcich čerstvú sledovanú látku alebo kontrolné vzorky.
• Tkanivové kultivačné platne sa potom inkubovali počas 48 hodín pri 37 °C • Supernatanty z jednotlivých kalíškov sa odsali do individuálnych skúmaviek a sledovali sa v konkurenčnom ELISA teste, ktorý deteguje c-telopeptid kolagénu typu I, ktorý sa uvoľnil počas resorpčného procesu. To je komerčne dostupná ELISA (Osteometer, Dánsko), ktorá obsahuje králičie protilátky, ktoré špecificky reagujú s 8-člennou aminkyselinovou sekvenciou (Glu-Eys-Ala-His-Asp-Gly-GlyArg), ktorá je prítomná na karboxy-terminálovom telopeptide a 1-reťazca kolagénu typu I. Výsledky sú vyjadrené ako % inhibície resorpcie v porovnaní s vehikulovou kontrolnou vzorkou.
Skúška adhézie ľudských osteoklastov
Ľudské osteoklasty sa obohatili a pripravili na sledovanie látok tak, ako je opísané v počiatočných 9 krokoch Skúšky 1. Na objasnenie sú tieto kroky opakované nižšie v tomto dokumente.
• Alikvóty bunkových suspenzií získaných z ľudských osteoklastov sa odobrali z uskladnenia v kvapalnom dusíku, rýchlo sa zahriali na 37 °C a premyli sa x1 v RPMI-1640 médiu pomocou centrifugácie (1000 ot./min., 5 minút pri 4 °C).
• Médium sa odsalo a nahradilo sa myšacou anti-HLA-DR protilátkou, potom sa zriedilo 1:3 s RPML-1640 médiom. Suspenzia sa inkubovala počas 30 minút na ľade a často sa premiešavala.
• Bunky sa premyli x2 so studeným RPMI-1640, po čom nasledovala centrifugácia (1000 ot./min., 5 minút pri 4 °C) a bunky sa potom preniesli do sterilnej 15 ml centrifugačnej skúmavky. Počet mononukleárnych buniek sa spočítal v zlepšenej Neubauerovej počítacej komore.
• Dostatok magnetických perličiek (5 I mononukleárnych buniek), pokrytých s kozím anti-myším IgG (Dynal, Great Neck, NY) sa odobral z ich zásobnej fľaše a umiestnil sa do 5 ml čerstvého média (tieto sa premyli od toxickej azidovej konzervačnej látky). Médium sa odstránilo pomocou imobilizovania perličiek na magnete a nahradilo sa čerstvým médiom.
• Perličky sa zmiešali s bunkami a suspenzia sa inkubovala počas 30 minút na ľade. Suspenzia sa často miešala.
• Bunkami pokryté perličky sa imobilizovali na magnete a zostávajúce bunky (frakcia bohatá na osteoklasty) sa dekantovali do sterilnej 50 ml centrifugačnej skúmavky.
• K bunkami pokrytým perličkám sa pridalo čerstvé médium na uvoľnenie zachytených osteoklastov. Tento premývací proces sa opakoval x10. Bunkami pokryté perličky sa vyhodili.
• Životaschopné osteoklasty sa spočítali v sčítacej komore, za použitia fluoresceíndiacetátu na označenie živých buniek. Na pridanie vzorky do komory sa použila plastová Pasteurova pipeta s veľkým vypúšťacím otvorom.
• Osteoklasty sa peletovali pomocou centrifugácie a hustota sa nastavila na príslušný počet v EMEM médiu (počet osteoklastov je variabilný od tumoru k tumoru), doplnenom s 10 % fetálnym teľacím sérom a 1,7 g/liter hydrogenuhličitanu sodného.
• Osteoklasty získané z osteoklastómu sa predinkubovali počas 30 minút pri 37 °C s testovanou látkou (4 dávky) alebo kontrolnými vzorkami.
• Bunky sa potom naočkovali na plátky pokryté osteopontínom (ľudský alebo potkaní osteopontín, 2,5 ug/ml) a inkubovali sa počas 2 hodín pri 37 °C.
Nezachytené bunky sa odstránili pomocou rázneho premytia plátkov vo fosfátom pufrovanej soľanke a bunky zostávajúce na plátkoch sa fixovali v acetóne.
• Osteoklasty sa vyfarbili na vínan-rezistentnú kyslú fosfatázu (TRAP), selektívny marker pre bunky tohto fenotypu (pozri kroky 15 až 17), a spočítali sa pomocou svetelnej mikroskopie. Výsledky sú vyjadrené ako % inhibície adhézie v porovnaní s vehikulovou kontrolou.
Skúška bunkovej adhézie Bunky a bunkové kultúry
Ľudské embryonálne obličkové bunky (HEK293 bunky) sa získali z ATCC (Katalógové č. CRL 1573). Bunky rástli v Earlovom minimálnom esenciálnom médiu (EMEM) médium obsahovalo Earlove soli, 10 % fetálne hovädzie sérum, 1% hmotnostné glutamínu a 1% hmotnostné zmesi penicilín-streptomycín.
Konštruktory a transfekcie
3,2 kb EcoRI-Kpnl fragment av podjednotky a 2,4 kb Xbal-Xhol fragment β3 subjednotky sa vložili do EcoRI-EcoRV klonujúcich miest pCDN vektora (Aiyar a spol., 1994), ktorý obsahuje CMV promótor a G418 selektovateľný marker pomocou otupenia a ligácie. Pre stabilnú expresiu sa 80x106 HEK293 buniek elektrotransformovalo s αν+β3 konštruktormi (20 gg DNA každej subjednotky) za použitia zariadenia Gen Pulser (Hensley a spol., 1994) a naniesli sa na 100 mm platne (5x105 buniek na platňu). Po 48 hodinách sa rastové médium doplnilo s 450 pg/ml Geneticin (G418 sulfát, GIBCO-BRL, Bethesda, MD). Bunky sa pestovali v selekčnom médiu, kým neboli kolónie dosť veľké na skúšky.
Imunocytochemická analýza transfekovaných buniek
Na určenie toho, či HEK293 transfektanty exprimovali receptor vitronektínu, sa bunky imobilizovali na mikroskopovacích sklíčkach pomocou centrifugácie,
-27fixovali sa v acetóne počas 2 minút pri laboratórnej teplote a sušili sa na vzduchu. Špecifická reaktivita s 23C6 monoklonálnymi protilátkami špecifickými pre ανβ3 komplex sa demonštrovala za použitia štandardného nepriameho imunofluorescenčného spôsobu.
Štúdium adhézie buniek
Corningové 96-kalíškové ELISA platne sa predpokryli počas noci pri 4 °C s 0,1 ml ľudského vitronektínu (0,2 pg/ml v RPMI médiu). V čase experimentu sa platne premyli jeden krát s RPMI médiom a blokovali sa s 3,5 % BSA v RPMI médiu počas 1 hodiny pri laboratórnej teplote. Transfekované 293 bunky sa resuspendovali v RPMI médiu doplnenom s 20 mmol/l Hepes, pH 7,4 a 0,1% BSA pri hustote 0,5x106 buniek/ml. 0,1 ml suspenzie buniek sa pridalo do každého kaliska a inkubovali sa počas 1 hodiny pri 37 °C v prítomnosti alebo neprítomnosti rôznych ανβ3 antagonis-tických látok. Po inkubácii sa pridalo 0,025 ml roztoku 10 % hmotnostných formaldehydu, pH 7,4 a bunky sa fixovali pri laboratórnej teplote počas 10 minút. Platne sa premyli 3 krát s 0,2 ml RPMI média a zachytené bunky sa vyfarbili s 0,1 ml roztoku 0,5 % hmotnostného toluidínovej modrej počas 20 minút pri laboratórnej teplote. Prebytok farbiva sa odstránil pomocou extenzívneho premytia s deionizovanou vodou. Toluidínová modrá včlenená do buniek sa eluovala pomocou pridania 0,1 ml roztoku 50 % hmotnostných etanolu obsahujúceho 50 mmol/l HCI. Adhézia buniek sa kvantifikovala podľa optickej hustoty pri vlnovej dĺžke 600 nm na zariadení na čítanie mikrotitračných platní (Titertek Multiskan MC, Šterling, VA).
Skúška viazania tuhá-fáza ανβ5
Receptor vitronektínu ανβ5 sa čistil z ľudskej placenty. Prípravok receptora sa zriedil s 50 mmol/l Tris-HCI, pH 7,5, 100 mmol/l NaCI, 1 mmol/l CaCI2, 1 mmol/l, MnCI2, 1 mmol/l MgCI2 (pufer A) a ihneď sa pridal do 96-kalíškových ELISA platní pri 0,1 ml na kalíšok. Pridalo sa 0,1 až 0,2 pg ανβ3 na kalíšok. Platne sa inkubovali počas noci pri 4 °C. V čase experimentu sa kalíšky premyli jeden krát s pufrom A a
-28inkubovali sa s 0,1 ml 3,5% hovädzieho sérového albumínu v rovnakom pufri počas 1 hodiny pri laboratórnej teplote. Po inkubácii sa kalíšky úplne odsali a premyli sa dva krát s 0,2 ml pufra A.
Pri [3H]-SK&F-107260 konkurenčnej skúške sa do kalíškov pridali rôzne koncentrácie neoznačenej antagonistickej látky (0,001 až 100 pmol/l), nasledovalo pridanie 5,0 nmol/l [3H]-SK&F-107260. Platne sa inkubovali počas 1 hodiny pri laboratórnej teplote. Po inkubácii sa kalíšky úplne odsali a premyli sa jeden krát s 0,2 ml ľadovo studeného pufra A v usporiadaní kališok po kalisku. Receptory sa solubilizovali s 0,1 ml 1 % SDS a viazaný [3H]-SK&F-107260 sa určil pomocou detekcie kvapalným scintilátorom s pridaním 3 ml roztoku Ready Safe v Beckman LS kvapalnom scintilačnom detektore so 40 % účinnosťou. Nešpecifické viazanie [3H]-SK&F-107260 sa určilo v prítomnosti 2 pmol/l SK&F-107260 a bolo konzistentne menej než 1% z celkového vstupného rádioligandu. Hodnota IC50 (koncentrácia antagonistickej látky na inhibovanie 50% viazania [3H]-SK&F-107260) sa určila pomocou programu nelineárnej metódy najmenších štvorcov na spracovanie kriviek, ktorý sa modifikoval z LUNDON-2 programu. Hodnoty K, (disociačná konštanta antagonistickej látky) sa vypočítali podľa rovnice Chenga a Prusoffa: Kj = IC50(1 + L/Kd), kde L a Kd boli koncentrácia a disociačná konštanta [3H]-SK&F-107260.
Inhibícia RGD-sprostredkovaného GPIIb-llla viazania Čistenie GPIIb-llla
Desať jednotiek starých premytých ľudských krvných doštičiek (získaných od Red Cross) sa lýzovali pomocou jemného premiešavania v roztoku 3 % hmotnostného oktylglukozidu, 20 mmol/l Tris-HCI, pH 7,4, 140 mmol/l NaCI, 2 mmol/l CaCI2 pri 4 °C počas 2 hodín. Lyzát sa centrifugoval pri 100 000 x g počas 1 hodiny. Získaný supernatant sa aplikoval na 5 ml kolónu s granulami lektínsepharose 4B (E.Y. Labs) v rovnováhe s roztokom 20 mmol/l Tris-HCI, pH 7,4, 100 mmol/l NaCI 2 mmol/l CaCI2, 1% oktylglukozidu (pufer A). Po 2 hodinách inkubácie sa kolóna premyla s 50 ml studeného pufra A. Lektínom zachytený GPIIb-llla sa
-29eluoval s pufrom A obsahujúcim 10 % hmotnostných dextrózy. Všetky procedúry sa uskutočnili pri 4 °C. Získané GPIIb-llla mali >95% čistotu, ako vidno z SDS polyakrylamidovej gélovej elektroforézy.
Včlenenie GPIIb-llla do lipozómov.
Zmes fosfatidylserínu (70 % hmotnostných) a fosfatidylcholínu (30 % hmotnostných) (Avanti Polar Lipids) sa vysušili na stenách sklennej skúmavky pod prúdom dusíka. Čistený GPIIb-llla sa zriedil na konečnú koncentráciu 0,5 mg/ml a zmiešal sa s fosfolipidmi v pomere proteín:fosfolipid 1:3 (hmotnostne). Zmes sa resuspendovala a opracovala sa ultrazvukom v ultrazvukovom kúpeli počas 5 minút. Zmes sa potom dialyzovala počas noci za použitia dialyzačných trubičiek na rez molekulovej hmotnosti 12000 až 14000 proti 1000-násobnému prebytku 50 mmol/l Tris-HCI, pH 7,4, 100 mmol/l NaCI, 2 mmol/l CaCI2 (s 2 výmenami). Lipozómy obsahujúce GPIIb-llla sa centrifugovali pri 12000g počas 15 minút a resuspendovali sa v dialyzačnom pufri na konečnú koncentráciu proteínu približne 1 mg/ml. Lipozómy sa uskladnili pri -70 °C, kým neboli potrebné.
Konkurenčné viazanie na GPIIb-llla
Viazanie na fibrinogénový receptor (GPIIb-llla) sa skúšalo pomocou spôsobu nepriameho konkurenčného viazania za použitia [3H]-SK&F-107260 ako ligandu RGD-typu. Skúška viazanie sa uskutočnila v 96-kalíškovej filtračnom platňovom zariadení (Millipore Corporation, Bedford, MA) za použitia 0,22 um hydrofilných duraporových membrán. Kalíšky sa vopred pokryli s 0,2 ml 10 pg/ml polylyzínu (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.) pri laboratórnej teplote počas 1 hodiny na blokovanie nešpecifického viazanie. Do kalíškov sa pridali rôzne koncentrácie neoznačených benzazepínov pri štyroch opakovaniach. [3H]-SK&F107260 sa aplikoval do každého kaliska pri konečnej koncentrácii 4,5 nmol/l, po čom nasledovalo pridanie 1 μρ čistených doštičiek GPIIb-llla-obsahujúcich lipozómov. Zmesi sa inkubovali počas 1 hodiny pri laboratórnej teplote. GPIIb-llla viazaný [3H]-SK&F-107260 sa separoval od neviazaného pomocou filtrácie za
-30použitia zariadenia na filtráciu Millipore, po čom nasledovalo premytie s ľadovostudeným pufrom (2 krát, každý 0,2 ml). Viazaná rádioaktivita zostávajúca na filtroch sa merala v 1,5 ml Ready Solve (Beckman Instruments, Fullerton, CA) v zariadení Beckman Liquid Scintillation Counter (Model LS6800) so 40 % účinnosťou. Nešpecifické viazanie sa určilo v prítomnosti 2 gmol/l neoznačeného SK&F-107260 a bolo konzistentne menej ako 0,14 % z celkovej rádioaktivity pridanej do vzoriek. Všetky údajové body sú priemerom zo štyroch opakovaných stanovení.
Údaje o konkurenčnom viazaní sa analyzovali pomocou programu nelineárnej metódy najmenších štvorcov na spracovanie kriviek. Tento spôsob poskytuje hodnoty IC50 antagonistických látok (koncentrácia antagonistickej látky, ktorá inhibuje špecifické viazanie [3H]-SK&F-107260 na 50 % pri rovnováhe). Hodnota IC50 je vo vzťahu s rovnovážnou disociačnou konštantou (K.) antagonistickej látky založenom na Chengovej a Ptusoffovej rovnici: K, = IC50(1 + L/Kd), kde L je koncentrácia [3H]-SK&F-107260 použitá v skúške konkurenčného viazania (4,5 nmol/l) a Kd je disociačná konštanta [3H]-SK&F-107260, ktorá je 4,5 nmol/l, podľa stanovenia pomocou Scatchardovej analýzy.
Výhodné látky podľa tohto vynálezu majú afinitu pre receptor vitronektínu v pomere ku fibrinogénovému receptoru vyššiu než 10:1, najvýhodnejšie látky majú a pomer aktivity väčší ako 100:1.
Účinnosť látky podľa tohto vynálezu samotnej alebo v kombinácii s antineoplastickým činidlom sa môže určiť za použitia viacerých transplantovateľných myších tumorových modeloch. Pozri U.S. patenty č.. 5,004,758 a 5,633,016 pre podrobnosti týchto modelov.
Príklady, ktoré nasledujú, nie sú zamýšľané žiadnym spôsobom na obmedzenie rozsahu tohto vynálezu, ale sú poskytnuté na ilustrovanie ako vyrobiť a používať látky podľa tohto vynálezu. Pre odborníka z tejto oblasti budú jednoducho zrejmé mnohé iné uskutočnenia vynálezu.
-31 Príklady uskutočnenia vynálezu
Všeobecne
Spektrá nukleárnej magnetickej rezonancie boli získané pri použití 250 alebo 400 MHz, spektrometra Bruker AM 250 alebo Bruker AC 400. CDCI3 je deuteriovaný chloroform, DMSO-d6 je hexadeuteriovaný dimetylsulfoxid, a CD3OD je tetradeuteriovaný metanol. Chemické posuny sú uvedené v jednotkách ppm (časti z milióna) (δ) vzhľadom na interný štandard tetrametylsilán. Skratky pre NMR údaje sú nasledujúce: s = singlet, d = dublet, t = triplet, q = kvartet, m = multiplet, dd = dublet dubletov, dt = dublet tripletov, app = zdanlivý, br = široký. J označuje NMR interakčnú konštantu meranú v Hertzoch. Kontinuálne vlnové infračervené (IR) spektrá boli merané na infračervenom spektrometri PerkinElmer 683 a Fourierove transformačné infračervené (FTIR) spektrá boli merané na Nicolet Impact 400 D infračervenom spektrometri. IR a FTIR spektrá boli namerané v transmisnom móde a polohy pásov sú uvedené vo vlnočtoch (cm'1). Hmotnostné spektrá sa snímali na zariadeniach buď VG 70 FE, PE Syx API III, alebo VG ZAB HF, za použitia ionizačných techník bombardovania rýchlymi atómami (FAB) alebo elektrospreja (ES). Elementárne analýzy sa získali za použitia elementárneho analyzátora Perkin-Elmer 240C. Teploty topenia sa merali na prístroji na meranie teplôt topenia Thomas-Hoover a sú nekorigované. Všetky teploty sú uvedené v stupňoch Celzia.
Na tenkovrstvovú chromatografiu sa použili tenkovrstvové platne Analtech Silica Gel GF a E. Merck Silica Gel 60 F-254. Aj rýchla aj gravitačná chromatografia sa uskutočnili na silikágeli E. Merck Kieselgel 60 (230 až 400 mesh). Analytická a preparatívna HPLC sa uskutočnili na chromatografoch Rainin alebo Beckman. ODS zodpovedá oktadecylsilyl-derivatizovanému silikagélovému chromatografickému nosiču. 5 μ Apex-ODS označuje oktadecylsilyl-derivatizovaný silikagélový chromatografický nosič, ktorý má nominálnu veľkosť častíc 5 μ, vyrobený Jones Chromatografy, Littleton, Colorado. YMC ODS-AQ® je ODS chromatografický nosič a je registrovanou obchodnou značkou YMC Co. Ltd., Kyoto, Japonsko. PRP-1® je
-32polymérny (styrén-divinylbenzénový) chromatografický nosič, a je registrovanou obchodnou značkou Hamilton Co., Reno, Nevada. Celíte® je filtračný prostriedok zložený z kyselinou premytého diatomického kremeňa, a je registrovanou obchodnou značkou Manville Corp., Denver, Colorado.
Príprava 1
Príprava Etyl-(±)-10,11 -dihydro-3-karboxy-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-acetátu
a) 3-benzyl-4-(trifluórmetánsulfonyloxy)anizol
Anhydrid kyseliny trifluórmetánsulfónovej (10,0 ml, 60 mmol) sa pridal počas 3 minút k roztoku 2-benzyl-4-metoxyfenolu (10,71 g, 50 mmol; pripravený podľa J. Am. Chem. Soc. 1949, 71, 64) a bezvodého 2,6-lutidínu (12,0 ml, 100 mmol) v bezvodom CH2CI2 (250 ml) pri -78 °C pod argónom. Reakčná zmes sa miešala pri -78 °C počas 0,5 hodiny, potom sa zahriala na laboratórnu teplotu. Po 1 hodine sa reakčná zmes zriedila hexánom (250 ml) a premyla sa postupne s 1,0 mol/l HCI (2 x 100 ml), 1,0 mol/l NaOH (2 x 50 ml), H2O (100 ml) a soľankou (50 ml). Sušenie (Na2SO4), skoncentrovanie a chromatografia na silikagéli (10 % hmotnostných EtOAc/hexány) poskytli látku z názvu tohto odstavca ako svetlo žltú tuhú látku (16,65 g, 96 %): TLC Rf 0,51 (10 % hmotnostných EtOAc/hexány); 1H NMR (250 MHz, CDCI3) δ 7,10 - 7,40 (m, 6H), 6,77 (dd, J = 9,0, 3,1 Hz, 1H), 6,66 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 4,03 (s, 2H), 3,73 (s, 3H); FTIR (CCI4) 1492, 1423, 1405, 1249, 1216, 1161, 1144, 1039, 869 cm'1; MS (ES) m/e 369 (M+Na)+, 364,0 (M+NH4)+, ;347,0 (M+H)+.
b) 4-alyl-3-benzylanizol
LiCI (3,08 g, 72,8 mmol) v nádobe s okrúhlym dnom sa vysušil nad plameňom za vysokého vákua a systém sa nechal ochladiť na laboratórnu teplotu pod argónom. Pridal sa 3-benzyl-4-(trfluórmetánsulfonyloxy)anizol (21,0 g, 60,6 mmol), bis(trifenylfosfín)paládium(ll)chlorid (2,13 g, 3,0 mmol), bezvodý DMF (150 ml) a alyltributylcín (22,6 ml, 72,8 mmol) a zmes sa premyla s argónom tromi cyklami vákum/argón. Zmes sa zahriala v olejovom kúpeli nastavenom na 95 °C a
-33poskytla žltý homogénny roztok. Po 1,5 hodine sa tmavá zmes skoncentrovala na rotačnej odparovačke (vysoké vákum) a zvyšok sa znovu skoncentroval z xylénu. Výsledný zvyšok sa preniesol do Et2O (120 ml) a miešal sa intenzívne s roztokom 10 % hmotnostných KF (120 ml) počas 0,5 hodiny. Vrstvy sa oddelili a vodná vrstva sa extrahovala s Et2O (2 x 120 ml). Kombinované organické vrstvy sa prefiltrovali cez Celíte®, aby sa odstránili nerozpustné tuhé látky a filtrát sa premyl postupne s H2O (60 ml) a soľankou (60 ml). Sušenie (MgSOJ a skoncentrovanie zanechalo zakalený žltý olej. Chromatografia (silikagél, 5 % hmotnostných EtOAc/hexány) poskytla látku z názvu tohto odstavca ako svetlo žltý olej (14,21 g, 98 %): TLC Rf (5 % hmotnostných EtOAc/hexány) 0,51; 1H NMR (250 MHz, CDCI3) δ 7,03 - 7,31 (m, 6H), 6,74 (dd, J = 8,3, 2,7 Hz, 1H), 6,66 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 5,79 - 5,98 (m, 1H), 4,89 - 5,07 (m, 2H), 3,97 (s, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,21 - 3,33 (m, 2H); FTIR (CCI4) 1610, 1496, 1256, 1046, 914 cm1; MS (ES) m/e 239,2 (M+H)+.
c) Kyselina 2-benzyl-4-metoxyfenyloctová
Roztok H5IO6 (23,83 g, 104,5 mmol) v H2O (56 ml) sa pridal k roztoku 4-alyl3-benzylanizolu (5,30 g, 22,24 mmol) v CCI4 (28 ml) a CH3CN (28 ml), a dobre premiešavaná zmes sa opatrne ochladila na 0 °C. Pridal sa RuCI3 (231 mg, 1,11 mmol) a reakčná zmes sa intenzívne miešala pri 0 °C počas 4 hodín, potom pri laboratórnej teplote počas 45 minút. Zmes sa prefiltrovala cez Celíte® a filtračná vrstva sa premyla s CH2CI2 (120 ml), potom s H2O (120 ml). Vrstvy sa oddelili a vodná vrstva sa extrahovala s CH2CI2 (3 x 120 ml). Sušenie (Na2SO4) a skoncentrovanie dalo hnedý olej. Olej sa rozdelil medzi Et2O (90 ml) a 0,25 mol/l NaOH (90 ml) a vrstvy sa oddelili. Et2O vrstva sa extrahovala s 0,25 mol/l NaOH (2 x 10 ml) a kombinované vodné vrstvy sa okyslili (pH 2) koncentrovanou HCI. CH2CI2 extrakcia, sušenie (Na2SO4) a skoncentrovanie poskytlo látku z názvu tohto odstavca ako žltý olej, ktorý stuhol na žltú tuhú látku (4,19 g, 74 %): 1H NMR (250 MHz, CDCI3) δ 7,05 - 7,35 (m, 6H), 6,77 (dd, J = 8,3, 2,7 Hz, 1H), 6,71 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,00 (s, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,54 (s, 2H); FTIR (CCI4) 2300 - 3500 (široký), 1710, 1611, 1502, 1496, 1285, 1257, 1045 cm’1; MS (ES) m/e 279,0 (M+Na)+, 274,0
-34(Μ+ΝΗ4)+, 257,0 (Μ+Η)+.
d) 3-metoxy-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10(11Η)-όη
Jemná prášková kyselina 2-benzyl-4-metoxyfenyloctovej (3,26 g, 12,72 mmol) sa pridala k silne premiešavanej kyseline polyfosforečnej (165 g) pri 100 až 110 °C. Po 15 minútach sa reakčná zmes vyliala na ľad (330 g). Pridal sa Et2O (330 ml) a zmes sa intenzívne miešala počas 15 minút. Vrstvy sa oddelili a vodná vrstva sa extrahovala s Et2O (330 ml). Kombinované organické vrstvy sa premyli s roztokom 5 % hmotnostných NaHCO3(2 x 80 ml), potom soľankou (80 ml), vysušili sa (MgSO4) a skoncentrovali. Zvyšok sa znovu skoncentroval z toluénu, potom sa chromatogratoval (silikagél, 20 % hmotnostných EtOAc/hexány). Látka z názvu sa získala ako žltá tuhá látka (1,44 g, 48 %): TLC Rf (20 % hmotnostných EtOAc/hexány) 0,46; 1H NMR (250 MHz, CDCI3) δ 8,07 - 8,15 (m, 1H), 7,39 - 7,49 (m, 1H), 7,25 - 7,48 (m, 2H), 7,19 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,71 (dd, J = 8,3, 2,6 Hz, 1H), 4,21 (s, 2H), 4,11 (s, 2H), 3,77 (s, 3H); FTIR (CCI4) 1680, 1501, 1282, 1270 cm·1; MS (ES) m/e 261 (M+Na)+, 256,0 (M+NH4)+, 239,0 (M+H)+.
e) Etyl-(±)-10,11-dihydro-10-hydroxy-3-metoxy-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10acetát
Bezvodý EtOAc (0,58 ml, 6,6 mmol) sa pridal po kvapkách k roztoku lítiumbis(trimetylsilyl)amidu (1,0 mol v THF, 6 ml, 6 mmol) v suchom THF (24 ml) v plameňom-sušenej banke pri -78 °C pod argónom. Žltý roztok sa miešal pri -78 °C počas 0,5 hodiny, potom sa počas 3 minút po kvapkách pridal roztok 3-metoxy-5Hdibenzo[a,d]cykloheptén-10(11H)-ónu (715 mg, 3 mmol) v suchom THF (3 ml). Ďalší suchý THF (0,4 ml) sa použil na prenos. Po 0,5 hodine pri -78 °C sa reakcia zastavila nasýteným NH4CI (15 ml), zmes sa zohriala na laboratórnu teplotu a extrahovala sa s EtOAc (2 x 30 ml). Sušenie (MgSO4), skoncentrovanie a chromatografia (silikagél, 10 % hmotnostných EtOAc/hexány (400 ml), potom 20 % hmotnostných EtOAc/hexány) poskytlo regenerovaný 3-metoxy-5H-dibenzo[a,dJcykloheptén-10(11H)-ón (305,4 mg, 43%) ako žltú tuhú látku, potom nasledovala
-35látka z názvu tohto odstavca ako svetlo žltý olej (531,9 mg, 54%); TLC Rf0,37 (20 % hmotnostných EtOAc/hexány); 1H NMR (250 MHz, CDCI3) δ 7,63 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 7,00 - 7,30 (m, 4H), 6,80 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,69 (dd, J = 8,2, 2,6 Hz, 1H), 3,95 - 4,35 (m, 2H), 4,07 (s, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,68 (s, 1H), 3,64 (d, J = 14,2 Hz, 1H), 3,35 (d, J = 14,2 Hz, 1 H), 2,79 (d, J = 16,0 Hz, 1H), 2,66 (d, J = 16,0 Hz, 1 H), 1,22 (t, J =7,2 Hz, 3H); FTIR (CCI4) 3580 (ostrý), 3509 (široký), 1735, 1715, 1503, 1261, 1198, 1156, 1044 cm'1; MS (ES) m/e 675,2 (2M+Na)+, 653,2 (2M+H)+-
f) Etyl-(±)-10,11-dihydro-3-metoxy-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-acetát
K roztoku etyl-(±)-10,11-dihydro-10-hydroxy-3-metoxy-5H-dibenzo[a,d]-cykloheptén-10-acetátu (741,1 mg, 2,27 mmol) sa pridalo 10 % Pd/C (242 mg, 0,23 mmol) a koncentrovaná HCI (0,19 ml, 2,27 mmol) v ľadovej AcOH (23 ml) a zmes sa trepala v Parrovom prístroji pri laboratórnej teplote pod H2 ( 345 kPa (50 psi)). Po 6 hodinách sa reakčná zmes prefiltrovala cez Celíte® a filtračná vrstva sa premyla s EtOAc. Filtrát sa skoncentroval a zvyšok sa znovu skoncentroval z toluénu. Výsledný slabo žltý olejový zvyšok sa chromatografoval (silikagél, 20 % hmotnostných EtOAc/hexány) a poskytol látku z názvu tohto odstavca ako bezfarebný olej (643,6 mg, 91 %): TLC Rf 0,57 (20 % hmotnostných EtOAc/hexány); 1H NMR (250 MHz, CDCI3) δ 7,05 - 7,22 (m, 4H), 7,01 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,76 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 6,67 (dd, J = 8,2, 2,7 Hz, 1H), 4,30 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 4,11 -4,25 (m, 2H), 3,85 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 3,70-3,90 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,31 (dd, J = 15,0, 4,1 Hz, 1H), 2,93 (dd, J = 15,0, 9,2 Hz, 1H), 2,64 (dd, J = 15,6, 5,0 Hz, 1H), 2,52 (dd, J = 15,6, 9,3 Hz, 1H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3H); FTIR (CCI4) 1734, 1611, 1504, 1285, 1263, 1155, 1044 cm’1; MS(ES) m/e 333,0 (M+Na)+, 328,0 (M+NH4)+, 311,0 (M+H)+, 265,0 (M+H-EtOH)+.
g) Etyl-(±)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-acetát
Bezvodý AICI3 (1,38 g, 10,35 mmol) sa naraz pridal k roztoku etyl-(±)-10,11 dihydro-3-metoxy-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-acetátu (643,6 mg, 2,07 mmol) v bezvodom CH2CI2 (21 ml) pri 0 °C pod argónom. Žltý roztok sa zohrial na
-36laboratórnu teplotu a miešal sa počas 3 hodín, potom sa ochladil na 0 °C a reakcia sa zastavila pridaním studenej 3 mol/l HCI (10 ml). Vrstvy sa oddelili a vodná vrstva sa extrahovala s CH2CI2. Kombinované organické vrstvy sa vysušili (MgSO4) a skoncentrovali. Chromatografia na silikagéli (25 % hmotnostných EtOAc/hexány) poskytla látku z názvu tohto odstavca ako skoro bezfarebný olej (611,7 mg, 100%): TLC Rf 0,26 (20 % hmotnostných EtOAc/hexány); 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 7,03 - 7,22 (m, 4H), 6,93 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,69 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,58 (dd, J = 8,1, 2,6 Hz, 1H), 5,00 (s, 1H), 4,25 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 4,11 -4,25 (m, 2H), 3,73-3,88 (m, 1H), 3,79 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 3,28 (dd, J = 15,0, 4,1 Hz, 1H), 2,91 (dd, J = 15,0, 9,3 Hz, 1H), 2,65 (dd, J = 15,6, 4,9 Hz, 1H), 2,53 (dd, J = 15,6, 9,5 Hz, 1H), 1,27 (t, J = 7,2 Hz, 3H); FTIR (CCI4) 3611 (ostrý), 3447 (široký), 1734, 1504, 1291, 1272, 1176,1152 cm'1; MS (ES) m/e 314,2 (M+NH4)+, 297,2 (M+H)+.
h) Etyl-(±)-10,11-dihydro-3-(trifluórmetánsulfonyloxy)-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén10-acetát
Anhydrid kyseliny trifluórmetánsulfónovej (0,45 ml, 2,68 mmol) sa po kvapkách pridal k roztoku etyl-(±)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-acetá-tu (611,7 mg, 2,06 mmol) a 2,6-lutidínu (0,48 ml, 4,12 mmol) v bezvodom CH2CI2 (10,3 ml) pri -78 °C pod argónom. Po 0,5 hodine sa reakčná zmes zahriala na laboratórnu teplotu a miešala sa počas 1 hodiny. Žltý roztok sa zriedil s Et2O (50 ml) a premyl sa postupne s 1,0 mol/l HCI (5 ml), 5 % NaHCO3 (5 ml) a soľankou (5 ml). Sušenie (MgSO4), skoncentrovanie a chromatografia na silikagéli (20 % hmotnostných EtOAc/hexány) poskytlo látku z názvu tohto odstavca ako bezfarebný olej (808,9 mg, 92%): TLC Rf (20 % hmotnostných EtOAc/hexány) 0,58; 1H NMR (250 MHz, CDCI3) δ 6,98 - 7,30 (m, 7H), 4,35 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 4,19 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,91 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 3,78 - 3,95 (m, 1H), 3,37 (dd, J = 15,2, 4,1 Hz, 1H), 3,02 (dd, J = 15,2, 9,6 Hz, 1H), 2,70 (dd, J = 15,8, 4,8 Hz, 1H), 2,53 (dd, J = 15,8, 9,6 Hz, 1H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3H); FTIR (CCI4) 1735, 1493, 1427, 1250, 1215, 1144, 961, 856 cm’1; MS (ES) m/e 451,1 (M+Na)+, 446,2 (M+NH4)+, 429,2 (M+H)+.
i) Etyl-(±)-10,11 -dihydro-3-karboxy-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-acetát
Zmes Etyl-(±)-10,11-dihydro-3-(trifluórmetánsulfonyloxy)-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-acetátu (808,9 mg, 1,89 mmol), KOAc (742 mg, 7,56 mmol), Pd(OAc)2 (21,2 mg, 0,095 mmol), 1,1'-bis(difenylfosfíno)ferocénu (210 mg, 0,38 mmol) a bezvodého DMSO (11 ml) sa premyla s oxidom uhoľnatým (tri premývacie cykly vákuum/CO, nasledované prebublávaním zmesi s CO počas 5 minút), potom sa miešala pod zvonom naplneným s CO v olejovom kúpeli udržiavanom pri 70 °C. Po 3,5 hodine sa reakčná zmes zriedila s H2O (11 ml), ochladila sa na 0 °C a okyslila s 1,0 mol/l HCI (asi 8 ml). CH2CI2 extrakcia (3 x 30 ml), sušenie (Na2SO4), koncentrácia a rekoncentrácia z toluénu zanechali červeno-oranžovú kvapalinu (2 až 3 ml). Chromatografia (silikagél, 3:2:0,1 EtOAc/toluén/AcOH; zmiešané frakcie znovu s 1:1:0,1 EtOAc/toluén/AcOH) poskytla látku z názvu tohto odstavca (581,9 mg, 95%) ako viskózny žltý olej, ktorý čiastočne kryštalizoval vo vysokom vákuu pri 40 °C: TLC Rf (3:2:0,1 EtOAc/toluén/AcOH) 0,60; 1H NMR (250MHz, CDCI3) δ 7,95 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 7,87 (dd, J = 7,8, 1,5 Hz, 1 H), 7,00 - 7,35 (m, 5H), 4,40 (d, J =
15.2 Hz, 1H), 4,19 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,97 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 3,82 - 4,00 (m, 1H), 3,43 (dd, J = 15,3, 4,0 Hz, 1H), 3,07 (dd, J = 15,3, 9,5 Hz, 1H), 2,69 (dd, J = 15,8, 4,8 Hz, 1H), 2,53 (dd, J = 15,8, 9,5 Hz, 1H), 1,28 (t, J = 7,1 Hz, 3H); FTIR (CCI4) 2357 - 3378 (široký), 1735, 1692, 1280 cm’1; MS (ES) m/e 342,2 (M+NH4)+,
325.2 (M+H)+, 307,2 (M+H-H2O)+.
Príprava 2
Príprava etyl-2-karboxy-10,11-dihydro-5H-dibenzo[a,d]cykloheptenyl-10-acetátu
a) Metyl-2-benzoyl-5-metoxyfenylacetát
Metyl-3-metoxy-fenylacetát sa opracoval s benzoylchloridom a chloridom hlinitým, ako je opísané v J. Chem. Soc., Perkin Trans 1, 1991, 171 a poskytol látku z názvu tohto odstavca.
b) Metyl-2-benzyl-5-metoxyfenylacetát
Látka z Prípravy 2(a) sa opracovala s bórhydridom sodným a kyselinou
-38trifluóroctovou v dichlórmetáne podľa všeobecného postupu zo Synthesis 1978, 763 a poskytla látku z názvu tohto odstavca.
c) Kyselina 2-benzyl-5-metoxyfenyloctová
Látka z Prípravy 2(b) sa opracovala s vodným roztokom hydroxidu sodného a metanolom a miešala sa. Zmes sa skoncentrovala a opracovala so zriedenou kyselinou chlorovodíkovou a poskytla látku z názvu tohto odstavca.
d) 5,11-dihydro-2-metoxy-10H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-ón
Látka z Prípravy 2(c) sa pridala k zmesi kyseliny fosforečnej a oxidu fosforečného miešanej a zahrievanej na 80 °C podľa všeobecného postupu US patentu 3,567,730 a poskytla látku z názvu tohto odstavca.
e) 5,11-dihydro-2-hydroxy-10H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-ón
Látka z Prípravy 2(d) sa opracovala s etántiolom a chloridom hlinitým podľa všeobecného postupu z Tetrahedron. Letters 1978, 5211 a poskytla látku z názvu tohto odstavca.
f) 5,11-dihydro-2-(trifluórmetánsulfonyl)oxy-10H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-ón
Látka z Prípravy 2(e) sa opracovala s anhydridom kyseliny trifluórmetánsulfónovej podľa všeobecného postupu z J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1987, 904 a poskytla látku z názvu tohto odstavca.
g) 5,11-dihydro-2-metoxykarbonyl-10H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-ón
Látka z Prípravy 2(f) sa opracovala s oxidom uhoľnatým, metanolom, octanom paladnatým a 1,3-bis(difenylfosíno)propánom v dimetylsulfoxide podľa všeobecného postupu z J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1987, 904 a poskytla látku z názvu tohto odstavca.
h) 5,11-dihydro-2-karboxy-10H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-ón
Látka z Prípravy 2(g) sa miešala so zriedeným vodným roztokom hydroxidu
-39sodného. Zmes sa opracovala so zriedenou kyselinou chlorovodíkovou a poskytla látku z názvu tohto odstavca.
i) 5,11-dihydro-2-terc-aleoxykarbonyl-10H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-ón
Látka z Prípravy 2(h) sa opracovala s Ν,Ν-dimetylformamid-di-tercbutylacetálom podľa všeobecného postupu z Synthesis 1983, 2, 135 a poskytla látku z názvu tohto odstavca.
j) Etyl-2-terc-aleoxykarbonyl-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-acetát
Látka z Prípravy 2(i) sa opracovala s práškovým zinkom a etylbrómacetátom podľa všeobecného postupu z Org. Reactions 1947, 1, 1 a J. Am. Chem. Soc. 1938, 60, 2947 a poskytla látku z názvu tohto odstavca.
k) Etyl-2-karboxy-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-acetát
Látka z Prípravy 2(j) sa opracovala s kyselinou trifluóroctovou v dichlórmetáne a miešala sa. Zmes sa skoncentrovala a poskytla látku z názvu tohto odstavca.
Príprava 3
Príprava dihydrochloridu 2-[(2-aminoetyl)amino]pyridínu
a) Mono-Boc-1,2-etyléndiamín
Roztok di-terc-butyl-hydrogenuhličitanu (10,91 g, 50 mmol) v CH2CI2(50 ml) sa pridal po kvapkách počas 30 minút k intenzívne miešanému roztoku 1,2etyléndiamínu (33 ml, 500 mmol) v CH2CI2 (250 ml) pri 0 °C pod argónom. Počas pridávania sa separovala zrazenina. Keď bolo pridávanie skončené reakčná zmes sa zohriala na laboratórnu teplotu, miešala sa počas 1 hodiny a skoncentrovala sa na rotačnej odparovačke. Zvyšok sa preniesol do H2O (100 ml) a prefiltroval sa, aby sa odstránilo malé množstvo nerozpustného materiálu. Filtrát sa extrahoval s CH2CI2 (3 x 100 ml) a kombinované organické fázy sa vysušili (MgSO4) a skoncentrovaním poskytli látku z názvu tohto odstavca (6,00 g, 75 %) ako zakalenú
-40kvapalinu: 1H NMR (250, CDCIJ δ 4,75 - 5,00 (m, 1H), 3,05 - 3,25 (m, 2H), 2,65 -
2.85 (m, 2H), 1,46 (s, 9 H), 1,12 (široký s, 2H).
b) 2-[[2-(Boc-amino)etyl]amino]pyridín-N-oxid
Zmes mono-Boc-1,2-etyléndiamínu (5,83 g, 36,39 mmol), hydrochloridu 2chlórpyridín-N-oxidu (7,25 g, 43,67 mmol), NaHCO3 (15,29 g, 182 mmol) a tercamylalkoholu (36 ml) sa zahrievala pri teplote refluxu. Po 47 hodinách sa tmavo hnedá zmes ochladila, zriedila sa s CH2CI2(100 ml) a prefiltrovala odsávaním, aby sa odstránil nerozpustný materiál. Filtrát sa skoncentroval a rekoncentroval z toluénu. Chromatografia na silikagéli (10 % hmotnostných MeOH/CHCI3) poskytla nečistú látku z názvu tohto odstavca (8,23 g, 89 %) ako žltú tuhú látku, ktorá sa použila bez ďalšieho čistenia: TLC (10 % hmotnostných MeOH/CHCI3) Rf 0,42; 1H NMR (250, CDCI3) δ 8,16 (dd, J = 6,5, 1,3 Hz, 1H), 7,05 - 7,30 (m, 2H), 6,68 (široký d, J = 8,6 Hz, 1H), 6,50 - 6,65 (m, 1 H), 5,70-5,95 (m, 1 H), 3,25 - 3,60 (m, 4H), 1,44 (s, 9H); MS (ES) m/e 254 (M+H)+
c) 2-[[2-(Boc-amino)etyl]amino]pyridín % Pd/C (106,4 mg, 0,10 mmol) sa pridalo k roztoku 2-[[2-(boc-amino)etyl-(amino]pyridín-N-oxidu (126,7 mg, 0,5 mmol) a cyklohexénu (0,25 ml, 0,25 mmol) v absolútnom EtOH (5 ml) a zmes sa zahrievala pri teplote refluxu. Po 16 hodinách sa reakčná zmes prefiltrovala cez Celíte® a filtrát sa skoncentroval. Zvyšok sa spojil so zvyškom získaným z inej oddelenej prípravy (0,5 mmol rozsah) a spojené materiály sa čistili chromatografiou na silikagéli (5 % hmotnostných MeOH/CHCI3). Látka z názvu tohto odstavca (148,4 mg, 63% založených na 1 mmol 2-[[2-(Boc-amino)etyl-(amino]pyridín-N-oxidu sa získala ako žltý olej: TLC (5 % hmotnostných MeOH/CHCI3) Rf0,43; 1H NMR (400, CDCI3) δ 8,05 - 8,12 (m, 1H), 7,37-7,46 (m, 1H), 6,53-6,61 (m, 1H),6,41 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 5,12 (široký s, 1H),
4.86 (široký s, 1H), 3,26 - 3,51 (m, 4H), 1,44 (s, 9 H); MS (ES) m/e 238 (M+H)+.
d) Dihydrochlorid 2-[(2-aminoetyl)amino]pyridínu mol/l HCI v dioxáne (3,2 ml) sa pridala v prúde k roztoku 2-[[2-(Bocamino)etyl]amino]pyridínu (148,4 mg, 0,63 mmol) v bezvodom CH2CI2(3,2 ml) pri 0 °C, potom sa reakčná zmes zohriala na laboratórnu teplotu. Po 2 hodinách sa zmes prefiltrovala odsávaním, čím sa získala vyzrážaná tuhá látka, ktorá sa premyla s bezvodým Et2O a vysušením poskytla látku z názvu tohto odstavca (132,8 mg, kvantitatívne) ako žltú tuhú látku: 1H NMR (400, CD3OD) δ 7,99 - 8,07 (m, 1H), 7,92 - 7,98 (m, 1H), 7,19 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 6,98 - 7,04 (m, 1H), 3,76 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 3,27 (t, J = 6,2 Hz, 2 hodiny, čiastočne zastretý zvyškovým signálom rozpúšťadla); MS (ES) m/e 138 (M+H)+.
Príprava 4
Príprava 2-[(3-hydroxy-1-propyl)amino]pyridín-N-oxidu
a) 2-[(3-hydroxy-1 -propyl)amino]pyridín-N-oxid
Zmes 2-chlórpyridín-N-oxidu (16,6 g, 0,1 mol), 3-amino-1-propanolu (15,3 ml, 0,2 mol), NaHCO3(42 g, 0,5 mol) a terc-amylalkoholu (100 ml) sa zahrievala pri teplote refluxu. Po 21 hodinách sa reakčná zmes ochladila, zriedila s CH2CI2 (300 ml) a prefiltrovala odsávaním, čím sa získali nerozpustné materiály. Filtrát sa skoncentroval a rekoncentroval z toluénu a poskytol žltý olej. Chromatografia na silikagéli (20 % hmotnostných MeOH/CHCI3) dala látku z názvu tohto odstavca (15,62 g, 93%) ako žltú tuhú látku: TLC (20 % hmotnostných MeOH/CHCI3) Rf 0,48; 1H NMR (250, CDCI3) δ 8,07 (dd, J = 6,6, 1,2 Hz, 1H), 7,34 (široký t, 1H), 7,10 7,30 (m, 1H), 6,64 (dd, J = 8,5, 1,4 Hz, 1H), 6,40-6,60 (m, 1H), 4,49 (široký s, 1H), 3,65 - 3,90 (m, 2H), 3,35 - 3,60 (m, 2H), 1,75 - 2,00 (m, 2H); MS (ES) m/e 169 (M+H)+.
Príprava 5 Príprava 2-[(3-hydroxy-1 -propyl)amino]-4-nitropyridín-N-oxidu
a) 2-[(3-hydroxy-1-propyl)amino]-4-nitropyridín-N-oxid
Podľa postupu v Príprave 12, s výnimkou nahradenia 2-chlór-4-nitropyridínN-oxidu (pozri Jain, P. C.; Chatterjee, S. K.; Anand, N. Indián Journal of Chemisrry 1966, 403) hydrochloridom 2-chlóropyridín-N-oxidu sa pripravila látka z názvu tohto odstavca ako oranžová tuhá látka: MS (ES) m/e 214,2 (M+H)+.
Príprava 6
Príprava 2-[(3-hydroxy-1 -propyl)amino]-4-metylpyridín-N-oxidu
a) 2-[(3-hydroxy-1-propyl)amino]-4-metylpyridín-N-oxid
Podľa postupu v Príprave 12, s výnimkou nahradenia 2-chlór-4-metylpyridín-N-oxidu (pozri Brown, E. V. J. Amer. Chem. Soc. 1957, 79, 3565) hydrochloridom 2-chlóropyridín-N-oxidu sa pripravila látka z názvu tohto odstavca ako bezfarebná tuhá látka: MS (ES) m/e 183 (M+H)+.
Príprava 7
Príprava 2-(etylamino)-6-pyridyletanolu
a) 2-(N-Boc-amino)-6-pikolín
K premiešavanému roztoku 2-amino-6-pikolínu (4,33 g, 40 mmol), Et3N (6,2 ml, 40 mmol) a CH2CI2 (50 ml) pri 0 °C sa pridal di-terc-butylhydrogenuhličitan (9,6 g, 44 mmol). Po miešaní pri laboratórnej teplote počas noci sa reakčná zmes skoncentrovala vo vákuu, zriedila sa H2O a extrahovala sa s CH2CI2 (2 x 50 ml). Sušenie (MgSOJ a skoncentrovanie poskytlo látku z názvu tohto odstavca ako bezfarebný olej: MS (ES) m/e 209 (M+H)+.
b) 2-(N-Boc-N-etylamino)-6-pikolín
K suspenzii NaH (disperzia 60 % hmotnostných v minerálnom oleji, 1,15 g, 29,5 mmol) v DMF (50 ml) pri 0 °C sa pridal roztok 2-(N-Boc-amino)-6-pikolínu v DMF (30 ml). Reakčná zmes sa miešala pri 0 °C počas 15 minút; potom sa pridal etyljodid (4,6 g, 30 mmol). Reakčná zmes sa miešala pri laboratórnej teplote počas noci; potom sa skoncentrovala vo vákuu. Zvyšok sa zriedil s H2O a extrahoval sa s
-43CH2CI2 (3 x 50 ml). Sušenie (MgSO4), skoncentrovanie a chromatografia na silikagéli (20 % hmotnostných EtOAc/hexány) poskytli látku z názvu tohto odstavca ako bezfarebný olej: MS (ES) m/e 237 (M+H)+.
c) Etyl-2-(N-Boc-N-etylamino)-6-pyridylacetát
LDA (0,018 mol) sa pripravila v THF (30 ml), ochladila sa na -78 °C a pridal sa 2-(N-Boc-N-etylamino)-6-pikolín (3,5 g, 15 mmol), čím sa vytvoril sýto červený roztok. Po 15 minútach sa pridal dietyluhličitan (2,2 ml, 17,9 mmol), burgundovosfarbený roztok sa miešal pri -78 °C počas ďalších 15 minút, potom sa reakcia zastavila s nasýteným NH4CI. Zmes sa zohriala na laboratórnu teplotu a extrahovala sa s EtOAc (3x30 ml). Spojené organické vrstvy sa premyli so soľankou, vysušili (MgSO4) a skoncentrovali sa. Chromatografia na silikagéli (10 % hmotnostných EtOAc/hexány) dala látku z názvu tohto odstavca ako bezfarebný olej: MS (ES) m/e 309 (M+H)+.
d) Etyl-2-(etylamino)-6-pyridylacetát
Roztok etyl-2-(N-Boc-N-etylamino)-6-pyridylacetátu (1,5 g, 4,87 mmol) a 4 mol/l HCI/dioxán (5 ml, 20 mmol) sa miešal pri laboratórnej teplote počas noci, potom sa skoncentroval. Rekoncentrácia z toluénu poskytla látku z názvu tohto odstavca ako bielu tuhú látku: MS (ES) m/e 209 (M+H)+.
e) 2-(etylamino)-6-pyridyletanol
K mechanicky miešanému roztoku LiAIH4 v THF (1,0 mol/l, 20 ml, 20,4 mmol) sa pridal po kvapkách roztok etyl-2-(etylamino)-6-pyridylacetátu (1 g, 4,1 mmol) v THF (30 ml). Po ukončení pridávania sa reakčná zmes zahrievala pri teplote refluxu. Po 5 hodinách sa reakčná zmes ochladila na 0 °C a reakcia sa zastavila s roztokom 10 % hmotnostných NaOH. Tuhé látky sa odfiltrovali a filtrát sa skoncentroval za vákua. Zvyšok sa rozpustil v CH2CI2a roztok sa vysušil (MgSO4) a skoncentroval. Rekoncentrácia z toluénu (3x) dala látku z názvu tohto odstavca ako bezfarebný olej: MS (ES) 167 (M+H)+.
-44Príprava 8
Príprava 10,11-dihydro-3-metoxy-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-ón
a) Kyselina 2-benzyl-4-metoxyfenyloctová
Roztok kyseliny 2-benzoyl-4-metoxyfenylaoctovej (13,0 g, 0,048 mol), pripravený postupom z J. Med. Chem. 1981, 24, 998, v ľadovej kyseline octovej (600 ml) sa opracoval pod argónom s 4,3 g 10 % Pd/C a hydrogenoval sa pri 345 kPa (50 psi) počas 17 hodín. Zmes sa prefiltrovala cez Celíte® a filtrát sa skoncentroval a rekoncentroval z toluénu a dichlórmetánu a poskytol 14,2 g látky z názvu: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 3,52 (s, 2H), 3,75 (s, 3H), 4,0 (s, 3H), 6,7 (m, 2H), 7,15 (m, 6H).
b) 10,11-dihydro-3-metoxy-5H- dibenzo[a,d]cykloheptén-10-ón
Roztok kyseliny 2-benzyl-4-metoxyfenyloctovej (14,2 g, 0,055 mol) v benzéne (120 ml) a tionylchloridu (28 ml) sa refluxoval počas 1 hodiny a skoncentroval sa. Chlorid kyseliny sa rozpustil v suchom dichlórmetáne (40 ml) a roztok sa pridal po kvapkách pod argónom k roztoku AICI3 (14,7 g, 0,11 mol) v dichlórmetáne (600 ml). Reakčná zmes sa miešala pod argónovou atmosférou počas 2,5 hodiny pri laboratórnej teplote, potom sa reakcia zastavila ľadovou vodou (200 ml). Vrstvy sa oddelili a organická fáza sa premyla postupne s roztokom 10 % hmotnostných NaOH, vodou a zriedenou HCI. Výsledný roztok sa zriedil s éterom (200 ml), vysušil nad MgSO4 a skoncentroval. Tuhý zvyšok sa rozotrel so zmesou éter/hexán (1:1) a 9,35 g látky z názvu sa získalo filtráciou: T.t. 105 až 106 °C; 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 3,72 (s, 3H), 4,1 (s, 2H), 4,2 (s, 2H), 6,7 (d, 1H), 6,82 (s, 1H), 7,30 (m, 4H), 8,1 (d, 1H).
Príprava 9
Príprava Etyl-(±)-10,11 -dihydro-3-metoxy-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-acetát
a) Etyl-(±)-3-(3-metoxyfenyl)indénacetát
-45K ochladenému roztoku 3-(3-metoxyfenyl)indénu (4 g, 18 mmol), pripravenému postupom z J. Med. Chem. 1981, 24, 998, v THF (15 ml) sa pri 0 °C pridal po kvapkách roztok LiN(TMS)2(20 ml, 1 mol/l v THF) počas 5 minút. Výsledný roztok sa po kvapkách pridal k roztoku etylbrómacetátu (3,34 g, 20 mmol) v THF (15 ml) pri -78 °C počas 30 minút. Po 2,5 hodine sa reakcia zastavila nasýteným roztokom chloridu amónneho a vrstvy sa oddelili. Organická vrstva sa vysušila nad MgSO4 a skoncentrovaním poskytla surový produkt, ktorý sa čistil kolónovou chromatografiou (SiO2/2 až 4 % hmotnostné EtOAc/hexány) a poskytol látku z názvu tohto odstavca (1,1 g): 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 1,30 (t, 3H), 2,50 (m, 1H), 2,85 (m, 1H), 3,85 (s, 3H), 4,0 (m, 1H), 4,20 (q, 2H), 6,6 (s, 1H), 6,9 (m, 1H),
7,2 (s, 1H), 7,35 (m,6H).
b) Etyl-(±)-3-[(3-metoxybenzoyl)]fenyljantaran
Roztok etyl-(±)-3-(3-metoxyfenyl)indénacetátu (1,1 g, 3,6 mmol) v acetóne (30 ml) sa opracoval so vodným 4 % hmotnostné roztokom oxidu osmičelého (0,5 ml) a následne sa po kvapkách pridalo 1,2 mol/l Jonesovo činidlo (5 ml, 6 mmol) postupom opísaným v literatúre J. Org. Chem. 1993, 58, 4745). Po celonočnom miešaní pri laboratórnej teplote sa reakcia tmavej reakčnej zmesi zastavila s izopropanolom (2,5 ml) a následne sa pridal hydrogenuhličitan sodný (0,9 g) a voda (30 ml). Vzniknutý produkt sa extrahoval etyl acetátom, premyl soľankou, vysušil nad MgSO4 a skoncentrovaním poskytol tuhý zvyšok. Rozotretie so zmesou 1:1 éter/hexán poskytlo 0,76 g látky z názvu: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 1,18 (t, 3H), 2,90 (m, 1H), 3,3 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 4,1 (q, 2H), 4,4 (m, 1H), 4,4 (d, 1H), 7,25 (m, 2H), 7,5 (m, 6H).
c) Etyl-(±)-3-[(3-metoxybenzyl)]fenyljantaran
Zmes etyl-(±)-3-[(3-metoxybenzoyl)]fenyljantaranu (0,76 g, 2,1 mmol) a 10 % Pd/C (0,6 g) v ľadovej kyseline octovej (35 ml) sa hydrogenovalo pri 345 kPa (50 psi) počas 17 hodín. Zmes sa prefiltrovala cez Celite® a filtračná vrstva sa premyla kyselinou octovou. Filtrát sa skoncentroval a rekoncentroval z toluénu a
-46dichlórmetánu a poskytol 0,65 g látky z názvu: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 1,20 (t, 3H), 2,20 (m, 1H), 3,0 (m, 1H), 3,74 (s, 3H), 4,1 (q, 2H), 4,18 (q, 2H), 4,4 (d, 1H),
6,2 (m, 2H), 7,22 (m, 6H).
d) Etyl-(±)-10,11-dihydro-3-metoxy-11-oxo-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-acetát
K magneticky miešanému roztoku etyl-(±)-3-[(3-metoxybenzyl)]fenyljantaranu (0,65 g, 1,9 mmol) v suchom dichlórmetáne (10 ml) sa pridal DMF (0,2 ml) a oxalylchlorid (0,2 ml, 2,28 mmol). Po 1,5 hodine sa roztok po kvapkách pridal k suspenzii chloridu hlinitého (0,6 g, 4,5 mmol) v suchom dichlórmetáne (15 ml). Reakcia sa zastavila Po 2 hodinách s ľadovou vodou, vrstvy sa oddelili a vodná vrstva sa extrahovala s dichlórmetánom. Kombinované organické vrstvy sa vysušili nad MgSO4a skoncentrovali sa. Zvyšok sa čistil kolónovou chromatografiou (SiO2/2 až 4 % hmotnostné EtOAc/hexány) a poskytol látku z názvu tohto odstavca (0,3 g): Ή NMR (400 MHz, CDCI3) δ 1,28 (t, 3H), 2,88 (m, 1H), 3,55 (m, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,88 (d, 1H), 4,18 (q, 2H), 4,85 (d, 1H), 4,95 (m, 1 H), 5,8 (m, 2H), 7,22 (m, 4H), 8,1 (s, 1H).
e) Etyl-(±)-10,11-dihydro-3-metoxy-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-acetát
Zmes etyl-(±)-10,11-dihydro-3-metoxy-11-oxo-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén10-acetátu (0,3 g, 0,93 mmol) a 10 % Pd/C (0,3 g) v ľadovej kyseline octovej (25 ml) sa hydrogenovala pri 345 kPa (50 psi) počas 18 hodín. Zmes sa prefiltrovala cez Celíte® a premyla kyselinou octovou. Filtrát sa skoncentroval a rekoncentroval z toluénu a dichlórmetánu a poskytol 0,25 g látky z názvu: 1H NMR (400 MHz, CDCI3) δ 1,28 (t, 3H), 2,60 (m, 2H), 2,90 (m, 1H), 3,30 (m, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,85 (d, 1H), 4,18 (q, 2H), 4,30 (d, 1H), 6,70 (m, 2H),7,0 (d, 1H), 7,22 (m, 4H).
Nasledujúce látky ilustrujú spôsoby prípravy biologicky aktívnych látok podľa tohto vynálezu z medziproduktov, ako sú opísané v predchádzajúcich Prípravách.
-47Príklad 1
Príprava kyseliny (±)-10,11-dihydro-3-[3-(2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]-cykloheptén-10-octovej
a) Etyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-[2-(N-oxopyridyl)amino]-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-acetát
Roztok 2-[(3-hydroxy-1-propyl)amino]pyridín-N-oxidu (1,94 g, 11,55 mmol) a dietylazodikarboxylátu (1,8 ml, 11,55 mmol) v bezvodom DMF (58 ml) sa pridal po kvapkách počas 10 minút k roztoku etyl-(±)-10,11-dihydro-3-hydroxy-5H-dibenzo[a,d]-cykloheptén-10-acetátu (1,37 g, 4,62 mmol) a trifenylfosfínu (3,27 g, 12,47 mmol) v bezvodom DMF (23 ml) pri laboratórnej teplote pod argónom. Po 23,5 hodinách sa reakčná zmes skoncentrovala na rotačnej odparovačke a zvyšok sa rekoncentroval z xylénu, čím sa odstránil zvyškový DMF. Chromatografia na silikagéli (30 % hmotnostných EtOAc/hexáne (0,5 I), potom EtOAc (1 I), potom 5 % hmotnostných MeOH/CHCI3) dali regenerovaný etyl (±)-10,11-dihydro-3-hydroxy5H-dibenzo[a,d]cy-kloheptén-10-acetát (298,1 mg, 22 %), potom látku z názvu tohto odstavca (1,54 g, 75 %) ako žltý olej: 1H NMR (250 MHz, CDCI3) δ 8,10 (dd, J = 6,6,
1.3 Hz, 1H), 6,85 - 7,30 (m, 7 H), 6,78 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,68 (dd, J = 8,2, 2,6 Hz, 1H), 6,61 (dd, J = 8,5, 1,6 Hz, 1H), 6,45 - 6,57 (m, 1H), 4,29 (d, J = 15,1 Hz, 1H), 4,10 - 4,25 (m, 2H), 4,06 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 3,84 (d, J = 15,1 Hz, 1H), 3,70 - 3,92 (m, 1H), 3,49 (q, J = 6,5 Hz, 2H), 3,30 (dd, J = 15,0, 4,2 Hz, 1H), 2,93 (dd, J = 15,0,
9.3 Hz, 1H), 2,65 (dd, J = 15,6, 5,0 Hz, 1H), 2,51 (dd, J = 15,6, 9,4 Hz, 1H), 2,05 2,25 (m, 2H), 1,27 (t, J = 7,1 Hz, 3 H); MS (ES) m/e 447 (M+H)+.
b) Etyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-(2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-acetát
Zmes etyl-(±)-10,11 -dihydro-3-[3-[2-(N-oxopyridyl)amino]-1 -propyloxy]-5Hdibenzo[a,d]cykloheptén-10-acetátu (1,54 g, 3,45 mmol), 10 % Pd/C (0,73 g, 0,69 mmol), cyklohexénu (7 ml, 6,9 mmol) a izopropanolu (35 ml) sa zahrievala pri teplote refluxu počas 2 hodín a potom sa katalyzátor odstránil filtráciou cez Celíte®.
-48Po koncentrácii zostal žltý olej, ktorý sa znovu podrobil reakčným podmienkam. Po 17 hodinách sa reakčná zmes spracovala postupom uvedeným vyššie a žltý zvyšok sa znovu podrobil reakčným podmienkam, ale ako rozpúšťadlo sa použila zmes 1:1 EtOAc/izopropanol (35 ml) namiesto izopropanolu. Zmes sa zahrievala pri teplote refluxu počas 5 hodín, pridala sa Pd čerň (73 mg, 0,69 mmol) a refluxovanie pokračovalo počas ďalších 18,5 hodiny. Postup opísaný s následnou gélovou chromatografiou (1:1 EtOAc/hexány) poskytli látku z názvu tohto odstavca (0,94 g, 63 %) ako svetlo žltý olej: TLC Rf (1:1 EtOAc/hexány) 0,38; 1HNMR (400 MHz, CDCI3) δ 8,02 - 8,11 (m, 1H), 7,33 - 7,42 (m, 1H), 7,02 - 7,20 (m, 4H), 7,00 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,77 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,67 (dd, J = 8,2, 2,6 Hz, 1H), 6,50 - 6,60 (m, 1H), 6,39 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 4,69 (široký t, 1H), 4,29 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 4,11 4,25 (m, 2H), 4,05 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 3,84 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 3,75 - 3,90 (m, 1H), 3,48 (zdanlivý q, 2H), 3,30 (dd, J = 15,0, 4,1 Hz, 1H), 2,93 (dd, J = 15,0, 9,2 Hz, 1H), 2,64 (dd, J = 15,6, 4,8 Hz, 1H), 2,52 (dd, J = 15,6, 9,5 Hz, 1H), 2,02 - 2,15 (m, 2H), 1,27 (t, J = 7,2 Hz, 3 H); MS (ES) m/e 431 (M+H)+.
c) Kyselina (±)-10,11-dihydro-3-[3-(2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,djcykloheptén-10-octová
Zmes etyl-(±)-10,11 -dihydro-3-[3-(2-pyridylamino)-1 -propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-acetátu (0,94 g, 2,18 mmol) a 1,0 mol/l NaOH (2,6 ml, 2,62 mmol) v absolútnom EtOH (1 9,2 ml) sa zahrievala v olejovom kúpeli nastavenom na 50 °C. Po 28,5 hodinách sa reakčná zmes skoncentrovala na rotačnej odparovačke a zvyšok sa čistil ODS chromatografiou (1:1 MeOH/H2O). Po skoncentrovaní zostal zakalený vodný roztok, ktorý sa zhomogenizoval pridaním malého množstva 1,0 mol/l NaOH. pH sa upravilo na hodnotu 7 pomocou 1,0 mol/l HCI a tuhá zrazenina sa odobrala a premyla H2O. Materský lúh sa skoncentroval a zvyšok sa opracoval podobne a poskytol malý druhý výťažok. Kombinované materiály sa vysušili vo vysokom vákuu pri 40 °C a poskytli látku z názvu tohto odstavca (0,70 g, 79 %) ako skoro bezfarebnú tuhú látku: HPLC (Hamilton PRP-1®, 40 % hmotnostných CH3CN/H2O s obsahom 0,1% TFA) k' = 1,2; 1H NMR (400 MHz,
-49DMSO-d6) δ 7,94 (d, J = 4,4 Hz, 1H), 7,32 - 7,41 (m, 1H), 7,03 - 7,22 (m, 4H), 6,97 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,60 - 6,74 (m, 2H), 6,41 - 6,50 (m, 2H), 4,20 (d, J = 14,7 Hz, 1H), 4,00 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 3,88 (d, J = 14,7 Hz, 1H), 3,60 - 3,70 (m, 1H), 3,26 - 3,40 (m, 2H, čiastočne zastretý zvyškovým signálom rozpúšťadla), 3,20 (dd, J = 15,1, 4,3 Hz, 1H), 2,83 (dd, J = 15,1, 10,3 Hz, 1H), 2,60 (dd, J = 15,9, 5,3 Hz, 1H), 2,50 (dd, 1H, čiastočne zastretý zvyškovým signálom rozpúšťadla), 1,88 - 2,00 (m, 2H); MS (ES) m/e 403 (M+H)+. Analýza, vypočítaná pre C25H26N2O3.0,25 H2O: C, 73,78; H, 6,56; N, 6,88. Nájdené: C, 73,85; H, 6,47; N, 6,75.
Príklad 2
Príprava kyseliny (±)-10,11-dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5Hdi-benzo[a,d]cykloheptén-10-octovej
a) Etyl-(±)-10,11 -dihydro-3-[3-[2-(4-nitro-N-oxopyridyl)amino]-1 -propyloxy]-5H-dibenzo-[a,d]cykloheptén-10-acetát
Podľa postupu v Príklade 1(a) s výnimkou nahradenia 2-[(3-hydroxy-1propyl)amino]-4-nitropyridín-N-oxidu namiesto 2-[(3-hydroxy-1 -propyl)amino]pyridín-N-oxidu, sa látka z názvu tohoto odstavca získala nasledujúcou chromatografiou na silikagéli (gradient: 2:1 EtOAc/hexán, potom EtOAc, potom 5 % hmotnostných MeOH v 1:1 EtOAC/CHCI3): MS (ES) m/e 492 (M+H)+.
b) Etyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]-cykloheptén-10-acetát
Podľa postupu v Príklade 1(b), s výnimkou nahradenia etyl-(±)-10,11dihydro-3-[3-[2-(4-nitro-N-oxopyridyl)amino]-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cyklo-heptén-10-acetátu namiesto etyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-[2-(N-oxopyridyl)amino]-1propyloxy]-5H-dibenzo-[a,d]cykloheptén-10-acetátu sa látka z názvu získala nasledujúcou chromatografiou na silikagéli (20 % hmotnostných MeOH/CHCI3): MS (ES) m/e 446 (M+H)+.
c) Kyselina (±)-10,11-dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo-[a,d]cykloheptén-10-octová
1,0 mol/l LiOH (0,74 ml, 0,74 mmol) sa naraz pridal k roztoku etyl-(±)-10,11 dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10acetátu (216,3 mg, 0,49 mmol) v THF (2,5 ml) a H2O (1,8 ml) pri laboratórnej teplote. Dvojfázová zmes sa zahrievala počas 1 hodiny v olejovom kúpeli nastavenom na 40 GC, potom sa pridal absolútny EtOH (asi 1 ml), aby sa fázy spojili. Teplota reakčnej zmesi sa udržiavala na 40 °C počas 19,5 hodiny, potom sa skoncentrovala a zvyšok sa rozpustil v 1:1 CH3CN/H2O (5 ml). Roztok sa okyslil s TFA (0,11 ml, 1,47 mmol) a skoncentroval sa. ODS chromatografia (40 % hmotnostných CH3CN/H2O s obsahom 0,1 % hmotnostného TFA) s následným skoncentrovaním, čím sa odstránil CH3CN, zanechali olejnato vodný roztok, ktorý sa zhomogenizoval pridaním malého množstva CH3CN. pH sa upravilo na hodnotu 7 pomocou 1,0 mol/l NaOH a vyzrážala sa olejnatá polotuhá zrazenina. Zmes sa skoncentrovala, čím sa odstránil CH3CN a odobrala sa výsledná tuhá látka. Táto sa rozpustila vo vodnom NaOH a pH sa upravilo na hodnotu 7. Tuhá látka sa odobrala, premyla sa prebytkom H2O a vysušila vo vysokom vákuu pri 45 °C a poskytla látku z názvu tohto odstavca (133,3 mg, 61 %) ako špinavo bielu tuhú látku: HPLC (Hamilton PRP-1®, 35 % hmotnostných CH3CN/H2O s obsahom 0,1 % hmotnostného TFA) k' = 3,0; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,48 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 7,04 - 7,22 (m, 4H), 6,95 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,88 - 7,02 (m, 1H), 6,82 (d, J =
2,4 Hz, 1H), 6,67 (dd, J = 8,2, 2,4 Hz, 1H), 6,27 (široký s, 2H), 5,95 (dd, 1H), 5.65 (úzky d, 1H), 4,18 (d, J = 14,7 Hz, 1 H). 4,00 (t, J = 6,1 Hz, 2H), 3,88 (d, J = 14,7 Hz, 1H), 3,59-3,70 (m, 1H), 3,13-3,30 (m, 3 H), 2,82 (dd, J = 15,2, 10,0 Hz, 1H), 2,46 (dd, J = 15,8, 8,8 Hz, 1H, čiastočne prekrytý zvyškovým signálom rozpúšťadla), 2,58 (dd, J = 15,8, 5,2 Hz, 1H), 1,86 - 2,01 (m, 2H); MS (ES) m/e 418 (M+H)+. Analýza vypočítaná pre C25H27N3O3.1,67H2O: C, 67,09; H, 6,83; N, 9,39. Nájdené: C, 66,99; H, 6,59; N, 9,34.
Príklad 3
Príprava kyseliny (±)-10,11-dihydro-3-[3-(4-metyl-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5Hdibenzo-[a,d]cykloheptén-10-octovej
a) Etyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-[2-(4-metyl-N-oxopyridyl)amino]-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-acetát
Podľa postupu z Príkladu 1(a), s výnimkou nahradenia 2-[(3-hydroxy-1propyl)amino]-4-metylpyridín-N-oxidu namiesto 2-[(3-hydroxy-1 -propyl)amino]pyridín-N-oxid, sa získala látka z názvu tohto odstavca ako svetlo žltý olej, nasledovala chromatografia na silikagéli (gradient: 30, 50, 100 % hmotnostných EtOAc v hexáne, potom 1 až 5 % hmotnostných MeOH v CHCI3): MS(ES) m/e 461,3 (M+H)+
b) Etyl-(±)-10,11-dihydro-3-[3-(4-metyl-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]-cykloheptén-10-acetát
Podľa postupu v Príklade 1(b), s výnimkou nahradenia etyl-(±)-10,11dihydro-3-[3-[2-(4-metyl-N-oxopyridyl)-amino]-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]-cykloheptén-10-acetátu namiesto etyl-(±)-10,11 -dihydro-3-[3-[2-(N-oxopyridyl)amino]-1 propyloxy]-5H-dibenzo-[a,d]cykloheptén-10-acetátu, sa látka z názvu získala nasledujúcou chromatografiou na silikagéli (gradient: 30 až 50 % hmotnostných EtOAc v hexáne): MS(ES) m/e 445,3 (M+H)+.
c) Kyselina (±)-10,11-dihydro-3-[3-(4-metyl-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo-[a,d]cykloheptén-10-octová
1,0 mol/l NaOH (0,144 ml, 0,144 mmol) sa pridal k roztoku etyl-(±)-10,11 dihydro-3-[3-(4-metyl-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]-cykloheptén-10acetátu (35 mg, 0,08 mmol) v EtOH (5 ml) pri laboratórnej teplote. Zmes sa zahrievala počas noci v olejovom kúpeli nastavenom na 32 °C, potom sa skoncentrovala. Zvyšok sa rozpustil v H2O (3 ml) a roztok sa okyslil s roztokom 20 % hmotnostných TFA. ODS chromatografia (5 až 10 % hmotnostných CH3CN/H2O s
-52obsahom 0,1 % hmotnostného TFA) s nasledujúcim skoncentrovaním a lyofilizáciou poskytli látku z názvu tohto odstavca ako biely prášok: MS (ES) m/e 417,3 (M+H)+. Analýza vypočítaná pre C26H28N2O3 .2,0TFA.1,0H2O: C, 54,38; H, 4,87; N, 4,23, Nájdené: C, 54,66; H, 4,53; N, 4.32.
Príklad 4
Príprava kyseliny (±)-10,11-dihydro-3-[2-[6-(etylamino)-2-pyridyl]-1-etoxy]-5H-dibenzo-[a,d]cykloheptén-10-octovej
a) Etyl-(±)-10,11-dihydro-3-[2-[6-(etylamino)-2-pyridyl]-1-etoxy]-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-acetát
Podľa postupu z Príkladu 1 (a) s výnimkou nahradenia 2-(etylamino)-6pyridyletanol namiesto 2-[(3-hydroxy-1-propyl)amino]pyridín-N-oxidu sa získala látka z názvu tohto odstavca ako bezfarebný olej, nasledovala chromatografia na silikagéli (5 % hmotnostných MeOH/CH2CI2): MS (ES) 445 (M+H)+
b) Kyselina (±)-10,11-dihydro-3-[2-[6-(etylamino)-2-pyridyl]-1-etoxy]-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-octová
Ety l-(±)-10,11 -dihydro-3-[2-[6-(etylamino)-2-pyridyl]-1 -etoxy]-5H-dibenzo[a,d]-cyklo-heptén-10-acetát (80 mg, 0,18 mmol) sa rozpustil v MeOH (3 ml) a pridal sa 1,0 mol/l NaOH (0,22 ml, 0,22 mmol). Roztok sa premiešaval pri laboratórnej teplote počas noci, potom sa skoncentroval vo vákuu. Zvyšok sa rozpustil v H2O (3 ml) a roztok sa okyslil s roztokom 20 % hmotnostných TFA. Chromatografia na kolóne C-18 Bond Elute (30 % CH3CN/H2O s obsahom 0,1 % hmotnostného TFA) poskytla látku z názvu tohto odstavca ako bielu tuhú látku: MS(ES) 417 (M+H)+. Analýza vypočítaná pre C26H28N2O3. 1,3CF3CO2H: C, 60,83; H, 5,23; N, 4,96, Nájdené: C, 60,64; H, 5,26; N, 4,26.
Vyššie uvedený opis úplne opisuje ako urobiť a používať tento vynález. Vynález však nie je obmedzený na konkrétne uskutočnenia opísané v tomto dokumente vyššie, ale zahrnuje všetky ich modifikácie v rozsahu nasledujúcich
-53patentových nárokov. Rôzne odkazy na časopisy, patenty a iné publikácie, ktoré sú citované v tomto dokumente zahrnuje doterajší stav techniky a sú v tomto dokumente včlenené ako odkaz, aby bol úplne uvedený.

Claims (19)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY <
    1. Antagonistyreceptora vitronektínu, ktoré sú vybraté zo skupiny:
    kyselina (±)-10,11-dihydro-3-[3-(4-amino-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-octová, kyselina (±)-10,11 -dihydro-3-[2-[6-(etylamino)-2-pyridyl]-1 -etoxy]-5H-dibenzo-[a,djcykloheptén-10-octová, alebo kyselina (±)-10,11-dihydro-3-[3-(4-metyl-2-pyridylamino)-1-propyloxy]-5H-dibenzo[a,d]cykloheptén-10-octová, alebo ich farmaceutický prijateľné soli.
  2. 2. Spôsob výroby antagonistov receptora vitronektínu všeobecného vzorca (I) podľa nároku 1 (D vyznačujúci sa t ý m, že zahrnuje redukciu látky vzorca (II) (II)
    -553. Spôsob výroby zlúčeniny všeobecného vzorca (II) (II) c
    vyznačujúci sa t ý m, že zahrnuje cyklizáciu zlúčeniny vzorca (III) (III)
  3. 4. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje antagonistu receptora vitronektínu podľa nároku 1 a farmaceutický prijateľný nosič.
  4. 5. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje antagonistu receptora vitronektínu podľa nároku 1, antineoplastické činidlo a farmaceutický prijateľný nosič.
  5. 6. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 3, vyznačujúci sa t ý m, že antineoplastickým činidlom je topotekan.
  6. 7. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že antineoplastickým činidlom je cisplatina.
  7. 8. Antagonisty receptora vitronektínu podľa nároku 1 na použitie na liečenie chorobného stavu, pri ktorom je indikovaný antagonizmus ανβ3 receptora.
  8. 9. Antagonisty receptora vitronektínu podľa nároku 1 na použitie na liečenie chorobného stavu, pri ktorom je indikovaný antagonizmus άνβ5 receptora.
    fr
  9. 10. Antagonisty receptora liečenie osteoporózy.
    vitronektínu podľa nároku na použitie na
  10. 11. Antagonisty receptora inhibovanie angiogenézy.
    vitronektínu podľa nároku na použitie na podľa inhibovanie rastu tumoru alebo tumorových metastáz.
  11. 12. Antagonisty receptora vitronektínu nároku na použitie na
  12. 13. Antagonisty receptora vitronektínu liečenie aterosklerózy alebo restenózy.
    podľa nároku na použitie na
  13. 14. Antagonisty receptora vitronektínu liečenie zápalu.
    podľa nároku na použitie na
  14. 15. Spôsob inhibovania rastu tumoru, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje postupné podávanie antagonistov receptora vitronektínu podľa nároku 1 a antineoplastického činidla.
  15. 16. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že antineoplastickým činidlom je topotekan.
  16. 17. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že antineoplastickým činidlom je cisplatina.
    -5718. Medziprodukty všeobecného vzorca IV (IV) na prípravu zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa nároku 1.
  17. 19. Medziprodukty všeobecného vzorca V (V) na prípravu zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa nároku 1.
  18. 20. Medziprodukty všeobecného vzorca VI (VI) na prípravu zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa nároku 1.
  19. 21. Medziprodukty všeobecného vzorca II (II) na prípravu zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa nároku 1.
SK927-99A 1997-01-08 1998-01-08 Vitronectin receptor antagonists, process for their preparation, pharmaceutical composition them containing, their use and intermediates SK92799A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US3402697P 1997-01-08 1997-01-08
PCT/US1998/000490 WO1998030542A1 (en) 1997-01-08 1998-01-08 Vitronectin receptor antagonists

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK92799A3 true SK92799A3 (en) 1999-12-10

Family

ID=21873846

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK927-99A SK92799A3 (en) 1997-01-08 1998-01-08 Vitronectin receptor antagonists, process for their preparation, pharmaceutical composition them containing, their use and intermediates

Country Status (30)

Country Link
US (2) US6069158A (sk)
EP (1) EP0977735B1 (sk)
JP (1) JP2001508067A (sk)
KR (1) KR20000069941A (sk)
CN (1) CN1249745A (sk)
AP (1) AP9901597A0 (sk)
AR (1) AR010873A1 (sk)
AT (1) ATE235467T1 (sk)
AU (1) AU729641B2 (sk)
BG (1) BG103548A (sk)
BR (1) BR9806852A (sk)
CA (1) CA2276738A1 (sk)
CO (1) CO4920232A1 (sk)
DE (1) DE69812602T2 (sk)
DZ (1) DZ2395A1 (sk)
EA (1) EA199900630A1 (sk)
ES (1) ES2196534T3 (sk)
HU (1) HUP0001945A3 (sk)
ID (1) ID23168A (sk)
IL (1) IL130760A0 (sk)
MA (1) MA26462A1 (sk)
NO (1) NO993350L (sk)
NZ (1) NZ336560A (sk)
OA (1) OA11076A (sk)
PE (1) PE44799A1 (sk)
PL (1) PL334499A1 (sk)
SK (1) SK92799A3 (sk)
TR (1) TR199901575T2 (sk)
WO (1) WO1998030542A1 (sk)
ZA (1) ZA9896B (sk)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999011626A1 (en) * 1997-09-04 1999-03-11 Smithkline Beecham Corporation Integrin receptor antagonists
US6576643B2 (en) 1997-09-19 2003-06-10 Smithkline Beecham Corporation Vitronectin receptor antagonists
DZ2609A1 (fr) * 1997-09-19 2003-03-01 Smithkline Beecham Corp Composés nouveaux antagonistes des récepteurs de vitronectine et compositions pharmaceutiques les contenant.
ATE542797T1 (de) 1998-04-09 2012-02-15 Meiji Seika Pharma Co Ltd Aminopiperidinderivate als integrin alpha v beta 3 antagonisten
JP4240424B2 (ja) * 1998-10-23 2009-03-18 エルジー ディスプレイ カンパニー リミテッド エッチング剤及びこれを用いた電子機器用基板の製造方法
US6339083B1 (en) 1998-12-14 2002-01-15 Bayer Aktiengesellschaft Multiheterocyclic pharmAceuticals
AU747503B2 (en) 1999-02-03 2002-05-16 Merck & Co., Inc. Benzazepine derivatives as alpha-V integrin receptor antagonists
DE19916837A1 (de) * 1999-04-14 2000-10-19 Merck Patent Gmbh Dibenzoazulenderivate
US6750219B1 (en) 1999-08-05 2004-06-15 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Ω-amino-α-hydroxycarboxylic acid derivatives having integrin ανβ3 antagonistic activity
DE19936780A1 (de) 1999-08-09 2001-02-15 Basf Ag Neue Antagonisten von Integrinrezeptoren
FR2806082B1 (fr) * 2000-03-07 2002-05-17 Adir Nouveaux composes bicycliques antagonistes des recepteurs de la vitronectine, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
US6943156B2 (en) 2000-10-24 2005-09-13 Merck & Co., Inc Dibenzoxazepine αv integrin receptor antagonist
WO2002085405A2 (en) 2001-04-24 2002-10-31 Merck Patent Gmbh COMBINATION THERAPY USING ANTI-ANGIOGENIC AGENTS AND TNF$g(a)
CA2464472C (en) 2001-10-22 2014-01-07 The Scripps Research Institute Antibody targeting compounds
GB0215867D0 (en) * 2002-07-09 2002-08-14 Glaxosmithkline Spa Novel method and compounds
AU2012216372B2 (en) * 2004-04-02 2015-01-22 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with alphaVbeta5 integrin
AU2005229015C1 (en) * 2004-04-02 2013-01-17 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with alphaVbeta5 integrin
UA87854C2 (en) 2004-06-07 2009-08-25 Мерк Энд Ко., Инк. N-(2-benzyl)-2-phenylbutanamides as androgen receptor modulators
WO2006128689A2 (de) 2005-05-31 2006-12-07 Ralf Jochem Therapeutsche zusammensetzung zur vorbeugung und bekämpfung von knochenmetastasen
US20070122408A1 (en) * 2005-10-20 2007-05-31 The Scripps Research Institute Fc Labeling for Immunostaining and Immunotargeting
JP2009523813A (ja) 2006-01-18 2009-06-25 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 癌を治療するためにインテグリンのリガンドを使用する特異的な治療法
PL2101805T3 (pl) 2007-01-18 2013-04-30 Merck Patent Gmbh Ligandy integryn do stosowania w leczeniu nowotworów
PT2222636E (pt) 2007-12-21 2013-07-16 Ligand Pharm Inc Moduladores seletivos de recetores de andrógeno (sarms) e suas utilizações
US8518927B2 (en) 2009-02-10 2013-08-27 The Scripps Research Institute Chemically programmed vaccination
KR20120104491A (ko) 2009-05-25 2012-09-21 메르크 파텐트 게엠베하 암 치료를 위한 실렌기티드의 연속 투여
WO2011011775A1 (en) 2009-07-24 2011-01-27 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with avb5 integrin
US10328082B2 (en) 2014-05-30 2019-06-25 Pfizer Inc. Methods of use and combinations
WO2023275715A1 (en) 2021-06-30 2023-01-05 Pfizer Inc. Metabolites of selective androgen receptor modulators

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE794424A (fr) * 1972-01-24 1973-07-23 Science Union & Cie Nouveaux dibenzocycloheptenes, leur procede d'obtention et leur application comme medicament
US3906032A (en) * 1972-11-10 1975-09-16 Squibb & Sons Inc Dihydroxy-tetrahydronaphthyoxyisobutyric acids and alkyl esters and salts thereof
IT1222986B (it) * 1987-10-23 1990-09-12 Texcontor Ets Derivati dell'efedrina esterificata aventi attivita' antiulcera prolungata nel tempo
US4994463A (en) * 1987-12-14 1991-02-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Tricyclic thromboxane A2 antagonists
EP0910563B1 (en) * 1995-06-29 2003-05-02 Smithkline Beecham Corporation Integrin receptor antagonists
WO1997024124A1 (en) * 1995-12-29 1997-07-10 Smithkline Beecham Corporation Vitronectin receptor antagonists
EP1000031A4 (en) * 1997-07-25 2001-08-16 Smithkline Beecham Corp VITRONECTIN RECEPTOR ANTAGONISTS
DZ2609A1 (fr) * 1997-09-19 2003-03-01 Smithkline Beecham Corp Composés nouveaux antagonistes des récepteurs de vitronectine et compositions pharmaceutiques les contenant.

Also Published As

Publication number Publication date
IL130760A0 (en) 2001-01-28
AU729641B2 (en) 2001-02-08
EP0977735A4 (en) 2000-04-05
US6191304B1 (en) 2001-02-20
KR20000069941A (ko) 2000-11-25
EP0977735A1 (en) 2000-02-09
ID23168A (id) 2000-03-23
BR9806852A (pt) 2001-08-07
WO1998030542A1 (en) 1998-07-16
NO993350D0 (no) 1999-07-07
EA199900630A1 (ru) 2000-02-28
CO4920232A1 (es) 2000-05-29
CN1249745A (zh) 2000-04-05
JP2001508067A (ja) 2001-06-19
ZA9896B (en) 1998-10-14
ES2196534T3 (es) 2003-12-16
NO993350L (no) 1999-09-06
CA2276738A1 (en) 1998-07-16
DE69812602D1 (de) 2003-04-30
ATE235467T1 (de) 2003-04-15
US6069158A (en) 2000-05-30
HUP0001945A3 (en) 2001-12-28
AU5912798A (en) 1998-08-03
NZ336560A (en) 2000-11-24
PL334499A1 (en) 2000-02-28
TR199901575T2 (xx) 1999-11-22
EP0977735B1 (en) 2003-03-26
DZ2395A1 (fr) 2003-06-04
HUP0001945A2 (hu) 2000-10-28
AR010873A1 (es) 2000-07-12
BG103548A (en) 2000-11-30
DE69812602T2 (de) 2004-02-19
AP9901597A0 (en) 1999-09-30
OA11076A (en) 2003-03-13
PE44799A1 (es) 1999-06-10
MA26462A1 (fr) 2004-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK92799A3 (en) Vitronectin receptor antagonists, process for their preparation, pharmaceutical composition them containing, their use and intermediates
AU738433B2 (en) Vitronectin receptor antagonists
AU9578798A (en) Vitronectin receptor antagonist
EP1146874B1 (en) Vitronectin receptor antagonist
US20020019387A1 (en) Vitronectin receptor antagonist
US6576643B2 (en) Vitronectin receptor antagonists
US20030216377A1 (en) Vitronectin receptor antagonist
CZ241599A3 (cs) Antagonista vitronektinového receptorů
CZ2000979A3 (cs) Antagonista vitronektinového receptoru
MXPA00002700A (en) Vitronectin receptor antagonists
MXPA01005547A (en) Vitronectin receptor antagonist