SK17012001A3 - A composition comprising an aqueous solution, lyophilized composition of a-beta peptide, process for the preparation of sterile composition, method of preventing and treating, method of inducing an antibody response and the use - Google Patents

Abstract

The invention is directed to compositions comprising solubilized A beta peptide or suspension of A beta peptide and to processes for producing the same by adjusting the pH sufficient to effect the solubilization, and sterile filtration thereof, to methods of treating and preventing Alzheimer's disease with the obtained compositions.

Description

Tento vynález sa týka farmaceutického prostriedku obsahujúceho proteíny, ktoré je možné použiť na vyvolanie protilátkovej odpovede u cicavcov. Špecificky sa tento vynález vzťahuje na farmaceutický akceptovateľný prostriedok, ktorý obsahuje množstvo beta-amyloidného peptidu dostatočného na vyvolanie imunitnej odpovede u cicavcov, s farmaceutický akceptovateľným rozpúšťadlom. Rozpúšťadlom je najmä sterilná parenterálne akceptovateľná vodná fáza.The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising proteins which can be used to elicit an antibody response in a mammal. Specifically, the present invention relates to a pharmaceutically acceptable composition comprising an amount of a beta-amyloid peptide sufficient to elicit an immune response in a mammal with a pharmaceutically acceptable solvent. In particular, the solvent is a sterile parenterally acceptable aqueous phase.

Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Beta-amyloid peptid, označovaný tiež A-beta peptid alebo Αβ peptid, je štiepný produkt amyloidného prekurzorového proteínu (APP). Je základnou zložkou amyloidných plakov v mozgu cicavcov, ktorých výskyt je základnou charakteristikou Alzheimerovej demencie. Αβ je 39 až 43 aminokyselinový reťazec, ktorý sa líši dĺžkou v závislosti od variability svojho vzniku z APP s účasťou niekoľkých protéz.A beta-amyloid peptide, also called A-beta peptide or Αβ peptide, is a cleavage product of amyloid precursor protein (APP). It is an essential component of amyloid plaques in the mammalian brain, the occurrence of which is an essential characteristic of Alzheimer's dementia. Αβ is a 39 to 43 amino acid chain that varies in length depending on the variability of its origin from APP with the participation of several prostheses.

Niekoľko mutácií vo vnútri APP proteínu sa spojuje s prítomnosťou Alzheimerovej demencie. Viď napr. Goate et al., Náture 349, 704 (1991) (valín⁷¹⁷ za izoleucín), Chartier.Harlan et al., Náture 353, 844 (1991) (valín⁷¹⁷ za glycín), Murell et al., Science 254, 97 (1991) (valín⁷¹⁷ za feriylalanín), Mullan et al., Náture Genet. 1,345 (1992) (dvojitá mutácia zámeny lyzínu⁵⁹⁵-metionínu⁵⁹⁶ za asparagín⁵⁹⁵leucín⁵⁹⁶). Predpokladá sa, že tieto mutácie spôsobujú Alzheimerovú demenciu zvýšením alebo alteráciou premeny APP na Αβ peptid, predovšetkým premenou APP na zvýšené množstvo Αβ42 a Αβ43. Mutácie v iných génoch, ako sú presenilínové gény, PS1 a PS2, sú považované za nepriamu príčinu postihnutia premeny APP vytvárajúce zvýšené množstvo Αβ42 a Αβ43 (viď Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Pozorovania ukazujú, že Αβ peptid a predovšetkým Αβ42 je prvkom spôsobujúcim vznik Alzheimerovej demencie. V mozgu sa Αβ proteín hromadí a vytvárajú sa amyloidné ložiská, v ktorých sa peptid organizuje do fibríl so štruktúrou β-skladaného listu.Several mutations within the APP protein have been associated with the presence of Alzheimer's dementia. See e.g. Goate et al., Nature 349, 704 (1991) (valine ⁷¹⁷ for isoleucine), Chartier. Harlan et al., Nature 353, 844 (1991) (valine ⁷¹⁷ for glycine), Murell et al., Science 254, 97 ( 1991) (valine ⁷¹⁷ for feriylalanine), Mullan et al., Nature Genet. 1,345 (1992) (double mutation of lysine ^595- methionine ⁵⁹⁶ to asparagine ⁵⁹⁵ leucine ⁵⁹⁶ ). These mutations are believed to cause Alzheimer's dementia by increasing or altering the conversion of APP to Αβ peptide, in particular by converting APP into an increased amount of Αβ42 and Αβ43. Mutations in genes other than the presenilin genes, PS1 and PS2, are considered to be an indirect cause of affecting APP conversion producing increased amounts of Αβ42 and Αβ43 (see Hardy, TINS 20, 154 (1997)). Observations show that Αβ peptide, and in particular Αβ42, is the cause of Alzheimer's dementia. In the brain, the Αβ protein accumulates to form amyloid foci in which the peptide organizes into fibrils with a β-sheet structure.

Súčasný výskum zaoberajúci sa liečbou alebo prevenciou Alzheimerovej choroby sa zameral na snahu zastavenia alebo spomalenia tvorby Αβ peptidu v mozgu alebo blokovanie jeho následnej úpravy alebo hromadenia v amyloidných plakoch. Jeden z terapeutických postupov, ktorý má zásadný význam na aplikáciu tohto vynálezu, je použitie Αβ peptidu na vyvolanie imunitnej odpovede proti tomuto proteínu. Viď napr. publikácia PCT č. WO 99/27 944, ktorá je takto odkazom začlenená v celom rozsahu.Recent research into the treatment or prevention of Alzheimer's disease has focused on trying to stop or slow the formation of Αβ peptide in the brain or block its subsequent processing or accumulation in amyloid plaques. One therapeutic approach that is essential for the application of this invention is the use of an β-peptide to elicit an immune response against this protein. See e.g. PCT publication no. WO 99/27 944, which is hereby incorporated by reference in its entirety.

Prítomný vynález sa zameriava na nové a nečakané metódy na uskutočnenie vynálezu opísaného v publikácii PCT č. WO 99/27 944. Predovšetkým zahŕňa podávanie určitých podôb dlhých foriem Αβ peptidu pacientovi na indukciu imunitnej odpovede. Aj napriek tomu, ako bolo v odbore opísané, je ťažké rozpúšťať dlhé formy Αβ peptidov v bežných systémoch.The present invention is directed to novel and unexpected methods for carrying out the invention described in PCT publication no. WO 99/27 944. In particular, it involves administering certain forms of long forms of the ββ peptide to a patient to induce an immune response. However, as described in the art, it is difficult to dissolve long forms of β-peptides in conventional systems.

Zvlášť Hilbich et al., j. Mol. Biol., 218 (1), pp. 149-64, (1991) opisuje, že zatiaľ čo je Αβ1-43 peptid rozpustný do určitého stupňa v čistej vode, pridanie iónových zložiek ako sú pufry alebo soli, alebo organických roztokov spôsobuje precipitáciu z roztoku vo forme amorfnej zrazeniny.In particular, Hilbich et al. Mol. Biol., 218 (1), s. 149-64, (1991) discloses that while the β1-43 peptide is soluble to some degree in pure water, the addition of ionic components such as buffers or salts, or organic solutions, causes precipitation from the solution as an amorphous precipitate.

Hilbich napríklad opisuje, že fosfátový pufor obsahujúci chlorid sodný („PBS“, ktorý v tomto prípade obsahuje 137 mM NaCI, 3 mM KCI, 8 mM Na₂HPO₄«2H₂O a 2 mM KH₂PO₄, pH 7,5) dosiahol nerozpustnosť 90 až 94 % peptidu obsiahnutého v prípravku. PBS je bežný nosič pre parenterálny prostriedok s tonicitou a hodnotou pH zodpovedajúcou hodnotám živých systémov. 5 mM NaCI spôsobuje precipitáciu 42 až 50 % peptidu (tak isto, str. 153, tabuľka 2). Roztok peptidu v čistej vode by bol hypotonícký a jeho pH by sa podľa Hilbucha priblížilo k hodnote 5,5. Typická hodnota pH krvi človeka je okolo 7,4. Dyrks, et al. tiež opísali, že Αβ42 je za fyziologických podmienok nerozpustný! Dyrks, T., Weidemann, A., Mulhaup, G., et al. EMBO J.7, pp. 949 až 57 (1988)).For example, Hilbich discloses that a phosphate buffer containing sodium chloride ("PBS"), which in this case contains 137 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O and 2 mM KH ₂ PO ₄ , pH 7.5 ) has an insolubility of 90 to 94% of the peptide contained in the formulation. PBS is a conventional carrier for a parenteral formulation with tonicity and a pH equivalent to that of living systems. 5 mM NaCl causes precipitation of 42 to 50% of the peptide (also, page 153, Table 2). A solution of the peptide in pure water would be hypotonic and, according to Hilbuch, its pH would approach 5.5. A typical human blood pH is about 7.4. Dyrks, et al. also described that Αβ42 is insoluble under physiological conditions! Dyrks, T., Weidemann, A., Mulhaup, G., et al. EMBO J.7 949-57 (1988)).

Štruktúra Αβ peptidu v roztoku môže byť určená za použitia spektroskopie cirkulárneho dichroizmu (C.D.). Štruktúrne štúdie Αβ peptidu a fragmentov používajúcich C.D. zaznamenal Hilbich, et al, idem. Viď tiež monografiu od M. Manninga s názvom: Proteín Structure and Stability Assessment by Circular Dichroism Spectroscopy, z Biocatyst design for Stability and Specificity, Himmel, M.E. a Georgiou, G., eds., ACS Symposium Šerieš 516 (1993) na str. 36. Tento odkaz, ktorý je ďalej uvádzaný ako odkaz na Manninga, je tu takto vložený v celom rozsahu.The structure of the β-peptide in solution can be determined using circular dichroism (C.D.) spectroscopy. Structural studies of Αβ peptide and fragments using C.D. reported by Hilbich, et al., Idem. See also a monograph by M. Manning entitled: Protein Structure and Stability Assessment by Circular Dichroism Spectroscopy, from Biocatyst Design for Stability and Specificity, Himmel, M.E. and Georgiou, G., eds., ACS Symposium Serias 516 (1993) p. 36. That reference, hereinafter referred to as Manning, is hereby incorporated in its entirety.

Kline et al., Patent US č. 5 851 996 ('996 patent) a 5 753 624 ('624 patent) opisujú podávanie veľmi malého množstva (10'² mg alebo menej) Αβ peptidu alebo jeho fragmentu sublinguálne v kvapalnom alebo pevnom nosiči, ako je fenylovaný roztok chloridu sodného. '996 patent uvádza, že amyloidný beta proteín „existuje v rôznych štrukturálnych formách“ (stĺpec 2, riadok 31) a že tieto môžu byť použité pri liečbe Alzheimerovej demencie. Nie je nikde definované, čo sa myslí rôznymi štrukturálnymi formami, ani nie je nikde viac charakterizovaný 28-aminokyselinový fragment použitý v príklade. Veľkosť dávky Αβ peptidu je v '996 patente ustanovená v rozmedzí od 1O'¹⁰ do 10'² mg (stĺpec 8, riadok 442 až 443).Kline et al., U.S. Pat. 5,851,996 ( '996 patent) and 5,753,624 (' 624 patent) describe administration of very small volume (10 ^'2 mg or less) Αβ peptide fragment or sublingually in a liquid or solid carrier, such as saline solution fenylovaný. The '996 patent discloses that amyloid beta protein "exists in various structural forms" (column 2, line 31) and that these can be used in the treatment of Alzheimer's dementia. It is not defined anywhere by the various structural forms, nor is there any more characterization of the 28-amino acid fragment used in the example. The dose of the peptide is Αβ in the '996 patent provided for in the range of 1O' ^{10-10 '2} mg (column 8, lines 442-443).

Z hľadiska vyššie opísaného bolo primárnou snahou ukázať, ako ťažké je rozpustiť Αβ peptid a uchovať ho v tomto stave. Navyše sa i cez dobrú rozpustnosť dlhých foriem Αβ peptidu objavili komplikácie z hľadiska sterilizácie a štandardizácie. Väčšina štandardných sterilizačných metód je nevhodných pre peptidový prostriedok, vrátane radiácie, techník chemickej sterilizácie, ako sú etylénoxidové páry a glutaraldehyd, ktoré všetky spôsobujú degradáciu peptidu. Preto by metódou voľby sterilizácie Αβ peptidového prostriedku bola filtrácia peptidu. Prekážkou je nerozpustnosť Αβ peptidu, ktorá spôsobí upchatie filtračnej membrány, čo znemožňuje získať dostatočné množstvo Αβ peptidu na komerčný rozsah výroby.In view of the above, the primary endeavor was to show how difficult it is to dissolve the Αβ peptide and maintain it in this state. In addition, despite the good solubility of long forms of β-peptide, complications in terms of sterilization and standardization have emerged. Most standard sterilization methods are unsuitable for a peptide composition, including radiation, chemical sterilization techniques such as ethylene oxide pairs and glutaraldehyde, all of which cause peptide degradation. Therefore, the method of choice for sterilizing the β-peptide composition would be filtering the peptide. An obstacle is the insolubility of Αβ peptide, which causes the filter membrane to clog, which makes it impossible to obtain sufficient Αβ peptide for the commercial scale of production.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Tento vynález sa zameriava na prekvapivé a neočakávané zistenie, že vodný roztok obsahujúci vysokú koncentráciu Αβ peptidu je možné pripraviť úpravou pH roztoku na acidické/bázické hodnoty, pri ktorých sa Αβ peptid rozpustí. Preferujú sa hodnoty v rozmedzí približne od 8,5 do 12, najmä hodnoty okolo pH 9 až 10.The present invention aims at the surprising and unexpected discovery that an aqueous solution containing a high concentration of ββ peptide can be prepared by adjusting the pH of the solution to acidic / basic values at which the ββ peptide dissolves. Preference is given to values in the range of approximately 8.5 to 12, in particular values around pH 9 to 10.

Vynález sa ďalej zameriava na zistenie, že vzniknuté roztoky Αβ peptidu je možné podrobiť sterilnej filtrácii cez vhodný mikropórový filter so ziskom najmenej 50 % Αβ peptidu z filtrácie. Je v prednostnom záujme získať aspoň 70 % Αβ peptidu, najlepšie aspoň 90 %. Takýto sterilný roztok môže byť považovaný za farmaceutickú zložku obsahujúcu dostatočné množstvo Αβ peptidu na vyvolanie imunogénnej odpovede po pododaní cicavcom. Uprednostňované je parenterálne podanie vo forme suspenzie.The invention is further directed to the discovery that the resulting solutions of ββ peptide can be subjected to sterile filtration through a suitable micropore filter to obtain at least 50% ββ peptide from filtration. It is in the preferred interest to obtain at least 70% Αβ peptide, most preferably at least 90%. Such a sterile solution may be considered to be a pharmaceutical ingredient containing a sufficient amount of the β-peptide to elicit an immunogenic response upon administration to a mammal. Parenteral administration in the form of a suspension is preferred.

Jedným aspektom prostriedku podľa vynálezu je úprava pH prostriedku po sterilnej filtrácii na fyziologicky akceptovateľné hodnoty tak, aby peptidová suspenzia obsahovala najmenej 0,1 mg/ml Αβ peptidu. Tento prostriedok je potom vhodný na parenterálne podanie. Hodnoty pH suspenzie sa pohybujú v rozmedzí od 5 do 7, prednostne medzi 5,5 až 6,5. Prostriedok, ktorý sa najviac uprednostňuje, obsahuje dostatočné množstvo QS-21 v spojení s Αβ peptidom tak, že vytvára opticky čistú, sterilnú suspenziu.One aspect of the composition of the invention is to adjust the pH of the composition after sterile filtration to physiologically acceptable values such that the peptide suspension contains at least 0.1 mg / ml Αβ peptide. The composition is then suitable for parenteral administration. The pH of the suspension is between 5 and 7, preferably between 5.5 and 6.5. Most preferably, the composition comprises a sufficient amount of QS-21 in conjunction with the β-peptide to form an optically pure, sterile suspension.

Tento vynález sa ďalej zameriava na zistenie, že rozpustné a potom sterilné roztoky Αβ peptidu môžu byť lyofilizované, poskytujúce tak lyofilizovanú podobu obsahujúcu Αβ peptid.The present invention is further directed to the discovery that soluble and then sterile β-peptide solutions can be lyophilized to provide a lyophilized form comprising the β-peptide.

V momente potreby môžu byť z tejto podoby späť prevedené na vodné prostriedky obsahujúce Αβ peptid.At this point, they can be converted from this form into aqueous formulations containing the β-peptide.

Ďalej sa tento vynález zameriava na vodný roztok s obsahom najmenej 0,01 mg/ml Αβ peptidu s pH zodpovedajúcim rozpustenej forme Αβ peptidu. Roztok je udržovaný na optimálnej hodnote pH pomocou dostatočného množstva farmaceutický akceptovateľného pufru.Further, the present invention is directed to an aqueous solution containing at least 0.01 mg / ml Αβ peptide having a pH corresponding to the dissolved form of the Αβ peptide. The solution is maintained at an optimum pH using a sufficient amount of a pharmaceutically acceptable buffer.

Ďalej je tento vynález zameraný na sterilný vodný roztok obsahujúci najmenej 0,01 mg/ml Αβ peptidu s pH zodpovedajúcom rozpustenej forme Αβ peptidu. Roztok je udržovaný na optimálnej hodnote pH pomocou dostatočného množstva farmaceutický akceptovateľného pufru.Furthermore, the present invention is directed to a sterile aqueous solution comprising at least 0.01 mg / ml β-peptide with a pH corresponding to the dissolved form of β-peptide. The solution is maintained at an optimum pH using a sufficient amount of a pharmaceutically acceptable buffer.

Ďalším zameraním tohto vynálezu sú lyofylizované prostriedky obsahujúce Αβ peptid pripravené spôsobom:Another object of the present invention are lyophilized compositions comprising an β-peptide prepared by the method of:

a) zmrazením sterilného vodného roztoku obsahujúceho aspoň 0,01 mg/ml Αβ peptidu, kde daný vodný roztok je udržovaný pri pH dostatočnom na rozpustenie daného Αβ peptidu a(a) freezing a sterile aqueous solution containing at least 0.01 mg / ml Αβ peptide, wherein said aqueous solution is maintained at a pH sufficient to dissolve said Αβ peptide; and

b) lyofilizáciou zmrazeného prostriedku pripraveného podľa kroku a).b) lyophilizing the frozen composition prepared according to step a).

S výhodou zahrňuje prostriedok tohto vynálezu dlhú formu (definovanú nižšie) Αβ peptidu. Najlepšie potom prostriedok zahŕňa farmaceutický akceptovateľný pufor, vybraný najskôr zo skupiny tvorenej aminokyselinami, ich solárni a derivátmi, farmakologicky akceptovateľnými alkáliami, hydroxidmi kovov a amóniumhydroxidmi, organickými a anorganickými kyselinami a ich solárni, a zmesami uvedených zlúčenín.Preferably, the composition of the invention comprises a long form (defined below) of an αβ peptide. Most preferably, the composition comprises a pharmaceutically acceptable buffer selected initially from the group consisting of amino acids, their solar and derivatives thereof, pharmacologically acceptable alkali, metal hydroxides and ammonium hydroxides, organic and inorganic acids and their solar salts, and mixtures thereof.

Ďalej sa tento vynález zameriava na prostriedok zahrňujúci vodný roztok, ktorý obsahuje aspoň 0,01 mg/ml Αβ peptidu, ktorého pH je zodpovedajúce na zachovanie rozpustenej formy Αβ peptidu a kde Αβ peptid je vo významnej miere v náhodne zvinutej konformácii.Further, the present invention is directed to a composition comprising an aqueous solution comprising at least 0.01 mg / ml Αβ peptide, the pH of which is adequate to maintain the dissolved form of the Αβ peptide and wherein the Αβ peptide is to a significant degree in a randomly folded conformation.

Prostriedok tohto vynálezu môže byť upravený na farmaceutický prostriedok vhodný na podanie cicavcom s Alzheimorovou demenciou alebo v riziku rozvoja tejto demencie.The composition of the invention may be formulated into a pharmaceutical composition suitable for administration to or at risk of developing a dementia of a mammal with Alzheimer's dementia.

Aspekty zloženia vynálezu sa zameriavajú na farmaceutické prostriedky, ktoré sú vodnou suspenziou najmenej 0,01 mg/ml Αβ peptidu obsiahnutého v rozpustnej náhodne zvinutej konformácii alebo stabilnej forme a alebo sú lyofilizované, kedy akýkoľvek z nich môže byť v sterilnej podobe parenterálne aplikovaný.Aspects of the composition of the invention are directed to pharmaceutical compositions which are an aqueous suspension of at least 0.01 mg / ml Αβ peptide contained in a soluble randomly wound conformation or stable form, or lyophilized, any of which can be parenterally administered in sterile form.

Jedným zo zamerania vynálezu je spôsob prípravy sterilného prostriedku dlhej formy Αβ peptidu, ktorý zahrňuje:One aspect of the invention is a method of preparing a sterile formulation of a long form of ββ peptide, comprising:

- úpravu pH vodného roztoku na hodnotu dostatočnú na rozpustenie Αβ peptidu,- adjusting the pH of the aqueous solution to a value sufficient to dissolve the Αβ peptide,

- rozpustenie Αβ peptidu v roztoku v množstve dostatočnom na dosiahnutie imonogénnej koncentrácie Αβ peptidu pre cicavce,- dissolution of the Αβ peptide in solution in an amount sufficient to achieve an immunogenic concentration of the Αβ peptide in mammals,

- filtrácie výsledného roztoku cez membránu s pórmi s rovnakou veľkosťou, ktorá sa pohybuje v rozmedzí dostatočnom na zachytenie baktérií a zároveň umožňujúcim priechod takmer všetkého množstva Αβ peptidu, a- filtering the resulting solution through a membrane with pores of the same size, which is in a range sufficient to contain bacteria while allowing passage of almost all of the Αβ peptide, and

- úpravou pH roztokov obsahujúcich 0,1 mg/ml alebo viac Αβ peptidu na hodnoty okolo pH 5 až 7 s cieľom získať suspenziu peptidu.- adjusting the pH of solutions containing 0.1 mg / ml or more Αβ peptide to values around pH 5-7 to obtain a peptide suspension.

Ďalším zameraním tohto vynálezu je spôsob prevencie a liečby Alzheimerovej demencie u cicavcov, ktorého postup zahŕňa podávanie dostatočného množstva sterilného vodného prostriedku obsahujúceho aspoň 0,05 mg/ml Αβ peptidu cicavcov s cieľom imunitnej odpovede.Another object of the present invention is a method of preventing and treating Alzheimer's dementia in a mammal, the method comprising administering a sufficient amount of a sterile aqueous composition comprising at least 0.05 mg / ml of mammalian Αβ peptide for immune response.

Tento vynález uprednostňuje filtráciu Αβ peptidu, ktorý sa väčšinou nachádza v náhodne zvinutej konformácii.The present invention favors filtration of ββ peptide, which is typically found in a randomly folded conformation.

Tento vynález sa zameriava na prostriedky a metódy, ktoré používajú vodné prostriedky obsahujúce terapeuticky účinnú koncentráciu Αβ peptidu. Predtým ako pristúpime k opisu vlastného vynálezu vo väčších detailoch, budú definované nasledujúce termíny.The present invention is directed to compositions and methods that use aqueous compositions comprising a therapeutically effective concentration of ββ peptide. Before proceeding to describe the invention in greater detail, the following terms will be defined.

Definície:definitions:

Termín „významná identita“ znamená, že dve peptidové sekvencie, pokiaľ sú optimálne zoradené, ako pomocou programov GAP alebo BESTFIT používajúcich trvalo rozdielne hmotnosti, majú aspoň 65 % sekvenčnej identity, s výhodou 80 alebo 90 %, najlepšie aspoň 95 % sekvenčnej identity alebo viac (napr. 99 % sekvenčná identita alebo vyššia). Zvyšné pozície, ktoré nie sú identické, sa líšia konzervatívnou substitúciou aminokyselín.The term "significant identity" means that two peptide sequences, when optimally aligned, such as by GAP or BESTFIT programs using consistently different weights, have at least 65% sequence identity, preferably 80 or 90%, most preferably at least 95% sequence identity or more (e.g., 99% sequence identity or higher). The remaining positions that are not identical differ by conservative amino acid substitution.

Na porovnanie sekvencii predstavuje typicky jedna sekvencia referenčnú sekvenciu, proti ktorej sa porovnáva testovaná sekvencia. Vhodnou referenčnou sekvenciou by bola sekvencia ľudského Αβ peptidu, konkrétne 42-aminokyselinová sekvencia opísaná nižšie. Ďalšie vhodné formy by boli skrátené sekvencie: ako je Αβ39, alebo predĺžená sekvencia Αβ43 (s pridanou treonínovou skupinou na Cterminálnom konci). Pri použití porovnávajúceho algoritmu sekvencie, sa referenčná a testovacia sekvencia zadá do počítača, pokiaľ je to nutné zadajú sa zhodné oblasti sekvencii, a nastavia sa parametre programu sekvenovacieho algoritmu. Porovnávací sekvenčný algaritmus potom na základe zvolených parametrov percentuálne vyhodnotí sekvenčnú zhodu testovanej sekvencie vzťahovanej na referenčnú sekvenciu.For sequence comparison, typically one sequence is a reference sequence against which the test sequence is compared. A suitable reference sequence would be the human Αβ peptide sequence, in particular the 42-amino acid sequence described below. Other suitable forms would be truncated sequences: such as Αβ39, or an extended sequence of Αβ43 (with an added threonine group at the terminal end). When using a sequence comparison algorithm, the reference and test sequences are entered into the computer, if necessary matching sequence regions are entered, and the sequence algorithm program parameters are set. The comparison sequence algarithm then evaluates the sequence identity of the test sequence relative to the reference sequence based on the selected parameters.

Optimálne polohy sekvencii na porovnanie je možné dosiahnuť napr. pomocou algoritmu lokálnej homológie: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), algoritmu homológneho postavenia: Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), metódou hľadania zhodnej oblasti: Pearson & Lipman, proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 85:2 444 (1988), počítačovým uskutočnením týchto algoritmov (GAP, BESTFIT, FASTA a TFASTA z Wisconsin Genetic Software Package, Genetic Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) alebo vizuálnou kontrolou (Ausubelt et al., viď vyššie v celom rozsahu). Príkladom vhodného algoritmu na percentuálne určenie sekvenčnej zhody a sekvenčnej podobnosti je algoritmus BLAST, opísaný v Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990): Softvérové vybavenie na uskutočnenie BLAST analýzy je verejne dostupné prostredníctvom National Center for Biotechnology Information (http://www.nebi.nlm.nih.gov/). Na uskutočnenie sekvenčného porovnania je možné použiť trvalé parametre programu, ale je tiež možné tieto parametre upraviť. Pre aminokyselinové sekvencie používa program BLASTP ako stále dĺžku slova (W) 3, zhoda (E = expactation) 10 a BLOSUM62 vyhodnovací vzor (viď Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10 915 (1989)).Optimal positions of sequences for comparison can be achieved e.g. using a local homology algorithm: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), a homologous position algorithm: Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), by the method of identifying a region: Pearson & Lipman, proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 85: 2,444 (1988), by computerization of these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA from the Wisconsin Genetic Software Package, Genetic Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) or by visual inspection (Ausubelt et al. above). An example of a suitable sequence identity and sequence similarity algorithm is the BLAST algorithm described by Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990): Software for performing BLAST analysis is publicly available through the National Center for Biotechnology Information (http://www.nebi.nlm.nih.gov/). Permanent program parameters can be used to perform a sequence comparison, but these parameters can also be modified. For amino acid sequences, the BLASTP program uses as a constant word length (W) 3, a match (E = expactation) of 10, and a BLOSUM62 scoring pattern (see Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10 915 (1989)).

Za účelom klasifikácie aminokyselinových substitúcií na konzervatívne a nekonzervatívne, sa rozdeľujú aminokyseliny do nasledujúcich skupín: skupina I (hydrofóbna časť reťazca): norleucín, Met, Ala, Val, Leu, lle; skupina II (neutrálna hydrofóbna časť reťazca): Cys, Ser, Tthr; skupina III (kyslá časť reťazca): Asp, Glu; skupina IV (zásaditá časť reťazca: Asn, Gin, His, Lys, Arg; skupina V (zvyšky ovplyvňujúce orientáciu reťazca): Trp, Tyr, Phe. Konzervatívne substitúcie predstavujú substitúcie medzi aminokyselinami v rámci jednej skupiny. U nekonzervatívnych dochádza k výmene členov z jednej skupiny za členy skupiny inej.In order to classify amino acid substitutions into conservative and non-conservative, amino acids are divided into the following groups: group I (hydrophobic part of the chain): norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile; group II (neutral hydrophobic portion of the chain): Cys, Ser, Tthr; group III (acidic part of the chain): Asp, Glu; Group IV (basic part of the chain: Asn, Gln, His, Lys, Arg; Group V (residues affecting chain orientation): Trp, Tyr, Phe. Conservative substitutions are substitutions between amino acids within one group. one group for members of another group.

APP⁶⁹⁵, APP⁷⁵¹ a APP⁷⁷⁰ označujú 695, 751 a 770 aminokyselín dlhé polypeptidy kódované ľudským APP génom. Viď Kang et al., Náture 325, 773 (1987); Ponte et al., Náture 331, 525 (1988); a Kitaguchi et al., Náture 331, 530 (1998). Aminokyseliny ľudského amyloid-prekurzorového proteínu (APP) sú očíslované podľa sekvencie izoformy APP770.APP ⁶⁹⁵ , APP ⁷⁵¹ and APP ⁷⁷⁰ refer to the 695, 751 and 770 amino acid long polypeptides encoded by the human APP gene. See Kang et al., Nature 325, 773 (1987); Ponte et al., Nature 331,525 (1988); and Kitaguchi et al., Nature 331, 530 (1998). The amino acids of the human amyloid precursor protein (APP) are numbered according to the sequence of the APP770 isoform.

V prítomnom vynáleze a v literatúre predstavuje hmotnosť vlastného Αβ peptidu asi 70 až 80 % celkovej hmotnosti Αβ peptidu a zvyšných asi 15 až 30 % je tvorené soľou a vodou. Toto bolo určené aminokyselinovou analýzou a/alebo analýzou nitrogénových častíc. Napríklad v prípade peptidu Αβ42 s hmotnosťou 0,1 mg, po oprave podľa vlastného obsahu peptidu, je 0,075 mg hmotnosti určené vlastným peptidom Αβ42 a 0,025 mg tvorí voda a soľ; 0,6 mg peptidu Αβ40 tvorí 0,45 mg samotného peptidu Αβ40 a 0,15 mg vody a soli; a 2,0 mg peptidu Αβ42 tvorí 1,5 mg peptidu Αβ42 a 0,5 mg vody a soli.In the present invention and in the literature, the weight of the actual Aβ peptide is about 70 to 80% of the total weight of the Aβ peptide, and the remaining about 15 to 30% is salt and water. This was determined by amino acid analysis and / or nitrogen particle analysis. For example, in the case of Αβ42 peptide weighing 0.1 mg, after correction according to the intrinsic content of the peptide, 0.075 mg weight is determined by the intrinsic Αβ42 peptide and 0.025 mg is water and salt; 0.6 mg of Αβ40 peptide consists of 0.45 mg of Αβ40 peptide alone and 0.15 mg of water and salt; and 2.0 mg of Αβ42 peptide consists of 1.5 mg of Αβ42 peptide and 0.5 mg of water and salt.

Názov Αβ peptid používaný v tomto vynáleze, označuje tie segmenty Αβ peptidu, ktoré sú schopné zaujímať β-štruktúru skladaného listu a schopné vyvolať imunogénnu odpoveď po dodaní cicavcom, či už samostatne alebo viazané nejakým adjuvans. Je v rámci bežných možností techniky určiť β štruktúru skladaného listu, napríklad, ako je tu opísané, použitím stanovenia cirkulárneho dichroizmu. Imunogenicita môže byť určená spôsobom opísaným nižšie v príkladoch v časti biologická aktivita.The term Αβ peptide used in the present invention refers to those Αβ peptide segments that are capable of occupying the β-sheet structure and capable of eliciting an immunogenic response upon delivery to a mammal, either alone or bound by an adjuvant. It is within the ordinary skill of the art to determine the β structure of a pleated sheet, for example, as described herein, using circular dichroism determination. Immunogenicity can be determined as described below in the biological activity section of the examples.

Termín „dlhé formy Αβ peptidu označuje akúkoľvek z prirodzene sa vyskytujúcich foriem Αβ38, Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 a Αβ43 a s nimi významne zhodné peptidové sekvencie a výhodne ľudské formy. Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 a Αβ43 označujú Αβ peptid obsahujúci aminokyselinové zvyšky 1 až 38, 1 až 40, 1 až 41, 1 až 42, 1 až 43, respektíve, kedy aminokyseliny sú odoberané z C-terminálneho konca peptidu. Αβ40, Αβ41 a Αβ39 sa tak líšia od Αβ42 absencií Ala, Ala-lle a AlaIle-Val, respektíve, na C-konci, ako je možné vidieť pri porovnaní s nižšie uvedenou sekvenciou Αβ peptidu. Αβ42 sa líši od Αβ43 prítomnosťou treonínového zvyšku na C-konci. Sekvencie týchto peptidov a ich vzťah k APP ilustruje obrázok 1 v Hardy et al., TINS 20, 155(1997).The term "long forms of Αβ peptide" refers to any of the naturally occurring forms of Αβ38, Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 and Αβ43, and substantially identical peptide sequences and preferably human forms thereof. Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42, and Αβ43 refer to the Αβ peptide containing amino acid residues 1 to 38, 1 to 40, 1 to 41, 1 to 42, 1 to 43, respectively, when amino acids are taken from the C-terminal end of the peptide. Thus, Αβ40, Αβ41 and β39 differ from β42 in the absence of Ala, Ala-lle and AlaIle-Val, respectively, at the C-terminus, as can be seen when compared to the Αβ peptide sequence below. Αβ42 differs from Αβ43 in the presence of a threonine residue at the C-terminus. The sequences of these peptides and their relationship to APP are illustrated in Figure 1 in Hardy et al., TINS 20, 155 (1997).

Sekvencia Αβ42 je: H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-ValHis-His-GIn-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gyl-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-lle-lleGly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-lle-Ala-OH.The sequence of Αβ42 is: H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-ValHis-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Ala-Glu-Asp- Val-Gyl-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-lleGly-Met-Leu-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH.

Termín „dlhé formy Αβ peptidu“ tiež zahŕňa analógy týchto foriem. Analógy sú alelické, druhové a indukované varianty. Typicky sa líšia od prirodzene sa vyskytujúcich peptidov v jednej alebo niekoľkých pozíciách, často na základe konzervatívnych substitúcií. Atypicky vykazujú aspoň 80 % alebo 90 % sekvenčnú identitu s prírodným peptidom. Niektoré analógy tiež obsahujú aminokyseliny, ktoré sa normálne prírodné nevyskytujú, alebo modifikácie N- alebo C-terminálnych aminokyselín. Príklady aminokyselín, ktoré sa v prírode nevyskytujú sú a, adisubstituované aminokyseliny, N-alkyl aminokyseliny, kyselina mliečna, 4hydroxyprolín, γ-karboxyglutamát, ε-Ν,Ν,Ν-trimetyllyzín, ε-Ν-acetyllyzín, O-fosfoserín, N-acetylserín, N-formylmetionín, 3-metylhistidín, 5-hydroxylyzín, ω-Ν-metylarginín.The term "long forms of β-peptide" also includes analogs of these forms. Analogs are allelic, generic and induced variants. They typically differ from naturally occurring peptides at one or more positions, often based on conservative substitutions. Atypically, they exhibit at least 80% or 90% sequence identity to the natural peptide. Some analogs also contain amino acids that do not normally occur naturally, or modifications of N- or C-terminal amino acids. Examples of non-naturally occurring amino acids are α, adisubstituted amino acids, N-alkyl amino acids, lactic acid, 4-hydroxyproline, γ-carboxyglutamate, ε-Ν, Ν, trim-trimethyllysine, ε-Ν-acetyllysine, O-phosphoserine, N- acetylserine, N-formylmethionine, 3-methylhistidine, 5-hydroxylysine, ω-Ν-methylarginine.

Αβ môže byť využitý v prostriedkoch alebo postupoch tohto vynálezu v koncentráciách asi od 0,05 mg/ml do hornej hranice jeho rozpustnosti asi 2,0 mg/ml (viď obr. 2). Uprednostňované rozmedzie koncentrácií peptidu je od 0,1 do 0,8 mg/ml, z ktorého najviac od 0,3 do 0,6 mg/ml.Αβ can be utilized in the compositions or processes of the invention at concentrations from about 0.05 mg / ml to an upper solubility limit of about 2.0 mg / ml (see Figure 2). A preferred range of peptide concentrations is from 0.1 to 0.8 mg / ml, of which at most 0.3 to 0.6 mg / ml.

Bolo opísané, že nerozpustná forma Αβ peptidú nájdená v amyloidných miestach má štruktúru β-skladaného listu. Soto, C., et al., Neuroscience Letters, 186 (2-3), pp. 115-118, (1995). Tiež Simmons, L.K., et al. Molec. Pharmacol., 45 (3) pp. 373-379 (1994) opísal, že štruktúra β-skladaného listu je spojená s neurotoxickými účinkami peptidú, zatiaľ čo náhodne zvinutá forma je len málo toxická alebo neaktívna. Ako sa spomína vyššie, metódy a prostriedky tohto vynálezu môžu využívať zvinutú konformáciu Αβ peptidú. Žiadateľ tu ukazuje, že náhodne zvinutá konformácia je schopná vyvolať imunitnú odpoveď u testovaných cicavcov. Náhodne zvinutá štruktúra sa uprednostňuje v mikrofiltrácii v postupoch vynálezu.The insoluble form of ββ peptides found at amyloid sites have been reported to have a β-sheet structure. Soto, C., et al., Neuroscience Letters, 186 (2-3). 115-118 (1995). Also, Simmons, L.K., et al. Mol. Pharmacol., 45 (3), pp. 373-379 (1994) reported that the β-sheet structure is associated with the neurotoxic effects of the peptide, while the randomly folded form is of little toxicity or inactive. As mentioned above, the methods and compositions of the present invention may utilize a folded conformation of β-peptide. Here, the applicant shows that a randomly folded conformation is capable of eliciting an immune response in the mammals tested. The randomly wound structure is preferred in microfiltration in the methods of the invention.

Termín „náhodne zvinutá“ označuje štruktúru otvoreného reťazca Αβ peptidú. Náhodné zvinutie je sekundárna štruktúra peptidového reťazca a nie je usporiadaná pravidelne ako štruktúra α-helixu alebo β-skladaného listu. U náhodného zvinutia ide skôr o porušenie hydrofóbneho poskladania a vodíkových väzieb, ktoré sú charakteristické pre iné, pravidelnejšie usporiadania. Aj tak môže náhodné zvinutie obsahovať určité stočenie peptidového reťazca alebo čiastočnú pravidelnosť, tieto znaky sú však náhodné a dynamické, a preto nie sú typické pre všetky náhodne zvinuté konformácie. Náhodne zvinutá štruktúra peptidú vykazuje dobrú rozpustnosť a filtrabilitu. Štruktúra α-helixu alebo β-skladaného listu sú v odbore dobre známe peptidové štruktúry. Sú opísané napríklad v Leninger's Biochemistry (2^nd Ed., Worth Publishers, 1975) na str. 128 až 129 pre α-helix a β-skladaný list na str. 133 až 134, ktoré sú zahrnuté v odkazoch tohto textu.The term "randomly rolled" refers to the open chain structure of the Αβ peptide. Random coiling is a secondary structure of the peptide chain and is not arranged regularly as an α-helix or β-sheet structure. Random winding is more likely to break the hydrophobic folding and hydrogen bonds that are characteristic of other, more regular arrangements. Nevertheless, the random coil may contain some twisting of the peptide chain or partial regularity, but these features are random and dynamic and are therefore not typical of all randomly coiled conformations. The randomly folded structure of the peptides shows good solubility and filterrability. The structure of α-helix or β-sheet is well known in the art for peptide structures. They are described, for example, in Leninger's Biochemistry (2 ^nd Ed., Worth Publishers, 1975) at p. 128 to 129 for α-helix and β-sheet on p. 133 to 134, which are incorporated herein by reference.

Náhodne zvinutá štruktúra môže byť charakterizovaná svojím spektrom cirkulárneho dichroizmu („CD“) a je ľahko rozlíšiteľná od štruktúry β-skladaného listu. Ako ukazuje CD spektrum, pre náhodne zvinutú štruktúru je špecifický silný negatívny prúžok medzi 19 a 200 nm a malý CD signál je vidieť vo vlnových dĺžkach dlhších ako 215 nm. Pokiaľ je vidieť CD signál vo vyšších vlnových dĺžkach, je veľmi slabo pozitívny v oblasti 220 až 225 nm. To ukazuje obrázok 1 časti „výkresy“. Štruktúra β-skladaného listu naopak vykazuje ostrý a pozitívny prúžok v oblasti okolo 200 nm. Na podrobný opis určenia sekundárnej peptidovej štruktúry prostredníctvom CD spektra odkazujeme na Manningovu monografiu citovanú vyššie.The randomly coiled structure may be characterized by its circular dichroism ("CD") spectrum and is easily distinguishable from the β-sheet structure. As the CD spectrum shows, a random negative band between 19 and 200 nm is specific for the randomly wound structure, and a small CD signal is seen at wavelengths longer than 215 nm. If the CD signal is seen at higher wavelengths, it is very weakly positive in the 220-225 nm range. This is shown in Figure 1 of the 'drawings' section. In contrast, the β-sheet structure exhibits a sharp and positive band in the region of about 200 nm. For a detailed description of the determination of the secondary peptide structure via the CD spectrum, reference is made to the Manning monograph cited above.

Αβ peptid je v podstate v náhodne zvinutej konformácii, pokiaľ sa viac ako 50 % Αβ peptidú nachádza v tejto konformácii. Lepšie potom, pokiaľ viac ako 70 % až 80 %, najlepšie viac ako 85 % až 90 % Αβ peptidú je v náhodne zvinutej konformácii.The β-peptide is essentially in a randomly folded conformation when more than 50% of the β-peptide is in this conformation. Preferably, if more than 70% to 80%, preferably more than 85% to 90% of the β-peptide is in a randomly folded conformation.

„Parenterálne prostriedky“ sú tie, ktoré sú sterilné a vhodné na podanie priamo do organizmu, napríklad injekčné alebo infúziou, tj. cestou, ktorá má bezprostredný kontakt s krvou a ktorá je bez prirodzených bariér a protekcie imunitného systému spojená s podaním liekových foriem vstupujúcich do organizmu cez kožu, sliznicu, tráviaci alebo dýchací systém. Z týchto dôvodov je sterilita parenterálnych prostriedkov nevyhnutná."Parenteral formulations" are those which are sterile and suitable for administration directly into the body, for example by injection or infusion, i. by direct contact with blood and without natural barriers and immune system protection associated with the administration of dosage forms entering the body through the skin, mucosa, digestive or respiratory system. For these reasons, sterility of the parenteral compositions is essential.

„Infúzia“, v zmysle aplikácie lieku, je v podstate kontinuálne a pomalé pritekanie roztoku lieku do krvného riečišťa počas dlhého časového úseku. Oproti tomu „injekcia“ je rýchle podanie dávky roztoku alebo suspenzie."Infusion", in terms of drug delivery, is essentially a continuous and slow flow of a drug solution into the bloodstream over a long period of time. In contrast, "injection" is the rapid administration of a dose of a solution or suspension.

„Intravaskulárne (alebo intravenózne alebo IV), intramuskulárne (IM), intraperitoneálne (IP), subkutánne (SC), a intrastemálne“ sú všetky rôzne spôsoby podania parenterálneho prostriedku. Anatomicky opisujú oblasti tela, kam je parenterálny prostriedok vpravený injekčné alebo infúziou. Prostriedky tohto vynálezu, ktoré majú fyziologicky akceptovateľné pH, môžu byť aplikované akýmkoľvek vyššie opísaným spôsobom, čo závisí od individuálneho rozhodnutia pacienta a lekára. Roztoky s vyšším pH (pH > 8) je najvýhodnejšie podávať formou pomalej IV infúzie."Intravascular (or intravenous or IV), intramuscular (IM), intraperitoneal (IP), subcutaneous (SC), and intrastemal" are all different routes of parenteral administration. They anatomically describe areas of the body where the parenteral composition is injected or infused. The compositions of the invention having a physiologically acceptable pH can be administered by any of the methods described above, depending on the individual judgment of the patient and the physician. Solutions with a higher pH (pH > 8) are most preferably administered by slow IV infusion.

Na pochopenie výrazu „pufor“ a „pufrovacie činidlo“ tak, ako sú používané v tomto vynáleze, je dobré pripomenúť, že titračná krivka kyseliny alebo zásady má relatívne horizontálnu oblasť v rozsahu asi 1,0 pH jednotky na každej strane titračného optima. V Mračnom optime sa prítomné množstvo protónových donorov danej kyseliny alebo zásady rovná množstvu prítomných protónových akceptorov. V tejto oblasti sa pri malom zvýšení H⁺ alebo OH' iónov pH systému mení pomerne málo. Je to oblasť, v ktorej konjugovaný pár kyselina-zásada funguje ako pufor, teda systém brániaci zmenám pH pri danom zvýšení H⁺ alebo OH' iónov. Pri pH hodnotách ležiacich mimo túto oblasť má pufor menšiu kapacitu na zabránenie zmenám pH. Sila pufru je najvyššia pri pH, ktoré zodpovedá titračnému optimu jeho titračnej krivky, tj. stavu, kedy sa koncentrácie protónových donorov a akceptorov rovnajú a pH je rovné pK (kyslá disocíačná konštanta). Prípravy pufru detailne opisuje Data for Biochemical Research, rex, M.C., Oxford Science Publications, 1995.In order to understand the terms "buffer" and "buffering agent" as used herein, it should be noted that the acid or base titration curve has a relatively horizontal region in the range of about 1.0 pH units on each side of the titration optimum. In the Cloud Optimum, the amount of proton donors of a given acid or base is equal to the amount of proton acceptors present. In this region, the pH of the system changes relatively little with a small increase in H ⁺ or OH 'ions. It is an area in which the conjugated acid-base pair acts as a buffer, a system to prevent changes in pH at a given increase in H ⁺ or OH 'ions. At pH values outside this range, the buffer has less capacity to prevent pH changes. The strength of the buffer is highest at a pH that corresponds to the titration optimum of its titration curve, i. a condition where the concentrations of proton donors and acceptors are equal and the pH is equal to pK (acid dissociation constant). Buffer preparations are described in detail in Data for Biochemical Research, Rex, MC, Oxford Science Publications, 1995.

Mnoho fyziologických mechanizmov zaisťuje v organizme udržanie pH v úzkom rozmedzí od 7,35 do 7,45. Aj keď niektoré z hlavných pufrovacích mechanizmov sú založené na rovnováhe kyseliny uhličitej alebo fosforečnej, mnoho iných mechanizmov predstavujú aminokyseliny a proteíny. Napríklad pH sĺz je udržované na hodnote 7,4 proteínovým pufrom. Samotné aminokyseliny sú tiež vhodnými puframi, aj keď vykazujú komplexnejšiu titračnú krivku tým, že majú donorový aj akceptorový atóm vo vnútri jednej molekuly. Takáto molekula sa označuje ako zwiterion, tj. existuje vo forme, ktorá nesie ako pozitívne, tak i negatívne nabité miesto na jednej molekule. Aminokyseliny sú schopné pufrovať pridanie H+ aj OH- iónov, ako je ukázané nižšie.Many physiological mechanisms ensure that the body maintains a pH within a narrow range of from 7.35 to 7.45. Although some of the main buffering mechanisms are based on the equilibrium of carbonic or phosphoric acid, many other mechanisms are amino acids and proteins. For example, the tear pH is maintained at 7.4 with protein buffer. Amino acids themselves are also suitable buffers, although they exhibit a more complex titration curve by having both a donor and an acceptor atom within a single molecule. Such a molecule is referred to as zwiterion, i. it exists in a form that carries both a positively and negatively charged site on one molecule. Amino acids are able to buffer the addition of both H + and OH-ions, as shown below.

zwitterionzwitterion

zwitterion (dipolárna forma)zwitterion (dipolar form)

OHOH

Z pohľadu toho vynálezu, „farmaceutický akceptovateľný pufor“ je definovaný tak, že zahrňuje konjugovaný pár kyselina-zásada, rovnako ako kyslú alebo zásaditú zlúčeninu so schopnosťou upraviť alebo udržať pH roztoku Αβ peptidu na požadovanej úrovni. V spôsoboch rozpustenia/filtrácie tohto vynálezu, je pH 8,5 alebo vyššie, alebo inokedy nižšie, ako pH 4.In view of this invention, a "pharmaceutically acceptable buffer" is defined to include a conjugated acid-base pair as well as an acidic or basic compound with the ability to adjust or maintain the pH of the β-peptide solution at the desired level. In the dissolution / filtration methods of the invention, the pH is 8.5 or higher, or else lower than pH 4.

Takéto pufry sú vybrané predovšetkým zo skupiny tvorenej aminokyselinami, soľami a ich derivátmi, farmakologicky akceptovateľnými alkalizátormi, alkalickými hydroxidmi kovov a amóniumhydroxidmi, organickými a anorganickými kyselinami a ich soľami, a výberom ich zmesí. Pufračné činidlá sa používajú v koncentráciách dostatočných na dosiahnutie a udržanie požadovaného pH, a tak sú ich koncentrácie závislé od kyslosti/zásaditosti každého pufru alebo vybranej zmesi. Výber účinnej koncentrácie je otázkou štandardných možností odboru používajúceho napr. pH metre alebo titračnú techniku.Such buffers are preferably selected from the group consisting of amino acids, salts and derivatives thereof, pharmacologically acceptable alkalisers, alkali metal hydroxides and ammonium hydroxides, organic and inorganic acids, and salts thereof, and selecting mixtures thereof. Buffering agents are used at concentrations sufficient to achieve and maintain the desired pH, and so their concentrations depend on the acidity / alkalinity of each buffer or mixture selected. Choosing an effective concentration is a matter of standard skill in the art using e.g. pH meters or titration technique.

Príklady skupín zlúčenín vhodných pre prítomný vynález sú hydroxidy, vrátane alkalických hydroxidov kovov a amóniumhydroxidov, alkalizátory známe vo farmaceutickom priemysle, zahrňujúce (nie však výlučne) Tris, boritan sodný (Na2B₄O?) a disodiumcitrát, aminokyseliny, soli, estery alebo amíny aminokyselín a ich jednoduché deriváty, napr. N-acetyl deriváty aminokyselín. Zvlášť uprednostňovanými puframi sú glycín (napr. glycinát sodný), arginín a lyzín, hydroxid sodný a amóniumhydroxid.Examples of groups of compounds suitable for the present invention are hydroxides, including alkali metal hydroxides and ammonium hydroxides, alkalis known in the pharmaceutical industry, including but not limited to Tris, sodium borate (Na ₂ B ₄ O 2) and disodium citrate, amino acids, salts, esters or amines of amino acids and simple derivatives thereof, e.g. N-acetyl amino acid derivatives. Particularly preferred buffers are glycine (e.g., sodium glycinate), arginine and lysine, sodium hydroxide, and ammonium hydroxide.

Príklady farmaceutický akceptovateľných kyselín, ktoré je možné použiť v metódach tohto vynálezu sú, bez obmedzenia, chlorovodíková kyselina, fosforečná kyselina, citrónová kyselina, octová kyselina, maleínová kyselina, jablčná kyselina a jantárová kyselina, apod. Navyše môžu byť tieto kyseliny použité na titráciu pH zásaditých roztokov na nižšie, fyziologicky lepšie akceptované hodnoty, kedy výsledkom je prostriedok vo forme peptidovej suspenzie.Examples of pharmaceutically acceptable acids that can be used in the methods of the invention include, without limitation, hydrochloric acid, phosphoric acid, citric acid, acetic acid, maleic acid, malic acid, and succinic acid, and the like. Moreover, these acids can be used to titrate the pH of basic solutions to lower, physiologically better accepted values, resulting in a composition in the form of a peptide suspension.

Opačne môžu byť základné zlúčeniny, ako sú vyššie opísané, použité na titráciu nízkych pH hodnôt filtrovaného roztoku na fyziologicky akceptovateľnejšie pH, čo tiež vedie k vzniku peptidovej suspenzie.Conversely, the parent compounds, as described above, can be used to titrate low pH values of the filtered solution to a more physiologically acceptable pH, which also leads to the formation of a peptide suspension.

Zamýšľa sa tiež nad kombináciami činidiel upravujúcimi pH. Konjugované páry kyselina-zásada opisované vyššie a dokladané na príklade solí ako je acetát amónny sú tiež predmetom záujmu ako pufračné činidlá pre tento vynález. Takýto konjugovaný pár môže byť vytvorený napríklad titráciou zásaditého roztoku hydroxidu amónneho kyselinou octovou na roztok acetátu amónneho blízko neutrálnym hodnotám.Combinations of pH adjusting agents are also contemplated. The conjugated acid-base pairs described above and exemplified by salts such as ammonium acetate are also of interest as buffering agents for the present invention. Such a conjugate pair may be formed, for example, by titrating a basic solution of ammonium hydroxide with acetic acid to a solution of ammonium acetate near neutral values.

Výraz „modifikátor tonicity“, tak, ako je používaný v texte, zahrňuje činidlá, ktoré prispievajú na osmolalitu roztoku. Príklady modifikátorov tonicity vhodných pre tento vynález predstavujú sacharidy (cukry), ako je manitol, sacharóza a glukóza a soli ako je chlorid sodný, chlorid cínatý apod., neobmedzujú sa však len na vymenované. Prednostne budú tonizačné činidlá využité v množstve zaisťujúcom hodnotu výslednej tonicity nižšiu ako asi 350 mOsm/kg, lepšie medzi asi 250 až 350 mOsm/kg, najlepšie potom medzi 280 až asi 320 mOsm/kg. Bude ešte opísané, že nabité zlúčeniny, ktoré slúžia v prostriedku ako pufry, môžu tiež ovplyvniť tonicitu. Tým je tonicita pufrovaného roztoku Αβ peptidu prvýkrát určená skôr, ako je upravovaná pridaním činidiel modifikujúcich tonicitu.The term "tonicity modifier" as used herein includes agents that contribute to the osmolality of a solution. Examples of tonicity modifiers suitable for the present invention include saccharides (sugars) such as mannitol, sucrose and glucose, and salts such as sodium chloride, stannous chloride and the like, but are not limited thereto. Preferably, the tonicity agents will be employed in an amount to provide a resulting tonicity of less than about 350 mOsm / kg, more preferably between about 250 to 350 mOsm / kg, most preferably between 280 to about 320 mOsm / kg. It will be further described that charged compounds that serve as buffers in the formulation can also affect tonicity. Thus, the tonicity of the buffered solution of the Aβ peptide is first determined before being adjusted by the addition of tonicity modifying agents.

Použitie chelačného činidla v postupoch a prostriedkoch vynálezu nie je nutné. Príklady preferovaných chelátov zahrňujú etyléndiamíntetraoctovú kyselinu (EDTA) a jej soli (ako sú sodné), ktoré sú normálne používané v koncentrácii od 0,05 do 50 mM, prednostne v koncentráciách od 0,05 do 10 mM alebo najlepšie okolo 0,1 až 5 mM. Iné známe chelačné (alebo izolačné) činidlá, ako niektoré polyvinylalkoholy, môžu byť tiež použité.The use of a chelating agent in the methods and compositions of the invention is not necessary. Examples of preferred chelates include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and its salts (such as sodium), which are normally used at a concentration of 0.05 to 50 mM, preferably at a concentration of 0.05 to 10 mM, or most preferably about 0.1 to 5 mM. mM. Other known chelating (or insulating) agents, such as some polyvinyl alcohols, may also be used.

Podľa voľby môže prostriedok obsahovať surfaktant alebo detergent, ako je sorbit (polysorbáte) (napr. Tween®) alebo 4-(1,1,4,4-tetrametylbutyl) fenyloxypolyeto xyetanol (Triton®) alebo polyméry polyetylénpolypropylénglykolov (Pluronics®). Surfaktanty sa pohybujú v rozmedzí od asi 0,005 do 1 %, prednostne okolo 0,02 až 0,75 %. Preferovaný polysorbit je PS-80 komerčne dostupný ako Tween® 80.Optionally, the composition may contain a surfactant or detergent such as sorbitol (polysorbate) (e.g., Tween®) or 4- (1,1,4,4-tetramethylbutyl) phenyloxypolyethoxyethanol (Triton®) or polyethylene polypropylene glycol polymers (Pluronics®). The surfactants range from about 0.005 to 1%, preferably about 0.02 to 0.75%. A preferred polysorbite is PS-80 commercially available as Tween® 80.

Zvlhčovacie činidlá sú tiež zamýšľanou inertnou zložkou vynálezu. Polyetylénglykoly, napr. PEG 3350, sú vhodné na modifikáciu združovania Αβ častíc a ich asociácií s povrchom polyméru a na usporiadanie hydrofilných častí molekuly vo vodnom prostredí. Zvlhčovacie činidlá môžu byť prítomné v množstve od 0,5 do 5 % (hmotnostných).Wetting agents are also contemplated as inert ingredients of the invention. Polyethylene glycols, e.g. PEG 3350 are useful for modifying the association of Αβ particles and their association with the polymer surface, and for arranging hydrophilic portions of the molecule in an aqueous environment. The humectants may be present in an amount of from 0.5 to 5% by weight.

Farmaceutický akceptovateľné cukry (napr. sacharóza, dextróza, maltóza alebo laktóza) alebo farmaceutický akceptovateľné cukrové alkoholy (napr. manitol, xylitol alebo sorbitol) nemajú žiadny vplyv na liečebné efekty účinných zložiek. Z určitého aspektu tohto vynálezu môžu byť použité cukry alebo cukrové alkoholy, ktorých molekulová hmotnosť je menšia ako 500 a ktoré sa ľahko rozpustia a dispergujú vo vode. Príklady cukrov a cukrových alkoholov, ktoré je možné použiť v prítomnom vynáleze, zahrňujú xylitol, manitol, sorbitol, arabinózu, ribózu, xylózu, glukózu, manózu, galaktózu, sacharózu, laktózu apod. Môžu byť použité samostatne alebo ako zmes dvoch alebo viacerých z týchto zlúčenín. Navyše preferovaným cukrom je manitol, predovšetkým v lyofilizovaných prostriedkoch, sacharóza sa ešte uprednostňuje v prostriedkoch vo forme roztoku.Pharmaceutically acceptable sugars (e.g. sucrose, dextrose, maltose or lactose) or pharmaceutically acceptable sugar alcohols (e.g. mannitol, xylitol or sorbitol) have no effect on the therapeutic effects of the active ingredients. In a particular aspect of the invention, sugars or sugar alcohols having a molecular weight of less than 500 and which are readily dissolved and dispersed in water may be used. Examples of sugars and sugar alcohols that can be used in the present invention include xylitol, mannitol, sorbitol, arabinose, ribose, xylose, glucose, mannose, galactose, sucrose, lactose and the like. They may be used alone or as a mixture of two or more of these compounds. In addition, the preferred sugar is mannitol, especially in lyophilized compositions, sucrose is even more preferably in solution compositions.

Bolo zaznamenané, že použitie QS-21 ako adjuvans („nosiča“) v prostriedku vynálezu interaguje so suspendovaným proteínom takým spôsobom, že vznikne vizuálne priehľadná suspenzia. Toto je žiaduca interakcia, kedy je peptid v konformácii β-skladaného listu, aleje suspendovaný vo fáze vo forme veľmi malých častíc a môže poskytovať danému prostriedku výhodnejšie vlastnosti, ako zvýšenie stability suspenzie. DPPC (dipalmitoylfosfatidylcholín) je v odbore známy a očakáva sa, že interaguje s Αβ peptidom podobným spôsobom ako QS-21 poskytujúcim rovnakú suspenziu malých častíc a zvažuje sa jeho použitie ako ďalšieho adjuvans vo vynáleze pri poskytnutí vizuálne čírej suspenzie. Prípadne môžu byť použité ďalšie adjuvans v prímesi s QS-21.It has been noted that the use of QS-21 as an adjuvant ("carrier") in the composition of the invention interacts with the suspended protein in such a way as to form a visually transparent suspension. This is a desirable interaction where the peptide is in the conformation of the β-sheet but is suspended in phase as very small particles and may give the composition more advantageous properties than enhancing the stability of the suspension. DPPC (dipalmitoylphosphatidylcholine) is known in the art and is expected to interact with the Αβ peptide in a manner similar to QS-21 providing the same small particle suspension and is contemplated for use as another adjuvant in the invention to provide a visually clear suspension. Alternatively, other adjuvants may be used in admixture with QS-21.

Lyofilizácia je technika dobre známa vo farmaceutických technikách, ako sú postupy na stabilizáciu peptidov počas a po lyofilizačnom procese. Stabilizácia proteínu alebo peptidového lyofilizátu v aminokyselinovej, sacharidovej matrici je tiež známou možnosťou v odbore. Viď napr. : Lueckel B., et al., Formulations of sugars with amino acids or mannitol - Influence of concentration ratio on the properties of the freeze-concentrate and the lyofilisate, PHARM. DEV. TECHNOL. 3(3) pp. 325336 (1998). The Royal Pharmaceutical Society of GB Symp: „New Analytical Approaches to the Charakterisation of Biotechnology Products, jún 1996 Luckel B., et al., predstavil: A strategy for optimizing the lyofilisation of biotechnological Products, PHARM. SCI. (UK) 3(1) pp. 3-8 (1997). Obidva tieto odkazy sú týmto začlenené poznámkou v celom svojom rozsahu.Lyophilization is a technique well known in pharmaceutical techniques, such as procedures for stabilizing peptides during and after the lyophilization process. Stabilization of a protein or peptide lyophilisate in an amino acid, carbohydrate matrix is also a known option in the art. See e.g. : Lueckel B., et al., Formulations of Sugars with Amino Acids or Mannitol - Influence of Concentration Ratio on Properties of Freeze-Concentrate and Lyophilisate, PHARM. DEV. TECHNOL. 3 (3) s. 325,336 (1998). The Royal Pharmaceutical Society of GB Symp: “New Analytical Approaches to the Characterization of Biotechnology Products, June 1996 Luckel B., et al., Presented: A strategy for optimizing the lyophilization of biotechnological products, PHARM. SCI. (UK) 3 (1) s. 3-8 (1997). Both references are hereby incorporated by reference in their entirety.

Termín „farmakologicky akceptovateľný určuje akýkoľvek prostriedok v tom zmysle, že prostriedok nenesie žiadne škodlivé alebo nečakané účinky pre subjekt, ktorému je podaný a v súvislosti, v ktorej je podaný. Výrazy „farmakologicky akceptovateľné rozpúšťadlo“ a „farmakologicky akceptovateľné inertné vehikulum“ sa vzťahuje na akúkoľvek zlúčeninu, ktorá chráni alebo nepoškodzuje aktivitu účinných zlúčenín(y) a nemá žiadne škodlivé alebo nečakané účinky pre subjekt, ktorému je podaná a v súvislosti, v ktorej je podaná, ako netoxické činidlo upravujúce pH, pufračné činidlo alebo tonicitu modifikujúce činidlo alebo chelačné činidlo, apod..The term "pharmacologically acceptable" refers to any composition in the sense that the composition does not produce any harmful or unexpected effects for the subject to which it is administered and in the context in which it is administered. The terms "pharmacologically acceptable solvent" and "pharmacologically acceptable inert vehicle" refer to any compound that protects or does not harm the activity of the active compounds (s) and has no harmful or unexpected effects on the subject to which it is administered and in the context in which it is administered, as a non-toxic pH adjusting agent, buffering agent or tonicity modifying agent or chelating agent, and the like.

Prostriedok alebo postupy „zahrňujúce“ jednu alebo viac spomínaných zložiek môžu zahrňovať ďalšie zložky, ktoré neboli špecificky opísané. Napríklad prostriedok, ktorý obsahuje Αβ peptid zahrňuje jednak Αβ peptid v podobe opísaného prostriedku a Αβ peptid ako súčasť prostriedku s ďalšími nespomínanými zložkami.A composition or process "comprising" one or more of said components may include other components not specifically described. For example, a composition comprising an βb peptide includes both an βb peptide in the form of the disclosed composition and an βb peptide as part of a composition with other components not mentioned.

Ďalšie definície sú nasledujúce:Other definitions are as follows:

Skratky °CAbbreviations ° C

C.D.C. D.

PHPH

Definícia stupne Celzia cirkulárny dichroizmus log [H⁺], stanovenie obsahu vodíkových pKDegree definition Celsius circular dichroism log [H ⁺ ], determination of hydrogen pK content

PS-80 μιτι min.PS-80 min.

mlml

MM

N mMN mM

DMSODMSO

EDTAEDTA

TrisTris

RP-HPLC rpmRP-HPLC rpm

CFA/IFACFA / IFA

MPLMPL

QS-21 iónov a tým acidity alebo bazicity roztoku kyslá disociačná konštanta súvisiaca s pH podľa vzťahu:QS-21 ions and thus the acidity or basicity of the acid pH-related dissociation constant according to the relation:

[akceptorov H⁺] pH = pK + log--------------------[donorov H⁺] polysorbit 80 alebo zmesný polymér polysorbitu 80 a etylénoxidu Tween 80®; monografia Merck Index č. 7559 (11 .vydanie) mikrometer minúta mililiter molarita, veličina určená mólmi/liter normalita-označenie molarity roztoku milimól dimetylsulfoxid etyléndiamíntetraacetát, obvykle vo forme disodnej soli trimetamín, tris(hydroxymetyl)aminometán, monograf. Merck Index č. 9684 (11.vyd.) rezervná fáza vysoko účinnej kvapalinovej chromatografie otáčky za minútu kompletné Freundovo adjuvans/nekompletné Fr. adjuvans (Chang et al., Advances Drug Delivery Reviews 32, 173-186(1998))[H ⁺ acceptors] pH = pK + log -------------------- [H ⁺ donors] polysorbite 80 or a blend of polysorbite 80 and Tween 80® ethylene oxide; monograph Merck Index no. 7559 (11th edition) micrometer minute milliliter molarity, molarity / liter normality-molarity of the solution millimolar dimethylsulphoxide ethylenediaminetetraacetate, usually in the form of trimethamine disodium, tris (hydroxymethyl) aminomethane, monograph. Merck Index no. 9684 (11th ed.) Reserve phase of high performance liquid chromatography rpm complete Freund's adjuvant / incomplete Fr. adjuvants (Chang et al., Advances Drug Delivery Reviews 32: 173-186 (1998))

3-O-deacylovaný monofosforylovaný lipid A (MPL™) (viď napr. GB 2220211) triterpénglykozid alebo saponín izolovaný z kôry stromu Qiullaja Saponaria Molina pôvodom z Južnej Ameriky (viď Kensil et al., z Vaccine design: The Subunit and adjuvant Approach (Powell & Newman, Plénum Press, NY, 1995); US Pat. No. 5,057,540). (Stimulon™ QS-21)3-O-deacylated monophosphorylated lipid A (MPL ™) (see, for example, GB 2220211) triterpene glycoside or saponin isolated from the bark of Qiullaja Saponaria Molina native to South America (see Kensil et al., Vaccine design: The Subunit and adjuvant Approach) Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); US Pat. No. 5,057,540). Stimulon ™ QS-21

FIO len pre informáciuFIO for information only

Filtrácia je proces oddeľovania kontaminant z tekutiny na základe veľkosti priechodu membránovým filtrom, ktorého póry majú jednotnú veľkosť. Aj keď častice veľkosti mikrometrov môžu byť oddelené použitím nemembránových alebo hustých materiálov, ako tých nájdených vo fibróznom médiu, len membránové filtre s presne definovanou veľkosťou pórov môžu zaistiť kvantitatívne oddelenie častíc s menšou veľkosťou. Tak je membránovou filtráciou možné kvantitatívne odstrániť baktérie z roztoku, ktoré prejdú mikrofiltrom, a tým ho sterilizovať. Predtým v súvislosti s purifikáciou Αβ peptidu bol peptid natoľko nerozpustný, alebo zostával agregovaný do tej miery, že roztok nemohol byť mikrofiltrovaný na komerčnom zariadení, pretože dochádzalo k upchatiu membrány časticami, a/alebo nízkemu zisku peptidu vo výslednom mikrofiltráte.Filtration is the process of separating contaminants from a fluid based on the size of the passage through a membrane filter whose pores have a uniform size. Although micrometer-sized particles can be separated using non-membrane or dense materials such as those found in fibrous media, only membrane filters with a precisely defined pore size can ensure quantitative separation of smaller particle sizes. Thus, membrane filtration can quantitatively remove bacteria from the solution that pass through the microfilter and thereby sterilize it. Previously, in connection with the purification of the ββ peptide, the peptide was so insoluble or remained aggregated to the extent that the solution could not be microfiltered on a commercial device because of membrane clogging by particles and / or low peptide yield in the resulting microfiltrate.

Používané filtre sú všeobecne definované ako filtre, ktoré majú schopnosť oddeliť častice s veľkosťou 0,2 mikrometrov a viac.The filters used are generally defined as having the ability to separate particles of 0.2 microns or more.

Membránový filter jednotne pridelený substrátu všeobecne umožňuje separáciu na základe veľkosti na povrchu membrány. Aj tak, môžu povrchové membránové filtre zachycovať častice jednak vo vnútri svojej štruktúry, aj na povrchu membrány. Pri separácii na základe veľkosti, prechádzajú častice menšie ako póry membrány filtrom, zatiaľ čo väčšie častice zostávajú na povrchu membrány. Pretože sa tieto filtre s definovanou veľkosťou „nevyprázdňujú“ (tj. ako sa filter začína plniť zachycovanými časticami, môže pri rastúcom prietokovom tlaku dôjsť k priechodu malého množstva zachytených častíc) sú podrobované mikrobiologickej kontrole. Sterílizačné povrchové membránové filtre sú vo farmaceutickom priemysle dobre známe.The membrane filter uniformly assigned to the substrate generally allows size separation on the membrane surface. Nevertheless, surface membrane filters can retain particles both within their structure and on the membrane surface. In size-based separation, particles smaller than the membrane pores pass through the filter, while larger particles remain on the membrane surface. Since these filters with a defined size do not "empty" (ie, as the filter begins to fill with trapped particles, a small amount of trapped particles may pass through the increasing flow pressure) are subjected to microbiological control. Sterilizing surface membrane filters are well known in the pharmaceutical industry.

Vo všetkých použitiach filtrácie môže byť priepustnosť filtra narušená chemickými, molekulárnymi alebo elektrostatickými vlastnosťami filtra, avšak bolo opísané, že hydrofilné filtre používané na tento vynález sú stabilné v prostredí vysokého alebo naopak nízkeho pH, ktoré závisí od použitej metódy, a spoľahlivo oddeľujú nežiaduce častice bez toho, aby sa upchávali. Závisí od znalostí štandardne schopného pracovníka, aby bol schopný vybrať a použiť hydrofilný mikrofilter. Špecifikácia komerčne dostupných produktov alebo webovej stránky ako:In all filtration applications, the permeability of the filter can be impaired by the chemical, molecular or electrostatic properties of the filter, but it has been described that the hydrophilic filters used for the present invention are stable in high or low pH environments depending on the method used and reliably separate unwanted particles without to be clogged. It depends on the knowledge of a standard worker to be able to select and use a hydrophilic microfilter. Specifying a commercially available product or website such as:

http://millispider.millipore.com/corporate/sitemap.nsf/catalogd ( mája 1999) umožňuje výber filtra s požadovanými vlastnosťami.http://millispider.millipore.com/corporate/sitemap.nsf/catalogd (May 1999) allows you to select a filter with the desired properties.

Príklady filtrov, ktoré sú preferované a používané v prítomnom vynáleze, sú Millipore Durapore®, tiež nazývaný Millex GV, (Millipore Corporation, hlavné sídlo Bedford, MA), hydrofilný polymér polyvinylidénfluorid, ktorý má dobrú stabilitu a nízke proteín-väzbové vlastnosti a póry s priemerom 0,22 pm; Millex GN™, hydrofilný nylonový materiál s pórmi s veľkosťou 0,2 pm; a Millex GP™, hydrofilný polyétersulfónový polymér s povrchovou úpravou a pórmi s veľkosťou 0,22 pm. Navyše sa preferuje Durapore vzhľadom na jeho stabilitu pri pH 9 až 9,5.Examples of filters that are preferred and used in the present invention are Millipore Durapore®, also called Millex GV, (Millipore Corporation, Bedford, MA), a hydrophilic polyvinylidene fluoride polymer having good stability and low protein-binding properties and pores with 0.22 µm diameter; Millex GN ™, a 0.2 µm hydrophilic nylon material with pores; and Millex GP ™, a hydrophilic polyether sulfone polymer with a 0.22 µm pore finish. In addition, Durapore is preferred due to its stability at pH 9 to 9.5.

Ideálne je prakticky celý Αβ peptid znovu získaný z filtrácie. Získanie prakticky celého Αβ peptidu je definované tak, že viac ako asi 50 % peptidu je získané zo sterilnej filtrácie. Prednostne viac ako 80 % Αβ peptidu a viac sa uprednostňuje získaním viac ako 90 % Αβ peptidu z filtrácie.Ideally, virtually all of the β-peptide is recovered from filtration. The recovery of virtually all of the Aβ peptide is defined such that more than about 50% of the peptide is obtained from sterile filtration. Preferably, more than 80% of the Αβ peptide and more preferably is obtained by obtaining more than 90% of the Αβ peptide from the filtration.

Metódytechniques

Metódy tohto vynálezu predstavujú prípravu vodných prostriedkov s koncentráciami najmenej 0,01 mg/ml Αβ peptidu. Také prostriedky sú pripravené úpravou pH roztoku tak, že sa v ňom Αβ peptid rozpustí pri dosiahnutí požadovanej koncentrácie v rozmedzí od asi 0,1 mg/ml do asi 2,0 mg/ml).The methods of the invention comprise the preparation of aqueous compositions with concentrations of at least 0.01 mg / ml β-peptide. Such compositions are prepared by adjusting the pH of the solution so that the β-peptide is dissolved therein to achieve the desired concentration (from about 0.1 mg / ml to about 2.0 mg / ml).

Úprava pH vodného roztoku sa dosahuje bežnými postupmi, ktoré typicky ilustrujú pridanie buď kyseliny alebo zásady na získanie požadovaného pH. Použitá kyselina alebo zásada je v použitom množstve farmakologicky akceptovateľná. S cieľom udržať pH roztoku počas dlhšieho skladovania je dobré použiť v prostriedku farmakologicky akceptovateľný pufor. Výber vhodného pufru, vzhľadom na požadované pH, je otázkou znalostí v odbore.Adjustment of the pH of the aqueous solution is accomplished by conventional procedures, which typically illustrate the addition of either an acid or a base to obtain the desired pH. The acid or base used is pharmacologically acceptable in the amount used. In order to maintain the pH of the solution during prolonged storage, it is advisable to use a pharmacologically acceptable buffer in the formulation. The choice of a suitable buffer with respect to the desired pH is a matter of skill in the art.

Odporúča sa, aby pH vodného roztoku bolo upravené na hodnotu okolo pH 2 až pH 4 alebo okolo pH 8,5 až pH 12. Pri takých pH je Αβ peptid prekvapivo rozpustný.It is recommended that the pH of the aqueous solution be adjusted to about pH 2 to pH 4 or about pH 8.5 to pH 12. At such pHs, the β-peptide is surprisingly soluble.

Pokiaľ je postup vynálezu uskutočňovaný pri nízkom pH (okolo pH 2 a 4), potom môžu byť na zníženie pH na požadovanú hodnotu použité kyseliny ako sú halogénvodíkové kyseliny (napr. HCI, HBr), kyselina fosforečná, citrónová a octová a ďalšie farmakologicky akceptovateľné kyseliny. Výber vhodných kyselín je otázkou znalostí v odbore.If the process of the invention is carried out at low pH (around pH 2 and 4), acids such as hydrohalic acids (e.g. HCl, HBr), phosphoric acid, citric acid and acetic acid and other pharmacologically acceptable acids can be used to lower the pH to the desired value. . The selection of suitable acids is a matter of skill in the art.

Pokiaľ je postup vynálezu uskutočňovaný pri vysokom pH (okolo pH 8,5 až 12), potom môžu byť na zvýšenie pH na požadovanú hodnotu použité farmakologicky akceptovateľné zásady, ako sú alkalické kovy, amóniumhydroxidy (napr. NaOH, NH4OH) apod.. Pri vysokých hodnotách pH, je pH roztoku v danom pufri prednostne upravené na rozmedzie medzi 8,5 až 11. Najlepšie je pH pohybujúce sa v rozmedzí pH 9 až 10.If the process of the invention is carried out at high pH (about pH 8.5-12), pharmacologically acceptable bases such as alkali metals, ammonium hydroxides (e.g. NaOH, NH 4 OH) and the like can be used to raise the pH to the desired value. pH, the pH of the solution in the buffer is preferably adjusted to between 8.5 and 11. Preferably, the pH is in the range of 9 to 10.

Pred alebo následne po úprave pH je do roztoku pridaná požadovaná koncentrácia Αβ peptidu. Preferuje sa samozrejme pridanie Αβ peptidu po úprave pH s cieľom bezprostredného rozpustenia peptidu. Po jeho pridaní môže byť nevyhnutné rozpustenie pomocou jemného trepania a zahriatia.Prior to or subsequent to pH adjustment, the desired concentration of ββ peptide is added to the solution. Of course, it is preferred to add β-peptide after pH adjustment to immediately dissolve the peptide. After addition, dissolution by gentle shaking and heating may be necessary.

Pridanie akejkoľvek z voliteľných prísad, ako sú farmakologicky akceptovateľné pufry, tonicitu modifikujúce činidlá, nosiče, atď. do prostriedku je možné v akomkoľvek vhodnom okamžiku pred alebo po pridaní Αβ peptidu.Addition of any of the optional ingredients, such as pharmacologically acceptable buffers, tonicity-modifying agents, carriers, etc. it is possible to form the composition at any convenient time before or after the addition of the β-peptide.

Akonáhle je vyššie opísaný roztok pripravený, je možné pokračovať sterilizačnou filtráciou a/alebo lyofilizáciou podľa postupov v odbore dobre známych, ktoré sú ilustrované nižšie v Príkladoch.Once the solution described above is prepared, sterilization filtration and / or lyophilization may be continued according to procedures well known in the art, as illustrated in the Examples below.

Nasledujúce roztoky sú pufračné systémy preferované na rozpustenie Αβ peptidu s dosiahnutím cieľovej koncentrácie v rozmedzí od 0,6 do 2 mg/ml peptidu:The following solutions are buffer systems preferred to dissolve the Αβ peptide to achieve a target concentration ranging from 0.6 to 2 mg / ml peptide:

Uprednostňované aminokyselinové prostriedky:Preferred amino acid compositions:

mM glycinát sodný, pH 9,0, 9,5 alebo 10,0 a/alebo s 0,02 až 1,0 % (hmotnostných) polysorbitom 80 (PS-80) podľa voľby, obsahujúce jeden alebo viac modifikátorov tonicity tak, aby vyhovovalo parenterálnemu podaniu;mM sodium glycinate, pH 9.0, 9.5 or 10.0 and / or with 0.02 to 1.0% (w / w) polysorbite 80 (PS-80) of choice, comprising one or more tonicity modifiers such that suitable for parenteral administration;

mM L-arginín-HCI alebo 10 mM L-Lyzinát, obidva s pH 9,0, 10,0 a/alebo s 0,02 až 1,0 % (hmotnostných) polysorbitom 80 (PS-80) podľa voľby obsahujúce jeden alebo viac modifikátorov tonicity tak, aby vyhovovalo parenterálnemu podaniu.mM L-arginine-HCl or 10 mM L-Lysinate, both pH 9.0, 10.0 and / or 0.02 to 1.0% (w / w) polysorbite 80 (PS-80) optionally containing one or multiple tonicity modifiers to suit parenteral administration.

Prostriedky prítomného vynálezu je optimálne skladovať pri nízkej teplote, aby sa zabránilo degradácii alebo agregácii peptidových reťazcov. Vhodné teplotné rozmedzie na skladovanie prostriedkov Αβ peptidu sa pohybuje od 2 do 8 °C.The compositions of the present invention are optimally stored at low temperature to prevent degradation or aggregation of the peptide chains. A suitable temperature range for storing the ββ peptide compositions is from 2 to 8 ° C.

Nasledujúce príklady ilustrujú uplatnenie vynálezu. Tieto príklady sú len ilustratívne a nesnažia sa v akomkoľvek smere obmedziť rozsah nárokov vynálezu.The following examples illustrate the practice of the invention. These examples are illustrative only and are not intended to limit the scope of the invention in any way.

Prehľad obrázkov na výkresochBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Obrázok 1 je C.D. spektrum ukazujúce meranie priemeru zvyškovej elipticity vyjadrenej v závislosti od vlnovej dĺžky pre dva rôzne roztoky Αβ42. Prerušovaná čiara ukazuje absorbanciu pri pH 6 a je možné ju priradiť k štruktúre β skladaného listu. Plná čiara vyjadruje absorbanciu roztoku Αβ42 pri pH 9 a ukazuje na náhodne zvinutú štruktúru peptidu.Figure 1 is a C.D. spectrum showing the measurement of the mean wavelength of the residual ellipticity for two different solutions Αβ42. The dashed line shows the absorbance at pH 6 and can be attributed to the β-sheet structure. The solid line indicates the absorbance of the Αβ42 solution at pH 9 and indicates a randomly folded peptide structure.

Obrázok 2 je vyjadrenie porovnania Αβ42 umiestneného do roztoku a odhadu pikovej plochy na množstvo rozpusteného peptidu určené pomocou reverznej fázy HPLC (high performance liquid chromatography) vyjadrujúce rozpustnosť Αβ42.Figure 2 is a representation of a comparison of 42β42 placed in solution and an estimate of the peak area for the amount of dissolved peptide determined by reverse phase HPLC (high performance liquid chromatography) expressing the solubility of Αβ42.

Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Príklad 1: Rozpustnosť peptiduExample 1: Solubility of Peptide

Peptid a činidláPeptide and reagents

Αβ42 bol získaný vo forme jeho trifluóracetátovej soli od American Peptide Co., Lot Numbers M05503T1, M10028T1 a bol použitý bez ďalšej modifikácie. Iné soli sú dostupné a boli úspešne použité v postupoch vynálezu. Na príklady iónov solí s opačným nábojom viď tabuľku 2. Všetky kyseliny, zásady a pufry boli pripravené z kvalitných laboratórnych reagencií a boli pre ľahké použitie skladované vo forme sterilných prefiitrovaných zásobných roztokov. Polysorbit 80 (Tween 80, PS-80): 40 % zásobný roztok bol pripravený zriedením (hmotnostným) slabého roztoku PS-80 peroxidu (10 % roztoky slabého peroxidu polysorbitanmonooleátu je možné získať napríklad od Aldrich-Sigma Chemicals).Ββ42 was obtained as its trifluoroacetate salt from American Peptide Co., Lot Numbers M05503T1, M10028T1 and was used without further modification. Other salts are available and have been used successfully in the methods of the invention. For examples of counterion salt ions, see Table 2. All acids, bases, and buffers were prepared from high quality laboratory reagents and stored for ease of use in sterile, filtered, stock solutions. Polysorbite 80 (Tween 80, PS-80): A 40% stock solution was prepared by diluting (w / w) a weak solution of PS-80 peroxide (10% weak peroxide solutions of polysorbitan monooleate can be obtained, for example, from Aldrich-Sigma Chemicals).

Rozpustnosť peptiduSolubility of the peptide

Navážené bolo približne 500 až 700 pg Αβ peptidu a potom rozpustené v zodpovedajúcom množstve pufrového roztoku za získania, hypoteticky, výslednej koncentrácie 0,6, 0,8 alebo 1,0 mg/ml Αβ42. Peptid bol navážený priamo do 4 ml sklenených fľaštičiek (Wheaton) so závitovým vrchnákom. Po pridaní primeraného množstva pufrového roztoku bol peptid mierne premiešavaný v čase 15 až 60 minút. Bola vizuálne hodnotená rozpustnosť roztokov podľa nasledujúcej stupnice:Approximately 500 to 700 µg of ββ peptide was weighed and then dissolved in an appropriate amount of buffer solution to obtain, hypothetically, a final concentration of 0.6, 0.8 or 1.0 mg / mL ββ42. The peptide was weighed directly into 4 ml glass vials (Wheaton) with a screw cap. After addition of an appropriate amount of buffer solution, the peptide was mixed gently for 15 to 60 minutes. The solubility of the solutions was visually evaluated according to the following scale:

(+) = nízka rozpustnosť, zakalená suspenzia, (++) = čistá suspenzia s niekoľkými nerozpustnými zhlukmi, (+++) = čistý roztok.(+) = low solubility, cloudy suspension, (++) = pure suspension with several insoluble aggregates, (+++) = pure solution.

Tabuľka 1. Vizuálne hodnotenie rozpustnosti roztokovTable 1. Visual evaluation of solubility of solutions

I Pufor I Pufor Výsledná koncentrácia Αβ42 (mg/ml) Final concentration Αβ42 (mg / ml) Vizuálna Rozpustnos ť Visual Solubility ť 0,01 N NaOH 0.01 N NaOH 1,0, 0,8 1.0, 0.8 +++ +++ 0,01 N NH₄OH0.01 N NH ₄ OH 1,0, 0,8 1.0, 0.8 +++ +++ 50 mM glycinát sodný, pH 9,0 50 mM sodium glycinate, pH 9.0 1,0 1.0 +++ +++ 10 mM glycinát sodný, pH 9,0 10 mM sodium glycinate, pH 9.0 1,0, 0,8, 0,6 1.0, 0.8, 0.6 +++ +++ 10 mM glycinát sodný, pH 9,5 10 mM sodium glycinate, pH 9.5 0,6 0.6 +++ +++ 10 mM glycinát sodný, pH 10 10 mM sodium glycinate, pH 10 1,0, 0,8 1.0, 0.8 +++ +++ 10 mM glycinát sodný, pH 9,0, 0,02% PS-80 10 mM sodium glycinate, pH 9.0, 0.02% PS-80 1,0 1.0 +++ +++ 10 mM glycinát sodný, pH 9,5, 0,01% PS-80, 5% sacharóza 10 mM sodium glycinate, pH 9.5, 0.01% PS-80, 5% sucrose 0,6 0.6 +++ +++ 10 mM glycinát sodný, pH 9,5, 4% manitol, 1 % sacharóza 10 mM sodium glycinate, pH 9.5, 4% mannitol, 1% sucrose 0,6 0.6 ++4* 4 * ++ 10 mM glycinát sodný, pH 9,5, 4% manitol 10 mM sodium glycinate, pH 9.5, 4% mannitol 0,6 0.6 +++ +++ 10 mM glycinát sodný, pH 10,0, 0,02% PS-80 10 mM sodium glycinate, pH 10.0, 0.02% PS-80 1,0 1.0 +++ +++ 10 mM L-arginín-HCI, pH 9,0 10 mM L-arginine-HCl, pH 9.0 0,6 0.6 +++ +++ 10 mM L-arginín-HCI, pH 10,0 10 mM L-arginine-HCl, pH 10.0 0,8 0.8 +++ +++ 10 mM L-lyzinát sodný, pH 9,0 10 mM sodium L-lysinate, pH 9.0 0,8, 0,6 0.8, 0.6 +++ +++ 10 mM L-lyzinát sodný, pH 10,0 10 mM sodium L-lysinate, pH 10.0 0,8 0.8 +++ +++ 10 mM L-lyzinát sodný, pH 9,0 10 mM sodium L-lysinate, pH 9.0 0,6 0.6 +++ +++ 10 mM acetát amónny, pH 9,0 10 mM ammonium acetate, pH 9.0 1,0 1.0 +++ +++ 10 mM acetát amónny, pH 9,0, 0,02% PS-80 10 mM ammonium acetate, pH 9.0, 0.02% PS-80 1,0 1.0 +++ +++ 50 mM tris-HCI, pH 10,0, EDTA (0,5 mM), 0,02% PS-80 50 mM Tris-HCl, pH 10.0, EDTA (0.5 mM), 0.02% PS-80 1,0 1.0 ++ ++ 10 mM borát sodný, pH 9,0 10 mM sodium borate, pH 9.0 1,0 1.0 +++ +++

10 mM A-acetyl-D-glutamín sodný, pH 9,0 10 mM sodium A-acetyl-D-glutamine, pH 9.0 0,8 0.8 + + + + + + 10 mM glycín-HCI, pH 3,0 10 mM glycine-HCl, pH 3.0 1,0 1.0 ++ ++ 0,01 A HCI 0.01 A HCl 1,0 1.0 +++ +++ 0,01 M kyselina fosforečná 0.01 M phosphoric acid 1,0 1.0 +++ +++ _; DMSO (čistý) _; DMSO (pure) 0,6 0.6 +++ +++ 10 mM glycinát sodný, pH 8,0 10 mM sodium glycinate, pH 8.0 1,0 1.0 ++ ++ 10 mM L-arginín-HCI, pH 9,0 10 mM L-arginine-HCl, pH 9.0 1,0, 0,8 1.0, 0.8 ++ ++ ;10 mM hydrogénuhličitan sodnoamónny, pH 9,0 10 mM sodium ammonium bicarbonate, pH 9.0 0,8 0.8 ++ ++ 10 mM uhličitan sodnoamónny, pH 9,0 10 mM sodium ammonium carbonate, pH 9.0 0,8 0.8 ++ ++ 50 mM Tris-HCl, pH 10,0, EDTA (0,5 mM) 50 mM Tris-HCl, pH 10.0, EDTA (0.5 mM) 1,0 1.0 ++ ++ 10 mM borát sodný, pH 10,0 10 mM sodium borate, pH 10.0 1,0 1.0 +-+ + - + 10 mM L-arginín-HCI, pH 8,0 10 mM L-arginine-HCl, pH 8.0 1,o 1 of + + 10 mM acetát amónny, pH 8,0 10 mM ammonium acetate, pH 8.0 1,0 1.0 + + 10 mM acetát amónny, pH 8,0, 0,02 % PS-80 10 mM ammonium acetate, pH 8.0, 0.02% PS-80 1,0 1.0 + + 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, pH 9,0 alebo pH 10,0 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, pH 9.0 or pH 10,0 1,0 1.0 + + 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 alebo pH 9,0 s 0,5 mM EDTA 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 or pH 9.0 with 0.5 mM EDTA 1,0 1.0 + + 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 alebo pH 9,0 s 0,5 mM EDTA a 0,02 % PS-80 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 or pH 9.0 with 0.5 mM EDTA and 0.02% PS-80 1,0 1.0 + + 50 mM alebo 100 mM NaCl, pH 9,0 50 mM or 100 mM NaCl, pH 9.0 1,0 1.0 + + 50 mM fosforečnan sodný, pH 8,0, pH 9,0 alebo pH 10,0 50 mM sodium phosphate, pH 8.0, pH 9.0 or pH 10.0 1,0 1.0 + + 50 mM glycinát sodný, pH 8,0 alebo pH 10,0 50 mM sodium glycinate, pH 8.0 or pH 10.0 1,0 1.0 + + 10 mM N-acetyl-D-glukózamín sodný, pH 10,0 10 mM sodium N-acetyl-D-glucosamine, pH 10,0 0,8 0.8 + + 10 mM N-acetyl-D-glutamín sodný, pH 10,0 10 mM sodium N-acetyl-D-glutamine, pH 10.0 0,8 0.8 + + 10 mM citrát sodný, pH 3,0 alebo pH 4,0 10 mM sodium citrate, pH 3.0 or pH 4.0 1,0 1.0 + + 10 mM acetát sodný, pH 4,0 10 mM sodium acetate, pH 4.0 1,0 1.0 + +

Roztoky hodnotené ako +++ boli pri dosadení zamýšľanej koncentrácie vizuálne čisté. Rozsah pH pufrových roztokov bol od pH 9 do pH 10. pH anorganických roztokov ako je NaOH a NH₄0H bolo alkalické, zatiaľ čo HCI a kyseliny fosforečnej bolo silne kyslé. Rozpustnosť peptidu sa dosiahla v koncentrácii od 0,6 do 1 mg/ml pri hodnotách približne > pH 9. Prísady ako je polysorbit 80, sacharóza, manitol a EDTA neovplyvňujú rozpustnosť peptidu a zúčastňujú sa zvýšenia tonicity a zisku po filtrácii alebo pôsobia ako chelačné činidlá. Kyslé roztoky (s pH približne 4 alebo nižšie) tiež rozpúšťajú Αβ42 peptid pri koncentráciách 0,6 až 1,0 mg/ml. Roztoky hodnotené ako ++ sa pri cieľovej koncentrácii javili ako čiastočne rozpustné. Peptid môže byť rozpustný pri nižšej koncentrácii, pri akej je tu testovaný. Roztoky, ktoré boli hodnotené ako +, nedosiahli po vizuálnej stránke pri cieľovej koncentrácii úplnú rozpustnosť.The solutions evaluated as +++ were visually pure at the intended concentration. The pH range of the buffer solutions was from pH 9 to pH 10. The pH of inorganic solutions such as NaOH and NH ₄ OH was alkaline, while HCl and phosphoric acid were strongly acidic. The solubility of the peptide was achieved at a concentration of 0.6 to 1 mg / ml at approximately> pH 9. Additives such as polysorbite 80, sucrose, mannitol, and EDTA do not affect the solubility of the peptide and are involved in increasing tonicity and gain after filtration or act as chelating agents. . Acid solutions (with a pH of about 4 or below) also dissolve the ββ42 peptide at concentrations of 0.6 to 1.0 mg / ml. Solutions evaluated as ++ appeared to be partially soluble at the target concentration. The peptide may be soluble at a lower concentration at which it is tested herein. The solutions evaluated as + did not visually achieve complete solubility at the target concentration.

Príklad 2: Rozpustnosť Αβ peptidu v pufrových roztokochExample 2: Solubility of ββ peptide in buffer solutions

Αβ42 (0,6, 1,0, 1,5, 2,0, 3,0 a 3,5 mg/ml) bol rozpustený v 10 mM pufru glycinátu sodného, pH 9. Každý roztok bol centrifugovaný na stolovej centrifúge (>10 000 rpm, asi 10 min.) v prípade vzniku zákalu pri koncentráciách 2,0 až 3,5 mg/ml (roztoky s koncentráciou 0,6 - 1,5 mg/ml boli vizuálne čisté).Αβ42 (0.6, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0 and 3.5 mg / ml) was dissolved in 10 mM sodium glycinate buffer, pH 9. Each solution was centrifuged in a table centrifuge (> 10,000 rpm, about 10 min) in the case of turbidity at concentrations of 2.0 to 3.5 mg / ml (solutions at a concentration of 0.6-1.5 mg / ml were visually pure).

Alikvot supernatantu z každého roztoku bol potom analyzovaný na RP-HPLC. Tabuľka 2 predstavuje tabuľkové pikové oblasti peptidu a grafické znázornenie rozpustnosti Αβ42 v pufri glycinátu sodného s pH 9.An aliquot of the supernatant from each solution was then analyzed by RP-HPLC. Table 2 shows the tabulated peak areas of the peptide and a graphical representation of the solubility of Αβ42 in sodium glycinate buffer at pH 9.

Tabuľka 2. Hranica rozpustnosti TFA soli peptidu Αβ42Table 2. Solubility limit of the TFA salt of Αβ42 peptide

Αβ42 mg/ml (10 mM glycín, pH 9,0) Αβ42 mg / ml (10 mM glycine, pH 9.0) HPLC piková oblasť HPLC peak area 0,6 0.6 3613553 3613553 1 1 5921792 5921792 1,5 1.5 8850393 8850393 2 2 9213446 9213446

Nakoniec bol peptid Αβ42 purifikovaný vo forme trifluóracetátových, amónnych, chloridových a sodných solí. Tieto soli boli rozpustením v niekoľkých pufroch, s koncentráciou peptidu Αβ42 0,45 mg/ml, upravené vzhľadom na obsah opačne nabitých iónov rôznych solí. Roztoky peptidu boli prefiltrované a zisk bol určený pomocou porovnania RP-HPLC pikových plôch peptidu pred a po filtrácií. Všetky soli boli rozpustné a ľahko filtrovateľné s koncentráciou 0,45 mg/ml, čo ukazuje tabuľka 3.Finally, the Aβ42 peptide was purified in the form of trifluoroacetate, ammonium, chloride and sodium salts. These salts were adjusted for the content of counter-charged ions of various salts by dissolving in several buffers, with a peptide concentration of Αβ42 of 0.45 mg / ml. The peptide solutions were filtered and the gain was determined by comparing the RP-HPLC peak areas of the peptide before and after filtration. All salts were soluble and readily filterable at a concentration of 0.45 mg / ml, as shown in Table 3.

Tabuľka 3. Rozpustnosť iných solí Αβ42 peptiduTable 3. Solubility of other Αβ42 peptide salts

0,45 mg/ml Αβ42 - 0.45 mg / ml Αβ42 - Zisk (%) Profit (%) Amónna soľ v 1 mM NH4OH Ammonium salt in 1 mM NH 4 OH 70 70 Amónna soľ v 2 mM NH₄OHAmmonium salt in 2 mM NH ₄ OH 106 106 Amónna soľ v 10 mM glycináte sodnom, pH 9,0 Ammonium salt in 10 mM sodium glycinate, pH 9.0 115 115 Amónna soľ v 10 mM glycináte sodnom, 5 % sacharóza, pH 9,0 Ammonium salt in 10 mM sodium glycinate, 5% sucrose, pH 9.0 96 96 Amónna soľ v 10 mM glycináte sodnom, pH 9,5 Ammonium salt in 10 mM sodium glycinate, pH 9.5 101 101 Amónna soľ v 10 mM glycináte sodnom, pH 10,0 Ammonium salt in 10 mM sodium glycinate, pH 10.0 106 106 Trifluóracetátová soľ v 10 mM glycináte sodnom, pH 9,0 Trifluoroacetate salt in 10 mM sodium glycinate, pH 9.0 101 101 Chloridová soľ v 10 mM glycináte sodnom, pH 9,0 Chloride salt in 10 mM sodium glycinate, pH 9.0 101 101 Sodná soľ v 10 mM glycináte sodnom, pH 9,0 Sodium salt in 10 mM sodium glycinate, pH 9.0 100 100

Príklad 3: Získanie'rozpusteného peptidu po použití predstavených hydrofilných filtrovExample 3: Obtaining the solubilized peptide after using the presented hydrophilic filters

Testované striekačkové filtre (polomer filtra 25 mm, filtračná oblasť 3,9 cm²): Millex GV, 0,22 pm: hydrofilná polyvinylidíndifluoridová membrána (PVDF, Durapore) s nízkymi proteín-väzbovými vlastnosťami, Millex GN, 0,20 pm: hydrofilná nylonová membrána s nízkymi proteín-väzbovými vlastnosťami a Millex GP, 0,22 pm hydrofilná povrchovo modifikovaná polyeténsulfónová membrána (PES) s nízkymi proteínväzbovými vlastnosťami.Syringe filters tested (25 mm filter radius, filtration area 3.9 cm ² ): Millex GV, 0.22 µm: hydrophilic polyvinylidine difluoride membrane (PVDF, Durapore) with low protein-binding properties, Millex GN, 0.20 µm: hydrophilic a low protein-binding nylon membrane; and a Millex GP, 0.22 µm hydrophilic surface-modified low density polyethylene sulfone (PES) membrane.

Vyššie opísané filtre boli použité ako zástupcovia komerčne dostupných typov hydrofilných mikrofilmov. Filtračné štúdie, ktoré boli uskutočnené, používali nasledujúci solubilizačný systém:The filters described above were used as representatives of commercially available types of hydrophilic microfilms. The filtration studies that were conducted used the following solubilization system:

1. 0,6 mg/ml Αβ42 v 0,01 N NH₄OH1. 0.6 mg / ml Αβ42 in 0.01 N NH ₄ OH

2. 0,6 mg/ml Αβ42 v 10 mM glycináte sodnom, pH 9,02. 0.6 mg / ml Αβ42 in 10 mM sodium glycinate, pH 9.0

3. 0,6 mg/ml Αβ42 v 10 mM lyzináte sodnom, pH 9,03. 0.6 mg / ml Αβ42 in 10 mM sodium lysinate, pH 9.0

4. 0,6 mg/ml Αβ42 v 10 mM arginín-HCI, pH 9,04. 0.6 mg / ml Αβ42 in 10 mM arginine-HCl, pH 9.0

Približne 2 ml objem z každého Αβ42 roztoku bol prefiltrovaný cez každý filter. Zisk z jednotlivých filtrov bol potom určený porovnaním pikových plôch peptidov pred a po mikrofiltrácii a výsledok ukazujú tabuľky 3a a 4.Approximately 2 ml volume from each Αβ42 solution was filtered through each filter. The gain from the individual filters was then determined by comparing the peak areas of the peptides before and after microfiltration and the results are shown in Tables 3a and 4.

Tabuľka 3a. Filtračné ziskyTable 3a. Filter profits

Prostriedok 0,6 mg/ml Αβ peptidu v: means 0,6 mg / ml Αβ peptide in: Typ filtra (% zisk) Filter Type (% Gain) Millex GV Millex GV Millex GN Millex GN Millex GP Millex GP 10 mM glycináte sodnom 10 mM sodium glycinate 99,1 99.1 97,2 97.2 98,0 98.0 10 mM arginín-HCI 10 mM arginine-HCl 91,9 91.9 86,6 86.6 92,5 92.5 10 mM lyzináte sodnom 10 mM sodium lysinate 95,0 95.0 94,7 94.7 97,4 97.4 0,01 N NH₄OH0.01 N NH ₄ OH 102,2 102.2 104,8 104.8 105,1 105.1

Príklad 4: Filtrácia Αβ42 v pufroch glycinátu sodného a lyzinátu sodného s a bez prídavkových inertných látokExample 4: Filtration of Αβ42 in buffers of sodium glycinate and sodium lysinate with and without added inert substances

V týchto štúdiách bol 0,6 mg/ml Αβ42 rozpustený v 10 mM glycináte sodnom obsahujúcim buď 0,1 % polysorbit 80 (PS-80), 0,9 % chlorid sodný alebo kombináciu 0,1 % PS-80, 0,9 % NaCl, 5 % sacharózy, 1 % sacharózy a/alebo 4 % manitolu.In these studies, 0.6 mg / ml Αβ42 was dissolved in 10 mM sodium glycinate containing either 0.1% polysorbite 80 (PS-80), 0.9% sodium chloride, or a combination of 0.1% PS-80, 0.9 % NaCl, 5% sucrose, 1% sucrose and / or 4% mannitol.

Približne 2 až 5 ml každého prostriedku bolo prefiltrované cez filter Millex GV. Alikvot filtrátu bol scentrifugovaný na stolovej mikrocentrifúge s > 10 000 rpm v čase 3 minút. Výťažky z filtrácie boli určené porovnaním RP-HPLC pikových plôch peptidu pred a po filtrácii.Approximately 2-5 mL of each formulation was filtered through a Millex GV filter. An aliquot of the filtrate was centrifuged on a benchtop microcentrifuge at> 10,000 rpm for 3 minutes. Filtration yields were determined by comparing the RP-HPLC peak areas of the peptide before and after filtration.

Tabuľka 4. Filtračný zisk pri rôznych zloženiach pufruTable 4. Filter gain at different buffer compositions

Zloženie ID 0,6 mg/ml Αβ42 v: ID composition 0,6 mg / ml Αβ42 in: Zisk (%) Profit (%) 10 mM glycinát sodný, pH 9,0 10 mM sodium glycinate, pH 9.0 104,5 104.5 10 mM glycinát sodný, pH 9,0, 0,1 % PS-80 10 mM sodium glycinate, pH 9.0, 0.1% PS-80 106,2 106.2 10 mM glycinát sodný, pH 9, 0,5 % sacharóza 10 mM sodium glycinate, pH 9, 0.5% sucrose 115,4 115.4 10 mM glycinát sodný, pH 9,5, 4 % manitol 10 mM sodium glycinate, pH 9.5, 4% mannitol 103,0 103.0 10 mM glycinát sodný, pH 9,5, 4 % manitol, 1 % sacharóza 10 mM sodium glycinate, pH 9.5, 4% mannitol, 1% sucrose 98,0 98.0 10 mM glycinát sodný, pH 9,0, 0,9 % NaCl 10 mM sodium glycinate, pH 9.0, 0.9% NaCl 76,7 76.7 10 mM glycinát sodný, pH 9,0, 0,1 % PS-80, 0,9 % NaCl 10 mM sodium glycinate, pH 9.0, 0.1% PS-80, 0.9% NaCl 65,0 65.0 10 mM L-lyzín/citrát, pH 9,5 10 mM L-lysine / citrate, pH 9.5 93,2 93.2 10 mM L-lyzín/citrát, pH 9,5, 4 % manitol 10 mM L-lysine / citrate, pH 9.5, 4% mannitol 80,0 80.0

Filter Millex GV bol vybraný ako vhodný filter pre prostriedok Αβ, pretože vykazuje uspokojivý zisk peptidu a prijateľnosť na použitie v komerčných postupoch. Prostriedok peptidu obsahujúci 0,9 % NaCl bol vizuálne menej rozpustný, čo viedlo k nižším ziskom z filtrácie na RP-HPLC. Na zvýšenie rozpustnosti peptidu v prítomnosti anorganických solí ako je chlorid sodný, môže byť vhodné pridať po mikrofiltrácii peptidu do pufru roztok činidla modifikujúci tonicitu.The Millex GV filter has been selected as a suitable filter for the Aβ formulation because it exhibits satisfactory peptide yield and acceptability for use in commercial processes. The peptide composition containing 0.9% NaCl was visually less soluble, resulting in lower gains from RP-HPLC filtration. To increase the solubility of the peptide in the presence of inorganic salts such as sodium chloride, it may be desirable to add a solution of a tonicity-modifying agent to the buffer after microfiltration of the peptide.

Z iného pohľadu, činidlá modifikujúce tonicitu, ako sú sacharidy (cukry) prejavujú odlišný typ aktivity roztoku a môžu zvýšiť stabilitu suspenzie. Tieto vlastnosti, známe ako usporiadanie vo vodnom prostredí, majú tendenciu „hydratovať“ peptidový reťazec v roztoku tak, že získa termodynamicky stabilnejšiu konformáciu β-skladaného listu.In another aspect, tonicity-modifying agents such as carbohydrates (sugars) exhibit a different type of solution activity and may increase suspension stability. These properties, known as aqueous arrangements, tend to "hydrate" the peptide chain in solution so as to obtain a thermodynamically more stable β-sheet conformation.

Αβ peptid môže byť filtrovaný pri pH v rozsahu od asi 8,5 do 12, prednostne od pH 9 až pH 10, s dobrými výsledkami. Filtrácia môže byť uskutočnená použitím 0,2 pm Milelx GV membrány (Millipore Durapore), ktorá je vhodná na výrobné postupy.The β-peptide can be filtered at a pH ranging from about 8.5 to 12, preferably from pH 9 to pH 10, with good results. Filtration can be performed using a 0.2 µm Milelx GV membrane (Millipore Durapore), which is suitable for manufacturing processes.

Na stabilnú, biologicky aktívnu podobu Αβ peptidu, ktorá je fyziologicky akceptovateľná a vhodná na klinické použitie, bude počiatočný krok výrobných postupov prednostne zahrňovať sterilnú filtráciu peptidu pri pH 8,5 až 10.For a stable, biologically active form of ββ peptide that is physiologically acceptable and suitable for clinical use, the initial step of the manufacturing process will preferably involve sterile filtration of the peptide at pH 8.5 to 10.

Príklad 5: Rozpustné kvapalné prostriedkyExample 5: Soluble liquid formulations

Metódy kvantitatívneho rozboruMethods of quantitative analysis

Tri skupiny Αβ peptidu boli vyrobené v American Peptide Co. (APC). Štandardné prípravy, výsledky chemického a biologického určenia APC peptidu, boli opísané s Αβ42 vyrobeného California Peptide Research.Three β-peptide groups were produced by American Peptide Co. (APC). Standard preparations, results of chemical and biological determination of APC peptide, have been described with Αβ42 manufactured by California Peptide Research.

Opisy prípravkov sú formulované v častiach 1,2 a 3 nižšie v texte.Descriptions of the formulations are formulated in sections 1, 2 and 3 below.

Analýzy stabilityStability analyzes

Opisy k jednotlivým prípravkom sú poskytnuté v samostatných sekciách nižšie. Jednotlivé fľaštičky sa opakovane analyzujú počas niekoľkomesačného uskladnenia pri 2 až 8 °C. Počas štúdie stability sa rutinne monitorujú hodnoty pH, koncentrácie a čistoty peptidu. Systém reverznej fázy HPLC (RP-HPLC) bol použitý na kvalifikáciu koncentrácie a plocha zodpovedajúca čistému Αβ peptidu v percentách. RP-HPLC využíva polymérnu kolónu reverznej fázy, s premývaním peptidu v amóniumbikarbonáte (alebo tris) /acetonitrilovom gradiente a detekciou pri 220 nm. Koncentrácia peptidu sa meria proti referencii štandardu; čistota sa počíta ako plocha zodpovedajúca čistému Αβ peptidu v percentách určená vo výsledné porovnanom chromatograme.Descriptions of individual preparations are provided in separate sections below. Individual vials are repeatedly analyzed for several months at 2-8 ° C. The pH, concentration and purity of the peptide are routinely monitored during the stability study. The reverse phase HPLC system (RP-HPLC) was used to qualify the concentration and the area corresponding to the pure Αβ peptide in percent. RP-HPLC utilizes a reverse phase polymer column, washing the peptide in an ammonium bicarbonate (or tris) / acetonitrile gradient and detecting at 220 nm. The peptide concentration is measured against a reference standard; the purity is calculated as the area corresponding to the pure Αβ peptide as a percentage, as determined in the resulting comparison chromatogram.

Charakterizáciacharacterization

Charakterizácia štruktúry Αβ42 v roztoku bola získaná štúdiou cirkulárneho dichroizmu ako ukazuje obr. 1.Characterization of the structure of Αβ42 in solution was obtained by the study of circular dichroism as shown in FIG. First

Biologická aktivitaBiological activity

Myšiam z chovu Swiss Webster (4 až 8 myší v skupine) bol injikovaný Αβ42 s rôznymi zloženiami adjuvans CFA/IFA, MPL (Corixa Immunochemicals) alebo QS 21 (Aquila Pharmaceuticals) v pomere koncentrácií antigén/adjuvans opísaných vo zvláštnej štúdii. Injekcie boli aplikované rutinne po dvoch týždňoch v 0., 2. a 4. týždni, pokiaľ nebolo zaznamenané inak. Myši boli odobraté po 2 a 4 týždňoch od injekcie. Séra boli analyzované štandardnou sendvičovou ELISA metódou, kedy Αβ42 slúžil ako antigén a kozie protimyšie IgG konjugované s HRP ako značiace protilátky. Titer protilátok bol zaznamenaný v jednotlivých diagramoch alebo ako geometrické priemery hodnôt každého zvieraťa v každej skupine a súhrnne bol porovnaný s titrami získanými použitím agregovaného Ap42/CFA/IFA ako kontrolného imunogénu. Výsledné titrácie sú v tabuľkách 8 a 10.Swiss Webster mice (4-8 mice per group) were injected with ββ42 with various adjuvant compositions of CFA / IFA, MPL (Corixa Immunochemicals) or QS 21 (Aquila Pharmaceuticals) at the antigen / adjuvant concentrations described in a separate study. Injections were administered routinely after two weeks at weeks 0, 2 and 4 unless otherwise noted. Mice were collected 2 and 4 weeks after injection. Sera were analyzed by a standard sandwich ELISA method where β42 served as an antigen and goat anti-mouse IgG conjugated to HRP as a labeling antibody. The antibody titer was recorded in individual diagrams or as geometric means of the values of each animal in each group and was compared in total to the titers obtained using aggregated Aβ42 / CFA / IFA as a control immunogen. The resulting titrations are in Tables 8 and 10.

1. Prípravky1. Preparations

Αβ peptid bol rozpustený v koncentrácii 0,6 mg/ml v 10 mM glycinátu sodného, pH pufru 9,0 až 9,5, a prefiltrovaný cez filter Millex GV, 0,2 pm. Suspenzia s objemom 0,5 ml bola prenesená do 2 ml sklenených fľaštičiek (Gensia P/N X34113-002), zatvorená sivými gumovými zátkami (Gensia P/N X66-113-030) a vzduchotesne uzavretá. Fľaštičky boli skladované pri 2 až 8 °C.The ββ peptide was dissolved at a concentration of 0.6 mg / ml in 10 mM sodium glycinate, pH buffer 9.0 to 9.5, and filtered through a Millex GV filter, 0.2 µm. The 0.5 ml suspension was transferred to 2 ml glass vials (Gensia P / N X34113-002), closed with gray rubber stoppers (Gensia P / N X66-113-030) and sealed. The vials were stored at 2-8 ° C.

2. Testovanie stability2. Stability testing

Koncentrácia a čistota Αβ42 v suspenzii boli monitorované pomocou RPHPLC. Rozpustené vzorky boli analyzované buď priamo alebo po mikrocentrifugácii.The concentration and purity of Αβ42 in suspension were monitored by RPHPLC. Dissolved samples were analyzed either directly or after microcentrifugation.

Nasledujúca tabuľka (tab. 5) ukazuje analytické dáta pre rozpustné kvapalné prípravky. Neboli pozorované žiadne rozdiely medzi vzorkami centrifugovanými alebo necentrifugovanými pred analýzou, čo svedčí o stálej rozpustnosti peptidu so zamýšľanou koncentráciou. Plocha zodpovedajúca čistému proteínu v percentách je porovnateľná s referenčným štandardom: nebola zaznamenaná žiadna významná degradácia peptidu. Rozpustný prípravok zostal stabilný v čase 3 mesiacov, pokiaľ bol skladovaný pri 2 až 8 °C.The following table (Table 5) shows analytical data for soluble liquid formulations. No differences were observed between the samples centrifuged or non-centrifuged prior to analysis, suggesting the sustained solubility of the peptide at the intended concentration. The area corresponding to the pure protein in percent is comparable to the reference standard: no significant degradation of the peptide was noted. The soluble formulation remained stable for 3 months when stored at 2-8 ° C.

Tabuľka 5. Výsledky po 3 mesačnom skladovaníTable 5. Results after 3 months storage

0,6 mg/ml Αβ42 v: 0,6 mg / ml Αβ42 in: Vzhľad appearance pH pH Plocha čistého proteínu v % Net area protein in% Koncentrácia Αβ (mg/ml) concentration Αβ (mg / ml) Referenčnom štandarde Reference standard n/a on the n/a on the 68% 68% n/a on the 10 mM glycinátu sodného, pH 9,0 10 mM sodium glycinate, pH 9.0 Čistý roztok Pure solution 8,6 8.6 69 % 69% 0,65 0.65

3. Charakterizácia3. Characterization

Charakterizácia prípravku Αβ pomocou cirkulárneho dichroizmu ukazuje, že peptid nebýva v roztoku náhodne zvinutej konformácie s typickou absorbanciou elipticity v rozmedzí 189 až 205 nm.Characterization of Αβ by circular dichroism shows that the peptide is not in solution of a randomly wound conformation with a typical ellipticity absorbance in the range of 189 to 205 nm.

Biologická aktivitaBiological activity

Pokiaľ je myši (Swiss Webster) injikovaný prípravok Αβ42 s pH 9 s adjuvans, dôjde k nárastu titru protilátok. Injekcia 33 μς Αβ42 spolu s adjuvans ako 50 MPL alebo 25 pg QS 21 v dvojtýždňových intervaloch (0, 2, 4 týž.) vyvoláva adekvátnu odpoveď (v zmysle zvýšenia titru Ab) v porovnaní s kontrolami.When mice (Swiss Webster) are injected with Αβ42 pH 9 with adjuvant, antibody titer increases. Injection of 33 μς Αβ42 together with an adjuvant such as 50 MPL or 25 µg QS 21 at two-week intervals (0, 2, 4 weeks) elicits an adequate response (in terms of an increase in Ab titer) compared to controls.

Príklad 6: Prostriedky vo forme kvapalných suspenziíExample 6: Formulations in the form of liquid suspensions

Prostriedok glycín/acetátGlycine / acetate formulation

Αβ peptid bol rozpustený v koncentrácii 0,6 mg/ml v 10 mM glycinátu sodného, v pufri s pH 9,0 až 9,5 samotnom alebo v kombinácii s rôznymi inertnými vehikulami (excipients). Roztoky peptidu boli prefiltrované cez filter Millex GV a potom titrované 0,1 M kyselinou octovou na pH 6 za vzniku suspenzie peptidu v pufri. Suspenzie s objemom 0,5 ml boli prenesené do 2 ml sklenených fľaštičiek (Gensia P/N X34113-002), zatvorené sivými gumovými zátkami (Gensia P/N X66-113-030) a vzduchotesne uzavreté. Suspenzie boli skladované pri 2 až 8 °C.The ββ peptide was dissolved at a concentration of 0.6 mg / ml in 10 mM sodium glycinate, in a buffer of pH 9.0 to 9.5 alone or in combination with various inert excipients. The peptide solutions were filtered through a Millex GV filter and then titrated with 0.1 M acetic acid to pH 6 to form a peptide suspension in the buffer. 0.5 ml suspensions were transferred to 2 ml glass vials (Gensia P / N X34113-002), sealed with gray rubber stoppers (Gensia P / N X66-113-030) and sealed. The suspensions were stored at 2-8 ° C.

Prostriedok glycín/citrátGlycine / Citrate

Prostriedky s koncentráciou 0,6 mg/ml Αβ42 boli pripravené do 10 mM glycinátu sodného obsahujúceho 0,1 % PS-80 samotný alebo v kombinácii s 5 % sacharózou (25 ml). Roztoky peptidu boli prefiltrované cez filter Millex GV a potom titrované 0,1 M kyselinou citrónovou približne na pH 6,0. Prípadne, je po titrácii na pH 6 pridaný ku glycinátu/citrátu/PS-80 0,9 % chlorid sodný. Suspenzie s objemom 0,5 ml boli potom prenesené do 2 ml sklenených fľaštičiek (Gensia P/N X34-113-002), zatvorené sivými gumovými zátkami (Gensia P/N X66-113-030) a vzduchotesne uzavreté. Suspenzie boli skladované pri 2 až 8 °C.Formulations with a concentration of 0.6 mg / ml Αβ42 were prepared in 10 mM sodium glycinate containing 0.1% PS-80 alone or in combination with 5% sucrose (25 ml). The peptide solutions were filtered through a Millex GV filter and then titrated with 0.1 M citric acid to approximately pH 6.0. Alternatively, after titration to pH 6, 0.9% sodium chloride is added to the glycinate / citrate / PS-80. 0.5 ml suspensions were then transferred to 2 ml glass vials (Gensia P / N X34-113-002), closed with gray rubber stoppers (Gensia P / N X66-113-030) and sealed. The suspensions were stored at 2-8 ° C.

Glycín/citrátové prostriedky boli ďalej vylepšované tak, aby mali pufrovú kapacitu pri pH 6. Bolo pripravených niekoľko 100 ml prostriedkov 0,6 mg/ml Αβ peptidu do 10 mM glycinátu sodného, pH 9, obsahujúceho 5 % sacharózu s alebo bez 0,1 % PS-80. Navyše boli ešte pripravené prostriedky 0,1 mg/ml Αβ42 v 10 mM glycináte sodnom obsahujúcom 5 % sacharózu s alebo bez 0,1 % PS-80.Glycine / citrate compositions were further improved to have a buffer capacity at pH 6. Several 100 ml of 0.6 mg / ml Αβ peptide formulations were prepared into 10 mM sodium glycinate, pH 9, containing 5% sucrose with or without 0.1 % PS-80. In addition, compositions of 0.1 mg / ml Αβ42 in 10 mM sodium glycinate containing 5% sucrose with or without 0.1% PS-80 were prepared.

Peptidové roztoky boli pred úpravou pH prefiltrované cez filter Milelx GV. pH bolo potom upravené na pH 6,0 pomocou 10 mM a 20 mM pufru citrátu sodného použitím zásobného roztoku 1 M citrátu sodného s pH 5,5. Suspenzie s objemom 0,5 ml boli potom prenesené do 2 ml sklenených fľaštičiek (Gensia P/N X34-113-002), zatvorené sivými gumovými zátkami (Gensia P/N X66-113-030) a utesnené alobalom.The peptide solutions were filtered through a Milelx GV filter prior to pH adjustment. The pH was then adjusted to pH 6.0 with 10 mM and 20 mM sodium citrate buffer using a 1 M sodium citrate buffer pH 5.5. 0.5 ml suspensions were then transferred to 2 ml glass vials (Gensia P / N X34-113-002), closed with gray rubber stoppers (Gensia P / N X66-113-030) and sealed with aluminum foil.

Testovanie stabilityStability testing

Koncentrácie a čistota Αβ42 v prostriedku boli sledované pomocou RP-HPLC. Absolútna peptidová koncentrácia suspenzie Αβ42 bola meraná rozpustením peptidu zriedeného (obj.:obj.) 2 % sódiumdodecylsulfátom (SDS) v 0,01 N NaOH a zahrievaním pri 100 °C v čase 1 minúty pred analýzou. Prípadne bola koncentrácia Αβ42 v suspenzii určená centrifugáciou testovanej vzorky na mikrocentifúge pri > 10 000 rpm v čase 3 až 5 minút. Alikvoty rozpusteného peptidu alebo supernatantu boli potom analyzované pomocou RP-HPLC. Je dobré si uvedomiť, že počas týchto štúdií boli vykonané pokroky v chromatografii v metóde RP-HPLC, čo viedlo k lepšiemu rozlíšeniu a kvantitatívnemu určeniu. Preto sú percentuálne hodnoty oblasti čistoty relatívne k referenčnému štandardu v čase vykonávaných analýz a chromatogramy sú porovnávané v každom časovom okamžiku na určenie miery degradácie. Počas štúdií stability bolo tiež sledované pH a vzhľad.The concentration and purity of β42 in the formulation was monitored by RP-HPLC. The absolute peptide concentration of the Αβ42 suspension was measured by dissolving the peptide (v / v) with 2% sodium dodecyl sulfate (SDS) in 0.01 N NaOH and heating at 100 ° C for 1 minute before analysis. Alternatively, the concentration of β42 in the suspension was determined by centrifugation of the test sample on a microcenter at> 10,000 rpm for 3-5 minutes. Aliquots of the dissolved peptide or supernatant were then analyzed by RP-HPLC. It is good to realize that during these studies advances were made in the RP-HPLC method, leading to better resolution and quantification. Therefore, the percent values of the purity region are relative to the reference standard at the time of the analyzes performed and the chromatograms are compared at each time point to determine the degradation rate. PH and appearance were also monitored during stability studies.

Tabuľka 6 ukazuje dáta z niekoľko kvapalných suspenzií Αβ42. Všetky prostriedky sú vizuálne suspenzie. Tieto prostriedky sú titrované na pH 6 príslušnými kyselinami opísanými v tabuľke. V závislosti od použitého inertného vehikula môže peptidová suspenzia vzniknúť bezprostredne alebo až v horizonte 2 týždňov aj viac. Vznik suspenzie je možné rýchlejšie dosiahnuť pridaním chloridu sodného alebo zámenou citrátu za acetát v peptidovom prostriedku.Table 6 shows data from several liquid suspensions of Αβ42. All formulations are visual suspensions. These compositions are titrated to pH 6 with the appropriate acids described in the table. Depending on the inert vehicle used, the peptide suspension may be formed immediately or up to 2 weeks or more. The suspension can be formed more quickly by adding sodium chloride or by substituting citrate for acetate in the peptide composition.

Všetky prostriedky dosahujú výsledné koncentrácie 0,6 mg/ml peptidu. Percentuálna oblasť čistoty bola vo všetkých prostriedkoch porovnateľná s čistotou referenčného štandardu. Počas 3 mesačného skladovania pri 2 až 8 °C nebola zaznamenaná žiadna strata alebo degradácia peptidu. Vzhľad a pH zostali porovnateľné s dátami uvedenými v tabuľke 1.All formulations achieve a final concentration of 0.6 mg / ml peptide. The percentage of purity was comparable to the purity of the reference standard in all formulations. No loss or degradation of the peptide was noted during 3 months of storage at 2-8 ° C. The appearance and pH remained comparable to the data shown in Table 1.

0,9 % NaCl aj 5 % sacharóza vytvára fyziologickú tonicitu na parenterálne podanie. Rovnako tak suspenzia s pH 6 v akceptovateľnom rozmedzí pH na účely injekčného podania.Both 0.9% NaCl and 5% sucrose produce physiological tonicity for parenteral administration. Likewise, a suspension of pH 6 within an acceptable pH range for injection purposes.

Tabuľka 6. Prostriedky vo forme kvapalných suspenziíTable 6. Liquid suspension formulations

i Zloženie ID i Composition ID Vzhľad appearance pH pH Čistota purity mg/ml Αβ42 mg / ml Αβ42 : 0,6 mg/ml Αβ v: 0.6 mg / ml Αβ in: v % in % Celkový peptid Total peptide Supernatant The supernatant

T=0 T = 0 T=2wks T = 2wks 10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0 10 mM sodium glycinate / acetate, pH 6.0 Suspenzia suspension 5,9 5.9 70 % 70% 0,54 0.54 0,23 0.23 0,04 0.04 10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 5 % sacharóza 10 mM sodium glycinate / acetate, pH 6.0, 5% sucrose Suspenzia suspension 5,9 5.9 68 % 68% 0,65 0.65 0,21 0.21 0,04 0.04 10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 5 % sacharóza 10 mM sodium glycinate / acetate, pH 6.0, 0.1% PS-80, 5% sucrose Suspenzia suspension 6,0 6.0 67% 67% 0,62 0.62 0,43 0.43 0,08 0.08 10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 0,9 % NaCl 10 mM sodium glycinate / acetate, pH 6.0, 0.1% PS-80, 0.9% NaCl Suspenzia suspension 5,9 5.9 68% 68% 0,55 0.55 0,04 0.04 0,04 0.04 10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 0,9 % NaCl 10 mM sodium glycinate / acetate, pH 6.0, 0.9% NaCl Suspenzia suspension 6,0 6.0 70 % 70% 0,53 0.53 0,26 0.26 0,05 0.05 10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 5 % sacharóza 10 mM sodium glycinate / acetate, pH 6.0, 0.1% PS-80, 5% sucrose Suspenzia suspension nd th 77 % 77% 0,63 0.63 <0,01 <0.01 nd th 10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 0,9 % NaCl 10 mM sodium glycinate / acetate, pH 6.0, 0.1% PS-80, 0.9% NaCl Suspenzia suspension nd th 71 % 71% 0,63 0.63 0,02 0.02 nd th

nd: nebolo uskutočnené (not done)nd: not done

Prostriedky, ktoré ukazuje tabuľka 7, boli pripravené pomocou 10 mM alebo 20 mM pufrovej kapacity poskytnutej citrátovým pufrom, s cieľom zaistiť počas výrobného postupu dosiahnutie pH 6. Tieto prostriedky vytvorili okamžite suspenziu. Na základe vlastností Αβ peptidu, viedla zmena konformácie peptidu k vzniku suspenzie vo vnútri sterilnej skúmavky. Použitie známej koncentrácie pufru, opačnej k titračnej, počíta s ľahkým zaobchádzaním a reprodukciou počas práce v sterilnej plniacej súprave.The formulations shown in Table 7 were prepared using 10 mM or 20 mM buffer capacity provided with citrate buffer to ensure pH 6 was reached during the manufacturing process. These formulations immediately formed a suspension. Based on the properties of the ββ peptide, a change in peptide conformation resulted in a suspension within the sterile tube. The use of a known buffer concentration, opposite to titration, allows for easy handling and reproduction while working in a sterile filling kit.

Tabuľka 7. Pufrované suspenzieTable 7. Buffered suspensions

0,6 mg/ml Αβ42 v: 0,6 mg / ml Αβ42 in: Vzhľad appearance pH pH Čistota v% purity in% Αβ peptid celková kone. mg/ml Αβ peptide total horse. mg / ml 10 mM citrát sodný, 10 mM glycín, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 5 % sacharóza 10 mM sodium citrate, 10 mM glycine, pH 6.0, 0.1% PS-80, 5% sucrose Suspenzia suspension 6,0 6.0 81 % 81% 0,66 0.66 20 mM citrát sodný, 10 mM glycín, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 5 % sacharóza 20 mM sodium citrate, 10 mM glycine, pH 6.0, 0.1% PS-80, 5% sucrose Suspenzia suspension 5,9 5.9 83 % 83% 0,69 0.69 20 mM citrát sodný, 10 mM glycín, pH 6,0, 5 % sacharóza 20 mM sodium citrate, 10 mM glycine, pH 6.0, 5% sucrose Suspenzia suspension 6,0 6.0 81 % 81% 0,67 0.67 0,1 mg/ml Αβ42 v: 0,1 mg / ml Αβ42 in: 20 mM citrát sodný, 10 mM glycín, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 5 % sacharóza 20 mM sodium citrate, 10 mM glycine, pH 6.0, 0.1% PS-80, 5% sucrose Suspenzia suspension 5,9 5.9 82 % 82% 0,2 0.2 20 mM citrát sodný, 10 mM glycín, pH 6,0, 5 % sacharóza 20 mM sodium citrate, 10 mM glycine, pH 6.0, 5% sucrose Suspenzia suspension 6,0 6.0 81 % 81% 0,09 0.09

Tieto prostriedky boli ďalej rozmnožené. Trifluóracetátové alebo chloridové soli Αβ peptidu boli rozpustené v 10 mM glycinátu sodného s pH 9 až 9,5. Ich koncentrácie boli upravené podľa obsahu soli s cieľom dosiahnuť koncentráciu Αβ42 0,45 mg/ml. Pred filtráciou môže byť do peptidového roztoku pridaný polysorbit 80, 0,02 % až 0,5 %. Rovnako tak môže byť do prostriedku pred alebo po pridaní kyseliny pridaná sacharóza alebo chlorid sodný. pH peptidového roztoku bolo upravené kyselinou citrónovou alebo chlorovodíkovou, ako je vyššie spomínané. Všetky prostriedky vytvorili suspenziu za vzniku požadovanej koncentrácie peptidu Αβ42.These funds were further multiplied. Trifluoroacetate or chloride salts of ββ peptide were dissolved in 10 mM sodium glycinate pH 9 to 9.5. Their concentrations were adjusted according to the salt content to achieve a concentration of Αβ42 of 0.45 mg / ml. Polysorbate 80, 0.02% to 0.5%, may be added to the peptide solution prior to filtration. Likewise, sucrose or sodium chloride may be added to the composition before or after the addition of the acid. The pH of the peptide solution was adjusted with citric or hydrochloric acid as mentioned above. All formulations were suspended to produce the desired ββ42 peptide concentration.

Tabuľka 7bTable 7b

Zloženie suspenzií 0,45 mg/ml Αβ42 v:Suspension composition 0,45 mg / ml Αβ42 in:

mM glycinát sodný, 20 mM citrát, 0,1 % PS-80, pH 6,0 mM glycinát sodný, 20 mM citrát, 0,5 % PS-80, pH 6,0 mM glycinát sodný, 20 mM citrát, 154 mM NaCl, pH 6,0 mM glycinát sodný, 20 mM citrát, 154 mM NaCl 0,1 % PS-80, pH 6,0 mM glycinát sodný, 154 mM NaCl, pH 6,0 (HCI) mM glycinát sodný, 154 mM NaCl, 0,1 % PS-80, pH 6,0 (HCI)mM sodium glycinate, 20 mM citrate, 0.1% PS-80, pH 6.0 mM sodium glycinate, 20 mM citrate, 0.5% PS-80, pH 6.0 mM sodium glycinate, 20 mM citrate, 154 mM NaCl, pH 6.0 mM sodium glycinate, 20 mM citrate, 154 mM NaCl 0.1% PS-80, pH 6.0 mM sodium glycinate, 154 mM NaCl, pH 6.0 (HCl) mM sodium glycinate, 154 mM NaCl, 0.1% PS-80, pH 6.0 (HCl)

Charakterizáciacharacterization

Charakterizácia suspenzie Αβ42, pH 6 pomocou cirkulárneho dichroizmu a FT-IR ukázala, že peptid so vznikom suspenzie zaujíma štruktúru β-skladaného listu. Štruktúry β-skladaného listu sú porovnateľné pri koncentrácii suspenzie 0,6 mg/ml, bez ohľadu na pufrujúcu kyselinu (citrát, acetát, fosfát) a ďalšie inertné vehikulá (sacharóza, NaCl) pridané do prostriedkov. Zdá sa, že pridanie PS-80 vedie k vzniku homogénnejšie dispergovanej suspenzie.Characterization of the Αβ42 suspension, pH 6 by circular dichroism and FT-IR showed that the suspension peptide occupies the β-sheet structure. The structures of the β-sheet are comparable at a suspension concentration of 0.6 mg / ml, regardless of the buffering acid (citrate, acetate, phosphate) and other inert vehicles (sucrose, NaCl) added to the compositions. The addition of PS-80 appears to result in a more homogeneously dispersed suspension.

Biologická aktivitaBiological activity

Pokiaľ je suspenzia Αβ peptidu s adjuvans injikovaná myšiam (Swiss Webster), dôjde k nárastu titru protilátok. Injekcie v dvojtýždňových intervaloch (0., 2., 4. týždni), ako ukazuje tabuľka 8, vyvolajú v porovnaní s kontrolami adekvátnu protilátkovú odpoveď.When an adjuvanted β-peptide suspension is injected into mice (Swiss Webster), the antibody titer increases. Injections at two-week intervals (0, 2, 4 weeks), as shown in Table 8, elicit an adequate antibody response compared to controls.

Tabuľka 8. Protilátková odpoveď na suspenzie prostriedkovTable 8. Antibody response to formulation suspensions

^! Peptidový prostriedok ; 0,6 mg/ml Αβ v: ^! Peptide composition; 0,6 mg / ml Αβ in: pg peptidu pg peptide — pg adjuvans - pg adjuvant Titer protilátok geom. priemery z 2. Odberu** Titer of antibodies Geometry. averages from 2. Subscription ** 10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 5 % sacharóza 10 mM sodium glycinate / acetate, pH 6.0, 5% sucrose 33 pg 33 pg 50 pgMPL* 50 pgMPL * -7 000 -7 000 10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 5 % sacharóza 10 mM sodium glycinate / acetate, pH 6.0, 5% sucrose 33 pg 33 pg 25 pg QS-21 25 pg of QS-21 -10 000 -10 000 10 mM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 5 % sacharóza 10 mM sodium glycinate / acetate, pH 6.0, 0.1% PS-80, 5% sucrose 33 pg 33 pg 50 pg MPL* 50 pg MPL -10 000 -10 000 10 ŕriM glycinát sodný/acetát, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 5 % sacharóza 10 µM sodium glycinate / acetate, pH 6.0, 0.1% PS-80, 5% sucrose 33 pg 33 pg 25 pg QS-21 25 pg of QS-21 -7 000 -7 000 10 mM glycinát sodný/citrát, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 5 % sacharóza 10 mM sodium glycinate / citrate, pH 6.0, 0.1% PS-80, 5% sucrose 33 pg 33 pg 50 pg MPL* 50 pg MPL -10 000 -10 000 10 mM glycinát sodný/citrát, pH 6,0, 0,1 % PS-80, 5 % sacharóza 10 mM sodium glycinate / citrate, pH 6.0, 0.1% PS-80, 5% sucrose 33 pg 33 pg 25 pg QS-21 25 pg of QS-21 -8 000 -8 000 10 mM glycinát sodný/citrát, pH 6,0, 0,9 % NaCl 10 mM sodium glycinate / citrate, pH 6.0, 0.9% NaCl 33 pg 33 pg 50 pg MPL* 50 pg MPL -12 000 -12 000 10 mM glycinát sodný/citrát, pH 6,0, 0,9 % NaCl 10 mM sodium glycinate / citrate, pH 6.0, 0.9% NaCl 33 pg 33 pg 25 pg QS-21 25 pg of QS-21 -14 000 -14 000 Kontrola: Calif. Peptide, časť MF0639 Control: Calif. Peptide, part MF0639 33 pg 33 pg CFA/IFA CFA / IFA -1 200 -1 200

* MPL obsahujúci trietanolamín ** Titre počítané ako jednotky pri 50 % maximálnej OD* MPL containing triethanolamine ** Titers calculated as units at 50% of maximum OD

Príklad 7: Lyofilizované prípravky PrípravkyExample 7: Lyophilized Formulations Formulations

Boli pripravené štyri kombinácie 0,6 mg/ml Αβ42 v glycinátovom alebo lyzínovom pufri, s manitolom alebo manitolom a sacharózou a potom sterilné filtrované cez filter Millex GV. Jeden prípravok (0,6 mg/ml Αβ42 v 10 mM glycináte sodnom s pH 9,5, 4 % manitol) bol bez titrácie na fyziologické pH prenesený do fľaštičky a uzavretý. Zvyšné tri roztoky (lyzín/citrát/4 % manitol; glycinát/citrát/4 % manitol; glycinát/HCI/4 % manitol/1 % sacharóza) boli titrované kyselinou citrónovou alebo chlorovodíkovou na pH 7,5. Prostriedky boli potom prenesené v objeme 0,5 ml do 2 ml sklenených fľaštičiek (Gensia P/N X34-113-002), netesne zatvorené sivými gumovými lyofilizačnými zátkami (Gensia P/N X66-113-030).Four combinations of 0.6 mg / ml Αβ42 in glycinate or lysine buffer, with mannitol or mannitol and sucrose were prepared and then sterile filtered through a Millex GV filter. One preparation (0.6 mg / ml Αβ42 in 10 mM sodium glycinate pH 9.5, 4% mannitol) was transferred to the vial and sealed without titration to physiological pH. The remaining three solutions (lysine / citrate / 4% mannitol; glycinate / citrate / 4% mannitol; glycinate / HCl / 4% mannitol / 1% sucrose) were titrated with citric acid or hydrochloric acid to pH 7.5. The formulations were then transferred in a volume of 0.5 ml into 2 ml glass vials (Gensia P / N X34-113-002), leak tightly closed with gray rubber lyophilization plugs (Gensia P / N X66-113-030).

Lyofilizácialyophilization

Prípravky boli lyofilizované v programovateľnom lyofilizéri Virtis (výrobca Gensia Sicor). Ako hlavná zložka matrice bol zvolený manitol. Aby došlo ku kryštalizácii manitolu, boli prípravky zmrazené počas určitej termálnej periódy (chladenia) a následne došlo k primárnemu a sekundárnemu vysušeniu zmrazených zhlukov.The formulations were lyophilized in a Virtis programmable lyophilizer (manufactured by Gensia Sicor). Mannitol was chosen as the main constituent of the matrix. In order to crystallize mannitol, the formulations were frozen during a certain thermal period (cooling) and the primary and secondary drying of the frozen agglomerates occurred.

Analýza stabilityStability analysis

Koncentrácia a čistota lyofilizovaných prípravkov bola sledovaná pomocou RP-HPLC. Každý prípravok bol rozpustený v 1,0 ml injekčnej vody (WFI). Bol analyzovaný bezprostredne po rozpustení (po alebo bez centrifugácie na stolovej mikrocentrige pri > 10 000 rpm v čase 3 až 5 minút) alebo bol znova rozpustený, ako bolo opísané vyššie.The concentration and purity of the lyophilized preparations were monitored by RP-HPLC. Each formulation was dissolved in 1.0 mL injection water (WFI). It was analyzed immediately after dissolution (after or without centrifugation on a table microcentrifuge at> 10,000 rpm for 3-5 minutes) or was redissolved as described above.

Nasledujúca tabuľka (tab. 9) ukazuje koncentráciu štyroch prípravkov Αβ42 po uskutočnenej lyofilizácii a následnom rozpustení. Ako je možné vyčítať z dát, tieto prípravky boli rozpustné. Vzorky boli analyzované jednak ako prípravky rozpustené z lyofilizovanej formy a ako prípravy rozpustené z lyofilizovanej formy „resolubilizované“ tak, ako sa opisuje pre peptidové suspenzie. Neboli pozorované žiadne významné rozdiely medzi prípravkami rozpustenými z lyofilizátu a úplnou koncentráciou peptidu (vzorky rozpusteného peptidu). Ako ukázala metóda RPHPLC, rovnaká ako pri testovaní stability v príklade 5, žiadna významná degradácia alebo strata peptidu nebola pozorovaná v priebehu 3 mesačného skladovania v tepelnom rozmedzí 2 až 8 °C.The following table (Table 9) shows the concentration of the four Aβ42 formulations after lyophilization and subsequent dissolution. As can be read from the data, these formulations were soluble. The samples were analyzed both as preparations dissolved from the lyophilized form and as preparations dissolved from the lyophilized form "resolubilized" as described for peptide suspensions. No significant differences were observed between the formulations dissolved from the lyophilisate and the complete concentration of the peptide (dissolved peptide samples). As shown by the RPHPLC method, the same as in the stability testing of Example 5, no significant degradation or loss of peptide was observed during 3 months of storage in the temperature range of 2 to 8 ° C.

Tabuľka 9. Lyofilizované prostriedkyTable 9. Lyophilized formulations

Prípravok 0,6 mg/ml Αβ42 v: agent 0,6 mg / ml Αβ42 in: Vzhľad appearance pH pH Čistota v % Purity (%) mg/ml Αβ42 mg / ml Αβ42 Peptid v rozpustenom lyofilizáte peptide in dissolved freeze-dried Rozpustený peptid dissolved peptide 10 mM glycinát sodný, pH 9,5, 4 % manitol 10 mM sodium glycinate, pH 9.5, 4% mannitol Čistý roztok clean solution 8,2 8.2 82 % 82% 0,59 0.59 0,61 0.61 10 mM citrát/glycinát sodný, pH 7,5, 4 % manitol 10 mM sodium citrate / glycinate, pH 7.5, 4% mannitol Čistý roztok clean solution 7,4 7.4 82 % 82% 0,57 0.57 0,60 0.60 10 mM citrát/lyzinát sodný, pH 7,5, 4 % manitol 10 mM citrate / lysinate sodium, pH 7.5, 4% mannitol Čistý roztok clean solution 7,6 7.6 81 % 81% 0,57 0.57 0,55 0.55 10 mM glycinát sodný/HCI, pH 7,5, 4 % manitol, 1 % sacharóza 10 mM glycinate sodium / HCl, pH 7.5, 4% mannitol, 1% sucrose Čistý roztok clean solution 7,4 7.4 81 % 81% 0,56 0.56 0,59 0.59

Charakterizáciacharacterization

Charakterizácia lyofilizovaného prostriedku Αβ42, pH 7,5 pomocou cirkulárneho dichroizmu a FT-IR ukazuje, že peptid počas lyofilizácie a spätného rozpustenia zostáva v náhodne zvinutej konformácii. Toto zistenie zostáva rovnaké pri prostriedku Αβ42/9^οίηόί sodný, pH 9, ktorý je tiež rozpustný, je možné ho filtrovať a v roztoku zaujíma náhodne zvinutú konformáciu.Characterization of the lyophilized formulation ββ42, pH 7.5 by circular dichroism and FT-IR shows that the peptide remains in a randomly folded conformation during lyophilization and redissolution. This finding remains the same for sodium 42β42 / 9 οίηόί, pH 9, which is also soluble, can be filtered and adopts a randomly wound conformation in solution.

Biologická aktivitaBiological activity

Lyofilizovaný prostriedok Αβ42, 0,6 mg/ml Αβ42 v 10 mM glycináte sodnom/HCI/4 % manitol/1 % sacharóza, pH 7,5, bol zvolený ako reprezentatívny lyofilizovaný prostriedok. Pokiaľ bol miešaný s adjuvans MPL alebo QS-21, došlo u myší (Swiss Webster) k zvýšeniu titru protilátok. Geometrický priemer titrov v porovnaní s kontrolami ukazuje tabuľka 10.The lyophilized formulation Αβ42, 0.6 mg / ml Αβ42 in 10 mM sodium glycinate / HCl / 4% mannitol / 1% sucrose, pH 7.5, was chosen as a representative lyophilized formulation. When mixed with MPL or QS-21 adjuvant, mice (Swiss Webster) increased antibody titer. Table 10 shows the geometric mean titers compared to controls.

Tabuľka 10. Protilátková odpoveď na lyofilizované preparátyTable 10. Antibody response to lyophilized preparations

Peptidový prípravok 0,6 mg/ml Αβ42 v: Peptide preparation 0,6 mg / ml Αβ42 in: pg peptidú pg peptides pg adjuvans pg adjuvant Titer protilátok, geom. priemery z 2.odberu** Titer antibody, geom. averages from 2nd subscription ** 10 mM glycinát sodný/HCI, pH 7,5, 4 % manitol, 1 % sacharóza 10 mM sodium glycinate / HCl, pH 7.5, 4% mannitol, 1% sucrose 33 pg 33 pg 50 pg MPL* ^** 50 ug MPL * ^** ~14 000 ~ 14,000 10 mM glycinát sodný/HCI, pH 7,5, 4 % manitol, 1 % sacharóza 10 mM sodium glycinate / HCl, pH 7.5, 4% mannitol, 1% sucrose 33 pg 33 pg 25 pg QS-21 25 pg of QS-21 ~3 000 ~ 3,000 Kontrola: Calif. Peptid, časť MF0639 Control: Calif. Peptide, part MF0639 33 pg 33 pg CFA/IFA CFA / IFA ~1 200 ~ 1,200

*MPL obsahujúci trietanolamín **Titre počítané ako jednotky pri 50 % maximálnej OD* MPL containing triethanolamine ** Titers calculated as units at 50% of maximum OD

Príklad 8: Rozšírenie používania štandardov vyrábaných GMPExample 8: Extending the use of standards produced by GMPs

Peptidová suspenzia bola dodaná v 1,5-litrových baleniach, vyrobených a plnených podlá zmluvy s výrobcom liečiv GMP. Balenia boli v dvoch koncentráciách: 0,6 mg/ml a 0,1 mg/ml. Obidve koncentrácie boli úspešne namnožené, rozplnené a zostali stabilné pri 2 až 8 °C a 25 °C v čase 2 mesiacov.The peptide suspension was supplied in 1.5-liter packages manufactured and filled under contract with the GMP drug manufacturer. The packages were in two concentrations: 0.6 mg / ml and 0.1 mg / ml. Both concentrations were successfully expanded, filled and remained stable at 2-8 ° C and 25 ° C for 2 months.

Αβ peptid bol rozpustený pri výslednej koncentrácii 0,6 mg/ml alebo 0,1 mg/ml v 10 mM pufru glycinát sodný, pH 9, obsahujúcim 5 % sacharózu. Peptidový roztok bol sterilné filtrovaný cez sterilizačný filter Milipak 20 Millipore Durapore, 0,2 pm, do aseptickej skúmavky. RP-HPLC analýza preukázala, že nedošlo k žiadnym významným stratám peptidú počas filtrácie. Potom bol vyrobený 1M pufor citrátu sodného, pH 5,5, a rovnako prefiltrovaný cez 0,2 pm filter Durapore do aseptickej skúmavky. Peptídový roztok bol navážený a pridalo sa k nemu primerané množstvo pufru za vzniku 20 mM citrátu, pH výsledného prípravku 6.The ββ peptide was dissolved at a final concentration of 0.6 mg / ml or 0.1 mg / ml in 10 mM sodium glycinate buffer, pH 9, containing 5% sucrose. The peptide solution was sterile filtered through a Milipak 20 Millipore Durapore, 0.2 µm sterilization filter into an aseptic tube. RP-HPLC analysis showed that there were no significant peptide losses during filtration. A 1 M sodium citrate buffer, pH 5.5, was then made and also filtered through a 0.2 µm Durapore filter into an aseptic tube. The peptide solution was weighed and added with an appropriate amount of buffer to give 20 mM citrate, pH of the resulting formulation 6.

Pri koncentrácii 0,6 mg/ml vytvára peptid bezprostredne pred pridaním citrátového pufru suspenziu; pH merané počas postupu bolo 6,4. Peptidová suspenzia, naplnená po 1,2 ml do 2 ml sklenených fľaštičiek utesnených zátkou (West 4416), bola stále premiešavaná. Koncentrácia 0,1 mg/ml zostala rozpustná (a bola rozplnená ako rozpustná) niekoľko hodín pred vznikom suspenzie vo fľaštičkách počas ďalšieho dňa.At a concentration of 0.6 mg / ml, the peptide forms a suspension immediately prior to the addition of the citrate buffer; The pH measured during the procedure was 6.4. The peptide suspension, filled with 1.2 ml in 2 ml glass vials sealed with a stopper (West 4416), was still mixed. The concentration of 0.1 mg / ml remained soluble (and filled as soluble) for several hours before the vial suspension was formed the next day.

Tabuľka 11 ukazuje dáta vytvorené pre 0,6 mg/ml suspenziu Αβ42;Table 11 shows data generated for 0.6 mg / ml suspension of Αβ42;

Tabuľka 11Table 11

Suspenzia Αβ peptidu 0,6 mg/ml v 10 mM glycíne, 20 mM citrátu, 5 % sacharóze, pH 6Αβ peptide suspension 0.6 mg / ml in 10 mM glycine, 20 mM citrate, 5% sucrose, pH 6

Test Test Špecifikácia specification Výsledek result Vzhľad appearance Neurčitá bezfarebná suspenzia, bez významnej kontaminácie Uncertain colorless suspension, no significant contamination Akceptovaná accepted pH pH 5,5 až 6,5 5.5 to 6.5 6,3 6.3 koncentrácia concentration 0,5 až 0,7 mg/ml 0.5 to 0.7 mg / ml 0,64 mg/ml 0.64 mg / ml plocha čistoty v % (HPLC) Area of purity in% (HPLC) FIO FIO 84,4 % 84.4% objem (ml) volume (ml) FIO FIO 1,13 ml 1.13 ml miera sterility sterility rate FIO FIO kultivácia negatívna cultivation negative výsledná sterilita kontajneru the resulting sterility of the container kultivácia negatívna cultivation negative akceptovaná accepted bakteriálne endotoxíny bacterial endotoxins FIO FIO <2 EU/ml <2 EU / ml

Príklad 9; Pufrované suspenzie Αβ1-42 s pridaným adjuvans QS-21Example 9; Buffered suspensions Αβ1-42 with added QS-21 adjuvant

S použitím QS-21, triterpénglykozidu so stimulačnými účinkami na imunitný systém, boli vytvorené ampulky jednotlivých prípravkov obsahujúcich Αβ1-42 a adjuvans, a s prekvapením sa zistilo, že tvoria vizuálne čistú suspenziu peptidu.Using QS-21, a triterpene glycoside with stimulating effects on the immune system, vials of individual formulations containing β-1-42 and adjuvant were formed and were surprisingly found to form a visually pure peptide suspension.

1. Jednotlivé vzorky prostriedkov Αβ1 -42/QS-211. Individual sample compositions of Αβ1 -42 / QS-21

Rozpustenie lyofilizovaného QS-21 pomocou roztoku Αβ1-42 v 10 mM glycináte sodnom pri pH 9,0. V každom z nasledujúcich príkladov bol lyofilizovaný QS-21 rozpustený pomocou roztoku Αβ1-42 (TFA soli, 0,45 mg/ml) v 10 mM glycíne (Gly), pH 9,0. pH prípravku obsahujúceho rozpustený QS-21 bolo potom upravené na pH 6,0 pridaním citrátového pufru (Cit) za vzniku vizuálne čistej suspenzie. Hodnotenie zákalu bolo uskutočnené pomocou spektrofometra pri vlnovej dĺžke 405 nm s cieľom určiť čistotu vzniknutých suspenzií. Výsledky ukázali, že veľkosť častíc suspendovaného peptidu je menšia ako vlnová dĺžka odrazeného svetla. Na základe uskutočnených testov bola preukázaná stabilita týchto prípravkov pri 3 mesačnom uskladnení pri 2 až 8 °C; všetky prípravky obsahovali prevažnú časť Αβ1-42 v konformácii β-skladaného listu; žiadny prípravok nevykazoval pri analýze na spektrofotometri pri 405 nm zákal. Prípravok 0,45 mg/ml Αβ1-42, 0,2 mg/ml QS-21, 10 mM Gíy, 20 mM Cit, 5 % sacharóza, pH 6,0 bol kvantitatívne testovaný na titer v myšiach s výsledkom vysokého titru protilátkovej odpovede.Dissolve lyophilized QS-21 with a solution of β1-42 in 10 mM sodium glycinate at pH 9.0. In each of the following examples, QS-21 was lyophilized dissolved with a solution of β1-42 (TFA salt, 0.45 mg / ml) in 10 mM glycine (Gly), pH 9.0. The pH of the formulation containing dissolved QS-21 was then adjusted to pH 6.0 by addition of citrate buffer (Cit) to form a visually pure suspension. The turbidity was evaluated using a spectrophotometer at 405 nm to determine the purity of the resulting suspensions. The results showed that the particle size of the suspended peptide is less than the wavelength of reflected light. On the basis of the tests carried out, the stability of these preparations was demonstrated for 3 months storage at 2-8 ° C; all preparations contained the predominant portion of Αβ1-42 in β-sheet conformation; no preparation showed turbidity when analyzed on a spectrophotometer at 405 nm. The preparation 0.45 mg / ml Αβ1-42, 0.2 mg / ml QS-21, 10 mM Gly, 20 mM Cit, 5% sucrose, pH 6.0 was quantitatively tested for titer in mice resulting in a high titer of antibody response .

Tabuľka 12ATable 12A

Prípravok agent Vzhľad appearance 0,45 mg/ml Αβ1-42, 0,2 mg/ml QS-21, 10 mM Gly, 20 mM Cit, 5 % sacharóza, pH 6,0¹ 0.45 mg / ml Αβ1-42, 0.2 mg / ml QS-21, 10 mM Gly, 20 mM Cit, 5% sucrose, pH 6.0 ¹ čistý clean 0,45 mg/ml Αβ1-42, 0,2 mg/ml QS-21, 10 mM Gly, 20 mM Cit, 5 % sacharóza, pH 6,0 0.45 mg / ml Αβ1-42, 0.2 mg / ml QS-21, 10 mM Gly, 20 mM Cit, 5% sucrose, pH 6.0 čistý clean 0,225 mg/ml Αβ1-42, 0,3 mg/ml QS-21, 10 mM Gly, 20 mM Cit, 5 % sacharóza, pH 6,0 0.225 mg / ml Αβ1-42, 0.3 mg / ml QS-21, 10 mM Gly, 20 mM Cit, 5% sucrose, pH 6.0 čistý clean 0,225 mg/ml Αβ1-42, 0,15 mg/ml QS-21, 10 mM Gly, 20 mM Cit, 5 % sacharóza, pH 6,0 0.225 mg / ml Αβ1-42, 0.15 mg / ml QS-21, 10 mM Gly, 20 mM Cit, 5% sucrose, pH 6.0 čistý clean

¹ Pre tento prípravok bol zistený vysoký titer protilátok u myší ¹ A high antibody titer in mice was found for this formulation

2. Titrácia Αβ42 s použitím QS-212. Titration of Αβ42 using QS-21

Αβ42 (2 mg/ml) bol rozpustený v 10 mM glycíne, pH 9,5. pH bolo upravené naΑβ42 (2 mg / ml) was dissolved in 10 mM glycine, pH 9.5. The pH was adjusted to

9,5 pomocou 1N NaOH. Roztok Αβ42 bol potom prefiltrovaný cez filter Millex GV. QS-21 (5 mg/ml) bol rozpustený v 10 mM citráte, pH 6,0 a potom prefiltrovaný cez filter Millex GV. Určité množstvo Αβ42 bolo zmiešané s určitým množstvom QS-21 v požadovanom pomere a rozpustené v 10 mM glycíne, pH 9,5 a 1M citráte, pH 5,2, za vzniku výsledných koncentrácií ukázaných v tabuľke 12.9.5 with 1N NaOH. The Αβ42 solution was then filtered through a Millex GV filter. QS-21 (5 mg / ml) was dissolved in 10 mM citrate, pH 6.0 and then filtered through a Millex GV filter. A certain amount of ββ42 was mixed with a certain amount of QS-21 in the desired ratio and dissolved in 10 mM glycine, pH 9.5 and 1M citrate, pH 5.2, to give the final concentrations shown in Table 12.

Tabuľka 12B. Počiatočné prípravky AN1792/QS-21Table 12B. Initial preparations AN1792 / QS-21

Prípravok V 10 mM glycíne, 20 mM citrátu, pH 6,0 agent In 10 mM glycine, 20 mM citrate, pH 6.0 Vzhľad appearance OD405 nm OD405 nm 1.0 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21 1.0 mg / ml Αβ42, 1.0 mg / ml QS-21 čisté clean 0,018 0,018 1.0 mg/ml Αβ42, 0,5 mg/ml QS-21 1.0 mg / ml Αβ42, 0.5 mg / ml QS-21 zákal (+) turbidity (+) 0,013 0,013 1.0 mg/ml Αβ42, 0,25 mg/ml QS-21 1.0 mg / ml Αβ42, 0.25 mg / ml QS-21 zákal (++) turbidity (++) 0,030 0,030 1.0 mg/ml Αβ42, 0,125 mg/ml QS-21 1.0 mg / ml Αβ42, 0.125 mg / ml QS-21 zákal (+++) turbidity (+++) 0,175 0,175 1.0 mg/ml Αβ42, 0,063 mg/ml QS-21 1.0 mg / ml Αβ42, 0.063 mg / ml QS-21 zákal (+++) turbidity (+++) 0,308 0,308 1.0 mg/ml Αβ42, 0,031 mg/ml QS-21 1.0 mg / ml Αβ42, 0.031 mg / ml QS-21 zákal (+++) turbidity (+++) 0,315 0,315 1.0 mg/ml Αβ42, 0,016 mg/ml QS-21 1.0 mg / ml Αβ42, 0.016 mg / ml QS-21 zákal (+++) turbidity (+++) 0,268 0,268 1.0 mg/ml Αβ42, 0,0 mg/ml QS-21 1.0 mg / ml Αβ42, 0.0 mg / ml QS-21 zákal (+++) turbidity (+++) 0,213 0,213 0.5 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21 0.5 mg / ml Αβ42, 1.0 mg / ml QS-21 čisté clean 0,005 0,005 0.5 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21 0.5 mg / ml Αβ42, 1.0 mg / ml QS-21 čisté clean 0,006 0,006 0.5 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21 0.5 mg / ml Αβ42, 1.0 mg / ml QS-21 čisté clean 0,005 0,005 0.5 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21 0.5 mg / ml Αβ42, 1.0 mg / ml QS-21 zákal (+) turbidity (+) 0,021 0,021 0.5 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21 0.5 mg / ml Αβ42, 1.0 mg / ml QS-21 zákal (++) turbidity (++) 0,148 0,148 0.5 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21 0.5 mg / ml Αβ42, 1.0 mg / ml QS-21 zákal (+++) turbidity (+++) 0,172 0,172 0.5 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21 0.5 mg / ml Αβ42, 1.0 mg / ml QS-21 zákal (+++) turbidity (+++) 0,162 0,162 0.5 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21 0.5 mg / ml Αβ42, 1.0 mg / ml QS-21 N/A ON THE N/A ON THE 0.3 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21 0.3 mg / ml Αβ42, 1.0 mg / ml QS-21 čisté clean 0,004 0,004 0.3 mg/ml Αβ42, 0,5 mg/ml QS-21 0.3 mg / ml Αβ42, 0.5 mg / ml QS-21 čisté clean 0,004 0,004 0.3 mg/ml Αβ42, 0,25 mg/ml QS-21 0.3 mg / ml Αβ42, 0.25 mg / ml QS-21 čisté clean 0,006 0,006

0.3 mg/ml Αβ42, 0,125 mg/ml QS-21 0.3 mg / ml Αβ42, 0.125 mg / ml QS-21 čisté clean 0,005 0,005 0.3 mg/ml Αβ42, 0,063 mg/ml QS-21 0.3 mg / ml Αβ42, 0.063 mg / ml QS-21 zákal(+) Turbidity (+) 0,013 0,013 0.3 mg/ml Αβ42, 0,031 mg/ml QS-21 0.3 mg / ml Αβ42, 0.031 mg / ml QS-21 zákal(+) Turbidity (+) 0,077 0,077 0.3 mg/ml Αβ42, 0,016 mg/ml QS-21 0.3 mg / ml Αβ42, 0.016 mg / ml QS-21 zákal(+) Turbidity (+) 0,068 0,068 0.3 mg/ml Αβ42, 0,0 mg/ml QS-21 0.3 mg / ml Αβ42, 0.0 mg / ml QS-21 zákal (++) turbidity (++) 0,046 0,046 0.1 mg/ml Αβ42, 1,0 mg/ml QS-21 0.1 mg / ml Αβ42, 1.0 mg / ml QS-21 čisté clean 0,004 0,004 0.1 mg/ml Αβ42, 0,5 mg/ml QS-21 0.1 mg / ml Αβ42, 0.5 mg / ml QS-21 čisté clean 0,002 0,002 0.1 mg/ml Αβ42, 0,25 mg/ml QS-21 0.1 mg / ml Αβ42, 0.25 mg / ml QS-21 čisté clean 0,002 0,002 0.1 mg/ml Αβ42, 0,125 mg/ml QS-21 0.1 mg / ml Αβ42, 0.125 mg / ml QS-21 čisté clean 0,001 0,001 0.1 mg/ml Αβ42, 0,063 mg/ml QS-21 0.1 mg / ml Αβ42, 0.063 mg / ml QS-21 čisté clean 0,002 0,002 0.1 mg/ml Αβ42, 0,031 mg/ml QS-21 0.1 mg / ml Αβ42, 0.031 mg / ml QS-21 čisté clean 0,003 0,003 0.1 mg/ml Αβ42, 0,016 mg/ml QS-21 0.1 mg / ml Αβ42, 0.016 mg / ml QS-21 čisté clean 0,004 0,004 0.1 mg/ml Αβ42, 0,0 mg/ml QS-21 0.1 mg / ml Αβ42, 0.0 mg / ml QS-21 čisté clean 0,008 0,008

3. Ďalšie prípravky Αβ42 a QS-213. Other preparations Αβ42 and QS-21

Chloridová soľ Αβ42 bola rozpustená na 1 mg/ml v 10 mM glycináte sodnom, pH 9,0 až 9,5, s alebo bez 5 % sacharózy, 0,1 % alebo 0,4 % PS-80. Peptidové roztoky boli sterilné filtrované cez striekačkový filter Millex GV. Lyofilizované QS-21 bolo rozpustené na 5 mg/ml v 10 mM citráte, pH 6,0 a sterilné filtrované cez striekačkový filter Millex GV.Αβ42 chloride salt was dissolved at 1 mg / ml in 10 mM sodium glycinate, pH 9.0 to 9.5, with or without 5% sucrose, 0.1% or 0.4% PS-80. The peptide solutions were sterile filtered through a Millex GV syringe filter. Lyophilized QS-21 was dissolved at 5 mg / ml in 10 mM citrate, pH 6.0 and sterile filtered through a Millex GV syringe filter.

Primerané množstvo roztoku Αβ42 a roztoku QS-21 bolo zmiešané za vzniku výsledných koncentrácií Αβ42 a QS-21 opísaných nižšie v prípravkoch v tabuľke XX. Nakoniec bolo pH znížené použitím 1M citrátového pufru, pH 5,4, za výsledného vzniku pH 6,0 v 20 mM citrátového pufru. Vzhľad prípravkov sa pohyboval v rozmedzí od čistého až po zakalený (+ až +++). Odlišnosť koncentrácií a pomeru Αβ42 a QS-21 mohlo ovplyvniť vizuálnu podobu prostriedku. Navyše, ďalšími akceptovateľnými prísadami prostriedku sú cukry a surfaktanty.An appropriate amount of Αβ42 solution and QS-21 solution was mixed to give the final concentrations of Αβ42 and QS-21 described below in the formulations in Table XX. Finally, the pH was lowered using 1M citrate buffer, pH 5.4, resulting in a pH of 6.0 in 20 mM citrate buffer. The appearance of the preparations ranged from pure to cloudy (+ to +++). The differences in concentrations and ratio of ββ42 and QS-21 could affect the visual appearance of the formulation. In addition, other acceptable ingredients of the composition are sugars and surfactants.

Tabuľka 12C. Ďalšie prípravky Αβ42 a QS-21Table 12C. Other preparations Αβ42 and QS-21

Prostriedky resources Vzhľad appearance QS-21 (mg/ml) QS-21 (Mg / ml) Αβ42 (mg/ml) Αβ42 (Mg / ml) Pomer Αβ42/Ο5-21 ratio Αβ42 / Ο5-21 Bez prísady without ingredients 5% sacharóza 5% sucrose 0,1 % PS-80 0.1% PS-80 0,4 % PS-80 0.4% PS-80 0,05 0.05 0,05 0.05 1,0 1.0 čisté clean čisté clean čisté clean čisté clean 0,1 0.1 0,1 0.1 1,0 1.0 čisté clean čisté clean čisté clean čisté clean 0.2 0.2 0,2 0.2 1,0 1.0 čisté clean čisté clean čisté clean zákal (+) turbidity (+) 0,1 0.1 0,23 0.23 2,3 2.3 zákal(+) Turbidity (+) zákal(+) Turbidity (+) zákal (+) turbidity (+) zákal (+) turbidity (+) 0,2 0.2 0,23 0.23 1,1 1.1 čisté clean čisté clean čisté clean zákal (+) turbidity (+) 0,3 0.3 0,23 0.23 0,8 0.8 čisté clean čisté clean čisté clean zákal (+) turbidity (+) 0,1 0.1 0,45 0.45 4,5 4.5 zákal (++) turbidity (++) zákal (++) turbidity (++) čisté clean zákal (++) turbidity (++) 0,2 0.2 0,45 0.45 2,3 2.3 zákal (++) turbidity (++) zákal (++) turbidity (++) zákal(+) Turbidity (+) zákal (++) turbidity (++) 0,3 0.3 0,45 0.45 1,5 1.5 čisté clean čisté clean čisté clean zákal (++) turbidity (++)

Príklad 10: Stanovenie a interpretácia C.D. spektra v prípravku Αβ42 Na zhromaždenie dát cirkulárneho dichroizmu bol použitý spektropolarimeter, model Aviv 62-DS (Lakewood, NJ). Vzorky boli pripravené približne na zber signálov z oblasti blízkej, respektíve vzdialenej UV spektru a vložené do 1 mn pozdĺžnej sklenenej komôrky bez napätia. Vzorky boli udržované pri stabilnej teplote 25 °C. Dáta boli zbierané po 0,5 nm intervaloch s časom 4 sekundy na spriemerovanie nameraných hodnôt. V oblasti vzdialenej UV spektru (λ - 180 až 250 nm) dominovali signály vlastného peptidového reťazca a bolo tak možné získať odhad sekundárnej štruktúry prípravku. Skúšky v oblasti blízkej UV spektru (λ ~ 250 až 350 nm) poskytovali odlišné informácie: v tejto oblasti primárne signály vychádzali z postranných aromatických reťazcov (Phe, Tyr a Trp). Charakter signálu ukazuje stupeň ohybnosti v každej oblasti peptidu a orientácii postranných reťazcov vzhľadom k hlavnému reťazcu. Tým, že počet týchto chromofórov je menší ako počet aminoskupin a tým, že chromofóry sú rozmiestnené po celej molekule, je možné určité rozpoznanie lokálnej štruktúry.Example 10: Determination and Interpretation of C.D. Spectropolarimeter, model Aviv 62-DS (Lakewood, NJ) was used to collect circular dichroism data. The samples were prepared to collect signals from near and far UV spectrum, respectively, and placed in a 1 mn longitudinal glass chamber without tension. The samples were kept at a stable temperature of 25 ° C. Data were collected at 0.5 nm intervals with a time of 4 seconds to average the measured values. In the region of the distant UV spectrum (λ - 180 to 250 nm), the signals of the self-peptide chain dominated and it was possible to obtain an estimate of the secondary structure of the preparation. Tests in the near-UV region (λ ~ 250-350 nm) provided different information: in this region the primary signals were based on the side aromatic chains (Phe, Tyr and Trp). The nature of the signal indicates the degree of flexibility in each region of the peptide and the orientation of the side chains relative to the backbone. Since the number of these chromophores is less than the number of amino groups, and because the chromophores are distributed throughout the molecule, some recognition of the local structure is possible.

Dá sa očakávať, s ohľadom na znalosti v odbore, že sa objaví množstvo modifikácií a variácií vynálezu opísaného vyššie v príkladoch. V súvislosti s tým si pripojené nároky kladú za cieľ pokryť všetky také varianty, ktoré sa v rámci nárokovaného vynálezu objavia.Numerous modifications and variations of the invention described above in the examples can be expected in view of the knowledge in the art. Accordingly, the appended claims are intended to cover all such variants that appear within the scope of the claimed invention.

Claims (47)

1. Prostriedok obsahujúci vodný roztok najmenej 0,01 mg/ml Αβ peptidu, vyznačujúci sa tým, že vodný roztok je udržovaný pri pH dostatočnom na rozpustenie spomínaného Αβ peptidu.A composition comprising an aqueous solution of at least 0.01 mg / ml Αβ peptide, characterized in that the aqueous solution is maintained at a pH sufficient to dissolve said Αβ peptide. 2. Prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že roztok je udržovaný pri takomto vhodnom pH za použitia účinného množstva farmaceutický akceptovateľného pufru.The composition of claim 1, wherein the solution is maintained at such a suitable pH using an effective amount of a pharmaceutically acceptable buffer. 3. Prostriedok obsahujúci sterilný vodný roztok obsahujúci najmenej 0,01 mg/ml Αβ peptidu, vyznačujúci sa tým, že vodný roztok je udržovaný pri pH dostatočnom na rozpustenie spomínaného Αβ peptidu.3. A composition comprising a sterile aqueous solution containing at least 0.01 mg / ml Αβ peptide, wherein the aqueous solution is maintained at a pH sufficient to dissolve said Αβ peptide. 4. Prostriedok podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že roztok je udržovaný pri takomto vhodnom pH za použitia účinného množstva farmaceutický akceptovateľného pufru.The composition of claim 3, wherein the solution is maintained at such a suitable pH using an effective amount of a pharmaceutically acceptable buffer. 5. Prostriedok podľa nárokov 1 a 3, vyznačujúci sa tým, že Αβ peptid je dlhou formou Αβ peptidu.Composition according to claims 1 and 3, characterized in that the Αβ peptide is a long form of the Αβ peptide. 6.. Prostriedok podľa nárokov 1 a 3, vyznačujúci sa tým, že Αβ peptid je Αβ42.Composition according to claims 1 and 3, characterized in that the Αβ peptide is Αβ42. 7. Prostriedok podľa nárokov 1 a 3, vyznačujúci sa tým, že pH je okolo 8,5 až okolo 12.The composition of claims 1 and 3, wherein the pH is about 8.5 to about 12. 8. Prostriedok podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že pH je okolo 9 až okolo 10.The composition of claim 7, wherein the pH is about 9 to about 10. 9. Prostriedok podľa nárokov 2 a 4, vyznačujúci sa tým, že farmaceutický akceptovateľný pufor je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z aminokyselín, ich solí a derivátov, farmaceutický akceptovateľných zásad, alkalických hydroxidov kovov, amóniumhydroxidov, organických a anorganických kyselín a ich solí a ich zmesí.The composition of claims 2 and 4, wherein the pharmaceutically acceptable buffer is selected from the group consisting of amino acids, salts and derivatives thereof, pharmaceutically acceptable bases, alkali metal hydroxides, ammonium hydroxides, organic and inorganic acids, and salts and mixtures thereof. . 10. Prostriedok podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že farmaceutický akceptovateľný pufor je glycín (glycinát sodný) alebo arginín (arginínchlorovodík).The composition of claim 9, wherein the pharmaceutically acceptable buffer is glycine (sodium glycinate) or arginine (arginine hydrogen chloride). 11. Lyofilizovaný prostriedok Αβ peptidu, vyznačujúci sa tým, že je pripravený11. A lyophilized composition of an Aβ peptide, characterized in that it is prepared a) zmrazením sterilného vodného roztoku obsahujúceho najmenej 0,01 mg/ml Αβ peptidu, pričom vodný roztok je udržovaný pri pH dostatočnom na rozpustenie Αβ peptidu, a(a) freezing a sterile aqueous solution containing at least 0,01 mg / ml Αβ peptide, the aqueous solution being maintained at a pH sufficient to dissolve the Αβ peptide, and b) lyofilizáciou zmrazeného prostriedku pripraveného v kroku a) vyššie.b) lyophilizing the frozen composition prepared in step a) above. 12. Prostriedok podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že Αβ peptid je dlhou formou Αβ peptidu.The composition of claim 11, wherein the Αβ peptide is a long form of the Αβ peptide. 13. Prostriedok podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že Αβ peptid je Αβ42.The composition of claim 11, wherein the Αβ peptide is Αβ42. 14. Prostriedok podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že roztok je udržovaný pri takomto pH za použitia účinného množstva farmaceutický akceptovateľného pufru.The composition of claim 11, wherein the solution is maintained at such pH using an effective amount of a pharmaceutically acceptable buffer. 15. Prostriedok podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že farmaceutický akceptovateľný pufor je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z aminokyselín, ich solí a derivátov; farmaceutický akceptovateľných zásad, alkalických hydroxidov kovov, amóniumhydroxidov, organických a anorganických kyselín a ich solí a ich zmesí.The composition of claim 14, wherein the pharmaceutically acceptable buffer is selected from the group consisting of amino acids, salts and derivatives thereof; pharmaceutically acceptable bases, alkali metal hydroxides, ammonium hydroxides, organic and inorganic acids, and salts and mixtures thereof. 16. Prostriedok podľa nárokov 1, 3 alebo 11, vyznačujúci sa tým, že Αβ peptid je v podstate v náhodne zvinutej konformácii.The composition of claims 1, 3, or 11, wherein the β-peptide is in substantially random coil conformation. 17. Prostriedok podľa nárokov 1, 3 alebo 11, vyznačujúci sa tým, že Αβ peptid má koncentráciu od asi 0,05 mg/ml do asi 2,0 mg/ml.The composition of claims 1, 3 or 11, wherein the β-peptide has a concentration of from about 0.05 mg / ml to about 2.0 mg / ml. 18. Prostriedok podľa nárokov 1, 3 alebo 11, vyznačujúci sa tým, že prostriedok ďalej obsahuje farmaceutický akceptovateľné adjuvans.The composition of claims 1, 3 or 11, wherein the composition further comprises a pharmaceutically acceptable adjuvant. 19. Prostriedok podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že adjuvans je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z nekompletného Freundovho adjuvans; MPL; QS-21; a kamenca.The composition of claim 18, wherein the adjuvant is selected from the group consisting of incomplete Freund's adjuvant; MPL; QS-21; and alum. 20. Prostriedok obsahujúci sterilnú vodnú suspenziu s najmenej 0,1 mg/ml Αβ peptidu s pH okolo 5 až okolo 7.A composition comprising a sterile aqueous suspension of at least 0.1 mg / ml Αβ peptide at a pH of about 5 to about 7. 21. Prostriedok podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že vodná suspenzia tiež obsahuje účinné množstvo farmaceutický akceptovateľného pufru.The composition of claim 20, wherein the aqueous suspension also comprises an effective amount of a pharmaceutically acceptable buffer. 22. Prostriedok podľa nárokov 20 alebo 21, vyznačujúci sa tým, že Αβ peptid je dlhou formou Αβ peptidu.The composition of claims 20 or 21, wherein the Αβ peptide is a long form of the Αβ peptide. 23. Prostriedok podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že Αβ peptid je Αβ42..The composition of claim 22, wherein the Αβ peptide is Αβ42. 24. Prostriedok podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že farmaceutický akceptovateľný pufor je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z aminokyselín, ich solí a derivátov; farmaceutický akceptovateľných zásad, alkalických hydroxidov kovov, amóniumhydroxidov, organických a anorganických kyselín a ich solí a ich zmesí.The composition of claim 21, wherein the pharmaceutically acceptable buffer is selected from the group consisting of amino acids, salts and derivatives thereof; pharmaceutically acceptable bases, alkali metal hydroxides, ammonium hydroxides, organic and inorganic acids, and salts and mixtures thereof. 25. Prostriedok podľa nároku 20 obahujúci 0,1 až 0,8 mg/ml peptidu Αβ42, 10 mM glycínu a kyselinu dostatočnú na úpravu pH na okolo 5,5 až okolo 6,5.The composition of claim 20 comprising 0.1 to 0.8 mg / ml of ββ42 peptide, 10 mM glycine and an acid sufficient to adjust the pH to about 5.5 to about 6.5. 26. Prostriedok podľa nárokov 24 alebo 25 obsahujúci ďalej jedno alebo viac inertných vehikúl vybraných zo skupiny pozostávajúcej z modifikátorov tonicity, surfaktantov a zvlhčovacích činidiel.The composition of claims 24 or 25, further comprising one or more inert excipients selected from the group consisting of tonicity modifiers, surfactants and wetting agents. 27. Prostriedok podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že prostriedok ďalej obsahuje farmaceutický akceptovateľné adjuvans.The composition of claim 24, wherein the composition further comprises a pharmaceutically acceptable adjuvant. 28. ' Prostriedok podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ešte ďalšie farmaceutický akceptovateľné adjuvans.28. The composition of claim 26, further comprising a further pharmaceutically acceptable adjuvant. 29. Prostriedok podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, že adjuvans je vybrané zo skupiny pozostávajúcej z nekompletného Freundovho adjuvans; MPL; QS-21; a kamenca.The composition of claim 28, wherein the adjuvant is selected from the group consisting of incomplete Freund's adjuvant; MPL; QS-21; and alum. 30. Prostriedok podľa nároku 28 obsahujúci okolo 0,1 až okolo 1,0 mg/ml peptidu Αβ42 v 10 mM glycínu a najmenej 0,1 mg/ml QS-21 v množstve účinnom na vytvorenie vizuálne čistej suspenzie s pH okolo 6.The composition of claim 28, comprising about 0.1 to about 1.0 mg / ml Αβ42 peptide in 10 mM glycine and at least 0.1 mg / ml QS-21 in an amount effective to form a visually pure suspension at a pH of about 6. 31. Spôsob prípravy sterilného prostriedku dlhej formy Αβ peptidu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:31. A process for the preparation of a sterile formulation of a long form of Aβ peptide, comprising: úpravu pH vodného roztoku dostatočnú na rozpustenie Αβ peptidu v ňom; rozpustenie dostatočného množstva Αβ peptidu v roztoku s dosiahnutím imunogénnej koncentrácie pre cicavce; a filtráciu vzniknutého roztoku cez membránu s pórmi s rovnakou veľkosťou, kedy veľkosť pórov je v rozsahu umožňujúcom oddelenie baktérií a zároveň priechod takmer všetkého Αβ peptidu.adjusting the pH of the aqueous solution sufficient to dissolve the ββ peptide therein; dissolving a sufficient amount of the Aβ peptide in solution to achieve an immunogenic concentration in the mammal; and filtering the resulting solution through a membrane with pores of the same size, where the pore size is within the range allowing the bacteria to separate and at the same time passing almost all Αβ peptide. 32. Spôsob podľa nároku 31, vyznačujúci sa tým, že filtrácia je uskutočnená cez hydrofilnú polymérnu membránu s pórmi s rovnakou veľkosťou okolo 0,22 mikrometrov.The method of claim 31, wherein the filtration is performed through a hydrophilic polymer membrane with pores of the same size about 0.22 microns. 33. Spôsob podľa nároku 31, vyznačujúci sa tým, že množstvo Αβ peptidu získané z filtrácie je väčšie ako 50 %.The method of claim 31, wherein the amount of ββ peptide obtained from the filtration is greater than 50%. 34. Spôsob podľa nároku 31, vyznačujúci sa tým, že roztok pred filtráciou obsahuje najmenej jedno rozpúšťadlo vybrané zo skupiny pozostávajúcej z farmakologicky akceptovateľných pufrov s koncentráciou od okolo 5 mM do okolo 45 mM.34. The method of claim 31, wherein the solution prior to filtration comprises at least one solvent selected from the group consisting of pharmacologically acceptable buffers at a concentration of from about 5 mM to about 45 mM. 35. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že roztok pred filtráciou obsahuje činidlo modifikujúce tonicitu od okolo 0,9 % do okolo 6,0 % hmotnostných.35. The method of claim 34, wherein the solution prior to filtration comprises a tonicity modifying agent of from about 0.9% to about 6.0% by weight. 36. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že roztok pred filtráciou obsahuje surfaktant od okolo 0,02 % do okolo 1,0 % hmotnostných.36. The method of claim 34, wherein the solution prior to filtration comprises a surfactant of from about 0.02% to about 1.0% by weight. 37. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že roztok pred filtráciou obsahuje chelačné činidlo od okolo 0,1 mM do okolo 1,0 mM.The method of claim 34, wherein the solution prior to filtration comprises a chelating agent from about 0.1 mM to about 1.0 mM. 38. Spôsob podľa nároku 34, 35, 36 alebo 37, vyznačujúci sa tým, že pH sterilného roztoku získaného z filtrácie je upravené na pH okolo 5 až okolo 7 za poskytnutia peptidovej suspenzie.The method of claim 34, 35, 36, or 37, wherein the pH of the sterile solution obtained from the filtration is adjusted to a pH of about 5 to about 7 to provide a peptide suspension. 39. Spôsob prevencie alebo liečby Alzheimerovej demencie u cicavcov, vyznačujúci sa tým, že cicavcom je aplikované množstvo sterilného vodného prostriedku obsahujúceho najmenej 0,05 mg/ml Αβ peptidu s cieľom vyvolať u cicavcov imunitnú odpoveď, a že vodný prostriedok je udržovaný pri pH dodatočnom na rozpustenie Αβ peptidu.39. A method of preventing or treating Alzheimer's dementia in a mammal, comprising administering to the mammal an amount of a sterile aqueous composition comprising at least 0.05 mg / ml Αβ peptide to elicit an immune response in the mammal, and wherein the aqueous composition is maintained at a pH additional for dissolving the Αβ peptide. 40. Spôsob vyvolania protilátkovej odpovede proti Αβ peptidu u cicavcov potrebujúcich takú antigénnu odpoveď, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa parenterálne podanie imunogénneho množstva sterilného prostriedku dlhej formy Αβ peptidu.40. A method of eliciting an antibody response against an Aβ peptide in a mammal in need of such an antigenic response comprising parenterally administering an immunogenic amount of a sterile composition of a long form of the Aβ peptide. 41. Spôsob podľa nároku 39 alebo 40, vyznačujúci sa tým, že tento spôsob ďalej zahŕňa podanie farmaceutický akceptovateľného adjuvans, samostatne alebo zmiešaného so sterilným prostriedkom.The method of claim 39 or 40, wherein the method further comprises administering a pharmaceutically acceptable adjuvant, alone or mixed with a sterile composition. 42. Spôsob podľa nároku 39 alebo 40, vyznačujúci sa tým, že sterilný prostriedok je v súlade s nárokom 30.The method of claim 39 or 40, wherein the sterile composition is in accordance with claim 30. 43. Prostriedok obsahuje suspenziu najmenej 0,1 mg/ml Αβ peptidu a účinné množstvo QS-21 na vytvorenie vizuálne čistej suspenzie v rozmedzí pH 5 až 7.43. The composition comprises a suspension of at least 0.1 mg / ml Αβ peptide and an effective amount of QS-21 to form a visually pure suspension in the pH range of 5-7. 44. Prostriedok obsahuje suspenziu najmenej 0,1 mg/ml Αβ peptidu a účinné množstvo dipalmitoylfosfatidylchloridu (DPPC) na vytvorenie vizuálne čistej suspenzie v rozmedzí pH 5 až 7.44. The composition comprises a suspension of at least 0.1 mg / ml Αβ peptide and an effective amount of dipalmitoyl phosphatidyl chloride (DPPC) to form a visually pure suspension in the pH range of 5-7. 45. Použitie sterilného prostriedku dlhej formy Αβ peptidu na výrobu lieku na vyvolanie protilátkovej odpovede proti Αβ peptidu.45. Use of a sterile formulation of a long form of the Aβ peptide for the manufacture of a medicament for eliciting an antibody response against an Aβ peptide. 46. Použitie sterilného vodného prostriedku Αβ peptidu na výrobu lieku vhodného na prevenciu alebo liečbu Alzheimerovej demencie.46. The use of a sterile aqueous formulation of an Aβ peptide for the manufacture of a medicament suitable for the prevention or treatment of Alzheimer's dementia. 47. Použitie podľa nároku 45 alebo 46, kde liek ďalej obsahuje farmaceutický akceptovateľné adjuvans.The use of claim 45 or 46, wherein the medicament further comprises a pharmaceutically acceptable adjuvant. Jf ftot '2.001Jf ftot '2.001 1/21/2 Vlnová dĺžka (nm)Wavelength (nm) Obr. 1 f?Fig. 1 f? 2/22/2 Hranice rozpustností Αβ42 v lOntMpufru glycinátu sodnom, pH 9,0Limits of solubility of Αβ42 in 10 µM Buffer of sodium glycinate, pH 9.0 RP-HPLC pikovej plochy peptiduRP-HPLC peak area of the peptide I. E+07I. E + 07 8.E+068.E + 06 5.E+065.E + 06 J. E+06J. E + 06 O. E+00O. E + 00 O 0.5 1 1.5 2 2.5 5O 0.5 1 1.5 2 2.5 5 AB42 (mg/mL)AB42 (mg / mL)