SK282543B6 - Spôsob klasifikácie hepatitis C vírusu a činidlá na použitie pri tomto spôsobe - Google Patents

Spôsob klasifikácie hepatitis C vírusu a činidlá na použitie pri tomto spôsobe Download PDF

Info

Publication number
SK282543B6
SK282543B6 SK1359-95A SK135995A SK282543B6 SK 282543 B6 SK282543 B6 SK 282543B6 SK 135995 A SK135995 A SK 135995A SK 282543 B6 SK282543 B6 SK 282543B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
hcv
epitopes
polypeptides
type
epitope
Prior art date
Application number
SK1359-95A
Other languages
English (en)
Other versions
SK135995A3 (en
Inventor
David Y. Chien
George Kuo
Original Assignee
Chiron Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22029220&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK282543(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Chiron Corporation filed Critical Chiron Corporation
Publication of SK135995A3 publication Critical patent/SK135995A3/sk
Publication of SK282543B6 publication Critical patent/SK282543B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/82—Hepatitis associated antigens and antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Sú opísané metódy a kompozície na použitie pri klasifikácii hepatitis C vírusu, založenej na kontakte vzorky s činidlom, ktoré obsahuje kombináciu polypeptidov, obsahujúce typovo špecifické epitopy jadrovej oblasti HCV, oblasti NS4 a NS5 oblasti HCV a majúcich dĺžku od 5 do 14 aminokyselín.ŕ

Description

Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka spôsobu klasifikácie vírusov hepatitis C (HCV). Najmä sa predložený vynález týka spôsobu klasifikácie HCV s použitím nových peptidov príslušných pre tieto typy.
Doterajší stav techniky
O vírusovej hepatitis je známe, že je vyvolávaná piatimi rôznymi typmi vírusov, ktoré sú známe ako hepatitis A, B, C, D a E. HAV je RNA vírus a nespôsobuje dlhodobé klinické symptómy. HBV je DNA vírus. HDV je závislý vírus, ktorý je neschopný infikovať bunky za neprítomnosti HBV. HEV je vo vode sa rozmnožujúci vírus. HCV bol najprv identifikovaný a charakterizovaný ako pôsobiaci non-A, non-B hepatitis (NANBH), Houghton a spol., EPO pub. č. 388322. Toto viedlo k opisu mnohých všeobecných a špecifických polypeptidov vhodných ako imunologické činidlá na identifikáciu HCV. Pozri tiež napr. Choo a spol. (1989) Science, 244: 359 - 362, Kuo a spol. (1989) Science, 244: 362 - 364 a Houghton a spol. (1991) Hepatology, 14: 381 - 388. HCV je hlavnou príčinou hepatitis sprostredkovanej krvnou transfúziou.
Prototyp izolátu HCV bol charakterizovaný EP publikáciami č. 318 216 a 388 232. Ako je tu používaný, zahrnuje výraz „HCV“ novoizolované NANBH vírusové druhy. Výraz „HCV-1“ označuje vírus opísaný v citovaných publikáciách.
Od počiatočnej identifikácie HCV bolo identifikovaných aspoň šesť rôznych virálnych typov a označených HCV-1 až HCV-6, Cha a spol. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 7144 - 7148. V týchto typoch je veľa subtypov. Typ vírusu, ktorým je pacient infikovaný, môže ovplyvňovať klinickú prognózu a tiež zodpovedá rôznym liečeniam, Yoshioka a spol. (1992), Hepatology, 16: 293 - 299. Vzhľadom na to, že najčastejším klinickým následkom infekcie HCV je hepatocelulámy karcinóm, bolo by vhodné stanoviť, akým typom alebo typmi HCV je pacient infikovaný.
V súčasnosti sa stanovenie typu vírusu vykonáva génovou klasifikáciou; t. j. izoláciou virálnej RNA a stanovením sekvencie rôznych segmentov polymerázovou reťazovou reakciou (PCR). Nielen že táto metóda je prácna a časovo náročná, ale nie je vhodná na použitie pri vzorkách, ktoré boli skladované za podmienok, ktoré neumožňujú ochranu RNA alebo vzoriek od pacientov, ktoré nemajú dostatočný virálny titer. Bolo by vhodné, aby existovala metóda na klasifikáciu HCV imunoanalýzou afebo séroklasifikáciou.
Metódou na skríning krvi a diagnostiku pacientov je imunoskúška. Imunoskúška používa antigén z HCV-1, ktorý obsahuje dostatočné množstvá bežných epitopov na detegovanie protilátok k iným typom HCV. Imunoskúška nerozlišuje medzi infekciami rôznymi typmi HCV.
Podstata vynálezu
Predložený vynález zahrnuje prípravky a metódy na klasifikáciu HCV genoklasifikáciou a séroklasifikáciou. Prípravky zahrnujú typovo špecifické epitopové, typovo klastrovo špecifické epitopové nukleové kyseliny, kódujúce epitopy na použitie ako sondy a nukleové kyseliny komplementárne k regiónom priliehajúcim k týmto epitopom na použitie ako priméry.
Jedným aspektom vynálezu je spôsob klasifikácie HCV, zahrnujúci stupne poskytnutia vzorky, obsahujúcej protilátku, od jednotlivca; kontakt vzorky s typovo špecifickým epitopom alebo typovo klastrovo špecifickými epitopmi za podmienok, ktoré umožňujú nadviazanie antigén protilátka; a stanovenie, ktoré protilátky v krvnej vzorke sa viažu k epitopu.
Ďalší aspekt vynálezu zahrnuje spôsob klasifikácie HCV, zahrnujúci stupne poskytnutia vzorky, obsahujúcej protilátku od jednotlivca; kontakt vzorky s prvým typovo špecifickým epitopom alebo typovo - klastrovo špecifickým epitopom za podmienok, ktoré umožňujú väzbu antigén - protilátka; kontakt vzorky s druhým typovo špecifickým epitopom alebo typovo - klastrovo špecifickým epitopom za podmienok, ktoré umožňujú väzbu antigén - protilátka; a stanovenie, či protilátky vo vzorke sa viažu buď k prvému alebo druhému epitopu.
Ďalší aspekt vynálezu sa týka polypeptidov obsahujúcich typovo špecifické epitopy alebo typovo - klastrové špecifické epitopy. Polypeptidy sú odvodené od troch rôznych regiónov HCV genómu. Jedna súprava polypeptidov zahrnuje typovo špecifický epitop alebo typovo - klastrovo špecifické epitopy získané z HCV jadrovej oblasti. Táto prvá súprava sa nachádza medzi aminokyselinovými zvyškami šesťdesiatsedem a osemdesiatštyri HCV-1 a homológnymi regiónmi iných typov HCV. V opise sú použité nasledujúce skratky aminokyselinových zvyškov: A - alanín, I - izoleucín, L - leucín, M - metionín, F - fenylalanín, P - prolín, W - tryptofán, V - valín, N - asparagín, C - cysteín, Q - glutamín, G - glycín, S - serín, T - treonín, Y - tyrozín, R - arginín, H - histidín, K - lyzín, D - kyselina aspartová a E - kyselina glutamová.
Konkrétne sekvencie aminokyselinových zvyškov odvodené od jadrovej oblasti a subtypy, z ktorých sú odvodené, sú nasledujúce:
1. PEGRTWAQ, subtyp la alebo lb.
2. STGKSWGK, subtyp 2a alebo 2b.
3. SEGRWAQ, subtyp 3a alebo 4.
Ďalšia súprava polypeptidov zahrnuje typovo špecifický epitop získaný z HCV neštrukturálneho regiónu 4 (NS4). Táto druhá súprava sa nachádza medzi aminokyselinovými zvyškami 1689 - 1718 HCV-1 a homológnych oblastí iných typov HCV.
Konkrétne aminokyselinové sekvencie a typy alebo subtypy, z ktorých sú odvodené, sú nasledujúce:
1. CSQHLPY, subtyp la.
2. CASHLPY, subtyp lb.
3. CASRAAL, subtyp 2a alebo 2b.
Ďalšia súprava polypeptidov zahrnuje typovo špecifický epitop alebo typovo - klastrovo špecifické epitopy získané z neštrukturálneho regiónu 5 (NS5) hepatitis C vírusu. Táto súprava sa nachádza medzi aminokyselinovými zvyškami 2281 - 2313 HCV-1 a homológnych regiónov iných typov hepatitis C vírusu.
Konkrétne aminokyselinové sekvencie a typy alebo subtypy, z ktorých sú odvodené, sú nasledujúce.
1. PDYEPPVVHG, subtyp la.
2. PDYVPPVVHG, subtyp lb.
3. PDYQPATVAG, subtyp 2A.
4. PGYEPPTVLG, subtyp 2b.
5. FAQASPVW, subtyp la.
6. FPQALPľW, subtyp lb.
7. FPQALPAW, subtyp 2a.
8. FPPQALPPW, subtyp 2b.
Ďalší aspekt vynálezu zahrnuje nukleokyselinové molekuly, kódujúce sekvencie aminokyselinových zvyškov opísaného typovo špecifického a typovo - klastrovo špeci2
SK 282543 Β6 fického epitopu. Tieto nukleokyselinové molekuly sú vhodné ako sondy napríklad v Southem blot - analýze alebo iných analýzach na rozpoznanie DNA, ako je zachytávacia skúška opísaná v US patentoch č. 4868105 a 5124246.
Ďalší aspekt vynálezu zahrnuje nukleokyselinové molekuly komplementárne k nukleokyselinovým sekvenciám priliehajúcich regiónov, kódujúcich typovo špecifické a typovo - klastrovo špecifické epitopy. Takéto nukleokyselinové molekuly sú použiteľné na vykonanie PCR na stanovenie genotypu konkrétneho HCV.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 je prietokový diagram séroklasifikačnej experimentálnej stratégie.
Obr. 2 je prietokový· diagram komprehensívnej stratégie mapovania epitopu.
Obr. 3 je kompilačný graf, znázorňujúci výsledky mapovania epitopu HCV la (Rodney).
Obr. 4 je kompilačný graf, znázorňujúci výsledky mapovania epitopu HCV 2b (Nomoto).
Definícia „Hepatitis C vírus“ alebo „HCV“ sa týka virálnych druhov, ktoré sú patogénnymi typmi spôsobujúcimi NANBH a zoslabených typov alebo defektných interferujúcich častíc z nich odvodených, pozri všeobecne publikácie citované v „Doterajšom stave techniky“. HCV genóm obsahuje RNA. Vírusy obsahujúce RNA majú relatívne vysoké rýchlosti spontánnej mutácie, uvádzané rádovo 10’3 až 104 na inkorporovaný nukleotid, Fields a Knipe (1986), „Fundamental Virology“ (Raven Press, NY). Pretože heterogenita a fluidita genotypu sú v RNA vírusoch inherentné, existuje tu veľa typov/subtypov HCV druhov, ktoré môžu byť virulentné alebo avirulentné. Propagácia, identifikácia, detekcia a izolácia rôznych HCV typov alebo izolátov je dokumentovaná v literatúre. Ako je tu vyjadrené, nukleotidové sekvencie a sekvencie aminokyselinových zvyškov sú od uvedených typov HCV, číslo HCV-1 genómu a aminokyselinových sekvencií počítané v Choo a spol. (1990), Brit. Med. Bull. 46: 423 - 441). Opis umožňuje diagnózu rôznych typov.
Ako je tu použité, výraz „typ“ sa týka HCV, ktoré sa odlišujú genotypícky o viac ako asi 30 %; „subtyp“ označuje HCV, ktoré sa odlišujú genotypícky o asi 10 - 20 % a „izolát“ označuje HCV, ktoré sa genotypícky odlišujú o menej ako asi 10 %. „Klasifikácia“ označuje odlíšenie jedného typu HCV od iného typu.
Informácie o niektorých odlišných HCV typoch/subtypoch je uvedená v Medzinárodnej publikácii č. WO 93/00365 hlavne pre typ alebo subtyp CDC/HCV1 (tiež nazývaný IICV-1). Informácie o jednom type alebo podtype, ako i parciálnej genómovej alebo aminokyselinovej sekvencií je dostatočná na to, aby mohol odborník v odbore s použitím štandardných techník izolovať nové typy IICV. Napríklad niekoľko rôznych typov HCV bolo skríningovaných, ako je opísané ďalej. Tieto typy, ktoré boli získané z mnohých ľudských sér (a z rôznych geografických oblastí), sú klasifikované s použitím metódy a činidiel, ktoré sú tu ďalej opísané.
Genómová štruktúra a nukleotidová sekvencia HCV-1 genómovej RNA boli dedukované. Genóm sa javí ako jednoreťazcová RNA obsahujúca 10 000 nukleotidov. Genóm je pozitívny reťazec a má kontinuálny, translačný, otvorený čítací rámček (ORF), ktorý kóduje polyproteín s asi 3000 aminokyselinami. V ORF sa javia štrukturálne proteín(y) ako kódované v približne prvej štvrtine amino - koncového regiónu, s prevahou polyproteínu zodpovedného za neštrukturálne (NS) proteíny. V porovnaní so všetkými známymi virálnymi sekvenciami sú pozorované malé, ale významné ko-lineáme homológie s neštrukturálnymi (NS) proteínmi rodu Flavivírusov a s pestivírusmi (ktoré sú teraz tiež pokladané za časť rodu Flavivírusov).
Na základe domnelých aminokyselinových zvyškov kódovaných v nukleotidovej sekvencií HCV-1 a iných prípadoch, sú možné proteínové domény kódovaných HCV polyproteínov, ako i približné hranice, uvedené v tabuľke 1.
Tabuľka 1
Tieto domény sú tentatívne. Napríklad El - NS2 pás je približne v regióne 750 - 810 a NS3 - NS4 pás je asi 1640 - 1650. Je tu tiež zrejmé, že 191 aminokyselín(aa) verzie C je prekurzor, ktorý je ďalej spracovávaný na asi 170 aa dĺžky a že NS2, NS4 a NS5 proteíny sú každý ďalej spracovávané do dvoch zrelých proteínov.
Rôzne typy HCV sú definované podľa rôznych kritérií, ako je napríklad ORF približne 9000 nukleotidov na približne 12 000 nukleotidov, kódujúce polyproteín podobného hydrofóbneho a/alebo antigénneho charakteru ako HCV-1 a prítomnosťou ko-lineámych polypeptidových sekvencií, ktoré sú konzervované v HCV-1.
Pri identifikácii HCV typov sú aplikovateľné nasledujúce parametre nukleokyselinovej homológie a aminokyselinovej homológie, buď samotnej alebo v kombinácii. Všeobecne, ako je opísané, sú rôzne typy HCV z asi 70 % homológne, zatiaľ čo subtypy sú z asi 80 - 90 % homológne a izoláty sú homológne z asi 90 %.
Ako je tu použité, polynukleotid „odvodený od“ označenej sekvencie sa týka polynukleotidovej sekvencie, ktorá obsahuje sekvenciu aspoň asi 6 nukleotidov, výhodne aspoň asi 8 nukleotidov, výhodnejšie aspoň asi 10 -12 nukleotidov a výhodnejšie aspoň asi 15 - 20 nukleotidov, zodpovedajúcich regiónu označenej nukleotidovej sekvencie. „Zodpovedajúcej“ znamená homológnej k alebo komplementárnej k označenej sekvencií. Výhodne je sekvencia regiónu, z ktorého je polynukleotid odvodený, homológna alebo komplementárna k sekvencií, ktorá je unikátna pre HCV genóm. Hybridizačné techniky na stanovenie komplementárny nukleokyselinových sekvencií sú v odbore známe, pozri napr. Maniatis a spol. (1982). Navyše môžu byť chyby dvojných polynukleotidov vytvorených pri hybridizácii stanovené známymi technikami, zahrnujúcimi napríklad štiepenie nukleázou, ako je SI, ktorá špecificky štiepi jednoreťazcová plochy v duplexe polynukleotidov. Regióny, z ktorých môžu byť typické DNA „odvodené“, zahrnujú, ale neobmedzujú sa na, napríklad regióny, kódujúce typovo špecifické epitopy, ako i netranskribované a/alebo netranslatované regióny.
Odvodený polynukleotid nie je nevyhnutne fyzicky odvodený od uvedenej nukleotidovej sekvencie, ale môže byť získaný mnohými spôsobmi, zahrnujúcimi napríklad chemickú syntézu alebo DNA replikáciu alebo reverznú transkripciu alebo transkripciu. Navyše môžu byť kombinácie
SK 282543 Β6 regiónov, zodpovedajúcich regiónom požadovanej sekvencie, modifikované spôsobmi známymi v odbore, ktoré sú v súlade so zamýšľaným účinkom.
Podobne polypeptidová alebo aminokyselinová sekvencia „odvodená od“ označenej aminokyselinovej alebo nukleokyselinovej sekvencie sa týka polypeptidov, majúcich aminokyselinovú sekvenciu identickú so sekvenciou polypeptidu kódovaného v sekvencii alebo jej časti, kde časť zahrnuje aspoň 3 - 5 aminokyselín a výhodne aspoň 8 -
- 10 aminokyselín a ešte výhodnejšie aspoň asi 11 - 15 aminokyselín alebo ktorá je imunologický zhodná s polypeptidom kódovaným v sekvencii. Terminológia tiež zahrnuje polypeptid exprimovaný z označenej nukleokyselinovej sekvencie.
Rekombinantný alebo odvodený polyproteín nie je nevyhnutne translatovaný z označenej nukleokyselinovej sekvencie, môže byť generovaný akýmkoľvek spôsobom, zahrnujúcim napríklad chemickú syntézu alebo expresiu rekombinantného expresného systému alebo izoláciu z HCV vrátane mutovaného HCV. Tu opísané polypeptidy sú všeobecne relatívne krátke, a preto sú ľahko chemicky syntetizovateľné.
Rekombinantný alebo odvodený polypeptid môže zahrňovať jeden alebo viacero analógov aminokyselín alebo neprirodzených aminokyselín vo svojej sekvencii. Spôsoby inzertovania analógov aminokyselín do sekvencie sú známe odborníkom v odbore. Môžu tiež obsahovať jedno alebo viacero značení, ktoré sú známe odborníkom v odbore. Detailný opis analógov a „mimotopov“ sa nachádza v US patente č. 5194392.
Peptidové analógy zahrnujú deléciu, adíciu, substitúciu alebo modifikáciu, ktoré zachovávajú schopnosť klasifikácie HCV. Výhodné „substitúcie“ sú tie, ktoré sú konzervatívne, t. j. kde zvyšok je nahradený iným rovnakého všeobecného typu. Je treba chápať, že prirodzene sa vyskytujúce aminokyseliny môžu byť subklasifikované ako kyslé, bázické, neutrálne a poláme alebo neutrálne a nepoláme. Ďalej sú tri z kódujúcich aminokyselín aromatické. Všeobecne je výhodné, že kódované polypeptidy sa odlišujú od prirodzeného epitopu tým, že obsahujú kodóny pre aminokyseliny, ktoré sú z rovnakej skupiny, ako je nahradená aminokyselina. Všeobecne, bázické aminokyseliny Lys, Arg a His sú vzájomne zameniteľné, kyslé aminokyseliny -
- kyselina aspartová a glutamová - sú zameniteľné; neutrálne poláme aminokyseliny Ser, Thr, Cys, Gin a Asn sú vzájomne zameniteľné; nepoláme alifatické amino-kyseliny Gly, Ala, Val, íle a Leu sú konzervatívne s ohľadom na ostatné (ale z dôvodov veľkosti sú Gly a Ala vzájomne si bližšie a Val, íle a Leu sú si tiež bližšie) a aromatické aminokyseliny Phe, Trp a Tyr sú vzájomne zameniteľné. Pretože prolín je nepoláma neutrálna aminokyselina, robí táto problémy vzhľadom na jej vplyv na konformáciu a substitúciu prolínom alebo prolíny nie sú preferované s výnimkou, keď môžu byť dosiahnuté rovnaké alebo podobné konformačné výsledky. Poláme aminokyseliny, ktoré predstavujú konzervatívne zmeny, zahrnujú Ser, Thr, Gin, Asn a v menšom rozsahu Met. Ďalej, i keď sú klasifikované v rôznych kategóriách, sa Ala, Gly a Ser javia ako zameniteľné a Cys navyše patrí do tejto skupiny alebo môže byť klasifikovaný s polárnymi neutrálnymi aminokyselinami.
Ďalej by bolo treba uviesť, že ak sú polypeptidy vyrobené synteticky, môžu byť tiež vykonané substitúcie aminokyselinami, ktoré nekódujú gén. Alternatívne zvyšky zahrnujú napríklad omega aminokyseliny vzorca H2N(CH2)nCOOH, kde n je 2 až 6. Sú to neutrálne, nepoláme aminokyseliny, ako je sarkozín (Sar), terc, butylalanín (t-BuA), terc, butylglycín (t-BuG), N-metyl íle (N-Melle) a norleucín (Nie). Fenylglycín, napríklad, môže nahradiť Trp, Tyr alebo Phe neutrálnu aromatickú aminokyselinu; citrulín (Cit) a metionín sulfoxid (MSO) sú poláme, ale neutrálne, cyklohexylalanín (CHa) je neutrálny a nepolámy, cysteínová kyselina (Cya) je kyslá a omitín (Om) je bázický. Konformačné vlastnosti prolínových zvyškov môžu byť zachované, ak je jeden alebo viacero z nich nahradených hydroxyprolínom (Hyp).
Výraz „rekombinantný polynukleotid“, ako je tu použitý, zahrnuje polynukleotidy genomického, cDNA, semisyntetického alebo syntetického pôvodu, ktorý vďaka svojmu pôvodu alebo spracovaniu: (1) nie je spojený so všetkými alebo časťou polynukleotidu, s ktorým je spojený v prírode, (2) je napojený k polynukleotidu inému ako ku ktorému je napojený v prírode, alebo (3) nevyskytuje sa v prírode.
Výraz „polynukleotid“, ako je tu použitý, označuje polymérmi formu nukleotidov akejkoľvek dĺžky, buď ribonukleotidov alebo dezoxyribonukleotidov. Tento výraz zahrnuje dvoj- a jednoreťazcovú DNA a RNA. Zahrnuje tiež známe typy modifikácie, napríklad značenia, ktoré sú známe v odbore, metyláciu, „caps“, náhradu jedného alebo viacerých prirodzene sa vyskytujúcich nukleotidov analógom, intemukleotidové modifikácie, ako sú napríklad tie so spojmi nenesúcimi náboj (napr. metylfosfonáty, fosforoteiestery, fosforoamidáty, karbamáty, atď.) a so spojmi nesúcimi náboj (napr. fosforotioáty, fosforoditioáty, atď.), tie, ktoré obsahujú pendant skupiny, ako sú napríklad proteíny, zahrnujúce, ale neobmedzujúce sa na nukleázy, toxíny, protilátky, signálne peptidy a poly-L-lyzín; obsahujúce interkalátory (napr. akridín, psoralén, atď.), obsahujúce chelátory (napr. kovy, rádioaktívne kovy, bór, oxidujúce kovy, atď.), obsahujúce alkylátory, obsahujúce modifikované spojenie (napr. alfa anoméme nukleové kyseliny, atď.), ako i nemodifikované formy polynukleotidov. Tu opísané polynukleotidy sú relatívne krátke a sú preto ľahko chemicky syntetizovateľné.
„Čistený“ polypeptid označuje polypeptid, ktorý je v stave, keď je v podstate zbavený od iných polypeptidov, t. j. v kompozícii, ktorá obsahuje minimálne asi 50 % hmotn. (požadovaný polypeptid/celkový polypeptid v kompozícii), výhodne minimálne asi 70 % a výhodnejšie i minimálne asi 90 % požadovaného polypeptidu bez ohľadu na neproteínové materiály v kompozícii. Techniky na čistenie virálnych polypeptidov sú známe v odbore. Čistené protilátky sú podobne definované v odbore.
Ako je tu použitý, označuje výraz „epitop“ antigénnu determinantu polypeptidu. Epitop by mal obsahovať 3 alebo viacero aminokyselín, ktoré definujú väzobné miesto protilátky. Všeobecne epitop obsahuje aspoň 5 aminokyselín a niekedy obsahuje aspoň 8 aminokyselín. Spôsoby mapovania epitopu sú v odbore známe.
Používaný výraz „typovo špecifický epitop“ označuje epitop, ktorý sa nachádza v jednom HCV type. „Typovo - klastrový špecifický epitop“ sa nachádza na viac ako jednom, ale menej ako všetkých HCV typoch. Napríklad jednotlivý epitop môže byť rozpoznávaný protilátkami od pacienta infikovaného HCV 1, ale rozpoznávaný menej účinne protilátkami od pacienta infikovaného HCV-2. Podobne typ - klastrovo špecifického epitopu odvodeného od HCV-3 môže byť rozpoznávaný protilátkami od pacienta infikovaného HCV-1 alebo HCV-2. „Konzervované epitopy“ sú tie, ktoré sú rozpoznávané protilátkami špecifickými pre všetky HCV typy.
Polypeptid je „imunologický reaktívny“ s protilátkou, ktorá sa viaže k peptidu vďaka tomu, že protilátka rozpoznáva špecifický epitop obsiahnutý v polypeptide. Imunolo
SK 282543 Β6 gická reaktivita môže byť determinovaná väzbou protilátky, konkrétnejšie kinetikou väzby protilátky a/alebo súťažením vo väzbe s použitím známych polypeptidov ako súťažiacich látok, obsahujúcich epitop, proti ktorému je protilátka riadená. Techniky na stanovenie, ktorý polypeptid je imunologický reaktívny s protilátkou, sú známe v odbore.
Tu používaný výraz „protilátka“ označuje polypeptid alebo skupinu polypeptidov, ktoré obsahujú aspoň jedno kombinované miesto pre protilátku. „Kombinované miesto pre protilátku“ alebo „väzobná doména“ sú vytvorené zo zloženia rôznych domén molekuly (molekúl) protilátok za vzniku trojrozmerného väzobného spojenia s vnútorným povrchovým tvarom a distribúciou náboja komplementárnym k rysom epitopu antigénu, ktorá umožňuje imunologickú reakciu s antigénom. Kombinované protilátkové miesto môže byť vytvorené z ťažkej a/alebo ľahkej reťazcovej domény (VH a VL), ktoré tvoria hypervariabilnú slučku, ktorá prispieva k väzbe antigénu. Výraz „protilátka“ zahrnuje, napríklad, protilátky obratlovcov, hybridné protilátky, chiméme protilátky, zmenené protilátky, jednoväzobné protilátky, Fab proteíny a jednotlivé domény protilátok.
Protilátky špecifické k polypeptidom a polypeptidy môžu byť vyrobené akoukoľvek metódou známou v odbore. Napríklad sú polypeptidy všeobecne suspendované vo fyziologicky prijateľnom pufri, zmiešané s vhodnou prísadou a injektované zvieraťu. Spôsoby výroby polygonálnych a monoklonálnych protilátok sú známe v odbore a nebudú tu podrobne opisované.
Výraz „polypeptid“ označuje polymér aminokyselín a neoznačuje špecifickú dĺžku produktu; v rozsahu definície polypeptidu sú preto zahrnuté polypeptidy, oligopeptidy a proteíny. Tento výraz tiež neznamená alebo vylučuje postexpresnú modifikáciu polypeptidu, napríklad glykozyláciu, acetyláciu, fosforyláciu a podobne. V definícii sú napríklad zahrnuté polypeptidy obsahujúce jeden alebo viacero analógov aminokyseliny (zahrnujúcej napríklad neprirodzené aminokyseliny, atď.), polypeptidy so substituovanými väzbami, ako i iné modifikácie známe v odbore, tak prirodzene sa vyskytujúce, ako i neprirodzene sa vyskytujúce.
„Liečenie“, ako je tu používané, znamená tak profylaxiu, ako terapiu.
„jednotlivec“, ako je tu tento výraz používaný, označuje obratlovcov, hlavne príslušníkov rodov cicavcov a zahrnuje, ale nie je takto obmedzený, živočíchy (napr. psy, mačky, hovädzí dobytok, prasce, ovce, kozy, králiky, myši, krysy, morčence atď.) a primáty vrátane opíc, šimpanzov, paviánov a ľudí.
Používaný výraz „negatívny reťazec“ (sense strans) nukleovej kyseliny obsahuje sekvenciu, ktorá má sekvenciu homológnu k sekvencii mRNA. „Pozitívny reťazec“ obsahuje sekvenciu, ktorá je komplementárna so sekvenciou „negatívneho reťazca“.
Ako je tu použité, je „pozitívne reťazcovaný genóm“ vírusu ten, v ktorom genóm, či RNA alebo DNA, je jednoreťazcový a ktorý kóduje virálny polypeptid(y). Príklady pozitívne reťazcových RNA vírusov zahrnujú Togaviridae, Coronaviridae, Tetroviridae, Picomaviridae a Caliciviridae. Zahrnuté sú tiež Flaviviridae, ktoré boli prv označované ako Togaviridae, pozri Fields a Knipe (1986).
Tu použitý výraz „telová vzorka obsahujúca protilátky“ označuje komponent jednotlivcovho tela, ktorá je zdrojom záujmových protilátok. Komponenty, obsahujúce telové protilátky, sú známe v odbore a zahrnujú, ale nie sú tak obmedzené, napríklad plazmu, sérum, miechovú kvapalinu, lymfatickú kvapalinu, vonkajšie sekcie dýchacieho, intesti nálneho a genitourinámeho traktu, sliny, mlieko, biele krvinky a myelómy.
„Biologická vzorka“ sa týka vzorky tkaniva alebo kvapaliny izolovanej z jednotlivca, zahrnujúcej, ale neobmedzujúcej sa napríklad na plazmu, sérum, miechový mok, lymfatickú kvapalinu, vonkajšie časti kože, respiračné, intestinálne a genitourinámc trakty, slzy, sliny, mlieko, krvné bunky, nádory, orgány. Zahrnuté sú tiež vzorky zložiek bunkových in vitro kultúr (zahrnujúce, ale neobmedzujúce sa na kondicionované médium vzniknuté pri raste buniek, domnele virálne infikovaných buniek, rekombinantných buniek a zložiek buniek).
Spôsoby vykonania vynálezu
Pri vykonaní predloženého vynálezu sa využívajú, ak nie je inak uvedené, bežné techniky molekulárnej biológie, mikrobiológie, syntézy rekombinantnej DNA, polypeptidov a nukleových kyselín a imunológie, ktoré sú odborníkom známe. Takéto techniky sú plne v literatúre opísané. Pozri napr. Maniatis, Fitsch a Sambrook, „Moleculary Cloning: A Laboratory Manual“ (1982); „DNA Cloning, zv. I a II.“ (D. N. Glover ed. 1985); „Oligonukleotide Synthesis“ (M. J. Gait ed„ 1984); „Nucleic Acid Hybridization; (B. D. Hames a S. J. Higgins vyd„ 1984); „Transcription and Translation“ (B. D. Hames a S. J. Higgins vyd. 1984); „Animal Celí Culture“ (R. I. Freshney ed„ 1986); „Immobilized Cells and Enzymes“ (IRL Press, 1986); B. Rerbal, „A Practical Guide to Molecular Cloning“ (1984); séria „Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); „Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells“ (J. H. Miller a M. P. Calos vyd. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Meth. Enzymol., zv. 154 a zv. 155 (Wu a Grossman a Wu, vyd.), Mayer a Walker, vyd. (1987), „Immunochemical Methods in Celí and Molecular Biology“ (Academic Press, Londýn); Scopes (1987) „Proteín Purification: Principles and Pracúce“, druhé vydanie Springer - Verlag, N. Y.) a „Handbook of Experimental Immunology“, zv. I - IV. (D. M. Weil a C. C. Blackwell vyd. 1986).
Všetky patenty, patentové prihlášky a publikácie uvedené v tomto opise, ako vyššie a ďalej, sú tu zahrnuté ako odkazy.
Vynález zahrnuje metódy na detekciu HCV a identifikáciu infekcie rôznych typov HCV. Vynález tiež zahrnuje polypeptidy a molekuly nukleovej kyseliny na použitie v týchto metódach.
Metódy detekcie a klasifikácie infekcie HCV zahrnujú tak imunoskúšky, ako i identifikácie nukleovej kyseliny metódami zahrnujúcimi, ale neobmedzujúcimi sa na ne, Southem blot analýzu a polymerázovú reťazcovú reakciu. Na účely identifikácie infekcie HCV sa biologická vzorka inkubuje s jedným z tu opísaných polypeptidov za podmienok, ktoré umožňujú väzbu antigén - protilátka a stanovenie, či sa protilátky vo vzorke viažu k epitopu, ktorý sa nachádza v polypeptide.
Imunoskúška a diagnostické kity
Peptidy obsahujúce špecifické epitopy a typ - klastrovo špecifické epitopy, sú vhodné v imunoskúškach na detegovanie prítomnosti HIV protilátok alebo prítomnosti vírusu a/alebo virálnych antigénov, v biologických vzorkách. Vykonanie imunoskúšok sa môže rôzne meniť a v odbore je známych veľa vyhotovení. Imunoskúška bude využívať aspoň jeden typovo špecifický epitop alebo typ - klastrovo špecifický epitop. V jednom vyhotovení používa imuno skúška kombináciu typovo špecifických epitopov a typ -
- klastrovo špecifických epitopov.
Polypeptidy sú použiteľné na klasifikáciu HCV s použitím epitopov na stanovenie prítomnosti typov špecifických alebo typovo - klastrových špecifických protilátok. Polypeptidy sú tiež vhodné na použitie pri generovaní typovo alebo typovo klastrovo špecifických protilátok, ktoré môžu byť použité v imunoskúške na rozlíšenie medzi rôznymi typmi HCV.
Polypeptidy sú odvodené od troch rôznych regiónov HCV genómu. Jedna súprava polypeptidov zahrnuje typovo alebo typovo - klastrovo špecifický epitop získaný z regiónu HCV jadra. Ďalšia súprava polypeptidov zahrnuje typovo alebo typovo - klastrovo špecifický epitop získaný z HCV neštrukturálneho regiónu 4 (NS4). Ďalší set polypeptidov zahrnuje typovo alebo typovo - klastrovo špecifický epitop získaný z neštrukturálneho regiónu 5 (NS5) vírusu hepatitídy C. Tento set sa nachádza medzi aminokyselinovými zvyškami 2281 - 2313 HCV-1 a homológnymi oblasťami iných typov vírusu hepatitis C.
Polypeptidy sú použiteľné v imunoskúškach pre jeden alebo viacero typov HCV. Pri skúške jedného typu sa vzorka uvedie do kontaktu s jedným alebo viacerými polypeptidmi, obsahujúcimi typovo - klastrovo špecifický epitop za podmienok, ktoré umožňujú väzbu antigén - protilátok a stanovenie, keď sa protilátky viažu vo vzorke k epitopu.
V imunoskúške na rozlíšenie jednotlivého typu HCV sa získa biologická vzorka od jednotlivca, uvedie sa do kontaktu s prvým typovo špecifickým peptidom alebo typovo -
- klastrovo špecifickým epitopom za podmienok, ktoré umožňujú väzbu antigén - protilátka; kontaktuje sa s druhým typovo špecifickým epitopom alebo typovo - klastrovo špecifickým epitopom za podmienok, ktoré umožňujú väzbu antigén - protilátka a stanoví sa, ktoré protilátky vo vzorke sa viažu buď k prvému alebo druhému epitopu. Tieto stupne môžu byť opakované s mnohými polypeptidmi, obsahujúcimi typovo a/alebo typovo - klastrovo špecifické epitopy.
Typicky, imunoskúška na anti-HCV protilátku(y) zahrnuje výber a prípravu skúšobnej vzorky, o ktorej sa predpokladá, že obsahuje protilátky, ako je biologická vzorka, potom inkubáciu tejto vzorky s typovo špecifickým epitopom alebo typovo - klastrovo špecifickým epitopom za podmienok, ktoré umožňujú vznik komplexov antigén -
- protilátka a potom detekciu tvorby takýchto komplexov. Vhodné inkubačné podmienky sú v odbore známe. Imunoskúška môže byť, bez obmedzenia, v heterogénnom alebo homogénnom vyhotovení a štandardného alebo kompetitívneho typu.
V heterogénnom vyhotovení sa typovo špecifický epitop alebo typovo klastrový špecifický epitop typicky viažu k pevnému nosiču kvôli uľahčeniu oddelenia vzorky od polypeptidu po inkubácii. Príklady pevných nosičov, ktoré môžu byť použité, zahrnujú, ale nie sú tak obmedzené, nitrocelulózu (napr. vo forme membrán alebo mikrotitračných doštičiek), polyvinylchlorid (napr. v doskách alebo mikrotitračných jamkách), polystyrénový latex (napr. v guľôčkach alebo mikrotitračných platniach), polyvinylidénfluorid (známy ako ImmunolonR), diazotizovaný papier, nylonové membrány, aktivované guľôčky a guľôčky Proteínu A. Napríklad Dynatech ImmunolonR 1 a Immunolon2 mikrotitračné doštičky alebo 0,25 palcové polystyrénové guľôčky (Precision Plastic Balí) môžu byť použité v heterogénnom vyhotovení. Pevný nosič obsahujúci typovo špecifický epitop alebo typovo klastrovo špecifický epitop je typicky premytý po jeho oddelení zo skúšobnej vzorky a pred de tekciou naviazaných protilátok. Tak štandardné, ako i kompetitívne vyhotovenia sú v odbore známe.
V homogénnom vyhotovení sa skúšobná vzorka inkubuje s typovo špecifickým epitopom alebo typovo klastrovo špecifickým epitopom v roztoku. Napríklad to môže byť za podmienok, keď sa budú zrážať akékoľvek komplexy antigén - protilátka, ktoré sa vytvoria. Tak štandardné, ako i kompetitívne vyhotovenia pre tieto skúšky sú známe v odbore.
V štandardnom vyhotovení sa množstvo HCV protilátok tvoriace komplex protilátka - typovo - alebo typovo - klastrovo špecifický epitop sleduje priamo. Toto sa môže vykonať stanovením, ako sa značené anti-xenogénne (napr. antihumánne) protilátky, ktoré rozpoznávajú epitop na antiHCV protilátkach, budú viazať vďaka tvorbe komplexu. V kompetitívnom vyhotovení sa množstvo HCV protilátok odvodí od kompetitívneho účinku na väzbu známeho množstva značenej protilátky (alebo iného kompetitívneho ligandu) v komplexe.
V inhibičnej skúške sa stanoví schopnosť protilátok viazať sa k polypeptidom, obsahujúcim rôzne odlišné typovo špecifické epitopy k typovo klastrovo špecifickým epitopom. Protilátky sa najprv vystavia polypeptidom, obsahujúcim epitop(y) z iného typu alebo typ - klastra HCV. Proces môže byť opakovaný pre ďalšie typy alebo typové klastry HCV.
Vytvorené komplexy obsahujúce anti-HCV protilátky (alebo v prípade kompetitívnej skúšky množstvo súťažiacej protilátky) sa detegujú mnohými známymi technikami, v závislosti od vyhotovenia. Napríklad neznačené HCV protilátky v komplexe môžu byť detegované s použitím konjugátu antoxenogénneho Ig komplexovaného so značením (napr. enzýmovým značením).
V typických imunoskúškach sa testovaná vzorka, typicky biologická vzorka, inkubuje s polypeptidmi, obsahujúcimi jeden alebo viacero typovo špecifických epitopov alebo typovo - klastrovo špecifických epitopov za podmienok, ktoré umožňujú tvorbu komplexov antigén - protilátka. Môžu sa použiť rôzne vyhotovenia. Napríklad „sendvičový“ môže byť použitý tam, kde sa protilátka viaže k pevnému nosiču a je inkubovaná skúšanou vzorkou, premytá, inkubovaná s druhou, značenou protilátkou k analytu a nosič je opäť premytý. Analyt sa deteguje stanovením, ak je naviazaná druhá protilátka k nosiču. V kompetitívnom vyhotovení, ktoré môže byť buď heterogénne alebo homogénne, sa skúšaná vzorka zvyčajne inkubuje s protilátkou a značí. Kompetitujúci antigén sa tiež inkubuje, buď postupne alebo súčasne. Tieto a iné vyhotovenia sú známe v odbore.
Protilátky riadené proti typovo špecifickým epitopom alebo typovo - klastrovo špecifickým epitopom môžu byť použité v imunoskúške na detekciu vírusových antigénov u pacientov s HCV vyvolanou NANBH a v infekčnej krvi darcov. Navyše sú tieto protilátky extrémne vhodné na použitie na detekciu akútnej fázy darcov a pacientov.
Imunoskúška môže použiť napríklad monoklonálnu protilátku riadenú proti typovo špecifickému epitopu alebo typovo - klastrovo špecifickému epitopu, kombináciu monoklonálnych protilátok riadenú proti epitopom jedného virálneho antigénu, monoklonálnych protilátok riadených proti epitopom rôznych virálnych protilátok, polyklonálnych protilátok riadených proti rovnakému viráinemu antigénu alebo polyklonálne protilátky riadené proti rôznym virálnym antigénom. Protokoly môžu tiež napríklad používať pevné nosiče alebo môže byť vykonaná imunoprecipitácia. Najviac skúšok zahrnuje použitie značenej protilátky alebo polypeptidu; značenie môže byť, ale nemusí byť, obmedze né na molekuly enzymatické, fluorescentné, chemiluminiscentné, rádioaktívne alebo farbív. Sú tiež známe skúšky, ktoré amplifikujú signály zo sond; príklady takýchto skúšok, ktoré využívajú biotín a avidín a enzýmom značené a sprostredkované imunoskúšky, ako je ELISA skúška.
Vynález ďalej zahrnuje nukleokyselinové molekuly, kódujúce sekvencie aminokyselinových zvyškov opísaných typovo špecifických epitopov a typovo - klastrovo špecifických epitopov. Tieto nukleokyselinové molekuly sú použiteľné ako sondy napríklad pre Southem bloty alebo iné DNA rozpoznávajúce skúšky, ako je zachytávacia skúška opísaná v US patentoch č. 4868105 a 5124246.
Štúdie antigénneho mapovania expresiou HCV cDBA ukazujú, že veľa z klonov, obsahujúcich tieto cDNA exprimuje polypeptidy, ktoré sú imunologický reaktívne so sérom z jednotlivcov, majúcich NANBH. Nijaký jediný polypeptid nebol imunologický reaktívny so všetkými sérami. Päť z týchto polypeptidov bolo veľmi imunogenických v tom, že protilátky k HCD epitopom v týchto polypeptidoch boli detegované v sére rôznych pacientov, i keď presah v detekcii nebol úplný. Preto výsledky imunogenicity polypeptidov kódovaných v rôznych klonoch potvrdzujú, že účinné detekčné systémy pre HCV infekciu môžu byť vykonané s použitím panelov epitopov. Epitopy v paneli môžu byť konštruované v jednom alebo viacerých polypeptidoch. Skúšky pre rôzne epitopy môžu byť postupné alebo súčasné.
Kity vhodné na imunodiagnózu a obsahujúce vhodne značené činidlá sú konštruované balením vhodných materiálov, zahrnujúcich polypeptidy podľa vynálezu, obsahujúce typovo špecifické epitopy a typovo - klastrovo špecifické epitopy alebo protilátky riadené proti typovo špecifickým epitopom a typovo - klastrovo špecifickým epitopom vo vhodných kontajneroch, spolu s ostatnými činidlami a materiálmi, potrebnými na vykonanie skúšky, ako i príslušným návodom na použitie.
Vynález ďalej zahrnuje nukleokyselinové molekuly komplementárne k nukleokyselinovým sekvenciám, lemujúcim regióny, kódujúce typovo špecifické epitopy a typovo - klastrovo špecifické epitopy. Takéto nukleokyselinové molekuly sú vhodné na vykonanie PCR kvôli stanoveniu genoty pu jednotlivého HCV.
Bolo by potrebné poznamenať, že sa vyskytujú rôzne a hypervariabilné regióny v HCV genóme; preto je homológia v týchto regiónoch považovaná za významne nižšiu ako v celom genóme.
Techniky na stanovenie nukleokyselinovej a aminokyselinovcj homológie sú v odbore známe. Napríklad aminokyselinová sekvencia môže byť stanovená priamo a porovnaná so sekvenciami tu uvedenými. Alternatívne môže byť nukleotidová sekvencia genomického materiálu domnelého HCV stanovená (zvyčajne cez cDNA medziprodukt), môže byť stanovená kódujúca aminokyselinová sekvencia a zodpovedajúce regióny porovnané.
Predchádzajúca diskusia a príklady iba ilustrujú vynález, pre odborníkov v odbore bude zrejmé, že vynález môže byť uskutočnený inými cestami a vynález je definovaný rozsahom predložených nárokov.
Príklady vyhotovenia vynálezu
Príklad 1
Porovnanie hlavných epitopov rôznych odlišných typov HCV
Homológia aminokyselinových zvyškov medzi rôznymi typmi a subtypmi HCV bola porovnávaná pre rôzne regióny. Subtyp HCV je opísaný Simmondsemovou fylogenetickou analýzou. Číslovanie aminokyselinovej sekvencie zodpovedá číslovaniu opísanému pre prototypovú HVV-1 sekvenciu, Choo a spol. Tabuľka 2 ukazuje percento homológie aminokyselinových zvyškov pre NS4 región typovo špecifických epitopov a typovo - klastrovo špecifických epitopov a konzervovaného hlavného epitopu. Tabuľka 3 ukazuje homológiu aminokyselinových zvyškov medzi dvoma typovo špecifickými epitopmi a typovo - klastrovo špecifickými epitopmi NS5 regiónu. Tabuľka 4 ukazuje percento homológie aminokyselinových zvyškov pre jadrový región konzervovaných hlavných epitopov a typovo špecifických epitopov.
Tabuľka 2
Aminokyselinová homológia (%) medzi rôznymi HCV subtypmi
HCV subtyp Príklad skratky typu NS4 región typ špecifických hlavných epitopov (1689-1718aa) NS4 región konzervovaného hlavného epitopu (1910-1936aa)
la HCV-1 (la) vs (la) 100 i 100 %
lb hcv-j (ia) vs (lb) 83 t 100 t
2a HCV-J6 (la) V8 (2a) 47 t 93 %
2b HCV-J8 (la) vs (2b) 43 * 93 %
Tabuľka 3
Aminokyselinová homológia (%) medzi rôznymi HCV subtypmi
HCV subtyp Príklad skratky typu WS4 región typ Špecifických hlavných epitopov (2281-2313aa)* NS4 región konzervovaného hlavného epitopu (2673-2707aa)*
la HCV-1 (la) vs (ia) 100 t 100 4
lb HCV-J (la) vs (lb) 76 t 89 t
2a HCV-J6 (la) vs (2a) 70 * 83 t
2b HCV-JB (la) vs (2b) 73 1 83 *
3a HCV-E-bl (la) vs (lb 77 t
3b HCV-Tb (la) vs (3b) 83 t
Tabuľka 4
Aminokyselinová homológia (%) medzi rôznymi HCV subtypmi
HCV subtyp Príklad skratky typu NS4 región typ špecifických hlavných epitopov (10-45aa)* KS4 región kon zervovaného hlavného epitopu (S7-84aa)*
la HCV-1 (la) vs (la) 100 t 100 t
lb HCV-J (la) vs (lb) 98 t 100 %
2a HCV-J6 (la) vs (2a) 98 t 61 *
2b HCV-J8 (la) vs (2b) 98 t 61 t
3a HCV-E-bl (la) vs (3a 93 t 89 t
4 HCV-EG-21 (la) va (4 98 % 83 t
Príklad 2
Syntéza peptidov
Boli syntetizované dve súpravy polypeptidov. Prvá súprava bola zostavená na vykonanie epitopového mapovania HCV-1 a druhá súprava bola zostavená kvôli zisteniu, ktorý epitop identifikovaný v štúdiách mapovania epitopov obsahuje typovo špecifické epitopy. V prvej súprave bolo syntetizovaných šesťdesiatštyri súprav (dvojmo) presahujúcich oktapeptidov pomocou Momotopes cez celý HCV-1 polyproteín (3011 aminokyselinových zvyškov).
Druhá súprava polypeptidov bola vykonaná podľa metódy opísanej Geysenom (1990), J. Trop. Med. Pub. Health,
21, 523 - 533 a Merrifield (1063), J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154.
V druhej súprave polypeptidov boli vybrané štyri antigénne regióny, ktoré predstavujú hlavné epitopy alebo konzervatívne sekvencie v HCV-1 z jadra, NS4, NS5 a ich zodpovedajúce sekvencie z HCV subtypov lb, 2a, 3a a typu 4 pre typovo špecifickú epitopovú syntézu. Sekvencia z jadra bola vybraná z menej konzervovaného regiónu aminokyselinových zvyškov 67-88. Sekvencia z NS4 regiónu bola vybraná z aminokyselinových zvyškov 1689-1718. Sekvencie vybrané z NS5 regiónu boli regióny aminokyselinových zvyškov 2281-2313 a 2673-2707.
Príklad 3
Biologické vzorky
Na účely stanovenia účinnosti polypeptidov v rozlišovaní medzi protilátkami špecifickými k rôznym typom HCV boli získané antiséra od dvadsiatich štyroch chronických NANBH pacientov z rôznych oblastí Spojených štátov - východné a západné pobrežie, Japonska, zemi západnej Európy, južnej Európy a južnej Afriky. Virálna RNA izolácia, cDNA syntéza, PCR amplifikácia, DNA sekvenovanie a hybridizácia oligonukleotidovou sondou boli vykonané ako opísal Cha a spol. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 7144-7148.
Príklad 4
Postupy mapovania epitópu
Na účely stanovenia, ktoré regióny HCV obsahujú epitopy tak skupiny konzervované, ako i špecifické, bol celý HCV-1 polyproteín podrobený epitopovému mapovaniu. Metóda je v podstate znázornená na obr. 2.
Šesťdesiatštyri (dvojmo) presahujúcich oktapeptidov bolo syntetizovaných pomocou MimotopesR cez celý HCV-1 polyproteín (3011 aminokyselín). Panel 40 vzoriek obsahuje 25 US HCV protilátka reaktívnych vzoriek, 9 japonských HCV reaktívnych vzoriek a 6 HCV nereaktívnych negatívnych kontrolných vzoriek, ktoré boli vybrané na epitopové mapovanie a klastrovú analýzu. Imunoskúšky boli vykonané s použitím štandardných ELISA postupov.
Kritéria na identifikovanie hlavných epitopov boli založené na početnosti protilátkovej reakcie a intenzite (titre) protilátkovej reakcie k týmto epitopom. Výsledky sú uvedené na obr. 3 a 4.
Príklad 5
Štúdia peptidový odvodený enzým - napojený imunosorbent
Na účely stanovenia optimálnej imunoskúšky využívajúcej polypeptidy opísané v príklade 2, boli vykonané dva rozdielne typy skúšok polypeptid odvodený enzým - napojený imunosorbent (ELISA) a výsledky boli porovnané. Prvý typ ELISA bol Nunc MaxiSorb™, na ktorý boli peptidy jednoducho adsorbované a druhý typ použil Nunc Convalink NH™, na ktorý sú polypeptidy naviazané kovalentne. Tvorba amidových väzieb medzi karboxylovými kyselinami a amínmi je iniciovaná prídavkom karbodiimidu. Kvôli zníženiu hydrolýzy môže byť aktívny ester vyrobený prídavkom N-hydroxy-sukcinimidu (NHS) k uvedeným konjugačným postupom.
Mikrotitračné platne pre prvý typ ELISA boli vyhotovené nasledovne. Polypeptidy boli umiestnené do jamiek Nunc MaxiSorb™ mikrotitračných platní v koncentrácii 1 ug/jamka v 100 μΐ fosfátom pufŕovaného salinického roztoku (PBS). Polypeptidy boli nechané absorbovať cez noc pri teplote miestnosti. Mikrotitračné platne boli potom premyté štyrikrát PBS bez detergentu. Jamky potom boli následne potiahnuté 220 μΐ Superblock™ (Pierce) jednu hodinu a potom aspirované bez ďalšieho premývania a vákuovo sušené.
Skúška bola vykonaná nasledovne. Vzorky séra s veľkosťou 5 μΐ boli pridané do jamiek so 100 μΐ 5 % netučného mlieka a inkubované jednu hodinu pri 37 °C. Jamky boli potom premyté päťkrát v PBS s 0,05 % Tweenu. Konjugát afinitne čisteného kozieho anti-humánneho IgG značeného s chrenovou peroxidázou (Jackson Laboratories) bol potom použitý na stanovenie stupňa naviazania ľudských protilátok k polypeptidom. Konjugát bol vopred zriedený na 5 % IgG v 150 mM NaCl, PBS, 5 % konské sérum (tepelne denaturované), 100 μΐ konjugátu bolo umiestnené do jamiek a inkubované jednu hodinu pri 37 °C. Jamky potom boli premyté päťkrát PBS/Tween a OPD [o-fenyl-diamín-2HC1, jedna tabletka na vývojku pufra (citrát fosfát pufrovaný 0,02 % H2O2); Sigma] po tridsať minút pri teplote miestnosti a bola stanovená absorpcia pri 492 a 620 nm. Vzorka bola stanovená z 200 náhodných (normálnych) vzoriek pri siedmich štandardných odchýlkach od priemeru alebo asi 0,45.
Mikrotitračné platne pre druhý typ ELISA boli vykonané nasledovne. Polypeptidy boli umiestnené v jamkách Nunc MaxiSorbR mikrotitračných platní v koncentrácii 10 mg/jamka v 50 μΐ vody, 25 μΐ 0,1Μ NHS (sulfo-N-hydroxysukcinimid, Pierce) a 25 μΐ 0,1 M EDC [1 -etyl-3-(3-dimetylaminopropylkarbodiimid) Sigma] bolo pridaných k polypeptidom a miešané pri teplote miestnosti 30 minút na kývajúcej sa plošine. Celé obsahy boli pridané k 52 ml ľadovo studeného 0,1 M uhličitanu sodného, pH 8,6. 100 μΐ zmesi bolo použité na potiahnutie jamiek mikrotitračných platní a potom inkubované pri 4 °C po 30 minút. Platne boli premyté štyrikrát PBS/0,1 % Triton X-100. Platne boli potom spracované so Superblock a skúška bola vykonaná, ako je opísané. Výsledky sú uvedené v nasledujúcich tabuľkách 5 - 14.
TabUlita 5 Séroklazifikácla epLtopouej analýzy z rôznych HCV typov
Sakv. raglôni N»«
Vzorke t6 Ptptld tt* faptld (HCV 1Yfl SakvenciA tivlali od typu
<u vzerky od platených darcov
MRPXIIPĎRRVLi'RtFDtKBiejQHtFYl
MKPAilfOttVtrUFOtHSECÍQKLPt:
NQMWXPMtVLrearOBtttCMMUt
cp<o:-ij(tb) KOftWVAPOKtlLYtnFDtHtKMKAXlt
Vzorky od plátaných darcov
«.aa cptOl-llfjb)
cpOi-lJli·) ep«0»-U(lb)
«.«’ .odeiOO ZLiríll·!
fteeguj. · baínýai apieópaf la. lb , 2a a 2b | PDtJEVLt |
fiekými epitópai ep<Ot-iO(i.a|
t.tl eptOÍ-iKtbi
4.20 cp<02>ll(la)
a. í· íp4OÍ-13(lb)
4.4Ϊ lOdCiOO ELISMI·!
Reaguj· * bainýni »pltápal Ja, lb, 2a a 2b |*DktVLŕj
Tabulka 6 Sároklasífikácia «pitopovej analýzy z rôznych HCV typov
Sákvánčný regióm rtt (idíJ-Disi
Pool· vzorky Peptid HA Peptid z TVPOVO závislá eekvgnA,,
Signál/rez (D Vzorky od platených darcov rôznych HCV typov SblirAlltBACVU AEFOtmCSQMLPY I
ep402*10(i«; se>PA::yoREviY«croEHiccs0rLprt
CpkOJ-llflS) SCaFAVtFDXCVLrgroZMZBCMHLAri
ορ4Ο2-12(21) ΝαΚΛννΑΙΟΧΒνίγγλΓΡΕΝΙΒΟΑΖΚΑλΕ,Ι
cp402-13(2»| NPWWAPOKtUYtAK>CHttCM<UAt.t
vzorky od platených darcov
rrissio |i>i s.sa rp4 OI-lO(li)
9. ?1 íp4O2-ll(lb)
6^63 ep<a?-l><2>)
ep<02-i3(2b)
».·» 1OÍC10O ELlSA(la)
Reaguje s bežnými epitópani la, Lb . 2a a 2b nonKvtr 8_L
im Vzorka reaguje s typovo épecii ickými epitopcil
rF23931 6-34 cp4C2-10<ll)
7.43 ep4O2-l1(lb)
1.89
14.5 cp«o;-ll|2b)
3.25 eoíClOO SUSA(li)
Reaguje s beínýa epitópem 1«, ib, 2« a 2t PORCVLr E 1
Tabulka 10 súhrn HCV špecifických epitopov hlavného typu v Jadra HS4 a NS6 regiónoch
Jadrový región· Hlavné koná, apitópy
TMPQOVkriaMgtvMvr limncMLCikcv-i) “Si Mj Ιό”i apitópy
Typ- ipec· epitópy |SJM«)
HCV-U * lt>-PMRTW*g
HCV-äa s 2b*IZCUWÍ£
KCV-3A or 4-swnjwAO
Typ. Jpes- epitópy (ita>-i?it)__
RCV-lb-----C44HLM uev-Ja s jb-cuuál
Typ. ípec. apitópy «eí-la « lb—porjp»wno KCv-ia----—aoxaPÓIVó« kcv-ib------aortMivM
HCV-ie-------fSSM,PXW
RC*-3b, rro
Kont, epitópy
ÍCiCCOVkMahSCVLtT-HOV-Ja
KCQie«VM»eaM0vtŤT-H6v-ih
Tabulka 11 Sátoklssií Lkkčfiá apltópcvá analýza rdanyeh typov HCV sekvencii (I I chronických ΝλΝΒΚ od plat, darcov Sekv. región· jadro (67-84)
IítouJM 7 SároklaslfIkečni epitopová analýza rôznych HCV typov
Sekvenčný zegiôn: wse (im-lmi
Popis vzorky peptid ZIA
Sígnál/rez f TJ Vxor«y od plátaných darcov
Peptid z ráznych HCV typov
Sekvencia závislá od typu icmm TPomt>r«roDit:esQHi.pr t
RT-32
U· t Jei cp<02-10(la cp*<3 S-11 r l h) cpeoj-ij tie) cp<02-10|l>) cp«02-ll(2b!
0.3? ep4?3-10(la|
0.34 epaíi-lKlbl
1.13 cp402-13(3a)
4.’2 cp4OJ.13<2bl sckaMipo’t/LracrotkttczOHLPTi
SGRRAVXPOREvtigsrJtkBSCASHLRrx
MonvwarcxctLrzancMKtCRsKAAtx reaktívne typovo Ipeciílckýte. apltópo® reaktívne s typovo ipeciEickým epitóposi eedCIOO ZLIlMlai
Ícmma-I |c>;W,.|
Tabulka e airahlaaiíikačná apltapovi analýza ráznych HCV typov
sekver.dný región: popis vzorky i H Chzonleká NANBH MÍS (3433-2701) peptidy i rôznych HCV od plat, darcov Sekvencia závislá ed typu
?»pt d IIA S/CO
I»b) 1 *1 /.J
a. sa O»49?-S<2a) t hs tteRLrvockxrasKoffTMrsecwisovtTT
3.« •e«»V7i»> insvttuLYvctvyTssMgsecYRAexAicvtn
Ic.it ceiO2-S<j»i1 isiLTlAi.rceopľresKakQCcrRRCKAicvtrt
Kritická sekvenčná zmena raj rraiesi 4.40 vykonaná v 2.2« apltópoch v tajte e»462-4(la) vzorka fi u 171
1.51 e041-»tlb> ep402-6|ía) ep402-í(36) e»402-7(26)
|0. <3 cp40i-l(3e)|
• 61 r-MS klllMl
Kritická sekvenčná odpovad vo vzorka seena výkon and v epitôpe t u 0
Tabulka $ sároklaeifikačná epitopovl analýza rôznych HCV typov
Sekvenčný región: HSS (247X-27O?) peptidy z rdznyeh HCV typov darcov
Popu vzorky
O) Chronická aptlá ľltlcká sekvenčná zmens
l>ULTt»CTVo<ípiTiu»ox><cori<kc*Asc vvrr taiutRt.vtoopttMMOKcaraRcMSovtTt i wtttLívooŕKn'áMQKemcMicviTT tssx.TikLrvoopxrxsMes<ora>ckAscvvTT iniLŤiKt.rwoáKTKSMOSocr»»CkkS«vrTt lsSVÍZ»ticcowr)i«ckota?RwixscwPT
Kritická sekvenčná ζϊλγι» vykonaná v eplcópe
V»g«« id siatia »xk sztn Partia mcv t»i Typ, závislá iek.ver.cle
»4-013766 7.93 41*» 7.M 3.76 6«-0)WJ 0.31 (3b| 2.63 1.01 ep401-01(la.lb) CR40I-02|24.>b) cp4OJ-0S(4| ep40i-ci;n,ib) CP403-0S|4)’ ep»b)-01O»,lb) ep401-02(2t<?b| ep40i-CS (4 | * rC2l tbISA (3-120 es KASA PCCRtWig F0YFWF KoAK stomwok Ferewŕ ιλμζ sscwsvkg aovkWP KAM SntS<iA0|PdFP«<6 .,«iF
STCtawok| Typ. i pec SICASkeg
76676 1.0? ¢0401-01(14,10: PtcaTVAg
)2») 4.75 Cp401-02(la,lb [sTCKSľOkj
1.04 Cp4«)-O«(31) StORSWAQ SICRSWAQ
rC2< CLtík 12-120 aa)
TaDulka 12 BárMLaaLfkLkácls epitopovaj analýzy rôznch typov HCV sekvencii (I) Chronická HANBH Od plat, darcov JekV. región: SS5 (2261-2313)
Vzorka 10 pegtid Bl* S/CQ jaeptid (HCV Τνηί
Typovo závislá sekvencie fAOALP FPPAGF rPPALP FPPALP
WARFMNPPLVETWKXPDYEPPWHG ΐνΛΗΡΟΪΚΡΡϋΕΟΚΚΟΡΟννρρννΜα
AVABPDVHPPt.VESWKHPD*QPATVAÍ PVAnPPVHPVl,IETWKRP«*ZPPTVlÄ
11) »5690(11
4.59 cp402-OO(la)
1.57 cp4C2-01(lb)
i.ié ep«o!-O3(la)
C.n ep4O2-t>3 (2b)
S.64 r-NSSEUSA(La)
Typovo ipacifický epitop
PP I PP Λ
Cp401-00(ll) cpá o i -o i (1 b) i----------------1 Cp4O3-O2(2a) Typovo špecifický epitop IPDYQPkTVACl Cp402-O3(2b) I-----------0.42 r-NSSELISA(la)
Tabulka 1) Sároklasifikaíná epitópová analýza rósnynh typov HCV sekvencii (I) ehtoalekej NMWI od plat, darcov tekv. regiónu) ssó 12281-2313)
Vrorra ľO peptid tra s/CO wtid
Typovo závislé sekvencia
11) HACS(lb) (2) FF15912(ia)
1.21 cp402-»0(la) 4.5« CbkCl-CKlb) C.10 cp«01-02(2el 0.47 pp402-03(3b|
6.36 r-HSJEUSA
«.«á ep402-CO(lal
4.3S cp402-01(lb) 5.52 epao2-02<2a! 5.00 cp10?-«3(2b)
Natypovo špecifická (konzervované) epitópy
FAQALPV FPPALPÍ FPPAbPA FPPAVPF
WARPOYH «MIŠOV* VARPOYH WARPDYH
WARPOYNÍ
PPLVtŤWX I PDYEPpWXC asv-tsvko I Pbvvss'JVHe PPbUESVKR1PDYQPATVAC PVLÍETWn' PGYEPPTVLC
POYEPPWHG(ii) POYVPPWHC (1 b)
PDY5PATVAC(2a) FGťEPPTVLC(2t:
Tabulka 14 Sároklasifilaaôná epitópová analýza rôznych typov HCV sekvencii II) chronickej HAH8H od plat, darcov sekv. regiónu) NS5 12251-2313)
Vzorka ip peptid IIA S/CO peptid
6.36
S o
£ (3’ MT56(ls a lb) 7
J
Typovo závislé
6.89
Príklad 6
Boli vykonané imunoskúšky kvôli stanoveniu, ktoré peptidy by mohli vzájomne súťažiť v naviazaní k protilátkam. Boli syntetizované tri súpravy krátkych polypeptidov z jadrových NS4 a NS5 regiónov rôznych typov HCV sekvencií. Tieto polypeptidy pokrývajú sekvenčné regióny od aminokyselín 1689-1695, 1696-1702 a 1711-1917. Inhibičné skúšky boli vykonané prídavkom 10 pg uvedených polypeptidov k vzorke a inkubované pri 37 °C jednu hodinu a potom boli vykonané ELISA skúšky, ako je opísané. Ak bola nájdená inhibícia viac ako 50 % protilátkovej väzby, polypeptid bol pokladaný za inhibičný. Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 15.
CKIIW-1C1
KtMrvvHO
CHtIN-lCÍ ewM-iw
IBtQ'MVAQ iTexiwcx
ICOMHAQ estn-iís eHiii-icc
CHIIN'K? C«ltx-K«
CH1W-1W
n. >», i· n u t it
Príklad 7
Typovo alebo typovo-klastrovo špecifické epitopy uvedené v tabuľke 16, sa použili v skúške ELISA v príklade 5 na testovanie 13 klinických vzoriek od non-A, non-B hepatitis pacientov (10 platených darcov, 3 transfúziou infikovaní chronickí non-A, non-B pacienti). Tabuľka 17 ukazuje výsledky týchto skúšok. Každá klinická vzorka bola odskúšaná na reaktivitu s 12 rozličnými peptidmi zodpovedajúcimi daným regiónom (aa 67-84, 1689-1718, alebo 22812313 ) predstavujúcim rozličné, typovo špecifické , alebo typovo-klastrové epitopy. Každá vzorka poskytuje reaktívnu (NR), slabo reaktívnu (WR) alebo reaktívnu (R) odpoveď s každým klasifikovaným peptidom. Tieto výsledky predpovedajú HCV genotyp pre každú vzorku, ktorá koreluje s HCV genotypom určeným PCR, uvedeným v stípčeku na pravej strane.
Tanolta 1«
BCV hlavni typovo ipaeifíeki apitópy v jadra, NSI a regiónoch
Hlavni kont, igltópy
Jadrový raglóni (1S-4S) rmuyQcvKTNecQtvoevi Limonu (mcv-d
Hlt Htglát· (H2S-H3») |ac>ivimurv(|Mcv-t| «MS Ragtón
Typovo iPec. apxtóŕv
Konrarvovaní tplcópy (*>-·«]
MjTfwŕ (la,lb.1·.
t (4)
HUVLT (li.lbl
K I f2a,2to>
Hcv-i· (cnHtäil
HCV-1B IcMtOhlI
HCV-2· a 2» CMKAM
ikoemanckAsm [26?2-2 >07] | «oSHccTtacmtavtTr] hct-i·
Tabula· 1?

Claims (15)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Spôsob klasifikácie hepatitis C vírusu, pozostávajúci z nasledovných krokov :
    a) poskytnutie biologickej vzorky,
    b) kontakt vzorky s prvým činidlom, obsahujúcim kombináciu polypeptidov obsahujúcich typovo špecifické epitopy špecifické pre prvý typ hepatitis C vírusu za podmienok, ktoré umožňujú tvorbu prvého komplexu epitop - protilátka; a
    c) vyhodnotenie na prítomnosť prvého komplexu epitop -
    - protilátka vo vzorke vyznačujúci sa tým, že epitopy sú zvolené z epitopov umiestnených v jadrovej oblasti HCV a nachádzajú sa medzi aminokyselinovými zvyškami 67 a 84, epitopov umiestnených v NS4 oblasti HCV a nachádzajú sa medzi aminokyselinovými zvyškami 1689 a 1718 a epitopov umiestnených v NS5 oblasti HCV a nachádzajú sa medzi aminokyselinovými zvyškami 2281 a 2313, kde aminokyselinové zvyšky sú číslované vzhľadom na HCV-1, alebo epitopov z homológnych oblastí iných typov hepatitis C vírusov a kde epitopy majú dĺžku od 5 do 15 aminokyselín.
  2. 2. Spôsob podľa nároku 1, pozostávajúci z nasledovných krokov: d) kontakt vzorky s druhým činidlom obsahujúcim ďalší typovo - špecifický epitop špecifický pre druhý typ vírusu hepatitis C za podmienok, ktoré umožňujú tvorbu druhého komplexu epitop - protilátka, a
    e) vyhodnotenie na prítomnosť druhého komplexu epitop -
    - protilátka vo vzorke, vyznačujúci sa tým, že epitopy sú zvolené z epitopov nešpecifických oblastí NS4, alebo NS5 vírusu HCV.
  3. 3. Spôsob na detekciu konkrétneho typu hepatitis C vírusu pozostávajúci z nasledovných krokov:
    a) poskytnutie biologickej vzorky,
    b) kontakt vzorky s činidlom obsahujúcim kombináciu polypeptidov obsahujúcich typovo špecifické epitopy špecifické pre daný typ hepatitis C vírusu za podmienok, ktoré umožňujú tvorbu komplexu epitop - protilátka; a
    c) vyhodnotenie na prítomnosť komplexu epitop - protilátka vo vzorke, vyznačujúci sa tým, že epitopy sú zvolené z oblastí umiestnených medzi aminokyselinovými zvyškami 67 a 84, 1689 a 1718 a 2281 a 2313 HCV -1, alebo homológnych oblastí iných typov hepatitis C vírusov a epitopy majú dĺžku od 5 do 15 aminokyselín.
  4. 4. Spôsob podľa ktoréhokoľvek nároku 1 až 3, v y značujúci sa tým, že epitopy sú zvolené zo súboru zahrnujúceho aminokyselinové sekvencie: PEGRTWAQ, STGKSWGK, SEGRSWAQ, CSQHLPY, CASHLPY, CASRAAL, CASKAAL, SQHLPY, ASRAAL, ASKAAL, FAQALPVW, FPPQALPPW, PDYEPPWHG, PDYVPPVVHG, PDYQPATVAG, PGYEPPTVLG, PDYRPPVVHG.
  5. 5. Spôsob klasifikácie hepatitis C vírusu, vyznačujúci sa tým, že pozostáva z nasledujúcich krokov:
    a) poskytnutie biologickej vzorky,
    b) kontakt vzorky s kombináciou protilátok špecifických pre prvý epitop, ako je definované v ktoromkoľvek nároku 1 až 4 za podmienok, ktoré umožňujú tvorbu komplexu epitop - protilátka; a
    c) vyhodnotenie na prítomnosť komplexu epitop - protilátka vo vzorke.
  6. 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, žc pozostáva z nasledujúcich krokov: d) kontakt vzorky s druhým činidlom, obsahujúcim kombináciu protilátok špecifických pre druhý epitop, ako je definovaný v ktoromkoľvek nároku 1 až 4 za podmienok, ktoré umožňujú tvorbu komplexu epitop - protilátka; a
    e) vyhodnotenie na prítomnosť komplexu druhý epitop - protilátka vo vzorke.
  7. 7. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že vyhodnotenie sa vykoná pomocou kompetitívneho testu, sendvičového testu, imunofluorescenčncho testu, rádioimunologického testu, alebo enzymaticky-viazaného imunosorbentového testu.
  8. 8. Súprava polypeptidov, vyznačujúca sa t ý m , žc obsahuje viac ako jeden polypeptid a kde jeden z polypeptidov obsahuje typovo-špecifický epitop odvodený od aminokyselinovej sekvencie s rozsahom aminokyselín 67 až 84 jadrovej oblasti hepatitis vírusu HCV-1 a homológnych regiónov iných typov hepatitis C vírusov a kde epitopy majú dĺžky od 5 do 15 aminokyselín.
  9. 9. Súprava polypeptidov podľa nároku 8, v y z n a čujúca sa tým, že polypeptidy sú zvolené z polypeptidov majúcich sekvencie PEGRTWAQ, STGKSWGK, alebo SEGRSWAQ.
  10. 10. Súprava polypeptidov, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje viac ako jeden polypeptid a kde jeden z polypeptidov obsahuje typovo-špecifický epitop odvodený od aminokyselinovej sekvencie rozprestierajúcej sa medzi aminokyselinami 1689 až 1718 NS4 oblasti hepatitis vírusu HCV-1 a homológnych oblastí iných typov HCV a kde epitopy majú dĺžky od 5 do 15 aminokyselín.
  11. 11. Súprava polypeptidov podľa nároku 10, vys a t ý m , že polypeptidy sú zvolené majúcich
    CASRAAL, sekvencie CASKAAL,
    CSQHLPY,
    SQHLPY, značujúca z polypeptidov CASHLPY, ASRAAL, alebo ASKAAL.
  12. 12. Súprava polypeptidov, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje viac ako jeden polypeptid a kde jeden z polypeptidov obsahuje typovo-špecifický epitop odvodený od aminokyselinovej sekvencie rozprestierajúcej sa medzi aminokyselinami 2281 až 2313 NS5 oblasti hepatitis vírusu HCV-1 a homológnych oblastí iných typov HCV a kde epitopy majú dĺžky od 5 do 15 aminokyselín.
  13. 13. Súprava polypeptidov podľa nároku 12, vyznačujúca sa tým, že polypeptidy sú zvolené z polypeptidov majúcich sekvencie FAQALPVW, FPPQALPPW, PDYEPPVVHG, PDYVPPVVHG, PDYQPATVAG, PGYEPPTVLG a PDYRPPVVHG.
  14. 14. Reagenčné činidlo pozostávajúce z kombinácie polypeptidov obsahujúcich typovo-špecifické epitopy, vyznačujúce sa tým, že epitopy sú zvolené z oblastí umiestnených medzi aminokyselinovými zvyškami 67 a 84, 1689 a 1718 a 2281 a 2313 HCV-1 alebo homológnych regiónov iných typov hepatitis C vírusu a kde epitopy majú dĺžky od 5 do 15 aminokyselín.
  15. 15. Reagenčné činidlo podľa nároku 14, vyznačujúce s kyselinových SEGRSWAQ, CASKAAL, FAQALPVW,
    PDYVPPVVHG, PDYQPATVAG, PDYRPPVVHG.
    a t ý m , že epitopy sú zvolené z aminosekvencií PEGRTWAQ,
    CSQHLPY,
    SQHLPY,
    CASHLPY,
    ASRAAL, FPPQALPPW,
    STGKSWGK, CASRAAL, ASKAAL, PDYEPPVVHG,
    PGYEPPTVLG a
SK1359-95A 1993-05-10 1994-05-09 Spôsob klasifikácie hepatitis C vírusu a činidlá na použitie pri tomto spôsobe SK282543B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6040093A 1993-05-10 1993-05-10
PCT/US1994/005151 WO1994027153A1 (en) 1993-05-10 1994-05-09 Methods of typing hepatitis c virus and reagents for use therein

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK135995A3 SK135995A3 (en) 1996-09-04
SK282543B6 true SK282543B6 (sk) 2002-10-08

Family

ID=22029220

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1359-95A SK282543B6 (sk) 1993-05-10 1994-05-09 Spôsob klasifikácie hepatitis C vírusu a činidlá na použitie pri tomto spôsobe

Country Status (19)

Country Link
US (3) US6054264A (sk)
EP (1) EP0698216B2 (sk)
JP (1) JP3645904B2 (sk)
KR (1) KR100330278B1 (sk)
CN (1) CN1129795C (sk)
AT (1) ATE281647T1 (sk)
CZ (1) CZ294629B6 (sk)
DE (1) DE69434117T3 (sk)
DK (1) DK0698216T4 (sk)
ES (1) ES2232815T5 (sk)
GE (1) GEP20012421B (sk)
HU (1) HU224513B1 (sk)
PL (3) PL175338B1 (sk)
PT (1) PT698216E (sk)
RO (1) RO115471B1 (sk)
RU (1) RU2158928C2 (sk)
SK (1) SK282543B6 (sk)
UA (1) UA46707C2 (sk)
WO (1) WO1994027153A1 (sk)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2123875C (en) 1991-11-21 2005-05-24 Peter Simmons Hepatitis-c virus testing
EP1004670B1 (en) 1993-04-27 2012-04-11 Innogenetics N.V. Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents
US7255997B1 (en) 1993-04-27 2007-08-14 N.V. Innogenetics S.A. Sequences of hepatitis C virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents
DE69434117T3 (de) * 1993-05-10 2009-10-08 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc.(n.d.Ges.d.Staates Delaware), Emeryville Verfahren zur typisierung von hepatitis c viren und dafür zu verwendende reagenzien
US7070790B1 (en) 1993-06-29 2006-07-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 and core genes of isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines
US5882852A (en) * 1993-06-29 1999-03-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Hepatitic C virus (HCV) core gene nucleotide sequences and related methods of detecting major and minor genotypes of HCV isolates
DE19504302A1 (de) * 1995-02-09 1996-08-14 Boehringer Mannheim Gmbh Methode zur serologischen Typisierung mittels typspezifischer Antigene
WO1996034013A1 (fr) * 1995-04-28 1996-10-31 Srl, Inc. Compose peptidique antigenique et methode de dosage immunologique
US6514731B1 (en) 1996-05-24 2003-02-04 Chiron Corporation Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens
US7052830B1 (en) * 1998-06-09 2006-05-30 Branch Andrea D Hepatitis C virus peptides and uses thereof
WO2000031130A1 (en) * 1998-11-20 2000-06-02 Bio Merieux Synthetic polypeptides corresponding to the hepatitis c virus (hcv) and applications
US6995299B2 (en) * 1999-11-02 2006-02-07 University Of Connecticut Propagation of human hepatocytes in non-human animals
US8124348B2 (en) 2000-08-23 2012-02-28 Jonathan Zmuda Oral fluid rapid assay for hepatitis C virus (HCV) antibodies using non-antibody labeling of IgA molecules recognizing HCV peptide epitopes
AU2002311897A1 (en) * 2001-05-09 2002-11-18 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid detection in pooled samples
US7196183B2 (en) * 2001-08-31 2007-03-27 Innogenetics N.V. Hepatitis C virus genotype, and its use as prophylactic, therapeutic and diagnostic agent
AU2003260578A1 (en) * 2002-04-04 2003-10-20 Achillion Pharmaceuticals, Inc. Hcv antiviral and cytotoxicity drug screening assay
WO2005010035A2 (en) * 2003-07-22 2005-02-03 Branch Andrea D Alternate reading frame polypeptides derived from hepatitis c and methods of their use
US20050075309A1 (en) * 2003-07-25 2005-04-07 Richard Storer Purine nucleoside analogues for treating Flaviviridae including hepatitis C
US8124747B2 (en) * 2003-08-29 2012-02-28 Innogenetics HCV clade and prototype sequences thereof
CA2552949C (en) 2004-01-07 2012-10-02 Third Wave Technologies, Inc. Determination of hepatitis c virus genotype
JP4533656B2 (ja) * 2004-04-28 2010-09-01 アボットジャパン株式会社 特異性の改良されたｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）抗体測定法
US7858752B2 (en) 2006-12-05 2010-12-28 Abbott Laboratories Recombinant antibodies against hepatitis C virus and methods of obtaining and using same
FR2984328B1 (fr) 2011-12-20 2016-12-30 Bio-Rad Innovations Procede de detection d'une infection par le virus de l'hepatite c
CN110261616B (zh) * 2019-04-30 2021-07-20 广东菲鹏生物有限公司 一种丙型肝炎病毒检测试剂盒

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4868105A (en) * 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5350671A (en) * 1987-11-18 1994-09-27 Chiron Corporation HCV immunoassays employing C domain antigens
EP0318216B2 (en) * 1987-11-18 2001-08-29 Chiron Corporation NANBV diagnostics
HUT54896A (en) * 1989-03-17 1991-04-29 Chiron Corp Process for producing aquous diagnosticum and vaccine of nanbv
US5106726A (en) * 1990-02-16 1992-04-21 United Biomedical, Inc. Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to HCV
JP2733138B2 (ja) * 1990-04-04 1998-03-30 カイロン コーポレイション 抗ｈｃｖ抗体の免疫アッセイに使用するｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）抗原の組合せ
US6190864B1 (en) * 1991-05-08 2001-02-20 Chiron Corporation HCV genomic sequences for diagnostics and therapeutics
DE69232871T2 (de) * 1991-06-24 2003-05-08 Chiron Corp Polypeptide des hepatitis c-virus (hiv)
EP0787807B1 (en) * 1991-08-27 2003-05-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Primers and probes for hepatitis C detection
US5427909A (en) * 1991-09-09 1995-06-27 Immuno Japan Inc. Oligonucleotides and determination system of HCV genotypes
CA2119013A1 (en) * 1991-09-16 1993-04-01 Richard R. Lesniewski Hepatitis c assay
CA2123875C (en) * 1991-11-21 2005-05-24 Peter Simmons Hepatitis-c virus testing
DE69334328D1 (de) 1992-07-16 2010-06-10 Advanced Life Science Inst Inc Antigene Peptide zur Gruppierung des Hepatitis-C-Virus, Kit damit und Verfahren zur Gruppierung unter Verwendung dieses Kits
WO1994011388A1 (en) * 1992-11-06 1994-05-26 Chiron Mimotopes Pty. Ltd. Support for the synthesis of modular polymers
EP0698101B1 (en) 1993-05-05 2004-11-03 Common Services Agency Hepatitis-c virus type 4, 5 and 6
DE69434117T3 (de) * 1993-05-10 2009-10-08 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc.(n.d.Ges.d.Staates Delaware), Emeryville Verfahren zur typisierung von hepatitis c viren und dafür zu verwendende reagenzien
US5885771A (en) * 1993-10-29 1999-03-23 Srl, Inc. Antigenic peptide compound and immunoassay

Also Published As

Publication number Publication date
HU224513B1 (hu) 2005-10-28
PL175360B1 (pl) 1998-12-31
UA46707C2 (uk) 2002-06-17
CZ294629B6 (cs) 2005-02-16
SK135995A3 (en) 1996-09-04
ATE281647T1 (de) 2004-11-15
US6416944B1 (en) 2002-07-09
EP0698216B1 (en) 2004-11-03
PL175338B1 (pl) 1998-12-31
US6416946B1 (en) 2002-07-09
HU9503219D0 (en) 1996-01-29
DK0698216T4 (da) 2009-06-15
CN1129795C (zh) 2003-12-03
DE69434117T3 (de) 2009-10-08
DE69434117D1 (de) 2005-01-20
EP0698216A1 (en) 1996-02-28
WO1994027153A1 (en) 1994-11-24
CN1125982A (zh) 1996-07-03
PT698216E (pt) 2005-03-31
RO115471B1 (ro) 2000-02-28
ES2232815T3 (es) 2005-06-01
ES2232815T5 (es) 2009-06-15
HUT73384A (en) 1996-07-29
PL311653A1 (en) 1996-03-04
DE69434117T2 (de) 2006-02-02
DK0698216T3 (da) 2005-02-14
JPH08510329A (ja) 1996-10-29
PL175342B1 (pl) 1998-12-31
KR100330278B1 (ko) 2002-08-19
CZ292995A3 (en) 1996-05-15
GEP20012421B (en) 2001-04-25
JP3645904B2 (ja) 2005-05-11
EP0698216B2 (en) 2009-02-25
RU2158928C2 (ru) 2000-11-10
US6054264A (en) 2000-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK282543B6 (sk) Spôsob klasifikácie hepatitis C vírusu a činidlá na použitie pri tomto spôsobe
US7728121B2 (en) Hepatitis-C virus type 4, 5 and 6
FI113967B (fi) Hepatitis-C-virustesti
JP2007197456A (ja) Ｎａｎｂｖの診断用薬
Chang et al. Artificial NS4 mosaic antigen of hepatitis C virus
CA2162250C (en) Methods of typing hepatitis c virus and reagents for use therein
CA2162134C (en) Hepatitis-c virus type 4,5 and 6
PT89041B (pt) Metodo de preparacao de diagnosticos e vacinas nanbv

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Expiry date: 20140509