SK280580B6 - Fragment dna, vektor a mikroorganizmus obsahujúci - Google Patents

Fragment dna, vektor a mikroorganizmus obsahujúci Download PDF

Info

Publication number
SK280580B6
SK280580B6 SK431-96A SK43196A SK280580B6 SK 280580 B6 SK280580 B6 SK 280580B6 SK 43196 A SK43196 A SK 43196A SK 280580 B6 SK280580 B6 SK 280580B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
carnitine
plasmid
rhizobium
butyrobetaine
genes
Prior art date
Application number
SK431-96A
Other languages
English (en)
Other versions
SK43196A3 (en
Inventor
Thomas Zimmermann
Josef Werlen
Original Assignee
Lonza A.G. (Dir.:Basel)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza A.G. (Dir.:Basel) filed Critical Lonza A.G. (Dir.:Basel)
Publication of SK43196A3 publication Critical patent/SK43196A3/sk
Publication of SK280580B6 publication Critical patent/SK280580B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/007—Carnitine; Butyrobetaine; Crotonobetaine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/743—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Agrobacterium; Rhizobium; Bradyrhizobium

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka rekombinantného genetického materiálu na expresiu génov látkovej premeny butyrobetaín/krotonobetaín-L-kamitínu, mikroorganizmov, ktoré obsahujú tento rekombinantný genetický materiál a použitie takýchto mikroorganizmov pri biotechnologickom spôsobe prípravy L-kamitínu.
L-Kamitín je prírodná látka podobná vitamínu s veľkým významom pri látkovej premene človeka. Podstatný je L-karnitín pri spracovaní mastných kyselín ako prenosná látka mitochondiálnej membrány, a tým ako prenášač metabolickej energie. Ak organizmus syntetizuje L-karnitín v nedostatočnom množstve, musí sa nutne dodávať v potrave na zamedzenie nedostatočného výskytu. Najmä pri výžive malých deti, ktoré ešte nie sú schopné samostatnej biosyntézy L-kamitínu, predstavuje L-karnitín podstatnú živinu.
Preparáty s L-kamitínom sa používajú ako aktívne zložky farmaceutických produktov. Dôležité je doplnenie L-karnitínom pri nedostatku karnitínu a ďalších terapeutických indikáciách, špeciálne pri ochoreniach srdca atď.
Doterajší stav techniky
Biosyntéza L-karnitínu pri vyšších organizmoch je známa, ďalšia funkcia pri látkovej premene a význam pre látkovú premenu sú predmetom intenzívneho skúmania. Okrem postupu reakcií látkovej premeny, ktorý sa opisuje pri mikroorganizmoch špeciálne rodu Pseudomonas (katalýza γ-butyrobetaínhydroxylázy, Lindstedt a spol., Biochemistry 16, 2181-2188, 1977), tvorí sa L-kamitín ako intermediát látkovej premeny určitých mikroorganizmov, napríklad Agrobacterium/Rhizobium sp.
Z európskej patentovej prihlášky EP-A-0 158 194 je známy spôsob mikrobiologickej prípravy L-kamitínu, kde sa vychádza napríklad z γ-butyrobetaínu, pri ktorom sa získa pomocou tradičných mikrobiologických selekčných postupov negatívny produkčný mutant L-karnityldehydrogenázy.
S týmto mutantom sa získajú relatívne dobré výťažky L-karnitínu v priebehu reakčného času 20 až 30 hodín. Ďalšie zlepšenie tohto postupu s ohľadom na objem-/časvýťažky nie je však pri tejto klasickej mikrobiologickej metóde možné.
Podstata vynálezu
Úlohou predloženého vynálezu je teda poskytnúť hospodárny biotechnologický spôsob výroby L-kamitínu, pri ktorom sa získa L-kamitín za podstatne kratší reakčný čas s ešte lepšími výťažkami.
Pokusy súvisiace s látkovou premenou γ-butyrobetaín/krotonobetaínu viedli k identifikácii piatich génov, bcoA/B. bcoC. bcoD. bcoE a bcoT. ktoré kódujú enzýmy reakčného postupu pri látkovej premene γ-butyrobetaín/krotonobetaínu a všeobecne sú obsiahnuté v operóne, tzv. butyrobetaín-L-kamitínovom operóne (bco). Tu znamená bcoA/B: gén y-butyrobetaín-CoA-syntetázy(bcoA)/krotonobetaín-CoA-syntetázy(bcoB), tzn. jediný gén, ktorý kóduje enzýmový produkt, ktorý má aktivitu ako γ-butyrobetaín-CoA-syntetázy, ako i aktivitu krotonobetain-CoA-syntetázy.
bcoC: gén γ-butyrobetaín-CoA-dehydrogenázy bcoD: gén krotonobetaín-CoA-hydrolázy bcoE: gén L-kamityldehydrogenázy a bcoT: potenciálny gén transportného systému.
Zistilo sa, že génové produkty génov bcoA/B. bcoC a bcoD sú zodpovedné za biosyntézu L-kamitínu, zatiaľ čo bcoE kóduje karnitíndehydrogenázu, ktorá ovplyvňuje odbúranie intermediátu látkovej premeny L-karnityl-CoA na betaín. Pri bcoT asi ide o gén, ktorý' kóduje prenášačový proteín transportného systému patriaceho k látkovej premene butyrobetaínu. Tento gén nie je pre biosyntézu L-kamitínu podstatný.
Predmetom predloženého vynálezu sú fragmenty DNA a vektory, zahrnujúce jeden alebo viac génov bcoC. bcoA/B a bcoD, ktoré kódujú enzýmy biosyntézy L-kamitínu pri látkovej premene γ-butyrobetaín/krotonobetaínu a obsahujúce prípadne ďalej potenciálny prenášačový gén bcoT.
Predmetom vynálezu sú ďalej mikroorganizmy, ktoré obsahujú tieto fragmenty DNA, prípadne vektory. Ďalším predmetom je biotechnologický spôsob výroby L-karnitinu použitím mikroorganizmov podľa vynálezu.
Označenie bcoA/B. bcoC. bcoD. bcoE a bcoT, ako sa tu opisuje a v nárokoch používajú, zahrnujú podľa definície tak gény organizmov divokého typu, ktoré kódujú enzýmy látkovej premeny γ-butyrobetaín/krotonobetaín-L-karnitínu s uvedenými enzýmovými aktivitami, najmä gény operónu butyrobetaín-L-kamitín(bco), ako aj ich ľunkčne ekvivalentné genetické varianty a mutanty, tzn. gény, ktoré sa odvodzujú od génov organizmov divokého typu, a ich genetické produkty sú v podstate vo svojej biologickej funkcii nezmenené. Funkčne ekvivalentné genetické varianty a mutanty tak zahrnujú napríklad zámeny báz v rámci známych degenerácií genetického kódu, ako môžu byť napríklad vytvorené umelo, aby sa genetická sekvencia prispôsobila na výhodné použitie kodónu určitého mikroorganizmu, v ktorom sa má uskutočniť expresia. Varianty a mutanty ďalej zahrnujú delécie, inzercie a substitúcie báz alebo kodónov, pokiaľ ponechajú génovým produktom takto zmenených génov ich biologické funkcie v podstate nezmenené. Tým sú zahrnuté napríklad génové sekvencie, ktoré preukazujú veľkú homológiu k sekvenciám divokého typu, napríklad väčšiu ako 70 % a za prísnych hybridizačných podmienok, napríklad pri teplotách medzi 50 a 70 °C a pri 0,5 až 1,5 M podielu soli, sú schopné hybridizácie s komplementom sekvencie divokého typu.
Pod pojmom transkripčná jednotka, ako sa tu používa, sa rozumejú sekvencie DNA, v ktorých sú gény usporiadané v jednom transkripčnom smere a pri spoločnej kontrole transkripcie sú prepisované do priebežného transkriptu, pričom sekvencie DNA majú okrem génov ešte genetické kontrolné prvky potrebné na génovú expresiu, ako promótory a väzbové miesta ribozómov.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1 ukazuje enzýmy reakčného postupu látkovej premeny γ-butyrobetaín, prípadne krotonobetaín-L-karnitinu.
Obr. 2 znázorňuje reštrikčnú mapu 10,6 kb fragmentu DNA z Rhizobium/Agrobacterium s operónom bco.
Obr. 3 a Obr. 4 znázorňujú plazmid pVK 1011, prípadne pAZlOl; šípky naznačujú polohu a orientáciu génov bco a génov beu (gény zužitkujúce betaín; EP-A-0 543 344). Inzerovaná časť plazmidov je znázornená hrubo.
Obr. 5 znázorňuje plazmid pCC49 ako možný východiskový materiál na prípravu hostiteľského kmeňa recA‘.
Obr. 6 ukazuje konštrukčnú schému pre plazmidy pVKlOl 1, pAZlOl, pVK 100qapAZ7.
Obr. 7 ukazuje konštrukčnú schému pre hostiteľský kmeň recA.
Ako východiskový materiál na izoláciu génov bcoA/B. bcoC. bcoD a bcoT na postup reakcií pri látkovej premene γ-butyrobetain/krotonobetaín-L-kamitínu môžu slúžiť všetky mikroorganizmy, ktoré látkovo premieňajú butyrobetaín a/alebo krotonobetain podľa obr. 1. Príklady vhodných kmeňov sú mikroorganizmy rodov Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium a Agrobacterium/Rhizobium, pričom výhodné sú uvedené nakoniec. Príkladom výhodného mikroorganizmu rodu Agrobacterium/Rhizobium je mikroorganizmus druhu Agrobacterium/Rhizobium sp. HK4 (DSM 2938), ako sú už opísané v EP-A-0 158 194. Zvlášť výhodne sa používajú mikroorganizmy, ktoré sú negatívne vzhľadom na kamitíndehydrogenázu, teda napríklad nemajú žiadny alebo majú len defektný gén bcoE (potom označovaný tiež ako bcoE'). Príklady výhodných mikroorganizmov s negatívnou karnitíndehydrogenázou sú mikroorganizmy druhu Agrobacterium/Rhizobium sp. HK13 (DSM 2903) a HK1331 b (DSM 3225), ktoré sú už opísané v EP-A-0 158 194, alebo druhu Agrobacterium/Rhizobium sp. HK1349 (DSM 3944), ktorý je opísaný v EPA-0 543 344.
Gény bcoA/B. bcoC. bcoD a bcoT na priebeh reakcií pri látkovej premene γ-butyrobetaín/krotonobetaín-L-karnitínu sa môžu lokalizovať v chromozóme mikroorganizmu tým, že sa mikroorganizmy podrobia napríklad transpozon-inzerčnej mutagenézii, a tým sa gény látkovej premeny γ-butyrobetaín/krotonobetaín-L-kamitínu označia vhodnou značkou, napríklad kanamycin-(Km)-rezistenciou. Tým sa potom môžu izolovať takto označené mutanty, ktoré už nemôžu zužitkovať intermediáty látkovej premeny butyrobetaínu. Takto je možné gény látkovej premeny γ-butyrobetaín/krotonobetaín-L-kamitínu identifikovať a priradiť im ich funkciu. Označené gény sa môžu potom klonovať a bližšie charakterizovať pomocou vhodných reštrikčných enzýmov. Izoláciu intaktných génov, prípadne fragmentov DNA podľa vynálezu, je možné potom uskutočniť tak, že sa vyjde z génovej banky zodpovedajúceho nemutovaného mikroorganizmu, z ktorej sa môžu gény bco alebo fragmenty z toho známym spôsobom izolovať a identifikovať pomocou hybridizácie so získanými klonovanými génmi kmeňa podrobeného mutagenézie. Získané gény sa potom môžu do žiaducich vektorov klonovať a mapovať pomocou reštrikčných enzýmov.
Za biosyntézu L-karnitínu sú zodpovedné len gény bcoA/B. bcoC a bcoD. Preto je tiež na produkciu L-kamitínu potrebná len prítomnosť týchto génov. V závislosti od zvolených východiskových podmienok, napríklad od zvoleného východiskového materiálu alebo od zvoleného produkčného kmeňa, môžu fragmenty DNA alebo vektory, ktoré sa použili pri produkcii L-karnitínu, obsahovať jeden alebo viac génov biosyntézy L-kamitínu.
Pokiaľ je to žiaduce, môžu DNA fragmenty a vektory podľa vynálezu okre génov bcoA/B. bcoC a bcoD tiež zahrnovať potencionálny trasnsportný gén bcoT.
Prítomnosť génu L-kamityldehydrogenázy, teda génu bcoE. je nežiaduca, pretože v jeho prítomnosti sa uskutočňuje odbúranie L-kamitinu. Prítomnosť defektného bcoE génu (bcoE1') ie však neškodná.
Účelne sa nachádzajú gény na biosyntézu L-karnitínu, teda bcoC. bcoA/B a bcoD a prípadne potenciálny transportný gén bcoT. na použitie pri výrobe L-kamitínu spoločne na jednom fragmente DNA alebo molekule vektora. Výhodne sa nachádzajú v konvencionálnom 5'-3'- smere po smere génovoregulačných prvkov v poradí bcoC. bcoA/B a bcoD. prípadne bcoC, bcoA/B. bcoD. bcoT a v jedinej definovanej transkripčnej jednotke, zodpovedajúcej usporiadaniu v prírodnom operóne butyrobetaín-L-karnitinu. Gény bcoC. bcoA/B. bcoD a bcoT takejto transkripčnej jednotky sa môžu charakterizovať napríklad zodpovedajúcimi štepmi reštrikčnej mapy obr. 2.
Transkripcia prípadne expresia génov bco sa účelne uskutočňuje pod kontrolou výhodne silného vhodného promótora Voľba promótora závisí od žiaducich podmienok expresie, napríklad od toho, či je žiaduca konštitutívna alebo indukovaná expresia alebo závisí od mikroorganizmu, v ktorom sa má expresia uskutočniť. Vhodným promótorom je napríklad promótor Pbco prírodného operónu butyrobetaín-L-kamitinu. Ak sa uskutočňuje izolácia génov bco zodpovedných za biosyntézu L-kamitinu napríklad z mikroorganizmu s defektným génom bcoE (bcoE'k môže sa napríklad výhodne z týchto mikroorganizmov izolovať a klonovať celý bco-operón s bcoE'-génom a príslušnými génovoregulačnými prvkami, a potom sa použije na produkciu L-kamitínu vo vhodných mikroorganizmoch. Takáto transkripčná jednotka s mutovaným bcoE-génom. ktorá sa môže izolovať napríklad z Rhizobium/Agrobacterium HK1349, sa prípadne taktiež môže charakterizovať pomocou reštrikčnej mapy uvedenej na obr. 2, keď je defekt v bcoE spôsobený napríklad iba bodovou mutáciou a netýka sa žiadneho miesta štiepenia. Ďalšími promótormi vhodnými na expresiu sú napríklad promótory PNra, Psl (M. Labes a spol., Gcnc, 89, 37-46, 1990), trp-promótor (Amann a spol., Gene, 25, 167-178, 1983), lac-promótor (Amanma spol., Gene, 25, 167-178, 1983) a tac-promótor, hybrid z menovaných trp- a lac-promótorov, ktorý sa môže použiť ako konštitutívny alebo indukovateľný promótor (Russell ¢.,, Bennett, Gene, 20, 231 - 243, 1982).
Na použitie pri výrobe L-karnitínu vo vhodnom pro- . dukčnom kmeni sa fragmenty DNA podľa vynálezu, ktoré zahrnujú menované bco-gény, výhodne spoločne v jedinej transkripčnej jednotke, zabudujú účelne pomocou známych techník do známych vhodných vektorov, najmä do expresných vektorov, napríklad fágov alebo plazmidov. Ako vektory sa môžu použiť autonómne a samoreplikujúce vektory alebo tiež tzv. integračné vektory. Pod integračným vektorom sa pritom rozumie vektor, napríklad plazmid, ktorý má aspoň jednu homológnu sekvenciu ku genómovej sekvencií kmeňa recipienta a pomocou homológovej rekombinácie s touto sekvenciou dovolí prepašovanie cudzích génov do genómu kmeňa recipienta. Výhodne sa používajú autonómne a samoreplikujúc vektory.
V závislosti od druhu zvolených vektorov sa môžu gény pre enzýmy biosyntézy L-kamitínu exprimovať v rôznych organizmoch. Ako vektory sa hodia jednak vektory so špecifickým hostiteľským spektrom, tak ako aj vektory so širokým hostiteľským spektrom „broad host range“) a opísané integračné vektory.
Ako vektory „broad host range“ sa môžu použiť všetky vektory, ktoré sú vhodné pre gram-negatívne baktérie. Príklady takýchto „broad host range“-vektorov sú pVKlOO (Knauf a Nester, Plasmid, 8, 45 - 54, 1982), pMe285 (Haas a Itoh, Gene, 36, 27 - 36, 1985) a pTK240 (Bagdasarian a spol., Gene, 26, 273 - 282, 1983) alebo ich deriváty. Ako derivát pVKlOO sa môže napríklad použiť pVKlOOl, ako derivát pME285 napríklad pAZlO a ako derivát pKT240 napríklad pL032 (ako sa opisuje v EP-A-0 543 344).
V prípade Rhizobium-Agrobacterium sa ako integračné vektory môžu použiť vektory na báze pACYC184 alebo pBR322 (Comai a spol., Plasmid, 10, 21 - 30, 1983).
Týmto spôsobom sa napríklad získali plazmidy pVKlOOq, pVKlOll (obr. 3), pAZ7, pAZ7::beu, pAZlOl (obr. 4) apL041. Plazmid pVKlOOq sa uložil 16. II. 1993 do Nemeckej zbierky pre mikroorganizmy a bunkové kultúry GmbH, D-38124 Braunschweig, Mascheroderweg lb, v Rhizobium/Agrobacterium HK1349 pod depozitným číslom DSM 8726.
Na prípravu produkčných kmeňov na fermentáciu, tzn. kmeňov na výrobu L-karnitínu, sa musia DNA fragmenty, prípadne vektory podľa vynálezu, vložiť do žiaducich a na expresiu vhodných hostiteľských kmeňov. Účelne sa na to mikroorganizmy transformujú zvyčajným a známym spôsobom pomocou vektorov obsahujúcich fragmenty DNA podľa vynálezu. Mikroorganizmy potom môžu mať fragment DNA podľa vynálezu buď na molekule vektora, alebo integrovaný vo svojom chromozóme.
Ako produkčné kmene sú vhodné všetky mikroorganizmy, ktoré sú schopné z krotonbetaínu a/alebo γ-butyrobetaínu produkovať L-karnitín a ktorých schopnosť odbúravať (katabolizovať) L-kamitín je úplne alebo čiastočne zabránená. Mikroorganizmy, ktoré majú obmedzený katabolizmus L-kamitínu, sú napríklad kmene, ktoré sú kamitíndehydrogenáza-negatívne. Sú to teda kmene, v ktorých je karnitíndehydrogenázový gén bcoE vyradený napríklad mutáciou alebo deléciou, a/alebo kmene, ktoré sú L,D-karnitínracemáza-negatívne a L-karnitíndehydratáza-negatívne.
Vhodné hostiteľské kmene, výhodne kmene s veľkou substrátovou a eduktovou toleranciou, sú napríklad mikroorganizmy rodov Escherichia, Pseudomortas, Agrobacterium, Rhizobium, Comamonas a Rhizobium/Agrobacterium, pričom posledné sú výhodné. Mikroorganizmy uvedeného druhu Rhizobium/Agrobacterium sp. KH13, HK1331 b a HK1349, ako i druhu HK1349.4 (ako sa opisuje v EP-A-0 543 344) sú obzvlášť výhodné.
Navyše sa zistilo, že sa výťažok L-kamitínu môže ešte zlepšiť, ak sa schopnosť «kombinácie hostiteľského kmeňa, teda jeho rekombinančná tendencia a frekvencia, zníži. Tým sa obmedzí «kombinácia s vektorom na základe chromozomálnej homológie. Rekombinančná schopnosť hostiteľského kmeňa sa môže znížiť napríklad známym spôsobom cielenou mutáciou jeho recA-génu (rec-mutácia). Obzvlášť výhodné mikroorganizmy so zníženou rekombinantnou schopnosťou sú mikroorganizmy druhu Rhizobium-Agrobacterium sp., napríklad kmene podľa vynálezu, získané ako sa opisuje, druhu Rhizobium-Agrobacterium HK1349.49.
Vhodné produkčné kmene sú tak napríklad mikroorganizmy druhu Rhizobium/Agrobacterium HK1349, HK1349.4 a HK1349.49, ktoré práve obsahujú plazmid pVKlOOq, pVKlOOl, pAZ7, pAZ7::beu, pAZlOl alebo pL041.
Izolácia transformovaných hostiteľských kmeňov (produkčných kmeňov) sa môže uskutočniť zo selektívneho živného média, ku ktorému sa pridá antibiotikum, proti ktorému sú kmene rezistentné, pomocou markerového génu na vektore alebo fragmente DNA. Ak sa ako produkčné kmene použijú mikroorganizmy podľa ΕΡ-Λ-0 543 344, tzn. mikroorganizmy, ktoré sú vo svojom chromozomálnom géne, ktotý kóduje zužitkovanie betanínu, mutované a transformované plazmidom, ktorý obsahuje gén kódujúci zužitkovanie betaínu, môže sa uskutočniť selekcia tiež vzhľadom na zužitkovanie betaínu. Príklady mikroorganizmov schopných selekcie vzhľadom na zužitkovanie betaínu sú už zmienené HK 1349.4 a HK1349.49, ktoré napríklad obsahujú plazmid pL041, pAZlOl, pAZ7::beu alebo pVKlOll.
Biotechnologická príprava L-karnitínu sa uskutoční použitím mikroorganizmov, ktoré obsahujú fragmenty DNA, prípadne vektory podľa vynálezu. Spôsob prípravy L-kamitínu sa uskutoční známymi postupmi, napríklad ako sú opísané v EP-A-0 158 194, podľa ktorého sa vychádza napríklad z γ-butyrobetaínu v prítomnosti vhodného zdroja uhlíka a dusíka. Ako zdroj uhlíka a dusíka sa môžu použiť napríklad glutamat, acetát a betaín alebo glycerín a betaín. Ak sa biotechnologická príprava uskutočňuje pomocou mikroorganizmov selektovaných vzhľadom na zužitkovanie betaínu, použije sa betaín ako jediný zdroj dusíka.
Fermentácia a nasledujúca izolácia L-kamitínu sa môže uskutočniť spôsobom podobným, ako je opísané v EP-A-0 158 194.
Obmenou živín v médiu a prispôsobením fermentačných podmienok zvyčajným spôsobom na práve použitý mikroorganizmus sa môže ďalej zvýšiť výťažok L-karnitínu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Výroba transpozón-inzertných mutantov (Tn5) a ich fenotypová identifikácia
Divoký kmeň Rhizobium-ZAgrobacterium HK4 (DSM 2938, EP-B-0 158 194) sa prinúti selekčným tlakom vyvinúť spontánnu rezistenciu na streptomycín (Sm. 1000 pg/ml). Táto rezistencia bola stabilná preukázateľne cez 50 generácií bez selekcie a použila sa ako marker.
0,2 ml Tn5-donorovej kultúry z E. coli S17-l/pSUP2021 (R. Šimon a spol., Biotechnology, 1983, 1, 784 - 790) sa zmieša s 2 ml recipientovej kultúry HK4 a odstredí. Bunky sa premyjú v 0,9 % roztoku NaCI a resuspendujú v 100 μΐ 0,9 % roztoku NaCI. Konjugácia recipientového kmeňa s donorovým kmeňom sa uskutoční cez noc pri 30 °C na suchom živom agare. Vybrané bunky sa v zriedeniach rozotreli na selekčné médium pre recipient (SmR) a transpozón (neomycínová rezistencia NmR).
Získajú sa Tn5-mutanty na živnom agare so Sm (1000 pg/ml) a Nm (100 pg/ml). Fenotypová identifikácia mutantov sa uskutoční pomocou dôkazu nezužitkovania intermediátov látkovej premeny butyrobetaínu podľa obr. 1 ako zdroja uhlíka v minimálnom médiu.
Príklad 2
Klonovanie Tn5-značených fragmentov DNA z HL4-genómu
Izolovaná genómová DNA z Tn5-mutovaného HK4 (5 pg) sa úplne štiepi pomocou EcoRI (4 U/pg, kde U znamená jednotku). pBR325 (2,5 pg) (Gene, 1977, 2, 95-113) sa po úplnom štiepení s EcoRI spracuje s alkalickou fosfatázou. Po zmiešaní genómovej DNA a pBR325 s T4-DNAligázou (0,2 U/pg DNA) v 400 pl ligačného tlmivého roztoku (20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM DTT (ditiotreitol), 10 mM MgCl2, 0,6 mM ATP) a inkubáciou cez noc pri 12 °C sa získajú hybridné plazmidy.
Alikvotné časti ligačnej zmesi sa použijú na transformáciu (Cohen a spol., 1972, PNAS 69, 2110'- 2114) E. coli ED 8654 (Barek a spol., Mol. Gen. Genet., 146, 199 - 207, 1976). Transformanty sa podrobia selekcii na živnom médiu na rezistenciu na ampicilín (Ap, 100 pg/ml) a kanamycín (Km, 25 pg/ml). Všetky selektované hybridné plazmidy majú HK4-inzert, ktorý je označený Tn5. Inzerty sa mapujú na rôzne reštrikčné enzýmy podľa reštrikčnej mapy na obr.
2. Porovnanie reštrikčných máp potvrdilo transpozónovú
SK 280580 Β6 inzerciu v rovnakom genómovom fragmente v rade Tn5mutantov s rozdielnym fenotypom.
Potvrdenie tohto pozorovania je možné získať pomocou Southem Blot-hybridizácie („Gentechnische Methoden“, vydanej S. Bertramom a H. G. Gassnom, nakladateľstvo G. Fischer 1991, 219 a ďalšie) identicky štiepenej plazmidovej DNA a nasledujúcim clcktroforetickým rozdelením. Ako sondy slúžia subfragmenty tejto klonovanej DNA z transpozónmutantov.
Príklad 3
Vytvorenie genómovej HK4-génovej banky v lambda-fázach
DNA musí byť veľká 40 - 52 kb a miesto „cos-site“, aby sa mohla zbaliť do lambda-fágov. Na vytvorenie genómovej HK4-génovej banky v lambda-fázach sa použije cosmidvektor pVKlOO (Knauf a Nester, 1982, Plasmid 8, 45 - 54), ktorý je veľký 23 kb, a tým dovolí klonovanie fragmentov DNA medzi 17-29 kb.
pVKlOO sa štiepi s EcoRI. defosforyluje a liguje s HK4-DNA, ktorá je čiastočne rozštiepená s EcoRI. Ideálna koncentrácia EcoRI na parciálne štiepenie HK4-DNA sa zistila pomocou testu štiepenia ako 0,58 U/pg DNA, prípadne 0,02 U/pg reakčnej zmesi, pričom sa použilo 8,5 pg HK4-DNA v reakčnej zmesi. Fragmenty DNA sa v rozsahu veľkosti väčšom ako 17 kb izolujú z elektroforetických agarózových gélov. Ligácia sa uskutoční v 10 pl objeme s obsahom 100 ng cosmid-vcktora a 400 ng passenger-DNA. Potom sa uskutočni „In vzŕro-Packing“ podľa návodu výrobcu v mixe firmy Promega Biotec. v priebehu 2 hod. pri 25 °C. Po transfekcii E. coli S17-1 sa podrobí selekcii na Km-rezistenciu cosmid-vektora. Jedným nasadením sa získa cca. 5500 kolónií (individuálne klony). Kolónie génovej banky sa uchovávajú v 5 „batches“ po ca. 1000 klonov v mraziacom médiu (Nutrient Yeast Broth (kvasinkové živné prostredie), NYB, Oxoid a 50 % glycerín) pri -70 °C. Amplifikácia génovej banky sa uskutoční vždy s 50 pl týchto „batches“ v 10 ml NYB-kultúry cez noc a porcovanim.
Príklad 4
Screening génovej banky HK4-cosmid, identifikácia cosmidových klonov nesúcich bco-gény cez hybridizáciu kolónií, hybridizácia dot-blotting alebo priama komplementácia na HK-mutantoch
Ako sondy hybridizácie sa môžu priamo použiť klonované Tn5 značené fragmenty DNA.
Klony so zodpovedajúcimi sekvenciami DNA vykazujú hybridizačné signály a vedú ku komplementácii práve defektného génu v HK4-mutante. Krížové hybridizácie DNA z rôznych mutantov potvrdzujú nahromadenie viac génov látkovej premeny butyrobetaínu na fragmente DNA s veľkosťou 10,6 kb (obr. 2).
Hybridizácia kolónií sa uskutočňuje zvyčajným spôsobom (S. Bertram a H. G. Gassen, 1991, tamtiež, 221 a ďalší). Dot-blotting sa taktiež uskutočňuje známym spôsobom (S. Bertram a N. G. Gassen, 1991, tamtiež, 217 a ďalší).
Príklad 5
Komplementácia HK-mutantov
Po presnej lokalizácii jednotlivých génov látkovej premeny butyrobetaínu s ohľadom na molekulárne veľkosti na základe identifikovaných peptidových reťazcov sa mohla docieliť komplementácia jednotlivých mutantov pomocou práve sa vyskytujúcich génových štiepení.
Práve expresný plazmid pVK100::HK-DNA sa vpraví konjugáciou z E. coli S17-1 do kmeňov Rhizobium-ZAgrobacterium sp. HK4 podľa príkladu 1, ktoré majú mutácie pre rozdielne kroky látkovej premeny (pozri obr. 1 ). Selekcia sa uskutočni proti prolínovej (pro)-auxotrofii donoru a na rezistenciu vektora na antibiotiká (KmRTc (tetracyklín)R).
Príklad 6
6.1 Klonovanie bco-fragmentu z kmeňa HK1349 (DSM 3944) a potomkov
Na dosiahnutie génovo-dávkových účinkov a zvýšenie produktivity na produkčnom kmeni sa klonuje bco-operón z HK 1349 (DSM 3944, EP-A-0 543 344). V tomto kmeni je celý bco-operón úplne obsiahnutý, no prvý gén, bcoE. pre kamitín-CoA-dehydrogenázu je mutovaný. Fragment DNA získaný z tohto kmeňa s bco-operónom je tým ideálny na zvyšovanie produktivity z dôvodu veľkého počtu kópií expresných vektorov.
Klonovanie sa uskutočnilo známym spôsobom v E. coli S17-1 podľa príkladu 3 EP-A-0 543 344. Na tento účel sa izoluje bco-operón 10,6 kb veľký z génovej banky HK1349 a liguje do pVKlOO. Z toho vznikne plazmid pVKlOOq (pozri konštrukčnú schému podľa obr. 6). Selekcia sa uskutoční v E. coli S17-1 na NYB Km (25 pg/ml). Identifikácia správneho inzertu sa darí na HK-mutantoch podľa metódy opísanej v príklade 5. DNA z HK1349 štiepená EcoRI sa rozdelí elektroforeticky a z gélu sa izolujú fragmenty v rozmedzí veľkosti okolo 10,6 kb. Izolované fragmenty sa ligujú do pVKlOO štiepenom v EcoRI.
Touto zmesou hybridných plazmidov sa transformuje E. coli S17-1 (prolín-auxotrofný) a podrobí selekcii na živnom agare Km (25 pg/ml). Identifikovanie správneho klonu hybridného plazmidu z vektora a fragmentu DNA 10,6 kb nesúceho bco-operón sa docieli pomocou „patch-mating“ na butyrobetaín-CoA-syntetáza-negatívnom mutante (HK4V4); na minimálnom médiu s 0,2 % (hmotnosť/objcm) butyrobetaínu ako zdroja uhlíka a dusíka. Správny kloň je schopný po takomto konjugatívnom prenose do mutantu kom? plementovať bunky pri zužitkovani tohto zdroja uhlíka. Takto identifikovaný kloň pVKlOOq slúži priamo ako produkčný plazmid alebo ako rezervoár fragmentu DNA s bco-operónom na ďalšie subklonovanie.
6.2 Vytvorenie pAZlOl, pAZ7, pVKlOll a pVKlOOq, pL041 apAZ::beu
Vytvorenie pAZlOl, pAZ7, pVKlOll a pVKlOOq sa uskutoční podľa schémy vytvorenia na obr. 6. Pri vytvorení pL041 sa vychádza z pL032 (EP-A-0 543 344) a použije sa inzercia bco-génov (10,6 kb veľký fragment EcoRI/EcoRI). Pri vytvorení plazmidu pAZ7::beu sa vychádza z pAZ7 (obr. 6) a použije sa inzercia beu-génov (3 kb veľký fragment Pstl/Pstl. EP-A-0 543 344). Použijú sa zodpovedajúce reštrikčné enzýmy s 3-5 U/pg DNA podľa údajov výrobcov. Plazmid pVKlOOq sa získa inzerciou bco-génov do pVKlOO (Knauf a Nester, tamtiež). Východiskový plazmid pVKlOOsl (schéma vytvorenia obr. 6) sa získa Eco-RI-delečnými klonovaniami plazmidu pVKlOOs (EP-A-O 543 344).
Príklad 7
Vpravenie recA-mutácie do HK 1349.4
7.1 Identifikácia klonu génovej banky kódujúceho recA
Pomocou metódy hybridizácie kolónií (S. Bertram a H. G. Gassen, 1991, tamtiež, 221 a ďalší) sa skúma genómová HK4-cosmid-génová banka na recA-kóduiúce klony. Ako sonda na hybridizáciu slúži klonovaný rec-gén z Rhizobium leguminosarum (W. Selbitschka a spol., Mol. Gen. Genet., 299, 1991, 86-95). Označený cosmidklon sa izoluje a Eco
RI-DNA-inzertfragmenty získané po štiepení EcoRI sa skúmajú pomocou Southem Blot-hybridizácie proti recA-sonde (S. Bertram a H. G. Gassen, 1991, tamtiež, 219 a ďalší) na recA-homológnei sekvencii. Takto označený EcoRI-fragment sa liguje do rovnako štiepeného vektora pVKlOO. So vzniknutým hybridným plazmidom pVKlOOrl sa na premnoženie DNA transformujú bunky E. coli S17-1.
7.2 Vloženie génu pre kanamycín-rezistenciu do HK1349.4 na inaktiváciu chromozomálneho recA-génu
EcoRI-fragment 11,0 kb veľký sa preklonuje z pVKlOOrl do pACYC184 (A. C. Y. Chang a S. N. Cohen, J. Bacteriol., 134, 1978,11411156), ktorý sa štiepil EcoRI.
Podľa zistenej reštrikčnej mapy sa klonuje štiepený Bglll-Nrul subfragment veľký 3,1 kb, ktorý sa pri Southem Blot-hybridizácii označil proti recA-sonde. do vektora pWS233, štiepený BamHI-Hindlll. pWS233 je „gene replacemenť vektor (vektor výmeny génov) a opisuje sa autormi W. Selbitschka a spol., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38, 1993,615-618.
Do miesta štiepenia Xhol výsledného plazmidu pCC45 sa klonuje fragment Xhol-DNA z Tn5 (pSUP2021, R. Šimon a spol., Biotechnology, 1, 1983, tamtiež), ktorý kóduje Km-rezistenciu. Z toho vznikne pCC49. Podľa postupu W. Selbitschka a spol., 1993, tamtiež, sa uskutoční „gene replacement“ takto:
ml exponenciálnej kultúry HK1349.4 sa dajú spolu s 1 ml exponenciálnej donom vej kultúry (S 17-l/pCC49), odstredia a premyjú s 0,9 % roztokom NaCl. Bunky sa inkubujú v 50 μΐ NYB na živnom agare cez noc pri 30 °C. Potom sa bunky resuspendujú v 0,9 % roztoku NaCl a nanesú na selektívne médiá vo vhodnom zriedení. Získajú sa transkonjugáty Sm-rezistentného recipientu HK1349.4 na živnom agare so Sm (1000 pg/ml) a Nm (150 pg/ml) a tie vykazujú senzitivitu na 5 % sacharózu v komplexnom médiu, čo zodpovedá génom sacRB na „replacement“ vektora.
Získajú sa dvojnásobné rekombinácie po kultivácii selektovaných transkonjugátov bez selekčného tlaku na živnom agare s malou frekvenciou (10‘8): Po ca. 1 týždni sa môžu izolovať bunky, ktoré tolerujú 5 % sacharózu v médiu, zostali Nm-rezistentné, ale opäť sa stali gentamycín (Gm)-senzitívne (vektorový marker).
Tento fenotyp potvrdzuje alelovú markerovú výmenu a ukazuje na recA-mutáciu v HK1349.4. Pozoruje sa typický fenotyp (napr. UV-senzitivita atď.) recA-mutantov.
V takto získanom kmeni HK1349.4 je výrazne znížená tendencia chromozomálnej integrácie plazmidov s homológnymi sekvenciami (homológová rekombinácia). Kmeň je preto vhodným hostiteľom pre hybridné plazmidy pripravené v príklade 6.2.
Príklad 8
Biotransformácia
Biotransformácia sa uskutočňuje v trepacích bankách (100 ml) s bezdusikovým minimálnym médiom (MM, Kulla a spol., Árch. Microbiol., 1983, 135, str. 1 - 7), ktoré obsahuje 0,2 % (hmotnosť/objem) -butyrobetaínu (edukt) a ako zdroj uhlíka 0,4 % (hmotnosť/objem) glycerínu. Ako zdroj dusíka a dodatkový zdroj uhlíka sa pridá 0,2 % (hmotnosť/objem) L-glutamátu (pri negatívnych kmeňoch na zužitkovanie betaínu) alebo 0,2 (hmotnosť/objem) betaínu.
Ako produkčné kmene sa použijú kmene podľa vynálezu HK1349.4/pL041, HK1349.4/pVK1011, HK1349.4/pAZ7::beu, HK1349.4/pAZ101, HK1349/pVK100q a HK1349/pAZ7.
Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 1 v porovnaní s HK13-potomkami HK1349 (DSM 3944) a HK1349.4, ktoré sú známe z EP-A-0 543 344.
Tvorba L-kamitínu z γ-butyrobetaínu sa stanoví pomocou DTNB (5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoát)-metódy opísanej Bergmeyerom (H. K. Bergmeyer, 1974, Methoden der enzymatischen Analyse, nakladateľstvo Chemie, Weinheim, 1810 a ďalší).
Kmene Médium MM & glycerín Spec. aktivita mmol/l/h/OD
HK1349 (nie podľa vynálezu) & betaín 0,24
HK1349/pVK lOOq & betaín 0,36
HK1349/pAZ & betaín 0,49
HK1349 (nie podľa vynálezu) & L-glutamát 0,14
HK 1349.4 (nie podľa vynálezu) & L-glutamát 0,11
HK1349.4/L041 & L-glutamát 0,29
HK1349.4 (nie podľa vynálezu) & amónium 0,12
HK1349.4/pVK1011 & betaín 0,54
HK1349.4/pAZ7::beu & betaín 0,47
HK1349.4/pAZ101 & betaín 1,08
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (16)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Izolovaný fragment DNA obsahujúci jeden alebo viacej génov bcoC. bcoA/B a bcoD biosyntézy L-kamitínu, ktoré kódujú γ-butyrobetaín-CoA-dehydrogenázu (bcoC). γ-butyrobetaín/krotonobetaín-CoA-syntetázu bcoA/B). prípadne krotonobetaín-CoA-hydrolázu ŕbcoD), pričom je tento fragment DNA zvolený
    a) z 10,6 kb-EcoRI-ffagmentu, ako je inzerovaný v plazmide pVKlOOq, uloženom v Rhizobium/Agrobacterium HK1349 pod depozitným číslom DSM 8726, alebo subfragmcntov z toho a
    b) z fragmentov, ktoré hybridizujú s týmto 10,6 kb-EcoRl-fragmentom alebo so subfragmentami z toho a kódujú enzýmy s aktivitami γ-butyrabetaín-CoA-dehydrogenázy, γ-butyrobetaín/krotonobetaín-CoA-syntetázy, a/alebo krotonobetaín-CoA-hydrolázy.
  2. 2. Fragment DNA podľa nároku 1 dodatočne obsahujúci gén bcoT. priradený na látkovú premenu γ-butyrobetaínu/krotonobetaínu, ktorý kóduje potenciálny transportný proteín.
  3. 3. Fragment DNA podľa niektorého z nárokov 1 a 2, v ktorom sú gény bcoC. bcoA/B. bcoD a prípadne bcoT odvodené z mikroorganizmov rodov Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium a Rhizobium/Agrobacterium.
  4. 4. Fragment DNA podľa niektorého z nárokov 1 až 3, v ktorom sú gény operatívne spojené s genetickými kontrolnými prvkami potrebnými na expresiu.
  5. 5. Fragment DNA podľa niektorého z nárokov 1 až 4, v ktorom sú gény biosyntézy L-kamitínu usporiadané v poradí bcoC. bcoA/B a bcoD alebo, prípadne, bcoC, bcoA/B. bcoD a bcoT a sú ako jediná transkripčná jednotka.
  6. 6. Fragment DNA podľa niektorého z nárokov 4 a 5, v ktorom génovoregulačný prvok obsahuje promótor prírodného bco-operónu, Pbco.
  7. 7. Fragment DNA podľa ktorého z nárokov 1 až 6, v ktorom sú gény bcoC, bcoA/B. bcoD a bcoT charakterizované nasledujúcou reštrikčnou mapou:
    2 J t S 6 1 bcoC bcoA/B bcoD bco T
  8. 8. Vektor, obsahujúci fragment DNA podľa niektorého z nárokov 1 až 7.
  9. 9. Vektor podľa nároku 8, konkrétne plazmid pVKlOOq, ako je uložený v Rhizobium/Agrobacíerium HK 1349 pod depozitným číslom DSM 8726, plazmid pVKlOll, ako je charakterizovaný reštrikčnou mapou podľa obr. 3, a plazmid pAZlOl, ako je charakterizovaný reštrikčnou mapou podľa obr. 4.
  10. 10. Rekombinantný mikroorganizmus obsahujúci fragment DNA alebo vektor podľa niektorého z nárokov 1 až 9.
  11. 11. Mikroorganizmus podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že jeho schopnosť katabolizovať L-karnitín je úplne alebo čiastočne obmedzená.
  12. 12. Mikroorganizmus podľa niektorého z nárokov 10 a 11, vyznačujúci sa tým, že jeho schopnosť rekombinácie je znížená.
  13. 13. Mikroorganizmus podľa niektorého z nárokov 10 až 12 vybraný z mikroorganizmov rodov Escherichia, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, Comamonas a Rhizobium/Agrobacíerium.
  14. 14. Mikroorganizmus Rhizobium/Agrobacíerium HK 1349 obsahujúci plazmid pVKlOOq, ako je uložený pod depozitným číslom DSM 8726, plazmid pVKlOll, ako je charakterizovaný reštrikčnou mapou podľa obr. 3, alebo plazmid pAZlOl, ako je charakterizovaný reštrikčnou mapou podľa obr. 4, ako aj z takýchto mikroorganizmov odvodené genetické varianty a mutanty so schopnosťou biosyntézovať L-kamitín.
  15. 15. Mikroorganizmus Rhizobium/Agrobacíerium HK 1349.4 obsahujúci plazmid pVKlOOq, ako je uložený v Rhizobium/Agrobacíerium HK 1349 pod depozitným číslom 8726, plazmid pVKlOl 1, ako je charakterizovaný reštrikčnou mapou podľa obr. 3, alebo plazmid pAZlOl, ako je charakterizovaný reštrikčnou mapou podľa obr. 4, ako aj z takýchto mikroorganizmov odvodené genetické varianty a mutanty so schopnosťou biosyntézovať L-kamitín.
  16. 16. Spôsob biotechnologickej výroby L-kamitínu, vyznačujúci sa tým, že sa krotonobetaín a/alebo γ-butyrobetaín v prítomnosti vhodného zdroja uhlíka a dusíka fermentuje pomocou mikroorganizmu podľa niektorého z nárokov 10 až 15 a L-karnitín sa izoluje.
SK431-96A 1993-10-08 1994-10-07 Fragment dna, vektor a mikroorganizmus obsahujúci SK280580B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH303693 1993-10-08
CH3694 1994-01-06
PCT/EP1994/003317 WO1995010613A1 (de) 1993-10-08 1994-10-07 Gene für den butyrobetain/crotonobetain-l-carnitin-stoffwechsel und ihre verwendung zur mikrobiologischen herstellung von l-carnitin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK43196A3 SK43196A3 (en) 1996-10-02
SK280580B6 true SK280580B6 (sk) 2000-04-10

Family

ID=25683317

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK431-96A SK280580B6 (sk) 1993-10-08 1994-10-07 Fragment dna, vektor a mikroorganizmus obsahujúci

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5759824A (sk)
EP (1) EP0722500B1 (sk)
JP (1) JP3708543B2 (sk)
KR (1) KR100346293B1 (sk)
CN (2) CN1058523C (sk)
AT (1) ATE257515T1 (sk)
AU (1) AU7854694A (sk)
CA (1) CA2173115C (sk)
CZ (1) CZ288247B6 (sk)
DE (1) DE59410350D1 (sk)
FI (1) FI118568B (sk)
HU (1) HU220798B1 (sk)
NO (1) NO319058B1 (sk)
PL (1) PL180300B1 (sk)
RU (1) RU2133773C1 (sk)
SK (1) SK280580B6 (sk)
WO (1) WO1995010613A1 (sk)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2237954T3 (es) 1998-10-27 2005-08-01 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Coenzima util para la sintesis de l-carnitina.
DE19850426A1 (de) * 1998-10-27 2000-05-04 Sigma Tau Ind Farmaceuti gamma-Butyrobetainyl-Coenzym A und Verfahren zu seiner Herstellung
DE19850433A1 (de) * 1998-10-27 2000-05-25 Sigma Tau Ind Farmaceuti Crotonobetainyl-Coenzym A, Verfahren zu seiner Herstellung
US6337197B2 (en) 1998-10-27 2002-01-08 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. Coenzymes useful for the synthesis of L-carnitine
MXPA03001030A (es) * 2000-08-04 2003-11-25 Microgenomics Inc Permeasas del acido 2,5-diceto-d-gluconico.
US6720168B2 (en) 2000-08-04 2004-04-13 Genencor International, Inc. 2,5-DKG permeases
ES2282399T3 (es) * 2001-01-31 2007-10-16 Lonza Ag Procedimiento microbiologico para la obtencion de l-carnitina.
US7229811B2 (en) 2001-08-03 2007-06-12 Genencor International, Inc. 2,5-diketo-D-gluconic acid (2,5-DKG) permeases
ATE531803T1 (de) * 2003-06-05 2011-11-15 Ajinomoto Kk Fermentierungsverfahren mittels veränderter bakterien mit einer erhöhten aufnahme von nebenprodukten
KR101166026B1 (ko) 2004-07-12 2012-07-19 씨제이제일제당 (주) 뉴로스포라 크라사 유래 ｌ-카르니틴 생합성 관련유전자를 포함하는 엔테로박테리아세 속 미생물 및 이를이용한 ｌ-카르니틴의 제조방법
WO2007003425A2 (en) 2005-07-05 2007-01-11 Lonza Ag Spray-drying process for producing a dry carnitine powder or granulate
JP4639235B2 (ja) * 2005-07-19 2011-02-23 シージェイ チェイルジェダン コーポレーション Ｌ−カルニチン生合成関連遺伝子を含む腸内細菌属微生物、およびその微生物を用いたｌ−カルニチンの産生方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59192095A (ja) * 1983-04-13 1984-10-31 Ajinomoto Co Inc Ｌ−カルニチンの製造法
CA2021869C (en) * 1989-07-28 2000-09-05 Frans Hoeks Process for microbiological batch production of l-carnitine
IT1240833B (it) * 1990-05-14 1993-12-17 Sigma Tau Ind Farmaceuti Procedimento biocatalitico per la produzione di l-(-)- carnitina da crotonilbetaina e ceppi di proteeae per l'uso in tale procedimento
RU2099418C1 (ru) * 1991-11-21 1997-12-20 Лонца Аг Фрагмент днк, обеспечивающий использование бетаина, рекомбинантная плазмидная днк с фрагментом днк, обеспечивающим использование бетаина, штамм бактерий rhizobium/agrobacterium, предназначенный для стабильного хранения плазмиды с фрагментом днк, способ получения штамма бактерий

Also Published As

Publication number Publication date
AU7854694A (en) 1995-05-04
FI961537A (fi) 1996-04-04
FI118568B (fi) 2007-12-31
RU2133773C1 (ru) 1999-07-27
KR100346293B1 (ko) 2002-11-30
WO1995010613A1 (de) 1995-04-20
CN1282791A (zh) 2001-02-07
PL313968A1 (en) 1996-08-05
JP3708543B2 (ja) 2005-10-19
NO961385L (no) 1996-06-03
CN1133066A (zh) 1996-10-09
CN1157480C (zh) 2004-07-14
EP0722500B1 (de) 2004-01-07
CN1058523C (zh) 2000-11-15
PL180300B1 (pl) 2001-01-31
CA2173115C (en) 2005-07-26
CZ100596A3 (en) 1996-10-16
SK43196A3 (en) 1996-10-02
US5759824A (en) 1998-06-02
CA2173115A1 (en) 1995-04-20
EP0722500A1 (de) 1996-07-24
DE59410350D1 (de) 2004-02-12
ATE257515T1 (de) 2004-01-15
CZ288247B6 (en) 2001-05-16
JPH09503390A (ja) 1997-04-08
NO319058B1 (no) 2005-06-13
HUT74825A (en) 1997-02-28
FI961537A0 (fi) 1996-04-04
NO961385D0 (no) 1996-04-03
HU220798B1 (hu) 2002-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0955368B1 (en) L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing l-glutamic acid
WO2019086708A1 (en) A genetically modified bacillus subtilis strain, optimized vectors, and uses thereof
Kuhlemeier et al. Cloning of nitrate reductase genes from the cyanobacterium Anacystis nidulans
Peralta et al. Engineering the nifH promoter region and abolishing poly-β-hydroxybutyrate accumulation in Rhizobium etli enhance nitrogen fixation in symbiosis with Phaseolus vulgaris
CN106062177B (zh) 具有改进的产生l-赖氨酸的能力的棒状杆菌微生物和用于使用其产生l-赖氨酸的方法
SK280580B6 (sk) Fragment dna, vektor a mikroorganizmus obsahujúci
JPH08501694A (ja) ビオチンの生物工学的製造方法
EP0035831A2 (en) Method for making genetically modified microorganisms
KR102617168B1 (ko) 쉬와넬라 오네이덴시스 유래 단백질을 발현하는 미생물, 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법
CA2083407C (en) Microorganisms for the stabilization of plasmids
Goosen et al. Genes involved in the biosynthesis of PQQ from Acinetobacter calcoaceticus
US7049097B2 (en) Antibiotics-independent vector for constant high-expression and method for gene expression using the same
NZ548685A (en) Reduction of spontaneous mutation rates in cells
EP0240105B1 (en) A gene coding for biotin synthetase and utilization thereof
JP4162383B2 (ja) ホモグルタミン酸の生産に関与する遺伝子およびその使用
US5591577A (en) Mobile genetic element originated from brevibacterium strain
KR102616694B1 (ko) 쉬와넬라 아틀란티카 유래 단백질을 발현하는 미생물, 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법
KR20220149219A (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
KR20220148694A (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
KR20220126610A (ko) L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-라이신의 생산 방법
KR20240017394A (ko) L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-시트룰린의 생산 방법
KR20230108790A (ko) L-히스티딘 생산능이 향상된 에스케리치아 속 변이주 및 이를 이용한 l-히스티딘의 생산 방법
JPH07327680A (ja) 新規プラスミド及びそれを用いる変異株の取得方法
JPH11235188A (ja) 自然環境中で増殖が制限されるアンモニア酸化細菌変異株の作製方法
JP2004242564A (ja) メチロフィラス属細菌のベクター

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20131007