SK279666B6 - Method of preparing 17-oxosteroids - Google Patents

Abstract

Described is a method of preparing 17-oxosteroids by the fermentative oxidation of 17beta-hydroxysteroids, characterized in that a bacterial culture of the species Mycobacterium spec. NRRL B-3805, Mycobacterium spec. NRRL B-3683, Mycobacterium phlei NRRL B-8154 or Mycobacterium fortuitum NRRL B-8153 is used for the fermentation.

Description

Oblasť technikyTechnical field

Vynález sa týka spôsobu výroby 17-oxosteroidov fermentatívnou oxidáciou 17p-hydroxysteroidov.The invention relates to a process for the preparation of 17-oxosteroids by fermentative oxidation of 17β-hydroxysteroids.

Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Spôsob fermentatívnej výroby 17-oxosteroidov je už dlhý čas známy. Už v roku 1938 opísal A. Vercellone a L. Momoli spôsob výroby 4-andrósten-3,17-diónu fermentáciou 5-andrósten-3[},17p-diolu (Ber. 71, 1938, 152-155). Tento spôsob poskytuje vysoké výťažky produktu postupu, keď sa zvolia vhodné mikroorganizmy (Czech 87.068; ref. C.A. 54, 1960, 2441). Je možné nájsť tiež veľa publikácií, v ktorých je opísané, že sa môžu vyrobiť 17-oxosteroidy (ako je 4-andrósten-3,17-dión, 1,4-androstadién-3,17-dión alebo 3-hydroxy-l,3,5,10/-estratrién-17-ón/ za dosiahnutia vysokých výťažkov fermentatívnym odbúravaním postranných reťazcov substrátov, ktoré v pozícii 17β nesú uhľovodíkový reťazec.The method of fermentative production of 17-oxosteroids has been known for a long time. As early as 1938, A. Vercellone and L. Momoli described a process for the production of 4-androsten-3,17-dione by fermentation of 5-androsten-3, 17β-diol (Ber. 71, 1938, 152-155). This method provides high yields of the product of the process when suitable microorganisms are selected (Czech 87.068; ref. C.A. 54, 1960, 2441). There are also many publications describing that 17-oxosteroids can be produced (such as 4-androsten-3,17-dione, 1,4-androstadiene-3,17-dione or 3-hydroxy-1, 3,5,10 (-estratrien-17-one) to obtain high yields by fermentative degradation of the side chains of substrates that carry the hydrocarbon chain at the 17β position.

Spôsoby, pomocou ktorých by bolo možné v dobrom výťažku oxidovať mikrobiologickou cestou 17β-hydroxysteroidy na 17-oxosteroidy bez toho, že by prebiehala dodatočná premena steroidov, sú známe veľmi málo. N.Welsh a C.Heusghem opisujú spôsob, pomocou ktorého je možné premeniť estradiol za výťažku 95% na estrón, ale tento spôsob nie je reprodukovateľný, lebo autormi použitý organizmus nie je verejnosti dostupný (Compt. Rend. Soc. Biol.., 142, 1948, 1074).Methods by which the 17β-hydroxysteroids can be oxidized microbiologically in good yield to 17-oxosteroids without additional conversion of steroids are known are very little known. N.Welsh and C.Heusghem describe a method by which estradiol can be converted to estrone in 95% yield, but this method is not reproducible because the organism used by the authors is not available to the public (Compt. Rend. Soc. Biol .., 142 (1948, 1074).

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Teraz vznikla značná potreba vypracovania takéhoto fermentatívneho postupu, lebo chemické spôsoby oxidácie sú skutočne veľmi nákladné. Inak majú chemické spôsoby ten nedostatok, že sa vykonávajú s použitím činidiel, ako je napríklad pyridín a oxid sírový, ktorých odstraňovanie je z hľadiska životného prostredia veľmi problematické.There has now been a great need for such a fermentative process, since chemical oxidation processes are indeed very expensive. Otherwise, chemical processes have the drawback that they are carried out using reagents such as pyridine and sulfur trioxide, the removal of which is very problematic from an environmental point of view.

Teraz bolo zistené, že je možné prekvapivo vyrobiť 17-oxosteroidy vo vysokých výťažkoch tak, že sa na fermentáciu ^-hydroxysteroidov použijú bakteriálne kultúry kmeňov Mycobactérium sp. NRRL B-3805, Mycobactérium sp NRRL B-3683, Mycobactérium phlei NRRL B-8154 alebo Mycobactérium fortuitum NRRL B-8153.It has now been found that, surprisingly, it is possible to produce 17-oxosteroids in high yields by using bacterial cultures of Mycobacterium sp. NRRL B-3805, Mycobacterium sp NRRL B-3683, Mycobacterium phlei NRRL B-8154 or Mycobacterium fortuitum NRRL B-8153.

Spôsob podľa predloženého vynálezu sa vykonáva za rovnakých podmienok, za akých sa tiež vykonávajú známe feimentatívne premeny, s použitím uvedených mikroorganizmov týchto bakteriálnych kultúr.The process of the present invention is carried out under the same conditions as known feeder transformations, using the microorganisms of these bacterial cultures.

Za podmienok, ktoré sú bežne používané pre uvedené bakteriálne kultúry, sa vo vhodnom živnom médiu za zavzdušňovania vypestuje submerzná kultúra. Potom sa do kultúry pridá substrát (rozpustený vo vhodnom rozpúšťadle, alebo v emulgovanej for me) a fermentuje sa, pokiaľ sa nedosiahne maximálna premena substrátu.Under the conditions commonly used for said bacterial cultures, a submerged culture is grown in a suitable nutrient medium under aeration. Subsequently, the substrate (dissolved in a suitable solvent or in an emulsified form) is added to the culture and fermented until the maximum conversion of the substrate is achieved.

Vhodnými rozpúšťadlami pre substrát sú napríklad metylalkohol, etylalkohol, glykolmonometyléter, dimetylformamid alebo dimetylsulfoxid. Emulgovanie substrátu sa môže napríklad vykonávať tak, že sa tento v mikronizovanej forme, alebo rozpustený v rozpúšťadle miešateľnom s vodou (ako je napríklad metylalkohol, etylalkohol, acetón, glykolmonometyléter, dimetylformamid alebo dimetylsulfoxid), nastrekuje za silnej turbulencie do vody (výhodne ochladenej), ktorá obsahuje bežné emulgačné pomocné činidlá. Vhodné emulgačné pomocné činidlá sú neiónogénne emulgátory, ako sú napríklad adukty etylénoxidu alebo esterov mastných kyselín s polyglykolmi. Ako vhodné (adukty) emulgátory je možné uviesť na trhu bežné zmáčadlá Tegín®, Tween® a Span®.Suitable solvents for the substrate are, for example, methanol, ethanol, glycol monomethyl ether, dimethylformamide or dimethylsulfoxide. For example, the emulsification of the substrate may be carried out by spraying it in micronized form or dissolved in a water-miscible solvent (such as methanol, ethyl alcohol, acetone, glycol monomethyl ether, dimethylformamide or dimethylsulfoxide), injected into water (preferably cooled) under strong turbulence, which contains conventional emulsifying aids. Suitable emulsifying auxiliaries are non-ionic emulsifiers such as adducts of ethylene oxide or polyglycol fatty acid esters. Suitable emulsifiers include commercially available wetting agents Tegin®, Tween® and Span®.

Optimálna koncentrácia substrátu, okamih pridávania substrátu a fermentačná doba sú závislé od typu použitého substrátu a mikroorganizmu a od podmienok fermentácie. Tieto veličiny sa musia priebežne zisťovať pomocou predbežných pokusov, ako je pre odborníkov na mikrobiologické premeny steroidov všeobecne známe, pre každý možný jednotlivý prípad.The optimum substrate concentration, substrate addition time and fermentation time are dependent upon the type of substrate used and the microorganism used and the fermentation conditions. These quantities must be continuously detected by preliminary experiments, as is generally known to those skilled in the art of microbiological transformation of steroids, for each possible individual case.

Na vykonávanie spôsobu podľa predloženého vynálezu sa ako substráty používajú výhodne 17β-hydroxysteroidy všeobecného vzorca (I)Preferably, 17β-hydroxysteroids of formula (I) are used as substrates for carrying out the process of the present invention.

v ktorom znamenáin which it means

Rj vodíkový atóm alebo metylovú skupinuR 1 is a hydrogen atom or a methyl group

St zvyšok estrán-17p-olovcho derivátu, obsahujúceho až 5 nekumulovaných dvojitých väzieb, substituovaného v polohe 3 fenolickou hydroxylovou skupinou, nižšou alkoxyskupinou, nižšou 1-alkoxy-alkoxyskupinou, 2-tetra-hydropyranyloxyskupinou, alebo nižšou alkyléndioxyskupinou, ako i prípadne v polohe 5,10 epoxyskupinou a v polohe 19 pripadne metylskupinou. Pod pojmom nižšia alkoxyskupina sa rozumie výhodne skupina, obsahujúca až 4 uhlíkové atómy. Vhodné alkoxyskupiny sú napríklad metoxyskupina alebo tere.-butyloxyskupina.The St residue of an estran-17β-lead derivative containing up to 5 non-accumulated double bonds substituted at the 3-position by a phenolic hydroxyl, lower alkoxy, lower 1-alkoxy-alkoxy, 2-tetrahydropyranyloxy, or lower alkylenedioxy group as well as optionally in position 5 , 10 with an epoxy group and at position 19 with a methyl group, respectively. A lower alkoxy group is preferably a group containing up to 4 carbon atoms. Suitable alkoxy groups are, for example, methoxy or tert-butyloxy.

Pod pojmom nižšia 1-alkoxy-alkoxy skupina sa rozumie výhodne nižšia alkoxy-metoxyskupina s až 4 uhlíkovými atómami valkoxyskupine. Ako príklad je možné uviesť 1-metoxymetoxyskupinu. Pod pojmom nižšia alkyléndioxyskupina sa rozumie obzvlášť skupina s 2 až 6 uhlíkovými atómami, ako je napríklad etyléndioxyskupina alebo 2,2-dimetyl-propyléndioxyskupina.The term lower 1-alkoxy-alkoxy means preferably lower alkoxy-methoxy having up to 4 carbon atoms and alkoxy. An example is 1-methoxymethoxy. The term lower alkylenedioxy is especially understood to mean the group having 2 to 6 carbon atoms, such as, for example, ethylenedioxy or 2,2-dimethyl-propylenedioxy.

Substrát, ktorý je vhodný na vykonávanie spôsobu podľa predloženého vynálezu, je napríklad derivát εί1ιύη-17β-ο1ιι všeobecného vzorca (la)A substrate which is suitable for carrying out the process of the present invention is, for example, a derivative of formula (Ia)

SK 279666 Β6SK 279666-6

v ktorom znamenáin which it means

R.2 vodíkový atóm alebo alkylovú skupinu s až 4 uhlíkovými atómami aR 2 is a hydrogen atom or an alkyl group of up to 4 carbon atoms; and

I II I

-A-B-C-D- skupiny čiastkových vzorcov-A-B-C-D- groups of partial formulas

I I III I II

-CH2-CH2-CH-CH- , -ch₂-ch=c-ch-CH 2 -CH 2 -CH-CH-, -ch ₂ -ch = c-ch

I I alebo -CH=CH-C=C aOr -CH = CH-C = C and

Rj má uvedený význam.R 1 is as defined above.

Z týchto substrátov vytvorené deriváty estran-17-ónu, prípadne z týchto zlúčenín éterovým štiepením získané 3-hydroxyzlúčeniny, sú ako je známe farmakologicky účinné a môžu sa ako je známe okrem toho redukovať na zodpovedajúce 17a-hydroxyzlúčeniny alebo previesť na zodpovedajúce 17p-hydroxy-etinylzlúčeniny.The estran-17-one derivatives or the 3-hydroxy compounds obtained from these substrates, which are obtained by ether cleavage, are known to be pharmacologically active and can furthermore be reduced to the corresponding 17 [alpha] -hydroxy compounds or converted to the corresponding 17 [beta] -hydroxy- etinylzlúčeniny.

Vhodné substráty sú ďalej deriváty estranu všeobecného vzorca (Ib)Suitable substrates are furthermore estran derivatives of formula (Ib)

v ktorom znamenáin which it means

R3 alkylovú skupinu s až 4 uhlíkovými atómami jednoduchú alebo dvojitú väzbu aR 3 is an alkyl group of up to 4 carbon atoms, a single or double bond; and

Rj má uvedený významR 1 is as defined above

17-Oxo-steroidy, vytvorené z týchto zlúčenín, môžu ako je známe slúžiť na výrobu farmakologicky účinných 17a-etinyl-17p-hydroxy-4-ester-3ónov, prípadne ich 18-metyl-homológov.The 17-oxo-steroids formed from these compounds can, as is known, serve for the preparation of pharmacologically active 17α-ethynyl-17β-hydroxy-4-ester-3ones or their 18-methyl-homologues.

Ako substráty, ktoré je možné brať do úvahy, sú zlúčeniny všeobecného vzorca (Ic)Compounds of formula (Ic) are suitable substrates to be considered.

výrobu pregnanových derivátov, čo je odborníkom známe.production of pregnane derivatives, as is known to those skilled in the art.

Konečne je tiež možné uvažovať deriváty estran-17P-olu všeobecného vzorca (Id)Finally, estran-17β-ol derivatives of formula (Id) may also be contemplated.

v ktorom znamenáin which it means

R9 vodíkový atóm, ako i R7 a Rg spoločne nižšiu alkyléndioxyskupinu, aleboR 9 is a hydrogen atom as well as R 7 and R 8 together are lower alkylenedioxy, or

R7 a R9 dva vodíkové atómy alebo spoločne väzbu uhlik-uhlik aR 7 and R 9 are two hydrogen atoms or together a carbon-carbon bond a

Rg nižšiu alkoxyskupinu, nižšiu 1-alkoxy-alkoxyskupinu alebo 2-tetrahydropyranyloxyskupinu a Rj a R5 majú uvedený významR8 is lower alkoxy, lower 1-alkoxy-alkoxy or 2-tetrahydropyranyloxy and R1 and R5 are as defined above

Ketóny získané z týchto zlúčenín sa môžu spôsobom opísaným v EP-A-0129499 previesť na antigestagénne účinné steroidy.The ketones obtained from these compounds can be converted to antigestagenically active steroids as described in EP-A-0129499.

Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Nasledujúce príklady uskutočnenia slúžia na bližšie objasnenie spôsobu podľa vynálezu:The following examples serve to illustrate the process of the invention in more detail:

Príklad 1Example 1

a) Erlenmayerova banka s objemom 500 ml naplnená 100 ml sterilného živného média, obsahujúceho 1% kvasnicového extraktu(a) Erlenmeyer flask of 500 ml capacity, filled with 100 ml of sterile nutrient medium containing 1% yeast extract

0,45% dihydrátu hydrogenfosforečnanu sodného0.45% disodium phosphate dihydrate

0,34% dihydrogénfosforečnanu draselného a0,34% of potassium dihydrogen phosphate and

0,2% tweenu 80, sa pri hodnote pH 6,7 zaočkuje suspenziou Mycobactérium sp. NRRL B-3683 a počas 72 hodín sa pri teplote 30 °C trepe na trepačke pri 180 otáčkach za minútu.0.2% tween 80, is inoculated with a suspension of Mycobacterium sp. NRRL B-3683 and shaken at 180 rpm at 30 ° C for 72 hours.

b) 50 Erlenmayerových baniek (100)ml, obsahujúcich vždy 20 ml sterilného média zloženého z 0,5% comsteep liquoru(b) 50 Erlenmeyer flasks (100) ml each containing 20 ml sterile medium composed of 0,5% comsteep liquor

0,05% glukózomonohydrátu0.05% glucose monohydrate

0,2% kvasnicového extraktu sa pri pH 7 zaočkuje vždy 1 ml predpestovanej kultúry Mycobactérium sp. a tieto banky sa inkubujú počas 24 hodín na rotačnej trepačke pri 220 otáčkach za minútu a pri teplote 30 °C.0.2% yeast extract is inoculated at pH 7 with 1 ml of a pre-cultured Mycobacterium sp. and these flasks are incubated for 24 hours on a rotary shaker at 220 rpm and at 30 ° C.

Potom sa každá kultúra zmieša s 0,02 g 3,3-(2,2-dimetyltrimetyléndioxy)-5,10 a-epoxy-5a-estra-9(ll)-én-17p-ólu, rozpusteného v 0,2 ml dimetylformamidu a sterilné prefiltrovaného, načo sa fermentuje d’alších 48 hodín.Thereafter, each culture was mixed with 0.02 g of 3,3- (2,2-dimethyltrimethylenedioxy) -5,10 α-epoxy-5α-estra-9 (11) -en-17β-ol dissolved in 0.2 mL dimethylformamide and sterile filtered, and fermented for an additional 48 hours.

c) Spojené kultúry sa extrahujú metylizobutylketónom a extrakt sa zahustí v rotačnej trepačke pri teplote maximálne 50°C za vákua.Potom sa vykonáva čistenie chromatografiou na stĺpci silikagélu.c) Extract the combined cultures with methyl isobutyl ketone and concentrate the extract in a rotary shaker at a maximum of 50 ° C under vacuum. Then purify by silica gel column chromatography.

v ktorom znamenáin which it means

R4 vodíkový atóm alebo metylovú skupinu, I<5 a Rg spoločne nižšiu alkyldioxyskupinu alebo R5 vodíkový atóm aR4 is a hydrogen atom or a methyl group, I <5 and R8 together are a lower alkyldioxo group or R5 a hydrogen atom and

R6 nižšiu alkoxyskupinu, nižšiu 1-alkoxy-alkoxy skupinu alebo 2-tetrahydropyranylovú skupinu aR 6 is lower alkoxy, lower 1-alkoxy-alkoxy or 2-tetrahydropyranyl and

R] má uvedený významR1 is as defined above

17-Oxosteroidy, získané z týchto zlúčenín, sa môžu rovnakým spôsobom ďalej spracovávať, ako steroidy z estran-17p-olových derivátov všeobecného vzorca (Ic); na druhej strane však tiež môžu slúžiť naThe 17-oxosteroids obtained from these compounds can be further processed in the same manner as the steroids from estran-17β-ol derivatives of formula (Ic); on the other hand, they can also serve to

Uvedeným spôsobom sa získa 0,85 g 3,3(2,2-dimetyltrimetyléndioxy)-5,10a-epoxy-5a-estra-9(ll)-én-170-ónu, ktorý je identický podľa HPLC s autentickou vzorkou.0.85 g of 3,3 (2,2-dimethyltrimethylenedioxy) -5,10α-epoxy-5α-estra-9 (11) -en-170-one is obtained, which is identical to HPLC with an authentic sample.

Príklad 2Example 2

a) Výroba očkovacej kultúry prebieha rovnako, ako je uvedené v príklade la)a) The production of the inoculum culture proceeds as described in Example 1a)

b) 50 Erlenmayerových baniek s obsahom 100 ml sa naplní vždy 20 ml sterilného živného média so zložením(b) 50 ml 100 ml Erlenmeyer flasks are filled with 20 ml sterile nutrient medium

2,5% comsteep liquoru2.5% comsteep liquor

0,25% sojovej múčky0.25% soya meal

0,3% hydrogénfosforečnanu amónneho0.3% ammonium hydrogen phosphate

0,25% tweenu 80 hodnota pH sa upraví na 6,5 a zaočkujú sa vždy 1 ml predpestovanej kultúry Mycobactérium sp., načo sa inkubujú na rotačnej trepačkc pri 220 otáčkach za minútu počas 24 hodín pri teplote 30°C.The pH of the 0.25% tween 80 is adjusted to 6.5 and inoculated with 1 ml of a pre-cultured Mycobacterium sp. Culture and incubated on a rotary shaker at 220 rpm for 24 hours at 30 ° C.

Po inkubácii sa do každej kultúry pridá 0,002 g α-equilolu, rozpusteného v 0,2 ml dimetylformamidu a fermentuje sa ďalších 72 hodín pri teplote 30°C.After incubation, 0.002 g of α-equilol dissolved in 0.2 ml of dimethylformamide is added to each culture and fermented for another 72 hours at 30 ° C.

c) Izolácia produktu prebieha rovnako, ako je opisané v príklade lc).c) Isolation of the product proceeds as described in Example 1c).

Uvedeným spôsobom sa získa 0,095 g equilínu, ktorý je podľa HPLC identický s autentickou vzorkou.In this way, 0.095 g of equilin is obtained, which is identical to an authentic sample by HPLC.

Claims (2)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Spôsob výroby 17-oxosteroidov fermentatívnou oxidáciou 17p-hydroxysteroidov, vyznačujúci sa tým, že sa na feimentáciu použijú bakteriálne kultúry kmeňov Mycobactérium sp. NRRL B-3805, Mycobactérium sp. NRRL B-3683, Mycobactérium phlei NRRL B-8154 alebo Mycobactérium fortuitum NRRL B-8153.Process for the production of 17-oxosteroids by fermentative oxidation of 17β-hydroxysteroids, characterized in that bacterial cultures of Mycobacterium sp. NRRL B-3805, Mycobacterium sp. NRRL B-3683, Mycobacterium phlei NRRL B-8154, or Mycobacterium fortuitum NRRL B-8153. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa oxiduje 17[i-hydroxysteroid všeobecného vzorca (I) st z--v ktorom znamenáProcess according to claim 1, characterized in that the 17β-hydroxysteroid of formula (I) is oxidized with - Rj vodíkový atóm alebo metylovú skupinuR 1 is a hydrogen atom or a methyl group St zvyšok estran-17p-olového derivátu, obsahujúceho až 5 nekumulovaných dvojitých väzieb, substituovaného v polohe 3 fenolickou hydroxylovou skupinou, nižšou alkoxyskupinou, nižšou 1-alkoxy-alkoxyskupinou, 2-tetrahydropyranyloxyskupinou alebo nižšou alkyléndioxy-skupinou, ako i prípadne v polohe 5,10 epoxyskupinou a v polohe 19 prípadne metylskupinou.The St radical of an estran-17β-ol derivative containing up to 5 non-accumulated double bonds substituted at the 3-position with a phenolic hydroxyl, lower alkoxy, lower 1-alkoxy-alkoxy, 2-tetrahydropyranyloxy or lower alkylenedioxy group as well as optionally in the 5-position, 10 is optionally substituted with epoxy and in position 19 with methyl.