SK8052001A3 - Peptide compound, the use thereof and pharmaceutical composition comprising the same - Google Patents

Abstract

Peptide compound (I), is new. New peptide has formula (I): W1>-X1>N-Arg-X2>-Asp-Leu-X3>-X4>-Leu-X5>-X6>m-W2> (I); X1>-X6>amino acid residue chosen from Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gln, Glu, Gly, Phe, His, Ile, Leu, Lys, Met, Nle, homo-Phe, Phg, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val, and known amino acid derivatives; Nle : norleucine; Phg : phenylglycine; W1>H or Ac; W2>OH, OR, NHR, NR2, NH2; R : 1-6C alkyl; and n, m : 0 - 15. ACTIVITY : Cardiant; thrombolytic; cytostatic; osteopathic; antiinflammatory; antipsoriatic; antiarteriosclerotic. MECHANISM OF ACTION : alpha vbeta 6 Integrin Receptor Inhibitor.

Description

Peptidická zlúčenina, jej použitie a farmaceutický prostriedok, ktorý ju obsahujeA peptide compound, its use and a pharmaceutical composition comprising it

Oblasť: techniky ¹ iArea: Techniques ¹ i

Vynález sa týka peptidických zlúčenín·, ktoré ako ligandy integrínu α_νβ₆ sú biologicky aktívne. Tieto peptidy majú všeobecný štruktúrny motív - Asp Leu Xaa Xaa Leu prípadne v osobitne výhodnej forme - Arg Xaa Asp Leu Xaa Xaa Leu Arg -, pričom Xaa znamená ľubovoľný aminokyselinový zvyšok. Peptidy podľa vynálezu ša môžu používať ako účinné inhibítory α_νβ₆ integrínového receptoru a tak na ošetrovanie rôznych chorôb a patologických nálezov.The invention relates to peptide compounds which are biologically active as integrin α _ν β ₆ ligands. These peptides have a general structural motif - Asp Leu Xaa Xaa Leu optionally in a particularly preferred form - Arg Xaa Asp Leu Xaa Xaa Leu Arg - wherein Xaa is any amino acid residue. The peptides of the invention can be used as potent inhibitors of _α ν β ₆ integrin receptor and thus for the treatment of various diseases and pathological findings.

Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Integríny patria do rodiny heterodimérnej triedy I transmembránových receptorov, ktoré majú významnú úlohu v početných adhéznych procesoch bunka-matrica prípadne bunka-bunka (Tuckwell a kol., 1996, Symp. Soc. Ex. Biol. 47). Zhruba sa môžu deliť do troch tried: β-L-integríny, ktoré predstavujú receptory pre extracelulárnu matrici, β2-integríny, ktoré sú aktivovateľné na leukocyty, a sú spúšťané pri zápalových procesoch, ako tiež a_v-integríny, ktoré ovplyvňujú bunkovú odozvu pri hojení rán a pri iných patologických procesoch (Marshall a Hart, Semin. Cancer Biol. 7, str. 191, 1996).Integrins belong to the family of heterodimeric class I transmembrane receptors, which play an important role in numerous cell-matrix or cell-cell adhesion processes (Tuckwell et al., 1996, Symp. Soc. Ex. Biol. 47). Roughly, they can be divided into three classes: β-L-integrins, which are receptors for the extracellular matrix, β2-integrins, which are activated by leukocytes, and triggered by inflammatory processes, as well as _v -integrins, which affect the cellular response in wound healing and other pathological processes (Marshall and Hart, Semin. Cancer Biol. 7, p.191, 1996).

Integríny α₅β_χ, α_ΙΙ1;)β₃, α₈β_χ, α_νβ_χ, α_νβ₃ a α_νβθ sa všetky viažu na Arg-Gly-Asp (RGD) peptidovú sekvenciu, napríklad v prírodnom ligandovom fibronektíne. Rozpustné RGD-obsahujúce peptidy podporujú inhibičnú interakciu každého tohto integrínu s fibronektínom. Integrín α_νβ₆ je pomerne vzácny integrín (Busk a kol., J. Biol. Chem. 267(9), str. 5790, 1992), ktorý sa pri procesoch opravy epitelových tkanív vo väčšom množstve vytvára a prednostne viaže prirodzené matricové molekuly fibronektín a tenascín (Wang a kol., Am. J. Respir. Celí Mol. Biol. 15(5), str. 664, 1996). Fyziologické a patologické funkcie α_νβ₆ nie sú dosial dokonalo známe, existuje však domnienka, že tento integrín má dôležitú úlohu pri fyziologických pochodoch a chorobách (napríklad zápaly, hojenie rán, nádory), na ktorých sa podielajú epitelové bunky. Tak sa α_νβ₆ exprimuje na keratinocytoch v ranách (Haapasalmi a kol., J. Invest. Dermatol. 106(1), str. 42, 1996), z čoho je možné predpokladal, že agonisty a antagonisty tohto integrínu sú ovplyvňované popri procesoch hojenia rán a zápaloch i iných patologických javoch kože, ako je napríklad psoriáza. Okrem toho má α_νβ₆ význam v epiteli dýchacích ciest (Weinacker a kol., Am. J. Respir. Celí Mol. Biol. 12(5), str. 547, 1995), takže by sa mohli úspešne nasadzovať: zodpovedajúce agonisty (antagonisty tohto integrínu pri ochoreniach dýchacích ciest, ako sú bronchitída, astma, plúcna fibróza a nádory dýchacích ciest). Je tiež známe, že α_νββ majú význam pre črevový epitel, takže by bolo možné používať, zodpovedajúce integrínové agonisty/antagonisty pri ošetrovaní zápalov, nádorov a poranení žalúdočného a črevového traktu.The integrins α ₅ β _χ , α _{ΙΙ 1;)} β ₃ , α ₈ β _χ , α _ν β _χ , α _ν β ₃ and α _ν βθ all bind to the Arg-Gly-Asp (RGD) peptide sequence, for example, in a natural ligand fibronectin. Soluble RGD-containing peptides promote the inhibitory interaction of each of these integrins with fibronectin. Integrin α _ν β ₆ is a relatively rare integrin (Busk et al., J. Biol. Chem. 267 (9), p. 5790, 1992), which produces and preferably binds natural matrix molecules in epithelial tissue repair processes. fibronectin and tenascin (Wang et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15 (5), 664, 1996). The physiological and pathological functions of α _ν β ₆ are not yet fully understood, but it is believed that this integrin plays an important role in the physiological processes and diseases (such as inflammation, wound healing, tumors) in which epithelial cells are involved. Thus, α _ν β _{6 is} expressed on wound keratinocytes (Haapasalmi et al., J. Invest. Dermatol. 106 (1), p. 42, 1996), suggesting that integrin agonists and antagonists are influenced in addition to wound healing and inflammation processes as well as other pathological phenomena of the skin, such as psoriasis. In addition, α _ν β _{6 is} important in the airway epithelium (Weinacker et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 12 (5), p. 547, 1995), so that the corresponding agonists could be successfully deployed: (antagonists of this integrin in respiratory diseases such as bronchitis, asthma, pulmonary fibrosis and airway tumors). It is also known that α _ν ββ is important for the intestinal epithelium, so that the corresponding integrin agonists / antagonists could be used in the treatment of inflammations, tumors and injuries of the stomach and intestinal tract.

Až dosial nebol nájdený nízkomolekulárny inhibítor, ktorý by sa selektívne viazal na α_νβ₆ integrín. Je preto úlohou popri dosial známym prírodným vysokomolekulárnym ligandom a protilátkam, s ktorými sa terapeuticky a diagnosticky obťažne zaobchádza, nájsť silné, špecifické prípadne selektívne nízkomolekulárne ligandy pre α_νβ₆, s výhodou peptidy, ktoré bý sa mohli používať pre uvedené terapeutické oblasti avšak tiež ako diagnostické a reakčné činidlá.Until now, a low molecular weight inhibitor has not been found to selectively bind to α _ν β ₆ integrin. It is therefore the task, in addition to the known natural high molecular weight ligands and antibodies which are therapeutically and diagnostically difficult to handle, to find strong, specific or selectively low molecular weight ligands for α _ν β ₆ , preferably peptides that could be used for these therapeutic areas but as diagnostic and reagents.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

S prekvapením sa zistilo, že d'alej· charakterizované peptidy všeobecného vzorca I a ich soli ako rozpustné molekuly pôsobia na bunky, ktoré majú uvedené receptory alebo keď sa viažu na povrchy, predstavujú umelé ligandy pre α_νβ₆ sprostredkovávané prilipovanie buniek. Predovšetkým pôsobia ako inhibítory α_νβ₆ integrínu, pričom predovšetkým brzdia vzájomné pôsobenie receptoru s inými ligandami, napríklad väzbu fibronektínu. Toto pôsobenie je možné doložiť napríklad spôsobom, ktorý opísal J. W. Smith a kol. (J. Biol. Chem.. 265, str. 12267 až 12271, 1990).Surprisingly, it has been found that the peptides of the general formula I and their salts as soluble molecules further characterized act on cells having said receptors or when they bind to surfaces represent artificial ligands for α _ν β ₆ mediated cell adhesion. In particular, they act as inhibitors of α _ν β ₆ integrin, inhibiting in particular the interaction of the receptor with other ligands, such as fibronectin binding. This action can be demonstrated, for example, by the method of JW Smith et al. (J. Biol. Chem. 265: 12267-12271, 1990).

P.C. Brooks, R.A. Clark a D.A. Cheresh (Science 264, str. 569 až 571, 1994) uvádzajú, že vývoj angiogenézy závisí od vzájomného pôsobenia vaskulárneho integrínu a extracelulárnych matricových proteínov.P.C. Brooks, R.A. Clark and D.A. Cheresh (Science 264: 569-571, 1994) report that the development of angiogenesis depends on the interaction of vascular integrin and extracellular matrix proteins.

Okrem toho sa zistilo, že nové zlúčeniny majú pri dobrej znášanlivosti veľmi hodnotné farmakologické vlastnosti a môžu sa používať ako liečivá. Táto skutočnosť bude ešte presnejšie opísaná.In addition, it has been found that the novel compounds have good pharmacological properties and are useful as pharmaceuticals with good tolerability. This will be described more precisely.

Peptidické zlúčeniny podľa vynálezu sa okrem toho môžu používať ako diagnostika pre detekciu a lokalizáciu patologických stavov v epitelovom systéme in vivo, pokiai sú opatrené signálnymi znakmi (napríklad biotinylovým zvyškom) podľa stavu techniky. Vynález zahŕňa tiež konjugáty s inými účinnými látkami, ako sú cytotoxicky účinné látky, ako tiež konjugáty s rádiosignálnymi znakmi pre rôntgenovú terapiu alebo pre PET diagnózu alebo tiež fúzne proteíny s proteínovými signálnymi ' J znakmi, ako sú GFP alebo protilátky, alebo terapeutické proteíny, ako je IL-2.In addition, the peptide compounds of the invention can be used as diagnostics for the detection and localization of pathological conditions in the epithelial system in vivo when provided with signaling features (e.g., a biotinyl residue) according to the prior art. The invention also encompasses conjugates with other active agents, such as cytotoxic active agents, as well as conjugates with radiosignal traits for X-ray therapy or PET diagnosis, or fusion proteins with protein signaling traits such as GFP or antibodies, or therapeutic proteins such as is IL-2.

Podstatou vynálezu sú peptidické zlúčeniny všeobecného vzorca IThe present invention provides peptide compounds of formula I

W¹ - X¹nArgX²AspLeu X³X⁴Leu X⁵X⁶m - W² (I) kde znamenáW ¹ - X ¹ nArgX ² AspLeu X ³ X ⁴ Leu X ⁵ X ⁶ m - W ² (I) where it means

X¹,X², X³,X⁴,X⁵,X⁶ vždy od seba nezávisle zvyšok aminokyseliny, pričom sú aminokyseliny od seba nezávisle zvolené zo súboru zahŕňajúceho Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gin, Glu, Gly, Phe, His, íle, Leu, Lys, Met, Nie, homo-Phe, Phg, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr a Val, pričom sú tieto aminokyseliny prípadne derivatizované,X ¹ , X ² , X ³ , X ⁴ , X ⁵ , X ^{6 are} each independently an amino acid residue, wherein the amino acids are independently selected from the group consisting of Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gln, Glu, Gly, Phe, His, Ile, Leu, Lys, Met, Nle, homo-Phe, Phg, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val, these amino acids optionally being derivatized,

W² skupinu OH, OR, NHR, NR₂, NH₂, *1W ² OH, OR, NHR, NR ₂ , NH ₂ , * 1

W atóm vodíka alebo acylovú skupinu,W is a hydrogen atom or an acyl group,

R alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, n, m od seba nezávisle číslo 0 až 15, pričom v prípadoch, keď m alebo n je väčšie ako 1, majú prípadne X¹ alebo X° od seba nezávisle rovnaký alebo odlišný význam.R is C 1 -C 6 alkyl, n, m independently of each other 0 to 15, wherein in cases where m or n is greater than 1, X ¹ or X 0 are independently the same or different.

Vynález zahŕňa tiež aminokyseliny alebo aminokyselinové zvyšky, ktoré pochádzajú od prírodných aminokyselín a sú derivatizované a ich homológy alebo izoméry. Aminokyselinové zvyšky sú spravidla vzájomne viazané prostredníctvom svojich α-aminoskupín alebo α-karboxylových skupín (peptidové viazanie ).The invention also includes amino acids or amino acid residues that originate from natural amino acids and are derivatized, and homologs or isomers thereof. Typically, amino acid residues are linked to each other through their α-amino or α-carboxyl groups (peptide bonding).

Vynález sa osobitne týka peptidických zlúčenín všeobecného vzorca I, kde znamená X² aminokyselinový zvyšok zvolený zo súboru zahŕňajúceho Thr, Ser, Asp a glycín, ďalej peptiO dických zlúčenín všeobecného vzorca I, kde znamená X aminokyselinový zvyšok zvolený zo súboru zahŕňajúceho Asp, Glu, Arg, Lys, His a Tyr a tiež peptidických zlúčenín všeobecného vzorca I, kde znamená X⁴ aminokyselinový zvyšok zvolený zo súboru zahŕňajúceho Ser, Tyr, Thr, Gly a Val.Particularly, the invention relates to peptide compounds of formula I in which X ² amino acid residue selected from Thr, Ser, Asp, and glycine, further peptiO Dick compounds of formula I, wherein X is an amino acid residue selected from the group consisting of Asp, Glu, Arg , Lys, His and Tyr, and also peptide compounds of formula I in which X ⁴ amino acid residue selected from Ser, Tyr, Thr, Gly, and Val.

Mimoriadne výhodnými zlúčeninami podlá vynálezu sú zlúčeniny (pričom jednotlivé symboly a skratky majú hore alebo d'alej uvedený význam) všeobecného vzorca II i‘Particularly preferred compounds of the invention are those compounds (wherein the individual symbols and abbreviations have the meanings given hereinbefore or hereinafter) of the general formula II;

W¹ — X\ Arg Thr Asp Leu X³ X⁴ Leu Arg X⁵ _m — W²Ha.W ¹ - X \ Arg Thr Leu X ³ X ⁴ Leu Arg X ⁵ _m - W ² Ha.

W¹ — X¹ n Arg Ser Asp Leu X³ X⁴ Leu Arg X⁶m — W²11b,W ¹ - X ¹ Arg Arg Asp Leu X ³ X ⁴ Leu Arg X ⁶ m - W ² 11b,

W¹ — X¹ n Arg Asp Asp Leu X³ X⁴ Leu Arg X⁶ _m — W² .11c,W ¹ - X ¹ n Arg Asp Leu Asp X ³ X ⁴ X Leu Arg ⁶ _m - W ² .11c.

W¹ — X¹ n ArgSer Asp Leu X³X⁴ Leu Arg X⁶ _m — W²||d,W ¹ - X ¹ ArgSer Asp Leu X ³ X ⁴ Leu Arg X ⁶ _m - W ² || d,

W¹— X¹n Arg Gly Asp Leu X³X⁴ Leu Arg X⁶m — W² Íle, alebo všeobecného vzorca IIIW ¹ - X ¹ n Arg Gly Asp Leu X ³ X ⁴ Leu Arg X ⁶ m - W ² Il, or Formula III

W¹ — X\ Arg X² Asp Leu Asp X⁴ Leu Arg X⁶ _m — W²Hla,W ¹ - X \ X ² Arg Asp Leu Asp Leu Arg X ⁴ X ⁶ _m - ² W IIIa,

W¹ — X¹n Arg X² Asp Leu Glu X⁴ Leu Arg X⁶m — W²llIb,W ¹ - X ¹ n Arg X ² Asp Leu Glu X ⁴ Leu Arg X ^6m - W ² llb,

W¹ — Χ¹η Arg X² Asp Leu Arg X⁴ Leu Arg X⁶ _m — W²|||W ¹ - Χ ¹ η Arg X ³ Asp Leu Arg X ⁵ Leu Arg X ⁶ _m - W ² |||

W¹ — X¹n Arg X² Asp Leu Lys X⁴ Leu Arg X⁶m — W²llld,W ¹ - X ¹ n Arg X ² Asp Leu Lys X ⁴ Leu Arg X ⁶ m - W ² llld,

W¹ — X¹n Arg X² Asp Leu His X⁴ Leu Arg X⁶m — W²IHe,W ¹ - X ¹ n Arg X ² Asp Leu His X ⁴ Leu Arg X ⁶ m - W ² IHe,

W¹ — X¹n Arg X² Asp Leu Tyr X⁴ Leu Arg X⁶m — W² > Ulf, alebo všeobecného vzorca IVW ¹ - X ¹ n Arg X ² Asp Leu Tyr X ⁴ Leu Arg X ⁶ m - W ² > Ulf or formula IV

W¹— X'n Arg X² Asp Leu X³ Ser Leu Arg X^sm —W²|Va,W ¹ - X'n Arg X ² Asp Leu X ³ Ser Leu Arg X ^with m - W ² | Va,

W¹ — X\ Arg X² Asp Leu X³ Tyr Leu Arg X⁶ _m — W²iVb,W ¹ - X \ Arg X ³ Asp Leu X ³ Tyr Leu Arg X ⁶ _m - W ² iVb,

W¹— X¹n Arg X² Asp Leu X³Thr Leu Arg X⁶m — W² |y_c,W ¹ - X ¹ n Arg X ² Asp Leu X ³ Thr Leu X ⁶ m - W ² | y _c ,

W¹ — X¹n Arg X² Asp Leu X³ Gly Leu Arg X^sm — W²IVd,W ¹ - X ¹ n Arg X ² Asp Leu X ³ Gly Leu Arg X ^with m - W ² IVd,

W¹— X¹n Arg X² Asp Leu X³ Val Leu Arg X⁶m —W²IVe.W ¹ - X ¹ n Arg X ² Asp Leu X ³ Val Leu Arg X ⁶ m —W ² IVe.

Osobitne výhodné sú peptidické zlúčeniny všeobecného vzorca VParticularly preferred are peptide compounds of formula V

W¹ - X¹nArgThrAspLeuAspSerLeuArgX⁶n - W² (V) a z nich predovšetkým peptidické zlúčniny všeobecného vzorca VIW ¹ - X ¹ nArgThrAspLeuAspSerLeuArgX ⁶ n - W ² (V) and in particular the peptide compounds of the general formula VI

W·¹· - X-'‘_nArgThrAspLeuAspSerLeuArgThrX^_m_^ - W² (VI)W · ¹ · - X- ' _n ArgThrAspLeuAspSerLeuArgThrX ^ _m _ ^ - W ² (VI)

Predovšetkým sú mimoriadne výhodné nasledujúce jednotlivé zlúčeniny, pričom sú zahrnuté tiež zlúčeniny, ktoré sú modifikované na svojom N- alebo C- zakončení.Particularly preferred are the following individual compounds, including those modified at their N- or C-terminus.

(a) H-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-Thr-Tyr-Thr-Ľeu-OH (b) H-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-OH (c) Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-Thr-OH (d) Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-Thr-NH₂ (e) H-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-Thr-OH (f) H-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-Thr-NH₂ (g) H-Arg-Thr-Asp-Leu-Tyr-Tyr-Leu-Arg-Thr-Tyr-OH (h) Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH₂ (a) H-Arg-Thr-Asp-Le-Asp-Ser-Leu-Arg-Thr-Tyr-Thr-Leu-OH (b) H-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg -OH (c) Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-Thr-OH (d) Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-Thr-NH ₂ (e) H-Arg-Thr-Asp-Le-Asp-Ser-Leu-Arg-Thr-OH (f) H-Arg-Thr-Asp-Le-Asp-Ser-Leu-Arg-Thr-NH ₂ (g) h-Arg-Thr-Asp-Leu-Tyr-Tyr-Leu-Arg-Thr-Tyr-OH (h) _{Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2}

Hore up a ďalej uvedené skratky pre zvyšky majú tento význam: and the abbreviations for residues as follows: Ala Ala A A alanín alanine Asn same time N N asparagín asparagine Asp Asp D D asparágová kyselina aspartic acid Arg Arg R R arginín arginine Cys Cys C C cysteín cysteine Gin gin Q Q glutamín glutamine Glu Glu E E glutamínová kyselina glutamic acid Gly Gly G G glycín glycine His His H H histidín histidine íle Ile I I izoleucín isoleucine Leu Leu L L leucín leucine Lys Lys K The lyzin lysine Met Met M M metionín methionine

Nie Not norleucín norleucine Orn Orn ornitín ornithine Phe Phe F F fenylalanín phenylalanine Phg PHG fenylglycín phenylglycine Pro for i' P i ' P prolín proline Ser Ser s with serin serine Thr Thr T T treonín threonine Trp Trp w w tryptofán tryptophan Tyr Tyr Y Y tyrozín tyrosine Val wall v in valín . valine.

Pokiaľ môžu byt uvedené aminokyseliny v niekoľkých enantiomérnych formách, zahŕňa vynález všetky hore i ďalej uvedené formy napríklad ako podiely zlúčenín všeobecného vzorca I až VI, a tiež ich zmesi. Okrem toho môžu mat aminokyseliny, napríklad ako podiely zlúčenín všeobecného vzorca I až VI, známe chrániace skupiny.As long as the amino acids can be present in several enantiomeric forms, the invention includes all of the above and below forms, for example, as proportions of compounds of formulas I to VI, as well as mixtures thereof. In addition, amino acids, for example as proportions of compounds of formulas I to VI, may have known protecting groups.

Zlúčeniny všeobecného vzorca In až VI môžu mat jedno alebo niekoľko chirálnych center a môžu byt preto v rôznych stereoizomérnych formách. Vynález zahŕňa všetky tieto formy, najmä D- a L-formy, a to ako v enantiomérnych tak tiež v racemických zmesiach. Hore a ďalej uvedené všeobecné vzorce I a II zahŕňajú tiež zodpovedajúce soli, predovšetkým zodpovedajúce fyziologicky prijateľné soli.Compounds of formulas (I) through (VI) may have one or more chiral centers and may therefore exist in different stereoisomeric forms. The invention encompasses all of these forms, especially the D- and L-forms, both in enantiomeric and racemic mixtures. The formulas I and II above and also include the corresponding salts, in particular the corresponding physiologically acceptable salts.

Vynález zahŕňa tiež takzvané prodrogové deriváty, to znamená zlúčenín všeobecného vzorca¹I, ktoré sú obmenené alkýlovými skupinami alebo acylovými skupinami, cukry alebo oligopeptidy, ktoré sa v organizmu rýchlo štiepia za uvoľnenia účinnej zlúčeniny podľa vynálezu všeobecného vzorca I.The invention also includes so-called prodrug derivatives, i.e., compounds of formula ⁽ I) which are altered by alkyl or acyl groups, sugars or oligopeptides which are rapidly cleaved in the body to release the active compound of formula (I).

Vynález zahŕňa tiež zlúčeniny a ich deriváty, ktoré sa skladajú z peptidov podľa vynálezu a zo známych signálnych znakov, ktoré umožňujú ľahko dokázat peptidy. Príkladmi takých derivátov sú biotinylované alebo fluorescenčné značené peptidy.The invention also encompasses compounds and derivatives thereof, which consist of the peptides of the invention and known signaling features which make it easy to detect the peptides. Examples of such derivatives are biotinylated or fluorescently labeled peptides.

Všeobecne sú peptidy podlá vynálezu lineárne, môžu byt však tiež cyklizované. Vynález zahŕňa nie len uvedené peptidy všeobecného vzorca I až VI avšak tiež ich zmesi a prostriedky, ktoré popri týchto zlúčenín podlá vynálezu obsahujú tiež ďalšie farmaceutický účinné látky alebo adjuvansy, ktoré žiaducim spôsobom ovplyvňujú primárne farmakologické pôsobenie peptidov podlá vynálezu.In general, the peptides of the invention are linear but can also be cyclized. The invention encompasses not only the peptides of the formulas I to VI but also mixtures thereof and compositions which, in addition to the compounds of the invention, also contain other pharmaceutical active substances or adjuvants which desirably affect the primary pharmacological action of the peptides of the invention.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I a východiskové látky na ich prípravu sa pripravujú známymi spôsobmi, ktoré sú opísané v literatúre (napríklad v štandardných publikáciách ako je Houbeh-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme Vérlag, Stuttgart), a to za reakčných podmienok, ktoré sú pre menované reakcie známe a vhodné. Pritom sa môžu tiež používat známe, tu bližšie neopisované varianty.The compounds of formula I and the starting materials for their preparation are prepared by known methods described in the literature (for example, in standard publications such as Houbeh-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme Verlag, Stuttgart) under reaction conditions, which are known and suitable for the above reactions. It is also possible to use known variants not described here in greater detail.

Peptidy podlá vynálezu sa môžu predovšetkým pripravovat syntézou v pevnej fáze a následným odštiepením a čistením spôsobom, ktorý opísal Jonczyk a Meienhofer (Peptides, Proc. 8th Am. Pept. Symp. Eds. V. Hrubý a D.H. Rich, Pierce Comp. III, str. 73 až 77, 1983 alebo Angew. Chem. 104, str. 375, 1992) alebo spôsobom, ktorý opísal Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 94, str.3102, 1972). Môžu sa tiež pripravoval: známymi spôsobmi prípravy aminokyselín a peptidov, ktoré sú známe z početných štandardných publikácií a patentových spisov (napríklad Novabiochem - 1999 Catalog & Peptide Synthesis Handbook der Calbiochem-Novabiochem GmbH, D-65796 Bad Soden). Biotinylované alebo fluorescenčné značené peptidy/proteíny sa môžu tiež pripravovat známymi spôsobmi (napríklad E.A. Bayer a Wilchek M., Methods of Biochemical Analysis, zväzok 26, The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology; a Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,In particular, the peptides of the invention can be prepared by solid phase synthesis followed by cleavage and purification as described by Jonczyk and Meienhofer (Peptides, Proc. 8th Am. Pept. Symp. Eds. V. Hruby and DH Rich, Pierce Comp. III, p. 73-77 (1983) or Angew. Chem. 104: 375 (1992) or by the method of Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 94 (1972)). They can also be prepared by known methods for the preparation of amino acids and peptides, which are known from numerous standard publications and patent publications (e.g. Novabiochem - 1999 Catalog & Peptide Synthesis Handbook of Calbiochem-Novabiochem GmbH, D-65796 Bad Soden). Biotinylated or fluorescently labeled peptides / proteins can also be prepared by known methods (e.g., EA Bayer and Wilchek M., Methods of Biochemical Analysis, Volume 26, The Use of the Avidin-Biotin Complex as and Tool in Molecular Biology; and Handbook of Fluorescent Probes) and Research Chemicals,

6. vydanie, 1996, R.P. Haugland, Molecular Probes, Inc.; alebo tiež svetový patentový spis číslo 97/14716).6th Edition, 1996, R.P. Haugland, Molecular Probes, Inc .; or also World Patent Specification No. 97/14716).

Peptidy podía vynálezu všeobecného vzorca I až VI sa môžu pripravovať tiež tak, že sa uvolňujú zo svojich funkčných derivátov solvolýzou, najmä hydrolýzou alebo hydrogenolýzou. Výhodnými východiskovými látkami na solvolýzu prípadne na hydrogenolýzu sú zlúčeniny, ktoré inak zodpovedajú hore uvedeným všeobecným vzorcom, majú však miesto volných aminoskupín alebo hydroxylových skupín zodpovedajúce chránené aminoskupiny alebo hydroxyskupiny, s výhodou zlúčeniny, ktoré miesto atómu vodíka, ktorý je viazaný s atómom dusíka majú skupinu chrániacu aminoskupinu, alebo miesto atómu vodíka v hydroxylovej skupine majú skupinu chrániacu hydroxylovú skupinu. To rovnako platí pre karboxylové kyseliny, ktoré môžu byť chránené tak, že miesto atómu vodíka v skupine -CO-OH majú chrániacu, napríklad esterovú, skupinu.The peptides of the formulas I-VI according to the invention can also be prepared by releasing them from their functional derivatives by solvolysis, in particular by hydrolysis or hydrogenolysis. Preferred starting materials for solvolysis or hydrogenolysis are compounds which otherwise correspond to the above formulas but have, instead of free amino or hydroxyl groups, corresponding protected amino or hydroxy groups, preferably compounds which have, instead of a hydrogen atom which is bound to a nitrogen atom, have an amino protecting group, or a hydrogen atom in the hydroxyl group, has a hydroxyl protecting group. This also applies to carboxylic acids which can be protected such that they have a protecting group, for example an ester group, instead of a hydrogen atom in the -CO-OH group.

Výraz skupina chrániaca aminoskupinu je všeobecne známy a ide o skupiny, ktoré sú vhodné na ochranu (blokovanie) aminoskupiny pred chemickými reakciami, ktoré sú však lahko odstránitelné, keď je žiadúca reakcia na inom mieste molekuly vykonaná. Typické pre také skupiny sú predovšetkým nesubstituované alebo substituované skupiny acylové, arylové, aralkoxymetylové alebo aralkylové. Pretože sa skupiny, chrániace aminoskupinu, po žiadúcej reakcii (alebo po slede reakcií) odstraňujú, nemá ich druh a velkosť rozhodujúci význam. Výhodné sú však skupiny s 1 až 20 a najmä s 1 až 8 atómami uhlíka. Výraz acylová skupina sa tu vždy rozumie v najširšom zmysle slova. Zahŕňa acylové skupiny odvodené od alifatických, aralifatických, aromatických alebo heterocyklických karboxylových alebo sulfónových kyselín, ako predovšetkým skupiny alkoxykarbonylové, aryloxykarbonylové a najmä aralkoxykarbonylové. Ako príklady takých acylových skupín sa uvádzajú skupiny alkanoylové ako acetylová, propionylová, butyrylová skupina; aralkanoylové ako fenylace10 tylová skupina; aroylové ako benzoylová alebo toluylová skupina; aryloxyalkanoylové jako fenoxyacetylová skupina; alkoxykarbonylové, ako skupina metoxykarbonylová, etoxykarbonylová, 2,2,2-trichlóretoxykarbonylo.vá, izopropoxykarbonylová, terc.-butoxykarbónylová (BOC), 2-jódetoxykarbonylová; aralkyloxykarbonylové ako skupina benzyloxykarbonylová (CBZ),The term amino protecting group is generally known and refers to groups which are suitable for protecting (blocking) the amino group from chemical reactions, but which are readily removable when the desired reaction elsewhere in the molecule is carried out. Typically, such groups are unsubstituted or substituted acyl, aryl, aralkoxymethyl or aralkyl groups. Since the amino-protecting groups are removed after the desired reaction (or sequence of reactions), their type and size are not critical. However, groups having 1 to 20, and in particular 1 to 8, carbon atoms are preferred. The term acyl is always understood in the broadest sense. It includes acyl groups derived from aliphatic, araliphatic, aromatic or heterocyclic carboxylic or sulfonic acids, in particular alkoxycarbonyl, aryloxycarbonyl and especially aralkoxycarbonyl groups. Examples of such acyl groups include alkanoyl groups such as acetyl, propionyl, butyryl; aralkanoyl such as phenylation; aroyl such as benzoyl or toluyl; aryloxyalkanoyl such as a phenoxyacetyl group; alkoxycarbonyl such as methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl, isopropoxycarbonyl, tert-butoxycarbonyl (BOC), 2-iodoethoxycarbonyl; aralkyloxycarbonyl as a benzyloxycarbonyl (CBZ) group,

4-metoxybenzyloxykarbonylová, 9-fluórenylmetoxykarbonylová (FMOC) skupina a arylsulfonylová skupina ako skupina Mtr. Výhodnými skupinami, chrániacimi aminoskupinu, sú skupiny BOC a Mtr, ďalej skupina CBZ, Fmoc, benzylová a acetylová skupina.4-methoxybenzyloxycarbonyl, 9-fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC) and arylsulfonyl such as Mtr. Preferred amino protecting groups are BOC and Mtr, CBZ, Fmoc, benzyl and acetyl.

Ako je hore uvedené, zahŕňajú peptidy podlá vynálezu tiež svoje fyziologicky prijatelné soli. Tak sa zásada všeobecného vzorca I môže kyselinou meniť na príslušnú adičnú sol s kyselinou, napríklad reakciou ekvivalentného množstva zásady a kyseliny v inertnom rozpúšťadle, ako je napríklad etanol a následným odparením rozpúšťadla. Na túto reakciu prichádzajú do úvahy najmä kyseliny, ktoré poskytujú fyziologicky prijatelné soli. Môžu sa používať anorganické kyseliny, ako sú kyselina sírová, dusičná, halogenovodíkové kyseliny, ako chlorovodíková alebo bromovodíková, fosforečné kyseliny, ako kyselina ortofosforečná, sulfamínová kyselina a organické kyseliny, predovšetkým alifatické, alicyklické, aralifatické, aromatické alebo heterocyklické jednosýtne alebo niekolkosýtné karboxylové, sulfónové alebo sírové kyseliny, ako sú kyselina mravčia, octová, propiónová, pivalová, dietyloctová, malónová, jantárová, pimelová, fumarová, maleiriová, mliečna, vínna, jablčná, citrónová, glukónová, askorbová, nikotínová, izonikotínová, metánsulfónová, etánsulfónová, etándisulfónová, 2-hydroxyetánsulfónová, benzénsulfónová, p-toluénsulfónová, naftalénmonosulfónová a naftaléndisulfónová a laurylsírová kyselina. Soli s fyziologicky nevhodnými kyselinami, napríklad pikráty, sa môžu používať na izoláciu a/alebo na čistenie zlúčenín všeobecného vzorca I.As mentioned above, the peptides of the invention also include their physiologically acceptable salts. Thus, the base of formula (I) can be converted into the appropriate acid addition salt by acid, for example by reacting an equivalent amount of base and acid in an inert solvent such as ethanol and subsequently evaporating the solvent. Suitable acids for this reaction are, in particular, those which give physiologically acceptable salts. Inorganic acids such as sulfuric, nitric, hydrohalic acids such as hydrochloric or hydrobromic acids, phosphoric acids such as orthophosphoric acid, sulfamic acid and organic acids, in particular aliphatic, alicyclic, araliphatic, aromatic or heterocyclic monohydric or non-fatty acid carboxylic, sulfonic acids may be used. or sulfuric acids such as formic, acetic, propionic, pivalic, diethyl acetic, malonic, succinic, pimelic, fumaric, maleiric, lactic, tartaric, malic, citric, gluconic, ascorbic, nicotinic, isonicotinic, ethanesulfonic, methanesulfonic, methanesulfonic -hydroxyethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, naphthalene monosulfonic acid, naphthalenedisulfonic acid and lauryl sulfuric acid. Salts with physiologically unacceptable acids, for example picrates, can be used for the isolation and / or purification of the compounds of formula I.

Na druhej strane sa zlúčeniny všeobecného vzorca I reakciou so zásadou môžu meniť na svoje fyziologicky vhodné soli kovové alebo amóniové. Ako soli prichádzajú do úvahy predovšetkýme soli sodné, draselné, horečnaté, vápenaté a amóniové, ďalej substituované amóniové soli, napríklad dimetylamóniové, dietylamóniové, diizopropylamóniové, monoetanolamóniové, dietanolamóniové, alebo diizopropanolamóniové, cyklohexylamóniové, dicyklohexylamóniové, dibenzyletyléndiamóniové, ďalej napríklad soli s arginínom alebo s lyzínom.On the other hand, the compounds of the formula I can be converted into their physiologically acceptable metal or ammonium salts by reaction with a base. Suitable salts are, in particular, the sodium, potassium, magnesium, calcium and ammonium salts, further substituted ammonium salts, e.g. .

Peptidické zlúčeniny podlá vynálezu všeobecného vzorca I sa môžu používať ako liečivá v humánnej a vo veterinárnej medicíne, predovšetkým na profylaxiu a/alebo na liečenie chorôb, na ktorých sa podielajú epitelové bunky. Osobitne výhodné sú pri ošetrovaní chorôb alebo zápalov alebo procesov hojenia rán kože, dýchacích orgánov, žalúdočného a črevového traktu, ako sú napríklad apoplexia, angína pectoris, nádorové ochorenia, osteolytické ochorenia ako je osteoporóza, patologické angiogénne ochorenia napríklad zápaly, fibróza plúc, oftalmologické ochorenia, diabetická retinopatia, svalová degenerácia, myopia, očná histoplazmóza, reumatická artritída, osteoartritída, rubeotický glaukóm, vredová kolitída, Crohnova choroba, ateroskleróza, psoriáza, restenóza po angioplastike, akútne zlyhanie obličiek alebo zápal obličiek.The peptide compounds of the formula I according to the invention can be used as medicaments in human and veterinary medicine, in particular for the prophylaxis and / or treatment of diseases in which epithelial cells are involved. Particularly preferred in the treatment of diseases or inflammations or healing processes of the skin, respiratory organs, stomach and intestinal tract, such as apoplexy, angina pectoris, cancer, osteolytic diseases such as osteoporosis, pathological angiogenic diseases such as inflammation, lung fibrosis, ophthalmology , diabetic retinopathy, muscle degeneration, myopia, ocular histoplasmosis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, rubeotic glaucoma, ulcerative colitis, Crohn's disease, atherosclerosis, psoriasis, restenosis after angioplasty, acute renal failure or inflammation of the kidneys.

Vynálezom sú preto peptidické zlúčeniny uvedených vzorcov vrátane ich fyziologicky prijateľných solí ako liečivá, diagnostiká alebô rekčné činidlá.Accordingly, the invention provides the peptide compounds of the above formulas, including their physiologically acceptable salts, as medicaments, diagnostics or reagents.

Vynálezom sú predovšetkým zodpovedajúce liečivá ako inhibítory k ošetrovaní chorôb, ktoré sú bezprostredne alebo nie bezprostredne spôsobené expresiou α_νβ₆ integrínových receptorov, najmä patogénnych angiogénnych chorôb, trombóz, srdcového infarktu, koronárnych ochorení srdca, artériosklerózy, nádorov, osteoporózy, zápalov, infekcií ako tiež na ovplyvňovanie procesov hojenia rán.The invention is particularly appropriate medicaments as inhibitors for the treatment of disorders which are indirectly or directly caused by the expression of _α ν β ₆ integrin receptors, in particular pathogenic angiogenic diseases, thromboses, cardiac infarction, coronary heart diseases, arteriosclerosis, tumors, osteoporosis, inflammation, infections such as also to influence wound healing processes.

Vynálezom sú tiež farmaceutické prostriedky, ktoré ako liečivo obsahujú aspoň jednu zlúčeninu všeobecného vzorca I. až VI,* ako tiež nosič a/alebo pomocné látky.The invention also relates to pharmaceutical compositions comprising as medicament at least one compound of the formulas I to VI as well as a carrier and / or excipients.

Vynález sa tiež týka použitia peptidických zlúčenín podlá vynálezu a/alebo ich fyziologicky prijatelných solí na výrobu liečiv na ošetrovanie chorôb, ktoré sú bezprostredne alebo nie bezprostredne spôsobené expresiou α_νβ₆ integrínových receptorov, predovšetkým patogénnych angiogénnych chorôb, trombóz, srdcového infarktu, koronárnych ochorení srdca, artériosklerózy, nádorov, osteoporózy, zápalov, infekcií ako tiež na ovplyvňovanie procesov hojenia rán.The invention also relates to the use of peptide compounds of the invention and / or physiologically acceptable salts thereof for the manufacture of a medicament for the treatment of disorders which are indirectly or directly caused by the expression of _α ν β ₆ integrin receptors, in particular pathogenic angiogenic diseases, thromboses, cardiac infarction, coronary heart diseases heart, arteriosclerosis, tumors, osteoporosis, inflammation, infections as well as to influence wound healing processes.

Liečivá podlá vynálezu prípadne farmaceutické prostriedky, ktoré ich obsahujú sa môžu používat v humánnej a vo veterinárnej medicíne. Ako nosiče prichádzajú do úvahy anorganické alebo organické látky, ktoré sú vhodné na enterálne (napríklad orálne) alebo na parenterálne alebo topické podávanie alebo na podávanie vo forme inhalačných sprejov a ktoré nereagujú so zlúčeninami všeobecného vzorca I, ako sú napríklad voda, rastlinné oleje, benzylalkoholy, alkylénglykoly, polyetylénglykoly, glyceríntriacetát, želatína, uhlohydráty, ako laktóza alebo škroby, stearát horečnatý, mastenec a vazelína. Na orálne použitie sa hodia predovšetkým tablety, pilulky, dražé, kapsuly, prášky, granuláty, sirupy, stavy alebo kvapky, na rektálne použitie čapíky, na parenterálne · použitie roztoky, predovšetkým olejové alebo vodné roztoky, d’alej suspenzie, emulzie alebo implantáty, na topické použitie masti, krémy alebo púdre. Zlúčeniny podlá vynálezu sa tiež môžu lyofilizovat a získané lyofilizáty sa môžu napríklad používat na prípravu vstrekovateIných prostriedkov. Prostriedky sa môžu sterilizovat a/alebo môžu obsahovat pomocné látky, ako sú klzné činidlá, konzervačné, stabilizačné činidlá a/alebo namáčadlá, emulgátory, soli na ovplyvnenie osmotického tlaku, tlmivé roztoky, farbivá, chuťové prísady a/alebo ešte jednu ďalšiu alebo ešte niekoľko ďalších účinných látok, ako sú napríklad vitamíny. Na podávanie vo forme inhalačných sprejov sa účinná látka rozpúšťa alebo suspenduje v hnacom plyne alebo v zmesi hnacích plynov (ako sú napríklad oxid uhličitý alebo fluórchlórované uhľovodíky). V takom prípade sa pritom používajú účinné látky v mikronizovanej forme, pričom sa môže pridávať aspoň jedno fyziologické kompatibilné rozpúšťadlo, napríklad etanol. Inhalačné roztoky sa môžu podávať pri použití známych zariadení na tento účel.The medicaments according to the invention or the pharmaceutical compositions containing them can be used in human and veterinary medicine. Suitable carriers are inorganic or organic substances which are suitable for enteral (e.g. oral) or parenteral or topical administration or for administration in the form of inhalation sprays and which do not react with compounds of the formula I, such as water, vegetable oils, benzyl alcohols , alkylene glycols, polyethylene glycols, glycerol triacetate, gelatin, carbohydrates such as lactose or starches, magnesium stearate, talc and petrolatum. Especially suitable for oral use are tablets, pills, dragees, capsules, powders, granules, syrups, conditions or drops, for rectal suppositories, for parenteral use solutions, in particular oily or aqueous solutions, further suspensions, emulsions or implants, for topical use ointments, creams or powders. The compounds of the invention may also be lyophilized and the resulting lyophilisates used, for example, for the preparation of injectables. The compositions may be sterilized and / or may contain adjuvants such as glidants, preservatives, stabilizers and / or wetting agents, emulsifiers, salts for affecting the osmotic pressure, buffers, coloring agents, flavoring agents and / or one or more more other active ingredients such as vitamins. For administration in the form of inhalation sprays, the active ingredient is dissolved or suspended in a propellant or propellant mixture (such as, for example, carbon dioxide or fluorocarbon). In this case, the active compounds are used in micronized form, and at least one physiologically compatible solvent, for example ethanol, can be added. Inhalable solutions may be administered using known devices for this purpose.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa vynálezu sa spravidla používajú v dávkach podobných ako obchodne známe peptidy, najmä obdobne ako zlúčeniny podľa amerického patentového spisu číslo 4 472305, s výhodou v dávke približne 0,05 až 500 mg, predovšetkým 0,5 až 100 mg na dávkovaciu jednotku. Denná dávka je s výhodou približne 0,01 až 20 mg/kg telesnej hmotnosti. Určitá dávka pre každého jednotlivého jedinca závisí od najrôznejších faktorov, napríklad od účinnosti určitej použitej zlúčeniny, od veku, telesnej hmotnosti, všeobecného zdravotného stavu, pohlavia, stravy, od okamihu a cesty podania, od rýchlosti vylučovania, od kombinácie liečiv a od závažnosti určitého ochorenia. Výhodné je parenterálne podávanie.The compounds of the formula I according to the invention are generally used in doses similar to commercially known peptides, in particular analogously to the compounds of U.S. Pat. No. 4,472,305, preferably at a dose of about 0.05 to 500 mg, in particular 0.5 to 100 mg per dosing. unit. The daily dose is preferably about 0.01 to 20 mg / kg body weight. The dose for each individual depends on a variety of factors, such as the efficacy of the particular compound used, age, body weight, general health, sex, diet, time and route of administration, elimination rate, drug combination, and severity of the disease. . Parenteral administration is preferred.

Vynález zahŕňa tiež rekombinantné DNA-sekvencie, ktoré obsahujú úseky, ktoré kódujú oblasti peptidov majúcich peptidické štrukturálne motívy podlá vynálezu všeobecného vzorca I až VI.The invention also encompasses recombinant DNA sequences which comprise regions which encode regions of peptides having the peptide structural motifs of the invention of formulas I to VI.

Také DNA sá môžu prenášať časticami na bunky, ako opisuje Ch. Andree a kol. (Proc. Natl. Acad. Aci. 91, str. 12188 až 12192, 1994) alebo môžu zvyšovať transfer na bunky inými pomocnými činiteľmi, ako sú lipozómy (A.I. Aronsohn a J.A. Hughes, J. Drug Targeting 5, str. 163 až 169, 1997).Such DNAs can be transferred by particles to cells as described by Ch. Andree et al. (Proc. Natl. Acad. Aci. 91: 12188-12192, 1994) or may enhance cell transfer by other co-agents such as liposomes (AI Aronsohn and JA Hughes, J. Drug Targeting 5, pp. 163-169) (1997).

Transfer takej DNA by sa preto mohol použiť v kvasinkách prostredníctvom Baculovírusov alebo v bunkách cicavcov na produkciu peptidických látok.Transfer of such DNA could therefore be used in yeast via Baculoviruses or in mammalian cells to produce peptides.

Pokial sa infikuje živočíšny alebo ludský organizmus takou rekombinantnou DNA, môžu sa viazať infikovanými bunkami nakoniec vytvorené peptidy podlá vynálezu bezprostredne na a_vp₆-integrínový receptor, napríklad na nádorové bunky a môžu ich blokovať.When an animal or human organism is infected with such recombinant DNA, the infected cells can ultimately bind to and block the α _- β ₆ -integrin receptor, for example, the tumor cells of the invention.

Zodpovedajúca rekombinantná DNA, ktorá sa môže pripraviť známymi a bežnými spôsobmi, môže byť však tiež napríklad vo forme vírusovej DNA, ktorá obsahuje úseky, ktoré kódujú vírusový obalový proteín. Infekciou hosťujúceho organizmu takými rekombinantnými, predovšetkým nepatogénnymi vírusmi, sa môžu hostiteľské bunky, ktoré exprimujú integrín α_νβ₆ s výhodou napadať (cielenie).However, the corresponding recombinant DNA, which can be prepared by known and conventional methods, can also be, for example, in the form of viral DNA which contains regions which encode a viral coat protein. By infecting the host organism with such recombinant, especially non-pathogenic viruses, host cells that express integrin α _ν β _{6 can be} advantageously attacked (targeting).

Vhodnými vírusmi sú napríklad adenovírusy, ktoré sa často používajú ako vektory pre cudzie gény v bunkách cicavcov. Pre svoje početné vlastnosti sa hodia na génovú terapiu, ako uvádza S.J. Watkins a kol. (Gene Therapy 4, str. 1004 až 1012, 1997) a tiež J. Engelhard a kol. (Hum. Gene Ther. 4, str. 759 až 769, 1993). Ako uvádza A. Fasbender a kol. (J. Clin. Invest. 102, str. 184 až 193, 1998), je spoločným problémom génovej terapie vírusovými a nevírusovými vektormi obmedzená účinnosť transferu génu. Hore opísanou prídavnou ligandovou sekvenciou pre integrín α_γβ₆ v obalovom proteíne adenovírušov sa môže dosiahnuť zlepšenie transferu napríklad cystický fiobrózový transmembránový vodivostný regulátor (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulátor, CFTR) cDNA.Suitable viruses are, for example, adenoviruses, which are often used as vectors for foreign genes in mammalian cells. Because of their numerous properties, they are suitable for gene therapy, as reported by SJ Watkins et al. (Gene Therapy 4, pp. 1004-1012, 1997) and also J. Engelhard et al. (Hum. Gene Ther. 4: 759-769, 1993). As reported by A. Fasbender et al. (J. Clin. Invest. 102: 184-193, 1998), the common problem of gene therapy with viral and non-viral vectors is the limited efficiency of gene transfer. The above described additional ligand sequence for integrin α _γ β ₆ in the adenovirus coat protein can improve the transfer of, for example, the cystic phobrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) cDNA.

Podobne ako opisuje T. Tanaka a kol. (Cancer ResearchSimilar to T. Tanaka et al. (Cancer Research

58, str. 3362 až 3369, 1998) sa môžu využiť miesto DNA pre angiostatín tiež DNA pre sekvencie podlá vynálezu na trans15 fekciu buniek prostredníctvom retrovírusových alebo adenovírusových vektorov.58, p. 3362-3369 (1998), the DNA for the sequences of the invention can also be used in place of the angiostatin DNA for trans15 fection of cells via retroviral or adenoviral vectors.

Peptidy podlá vynálezu sa môžu používať tiež v komplexe lipozómov zo systému lipid/peptid/DNA vyrobenom na transfekciu bunkových kultúr z lipozómového komplexu skladajúceho sa zo systému lipid/DNA (bez peptidu) na použitie v génovej terapii ludí. Prípravu komplexu lipozómov zo systému lipid/DNA/peptid opísal napríklad S.L. Hart a kol. (Lipid-Mediated Enhancement of Transfection by a Non-Viral Integrin-Targeting Vector, Human Gene Therapy 9, str. 575 až 585, 1998).The peptides of the invention may also be used in a liposome complex of a lipid / peptide / DNA system made to transfect cell cultures from a liposome complex consisting of a lipid / DNA system (without peptide) for use in human gene therapy. The preparation of the liposome complex from the lipid / DNA / peptide system has been described, for example, by S.L. Hart et al. (Lipid-Mediated Enhancement of Transfection by Non-Viral Integrin-Targeting Vector, Human Gene Therapy 9, pp. 575-585, 1998).

Komplex systému lipid/DNA/peptid je pripravítelný napríklad z nasledujúcich kmeňových roztokov:The lipid / DNA / peptide complex can be prepared, for example, from the following stem solutions:

μg/μl Lipofectinu (ekvimolárna zmes DOTMA (= N-[l-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimetylamóniumchlorid) a DOPE (dioleylfosfatidyletanolamín), 10 μg/ml plazmidu DNA a 100 μg/ml peptidu. ako DNA tak tiež peptid sa ža týmto účelom rozpustia v bunkovom kultivačnom prostredí.μg / μl Lipofectin (equimolar mixture of DOTMA (= N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride) and DOPE (dioleylphosphatidylethanolamine), 10 μg / ml plasmid DNA and 100 μg / ml For this purpose, both the DNA and the peptide are dissolved in the cell culture medium.

Komplex, lypozómov sa pripraví zmiešaním týchto troch zložiek v určitom hmotnostnom pomere (lipid:DNA:peptid napríklad 0,75:1:4). Komplex lypozómov a DNA je už opísaný pre génovú terapiu ludí (Caplen N.J. a kol., Liposome-mediated CFTR gene transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis, Náture Medicíne 1, str. 39 až 46, 1995).The liposome complex is prepared by mixing the three components at a particular weight ratio (lipid: DNA: peptide, for example, 0.75: 1: 4). The liposome-DNA complex has already been described for human gene therapy (Caplen N.J. et al., Liposome-mediated CFTR gene transfer to the nasal epithelium of cystic fibrosis patients, Nature Medicine 1, pp. 39-46, 1995).

Vynález sa preto tiež týka použitia zodpovedajúcim spôsobom modifikovanej rekombinantnej DNA z gén uvoľňujúcich systémov, predovšetkým zo systému vírus-DNA, na ošetrovanie chorôb, ktoré sú bezprostredne alebo nie bezprostredne spôsobené expres iou «_νβ₆ integrínových receptorov, najmä patogénnych angiogénnych chorôb, trombóz, srdcového infarktu, koronárnych ochorení srdca, artériosklerózy, nádorov, osteoporózy, zápalov, infekcií ako tiež na ovplyvňovanie procesov hojenia rán.The invention furthermore relates to the use of accordingly modified recombinant DNA of gene-releasing systems, in particular the system of virus DNA, for the treatment of disorders which are indirectly or directly caused by express iou _{'ν β 6} integrin receptors, in particular pathogenic angiogenic diseases, thromboses, heart attack, coronary heart disease, arteriosclerosis, tumors, osteoporosis, inflammation, infections as well as to influence wound healing processes.

Nové zlúčeniny podlá vynálezu sa tiež môžu používať ako integrínové Ugandy na výrobu stĺpcov pre afinitnú chromatograf iu na výrobu čistých integrínov. Komplex Avidinom .deriyatizovaného nosiča, napríklad Sepharose, a nových zlúčenín všeobecného vzorca I sa vytvára známym spôsobom (ako opisuje napríklad E.A. Bayer a M. Wilchek, Methods of Biochemical Analysis, zväzok 26, The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology). Ako polymérne nosičove materiály sú pre tento účel vhodné polymérne pevné fázy známe z chémie peptidov s výhodou s hydrofilnými vlastnosťami, napríklad zositované polycukry, ako sú celulóza, Sepharose alebo Sephadex^R, akrylamidy, polymér na polyetylénglykolovej báze alebo Tentakelpolyméry^R.The novel compounds of the invention can also be used as integrin ligands for the production of affinity chromatography columns for the production of pure integrins. A complex of an Avidin-derivatized carrier such as Sepharose and novel compounds of formula I is formed in a manner known per se (as described, for example, by EA Bayer and M. Wilchek, Methods of Biochemical Analysis, Volume 26, The Use of the Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology). Suitable polymeric carrier materials for this purpose are the polymeric solid phases known from peptide chemistry, preferably with hydrophilic properties, for example crosslinked polycugars such as cellulose, Sepharose or Sephadex ^R , acrylamides, polyethylene glycol-based polymer or Tentacelpolymers ^R.

Vynález objasňujú, žiadnym spôsobom však neobmedzujú nasledujúce príklady praktického uskutočnenia.The invention is illustrated by the following non-limiting examples.

Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Príklad 1Example 1

Príprava a čistenie peptidu podía vynálezuPreparation and purification of the peptide of the invention

Peptidy podía vynálezu sa v podstate pripravujú a čistia použitím Fmoc-stratégie za chránenia ku kyseline labilných postranných reťazcov na živiciach labilných ku kyseline pri využití obchodne dostupných kontinuálnych (continuous flow) syntetizérov peptidov podía opisu Haubnera a kol. (J. Am. Chem. Soc. 118, str. 17703, 1996).The peptides of the invention are essentially prepared and purified using the Fmoc strategy to protect acid-labile side chains on acid-labile resins using commercially available continuous flow peptide synthesizers as described by Haubner et al. (J. Am. Chem. Soc. 118, 17703 (1996)).

Príkladne sa opisuje príprava a čistenie peptidamidu Ac-RTDLDSLR-NH₂. Na prípravu peptidovej kyseliny sa predloží o-chlórtritylchloridová živica (Novabiochem) podía údajov vý17 robcu so zodpovedajúcou C-koncovou Fmoc-aminokyselinou a použije sa v syntéznom zariadení podlá návodu výrobcu (Milligen). Zásadné kroky sú premytie - odštiepenie Fmoc chrániacej skupiny - premytie - kopulácia s nasledujúcou Fmoc-aminokyselinóu - acétylácia (capping) - premytie. Pokial je žiaduca N-koncová acylácia po poslednej aminokyselinovej kopulácii, vykoná sa po odštiepení poslednej Fmoc-chrániacej skupiny použitím zodpovedajúceho aktivovaného acylového zvyšku, napríklad acetanhydridu. Postupne sa kopulujú 2 g 9-Fmoc-aminoxantenyloxyživice (Novabiochem, 0,37 mmol/g) vždy s 0,45 g hydroxybenzoťriazolhydrátom (HOBt), s 0,5 ml etyldiizopropylamínu, vždy s 4 ekvivalentmi diizopropylkarbodiimidu (DIC) a s Fmoc-aminokyselinou v dimetylformamide v obchodnom syntéznom zariadení pri použití typického postupu (zariadenie a príručka Milligen 9050 PepSynthesizer™, 1985) pri 60 minútach pre každý kopulačný krok. Premývanie sa vykonáva v dimetylformamide počas 10 minút, štiepenie v systéme piperidín/DMF (1:4 objemovo) počas 5 minút, N-koncová acétylácia (capping) sa vykonáva pri použití systému acetanhydrid/pyridín/dimetylformamid (2:3:15 objemovo) počas 15 minút. Používajú sa aminokyseliny Fmoc-Arg(Pmc), potom Fmoc-Leu, potom Fmoc-Ser(But), potom Fmoc-Asp(OBut) potom Fmoc-Leu, potom Fmoc-Asp(OBut), potom Fnoc-Thr(But) a nakoniec Fmoc-Arg(Pmc). Po premytí dimetylformamidom a izopropanolom a po následnom vysušení vo vákuu sa získa 3,48 g na N-zakončení acetylovej peptidylovej živice Ac-Arg (Pmc) -Thr(But) -Asp (OBut) -Leu-Asp(OBut) -Ser(But) -Leu -Arg(Pmc)-aminoxantenyloxyživice.For example, the preparation and purification of the Acid-RTDLDSLR-NH ₂ peptidamide is described. For the preparation of the peptide acid, o-chlorotrityl chloride resin (Novabiochem) was submitted according to the manufacturer's data with the corresponding C-terminal Fmoc amino acid and used in a synthesis apparatus according to the manufacturer's instructions (Milligen). The essential steps are washing - cleavage of the Fmoc protecting group - washing - coupling with the following Fmoc-amino acid - acetylation (capping) - washing. If N-terminal acylation is desired after the last amino acid coupling, it is carried out after cleavage of the last Fmoc-protecting group using the corresponding activated acyl residue, for example acetic anhydride. Subsequently, 2 g of 9-Fmoc-aminoxanthenyloxy resin (Novabiochem, 0.37 mmol / g) are coupled successively with 0.45 g of hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt), 0.5 ml of ethyldiisopropylamine, 4 equivalents each of diisopropylcarbodiimide (DIC) and Fmoc-amino acid. in dimethylformamide in a commercial synthesis apparatus using a typical procedure (Milligen 9050 PepSynthesizer ™ Equipment and Handbook, 1985) at 60 minutes for each coupling step. Washing is performed in dimethylformamide for 10 minutes, cleavage in piperidine / DMF (1: 4 by volume) for 5 minutes, N-terminal acetylation (capping) is performed using acetic anhydride / pyridine / dimethylformamide (2: 3: 15 by volume) for 15 minutes. The amino acids Fmoc-Arg (Pmc), then Fmoc-Leu, then Fmoc-Ser (But), then Fmoc-Asp (OBut), then Fmoc-Leu, then Fmoc-Asp (OBut), then Fnoc-Thr (But) are used. and finally Fmoc-Arg (Pmc). After washing with dimethylformamide and isopropanol and subsequent drying in vacuo, 3.48 g of the N-terminus of the acetyl peptidyl resin Ac-Arg (Pmc) -Thr (But) -Asp (OBut) -Leu-Asp (OBut) -Ser ( But) -Leu -Arg (Pmc) -aminoxanthenyloxy resin.

Spracovávaním tejto peptidovej živice systémom kyselina trifluóroctová/anizol/dichlórometán (74 ml/3,7 ml/74 ml) počas štyroch hodín pri teplote miestnosti, filtráciou, zahustením vo vákuu a trením s dietyléterom sa môže získať zrazenina 0,6 g peptidu Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser--Leu-Arg-NH₂.Treatment of this peptide resin with trifluoroacetic acid / anisole / dichloromethane (74 mL / 3.7 mL / 74 mL) for four hours at room temperature, filtration, concentration in vacuo and trituration with diethyl ether may give a precipitate of 0.6 g of Ac- peptide. Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser - Leu-Arg-NH _second

Produkt sa čistí chromatografiou RP-HPLC na prostriedku Lichrosorb RP18 (250-25, 7 μιη, Merck KGaA) v 0,3% kyseline tri18 fluóroctovej s gradientom 4 % až 24 % 2-propanolu počas dvoch hodín pri 8 ml/min a za posúdenia UV-prietokovým fotometrom pri 215 nm.The product is purified by RP-HPLC on Lichrosorb RP18 (250-25, 7 µm, Merck KGaA) in 0.3% tri-18-fluoroacetic acid with a gradient of 4% to 24% 2-propanol over 2 hours at 8 mL / min and assessment by UV flow photometer at 215 nm.

II

Frakcia obsahujúca produkt sa suší vymrazovaním. Získaný produkt zodpovedá podlá hmotovej spektrometrie pri bombardovaní rýchlymi atómami (Fast Atóm Bombardment Mass Spectroscopy, FAB-MS) očakáva sa: C₄₁H₇₃N₁₅O₁₅M 1015,5 g/mol; (M+H)⁺ 1016.The product-containing fraction is freeze-dried. The product obtained, according to Fast Atom Bombardment Mass Spectroscopy (FAB-MS), is expected to: C ₄₁ H ₇₃ N ₁₅ O ₁₅ M 1015.5 g / mol; (M + H) < ^{+ &gt};

Čistený produkt Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2 má podlá analytickej HPLC na prostriedku SuperSpher RP18e (250-4, Merck KGaA) pri gradiente o až 99 % A (0,08 m fosfát, hodnota pH 3,5, 15 % acetonitrilu) podlá B (0,03 m fosfát, hodnota pH 3,5, 70 % acetonitrilu) v 50 minútach pri 1 ml/min a detekcii pri 215 nm, čas retencie 7,22 min.Purified product Ac-Arg-Thr-Asp-Leu-Asp-Ser-Leu-Arg-NH2 has an analytical HPLC on SuperSpher RP18e (250-4, Merck KGaA) at a gradient of up to 99% A (0.08m phosphate , pH 3.5, 15% acetonitrile) according to B (0.03 m phosphate, pH 3.5, 70% acetonitrile) at 50 min at 1 mL / min and detection at 215 nm, retention time 7.22 min .

Ďalšie chromatografické analýzy sa vykonávajú v obidvoch nasledujúcich systémoch:Further chromatographic analyzes are performed on both of the following systems:

Systém A: 0,3% kyselina trifluóroctová s gradientmi 0 až 80 % 2-propanolu v 50 minútach na prostriedku LichroSpher 60 RP-Select B^r (250-4) (Merck KGaA, Darmstadt, Nemecko) pri 1 ml/min a detekcii pri 215 nm.System A: 0.3% trifluoroacetic acid with a gradient of 0 to 80% 2-propanol in 50 minutes, the composition LiChrospher 60 RP-Select B ^R (250-4) (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) at 1 ml / min and detection at 215 nm.

Systém B: 0,1% kyselina trifluóroctová s gradientmi 30 až 70 % acetonitrilu v 50 minútach na prostriedku SuperSpher 100 RP18e (250-4,) (Merck KGaA, Darmstadt, Nemecko) pri 1 ml/min a detekcii pri 215 nm.System B: 0.1% trifluoroacetic acid with 30-70% acetonitrile gradients in 50 min on SuperSpher 100 RP18e (250-4,) (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) at 1 mL / min and detection at 215 nm.

Príklad 2Example 2

Spôsobom podlá príkladu 1 sa pripravujú peptidy podlá nasledujúcej tabulky I a čistia sa.By the method of Example 1, the peptides of Table I are prepared and purified.

Tabuľka ITable I

Štruktúra structure t noi.hi. (g/mol) t noi.hi. (G / mol) FAB-MS [M+H], zistené FAB-MS [M + H] found Rt (HPLC) / min (Systém A) r Rt (HPLC) / min (System A) r Rt (HPLC) / min (Systém A) Rt (HPLC) / min (System A) RTDLDSLRTÝTĽ RTDLDSLRTÝTĽ 1453,6 1,453.6 1456 1456 21,9 21.9 DSLRTYTL DSLRTYTL 968,1 968.1 969 969 18,6 18.6 RTDLDSL RTDLDSL 818,9 818.9 820 820 18,6 18.6 23,6 23.6 DLDSLRTY DLDSLRTY 982,1 982,1 983 983 16,6 16.6 RTDLDSLR RTDLDSLR 975,1 975.1 975 975 13,5 13.5 RTDLDSLRTY RTDLDSLRTY 1239,3 1,239.3 1239 1239 16,6 16.6 Ac-RTDLDSLRT Ac-RTDLDSLRT 1118,2 1,118.2 1119 1119 16,2 16.2 15,6 15.6 RTDLDSLRT RTDLDSLRT 1076,2 1,076.2 1076 1076 13,9 13.9 RTDLPSLRTY RTDLPSLRTY 1221.4 1221.4 1221 1221 19,2 19.2 rtdlďlrt-nh₂ rtdldrt-nh ₂ 988,1 988.1 989 989 13.4 13.4 Ac- RTDLDLRT-NH₂ Ac-RTDLDLRT-NH ₂ 1030,2 1,030.2 1031 1031 15,3 15.3 RTDLYÝLMDL RTDLYÝLMDL 1302,5 1302.5 1302 1302 28,2 28.2 RTDLDSLRT-NHz RTDLDSLRT-NH 1075,2 1,075.2 1076 1076 11,1 11.1 13,8 13.8 RTDLDPLRIY RTDLDPLRIY 1249,4 1,249.4 1250 1250 16,3 16.3 RTDLYYLRTY RTDLYYLRTY 1363,5 1,363.5 1363 1363 11.5 11.5 Ac-RTDLDSLRT-NH₂ Ac-RTDLDSLRT-NH ₂ 1117,2 1117,2 1118 1118 13,2 13.2 15,0 15.0 Ac-RTDLDSLR-NH_{2 Ac-RTDLDSLR-NH2} 1015,5 1015,5 1016 1016 ^: pozri príkl. 1 ^: see example. 1 TDLDSLRT TDLDSLRT 920,0 920.0 920 920 14,8 14.8 PVDLYYLMDL PVDLYYLMDL 1241,5 1,241.5 1241 1241 36,1 36.1

Ako porovnávacie zlúčeniny sa používajú známe RGD-peptidy ako sú GRGDSPK, cyklo-(RGDfV) ako tiež lineárny peptid DLYYLMDL.Known RGD-peptides such as GRGDSPK, cyclo- (RGDfV) as well as the DLYYLMDL linear peptide are used as reference compounds.

Príklad 3Example 3

Výroba a^g-integrínového prostriedkuProduction of a .alpha.-integrin composition

Získa sa α_νβ₆ v rozpustnej transmembránovej skrátenej forme (Weinacker a kol., J. Biol. Chem. 269, str. 6940, 1994) z baculovírusového expresného systému známym rekombinantným spôsobom pre α^,β^ (Mehta a kol., Biochem. J. 330, str. 861, 1998) pri použití 14D9.F8 protilátkovej afinitnej chromátografie (Mitjans a kol., J. Celí Sci. 108, str. 2825, 1995) a čistí sa. ľudské α_γ a βθ cDNA klony sú všeobecne známe a všeobecne dostupné. Používa sa vektor prenosu pAcUW31 (Clontech Lab. Inc., Sp. st. a.), ktorý umožňuje súčasnú expresiu dvoch rôznych delových cDNA, aby došlo k expresii transmembránovo skráteného α_νβ₆ z rekombinantných buniek Baculovírusu. Na tento účel sa vyrába a_v transferový vektor a transmembránový skrátený ( ΤΜ)α_γ vystrihnutý z plazmidu a_y TM(pBAc9) pri použití reštrikčného enzýmu EcoRi a Xbal (Mehta a kol., Biochem. J. 330, str. 861, 1998) a prostredníctvom ligácie zarovnaného konca (blunt-end) naklonovanej do BamHI strihového miesta pAcUW31 v smere (downstream) polyhedrínového promotoru. Transmembránová skrátená β^ cDNA sa vystrihne z plazmidu ρΌΏΝΑηβοβ₆ (Weinacker a kol.) pri použití reštrikčného enzýmu EcoRi a Xbal rovnako prostredníctvom ligácie zarovnaného konca do BamHI strihového miesta pAcUW31 vklonovaný do BamHI strihového miesta pAcUW31 v smere polyhedrínového promotoru. Použijú sa skrátené a_v a β₆ obsahujúce tandemové vektory na získanie rekombinantného Baculovírusu (Mehta a kol., Biochem. J. 330, str. 861, 1998). Rekombinantné Baculovírusy sa používajú na identifikáciu buniek hmyzu High Five. Rozpustný receptor sa získa kultiváciou trvajúcou 48 až 71 hodín, pričom sa nadbytok bunkovej kultúry vedie cez afinitné stĺpce hore uvedeného druhu za eluovania pri hodnote pH 3,1. Všetky kroky sa vykonávajú pri teplote miestnosti a v neprítomnosti detergentov. Pikové frakcie sa neutralizujú, koncentrujú sa a dialyzujú sa pri teplote 4°C a nakoniec sa uchovávajú pri teplote -80’C. Takto získaný rekombinantný rozpustný ludský receptor je biologicky aktívny a uchováva si svoju ligandovú špecifickosť.Α _ν β _{6 is obtained} in soluble transmembrane truncated form (Weinacker et al., J. Biol. Chem. 269, 6940 (1994)) from the baculovirus expression system in a known recombinant manner for α 1, β 1 (Mehta et al. Biochem. J. 330, 861 (1998)) using 14D9.F8 antibody affinity chromatography (Mitjans et al., J. Cell Sci. 108, 2825 (1995)) and purified. human α _γ and βθ cDNA clones are generally known and generally available. A pAcUW31 transfer vector (Clontech Lab. Inc., Sp. St. A.) Is used, which allows two different cannon cDNAs to be co-expressed to express transmembrane truncated α _ν β ₆ from recombinant Baculovirus cells. To this end, and manufactured _{in the} transfer vector and the transmembrane truncated (ΤΜ) _α γ excised from the plasmid _and? TM (pBAc9) using the restriction enzyme EcoRI and XbaI (Mehta et al., Biochem. J. 330, pp. 861, 1998 and blunt-end ligation cloned into the BamHI shear site of pAcUW31 downstream of the polyhedrin promoter. The transmembrane truncated β ^ cDNA was excised from the plasmid ρΌΏΝΑηβοβ ₆ (Weinacker et al.) Using the restriction enzyme EcoRi and XbaI as well by blunt-end ligation into the BamHI splice site of pAcUW31 cloned into the BamHI splice site of the pAcW splice site pAc. Truncated α _v β ₆ containing tandem vectors are used to obtain recombinant Baculovirus (Mehta et al., Biochem. J. 330, 861, 1998). Recombinant Baculoviruses are used to identify High Five insect cells. A soluble receptor is obtained by culturing for 48 to 71 hours, whereby excess cell culture is passed through affinity columns of the above species eluting at pH 3.1. All steps are carried out at room temperature in the absence of detergents. The peak fractions were neutralized, concentrated and dialyzed at 4 ° C and finally stored at -80 ° C. The recombinant soluble human receptor thus obtained is biologically active and retains its ligand specificity.

Podobne je opísaný v európskom patentovom spise čísloSimilarly, it is disclosed in European Patent Application Ser

EP 0 846702 spôsob prípravy použitelný na rozpustný «_νβ₃·EP 0 846702 preparation method applicable to soluble « _ν β ₃ ·

Príklad 4Example 4

Test receptorového viazania αγβθ/fibronektínΑγβθ / fibronectin receptor binding assay

Vyrobené peptidy podľa vynálezu sa viažu v roztoku spolu s konkurenčne pôsobiacim fibronektínom na imobilizovaný ctyPg receptor a zisťuje sa hodnota Q ako miera selektivity viazania skúšaného peptidu na α_νβ₆· Hodnota Q sa vyráta z kvocientu hodnoty IC₅₀ testovaného peptidu a štandardu. Ako štandard sa použije lineárny hepta-RGD-peptid GRGDSPK (lit./patent porovnaj Pytela a kol., Science 231, str. 1559, 1986).The produced peptides of the invention bind in solution together with competing fibronectin to the immobilized ctyPg receptor and determine the Q value as a measure of the selectivity of the binding of the test peptide to α _ν β _6. The Q value is calculated from the IC _{50 of} test peptide and standard. Linear hepta-RGD-peptide GRGDSPK is used as a standard (Lit./patent cf. Pytela et al., Science 231, 1559 (1986)).

Skúška viazania sa uskutoční nasledujúcim spôsobom:The binding test shall be carried out as follows:

Imobilizácia rozpustného α_νβ₆ receptoru na mikrotitracných doštičkách prebieha po zriedení proteínového roztoku v TBS++ a následnej inkubácii cez noc pri teplote 4°C (100 μΐ/ jamka). Nešpecifické miesta viazania sa blokujú inkubáciou (dve hodiny pri teplote 37°C) s 3 % (hmotnosť/objem) BSA v TBS++ (200 μΐ/jamka). Nadbytok BSA sa odstráni trojitým premytím TBSA++. Peptidy sa sterilné (1:10) v TBSA++ zriedia a inkubujú sa s biotinyloyaným fibronektínom (2 gg/ml) s imobilizovným integrínom (50 μΐ peptidu + 50 μΐ ligandu na jamku; dve hodiny pri teplote 37°C). Neviazaný fibroriektín a peptidy sa odstránia trojitým premytím TBSA++. Detekcia viazaného fibronektínu sa vykonáva inkubáciou (jednu hodinu pri teplote 37°C) s alkalickou fosfatázou kopulovanou s antibiotínovou protilátkou (Biorad) (1:20000 v TBSA++; 100 μΐ/jamka). Po trojitom premytí TBSA++ sa vykoná kolorimetrické zistenie inkubáciou (10 až 15 minút pri teplote 25°C v tme) s roztokom substrátu (5 mg nitrofenylfosfátu, 1 ml etanolamínu, 4 ml vody; 100 μΐ/jamka). Enzýmová rekcia sa ukončí pridaním 0,4 M roztoku hydroxidu sodného (100 μΐ/jamka. Farebná intenzita sa stanovuje pri 405 nm v meracom zariadení ELISA a porovnáva sa s nulovou hodnotou. Ako nulové hodnoty sa používajú jamky, do ktorých nebol vnesený receptor. Ako štandard sa používaImmobilization of the soluble α _ν β ₆ receptor on microtiter plates is performed after dilution of the protein solution in TBS ++ and subsequent incubation overnight at 4 ° C (100 μΐ / well). Non-specific binding sites are blocked by incubation (two hours at 37 ° C) with 3% (w / v) BSA in TBS ++ (200 μΐ / well). Excess BSA is removed by washing three times with TBSA ++. Peptides are sterile (1:10) in TBSA ++ diluted and incubated with biotinylated fibronectin (2 gg / ml) with immobilized integrin (50 μΐ peptide + 50 μΐ ligand per well; two hours at 37 ° C). Unbound fibrorectin and peptides are removed by washing three times with TBSA ++. Detection of bound fibronectin is performed by incubation (one hour at 37 ° C) with alkaline phosphatase coupled with antibiotic antibody (Biorad) (1: 20000 in TBSA ++; 100 μΐ / well). After washing three times with TBSA ++, a colorimetric determination is made by incubating (10-15 minutes at 25 ° C in the dark) with substrate solution (5 mg nitrophenylphosphate, 1 ml ethanolamine, 4 ml water; 100 μΐ / well). The enzyme reaction is terminated by the addition of 0.4 M sodium hydroxide solution (100 μΐ / well. The color intensity is determined at 405 nm in an ELISA reader and compared to zero. standard is used

GRGDSPK. Hodnoty IC^₀ pre testované peptidy sa odčítajú z grafiky a z nich spolu s IC₅₀ hodnotou štandardného peptidu sa zistuje hodnota Q peptidu podlá vynálezu. Výsledky opísaného testu' sú uvedené v nasledujúcej tabulke.GRGDSPK. The IC ^ ₀ for the test peptides are read from the graphic and the one with the _IC50 value of the wild-peptide was determined Q value of the peptide of the invention. The results of the described assay are shown in the following table.

Tabulka IITable II

Štruktúra structure q. · = ΙΟ» Testpeptid / IC_M Standardpeptidq. · = ΙΟ »Test peptide / IC _M Standard peptide GRGDSPK GRGDSPK 1,0 (ICjo = 400nM) 1.0 (IC50 = 400nM) zyklo-(RGDfV) zyklo- (RGDfV) 0.6 0.6 DLYYLMDL DLYYLMDL naktiv (IC50 > 50μΜ) naktiv (IC50> 50μΜ) RTDLDSLRTYTL RTDLDSLRTYTL 0,27 0.27 DSLRTYTL DSLRTYTL inaktiv (IC₅₀ > 50μΜ)inactiv (IC ₅₀ > 50μΜ) RRDLDSL RRDLDSL 2.5 2.5 DLDSLRTY DLDSLRTY inaktiv (IC50 > 50μΜ) inactiv (IC50> 50μΜ) RTDLDSLR ' RTDLDSLR ' 0,17 0.17 RTDLDSLRTY RTDLDSLRTY 0,10 0.10 Ac-RTDLDSLRT Ac-RTDLDSLRT 0,029 0,029 RTDLDSLRT RTDLDSLRT 0,11 0.11 RTDLDLRT-NHj RTDLDLRT-N H 1.1 1.1 Ac-RTDLDLRT-NH₂ Ac-RTDLDLRT-NH ₂ 0.5 0.5 RTDLYYLMDL RTDLYYLMDL 0,33 0.33 RTDLDSĽRT-NH₂ ,RTDLDSLRT-NH ₂ , 0,056 0,056 RTDLDPLRTY RTDLDPLRTY 0,50 0.50 RTDLYYLRTY RTDLYYLRTY 0,042 0,042 AC-RTDLDSLRT-NH2 AC-NH2 RTDLDSLRT 0,013 0,013 TDLDSLRT TDLDSLRT 66 66 PVDLYYLMDL PVDLYYLMDL inaktiv (IC50 > 50μΜ) inactiv (IC50> 50μΜ)

Testpeptid = testovaný peptidTest peptide = test peptide

Standardpeptid = štandardný peptid inaktiv = neaktívnyStandard peptide = standard peptide inactive = inactive

Hodnota Q menšia ako 1 znamená, že vykazujú pomerne lepšie viazanie na receptor ako porovnávaný štandardný peptid, ktorý absolútne videné, má samotný dobrú väzbu v porovnaní s prírodným ligandom fibronektín.A Q value of less than 1 means that they exhibit relatively better receptor binding than the standard peptide of comparison, which, absolutely seen, has good binding alone compared to the natural fibronectin ligand.

Príklad 5Example 5

Podobne ako pri predchádzajúcom príklade sa na účely porovnania vykonáva test viazania integrín-ligand s rôznymi integrínmi (napríklad α_νβ₃, α_νβ₅) ^{a so} zodpovedajúcimi ligandmi (napríklad vitronektín, fibrinogén).As in the previous example, an integrin-ligand binding assay with different integrins (e.g. α _ν β ₃ , α _ν β ₅ ) ^{and the} corresponding ligands (eg vitronectin, fibrinogen) is performed for comparison purposes.

Príklad 6Example 6

Všeobecná príprava komplexu DNA-lipozóm a použitie na génovú terapiuGeneral preparation of DNA-liposome complex and use for gene therapy

Zmieša sa lipid ä DNA v hmotnostnom pomere 5:1 (lipid:DNA) v roztoku Krebs-Hepes (140 mM chloridu sodného, 1 mM chloridu horečnatého, 2 mM chloridu vápenatého, 6 mM chloridu draselného, 10 mM HEPES, 10 mM D-glukózy, hodnota pH 9,0). Pritom je jednotlivá dávka 30 μg DNA/200 μΐ. Nanesie sa 200 μΐ komplexu lipid-DNA pumpičkovým rozprašovačom na epitel nosa. Toto nanesenie sa opakuje 10 krát vždy po 15 minútach. Celková dávka DNA je 300 μg.Mix 5: 1 lipid and DNA (lipid: DNA) in Krebs-Hepes solution (140 mM sodium chloride, 1 mM magnesium chloride, 2 mM calcium chloride, 6 mM potassium chloride, 10 mM HEPES, 10 mM D- glucose, pH 9.0). The single dose is 30 μg DNA / 200 μΐ. Apply 200 μΐ of lipid-DNA complex with a pump spray to the nasal epithelium. This application is repeated 10 times every 15 minutes. The total DNA dose is 300 μg.

Nasledujúce príklady objasňujú farmaceutické prostriedky:The following examples illustrate pharmaceutical compositions:

Príklad A. Injekčné ampulkyExample A. Injection ampoules

Roztok 100 g účinnej látky všeobecného vzorca I a 5 g dinátriumhydrogenfosfátu v 3 1 dvakrát destilovanej vody sa nastaví 2n kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu pH 6,5, sterilné sa sfiltruje a plní sa do injekčných ampuliek, lyofilizuje sa za sterilných podmienok a ampulky sa sterilné uzatvoria. Každá injekčná ampulka obsahuje 5 mg účinnej látky.A solution of 100 g of an active compound of the formula I and 5 g of disodium hydrogen phosphate in 3 l of double-distilled water is adjusted to pH 6.5 with 2N hydrochloric acid, sterile filtered and filled into vials, lyophilized under sterile conditions and vials sealed sterile. . Each vial contains 5 mg of active ingredient.

Príklad B. ČapíkyExample B. Suppositories

Roztopí sa zmes 20 g účinnej látky všeobecného vzorca I so 100 g sójového lecitínu a 1400 g kakaového masla, vleje sa do formičiek a nechá sa vychladnúť. Každý čapík obsahuje 20 mg účinnej látky.A mixture of 20 g of an active compound of the formula I with 100 g of soya lecithin and 1400 g of cocoa butter is melted, poured into molds and allowed to cool. Each suppository contains 20 mg of active ingredient.

Príklad C. RoztokExample C. Solution

Pripraví sa roztok 1 g účinnej zlúčeniny všeobecného vzorca I, 9,38 g dihydrátu nátriumdihydrogenfosfátu, 28,48 g dinátriumhydrogenfosfátu s 12 molekulami vody a 0,1 g benzalkónium-chloridu v 940 ml dvakrát destilovanej vody. Hodnota pH roztoku sa upraví na 6,8, doplní sa na jeden liter a sterilizuje sa ožiarením. Tento roztok je možné používať vo forme očných kvapiek.A solution of 1 g of an active compound of the formula I, 9.38 g of sodium dihydrogen phosphate dihydrate, 28.48 g of dihydrogen phosphate with 12 water molecules and 0.1 g of benzalkonium chloride in 940 ml of double-distilled water is prepared. The pH of the solution was adjusted to 6.8, made up to 1 liter and sterilized by irradiation. This solution can be used in the form of eye drops.

Príklad D. MasťExample D. Ointment

500 mg účinnej látky všeobecného vzorca I sa zmieša s 99^5 g vazelíny za aseptických podmienok. '500 mg of an active compound of the formula I are mixed with 99-5 g of petroleum jelly under aseptic conditions. '

Príklad E. TabletyExample E. Tablets

Zo zmesi 1 kg účinnej látky všeobecného vzorca I, 4 kg laktózy, 1,2 kg zemiakového škrobu, 0,2 kg mastenca a 0,1 kg stearátu horečnatého sa obvyklým spôsobom vylisujú tablety, tak, že každá tableta obsahuje 10 mg účinnej látky.Tablets are compressed in a conventional manner from a mixture of 1 kg of active compound of the formula I, 4 kg of lactose, 1.2 kg of potato starch, 0.2 kg of talc and 0.1 kg of magnesium stearate such that each tablet contains 10 mg of the active ingredient.

Príklad F. DražéExample F. Dragees

Obdobne ako podlá príkladu E sa vylisujú tablety, ktoré sa potom obvyklým spôsobom potiahnu povlakom zo sacharózy, zemiakového škrobu, mastenca, tragantu a farbiva.Analogously to Example E, tablets are compressed and then coated in a conventional manner with a coating of sucrose, potato starch, talc, tragacanth and colorant.

Príklad G. KapsulyExample G. Capsules

Známym spôsobom sa plnia do kapsúl z tvrdej želatíny 2 kg účinnej látky všeobecného vzorca I tak, že každá kapsula obsahuje 20 mg účinnej látky.In a known manner, 2 kg of active ingredient of the formula I are filled into hard gelatin capsules such that each capsule contains 20 mg of active ingredient.

Príklad H. AmpulyExample H. Ampoules

Roztok 1 kg účinnej látky všeobecného vzorca I v 60 1 dvakrát destilovanej vody sa sterilné sfiltruje a plní sa do ampúl, lyofilizuje sa za sterilných podmienok a ampuly sa sterilné uzavrú. Každá ampula obsahuje 10 mg účinnej látky.A solution of 1 kg of active compound of the formula I in 60 l of double-distilled water is sterile filtered and filled into ampoules, lyophilized under sterile conditions and the ampoules sealed. Each ampoule contains 10 mg of active ingredient.

Príklad I. Inhalačný sprejExample I. Inhalation Spray

Rozpustí sa 14 g účinnej látky všeobecného vzorca I v 10 1 izotonického roztoku chloridu sodného a plní sa do bežných obchodných nádob na striekanie s pumpovým mechanizmom. Roztok sa môže striekať do úst alebo do nosa. Každé nastriekanie (približne 0,1 ml) zodpovedá dávke približne 0,14 mg.Dissolve 14 g of an active compound of the formula I in 10 l of isotonic sodium chloride solution and fill in conventional commercial spray cans with a pump mechanism. The solution may be sprayed into the mouth or nose. Each spray (approximately 0.1 ml) corresponds to a dose of approximately 0.14 mg.

Priemyselná využiteľnosťIndustrial usability

Peptidické zlúčeniny, ktoré ako ligand integrínu a_vPg sú vhodné na výrobu farmaceutických prostriedkov na ošetrovanie chorôb založených na expresii a na patologickej funkcii a_vPg integrínových receptorov.Peptidic compounds which, as integrin ligand and _in Pg, are suitable for the manufacture of pharmaceutical compositions for the treatment of diseases based on expression and pathological function and _at Pg integrin receptors.

Claims (16)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Peptidické zlúčeniny všeobecného vzorca ICLAIMS 1. Peptide compounds of formula I W¹ - X¹nArgX²AspLeu X³X⁴Leu. X⁵X⁶m - W² ' (i) kde znamenáW ¹ - X ¹ nArgX Aspley ² X ³ X ⁴ Leu. X ⁵ X ⁶ m - W ² '(i) where is X¹,X², X³,X⁴,X⁵,X⁶ vždy od seba nezávisle zvyšok aminokyseliny, pričom sú aminokyseliny od seba nezávisle zvolené zo súboru zahŕňajúceho Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gin, Glu, Gly, Phe, His, íle, Leu, Lys, Met, Nie, homo-Phe, Phg, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr a Val, pričom sú tieto aminokyseliny prípadne derivatizované,X ¹ , X ² , X ³ , X ⁴ , X ⁵ , X ^{6 are} each independently an amino acid residue, wherein the amino acids are independently selected from the group consisting of Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gln, Glu, Gly, Phe, His, Ile, Leu, Lys, Met, Nle, homo-Phe, Phg, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val, these amino acids optionally being derivatized, W² Skupinu OH, OR, NHR, NR₂, NH₂,W ² OH, OR, NHR, NR ₂ , NH ₂ , W¹ atóm vodíka alebo acylovú skupinu,W ¹ is a hydrogen atom or an acyl group, R alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, n, m od seba nezávisle číslo 0 až 15, pričom v prípadoch, keď m alebo n je väčšie ako 1, majú prípadne X¹ alebo X⁶ od seba nezávisle rovnaký alebo odlišný význam.R is C 1 -C 6 alkyl, n, m independently of each other 0 to 15, wherein, in the case where m or n is greater than 1, X ¹ or X ⁶ independently of each other have the same or different meanings. 2. Peptidické zlúčeniny podlá nároku 1 všeobecného vzorca I, kde znamená X² aminokyselinový zvyšok zo súboru zahŕňajúceho Thr, Ser, Asp a glycín.2. The peptide according to claim 1 of a compound of formula I in which X ² amino acid residue from the group consisting of Thr, Ser, Asp, and glycine. 3. Peptidické zlúčeniny podlá nároku 1 všeobecného vzorcaPeptide compounds according to claim 1 of the general formula I, kde znamená X³ aminokyselinový zvyšok zo súboru zahŕňajúcehoWherein X is a ³ amino acid residue from the group consisting of Asp, Glu, Arg, Lys, His a Tyr.Asp, Glu, Arg, Lys, His, and Tyr. 4. Peptidické zlúčeniny podlá nároku 1 všeobecného vzorca I, kde znamená X⁴ aminokyselinový zvyšok zo súboru zahŕňajúceho Ser, Tyr, Thr, Gly a Val.4. A compound according to claim 1, wherein X is a ⁴ amino acid residue selected from the group consisting of Ser, Tyr, Thr, Gly and Val. 5. Peptidické zlúčeniny podlá nároku 1 všeobecného vzorca V5. A compound according to claim 1 of formula V W¹ - X¹nArgThrAspLeuAspSerLeuArgX⁶m -- W² (V) kde jednotlivé symboly majú v nároku 1 uvedený význam.W ¹ - X ¹ nArgThrAspLeuAspSerLeuArgX ⁶ m - W ² (V) wherein the individual symbols are as defined in claim 1. 6. Peptidické zlúčeniny podlá nároku 1 všeobecného vzorca VI6. A compound according to claim 1 of formula VI W¹ - X¹nArgThrAspLeuAspSerLeuArgThrX⁶m_₁ - W² (VI).W ¹ - X ¹ nArgThrAspLeuAspSerLeuArgThrX ⁶ m_ ₁ - W ² (VI). 7. Peptidické zlúčeniny podlá nároku 1 až 6 všeobecného vzorca I alebo II a ich fyziologicky prijatelné soli ako liečivá.Peptide compounds according to claims 1 to 6 of formula I or II and their physiologically acceptable salts as medicaments. 8. Liečivá podlá nároku 7 ako inhibitory na ošetrovanie chorôb, ktoré sú založené na expresii a na patologickej funkcii α_νβ₆ integrinových receptorov.8. The medicament of claim 7 as an inhibitor for the treatment of diseases based on expression and pathological function of _α ν β ₆ integrin receptors. 9. Liečivá podlá nároku 8 na ošetrovanie trombóz, srdcového infarktu, koronárnych ochorení srdca, artériosklerózy, nádorov, osteoporózy, fibróz, zápalov, infekcií, psoriázy ako tiež na ovplyvnenie hojenia rán.Medicaments according to claim 8 for the treatment of thromboses, heart attack, coronary heart disease, arteriosclerosis, tumors, osteoporosis, fibrosis, inflammations, infections, psoriasis as well as to affect wound healing. 10. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa t ý m, že obsahuje aspoň jedno liečivo podlá nároku 7 až 9 a prípadne nosič a/alebo pomocnú látku a prípadne iné účinné látky.Pharmaceutical composition, characterized in that it comprises at least one medicament according to claims 7 to 9 and optionally a carrier and / or excipient and optionally other active substances. 11. Použitie peptidických zlúčenín podlá nároku 1 až 6 a/alebo ich fyziologicky prijateľných solí na výrobu liečiva na ošetrovanie chorôb, ktoré sú založené na expresii a patologickej funkcii a_v3g integrínových receptorov.Use of the peptide compounds according to claims 1 to 6 and / or their physiologically acceptable salts for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases which are based on expression and pathological function and _at 3g integrin receptors. 12. Použitie peptidických zlúčenín podlá nároku 11 na výrobu liečiva na ošetrovanie trombóz, srdcového infarktu, koronárnych chorôb srdca, artériosklerózy, nádorov, osteoporózy, fibróz, zápalov, infekcií, psoriázy ako tiež na ovplyvnenie hojenia rán.Use of the peptide compounds according to claim 11 for the manufacture of a medicament for the treatment of thromboses, heart attack, coronary heart disease, arteriosclerosis, tumors, osteoporosis, fibrosis, inflammations, infections, psoriasis as well as affecting wound healing. 13. Rekombinantná DNA, obsahujúca sekvenciu, ktorá kóduje peptidový úsek, ktorý zodpovedá peptidickej zlúčenine podlá nároku 1 až 6.A recombinant DNA comprising a sequence that encodes a peptide region that corresponds to a peptide compound according to claims 1 to 6. 14. Rekombinát vírus-DNA podlá nároku 13.14. The virus-DNA recombinant of claim 13. 15. Vírus obsahujúci obalový proteín, ktorý má sekvenciu, ktorá zodpovedá nároku 1 až 6.A virus comprising a coat protein having a sequence corresponding to claims 1 to 6. 16. Použitie vírusu podlá nároku 15 na výrobu liečiva na ošetrovanie nemocí, ktoré sú založené na expresii a na patologickej funkcii α_νβ₆ integrínových receptorov.Use of the virus according to claim 15 for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases based on the expression and pathological function of α _ν β ₆ integrin receptors.