SK70398A3 - Method for the production of lactic acid - Google Patents

Abstract

Production method for lactic acid is based on that the micro-organism Bacillus coagulans, preferably Bacillus coagulans CCM 4318, is submersively cultivated under the temperature 40 to 60 C, pH value 5.5 to 7.5, and the contents 4 to 14 wt. % of saccharide substrate and with the initial concentration of lactic acid 1 to 10 wt. %.

Description

Oblasť technikyTechnical field

Vynález sa týka spôsobu výroby kyseliny mliečnejThe invention relates to a process for producing lactic acid

Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Kyselina mliečna (2-hydroxypropánová) je produkovaná množstvom mikroorganizmov, predovšetkým baktérií a vláknitých húb. Na priemyselnú produkciu sa používajú predovšetkým baktérie rodu Lactobacillus, ktoré pri teplotách 30-40°C konvertujú sacharidický substrát (glukóza, sacharóza, laktóza) na kyselinu mliečnu s rôznym obsahom L(+)-, D(-)- a DL-formy kyseliny podľa vlastností producenta. Ako producenti sú popísaní aj termofilné baktérie zrodu Bacillaceae, predovšetkým Bacillus coagulans, produkujúci kyselinu mliečnu pri teplotách 50-60°C. Výhodou bakteriálnej fermentácie je anaeróbny režim fermentácie, čo sa odráža v jednoduchosti kultivačných zariadení a nižších nárokoch na sterilitu. Nevýhodou bakteriálnych producentov je často potreba výživovo bohatých kultivačných médií a produkcia vedľajších metabolitov (Vickroy,T.B.: In ComprehensiveLactic acid (2-hydroxypropanoic acid) is produced by a number of microorganisms, especially bacteria and filamentous fungi. Lactobacillus is used mainly for industrial production, which converts the carbohydrate substrate (glucose, sucrose, lactose) at 30-40 ° C to lactic acid with different content of L (+) -, D (-) - and DL-forms of acid. according to the characteristics of the producer. Thermophilic bacteria of the genus Bacillaceae, in particular Bacillus coagulans, producing lactic acid at temperatures of 50-60 ° C are also described as producers. The advantage of bacterial fermentation is the anaerobic fermentation regime, which is reflected in the simplicity of the cultivation equipment and lower sterility requirements. The disadvantage of bacterial producers is often the need for nutrient-rich culture media and the production of side metabolites (Vickroy, T.B .: In Comprehensive

Biotechnology, Vol.3, str.761-776, Pergamon Press, 1985). Z vláknitých húb patrí medzi dobrých producentov kyseliny mliečnej Rhizopus arrhizus ,resp. oryzae. Vláknité huby produkujú len kyselinu L(+)-mliečnu, čo je nespornou výhodou oproti bakteriálnym producentom. Režim fermentácie je však aeróbny (vysoké nároky na prípravu sterilného vzduchu) a taktiež konverzia substrátu na produkt je menej efektívna v dôsledku dlhších fermentačných časov a nižších molárnych výťažkov (70-77% u vláknitých húb, 90-98% u baktérií). Aeróbny režim u vláknitých húb môže byť výhodou u vláknitých húb v prípade priamej prípravy vápenatých solí kyseliny mliečnej, kedy u baktérií môže dochádzať k predlžovaniu fermentácie a znižovaní výťažkov v dôsledku nedôslednej neutralizácie (slabé miešanie) v prípade uhličitanu vápenatého (Mattey M.: Critical Reviews in Biotechnology 12 87-132 (1992). Pri bakteriálnej produkcii boli okrem klasických batch fermentácií rozpracované semikontinuálne a kontinuálne produkcie s použitím moderných separačných techník (elektrodialýza, extrakcia ).Biotechnology, Vol.3, pp.761-776, Pergamon Press, 1985). Of the filamentous fungi, rhizopus arrhizus, resp. oryzae. Filamentous fungi only produce L (+) - lactic acid, which is an indisputable advantage over bacterial producers. However, the fermentation regime is aerobic (high demands on sterile air preparation) and also the conversion of substrate to product is less effective due to longer fermentation times and lower molar yields (70-77% for filamentous fungi, 90-98% for bacteria). The aerobic regime of filamentous fungi may be advantageous for filamentous fungi in the direct preparation of calcium lactic acid salts, where bacteria may experience prolonged fermentation and reduced yields due to inconsistent neutralization (poor mixing) for calcium carbonate (Mattey M .: Critical Reviews in Biotechnology 12 87-132 (1992) In addition to conventional batch fermentations, bacterial production was semi-continuous and continuous production using modern separation techniques (electrodialysis, extraction).

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Podstatou prípravy kyseliny mliečnej podľa vynálezu je, že sa submerzne kultivujú baktérie Bacillus coagulans vodnom živnom médiu pri teplote 40-60°C, hodnote pH 5,5 ažThe essence of the preparation of lactic acid according to the invention is that Bacillus coagulans are submerged in an aqueous nutrient medium at a temperature of 40-60 ° C, a pH of 5.5 to

7,5 s obsahom 4-14% hmotn. sacharidického substrátu a 1-10% kyseliny mliečnej. Ako produkčný mikroorganizmy je možné použiť napr. kmeň Bacillus coagulans CCM 4318, vykazuje vysokú selektivitu a rýchlosť konverzie. Výhodné je fermentovať v prítomnosti kyseliny mliečnej v celom priebehu fermentácie, Čo zabezpečí vysokú rýchlosť konverzie i v závere fermentácie pri nízkych zbytkových koncentráciách sacharidu. Navyše tento režim umožňuje dobrý rast produkčnej kultúry i pri vyšších koncentráciách kyseliny mliečnej v produkčnom médiu. Týmto spôsobom je možné i fermentovať média s rôznym počiatočným obsahom laktátu, čo je možné využiť pri technológiách, kde sa časť kyseliny mliečnej po purifikácii vracia do technologického procesu (elektrodialýza, matečné lúhy a pod.)7.5 containing 4-14 wt. carbohydrate substrate and 1-10% lactic acid. As production microorganisms, e.g. strain Bacillus coagulans CCM 4318, shows high selectivity and conversion rate. It is preferred to ferment in the presence of lactic acid throughout the fermentation process, which ensures a high conversion rate even at the end of the fermentation at low residual saccharide concentrations. In addition, this regime allows good production culture growth even at higher concentrations of lactic acid in the production medium. In this way it is also possible to ferment media with different initial lactate content, which can be used in technologies where a part of lactic acid after purification returns to the technological process (electrodialysis, mother liquors, etc.)

V priebehu kultivácie sa hodnota pH udržiava v rozmedzí 5,5-7,5 prídavkom alkalický reagujúcich roztokov, hlavne NaOH, KOH, NH4OH, CaCO3, Ca(0H)2. Kyselina mliečna sa bude nachádzať v kultivačnom médiu i vo forme zodpovedajúcich solí, ktoré spadajú taktiež v tomto texte do výrazu „kyselina mliečna“.During cultivation, the pH is maintained between 5.5-7.5 by the addition of alkaline reacting solutions, in particular NaOH, KOH, NH 4 OH, CaCO 3, Ca (OH) 2. Lactic acid will be present both in the culture medium and in the form of the corresponding salts, which also fall within the term "lactic acid".

Na zaočkovanie produkčného fermentora je výhodné použiť vegetatívne inokulum, ktoré sa získa 12 až 28-hodinovou kultiváciou producenta a dávkuje sa do produkčného fermentora v množstve od 5 do 25% celkového objemu.To inoculate the production fermenter, it is preferable to use a vegetative inoculum, which is obtained by cultivating the producer for 12 to 28 hours and dosed into the production fermenter in an amount of 5 to 25% of the total volume.

Fermentačné médium obsahuje sacharidický substrát v množstve 4-14% hmotn. Pod sacharidickým substrátom sa rozumie glukóza, kyslé a enzýmové hydrolyzáty škrobu, sacharóza, predovšetkým afinády, rafmády, ľahké a ťažké šťavy, kléry i ďalšie substráty obsahujúce voľnú glukózu, sacharózu, maltózu a pod.. Pretože Bacillus coagulans má βgalaktozidázovú aktivitu, je možné na prípravu kyseliny mliečnej použiť i laktózu, resp. média, ktoré ju obsahujú (ako srvátka)The fermentation medium contains a saccharide substrate in an amount of 4-14 wt. Carbohydrate substrate refers to glucose, acidic and enzymatic hydrolysates of starch, sucrose, especially affinades, raffades, light and heavy juices, clergy and other substrates containing free glucose, sucrose, maltose and the like. Lactic acid, resp. media containing it (like whey)

Fermentačné médium sa mierne mieša bez prevdušňovania a teplotu je výhodné udržovať v rozmedzí 40-60°C. Táto vysoká teplota priaznivo ovplyvňuje rozpustnosť predovšetkým vápenatých solí, ulehčuje separáciu producenta po fermentácii v procese mikrofiltrácie a minimalizuje nebezpečenstvo kontaminácie.The fermentation medium is mixed gently without aeration, and the temperature is preferably maintained at 40-60 ° C. This high temperature favorably affects the solubility of the calcium salts in particular, facilitates the separation of the producer after fermentation in the microfiltration process and minimizes the risk of contamination.

Fermentácia sa prebieha až do vyčerpania substrátu. Napr. za 20 hod. kultivácie možno konvertovať 70g/l glukózy, resp. sacharózy pri počiatočnej koncentrácii laktátu sodného 2-3% kyselinu mliečnu s výťažkom 90-93% teoretickej hodnoty. Obsah ostatných organických kyselín neprekročí 0,4 % hmotn. Treba počítať s určitými odchýlkami v reakčných časoch i vo výťažkoch v závislosti od použitého zariadenia a podmienok kultivácie.Fermentation is continued until the substrate is depleted. E.g. for 20 hours cultures can convert 70g / l glucose, respectively. sucrose at an initial sodium lactate concentration of 2-3% lactic acid in a yield of 90-93% of theoretical. The content of other organic acids shall not exceed 0,4% by weight. Some variations in reaction times and yields should be considered depending on the equipment used and the culture conditions.

Kyselinu mliečnu je možné pripraviť z vyfermentovaného média po separácii biomasy pôsobením minerálnej kyseliny alebo inými priemyselnými postupmi (katexy, reverzná osmóza, elektrodialýza, bipoláme membrány a pod.).Lactic acid can be prepared from fermented medium after separation of biomass by treatment with mineral acid or other industrial processes (cation exchangers, reverse osmosis, electrodialysis, bipolar membranes, etc.).

Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Príklad 1Example 1

Pripraví sa vegetatívna kultúra Bacillus coagulans CCM 4318 24 hod kultiváciou pri 51 °C.A Bacillus coagulans CCM 4318 vegetative culture was prepared by culturing at 51 ° C for 24 hours.

V ldm'³ Erlenmayerove banke je 250 ml média, ktoré obsahuje v 1 litri destilovanej vody lOg peptónu, 5g kvasničného autolyzátu, 5g mliečnanu sodného, 2g K2HPO_4> 3g octanu sodného, 2g citranu amónneho, 0,2g MgSO4.7H2O, 0,05g MnSO4.4H₂0. Počiatočná koncentrácia baktérií je 1-10⁶ v lml. Takto pripravená kultúra slúži k zaočkovaniu propagačného fermentora.The ep ^"3 Erlenmeyer flask of 250 ml of medium containing in 1 liter of distilled water, lOg of peptone, 5g of yeast extract, 5 g sodium lactate, 2 g K2HPO _4> 3 g of sodium acetate, 2 g ammonium citrate, 0.2 g MgSO4.7H2O, 0, 05 g MnSO4.4H ₂ 0 is the initial concentration of bacteria in lml 110 ^6. The culture thus prepared serves to inoculate a propagation fermenter.

Pripraví sa 2 1 sterilného produkčného média v 5 1 laboratórnom fermentore (sterilizácia 20 min pri 121°C). Produkčné médium obsahuje v 1 litri destilovanej vody 70g sacharózy, 4g kvasničného autolyzátu, 20 g kyseliny mliečnej, l,5g (NH4)2HPO₄, 0,2g MgSO₄.7H2O, 0,05g MnSO₄.4H20, 0,01g FeSO₄.7H20. Takto pripravené produkčné médium sa zaočkuje 250 ml submerznej kulturi a kultivuje sa za mierneho miešania pri 52°C. Hodnota pH sa udržuje prídavkom 50% NaOH v rozmedzí hodnot 6,4-6,6. Po 8 hodinách kultivácie sa celé médium použije na zaočkovanie produkčného 30 litrového fermentora s 21 litrami produkčného média (zloženie je stejné). Fermentácia sa prevádza prvých 8 hodín pri 54°C a v ďalšom priebehu je teplota držiavaná na 52°C, hodnota pH sa udržuje prídavkom 50% NaOH v rozmedzí hodnotPrepare 2 L of sterile production medium in a 5 L laboratory fermenter (sterilization for 20 min at 121 ° C). The production medium containing in 1 liter of distilled water, 70 g of sucrose, 4 g of yeast extract, 20 g of lactic acid, L, 5 g (NH 4) 2 HPO _4, 0.2 g MgSO ₄ .7H2O, 0.05 g MnSO ₄ .4H20, 0.01 g FeSO ₄ .7H20. The production medium thus prepared is inoculated with 250 ml of submerged culture and cultured under gentle stirring at 52 ° C. The pH is maintained at 6.4-6.6 by the addition of 50% NaOH. After 8 hours of culture, the whole medium is used to inoculate a 30 liter production fermenter with 21 liters of production medium (composition is the same). The fermentation is carried out for the first 8 hours at 54 ° C and the temperature is maintained at 52 ° C thereafter, the pH is maintained by the addition of 50% NaOH in the range of values.

6,4-6,6. Po 22 hodinách kultivácie médium obsahuje 85 g/1 kyseliny mliečnej (vztiahnuté na počiatočný objem) pri zbytkovom sacharide 3g/l, čo predstavuje 93% teoretickej výťažnosťi.6.4-6.6. After 22 hours of culture, the medium contains 85 g / l lactic acid (based on initial volume) at a residual saccharide of 3 g / l, which represents 93% of the theoretical yield.

Príklad 2Example 2

Zloženie médií je stejné, ako v príklade 1 s následovnými zmenami : Namiesto sacharózy glukózy použijeme v produkčnom médiu glukózu (v koncentrácii 80g/l), kvasničný autolyzát 2g/l, kukuričný výluh 8g/l. Príprava inokula a podmienky fermentácie sú analogické, ako v príklade 1. Čas fermentácie je 25 hodín a výťažky sú analogické ako v príklade 1.The composition of the media is the same as in Example 1 with the following changes: Instead of sucrose glucose, glucose (80g / l), yeast autolysate 2g / l, corn leach 8g / l are used in the production medium. Inoculum preparation and fermentation conditions are analogous to Example 1. The fermentation time is 25 hours and yields are analogous to Example 1.

Príklad 3Example 3

Fermentácia sa prevádza podľa príkladu 1. Po ukončení fermentácie sa 18 litrov vyfermentovaného média vypustí z fermentora a doplní 17 litrami produkčného média (Zloženie je analogické, ako v príklade 1 s vyjímkou kvasničného autolyzátu, ktorého koncentrácia je 2,5g/l). Podmienky fermentácie sú analogické ako v príklade 1. Po 22 hodinovej kultivácii dosiahne konverzia sacharózy na kyselinu mliečnu 92% teoretickej hodnoty.The fermentation is carried out according to Example 1. After the fermentation is complete, 18 liters of fermented medium are discharged from the fermenter and supplemented with 17 liters of production medium (The composition is analogous to Example 1 except for yeast autolysate having a concentration of 2.5 g / l). The fermentation conditions are analogous to Example 1. After 22 hours of cultivation, the conversion of sucrose to lactic acid reaches 92% of the theoretical value.

Priemyselná využiteľnosťIndustrial usability

Vynález je využiteľný pri výrobe kyseliny mliečnej, alebo jej solí, ktoré majú široké použitie v potravinárstve, farmácii, chemickom priemysle a ďalších oblastiach.The invention is useful in the manufacture of lactic acid, or salts thereof, which are widely used in the food, pharmaceutical, chemical and other fields.

Claims (2)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Spôsob výroby kyseliny mliečnej alebo jej solí, vyznačujúci sa tým, že sa mikroorganizmus Bacillus coagulans submerzne kultivuje vo vodnom živnom médiu pri teplote 40-60°C, hodnote pH 5,5 až 7,5 s obsahom 4-14% hmotn. sacharidického substrátu a pri počiatočnej koncentrácii kyseliny mliečnej 1-10%.Process for the production of lactic acid or its salts, characterized in that the microorganism Bacillus coagulans is submerged in an aqueous nutrient medium at a temperature of 40-60 ° C, a pH of 5.5 to 7.5 containing 4-14% by weight. saccharide substrate and at an initial lactic acid concentration of 1-10%. 2. Spôsob výroby podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa na produkciu výhodne použije kmeň Bacillus coagulans CCM 4318.Method according to claim 1, characterized in that the production is preferably carried out using a strain of Bacillus coagulans CCM 4318.