SK287601B6

SK287601B6 - Použitie protilátky alebo jej fragmentu viažuceho antigén na výrobu farmaceutickej kompozície na liečenie mnohonásobného myelómu a na inhibíciu resorpcie kostí

Info

Publication number: SK287601B6
Application number: SK605-2001A
Authority: SK
Inventors: Gregory R. Mundy; Toshiyuki Yoneda
Original assignee: Board Of Regents, The University Of Texas System
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1999-09-13
Publication date: 2011-03-04
Also published as: CN1236815C; EE05558B1; WO2000015247A3; IL141877A0; HUP0103630A3; EA200100362A1; CZ302997B6; DE69940206D1; CN1321091A; BR9913705A; EE200100146A; CA2343579A1; HU229038B1; JP5378303B2; EP1113810A2; PT1113810E; KR100628818B1; NO20011283D0; SI1113810T1; JP2013241441A

Abstract

Je opísané použitie protilátky alebo jej fragmentu viažuceho antigén, zvolených z (a) protilátky anti-VLA-4 alebo jej fragmentu, viažuceho antigén; (b) protilátky anti-alfa4/beta7 integrínu alebo jej fragmentu viažuceho antigén; a (c) protilátky anti-VCAM-1 alebo jej fragmentu viažuceho antigén na výrobu farmaceutickej kompozície na liečenie mnohonásobného myelómu a na výrobu farmaceutickej kompozície na inhibíciu resorpcie kostí súvisiacej s nádormi kostnej drene. Ďalej je opísané použitie rozpustného VLA-4 alebo VCAM-1 polypeptidu, ktorý antagonizuje VLA-4/VCAM-1 interakciu, na výrobu farmaceutickej kompozície na liečenie uvedených ochorení.

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka použitia protilátky alebo jej fragmentu viažuceho antigén alebo rozpustného VLA-4 alebo VCAM-1 polypeptidu na výrobu farmaceutickej kompozície na liečenie mnohonásobného myelómu, a uvoľňovania kostných resorpčných faktorov myelómovými bunkami, čo vedie ku kosnej strate, ktorá je vedľajším efektom myelómu u človeka. Konkrétnejšie sa vynález týka použitia protilátky anti-VLA-4 alebo jej fragmentu viažuceho antigén, protilátky anti-alfa4/beta7 integrínu alebo jej fragmentu viažuceho antigén alebo protilátky anti-VCAM-1 alebo jej fragmentu viažuceho antigén, alebo rozpustného VLA-4 alebo VCAM-1 polypeptidu, ktorý antagonizuje VLA-4 alebo VCAM-1 interakciu na prípravu farmaceutických kompozícií na takéto liečenie.

Doterajší stav techniky

Mnohonásobný myelóm je druhá najčastejšia hematologická malígna choroba s 15 000 novodiagnostikovanými prípadmi každý rok a 30 000 až 40 000 pacientmi ročne v USA (Mundi a Bertolini, 1986). 80 % pacientov trpí devastujúcou osteolytickou deštrukciou kostí spôsobenou zvýšenou tvorbou a aktivitou osteoklastov (OCL) (Mundi a Bertolini, 1986). Táto deštrukcia kostí spôsobuje neznesiteľnú bolesť kostí, patologické fraktúry, kompresiu chrbtice a život ohrozujúcu hyperkalcémiu. Keďže mnohonásobný myelóm sa nemôže liečiť štandardnou chemoterapiou alebo transplantáciou kmeňových buniek (Attal et al., 1996) a je spojený s vysokou chorobnosťou a potenciálnou mortalitou, sú životne dôležité také liečebné stratégie, ktoré bránia rastu samotných myelómov a najmä osteolytickej deštrukcii kostí, ku ktorej u týchto pacientov dochádza.

Patologické mechanizmy, ktoré sú zodpovedné za zvýšenú aktivitu osteoklastov u pacientov s mnohonásobným myelómom, sú však doteraz neznáme (Mundy, 1998). Objavujú sa rôzne profily kostných lézií. Niekedy sa u pacientov vyvinú diskrétne osteolytické lézie, ktoré sú spojené so solitémymi plazmacytómami. Niektorí pacienti majú difúznu osteopéniu, ktorá maskuje výskyt osteoporózy a je spôsobená tým, že myelómové bunky sa difúzne rozšírili chrbticou. U väčšiny pacientov sa objavujú počerné diskrétne lytické lézie v susedstve hniezd myelómových buniek.

Hyperkalcémia sa objavuje ako dôsledok deštrukcie kostí asi u jednej tretiny pacientov s pokročilou chorobou. Pacienti s myelómom len zriedkavo nemávajú lytické lézie alebo straty kostí, a skôr u nich dochádza k zvýšeniu tvorby novej kosti v okolí hniezd myelómových buniek. Táto vzácna situácia sa nazýva osteosklerotický myelóm.

Osteolytické kostné lézie sú zďaleka najrozšírenejším kostrovým prejavom u pacientov s myelómom (Mundy, 1998). Hoci presný molekulárny mechanizmus zostáva nejasný, pozorovania za posledných 15 rokov viedli k záverom, že:

1. Mechanizmus, ktorým pri myelóme dochádza k deštrukcii kosti, je sprostredkovaný osteoklastmi, čo sú normálne bunky resorbujúce kosť.

2. Osteoklasty sa akumulujú na kosť resorbujúcich povrchoch priľahlých k zhluku myelómových buniek a zdá sa, že mechanizmus, ktorým sú stimulované osteoklasty v myelóme, je lokálny mechanizmus.

3. Už veľa rokov je známe, že kultúry ľudských myelómových buniek in vitro produkujú niekoľko faktorov stimulujúcich osteoklasty, ako sú napr. lymfotoxín-alfa (LT-a), interleukín-1 (IL-1), proteín príbuzný paratormónu (PTHrP) a interleukín-6 (IL-6).

4. Hyperkalcémia sa objavuje niekedy v priebehu choroby asi u jednej tretiny pacientov a je vždy spojená s výrazným zvýšením resorpcie kostí a veľmi často aj s výrazným poškodením glomerulámej filtrácie.

5. Zvýšenie resorpcie kostí osteoklastmi v myelóme je často spojené so zvýšeným poškodením funkcie osteoklastov. Aktivita alkalickej fosfatázy v sére je znížená alebo je normálna, na rozdiel od pacientov s inými typmi osteolytického ochorenia kostí, a rádionuklidové vyšetrenie sa nevyznačuje známkami zvýšeného príjmu, čo poukazuje na narušenú reakciu osteoblastov na zvýšenie resorpcie kostí.

Hoci rôzne uvedené medíátory sa zúčastňujú stimulácie aktivity osteoklastov u pacientov s mnohonásobným myelómom, doterajšie publikácie o faktoroch produkovaných myelómovými bunkami neboli konzistentné a niektoré štúdie neboli preukazné vzhľadom na prítomnosť iných kontaminujúcich typov buniek vrátane stromových buniek a makrofágov, v populácii buniek mnohonásobného myelómu. Hlavným myelómovým rastovým faktorom je IL-6, ktorý podporuje rast niekoľkých myelómových bunkových línií a myelómových buniek čerstvo izolovaných z pacienta (Bataille et al., 1989). Produkcia IL-6 sa môže detegovať u asi 40 % čerstvo izolovaných myelómových buniek použitím metódy PCR, ale iba 1 zo 150 vyšetrovaných pacientov mal produkciu IL-6 detegovateľnú imunocytochemickým testom alebo testom ELISA (Epstein, 1992). IL-6 receptory sa detegovali iba u 6 z 13 vzoriek z pacientov s mnohonásobným myelómom (Bataille et al., 1992). Navyše, zrelé myelómové bunky majú podľa publikácií minimálnu proliferačnú reakciu na IL-6. Interleukín-11 (IL-11) má na plastocytómy účinky podobné IL-6, doteraz však nikto nepreukázal, že myeló2 mové bunky produkujú IL-11. Bataille et al. (1995) ukázal, že perfuzie u piatich pacientov s refraktomým myelómom, protilátkou proti IL-6, znížili počet myelómových buniek iba u dvoch z týchto pacientov. IL-1 je extrémne účinné činidlo resorpcie kostí, ktoré spôsobuje hyperkalcémiu na zvieracích modeloch bez zlyhania obličiek (Boyce et al., 1989). Naproti tomu hyperkalcémia sa vyskytuje zriedkavo u pacientov s myelómom bez zlyhania obličiek. Dôležitejšia je však skutočnosť, že pri vysoko purifikovaných myelómových bunkách sa nedetegovala žiadna produkcia IL-1 a len vzácna produkcia TNF-a, čo viedlo k domnienke, že iné kontaminujúce bunky, ako napr. makrofágy, by mohli byť zdrojom IL-1 a TNF-a (Epstein, 1992). Podobne LT-a je produkovaný väčšinou ľudských myelómových bunkových línií (Bataille et al., 1995), ale nie je produkovaný myelómovými bunkami in vivo (Alsina et al., 1996). Okrem IL-1, TNF-a, LT-a a IL-6 myelómové bunky produkujú skrátenú formu M-CSF, ktorý je biologicky aktívny, samotný M-CSF však nespôsobuje hyperkalcémiu ani neindukuje tvorbu osteoklastov v kultúrach ľudskej kostnej drene (Mac Donald et al., 1986).

Takže úloha žiadneho z týchto faktorov v osteolytickej chorobe kostí u pacientov s myelómom sa doteraz nepreukázala in vivo, takže známe cytokíny samotné zjavne nie sú zodpovedné za celkovú resorpciu kostí pozorovanú u týchto pacientov.

Úloha interakcií adhezívnych molekúl pri myelómovej chorobe kostí

Prvou skupinou, ktorá preukázala dôležitosť adhezívnych interakcií medzi myelómovými bunkami a bunkami v mikroprostredí drene tak pre rast myelómových buniek, ako aj pre rozvoj osteolytickej choroby kostí, bol Anderson et al.

Bunky mnohonásobného myelómu exprimujú na svojom povrchu adhézne molekuly, CD29 (VLA-4), LFA-1 a CD44 (Chauhan et al., 1995). Títo pracovníci predpokladali, že myelómové bunky sú lokalizované v dreni prostredníctvom špecifických adhéznych interakcií medzi proteínmi extracelulámej matrice a stromovými bunkami drene. Ďalej ukázali, že adhézia buniek mnohonásobného myelómu k stromovým bunkám spúšťala sekréciu IL-6 tak pri normálnych stromových bunkách, ako aj pri myelómových bunkách, a zvyšovala rast nádorových buniek sprostredkovaný IL-6. Protilátky proti CD29, LFA-1 alebo CD44 však neznížili produkciu IL-6 stromovými bunkami drene v reakcii na myelómové bunky, čo predpokladalo, že iná interakcia ligand-receptor spúšťa sekréciu IL-6 stromových buniek drene naviazaných na myelómové bunky. Samotná identifikácia možnej adhéznej metabolickej dráhy neznamená, že táto dráha je dôležitá. V tomto prípade sa ukázalo, že žiadna z domnelých dráh nezohrávala úlohu v produkcii IL-6.

Vanderkerken et al. (1997) vyšetril aj fenotypový adhézny profil myších buniek 5T2 a 5T33 myelómových buniek na modeli myšieho myelómu. Tieto výskumy ukázali, že tieto bunkové línie exprimovali VLA-4, VLA-5, LFA-1 a CD44, a viedli k predpokladu, že tieto faktory sú dôležité pritom, aby sa myelómové bunky naviazali na stromové bunky drene.

Aj napriek značným pokrokom v laboratórnom výskume však základné mechanizmy zvýšenej osteoklastickej deštrukcie kostí pri myelóme zostali nevyjasnené. To odráža aj neľahkú situáciu pri interpretácii údajov o adhezívnych interakciách získaných in vitro pre situáciu in vivo. Tak napr. mnohé štúdie in vitro dokazovali účasť tak integrínu VLA-4, ako aj integrínu LFA-1 pri adhézii hepatopoetických kmeňových buniek na stromové bunky drene (prehľad pozri Papaynnapoulou a Nakamoto, 1993). Tieto in vitro údaje by viedli k predikcii toho, že obe metabolické dráhy, ak by boli blokované in vivo, by viedli k periferalizácii hematopoetických kmeňových buniek z drene do periférnej krvi. Teraz sa na štúdii s primátmi ukázalo, že zatiaľ čo monoklonálna protilátka (mAb) proti VLA-4 skutočne účinne periferalizovala kmeňové bunky, monoklonálna protilátka proti beta 2 integrínovému reťazcu LFA-1 bola bez účinku aj napriek zvýšenému počtu neutrofilov dokazujúcemu aktivitu protilátky (Papaynnapoulou a Nakamoto, 1993). Tieto údaje okrem iného, dokázali, že na základe výsledkov získaných in vitro nedala predvídať situácia in vivo.

Je potrebné poznamenať, že úloha integrínu VLA-4 sa študovala v metastázach mnohých nádorov vrátane leukémií, ako je lymfóm, s rozdielnymi výsledkami. Transfekcia ľudského alfa 4 reťazca do buniek ovárií čínskeho škrečka (CHO) viedla k expresii VLA-4 a poskytla týmto bunkám schopnosť migrovať do kostnej drene in vivo, pričom tento jav sa inhiboval protilátkami proti VLA-4 (Matsuura et al., 1996). Naproti tomu transfekcia lymfómových buniek VLA-4 viedla k silnej inhibícii metastáz v pečeni, pľúcach a obličkách, a bola bez účinku na osídľovanie a proliferáciu kostnej drene (Gosslar et al., 1996). Navyše expresia VLA-4 na silno metastázujúcich bunkách myšieho melanómu inhibovala vytváranie pľúcnych metastáz in vivo (Qian et al., 1994) a nepredisponovala melanóm k metastázam v kostnej dreni.

Dá sa teda zhrnúť, že na základe štúdií adhezívnych dráh in vitro nie je jasné, aká je relevancia predikcie pre situáciu in vivo. Dokonca ani zo štúdií in vitro nie sú konzistentné údaje. Hlavným dôvodom prekvapivej nekonzistencie údajov je zrejme to, že súčasné dostupné zvieracie modely myelómu nie sú dostatočne dobré na predikciu choroby u ľudí. V prípade mnohonásobného myelómu ľudské a myšie myelómové bunkové línie, ktoré môžu byť kultivované in vitro, sú len veľmi zriedkavo spojené s deštrukciou kostí in vivo (Mundy, 1998).

Je teda veľmi potrebné identifikovať zlúčeniny alebo antagonisty, ktoré inhibujú produkciu týchto faktorov resorpcie kostí, a tým môžu zastaviť deštrukciu kostí a zlepšiť kvalitu života pacientov trpiacich myelómom.

Podstata vynálezu

Použil sa novovyvinutý model mnohonásobného myelómu, v ktorom sa u myší vyvíjajú závažné osteolýzy so všetkými základnými príznakmi tej istej choroby u ľudí (Garret, 1997). Pomocou tejto bunkovej línie a zvieracieho modelu pôvodcovia zistili, že inhibícia dráhy „alfa 4 integrín/ligand alfa 4 integrínu“ in vivo vedie k zníženiu schopnosti buniek mnohonásobného myelómu proliferovať a/alebo prežívať. Pôvodcovia ďalej ukázali, že kontakty bunka-bunka medzi myelómovými bunkami a stromovými bunkami kostnej drene prostredníctvom interakcie VLA-4/VCAM-1 je nutná na zvýšenie produkcie aktivity, ktorá stimuluje resorpciu kosti osteoklastmi v mikroprostredí kosti in vivo.

Predpokladalo sa, že táto interakcia je kritická pre osídlenie kompartmentu kostnej drene myelómovými bunkami, ako aj na ďalšie prežívanie a rast myelómových buniek, až po progresiu myelómom indukovanej osteolýzy. Tento predpoklad sa testoval na zvieracom modeli a zistilo sa, že v podmienkach in vivo antagonista integrínu VLA-4 obsahujúceho podjednotku alfa 4 silno inhibuje produkciu protilátok typu IgG2b. Tento izotyp je zhodný s izotypom produkovaným bunkovou líniou 5TGM1 a je v ktoromkoľvek okamihu presnou náhradou radu myelómových buniek v kompartmente kostnej drene. Takže blokovanie dráhy VLA-4 významne inhibuje produkciu IgG2b a teda v dôsledku toho hladinu záťaže myelómom.

Jeden aspekt predkladaného vynálezu sa týka použitia protilátky anti-VLA-4, protilátky anti-alfa4/beta7 integrínu alebo protilátky anti-VCAM-1 alebo ich fragmentov viažucich antigén na výrobu farmaceutickej kompozície na liečenie mnohonásobného myelómu. Výhodnými činidlami sú humánne, chimérické, humanizované protilátky a ich fragmenty viažuce antigén; homológy protilátok anti-VCAM-1 (humánne protilátky, chimérické, humanizované protilátky a ich fragmenty). Kompozícia sa môže podávať v takých dávkach, aby poskytli od 0,1 až 20 mg/kg telesnej hmotnosti. Predovšetkým, výhodné činidlá môžu antagonizovať interakciu a) spoločne tak VLA-4, ako aj alfa4 beta7, s príslušnými ligandmi alfa4; alebo b) iba VLA-4 s ligandmi alfa4; alebo c) iba alfa4beta7 s ligandmi alfa4.

Ďalším znakom vynálezu je použitie rozpustného VLA-4 alebo VCAM-1 polypeptidu, ktorý antagonizuje VLA-4/VCAM-1 interakciu na výrobu farmaceutickej kompozície na liečenie mnohonásobného myelómu.

Ďalším znakom vynálezu je protilátky anti-VLA-4, protilátky anti-alfa4/beta7 integrínu alebo protilátky anti-alfa4/beta7 integrínu alebo ich fragmentov viažucich antigén na výrobu farmaceutickej kompozície na inhibíciu resorpcie kostí súvisiacej s nádormi kostnej drene.

Výhodnými činidlami sú protilátky anti-VLA-4 alebo anti-alfa4beta7 (humánne protilátky, chimérické, humanizované protilátky a ich fragmenty viažuce antigén); protilátky anti-VCAM-1 (humánne protilátky, chimérické, humanizované protilátky a ich fragmenty). Činidlo sa môže podávať v takých dávkach, aby poskytli od asi 0,1 až asi 20 mg/kg telesnej hmotnosti.

Ďalším aspektom vynálezu je použitie rozpustného VLA-4 alebo VCAM-1 polypeptidu, ktorý antagonizuje VLA-4/VCAM-1 interakciu na výrobu farmaceutickej kompozície na inhibíciu resorpcie kostí súvisiacej s nádormi kostnej drene.

Kompozícia sa môže podávať v takých dávkach, aby poskytli od približne 0,1 do približne 20 mg/kg telesnej hmotnosti.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1

Účinok neutralizačných protilátok na vytváranie TRAP-pozitívnych multinukleárnych buniek podobných OC v spoločných kultúrach (kokultúrach) buniek 5TGM1 a buniek kostnej drene

Zmes buniek 5TGM1 (1 e3) a buniek kostnej drene (leó) v suspenzii sa vysiala na 48-jamkové kultivačné doštičky a kultivovala sa buď bez alebo s prídavkom 10 /zg/ml protilátky anti-VCAM-1 (VCAM-1 Ab), protilátky anti-alfa 4 beta 1 (o4/31 Ab), protilátky anti-ICAM-1 (ICAM-1 Ab) alebo IgG potkana ako kontrolnej protilátky. Po 6-dennej kultivácii sa kultúry fixovali a stanovilo sa množstvo TRAP-pozitívnych multinukleámych buniek podobných OC (TRAP(+)MNC). Tak protilátky VCAM-1 Ab, ako aj anti-alfa 4 beta 1 inhibovali vytváranie buniek TRAP(+)MNC, zatiaľ čo protilátka ICAM-1 Ab bola bez účinku. Údaje sú uvedené ako priemerné hodnoty ± smerodajná odchýlka (S. E.) pre n = 3.

* označuje štatisticky významný rozdiel v porovnaní s IgG kontrolou.

Obr. 2

Účinok 5TGM1 a ST2 kondiciovaného média na resorpciu kosti v orgánovej kultúre dlhých kostí z feta potkana

Kondiciované médiá (48 hodín) získané zo samotnej kultúry ST2, samotné kultúry 5TGM1 a spoločné kultúry ST2 a 5TGM1 sa testovali na kosť resorbujúcu aktivitu v orgánových kultúrach dlhých kostí z feta potkana značených ⁴⁵Ca. Dlhé kosti z feta potkana značené ⁴⁵Ca sa kultivovali v prítomnosti kondiciovaného (40 % objem) alebo kontrolného média počas 120 hodín. Hodnoty sú uvedené ako percentá zvýšenia uvoľňovania vápnika v porovnaní s kontrolným médiom. Uvoľňovanie z kondiciovaného média stromových buniek ST2 je znázornené ako prázdny (biely) stĺpec, uvoľňovanie z kondiciovaného média 5TGM1 je znázornené šrafovaným stĺpcom. Uvoľňovanie z kondiciovaného média zo spoločnej kultúry 5TGM1 a ST2 je znázornené ako plné (čierne) stĺpce. Údaje sú uvedené ako priemer ± S. E. (stredná chyba) pre n = 4.

* znamená štatisticky významne odlišnú hodnotu od samotnej ST2, ** znamená štatisticky významne odlišnú hodnotu od samotnej 5TMG1.

Obr. 3

Účinok rekombinantného rozpusteného VCAM-1 (sVCAM-1) na produkciu osteoklastogénnej aktivity pri bunkách 5TGM1

Kondiciované médium sa zobralo z bunkových kultúr 5TGM1 v prítomnosti či absencii sVCAM-1 (1 x x 10‘⁸ až 1 x 10⁷ mol/1) počas 24 hodín. Osteoklastogénna aktivita týchto kondiciovaných médií sa testovala na kultúrach buniek z kostnej drene myší. Bunky kostnej drene (leó/jamka) sa naniesli na 48-jamkové doštičky a kultivovali sa v prítomnosti kondiciovaného média (šrafované stĺpce) alebo kontrolného média (IMDM) obsahujúceho rovnakú koncentráciu sVCAM-1 (prázdne stĺpce). Po 6 dňoch sa kultúry fixovali a stanovil sa počet TRAP-pozitívnych multinukleámych buniek podobných OC (TRAP(+)MNC). Kondiciované médium z buniek 5TGM1 ošetrené 1 x 10'⁷ mol/1 sVCAM-1 zvýšilo tvorbu TRAP(+)MNC. Údaje sú uvedené ako priemer ± S. E. (stredná chyba) pre n = 3. * znamená štatisticky významne odlišnú hodnotu od kontroly.

Obr. 4

Účinok monoklonálnej protilátky (mAb) PS2 proti VLA-4 na zvýšenie IgG2b v sére myší nesúcich 5TGM1

Myšiam sa injikovalo le5 buniek 5TGM1, aby osídlili kostnú dreň. Potom sa myši rozdelili do dvoch skupín po troch, keď prvá skupina slúžila ako kontrola a druhá skupina sa v 8., 11., 14., 17. a 20. deň ošetrila 80 /zg mAb PS2 (približne 4 mg/kg). Týždenne od 1. do 6. týždňa sa merali hladiny IgG2b, izotypovej protilátky produkovanej myelómovými bunkami 5TGM1. Ošetrenie protilátkami významne inhibovalo tvorbu IgG2b, čo ukazuje na to, že došlo k inhibícii prežívania a rastu myelómových buniek in vivo.

Obr. 5

Účinok monoklonálnej protilátky (mAb) M/K-27 proti VCAM-1 na hladinu IgG2b v sére myší nesúcich 5TGM1

Myšiam sa injikovali bunky 5TGM1 rovnako, ako sa opísalo pri obr. 4, aby osídlili kostnú dreň. Potom sa myši rozdelili do skupín po štyroch alebo piatich, kedy prvá skupina slúžila ako kontrola (prázdne štvorčeky) a druhá/tretia skupina sa profylaktický ošetrila 80 /zg (prázdne kosoštvorčeky) a 160 /zg mAb (4 a 8 mg/kg) a štvrtá skupina sa ošetrila terapeuticky 160 gg a 80 /zg mAb (prázdne trojuholníčky). Merali sa hladiny IgG2b, izotypovej protilátky produkovanej myelómovými bunkami 5TGM1. Ošetrenie protilátkami významne inhibovalo tvorbu IgG2b, čo poukazuje na to, že došlo k inhibícii prežívania a rastu myelómových buniek in viObr. 6

Účinok protilátky proti alfa 4 integrínu prežívania myší nesúcich mnohonásobný myelóm

Podrobný opis vynálezu

Vynález sa týka liečenia, okrem iného prevencie mnohonásobného myelómu. Konkrétnejšie použitia protilátok alebo polypeptidových antagonistov interakcie medzi integrínom obsahujúcim podjednotku alfa4 a ligandom tohto integrínu na liečenie mnohonásobného myelómu. Termínom mnohonásobný myelóm sa rozumie ochorenie, ktorým trpí jedinec s neoplastickým ochorením plazmatických buniek, s neoplastickým klonom predstavujúcim bunky v rôznom štádiu vývoja v plazmatickej bunkovej línii u rôznych pacientov (Mundy, 1998).

alfa 4 beta 1 integrín je receptor lokalizovaný na bunkovom povrchu pre VCAM-1, fibronektín a možno aj iné molekuly, ktoré sa naň viažu alebo s ním inak interagujú. Z tohto hľadiska molekuly, ktoré sa viažu na integrín obsahujúci podjednotku alfa 4 alebo s ním inak interagujú, sa vo všeobecnosti označujú „alfa 4 ligandy“. Termín „a4bl integrín“ (ako aj zameniteľné používané označenie VLA-4 alebo a4bl) označuje po5 lypeptid, ktorý je schopný viazať VCAM-1 a niektoré proteíny extracelulárnej matrice, najmä fibronektín, alebo jeho homológy a fragmenty, hoci odborníkovi je známe, že môžu existovať aj iné ligandy VLA-4a, ktoré sa dajú analyzovať konvenčnými metódami.

Je však známe, že podjednotka alfa 4 asociuje okrem podjednotky beta 1 ešte aj s inými podjednotkami beta, takže termín „alfa 4 integrín“ sa môže definovať tak, že zahŕňa také integríny, ktorých podjednotka alfa 4 asociuje s podjednotkou beta jedného či druhého typu. Ďalším príkladom alfa 4 integrínu je alfa 4 beta 7 (Lobb a Hemler, 1994). Termín „alfa 4 integrín(y)“ používaný v predkladanom opise označuje teda VLA-4, ako aj integríny, ktoré obsahujú podjednotku beta 1, beta 7 alebo akúkoľvek inú podjednotku beta.

V rozsahu vynálezu sú aj medicínske použitia činidla, ktoré antagonizuje pôsobenie viac ako jedného alfa 4 integrínu, takých ako protilátka, ktorá antagonizuje niekoľko alfa 4 integrínov, ako sú VLA-4 a alfa4beta7, alebo ďalšie kombinácie alfa 4 integrínov. Do rozsahu vynálezu patria tiež spôsoby použitia kombinácie rôznych molekúl tak, že kombinovaná aktivita antagonizuje pôsobneie viac ako jeden alfa4integrín, pričom takéto spúsoby používajú niekoľko protilátok, ktoré v kombinácii antagonizujú alfa4integríny VLA-4 a alfa4beta7.

Tak napríklad sú vhodné protilátky (budú sa ešte opisovať v ďalšej časti predloženého vynálezu), ako aj rozpustné formy prírodných väzbových proteínov pre VLA-4 a VCAM-1.

V inom príklade je VCAM-1 alebo jeho fragment schopný viazať sa na VLA-4 na povrchu myelómových buniek nesúcich VLA-4, teda napr. fragment s dvoma N-koncovými doménami VCAM-1 sa môže fúzovať s druhým peptidom, napr. s peptidom, ktorý zvyšuje rozpustnosť alebo in vivo polčas časti VCAM-1 fúzneho peptidu. Druhý peptid môže byť fragment rozpustného peptidu, výhodne ľudského peptidu, najvýhodnejšie plazmatického proteínu, alebo člen superrodiny imunoglobulínov.

V inom výhodnom uskutočnení je činidlom, použitým podľa vynálezu na viazanie, blokovanie alebo poťahovanie bunkového povrchu alfa 4 integrínu a/alebo ligand alfa 4 integrínu, monoklonálna protilátka antiVLA-4 a/lebo anti-alfa 4 beta 7. Výhodné protilátky vhodné na liečenie, najmä na liečenie ľudí, zahŕňajú ľudské protiláty, humanizované protilátky, chimérícké protilátky, Fab, Fab', F(ab')₂ a F(v) fragmenty protilátok a monoméry alebo diméry protilátok s ľahkými alebo ťažkými reťazcami alebo ich zmesi. Monoklonálne protilátky proti VLA-4 sú výhodné väzbové činidlá podľa vynálezu.

Termín „protilátka“ podľa vynálezu zahŕňa intaktné protilátky zložené z ťažkého reťazca a ľahkého reťazca imunoglobulínu, ktoré sú spojené disulfidickými väzbami. Termín „protilátka“ zahŕňa aj proteíny obsahujúce jeden alebo viacero polypeptidov vybraných zo skupiny obsahujúcej ľahké reťazce imunoglobulínu, ťažké reťazce imunoglobulínu a ich fragmenty viažuce antigén, ktoré sú schopné viazať jeden alebo viacero antigénov. Zložené polypeptidy homológov protilátky obsahujúce viac než jeden polypeptid sú prípadne viazané disulfidickými väzbami alebo kovalentne zosietené.

Teda „protilátky“ zahrnujú intaktné imunoglobulíny typov IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (vrátane ich subtypov), kde sú ľahké imunoglobulínové reťazce typu kappa alebo lambda.

„Protilátky“ taktiež zahŕňajú aj časti intaktných protilátok, ktoré si uchovávajú väzbovú špecifickosť pre antigén, napr. fragmenty Fab, Fab', F(ab')₂ a F(v), ďalej monoméry alebo diméry ťažkého reťazca, monoméry alebo diméry ľahkého reťazca, diméry zložené z jedného ťažkého reťazca a jedného ľahkého reťazca a pod., takže podľa vynálezu sú užitočné fragmenty viažuce antigén rovnako ako diméme alebo trimérne polypeptidy s úplnou dĺžkou odvodené od opísaných protilátok.

Termín „humanizovaná protilátka“ označuje protilátku pripravenú technológiou rekombinantnej DNA, kde buď len niektoré alebo všetky aminokyseliny, ktoré nie sú nevyhnutné pre väzbu antigénu z ťažkého alebo ľahkého reťazca imunoglobulínu cicavca iného než človek, sa nahradili zodpovedajúcimi aminokyselinami ťažkého alebo ľahkého reťazca ľudského imunoglobulínu.

Termín „chimérická protilátka“ označuje protilátku pripravenú technológiou rekombinantnej DNA, kde buď celá alebo časť kĺbovej oblasti a konštantných úsekov ťažkého alebo ľahkého reťazca imunoglobulínu, sa nahradili zodpovedajúcimi úsekmi ťažkého alebo ľahkého reťazca iného imunoglobulínu. Iným aspektom predkladaného vynálezu je variant chimérickej molekuly, ktorá obsahuje 1. VLA-4 zameriavaciu časť, napr. časť VCAM-1 schopnú viazať sa na antigén (t. j. VLA-4) na povrchu myelómovej bunky nesúcej VLA-4, a 2. prípadne druhý peptid, napr. taký, ktorý zvyšuje rozpustnosť alebo biologický polčas in vivo, napr. člen superrodiny imunoglobulínov alebo jeho fragment, napr. časť alebo fragment imunoglobulínu G, napr. konštantný úsek ťažkého reťazca ľudského IgGl, napr. kĺbové úseky CH2 a CH3, a ďalej toxínovú časť. VLA-4 zameriavacia časť je prirodzene sa vyskytujúci VLA-4 ligand alebo jeho fragment, napr. peptid VCAM-1 alebo podobná konzervatívne substituovaná sekvencia aminokyselín. Výhodná zameriavacia časť je rozpustný fragment VCAM-1, napr. N-koncové domény 1 a 2 molekuly VCAM-1. Chimérická molekula sa môže použiť na liečenie subjektu, napr. človeka, u ktorého je riziko choroby, napr. mnohonásobného myelómu, charakterizované prítomnosťou myelómových buniek nesúcich VLA-4, a výhodne VLA-4.

Termín „ľudská protilátka“ je protilátka pripravená technológiou rekombinantnej DNA, kde všetky aminokyseliny ťažkého reťazca i ľahkého reťazca imunoglobulínu pochádzajú z ľudského zdroja.

Spôsob prípravy protilátok anti-VLA-4

Techniky prípravy homológov monoklonálnych protilátok sú odborníkom dobre známe. Stručne zhrnuté, nesmrteľná bunková línia (typicky myelómové bunky) sa fuzuje s lymfocytmi (typicky splenocytmi) z cicavca imunizovaného celými bunkami exprimujúcimi daný antigén, napr. VLA-4, a supematant z kultúry výsledných hybridómových buniek sa potom testuje na prítomnosť protilátok proti antigénu (pozri Kohler et al., Náture 265, 295-297 (1975)).

Imunizácia sa uskutočňuje štandardným postupom. Jednotkové dávky a imunizačný režim sú závislé od druhu imunizovaného cicavca, jeho imunitného stavu, telesnej hmotnosti a pod. Typicky sa imunizovanému cicavcovi odoberie krv a sérum z každej krvnej vzorky sa testuje pomocou príslušného testu na prítomnosť určitých protilátok. Tak napr. protilátky anti-VLA-4 sa môžu identifikovať pomocou imunoprecipitácie bunkových lyzátov buniek exprimujúcich VLA-4 značených ^l25I (pozri napr. Sanchez-Madrid et al., Eur. J. Immunol. 16, 1343-1349 (1996), Hemler et al., J. Biol. Chem. 262, 11478-11485 (1987)). Protilátky anti-VLA-4 sa môžu identifikovať aj pomocou prietokovej cytometrie, napr. meraním fluorescenčného zafarbenia Ramosových buniek inkubovaných s protilátkou, ktorá rozpoznáva VLA-4 (Elices et al., Celí 60, 577-584 (1990)). Lymfocyty použité na prípravu hybridómových buniek sa typicky izolujú z imunizovaných cicavcov, ktorých sérum bolo v teste na prítomnosť protilátok anti-VLA-4 pozitívne.

Typicky nesmrteľná bunková línia (napr. myelómové bunky) pochádza z rovnakého druhu cicavca, ako lymfocyty. Výhodné nesmrteľné bunkové línie sú myšie myelómové bunkové línie, ktoré sú citlivé na kultúrne médium obsahujúce hypoxatín, aminopterín a tymidín (médium „HAT“). Typicky HAT-senzitívne myšie myelómové bunky sa fuzujú s myšími splenocytmi pomocou polyetylénglykolu s molekulovou hmotnosťou 1500 (PEG 1500). Vzniknuté hybridómové bunky sa potom selektujú pomocou média HAT, ktoré usmrtí nefúzované alebo neproduktívne fúzované bunky (nefúzované splenocyty odumrú po niekoľkých dňoch, pretože nie sú transformované). Hybridómy produkujúce požadovanú protilátku sa detegujú pomocou testu supematantu z kultúry buniek. Tak napr. hybridómy pripravené tak, aby produkovali protilátky anti-VLA-4, sa podrobia skríningu, keď sa testuje supematant z hybridómovej kultúry na prítomnosť secemovaných protilátok, ktoré majú schopnosť viazať sa na rekombinantnú bunkovú líniu exprimujúcu alfa 4 podjednotku (pozri napr. Elices et al., 1990).

Na prípravu homológov protilátok anti-VLA-4, ktoré sú intaktné imunoglobulíny, sa hybridómové bunky, ktoré boli v opísaných testoch pozitívne, kultivujú v živnom médiu v takých podmienkach a taký dlhý čas, ktoré sú dostatočné na to, aby hybridómové bunky secemovali monoklonálne protilátky do média. Techniky tkanivových kultúr a živné médiá vhodné pre hybridómové bunky sú známe. Kondiciovaný supematant z hybridómovej kultúry sa odoberie a požadované protilátky anti-VLA-4 sa môžu, ak je to potrebné, ďalej purifikovať známymi metódami.

Alternatívne sa požadované protilátky produkujú injikovaním hybridómových buniek do peritoneálnej dutiny myši premedikovanej pristanom. Hybridómové bunky sa potom proliferujú v peritoneálnej dutine a secemujú protilátky, ktoré sa akumulujú v ascite. Protilátky sa potom izolujú odobratím tekutiny z ascitu pomocou injekčnej striekačky.

Niekoľko myších monoklonálnych protilátok anti-VLA-4 sa opísalo už skôr (pozri napr. Sanchez-Madrid et al., 1986, Hemler et al., 1987, Pulido et al., J. Biol. Chem. 266(16), 10241-10245 (1991)). Tieto monoklonálne protilátky anti-VLA-4, ako je napr. HP1/2 a ďalšie (napr. HP2/1, HP2/4, L25, P4C2, P4G9) schopné rozpoznávať P reťazec VLA-4, sú užitočné podľa vynálezu. Výhodné sú také protilátky anti-VLA-4, ktoré rozpoznávajú alfa 4 epitop VLA-4, ktorý sa zúčastňuje väzby k ligandom VCAM-1 a fibronektínu (t. j. protilátky, ktoré sa môžu viazať na VLA-4 v mieste podieľajúcom sa na rozpoznaní ligandu a teda blokovať väzbu VCAM-1 a fibronektínu). Takéto protilátky sa definovali ako protilátky špecifické pre epitop B (BI alebo B2) (pozri Pulido et al., 1991) a sú aj anti-VLA-4 protilátkami v zmysle predkladaného vynálezu.

Homológy úplne ľudských protilátok proti VLA-4 sú ďalším výhodným činidlom podľa vynálezu, ktorý blokuje alebo pokrýva VLA-4 antigény. Takéto protilátky v ich intaktnej forme sa môžu pripraviť z ľudských splenocytov stimulovaných in vitro, ako opísali Boemer et al., J. Immunol. 147, 86-95 (1991). Alternatívne sa môžu pripraviť repertoárovým klonovaním, ako opísali Persson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2432-2436 (1991) alebo Huang a Stollar, J. Immunol. Methods 141, 227-236 (1991) a Patent USA 5,798,230, „Process for the preparation of human monoclonal antibodies and their use“ z 25. augusta 1998, na prípravu ľudských monoklonálnych protilátok z ľudských B buniek. Týmto postupom sa ľudské B bunky produkujúce protilátku imortalizujú tak, že sa infikujú vírusom Epstein-Barrovej alebo jeho derivátom, ktorý exprimuje EBV jadrový antigén 2 (EBNA2). Funkcia EBNA2, ktorá je nutná na imortalizáciu, sa potom vyradí z činnosti, čo vedie k zvýšeniu tvorby protilátok.

V ďalšej metóde produkcie úplne ľudských protilátok (Patent USA 5,789,650, „Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies“ zo 4. augusta 1998), sa opisuje použitie transgénnych zvierat s výnimkou človeka, schopných produkovať heterológne protilátky, a transgénnych zvierat, ktoré majú inaktivované endogénne imunoglobulínové gény. Endogénne imunoglobulínové gény sa potlačia použitím antisense oligonukleotidov a/alebo antisérom namiereným proti endogénnym imunoglobulínom. Heterológne protilátky sú kódované imunoglobulínovými génmi, ktoré sa normálne v genóme daného biologického druhu nevyskytujú. Jeden alebo viacero transgénov obsahujúcich sekvencie ťažkého reťazca heterológneho ľudského imunoglobulínu, ktoré sú v pôvodnom usporiadaní, sa vnesú do zvieraťa iného než človek, čím sa vytvorí transgénne zviera schopné funkčne preorganizovať transgénne imunoglobulínové sekvencie a produkovať tak repertoár protilátok rôznych izotypov, ktoré sú kódované ľudskými imunoglobulínovými génmi. Takéto heterológne ľudské protilátky sú produkované B bunkami, ktoré sa potom imortalizujú, napr. fúziou s imortalizovanou bunkovou líniou, ako je napr. myelóm, alebo úpravou týchto B buniek iným postupom tak, aby poskytli permanentnú bunkovú líniu produkujúcu homológy monoklonálnej heterológnej úplne ľudskej protilátky.

Veľké neimunizované knižnice používajúce fágové expozície sa môžu použiť na izoláciu protilátok s vysokou afinitou, ktoré sa potom ďalej môžu spracovať ako lieky konvenčnou technikou, pri ktorej sa využijú fágy (Vaughan et al., 1996).

Ďalšie výhodné väzbové činidlo, ktoré môže blokovať alebo poťahovať VLA-4 antigény podľa vynálezu, je homológ humanizovanej rekombinantnej protilátky, ktorá má špecifickosť anti-VLA-4. Po pôvodných metódach na prípravu chimérických protilátok sa opísal nový spôsob v dokumente EP 0,239,400 (Winter et al.), kde sa protilátky zmenili substitúciou ich pôvodných komplementaritu určujúcich úsekov (CDR) úsekmi z iného biologického druhu. Tento spôsob sa môže použiť napr. na nahradenie CDR z domén variabilných úsekov ťažkého a ľahkého reťazca ľudského Ig alternatívnymi CDR z domén variabilných úsekov Ig myší. Tieto altemované variabilné úseky Ig sa potom môžu kombinovať s konštantnými úsekmi ľudského Ig, čím sa vytvoria protilátky, ktoré sú svojím zložením úplne ľudské, až na substituované myšie CDR. Dá sa predpokladať, že takéto substituované protilátky budú s oveľa menšou pravdepodobnosťou vyvolávať imunitnú reakciu u ľudí v porovnaní napr. s chimérickými protilátkami, pretože CDR substituované protilátky obsahujú významne menej zložiek, ktoré nie sú ľudského pôvodu. Proces „humanizácie“ protilátok metódou tzv. „očkovania“ CDR sa nazval „pretvarovanie“ protilátok (Riechmann et al., Náture 332, 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)).

Typicky sa komplementaritu určujúce úseky (CDR) z myšej protilátky transplantujú do zodpovedajúcich úsekov ľudskej protilátky, pretože sú to práve CDR úseky (tri v ťažkých reťazcoch a tri v ľahkých reťazcoch protilátky), ktoré sa v myšej protilátke viažu na špecifický antigén. Transplantácia CDR sa uskutoční metódami génového inžinierstva, keď sa sekvencia cDNA pre CDR určí klonovaním génových segmentov pre variabilné úseky (V) ľahkého a ťažkého reťazca, a potom sa prenesú do zodpovedajúcich úsekov miestne cielenou mutagenézou. V poslednej fáze tohto postupu sa segmenty génu ľudského konštantného úseku požadovaného izotypu (zvyčajne gama I pre CH a kappa pre CL) pridajú a gény pre humanizované ľahké a ťažké reťazce sa spoločne exprimujú (koexprimujú) v bunkách cicavca a produkujú tak rozpustné humanizované protilátky.

Presun týchto CDR do ľudských protilátok dáva ľudským protilátkam antigénno-väzbové vlastnosti pôvodne myšej protilátky. Šesť úsekov CDR z myšej protilátky sa vnesie do „rámcového“ úseku V. Dôvod úspešného očkovania CDR je ten, že rámcové úseky myších a ľudských protilátok majú veľmi podobnú 3D štruktúru s podobnými bodmi naviazania CDR, takže CDR sa môžu zamieňať. Takéto homológy humanizovaných protilátok sa môžu pripravovať postupmi, ktoré opísali napr. Jones et al., Náture 321, 522-525 (1986), Riechmann, Náture 332, 323-327 (1988), Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029 (1989) a Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3833 (1989).

Predpokladá sa však, že niektoré aminokyseliny v rámcovej oblasti protilátky interagujú s CDR a ovplyvňujú celkovú väzbovú schopnosť protilátky. Priamy prenos CDR z myšej protilátky na rekombinantnú ľudskú protilátku bez akejkoľvek modifikácie ľudského rámcového V úseku často vedie k čiastočnej alebo k úplnej strate väzbovej afinity. V mnohých prípadoch je zrejme kritická zámena zvyškov v rámcovom úseku akceptorovej protilátky, aby sa dosiahla väzbová aktivita.

V dokumentoch Queen et al., 1989 a WO 90/07861 (Protein Design Labs) sa opísala príprava humanizovaných protilátok, ktoré obsahujú modifikované rezíduá v rámcovej oblasti akceptorovej protilátky tým, že sa kombinovali CDR z myšej monoklonálnej protilátky (MAb) anti-Tac s rámcovým a konštantným úsekom ľudského imunoglobulínu. Takto sa teda ukázalo jedno z riešení problému straty väzbovej afinity, ktorá je často dôsledkom priameho prenosu CDR bez toho, aby sa modifikovali zvyšky ľudskej V rámcovej oblasti. Toto riešenie obsahuje dva rozhodujúce kroky. Prvým krokom je výber ľudskej V rámcovej oblasti pomocou počítačovej analýzy na optimálnu homológiu proteínových sekvencií s V rámcovou oblasťou pôvodnej myšej protilátky, v danom prípade anti-Tac MAb. V druhom kroku sa modeluje terciáma štruktúra myšieho V úseku pomocou počítačového programu, aby sa mohli vizualizovať aminokyselinové zvyšky v rámcovej oblasti, ktoré pravdepodobne interagujú s myšími CDR a tieto aminokyselinové zvyšky sa potom prenesú na homológny ľudský rámcový úsek (pozri aj Patent USA 5,693,762 (Protein Design Labs)).

Môže sa použiť aj iný prístup (Tempest et al., Biotechnology 9, 266-271 (1991)) a využiť ako štandard úseky V rámca odvodené z NEWM a REI ťažkého a ľahkého reťazca pre očkovanie CDR bez radikálneho vnášania aminokyselinových zvyškov myši. Výhodou uvedeného postupu pri konštrukcii humanizovaných protilátok založených na NEWM a REI je to, že 3D štruktúry variabilných úsekov NEWM a REI sú známe zo skúmania rôntgenovou kryštalografiou a teda sa dajú modelovať špecifické interakcie medzi CDR a aminokyselinovými zvyškami V rámcového úseku.

Bez ohľadu na spôsob prípravy príklady počiatočných homológov humanizovaných protilátok ukazujú, že to nie je jednoduchý proces. Aj keď sa uznáva, že zmeny v rámcovom úseku sú nutné, nie je možné na základe doterajšieho stavu techniky predpovedať, ktoré aminokyselinové zvyšky bude potrebné zmeniť, aby sa získala funkčná humanizovaná rekombinantná protilátka s požadovanou špecifickosťou. Doterajšie výsledky ukazujú, že zmeny nutné na zachovanie špecifickosti a/alebo afinity sú z väčšej časti jedinečné pre danú protilátku a nedajú sa predpovedať na základe humanizácie inej protilátky.

K výhodným antagonistom užitočným podľa vynálezu patria homológy chimérickej rekombinantnej a humanizovanej protilátky (t. j. intaktné imunoglobulíny a ich časti) so špecifickosťou k B epitopu, ktoré sa pripravili spôsobom opísaným v súčasnosti prejednávanej prihláške vynálezu USA 08/004,798 podanej 7. januára 1993 a publikovanej ako PCT/US94/00266. Východiskovým materiálom na prípravu homológov chimérickej (myší V - ľudský C) protilátky a humanizovanej protilátky anti-VLA-4 je myšia monoklonálna protilátka anti-VLA-4, ktorá je komerčne dostupná (napr. protilátka HP2/1, Amae International, Inc., Westbrook, Maine) alebo monoklonálna protilátka anti-VLA-4 pripravená postupom podľa predkladaného vynálezu. Tak napr. variabilné úseky ťažkého a ľahkého reťazca anti-VLA-4 protilátky HP'/₂ sa klonovali, sekvenovali a exprimovali v kombinácii s konštantnými úsekmi ťažkého a ľahkého reťazca ľudského imunoglobulínu. Takéto protilátky HP‘/₂ sú svojou špecifickosťou a účinkom podobné myšej protilátke HP1/2 a dajú sa využiť ako liečivá podľa vynálezu.

Ďalšie výhodné homológy humanizovanej protilátky sa opísali v prihláške PCT/US95/01219 podanej 27. júla 1995 (Athena Neurosciences, Inc.). Tieto humanizované protilátky anti-VLA-4 obsahujú humanizovaný ľahký reťazec a humanizovaný ťažký reťazec. Humanizovaný ľahký reťazec obsahuje tri komplementaritu určujúce úseky (CDR1, CDR2 a CDR3), ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu zo zodpovedajúcich komplementaritu určujúcich úsekov myšieho 21-6 imunoglobulínového ľahkého reťazca a sekvenciu rámca variabilného úseku ľudského ľahkého reťazca kappa s výnimkou, že aspoň v jednej pozícii je aminokyselinová pozícia obsadená rovnakou aminokyselinou, aká je prítomná v ekvivalentnej pozícii rámca variabilného úseku ľahkého reťazca myšieho imunoglobulínu 21-6. Humanizovaný ťažký reťazec obsahuje tri komplementaritu určujúce úseky (CDR1, CDR2 a CDR3), ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu zo zodpovedajúcich komplementaritu určujúcich úsekov myšieho 21-6 imunoglobulínového ťažkého reťazca a sekvenciu rámca variabilného úseku z rámca variabilného úseku ľudského ťažkého reťazca s tou výnimkou, že aspoň v jednej pozícii je aminokyselinová pozícia obsadená rovnakou aminokyselinou, aká je prítomná v ekvivalentnej pozícii rámca variabilného úseku ľahkého reťazca myšieho imunoglobulínu 21-6.

Terapeutické prípravky

Prípravky podľa vynálezu, t. j. VLA-4 väzbové činidlá, najmä homológy fúzie VCAM-1 a anti-VLA-4 protilátky, sa výhodne podávajú parenterálne.

Termín „parenterálne“ podľa vynálezu znamená podávanie subkutánnou, intravenóznou, intramuskulárnou, intraartikulámou, intrasynoviálnou, intraastemálnou, intraatekálnou, intrahepatickou, intrakraniálnou injekciou alebo infúziou alebo podávanie priamo do lézie.

VLA-4 väzbové činidlá podľa vynálezu sa výhodne podávajú ako sterilné farmaceutické prípravky obsahujúce farmaceutický prijateľný nosič, čo môže byť akýkoľvek nosič z množstva v odbore známych nosičov, ako je napr. voda, soľný roztok, pufrovaný soľný roztok, dextróza, glycerol, etanol a pod., alebo zmesi týchto látok. Zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť vo forme farmaceutický prijateľných solí organických alebo anorganických kyselín a báz. K takýmto soliam patria napr. acetát, adipát, alginát, aspartát, benzoát, benzénsulfonát, bisulfát, butyrát, citrát, gáfrát, gáforsulfonát, cyklopentánpropionát, diglukonát, dodecylsulfát, etánsulfonát, fumarát, glukoheptanoát, glycerolfosfát, hemisulfát, heptanoát, hexanoát, hydrochlorid, hydrobromid, hydrojodid, 2-hydroxyetánsulfonát, laktát, maleát, metánsulfonát, 2-naftalénsulfonát, nikotinát, oxalát, pamoát, pektinát, persulfát, 3-fenylpropionát, pikrát, pivalát, propionát, sukcinát, tartarát, tiokyanát, tozylát a undekanoát. K bázickým soliam patria amónne soli, soli alkalických kovov, ako sú sodné a draselné soli, soli kovov alkalických zemín, ako sú soli vápnika a horčíka, soli s organickými bázami, ako sú napr. dicyklohexylamínové, N-metyl-D-glukamínové a tris(hydroxymetyl)metylaminové soli, a soli s aminokyselinami, ako sú arginín, lyzín atď. Bázické skupiny obsahujúce dusík môžu byť takisto kvartemizované činidlami, napr. nižšími alkylhalogenidmi, ako sú metyl-, etyl-, propyl-, butylchloridy, -bromidy a -jodidy, dialkylsulfátmi, ako sú dimetyi-, dietyl-, dibutyl a diamylsulfáty, alkylhalogenidmi s dlhým reťazcom, ako sú decyl-, lauryl-, myristyl- a stearylchloridy, -bromidy a -jodidy, aralkylhalogenidmi, ako sú benzyl- a fenetylbromid a pod. Takto sa získavajú produkty, ktoré sú rozpustné alebo dispergovateľné vo vode alebo v oleji.

Farmaceutické prípravky podľa vynálezu obsahujú akúkoľvek zlúčeninu podľa vynálezu alebo jej farmaceutický prijateľný derivát spolu s farmaceutický prijateľným nosičom. Termín „nosič“ podľa vynálezu zahŕňa aj prijateľné adjuvanty a vehikulá. K farmaceutický prijateľným nosičom, ktoré sa dajú využiť v predkla9 danom vynáleze patria (bez toho, aby bol tento výpočet obmedzujúci) ionomeniče, oxid hlinitý, stearát hlinitý, lecitín, sérové proteíny, ako je ľudský sérový albumín, pufrované zlúčeniny, ako sú fosfáty, glycín, kyselina sorbová, sorbát draselný, zmesi parciálnych glyceridov rastlinných nasýtených mastných kyselín, voda, soli alebo elektrolyty, ako je napr. protamínsulfát, hydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan draselný, chlorid sodný, soli zinku, koloidný oxid kremičitý, kremičitan horečnatý, polyvinylpyrolidón, látky odvodené z celulózy, polyetylénglykol, sodná soľ karboxymetylcelulózy, polyakryláty, vosky, blokové polyméry polyetylén-polyoxypropylénu, polyetylénglykol a tuky z ovčej vlny.

Farmaceutické prípravky podľa vynálezu môžu byť vo forme sterilného injikovateľného prípravku, napr. sterilnej injikovateľnej suspenzie vo vode alebo v oleji. Takáto suspenzia sa formuluje zvyčajnými technikami, ktoré sú odborníkovi známe, pomocou vhodných dispergujúcich, suspendujúcich a zvlhčovacích činidiel. Sterilné injikovateľné prípravky môžu byť aj sterilné injikovateľné roztoky alebo suspenzie v netoxických parenterálne prijateľných rozpúšťadlách alebo riedidlách, napr. ako roztok v 1,3-butándiole. Ako prijateľné vehikulá a rozpúšťadlá sa môžu použiť aj voda, Ringerov roztok a izotonický roztok chloridu sodného. Okrem toho sa ako rozpúšťadlá alebo suspendačné médium zvyčajne používajú sterilné upravené oleje. Na tento účel sa môže použiť akýkoľvek nedráždivý upravený olej vrátane syntetických mono- alebo diglyceridov. Na prípravu injikovateľných prípravkov sú užitočné mastné kyseliny, ako je kyselina olejová a jej glyceridové deriváty, rovnako ako prírodné farmaceutický prijateľné oleje, ako je olivový olej, ricínový olej, a obzvlášť ich polyoxyetylované verzie. Tieto olejové roztoky alebo suspenzie môžu obsahovať aj alkoholové riedidlo, napr. podľa Ph. Helv. (Švajčiarskeho liekopisu) alebo podobný alkohol, alebo dispergujúce činidlo s dlhým reťazcom.

Farmaceutické prípravky podľa tohto vynálezu, najmä antagonistické malé molekuly pôsobiace ako inhibítory interakcie VLA-4/VCAM-1, sa môžu podávať parenterálne alebo perorálne. Ak sa podávajú perorálne, môžu sa podávať v každej perorálne prijateľnej dávkovej forme vrátane, a bez obmedzenia, toboliek, tabliet, vodných suspenzií alebo roztokov. V prípade tabliet na perorálne použitie zvyčajne používané nosiče zahŕňajú laktózu a kukuričný škrob. Typicky sa pridávajú aj lubrikanty, ako napr. stearát horečnatý. Na perorálne podávanie vo forme toboliek zahŕňajú použiteľné riedidlá laktózu a sušený kukuričný škrob. Keď sa na perorálne použitie vyžaduje vodná suspenzia, aktívna zložka sa spojí s emulgátormi a suspendujúcimi činidlami. Ak je to žiaduce, môžu sa pridať aj určité sladidlá, príchuti alebo farbivá. Môžu sa použiť aj topické transdermálne náplasti. Farmaceutické prípravky podľa tohto vynálezu sa môžu podávať aj nazálnym aerosólom alebo inhaláciou s použitím nebulizéra, inhalátora suchého prášku alebo inhalátora s meranými dávkami. Tieto prípravky sa pripravia technikami dobre známymi v odbore farmaceutických formulácií a môžu sa pripraviť ako roztoky vo fyziologickom roztoku a používať pritom benzylalkohol alebo ďalšie vhodné konzervačné prostriedky, činidlá podporujúce absorpciu na zvýšenie biologickej dostupnosti, fluorované uhľovodíky a/alebo ďalšie zvyčajné solubilizačné alebo dispergujúce činidlá.

Podľa ďalšieho uskutočnenia prípravky obsahujúce zlúčeninu podľa tohto vynálezu môžu obsahovať aj ďalšie činidlo vybrané zo skupiny zahŕňajúcej kortikosteroidy, protizápalové činidlá, imunosupresíva, antimetabolity a imunomodulátory. Špecifické zlúčeniny v každej z týchto skupín sa môžu vybrať z akýchkoľvek zlúčenín uvedených v príslušnom záhlaví v Comprehensive Medicinal Chemistry, Pergamon Press, Oxford 1990, str. 970-986, ktorých opis je zahrnutý vo forme odkazu. V tejto skupine sú zahrnuté aj zlúčeniny, ako napr. teofylín, sulfasalazín a aminosalicyláty (protizápalové látky); cyklosporín, FK-506 a rapamycín (imunosupresíva), cyklofosfamid a metotrexát (antimetabolity) a interferóny (imunomodulátory).

Množstvo aktívnej zložky, ktoré sa môže spojiť s materiálom nosiča, aby vznikla jednotková lieková forma, závisí od liečeného hostiteľa a konkrétneho spôsobu podávania. Je však potrebné poznamenať, že špecifické dávkovanie a liečebný režim pre každého konkrétneho pacienta závisí od celého radu faktorov vrátane aktivity špecifickej použitej zlúčeniny, veku, telesnej hmotnosti, všeobecného zdravia, pohlavia, diéty, času podávania, rýchlosti vylučovania, kombinácie lieku a úsudku ošetrujúceho lekára a závažnosti konkrétnej liečenej choroby. Množstvo aktívnej zložky môže závisieť aj od eventuálneho terapeutického alebo profylaktického prípravku, s ktorým sa zložka spoločne podáva.

Dávkovanie a dávkovací režim zlúčenín podľa tohto vynálezu účinný na prevenciu, supresiu alebo inhibíciu bunkovej adhézie závisí od celého radu faktorov, ako je charakter inhibítora, veľkosť pacienta, cieľ liečby, charakter liečenej patológie, špecificky použitý farmaceutický prípravok a úsudok ošetrujúceho lekára. Použiteľná je hladina dávok medzi približne 0,001 a približne 100 mg/kg telesnej hmotnosti denne, výhodne medzi približne 0,1 a približne 50 mg/kg telesnej hmotnosti denne, aktívnej zložky zlúčeniny. Najvýhodnejšie sa VLA-4 väzobné činidlo, keď ide o protilátku alebo jej derivát, podáva v dávke 0,1 mg/kg až 20 mg/kg telesnej hmotnosti denne, výhodne 0,1 mg/kg až 10 mg/kg telesnej hmotnosti denne, v intervale 1 až 14 dní. V prípade činidiel, ktorými sú malé molekuly, alebo ktoré majú iný charakter než protilátky, dávky sú molárnymi ekvivalentmi dávok protilátok. Výhodne sa protilátkový prípravok podáva v množstve, ktoré poskytuje účinnú hladinu protilátky v plazme aspoň 1 mg/ml. Optimalizácia dávok sa dá určiť na základe podávania väzbového činidla a následného vyhodnotenia potiahnutia buniek pozitívnych na VLA-4 činidlom v priebehu času po podaní danej dávky in vivo.

Myelómové bunky obsiahnuté vo vzorke periférnej krvi odobratej pacientovi (alebo vo vzorke kostnej drene) je potrebné testovať na prítomnosť činidla in vitro (alebo ex vivo) pomocou druhého činidla, ktorým sa deteguje podávané činidlo. Môže to byť napr. fluorochrómom značená protilátka špecifická pre podávané činidlo, ktorá sa potom stanovuje štandardným postupom použitím prietokovej cytometrie FACS („fluorescence activated celí sorter“). Alternatívne sa prítomnosť podávaného činidla môže detegovať in vitro (alebo ex vivo) pomocou neschopnosti alebo zníženej schopnosti jednotlivých buniek viazať rovnaké činidlo, ktoré samotné sa označilo (napr. fluorochrómom). Výhodné dávkovanie by malo viesť k detegovateľnému potiahnutiu prevažnej väčšiny buniek pozitívnych na VLA-4. Výhodne by toto potiahnutie malo pretrvávať v prípade homológu protilátky 1 až 14 dní.

Zvieracie modely

Zvieracie modely sa podrobne opísali v práci Garretta, 1997. Stručne zhrnuté, Radi et al., 1988, opísali myší model myelómu, ktorý vzniká spontánne u starnúcich myší CS7BL/KaLwRij. Táto choroba vzniká pri starnutí približne u jedného z 200 zvierat a vedie k monoklonálnej gamapatii s niektorými rysmi choroby u ľudí (Radi et al., 1988). Na vývoj lepšieho modelu s vyššou reprodukovateľnosťou pripravili a subklonovali bunkovú líniu z myšieho myelómu nazvanú 5TGM1 a zistili, že spôsobuje lézie u myší charakteristické pre ľudský myelóm, ako je napr. silná osteolýza, a postihuje aj iné orgány než kosti, napr. obličky a pečeň (Garrett, 1997). U myší inokulovaných kultivovanými bunkami sa vyvíja choroba, a to vysoko predikovateľným a reprodukovateľným spôsobom, ktorá zahŕňa vznik monoklonálnej gamapatie a rádiologickej kostnej lézie. Okrem toho sa niektoré myši stávajú hyperkalcemické a kostné lézie sú charakteristické zvýšenou aktivitou osteoklastov. Teda na základe histologického vyšetrenia postihnutých orgánov myší nesúcich 5TGM1 a zvýšenej sérovej hladiny IgG2b sa 5TGM1 definoval ako myší myelóm, ktorý presne reprodukuje významné znaky ochorenia u ľudí.

Nasledovné príklady podrobne ilustrujú výhodné uskutočnenia vynálezu a nijako neobmedzujú predmet vynálezu.

Reštrikčné enzýmy, plazmidy a ďalšie reagenty a materiály sa dajú získať z komerčných zdrojov a postupy klonovania a ďalších metód génového inžinierstva (technológia rekombinantnej DNA) sú odborníkom známe.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Materiál a metódy

Myelómové bunky 5TGM1

Myelómové bunky 5TGM1 pôvodne pochádzajú z myelómu, ktorý vznikol spontánne u starých myší C57BL/KaLwRij (Garrett, 1997; Vanderkerken, 1997). Bunky sa pestovali v Dulbeccovom médiu modifikovanom podľa Isocova (IMDM, Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) doplnenom 10 % fetálnym bovinným sérom (FBS, Surnmit, Fort Collins, CO) a 1 % roztokom penicilín-streptomycínu (GIBCO, Grand Island, NY) pri teplote 37 °C v atmosfére obsahujúcej 5 % CO₂. Pre in vitro pokusy opísané v ďalšej časti vynálezu sa použili bunky 5TGM1 medzi 25. a 30. pasážou

Protilátky, rozpustná VCAM-1

Neutralizačné protilátky proti myšej VCAM-1 (M/K-2.7), integrínu VLA-4 (PS/2) a intercelulámej adhezívnej molekule-1 (ICAM-1, YN1/1.7) boli darom od Dr. Kensuke Miyakeho (Saga Medical University, Saga, Japonsko). Rekombinantná rozpustná VCAM-1 (Lobb et al., 1991) obsahujúca 7 extracelulámych domén ľudskej VCAM-1 bol dar od Dr. Roya Lobba, Biogen, Inc., Cambridge, MA.

Reverzná transkripcia spriahnutá s polymerázovou reťazovou reakciou (RT-PCR)

Použitím RT-PCR potvrdili pôvodcovia expresiu VCAM-1 a integrínu alfa 4 v stromových bunkách kostnej drene a 5TGM1 v danom poradí. Celková RNA sa izolovala z 5TGM1, z primárnej kultúry stromových buniek kostnej drene a stromová bunková línia ST2 kostnej drene (RIKEN Celí Bank, Tsukuba, Japonsko) pomocou jednokrokovej metódy izolácie RNA použitím reagentu TRIzol (GIBCO). 3 gg RNA sa inkubovali s 50 ng náhodného hexaméru pri teplote 70 °C počas 10 minút, ochladili sa ľadom a potom sa konvertovali na prvé vlákno cDNA použitím reverznej transkriptázy (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ) podľa inštrukcií výrobcu. Priméry použité na PCR boli nasledovné: myší VCAM-1 5'-primér, 5 -OH-GCTGCGCGTCACCATTGTTCTC-3'-OH (sekvencia SEQ ID NO: 1), myší VCAM-1 3'-primér, 5 -OH-ACCACCCTCTTGAAGCCTTGTG-3-OH (sekvencia SEQ ID NO: 2), myší integrín alfa 4 5 '-primér, 5 11

-OHCCCCTCAACACGAACAGATAGG-3 -OH (sekvencia SEQ ID NO: 3), myší integrín alfa 4 3 -primér, 5'-OH-GCCTTGTCCTTAGCAACACTGC-3'-OH (sekvencia SEQ ID NO: 4).

PCR sa uskutočňovala 30 cyklami skladajúcimi sa z 1 min pri teplote 94 °C, 1 min. pri teplote 55 °C a 2 min. pri teplote 72 °C. PCR reakčná zmes (celkove 50 μΐ) obsahovala 10 μΐ. Prvé vlákno cDNA, 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2 mM MgCl₂, deoxy-NTP mix (0,2 mM každý), pár primérov (0,15 μΜ každý) a 2 U Taq DNA polymerázy (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ). Produkty PCR sa separovali na 2,5 % agarózových géloch obsahujúcich etídiumbromid a vizualizovali sa pod ultrafialovým svetlom. Veľkosť fragmentov sa potvrdila vzťahom k štandardom molekulovej hmotnosti.

Pripojenie buniek 5TGM1 k stromovým bunkám kostnej drene

Na uskutočnenie heterotypových testov adhézie buniek sa bunky ST2 (5e4/jamka) nasadili na 48-jamkové kultivačné doštičky (Costar, Cambridge, MA) a pestovali sa počas 48 hodín v médiu alfaMEM doplnenom 10 % FBS do zlúčenia. Bunky 5TGM1 (5e6) sa označili inkubáciou s 10 μθ [metyl-3H] tymidínu (New England Nuclear) počas 24 hodín pri teplote 37 °C v kultivačnom médiu. Potom, ako sa vytvorila monovrstva ST2, inkubovali sa s 1 % bovinným sérovým albumínom (BSA, Sigma, St. Louis, MO) v médiu alfaMEM bez séra počas 1 hodiny a na mono vrstvu sa naniesli bunky 5TGM1 značené tríciom. Systém sa inkuboval v prítomnosti alebo neprítomnosti protilátok proti VCAM-1 alebo integrínu alfa 4 beta 1 pri teplote 37 °C počas 1 hodiny. Neadherované bunky sa odstránili premytím 5 % kyselinou trichlóroctovou (dvakrát) a PBS (dvakrát) a adherované bunky sa solubilizovali v 300 μΐ 0,25 mM NaOH, 0,25 mM HC1, neutralizovali sa rovnakým objemom a rádioaktivita sa určila počítačom scintilácie v kvapalinách.

Test tvorby osteoklastov v spoločnej kultúre buniek 5TGM1 a buniek kostnej drene myší

Bunky kostnej drene myší sa získali od samcov myší C57BL starých 5 týždňov (Yoneda, 1993). Femury a tíbie sa aseptický vyňali a oba konce sa odsekli. Bunky kostnej drene sa vypláchli, zozbierali a inkubovali v médiu alfaMEM doplnenom 10 % FBS (Hyclone, Logan, UT) a 1 % penicilín-streptomycínom na kultivačných miskách s priemerom 100 mm (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) pri teplote 37 °C počas 2 hodín. Neadherované bunky obsahujúce hemopoetické prekurzory osteoklastov a stromových buniek sa zobrali. Bunky kostnej drene (leó) a bunky 5TGM1 (le3) v 300 μΐ kultivačného média sa nasadili na 48-jamkové kultivačné doštičky (deň 0). V deň 2 sa do každej jamky jemne pridalo 300 μΐ čerstvého kultivačného média a v deň 4 sa 300 μΐ vyčerpaného média nahradilo rovnakým objemom čerstvého média. V deň 6 sa kultúry fixovali a vyfarbili kyslou fosfatázou rezistentnou na tartarát (TRAP) použitím komerčného kitu (Sigma). TRAP-pozitívne multinukleárne bunky s viac než 3 jadrami sa definovali ako bunky podobné osteoklastom (podobné OC) a ručne sa spočítali pod mikroskopom. Aby sa potvrdilo, že tieto bunky podobné OC majú schopnosť resorbovať kosť, pestovali sa spoločne bunky 5TGM1 a bunky drene na rezoch veľrybieho dentinu s veľkosťou 5x5 mm za rovnakých podmienok, a otvory vytvorené na týchto dentinových rezoch sa vyšetrili rastrovacím elektrónovým mikroskopom (Yoneda, 1992).

V niektorých pokusoch sa uskutočňovali spoločné kultivácie myelómových buniek 5TGM1 a buniek kostnej drene použitím jamkových priehradiek (Becton Dickinson Labware), aby sa zabránilo priamemu kontaktu medzi týmito dvoma typmi buniek (2e6, 24-jamkové doštičky, Costar). Bunky drene sa nasadili do spodných komôrok a myelómové bunky 5TGM1 (2e3) sa potom nasadili buď do spodných (priamy kontakt) alebo do horných (bez kontaktu) komôrok.

Orgánové kultúry fetánych dlhých kostí laboratórneho potkana značené ⁴⁵Ca

Kondiciované médiá zobrané z kultúr 5TGM1 sa testovali na aktivitu resorpcie kostí prostredníctvom orgánovej kultúry fetálnych dlhých kostí laboratórneho potkana značenej ⁴⁵Ca (Mbalaviele, 1995). Tehotným samiciam laboratórneho potkana sa podávali injekcie 250 μ€ί ^4SCa (New England Nuclear) v 18. deň tehotnosti. Diafýzy vretennej a lakťovej kosti sa získali z fétov starých 19 dní pomocou mikrodisekcie a predbežne sa pestovali počas 24 hodín v médiu BGJ (Sigma) doplnenom 0,1 % BSA na rozhraní vzdušnej a tekutej fázy na mriežkach z nehrdzavejúcej ocele. Kosti sa pestovali v kondiciovaných médiách (50 % objem/objem) alebo v kontrolnom médiu počas 120 hodín. Médiá sa menili jedenkrát za 48 hodín. Na konci kultivácie sa kosti inkubovali v ľadovo studenej 5 % kyseline trichlóroctovej počas 2 hodín a rádioaktivita ⁴⁵Ca v kostiach a médiách sa určovala počítačom scintilácie v kvapalinách. Resorpcia kostí sa kvantifikovala ako percento ⁴⁵Ca uvoľnené do média z kostí podľa vzorca: (počet impulzov ⁴⁵Ca v médiu)/(počet impulzov ⁴⁵Ca v médiu a kosti) x 100.

Spoločná kultivácia myelómových buniek 5TGM1 so stromovými bunkami z myšej bunkovej línie ST2

Bunky ST2 (0,5 a 6) a bunky 5TGM1 (4 a 6) sa nasadili spoločne na kultivačné misky s priemerom 60 mm (Becton Dickinson Labware) v IMDM doplnenom 10 % FBS a pestovali sa cez noc, dvakrát sa premyli IMDM bez séra a inkubovali sa v 5 ml IMDM bez séra. Po 48 hodinách sa kondiciované médiá zobrali a uskladnili sa pri teplote -70 ⁰C až do použitia.

Účinok mAb PS2 na eleváciu IgG2b v sére u myší nesúcich 5TGM1

Myšiam sa podala injekcia 1 a 5 buniek 5TGM1, ktorým sa umožnilo kolonizovať kostnú dreň. Myši sa rozdelili na dve skupiny po troch, jedna slúžila ako kontrolná skupina a druhá sa ošetrovala dvakrát týždenne počínajúc 8. dňom 80 μg mAb PS2 (4 mg/kg). Hladiny IgG2b, protilátkového izotypu produkovaného myelómovými bunkami 5TGM1, sa merali v týždenných intervaloch od 1. do 6. týždňa.

Výsledky

Expresia VCAM-1, VLA-4 a účinok protilátok proti VCAM-1 a VLA-4 na pripojenie 5TGM1 na monovrstvy ST2

Použitím RT-PCR potvrdili pôvodcovia expresiu VCAM-1 a integrínu VLA-4 v stromových bunkách kostnej drene a myelómových bunkách v danom poradí. Ako sa dá očakávať, tak stromová bunková línia ST2, ako aj primárne stromové bunky kostnej drene, exprimovali VCAM-1, zatiaľ čo 5TGM1 neexprimovali. Na rozdiel od toho myelómové bunky 5TGM1 exprimovali integrín VLA-4, zatiaľ čo stromové bunky neexprimovali (údaje neuvedené). Okrem toho tak protilátka anti-VCAM-1 (10 /tg/ml), ako aj protilátka VLA-4 (10 /rg/'ml). čiastočne (50 až 80 %) inhibovali pripojenie buniek 5TGM1 k monovrstve ST2, čo ukazovalo, že VCAM-1 a integrín VLA-4 exprimované na týchto bunkách sú biologicky funkčné a že tieto protilátky majú neutralizačnú aktivitu (údaje neuvedené).

Vznik buniek podobných OC v spoločnej kultúre myelómových buniek 5TGM1 s bunkami kostnej drene myší

6. deň spoločnej kultúry buniek 5TGM1 a buniek kostnej drene myší vznikali mnohé TRAP-pozitívne multinukleárne bunky podobné osteoklastom (podobné OC). Tieto bunky podobné OC vytvárali na dentinových rezoch resorpčné otvory, čo dokazovalo, že tieto bunky boli schopné resorbovať kosť a majú osteoklastický fenotyp. V pokusoch používajúcich priehradky v jamkách, sa pozoroval vznik buniek podobných OC, keď sa bunky 5TGM1 pestovali v priamom kontakte s bunkami kostnej drene. Na rozdiel od toho sa bunky podobné OC, ktoré vznikli pri oddelení buniek 5TGM1 od buniek drene membránou v jamke, vyskytovali iba v malom počte. Bunky 5TGM1 teda indukujú vznik osteoklastov v zmiešaných kultúrach kostnej drene a táto indukcia vyžaduje priamy kontakt buniek.

Účinok protilátok proti VCAM-1 a integrínu VLA-4. Vznik buniek podobných OC v spoločnej kultúre buniek 5TGM1 a buniek drene

Tak protilátka anti-VCAM-1 (VCAM-1 Ab, 10 gg/ml), ako aj protilátka VLA-4 integrín (alfa 4 beta 1 Ab, 10 /tg/ml) pozoruhodne inhibovali vznik buniek podobných OC. Na rozdiel od toho mAb proti ICAM-1, inej adhezívnej molekule stromových buniek kostnej drene zapojenej do interakcie stróma/myelóm, nemala na vznik buniek podobných OC žiadny účinok (obr. 1).

Aby sa určilo, či táto inhibícia prostredníctvom VCAM-1 a VLA-4 mAb bola špecifická pre vznik buniek podobných OC indukovaný 5TGM1 a nebola spôsobená cytotoxicitou, vyšetroval sa účinok týchto protilátok na vzniku buniek podobných OC indukovaným 1,25(OH)₂D₃, široko používaným stimulátorom osteoklastogenézy v myších bunkových kultúrach kostnej drene (Takahashi, 1988). Ani VCAM-1 Ab alebo VLA-4 mAb neinhibovali vznik buniek podobných OC indukovaný vitamínom D₃, ktorý samotný nemá žiadny účinok na expresiu VCAM-1 na stromových bunkách (údaje neuvedené).

Účinok kondiciovaných médií zobraných zo spoločnej kultúry 5TGM1 a ST2 na resorpciu kostí

Kondiciované médium pre spoločnú kultúru buniek 5TGM1 a ST2 sa vyznačovalo výrazným zvýšením resorpcie kostí v teste na fetálnych dlhých kostiach laboratórneho potkana (obr. 2), zatiaľ čo kondiciované médium z 5TGM1 spôsobilo iba malé zvýšenie v porovnaní s kontrolným médiom. Kondiciované médium z buniek ST2 sa nevyznačovalo žiadnym zvýšením resorpcie kostí. Teda priamy kontakt buniek prostredníctvom oboch VCAM-1 a VLA-4 indukuje bunky podobné osteoklastom a in vitro produkciu faktorov resorbujúcich kosť.

Účinok rekombinantnej rozpustnej VCAM-1 (sVCAM-1) na aktivitu resorbujúcu kosť a osteoklastogénnu aktivitu buniek 5TGM1

Kondiciované médium z 5TGM1 ošetrených rozpustnou rekombinantnou formou VCAM-1 (sVCAM-1) zvyšovalo resorpciu kostí na dlhých kostiach feta laboratórneho potkana spôsobom závislým od dávky, zatiaľ čo kondiciované médium získané z neošetrených 5TGM1 zvyšovalo resorpciu kostí iba obmedzene. Rozpustná VCAM-1 samotná nemala žiadny účinok na resorpciu kostí (údaje neuvedené). V systéme tkanivovej kultúry myšej kostnej drene kondiciované médium zobrané z buniek 5TGM1 ošetrených VCAM-1 sa vyznačovalo zvýšenou aktivitou, pokiaľ ide o vznik buniek podobných OC, zatiaľ čo kondiciované médium získané z neošetrených 5TGM1 prejavovalo iba obmedzenú aktivitu na vznik buniek podobných OC (obr. 3).

Expresia mRNA ligandu Rank v stromových bunkách kostnej drene (ST2) pestovaných v prítomnosti a neprítomnosti myších myelómových buniek

Pretože sa zdá, že Iigand Rank je dôležitým mediátorom tvorby OCL a môže byť konečnou spoločnou metabolickou dráhou pre pôsobenie osteoklastogénnych cytokínov na tvorbu OCL, skúmali pôvodcovia expresiu ligandu Rank v bunkách 5TGM1 a ST2 individuálne a pri spoločnej kultivácii. Pôvodcovia zistili, že spoločná kultivácia buniek 5TGM1 a ST2 indukuje mRNA ligandu Rank v bunkách ST2. Navyše, aj keď bunky 5TGM1 neexprimujú Iigand Rank, urobia tak pri ošetrení s VCAM-1 (údaje neuvedené). Napokon, kondiciované médium z buniek 5TGM1 ošetrených VCAM-1 indukovalo mRNA ligandu Rank v bunkách ST2, čo svedčilo pre to, že metabolická dráha VCAM-l/VLA-4 produkuje v myelómových bunkách cytokín, ktorý zvyšuje expresiu ligandu Rank stromovými bunkami kostnej drene (údaje neuvedené).

Súhrnne, pôvodcovia preukázali, že bunky 5TGM1 samotné produkujú obmedzené množstvo aktivity, ktorá stimuluje vznik buniek podobných OC a resorpciu kostí. Ale keď sa myelómové bunky 5TGM1 spoločne pestovali s bunkami kostnej drene obsahujúcimi hemopoetické prekurzory osteoklastov a stromové bunky, adherovali silno k stromovým bunkám a zvyšovali vznik buniek podobných OC. V spoločných kultúrach, keď sa bunkám 5TGM1 zabránilo v kontakte so stromovými bunkami, nevznikali žiadne bunky podobné OC. Navyše v orgánových kultúrach fetálnych dlhých kostí laboratórneho potkana zvyšovalo kondiciované médium zobrané zo spoločných kultúr myelómových buniek 5TGM1 a stromových buniek kostnej drene ST2 aktivitu resorbujúcu kosť v porovnaní s kondiciovaným médiom zo samotných ST2 alebo 5TGM1. Tieto údaje sú konzistentné s teóriou, že priamy medzibunkový kontakt buniek 5TGM1 so stromovými bunkami kostnej drene sa vyžaduje pri produkcii aktivity stimulujúcej osteoklasty a resorpciu kostí. Pôvodcovia teda zistili, ktoré bunkové adhezívne molekuly sa zapojili do priamych bunkových interakcií medzi bunkami 5TGM1 a stromovými bunkami kostnej drene, ktoré sú nutné na vytvorenie osteoklastogénnej aktivity.

Údaje pôvodcov ukazujú, že VCAM-1 a integrín VLA-4 majú úlohu v týchto bunkových interakciách, pretože neutralizačné protilátky k týmto dvom adhezívnym molekulám vážne znížili vznik buniek podobných OC v spoločných kultúrach. Interakcia VCAM-1/integrín VLA-4 je zodpovedná za bunkovú komunikáciu medzi stromovými bunkami kostnej drene a myelómovými bunkami 5TGM1, ktorá vedie k zvýšenému vytvoreniu osteoklastogénnej aktivity a aktivity resorbujúcej kosť. Napokon, táto aktivita resorbujúca kosť je čiastočne spôsobená indukciou ligandu Rank.

Príklad 2

Pokusy in vivo

In vivo štúdie pôvodcov svedčia o tom, že interakcia medzi VLA-4 na myelómových bunkách s VCAM-1 na stromových bunkách kostnej drene môže mať kľúčovú úlohu v indukcii aktivity myelómu resorbujúceho kosť. Pôvodcovia podnikli kľúčové kroky testovania tejto hypotézy in vivo na zvieracom modeli, ktorý presne odráža ľudské ochorenie.

A. V tomto pokuse sa myšiam podávala injekcia s 1 a 5 myelómových buniek 5TGM1, ktoré sa ponechali kolonizovať kostnú dreň. Myši sa rozdelili do dvoch skupín po troch, jedna slúžila ako kontrolná skupina a druhá sa ošetrovala dvakrát týždenne počínajúc 8. dňom mAb PS/2. Hladiny IgG2b, protilátkového izotypu produkovaného myelómovými bunkami 5TGM1, sa merali každý týždeň od 1. do 6. týždňa. Ošetrenie mAb v dávke 80 gg na injekciu (4 mg/kg) dvakrát týždenne silno inhibovalo tvorbu IgG2b, udávajúcu významnú inhibíciu prežívania myelómových buniek a rastu in vivo (obr. 4). Ďalej ošetrené myši sa vyznačovali zníženým výskytom paraplégie (všetky tri neošetrené zvieratá sa vyznačovali paraplégiou 42. deň, zatiaľ čo iba jedno z ošetrených zvierat sa vyznačovalo paraplégiou). Dve ošetrené zvieratá bez paraplégie sa vyznačovali aj redukciou hmotnosti sleziny a pečene, čo tiež korelovalo s výskytom nádorov. Napokon, ošetrené zvieratá sa vyznačovali redukciou rozsahu nádoru pri histologickom vyšetrení (od 6,71 ± 1,74 do 0,05 ± 0,08 mm³) tíbií a femurov. Na sérové hladiny vápnika ošetrenie nemalo žiadny vplyv (údaje neuvedené).

B. V paralelne prebiehajúcom pokuse nemalo ošetrenie 40 gg PS/2 dvakrát týždenne žiadny účinok na hladiny IgG2b (neuvedené). Tieto údaje ukazujú, že mAb PS/2 proti VLA-4 silne inhibuje rast usadených myelómových buniek spôsobom závislým od dávky.

C. V ďalšom in vivo pokuse sa myšiam 18 SCID podala injekcia s myelómovými bunkami 5TGM1 v deň 0. Štyri myši sa ošetrili PBS, štyri myši sa ošetrili podľa profylaktického protokolu mAb M/K-2.7 reaktívnej proti myšej VCAM-1 v dávke 80 jig (4 mg/kg) každé 3 dni počínajúc dňom -1 (t. j. dni -1, 2, 5, 8 a 11). V paralelnom pokuse používajúcom rovnaký protokol sa päť myší ošetrilo 160 gg mAb M/K-2.7. Okrem toho sa päť myší ošetrilo 160 gg mAb M/K-2.7 počínajúc 8. dňom (t. j. dni 8, 11, 14, 17 a 20) terapeutického protokolu. Všetkým myšiam sa odobralo sérum v dňoch 21, 28 a 35 a zvieratá sa podrobili rôntgenovému vyšetreniu a potom sa utratili, aby sa uskutočnilo histologické vyšetrenie v 35. deň. Všetky tri ošetrené skupiny sa vyznačovali znížením sérových hladín IgG2b, udávajúcim znížený výskyt myelómových buniek (obr. 5). Re14 latívne ku kontrolám sa pozoroval aj významný účinok na hmotnosť sleziny použitím profylaktického protokolu s nízkymi dávkami (0,23 ± 0,14 g pri kontrolách oproti 0,08 ± 0,04 g u ošetrených). V profylaktickej skupine s vysokými dávkami sa štyri z piatich zvierat vyznačovali jasnou redukciou hmotnosti sleziny, ale celková hodnota nebola významná vďaka jednému zvieraťu s veľkou hmotnosťou sleziny (údaje neuvedené).

D. Môže sa skúmať aj to, či počiatočná vysoká dávka ako bolus antagonistu alfa 4 integrínu, nasledovaná udržiavacou dávkou, zlepší účinnosť. Myelómové bunky sú už usadené v kompartmente kostnej drene a ich tesná interakcia s VCAM-1 závislá od VLA-4 sa musí inhibovať. Navyše sa dá predpokladať, že čím je počet usadených myelómových buniek väčší, tým sa vyžaduje vyššia počiatočná dávka na vyplavenie buniek do periférnej cirkulácie.

Uskutočnila sa teda väčšia štúdia s anti-VLA-4 protilátkou PS/2. Dvadsiatim ôsmim myšiam SCID sa podala injekcia s myelómovými bunkami 5TGM1 v deň 0. Deväť myší nedostalo žiadne ošetrenie, deväť dostalo izotypovo súhlasnú kontrolnú IgG mAb, desať myší sa ošetrilo mAb PS/2 proti alfa 4 integrínu. Používal sa odlišný terapeutický režim, v ktorom sa myšiam podala vysoká dávka mAb (200 μΰ.) v dňoch 4, 5 a 6, a potom udržiavacia dávka 80 gg (4 mg/kg) každé 3 dni počínajúc 8. dňom.

Našla sa štatisticky významná redukcia sérového IgG2b, keď sa ošetrená skupina porovnala buď s neošetrenou skupinou, alebo skupinou ošetrenou kontrolným IgG v 3. a 4. týždni (údaje neuvedené). Je dôležité, že keď sa ošetrená skupina porovnala buď s neošetrenou skupinou, alebo skupinou ošetrenou kontrolným IgG, bol zreteľný vplyv na prežitie (obr. 6).

Príklad 3

Ďalšie pokusy in vivo

Na základe informácií uvedených tu po prvýkrát, môžu odborníci ľahko potvrdiť a rozšíriť dôležitosť alfa 4 integrínov a ich ligandov pri mnohonásobnom myelóme použitím opísaného zvieracieho modelu myší.

Nasledovná séria pokusov je v kompetencii odborníka na základe predkladaného opisu, slúži teda iba ako príklad a vynález nijako neobmedzuje.

1. Odpoveď na dávku mAb PS/2 na stanovenie optimálnej udržiavacej dávky podávané dvakrát týždenne. 80 /zg ukazovalo dobrú účinnosť, ale 40 /zg bolo bez účinku. Na určenie optimálneho dávkovania sa dajú vyšetriť vyššie dávky až do 20 mg/kg dvakrát alebo trikrát týždenne.

2. Pacienti s chorobou v rôznych stupňoch závažnosti spojení so zvýšeným výskytom nádorov. Dá sa vyšetriť účinnosť mAb PS/2 podávanej v rôznych časoch po stanovení choroby, t. j. dá sa porovnávať začiatok ošetrenia v 8 dňoch (pozri napr. obr. 4) so začiatkom po dvoch, troch, štyroch a piatich týždňoch po inokulácii, aby sa dalo vidieť, ako neskoro sa môže mAb podávať, aby poskytovala určitú úľavu od príznakov.

3. Dá sa vyšetriť účinok mAb MK-2 proti myšej VCAM-1 pri nasledovaní rovnakých parametrov, ako sa už uviedli (dávkovanie, časovanie dávkovania) pre mAb proti VLA-4. Očakáva sa, že na pozorovanie účinnosti budú nevyhnutné podobné hladiny dávok.

4. Vyšetrujú sa ďalšie markery progresie myelómu, vrátane výskytu nádorov v kostnej dreni a na miestach mimo drene, kvantifikácia kostných lézií pomocou rôntgenografickej analýzy skeletu prostredníctvom histomorfometrie, meranie rýchlosti resorpcie kostí vyhodnotením zosietenia kolagénu v plazme, meranie tvorby monoklonálneho proteínu v plazme, výskyt hyperkalcémie a úmrtnosť.

5. Mnohonásobný myelóm sa v súčasnosti neúčinne lieči podľa štandardných chemoterapeutických režimov. Dá sa skúmať aditívny alebo synergický účinok mAb v optimálnom dávkovaní v spojení s dávkovaním podľa príslušného chemoterapeutického režimu, či už pred týmto režimom alebo po ňom.

6. Dá sa skúmať schopnosť malej molekuly inhibítora alfa 4 integrínu, ktorý je selektívny pre jeden konkrétny alfa 4 integrín alebo je selektívny pre niekoľko alfa 4 integrínov naraz alebo schopnosť kombinácie týchto inhibítorov napodobovať účinok mAb a blokovať progresiu myelómu s použitím protokolov a opísaných výsledkov. Inhibítory s malou molekulou sa podávajú parenterálne alebo perorálne v rozsahu dávok od 0,1 do 30 mg/kg jedenkrát alebo dvakrát alebo trikrát týždenne.

Prehľad citovanej literatúry

Alsina M., Boyce B., Devlin R., Anderson J. L., Craig F., Mundy G. R., Roodman G. D., Development of an in vivo model of human multiple myeloma bone disease, Blood 87, 1495-1501 (1996).

Attal M., Harousseau J. L., Stoppa A. M., Sotto J. J., Fuzibet J. G., Rossi J. F., Casassus P., Maisonneuve H., Facon T., Ifrah N., Payen C., Bataille R., A prospective, randomized trial of autologous bone marrow transplantation and chemotherapy in multiple myeloma. Intergroupe Francais du Myelome, N. Engl. J. Med. 335, 91-97 (1996).

Bataille R., Jourdan M., Zhang X. G., Klein B., Sérum levels of interleukin-6, a potent myeloma celí growth factor, as a reflection of disease severity in plasma celí dyscrasias, J. Clin. Invest. 84, 2008 (1989).

Bataille R., Chappard D., Klein B., Mechanisms of bone lesions in multiple myeloma, Hem. One. Clin. N. A. 6, 285-295 (1992).

Bataille R., Barlogie B., Lu Z. Y., Rossi J. F., Lavabre-Bertrand T., Beck T., Wijdenes J., Brochier J., Klein B., Biológie effects of anti-interleukin-6 murine monoclonal antibody in advanced multiple myeloma, Blood 86, 685-691 (1995).

Boyce B. F., Yates A. J. P., Mundy G. R., Bolus injections of recombinant human interleukin-1 cause transient hypocalcemia in normál mice, Endocrinology 125, 2780-2783 (1989).

Chauhan D., Uchiyama H., Urashima M., Yamamoto K. Anderson K. C., Regulation of interleukin-6 in multiple myeloma and bone marow stromal cells, Stem. Cells 13, 35-39 (1995).

Epstein J., Myeloma phenotype: Clues to disease origin and manifestation, Hem. One. Clin. N. A. 6, 249-256 (1992).

Garrett I. R., Dallas S., Radi J., Mundy G. R., A murine model of human myeloma bone disease, Bone 20, 515-520(1997).

Gosslar U., Jonas P., Luz A., Lifka A., Naor D., Hamann A., Holzmann B., Predominant role of alpha 4 integrins for distinet steps of lymphoma metastasis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4821-4826 (1996).

Lacey D. L., Timms E., Tan H. L., Kelley M. J., Dunstan C. R., Burgess T., Elliott R., Colombero A., Elliott G., Scully S., Hsu H., Sullivan J., Hawkins N., Davy E., Capparelli C., Eli A., Qian Y. X., Kaufman S., Sarosi I., Shalhoub V., Senaldi G., Guo J., Delaney J., Boyle W. J., Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation, Celí 93, 165-176 (1998).

Lobb R., Chi-Rosso G., Leone D., Rosa M., Newman B., Luhowskyj S., Osbom L., Schiffer S., Benjamín C., Dougas I., Hession C., Chow P., Expression and funetional characterisation of a soluble form of vascular celí adhesion molecule 1, Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 1498-1504 (1991).

Lobb R., Hemler M., The patophysiologic role of alpha 4 integrins in vivo, J. Clin. Invest. 94, 1722-1728 (1994)

Mac Donald B. R., Mundy G. R., Clark S., Wang E. A., Kuehl T. J., Stanley E. R., Roodman G. D., Effects of human recombinant CSF-GM and highly purified CSF-1 on the formation of multinucleated cells with osteoclast characteristics in long-therm bone marrow cultures, J. Bone Min. Res. 1, 227-233 (1986).

Mbalaviele G., Chen H., Boyce B. F., Mundy G. R., Yoneda T., The role of cadherin in the generation of multinucleated osteoclasts from mononuclear preeursors in murine marrow, J. Clin. Invest. 95, 2757-2765 (1995).

Matsuura N., Puzon-Mc Lauglin W., Irie A., Morikawa Y., Kakudo K., Takada Y., Induction of experimental bone metastasis in mice by transfection of integrin alpha 4 beta 1 into tumor cells, Am. J. Pathol. 148, 55-61 (1996).

Matsuzaki K., Udagawa N., Takahashi N., Yamaguchi K., Yasuda H., Shima N., Morinaga T., Toyama Y., Yabe Y., Higashio K., Suda T., Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like celí formation in human peripheral blood mononuclear celí cultures, Biochem. Biophys. Res. Commun. 246, 199-204 (1998).

Mundy G. R., Bertolini D. R., Bone destruction and hypercalcemia in plasma celí myeloma, Seminár Oncol. 3,291 (1986).

Mundy G. R., Myeloma bone disease, Eur. J. Cancer 34, 246-251 (1998).

Papayannopoulou T., Nakamoto B., Peripheralization of hemopoietic progenitors in primates treated with anti-VLA-4 integrin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9374-9378 (1993).

Qian F., Vaux D. L., Weissman I. L., Expresion of the integrin a4bl on melanoma cells can inhibit the invasive stage of metastasis formation, Celí 77, 335-347 (1994).

Radi J., Croese J. W., Zurcher C., van den Enden-Vieveen M. M., de Leuuw A. M., Animal model of human disease, Am. J. Pathol. 132, 593-597 (1988).

Simonet W. S., Lacey D. L., Dunstan C. R., Kelley M., Chang M. S., Luthy R., Nguyen H. Q., Wooden S., Bennett L., Boone T., Shimamoto G., De Rose M., Elliott R., Colombero A., Tan H. L., Trail G., Sullivan J., Davy E., Bucay N., Renshaw-Gegg L., Hughes T. M., Hill D., Pattison W., Campbell P., Boyle W. J., Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density, Celí 92, 309-319 (1997). Takahashi N., Yaman H., Yosjhiki S., Roodman G. D., Mundy G. R., Jones S. H., Boyde A., Suda T., Osteoclast-like celí formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures, Endocrinology 122, 1373-1382 (1988).

Vanderkerken K., De Raeve H., Goes E., Van Meirvenne S., Radi J., Van Riet L., Thielemans K., Van Camp B., Organ involvement and phenotypic adhesion profile of 5T2 and 5T33 myeloma cells in the C57BL/KaLwRij mouse, Brit. J. Cancer 76, 451-460 (1997).

Takahashi N., Suda T., Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegrin/osteoclastogenesisinhibitory factor and is identical to TRANCE/RankL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3597-3602 (1998). Yoneda T., Alsina M. M., Garcia J. L., Mundy G. R., Differentiation of HL-60 cells into cells with the osteoclast phenotype, Endocrinology 129, 683-689 (1992).

Yoneda T., Lowe C., Lee C. H., Gutierrez G., Niewolna M., Williams P., Izbička E., Uehara Y., Mundy G. R., Herbimycin A, a pp60c-src tyrosine kinase inhibitor, inhibits osteoclastic bone resorption in vitro and hypercalcemia in vivo, J. Clin. Invest. 91, 2791-2795 (1993).

Vaughan T., Williams A. J., Pritchard K., Osboum J. K., Pope A. R., Earnshaw J. C., Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library, Náture Biotechnology 14, 309-314(1996).

Yasuda H., Shima N., Nakagawa N., Yamaguchi K., Kinosaki M., Mochizuki S., Tomoyasu A., Yano K., Goto M., Murakami A., Tsuda E., Morinaga T., Higashio K., Udagawa N.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použitie protilátky alebo jej fragmentu viažuceho antigén, zvolených z:

(a) protilátky anti-VLA-4 alebo jej fragmentu viažuceho antigén;

(b) protilátky anti-alfa4/beta7 integrínu alebo jej fragmentu viažuceho antigén; a (c) protilátky anti-VCAM-1 alebo jej fragmentu viažuceho antigén na výrobu farmaceutickej kompozície na liečenie mnohonásobného myelómu, pričom protilátka alebo fragment viažuci antigén sú vybrané zo skupiny pozostávajúcej z ľudskej protilátky, chimérickej protilátky, humanizovanej protilátky a ich fragmentov viažucich antigén.
2. Použitie protilátky alebo fragmentu viažuceho antigén zvolených z:

(a) protilátky anti-VLA-4 alebo jej fragmentu viažuceho antigén;

(b) protilátky anti-alfa4/beta7 integrínu alebo jej fragmentu viažuceho antigén; a (c) protilátky anti-VCAM-1 alebo jej fragmentu viažuceho antigén, na výrobu farmaceutickej kompozície na inhibíciu resorpcie kostí súvisiacej s nádormi kostnej drene, pričom protilátka alebo jej fragment viažuci antigén sú vybrané zo skupiny pozostávajúcej z ľudskej protilátky, chimérickej protilátky, humanizovanej protilátky a ich fragmentov.
3. Použitie rozpustného VLA-4 alebo VCAM-1 polypeptidu, ktorý antagonizuje VLA-4/VCAM-1 interakciu na výrobu farmaceutickej kompozície na liečenie mnohonásobného myelómu.
4. Použitie rozpustného VLA-4 alebo VCAM-1 polypeptidu, ktorý antagonizuje VLA-4/VCAM-1 interakciu na výrobu farmaceutickej kompozície na inhibíciu resorpcie kostí súvisiacej s nádormi kostnej drene.
5. Použitie podľa nárokov 1 alebo 2, kde protilátkou alebo jej fragmentom viažucim antigén je protilátka anti-VLA-4 alebo jej fragment viažuci antigén vybrané zo skupiny pozostávajúcej z: protilátky HP1/2 alebo jej fragmentu viažuceho antigén, protilátky HP2/1 alebo jej fragmentu viažuceho antigén, protilátky HP2/4 alebo jej fragmentu viažuceho antigén, protilátky L25 alebo jej fragmentu viažuceho antigén, protilátky P4C2 alebo jej fragmentu viažuceho antigén, a protilátky P4G9 alebo jej fragmentu viažuceho antigén.
6. Použitie podľa nárokov 1 alebo 2, kde protilátkou alebo jej fragmentom viažucim antigén je humanizovaná protilátka anti-VLA-4 alebo jej fragment viažuci antigén obsahujúce humanizovaný ľahký reťazec a humanizovaný ťažký reťazec, pričom tak ľahký reťazec, ako aj ťažký reťazec každý obsahuje komplementaritu určujúce úseky (CDR1, CDR2 a CDR3) z myšej 21.6 protilátky anti-VLA-4.
7. Použitie podľa nároku 6, kde kde (a) humanizovaný ľahký reťazec obsahuje rámec variabilného úseku zo sekvencie rámca variabilného úseku ľudského ľahkého reťazca kappa, pričom aspoň jedna aminokyselinová pozícia rámca úseku je obsadená aminokyselinou prítomnou v ekvivalentnej pozícii rámca variabilného úseku ľahkého reťazca myšieho 21.6 imunoglobulínu; a (b) humanizovaný ťažký reťazec obsahuje rámec variabilného úseku zo sekvencie rámca variabilného úseku ľudského ťažkého reťazca, pričom aspoň jedna aminokyselinová pozícia rámca úseku je obsadená aminokyselinou prítomnou v ekvivalentnej pozícii rámca variabilného úseku ťažkého reťazca myšieho 21.6 imunoglobulínu.
8. Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, kde protilátka alebo jej fragment viažuci antigén alebo polypeptid sú upravené na parenterálne podanie.
9. Použitie podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, kde protilátka alebo jej fragment viažuci antigén alebo polypeptid sú vhodné na použitie v kombinácii s jedným alebo viacerými z: kortikosteroidu, protizápalového činidla, imunosupresíva, antimetabolitu, a imunomodulátora.
10. Použitie podľa niektorého z nárokov 1, 2 alebo 5 až 9, kde protilátkou alebo jej fragmentom viažucim antigén j e monoklonálna protilátka, alebo jej fragment viažuci antigén.
11. Použitie podľa niektorého z nárokov 1, 2 alebo 5 až 10, kde protilátka anti-VLA-4 alebo jej fragment viažuci antigén viažu alfa4 reťazec VLA-4.
12. Použitie podľa niektorého z nárokov 1, 2 alebo 5 až 11, kde protilátkou anti-VLA-4 alebo jej fragmentom viažucim antigén je protilátka anti-VLA-4 špecifická k B epitopu alebo jej fragment viažuci antigén.