SK137795A3 - Antibodies to p-selectin and their use - Google Patents

Abstract

The present invention relates to compositions and methods for treating inflammation and other pathological conditions using novel blocking P-selectin antibodies that inhibit adhesion of leukocytes to activated platelets and/or to activated vascular endothelium in vivo. Both murine and humanized antibodies are provided.

Description

Protilátky proti P-selektínu a ich použitieP-selectin antibodies and their use

Odkaz na príbuzné prihláškyReference to related applications

Táto prihláška je čiastočne pokračovacou prihláškou (continuation-in-part) americkej patentovej prihlášky č. 08/057292, podanej 5.5.1993, ktorá je čiastočne pokračovacou prihláškou americkej patentovej prihlášky č. 07/880196, podanej 5.5.1992, teraz opustenej. Tieto prihlášky sú tu vo svojej úplnosti pre všetky účely zahrnuté formou odkazu.This application is partially a continuation-in-part of U.S. Patent Application Ser. No. 08/057292, filed May 5, 1993, which is in part a continuation of U.S. Patent Application Ser. 07/880196, filed May 5, 1992, now abandoned. These applications are incorporated herein by reference in their entirety.

Oblasť technikyTechnical field

Vynález sa všeobecne týka nových imunoglobulínov, reagujúcich s funkčnými epitopmi na povrchovom bunkovom receptore P-selektínu. Táto prihláška sa tiež všeobecne týka diagnostických a terapeutických metód použitia týchto protilátok.The invention generally relates to novel immunoglobulins reacting with functional epitopes at the surface cell receptor of P-selectin. This application also generally relates to diagnostic and therapeutic methods of using these antibodies.

Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Schopnosť vzájomnej adhézie buniek zohráva kritickú úlohu pri vývoji, normálnej fyziológii a chorobných procesoch, ako sú zápaly. Táto schopnosť je sprostredkovaná adhéznymi molekulami, všeobecne glykoproteínmi, exprimovanými na bunkových membránach, často sa adhézna molekula na jednom type bunky viaže k inej adhéznej molekule, exprimovanej na odlišnom type bunky, a tak vytvára dvojicu receptor-protireceptor. Tri významné skupiny adhéznych molekúl tvoria integríny, selektíny a členovia nadskupiny imunoglobulínov (Ig) (vid Springer, Náture 346:425 (1990); Osborn, Celí 62:3 (1990); Hynes, Celí 69:11 (1992), ktoré odkazy sú tu vo svojej úplnosti pre všetky účely zahrnuté formou odkazu). Tieto molekuly sú zvlášť nevyhnutné pre interakciu leukocytov a doštičiek sa sebou navzájom a s extracelulárnou matricou a vaskulárnym endotelom.The ability of cell adhesion to each other plays a critical role in development, normal physiology and disease processes such as inflammation. This ability is mediated by adhesion molecules, generally glycoproteins expressed on cell membranes, often an adhesion molecule on one cell type binds to another adhesion molecule expressed on a different cell type, thus forming a receptor-antireceptor pair. Three important classes of adhesion molecules are integrins, selectins and members of the immunoglobulin (Ig) superfamily (see Springer, Nature 346: 425 (1990); Osborn, Cell 62: 3 (1990); Hynes, Cell 69:11 (1992), which references are incorporated herein by reference in their entirety). These molecules are particularly necessary for the interaction of leukocytes and platelets with each other and with the extracellular matrix and the vascular endothelium.

P-Selektín, známy tiež ako CD62, granulárny membránový proteín 140 (GMP-l40)/granulárna externá membrána závislá na aktivácii doštičiek (PADGEM)/LECCAM-3, je špecializovaný povrchový receptor na vaskulárnych endoteliálnych bunkách a doštičkách, ktorý sa zúčastňuje rozpoznávania rôznych obiehajúcich buniek. P-Selektín je povrchový glykoproteín s lektínom podobnou doménou, oblasťou, ktorá je homologická k epidermálnemu rastovému faktoru, a oblasťou homologickou k proteínom regulujúcim komplement (vid NcEver, Blood Cells 16:73-83 (1990)). Štruktúra P-selektínu je podobná ako u dvoch iných povrchových receptorov vaskulárnych buniek, endoteliálnej leukocytovej adhéznej molekuly (ELAM-1) a receptoru smerujúceho lymfocyty (LHR). Názov selektín bol pre túto všeobecnú skupinu receptorov navrhnutý kvôli ich doméne podobnej lektínu a selektívnemu charakteru ich adhéznych funkcií .P-Selectin, also known as CD62, granular membrane protein 140 (GMP-140) / platelet-dependent granular external membrane (PADGEM) / LECCAM-3, is a specialized surface receptor on vascular endothelial cells and platelets that is involved in the recognition of various circulating cells. P-Selectin is a surface glycoprotein with a lectin-like domain, an area homologous to epidermal growth factor, and an area homologous to complement-regulating proteins (see NcEver, Blood Cells 16: 73-83 (1990)). The structure of P-selectin is similar to that of two other vascular cell surface receptors, the endothelial leukocyte adhesion molecule (ELAM-1) and the lymphocyte targeting receptor (LHR). The name selectin has been suggested for this general family of receptors because of their lectin-like domain and the selective nature of their adhesion functions.

P-Selektín je na povrchu doštičiek a endoteliálnych buniek prítomný ako odpoveď na rôzne stimuly, kde sprostredkováva interakcie doštička-leukocyt a endotel-leukocyt. Naproti tomu je ELAM-1 exprimovaný iba na endoteliálnych bunkách a LHR je exprimovaný na rôznych leukocytoch v endoteliálnych žilkách periférnych lymfatických uzlín. Expresia P-selektínu je indukovateíná a k expresii nedochádza na neaktivovaných endoteliálnych bunkách alebo doštičkách. Expresia P-selektínu nevyžaduje opätovnú syntézu, pretože je skladovaný v sekréčnych granulách (alebo Weibel-Paladových telieskach) ako v doštičkách, tak v endoteliálnych bunkách. Počas niekoíkých minút po aktivácii buniek oboch typov trombínom, histamínom alebo forbolovými estermi alebo inými humorálnymi faktormi je teda P-selektín rýchle redistribuovaný k povrchu bunky, kde je prístupný pre väzbu na iné bunky.P-selectin is present on the surface of platelets and endothelial cells in response to various stimuli where it mediates platelet-leukocyte and endothelial-leukocyte interactions. In contrast, ELAM-1 is expressed only on endothelial cells and LHR is expressed on various leukocytes in peripheral lymph node endothelial veins. P-selectin expression is inducible and does not occur on unactivated endothelial cells or platelets. Expression of P-selectin does not require re-synthesis since it is stored in secretory granules (or Weibel-Palad bodies) in both platelets and endothelial cells. Thus, within a few minutes of cell activation of both types by thrombin, histamine or phorbol esters or other humoral factors, P-selectin is rapidly redistributed to the cell surface where it is accessible for binding to other cells.

Bol zaznamenaný veľký počet myších protilátok proti P-selektínu (viď napríklad patent US 4,783.330, patentová prihláška WO 91/06632, patentová prihláška PCT/FR90/00565, McEver ad., J. Biol. Chem. 259:9799-9804 (1984); Gang a d., Náture 343:757-760; Parmentier a ď., Blood 77:1734-1739 (1991)). Ďalšia protilátka proti P-selektínu bola opísaná v prednáškach na Scripps Inštitúte, La Jolla, California, a na kolokviu v Keystone 16.1.1992. Niektoré z týchto protilátok, ktoré blokujú P-selektínom sprostredkovanú adhéziu, sú závislé na Ca2⁺.A large number of murine antibodies against P-selectin have been reported (see, for example, U.S. Patent 4,783,330, WO 91/06632, PCT / FR90 / 00565, McEver et al., J. Biol. Chem. 259: 9799-9804 (1984)). Gang et al., Nature 343: 757-760; Parmentier et al., Blood 77: 1734-1739 (1991)). Another anti-P-selectin antibody has been described in lectures at the Scripps Institute, La Jolla, California, and at Colloquium in Keystone on January 16, 1992. Some of these antibodies which block P-selectin mediated adhesion are Ca ²⁺ dependent.

Experimenty in vitro s použitím protilátok proti P-selektínu poskytli obmedzené pochopenie ligandovej špecificity tohto receptora. Bolo uvedené, že P-selektín viaže neutrofily, monocyty a určité karcinómové bunky (Bevilacqua a d., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9238-9242 (1987); Geng a d., Náture 343:757-760 (1990); Larsen a d., Celí 63:467-474 (1990), a Polley a d. Bolo taktiež uvedené, že P-selektín rozpoznáva Le^x ako vysoko afinitný ligand (Larsen a d., Celí 63:467-474 (1990)). Následné experimenty však ukázali, že SLe^x obsahujúci oligosacharid je v skutočnosti účinnejším inhibítorom P-selektínom sprostredkovanej adhézie než Le^x (Polley a d., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:6224-6228 (1991)).In vitro experiments using anti-P-selectin antibodies gave a limited understanding of the ligand specificity of this receptor. P-selectin has been reported to bind neutrophils, monocytes and certain carcinoma cells (Bevilacqua et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 9238-9242 (1987); Geng et al., Nature 343: 757-760 (1990); Larsen et al., Cell 63: 467-474 (1990), and Polley et al. P-selectin has also been reported to recognize Le ^x as a high affinity ligand (Larsen et al., Cell 63: 467-). However, subsequent experiments have shown that SLe ^x containing oligosaccharide is in fact a more potent inhibitor of P-selectin-mediated adhesion than Le ^x (Polley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6224-6228 ( 1991)).

Z účasti P-selektínu v intracelulárnej adhézii in vitro je možné usudzovať, že P-selektín sa môže, podobne ako iné adhézne molekuly, zúčastňovať na bunkových interakciách, ktoré prispievajú k zápalovým ochoreniam in vivo. Dosiaľ však nebolo ozrejmené, v ktorých konkrétnych zápalových ochoreniach by P-selektín mohol hrať významnú úlohu. Podobne je nejasná epitopová špecificita prostriedkov, účinných pri likvidácii konkrétnych P-selektínom sprostredkovaných zápalových ochorení. Zo známych protilátok k P-selektínu sa niektoré na P-selektín viažu, ale neblokujú P-selektínom sprostredkované intercelulárne interakcie. Iné známe protilátky majú schop4 nosť blokovať P-selektínom sprostredkovanú intercelulárnu väzbu iba v prítomnosti vysokých koncentrácií Ca²⁺, ktorá podmienka nemusí byť in vivo vždy splnená. Absencia vysokých koncentrácií Ca²⁺ in vivo spôsobuje neúčinnosť týchto protilátok ako terapeutických prostriedkov. Naviac všetky doposiaľ vyrobené protilátky k P-selektínu sú myšieho pôvodu, a môžu teda v klinickom použití vyvolať ludskú-antimyšiu protilátkovú odpoveď (HAMA).The involvement of P-selectin in intracellular adhesion in vitro suggests that P-selectin, like other adhesion molecules, may be involved in cellular interactions that contribute to inflammatory diseases in vivo. However, it has not yet been clarified in which specific inflammatory diseases P-selectin could play an important role. Similarly, the epitope specificity of agents effective in eradicating particular P-selectin-mediated inflammatory diseases is unclear. Among the known antibodies to P-selectin, some bind to P-selectin but do not block P-selectin-mediated intercellular interactions. Other known antibodies have the ability to block P-selectin-mediated intercellular binding only in the presence of high concentrations of Ca ²⁺ , which condition may not always be met in vivo. The absence of high Ca ²⁺ concentrations in vivo renders these antibodies ineffective as therapeutic agents. Furthermore, all of the antibodies produced to P-selectin produced so far are of murine origin and can therefore elicit a human-anti-mouse antibody response (HAMA) in clinical use.

Na základe vyššie uvedených skutočností je zrejmé, že existuje potreba nových prostriedkov, cielených proti P-selektínu, ktoré majú príslušnú epitopovú špecificitu pre likvidáciu intercelulárnych interakcií, vedúcich k zápalovým ochoreniam in vivo. Ideálne také prostriedky nebudú vyvolávať pri ošetrovaní ludí odpoveď HAMA. Túto a ďalšie potreby plní tento vynález.In view of the above, there is a need for novel compositions directed against P-selectin having the appropriate epitope specificity for the eradication of intercellular interactions leading to inflammatory diseases in vivo. Ideally, such compositions will not elicit a HAMA response in the treatment of humans. This and other needs are met by the present invention.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

V jednom aspekte sú predmetom vynálezu blokujúce protilátky, ktoré sa špecificky viažu na P-selektín. Príkladom je protilátka označená mu MAb PB1.3 (produkovaná bunkovou líniou, ktorá má prírastkové číslo ATCC HB11041). Ďalšie protilátky konkurenčne inhibujú väzbu mu MAb PB1.3 na P-selektín, merané testom kompetitívnej inhibície. Výhodne protilátky sa viažu na P-selektín v neprítomnosti Ca²⁺. Protilátky podlá vynálezu zahrnujú fragmenty, ako je Fab, Fab' F(ab')₂, Fabc a Fv, rovnako ako intaktné protilátky.In one aspect, the invention provides blocking antibodies that specifically bind to P-selectin. An example is the antibody designated mu MAb PB1.3 (produced by a cell line having ATCC accession number HB11041). Other antibodies competitively inhibit mu MAb PB1.3 binding to P-selectin, as measured by competitive inhibition assay. Preferably, the antibodies bind to P-selectin in the absence of Ca ²⁺ . Antibodies of the invention include fragments such as Fab, Fab 'F (ab') ₂ , Fabc and Fv as well as intact antibodies.

V ďalšom aspekte sú predmetom vynálezu farmaceutické prípravky. Farmaceutické prípravky zahrnujú vyššie opísanú blokujúcu protilátku proti P-selektínu a farmaceutický prijateľný nosič.In another aspect, the invention provides pharmaceutical compositions. The pharmaceutical compositions include the above-described blocking anti-P-selectin antibody and a pharmaceutically acceptable carrier.

Vynález taktiež poskytuje terapeutické metódy pre liečbu ochorení imunitného systému. Tieto metódy zahrnujú podávanie terapeuticky účinnej dávky vyššie opísaného farmaceutického prípravku pacientovi, trpiacemu takýmto ochorením. Príklady ochorení, liečiteľných podľa vynálezu, sú akútne poškodenie pľúc a ischemické reperfúzne poškodenie.The invention also provides therapeutic methods for treating diseases of the immune system. These methods comprise administering to a patient suffering from such a disease a therapeutically effective dose of the above-described pharmaceutical composition. Examples of diseases treatable according to the invention are acute lung injury and ischemic reperfusion injury.

Niektoré protilátky podía vynálezu sú humanizované imunoglobulíny. Humanizované imunoglobulíny zahrnujú humanizovaný ťažký reťazec a humanizovaný ľahký reťazec. Humanizovaný ľahký reťazec zahrnuje tri oblasti determinujúce komplementaritu (CDR1, CDR2 a CDR3), majúce sekvencie aminokyselín zo zodpovedajúcich oblastí determinujúcich komplementaritu ľahkého reťazca myšieho imunoglobulínu PB1.3 a úsek základnej štruktúry variabilnej oblasti zo sekvencie základnej štruktúry variabilnej oblasti ľudského ľahkého reťazca. Humanizovaný ťažký reťazec zahrnuje tri oblasti determinujúce komplementaritu (CDR1, CDR2 a CDR3), majúce sekvencie aminokyselín zo zodpovedajúcich oblastí determinujúcich komplementaritu ťažkého reťazca myšieho imunoglobulínu PB1.3 a úsek základnej štruktúry variabilnej oblasti zo sekvencie základnej štruktúry variabilnej oblasti íudského ťažkého reťazca. Humanizované imunoglobulíny sa špecificky viažu na P-selektín, pričom väzbová afinita má spodnú hranicu asi 10? M~^ a hornú hranicu asi päťnásobku väzbovej aktivity myšieho imunoglobulínu PB1.3.Some antibodies of the invention are humanized immunoglobulins. Humanized immunoglobulins include a humanized heavy chain and a humanized light chain. The humanized light chain comprises three complementarity determining regions (CDR1, CDR2, and CDR3) having amino acid sequences from corresponding murine immunoglobulin light chain complementarity determining regions PB1.3 and a variable region framework from the human light chain variable region framework. The humanized heavy chain comprises three complementarity determining regions (CDR1, CDR2, and CDR3) having amino acid sequences from corresponding murine immunoglobulin heavy chain complementarity determining regions PB1.3 and a variable region framework from the human heavy chain variable region framework. Humanized immunoglobulins specifically bind to P-selectin, with a binding affinity having a lower limit of about 10? It has an upper limit of about five times the binding activity of mouse immunoglobulin PB1.3.

V mnohých humanizovaných imunoglobulínoch je sekvencia úseku základnej štruktúry variabilnej oblasti ľahkého ľudského reťazca substituovaná v aspoň jednej polohe, vybranej z prvej skupiny tvorenej L21, L46, L60 a L70 aminokyselinou prítomnou v ekvivalentnej polohe sekvencie úseku základnej štruktúry variabilnej oblasti ľahkého reťazca myšieho imunoglobulínu PB1.3. Podobne je sekvencia úseku základnej štruktúry variabilnej oblasti ťažkého ľudského reťazca substituovaná v aspoň jednej polohe, vybranej z druhej skupiny tvorenej Hl, H2, H71 a H73 aminokyselinou prítomnou v ekvivalentnej polohe sekvencie úseku základnej štruktúry variabilnej oblasti ťažkého reťazca myšieho PB1.3. V niektorých humanizovaných imunoglobulínoch je úsekom základnej štruktúry variabilnej oblasti humanizovaného ťažkého reťazca sekvencia úseku základnej štruktúry variabilnej oblasti ťažkého reťazca 21/28'CL. V niektorých humanizovaných imunoglobulínoch je úsekom základnej štruktúry variabilnej oblasti humanizovaného ľahkého reťazca sekvencia úseku základnej štruktúry variabilnej oblasti ľahkého reťazca DEN. Príklady aminokyselinových sekvencií variabilnej oblasti maturovaného ľahkého reťazca sú znázornené na obr. 14 až 17. Príklady aminokyselinových sekvencií variabilnej oblasti maturovaného ťažkého reťazca sú znázornené na obr. ll až 13. výhodný humanizovaný imunoglobulín zahrnuje variabilnú oblasť maturovaného ľahkého reťazca, znázornenú na obr. 17, a variabilnú oblasť maturovaného ťažkého reťazca, znázornenú na obr. 12.In many humanized immunoglobulins, the light chain variable region framework sequence is substituted at at least one position selected from the first group consisting of L21, L46, L60, and L70 amino acid present at the equivalent position of the mouse immunoglobulin light chain framework region variable region PB1.3 . Similarly, the heavy chain variable region framework sequence is substituted at at least one position selected from the second group consisting of H1, H2, H71 and H73 amino acid present at the equivalent sequence of the murine PB1.3 heavy chain variable region framework sequence. In some humanized immunoglobulins, the humanized heavy chain variable region framework region is the 21 / 28'CL heavy chain variable region framework sequence. In some humanized immunoglobulins, the humanized light chain variable region framework region is a DEN light chain variable region framework region sequence. Examples of mature light chain variable region amino acid sequences are shown in FIG. 14-17. Examples of mature heavy chain variable region amino acid sequences are shown in FIGS. 11-13. a preferred humanized immunoglobulin comprises the mature light chain variable region shown in FIGS. 17, and the mature heavy chain variable region shown in FIG. 12th

Vynález poskytuje intaktné humanizované imunoglobulíny a fragmenty humanizovaných imunoglobulínov, ako je Fab, Fab' F(ab')₂, Fabc a Fv. Niektoré humanizované imunoglobulíny dalej zahrnujú konštantnú oblasť, ktorá môže alebo nemusí mať efektorovú funkciu.The invention provides intact humanized immunoglobulins and fragments of humanized immunoglobulins such as Fab, Fab 'F (ab') ₂ , Fabc and Fv. Some humanized immunoglobulins further include a constant region that may or may not have effector function.

V ďalšom aspekte sú predmetom vynálezu nukleové kyseliny, kódujúce humanizované imunoglobulíny. Niektoré nukleové kyseliny kódujú ťažké a iné ľahké reťazce.In another aspect, the invention provides nucleic acids encoding humanized immunoglobulins. Some nucleic acids encode heavy and other light chains.

Predmetom vynálezu sú taktiež počítače, programované tak, aby zobrazovali trojrozmerné znázornenie vyššie opísaných imunoglobulínov na monitore alebo tlačiarni.The invention also relates to computers programmed to display a three-dimensional representation of the immunoglobulins described above on a monitor or printer.

Predmetom vynálezu sú ďalej farmaceutické prípravky, zahrnujúce vyššie opísané humanizované imunoglobulíny a farmaceutický prijateľný nosič.The invention further provides pharmaceutical compositions comprising the humanized immunoglobulins described above and a pharmaceutically acceptable carrier.

V ďalšom aspekte sú predmetom vynálezu spôsoby detekcieIn another aspect, the invention provides methods of detection

P-selektínu s použitím vyššie opísaných humanizovaných imunoglobulínov. Humanizovaný imunoglobulín sa aplikuje pacientovi alebo na vzorke jeho tkaniva. Detegujú sa komplexy, vznikajúce špecifickou väzbou medzi imunoglobulínom a P-selektínom, prítomným v cielovej vzorke, ktoré indikujú prítomnosť P-selektínu.P-selectin using the humanized immunoglobulins described above. The humanized immunoglobulin is administered to a patient or to a tissue sample thereof. Complexes resulting from specific binding between the immunoglobulin and the P-selectin present in the target sample are detected to indicate the presence of the P-selectin.

Predmetom vynálezu sú taktiež spôsoby liečenia pacienta trpiaceho ochorením imunitného systému s použitím humanizovaných imunoglobulínov. Tieto spôsoby zahrnujú podávanie terapeuticky účinnej dávky vyššie opísaného farmaceutického prípravku pacientovi. Ochorenia, na ktoré je táto liečba použiteľná, zahrnujú akútne poškodenia plúc a ischemické reperfúzne poškodenia. Prípravky sú použiteľné napríklad na liečbu pacientov trpiacich epidermálnou, myokardiálnou, renálnou, cerebrálnou, splenickou, hepatickou, spinálnou, splanchnickou, pulmonárnou ischémiou a ischémiou celého tela alebo jeho častí.The invention also provides methods of treating a patient suffering from an immune system disease using humanized immunoglobulins. The methods include administering to the patient a therapeutically effective dose of the above-described pharmaceutical composition. Diseases to which this treatment is applicable include acute lung injury and ischemic reperfusion injury. The compositions are useful, for example, for the treatment of patients suffering from epidermal, myocardial, renal, cerebral, splenic, hepatic, spinal, splanchnic, pulmonary ischemia and ischemia of the whole body or parts of it.

V ďalšom aspekte sú predmetom vynálezu stabilné bunkové línie produkujúce humanizované imunoglobulíny. Stabilné bunkové línie zahrnujú dva segmenty nukleových kyselín. Jeden segment nukleovej kyseliny kóduje ťažký reťazec vyššie uvedeného humanizovaného imunoglobulínu a je operatívne viazaný k promótoru na umožnenie expresie ťažkého reťazca. Druhý segment nukleovej kyseliny kóduje ľahký reťazec humanizovaného imunoglobulínu a je operatívne viazaný k druhému promótoru na umožnenie expresie ľahkého reťazca. Výhodné bunkové línie produkujú asi 30 μg humanizovaného imunoglobulínu/ΊΟ^ buniek/deň.In another aspect, the invention provides stable cell lines producing humanized immunoglobulins. Stable cell lines include two nucleic acid segments. One nucleic acid segment encodes the heavy chain of the aforementioned humanized immunoglobulin and is operably linked to a promoter to allow expression of the heavy chain. The second nucleic acid segment encodes a humanized immunoglobulin light chain and is operably linked to a second promoter to allow expression of the light chain. Preferred cell lines produce about 30 µg of humanized immunoglobulin / buniek cells / day.

V ďalšom aspekte sú predmetom vynálezu fragmenty P-selektínu. Tieto fragmenty majú až 100 aminokyselín, ktoré zahrnujú aspoň päť navzájom susediacich aminokyselín zo segmentu medzi polohami 448 a 467 sekvencie aminokyselín, znázornenej na obr. 34. Vo výhodných fragmentoch týchto až 100 aminokyselín zahrnuje celý súvislý segment aminokyselín medzi polohami 448 a 467.In another aspect, the invention provides P-selectin fragments. These fragments have up to 100 amino acids that include at least five adjacent amino acids from the segment between positions 448 and 467 of the amino acid sequence shown in FIG. 34. In preferred fragments, these up to 100 amino acids comprise the entire contiguous segment of amino acids between positions 448 and 467.

Prehíad obrázkov na výkresochOverview of the drawings

Obr. 1 znázorňuje údaje, z ktorých vyplýva, že protizápalové imunoglobulíny podlá vynálezu inhibujú väzbu trombínom aktivovaných doštičiek na neutrofily.Fig. 1 shows data suggesting that the anti-inflammatory immunoglobulins of the invention inhibit the binding of thrombin-activated platelets to neutrophils.

Obr. 2A a 2B ukazujú, že protizápalové imunoglobulíny podlá vynálezu účinne zabraňujú poškodeniu plúc vyvolanému infúziou faktoru kobrieho jedu (CVF), merané prostredníctvom permeability (obr. 2A), resp. hemoragie (obr. 2B).Fig. Figures 2A and 2B show that the anti-inflammatory immunoglobulins of the invention effectively prevent lung damage induced by cobra venom factor (CVF) infusion, as measured by permeability (Fig. 2A), respectively. hemorrhage (Fig. 2B).

Obr. 3A až 3H ukazujú, že obsah expresie P-selektínu v plúcach živočíchov je doregulovávaný v odpovedi na infúziu kobrieho jedu, vizualizované farbením mu MAb PB1.3 chrenovou peroxidázou; panely (a) až (d) zobrazujú expresiu P-selektínu v plúcnych žilkách v rôznych dobách po infúzii CVF; (a) doba 0, (b) 5 min, (c) 10 min a (d) 15 min (obr. 3A až 30). Obr. 3E až 3H sú svetelné a priepustnostné fotografie z elektrónového mikroskopu v prípade akútneho poškodenia plúc, vyvolaného CVF u krýs, ošetrených 200 g neblokujúcej protilátky (mu MAb PNB1.6) (rámce a, c) alebo blokujúcej protilátky (mu MAb PB1.3) proti P-selektínu (rámce b, d). U zvierat ošetrených PNB1.6 bolo vaskulárne poškodenie indikované intenzívnou intraalveolárnou hemoragiou (rámec a), spojovanou s intravaskulárnymi agregátmi alebo neutrofilmi (rámec c, šípky) v ostrom protiklade s endoteliáInými bunkami. Naproti tomu u zvierat ošetrených mu MAb PB1.3 k intraalveolárnej hemoragii nedošlo (rámec b) a intravaskuláme neutrofily vykázali málo kontaktov s endotelom (rámec d, šípky). Rámce a a b: sekcie zaliate v plaste farbené toluidínovou modrou, X160, rámce c a d: farbené uránylacetátom, citrátom olovnatým, X2250.Fig. Figures 3A to 3H show that the expression level of P-selectin in the lungs of animals is regulated in response to cobra venom infusion, visualized by staining mu MAb PB1.3 with horseradish peroxidase; panels (a) to (d) show P-selectin expression in the pulmonary veins at various times after CVF infusion; (a) time 0, (b) 5 min, (c) 10 min, and (d) 15 min (Figs. 3A to 30). Fig. 3E to 3H are electron microscopic light and transmission photographs in the case of acute lung injury induced by CVF in rats treated with 200 g of non-blocking antibody (mu MAb PNB1.6) (frames a, c) or blocking antibody (mu MAb PB1.3) against P-selectin (frames b, d). In animals treated with PNB1.6, vascular injury was indicated by intense intraalveolar haemorrhage (frame a) associated with intravascular aggregates or neutrophils (frame c, arrows) in sharp contrast to endothelial cells. In contrast, animals treated with MAb PB1.3 had no intraalveolar haemorrhage (frame b) and showed little contact with the endothelium by intravascular neutrophils (frame d, arrows). Frames a and b: sections embedded in tastes stained with toluidine blue, X160, frames c and d: stained with uranyl acetate, lead citrate, X2250.

Obr. 4 znázorňuje väzbu monoklonálnej protilátky mu MAb PB1.3 na P-selektín: účinok chelatačných dvojväzbových katiónov s EDTA. Prázdne symboly v grafe (spodná čiara) znázorňujú väzbu v prítomnosti Ca²⁺ a Mg²⁺ a plné symboly (horná čiara) väzbu v prítomnosti EDTA. Protilátka bola riedená pri 1,6 mg/ml ako je uvedené.Fig. 4 shows the binding of the monoclonal antibody mu MAb PB1.3 to P-selectin: the effect of chelating divalent cations with EDTA. The empty symbols in the graph (lower line) show the binding in the presence of Ca ²⁺ and Mg ²⁺ and the solid symbols (upper line) the binding in the presence of EDTA. The antibody was diluted at 1.6 mg / ml as indicated.

Obr. 5 znázorňuje vplyv peptidu CQNRYTDLVAIQNKNE na väzbu mu MAb PB1.3 k P-selektínu. Plné symboly zodpovedajú prítomnosti 0,35 mg/ml peptidu, prázdne symboly absencii peptidov. Uvedené riedenie sa uskutočňovalo z roztoku s 1,6 mg/ml mu MAb PB1.3.Fig. 5 shows the effect of the peptide CQNRYTDLVAIQNKNE on the binding of mu MAb PB1.3 to P-selectin. The filled symbols correspond to the presence of 0.35 mg / ml peptide, the empty symbols indicate the absence of peptides. Said dilution was performed from a solution with 1.6 mg / ml mu MAb PB1.3.

Obr. 6A, 6B a 6C osvetľujú schopnosť monoklonálnych protilátok blokovať väzbu na P-selektín. Blokujúce protilátky boli prítomné v množstve 50 μg/ml. Uvedené riedenie biotinylovaných protilátok sa uskutočňovalo z 1,6 mg/ml mu MAb PB1.3, 0,87 mg/ml mu MAb PNB1.6 a 0,59 mg/ml mu MAb 84/26.Fig. 6A, 6B and 6C illustrate the ability of monoclonal antibodies to block P-selectin binding. Blocking antibodies were present at 50 µg / ml. Said dilution of biotinylated antibodies was performed from 1.6 mg / ml mu MAb PB1.3, 0.87 mg / ml mu MAb PNB1.6 and 0.59 mg / ml mu MAb 84/26.

Obr. 7 ukazuje, že rozsah agregácie doštičiek, vyvolanej trombínom, je ekvivalentný za kontrolných podmienok v neprítomnosti protilátky i v prítomnosti zvyšujúcich sa koncentrácií (1-100 μg/ml) čistenej protilátky mu MAb PB1.3.Fig. 7 shows that the extent of platelet aggregation induced by thrombin is equivalent under control conditions in the absence of antibody and in the presence of increasing concentrations (1-100 µg / ml) of purified mu MAb PB1.3 antibody.

Obr. 8 ukazuje, že rozsah myokardiálnej ischémie, vyjadrený ako percento rizikovej oblasti, je významne nižší u zvierat ošetrených blokujúcou protilátkou proti P-selektínu (mu MAb PB1.3) než u zvierat ošetrených neblokujúcou protilátkou k P-selektínu. Taktiež schopnosť relaxácie krúžkov z koronárnych tepien v odpovedi na acetylcholín je významne väčšia u zvierat ošetrených mu MAb PB1.3 v porovnaní s mu MAb PNB1.6. To, že je možné tieto javy prisúdiť zníženiu myokardiálnej infiltrácie leukocytov, ukazuje znížený počet PMN v myokardiálnom tkanive zo zvierat ošetrených mu MAb PB1.3 v porovnaní s PNB1.6.Fig. 8 shows that the extent of myocardial ischemia, expressed as a percentage of the risk area, is significantly lower in animals treated with a blocking anti-P-selectin antibody (mu MAb PB1.3) than in animals treated with a non-blocking antibody to P-selectin. Also, the ability to relax rings from coronary arteries in response to acetylcholine is significantly greater in animals treated with mu MAb PB1.3 compared to mu MAb PNB1.6. The fact that these phenomena can be attributed to a decrease in myocardial leukocyte infiltration shows a reduced number of PMNs in myocardial tissue from animals treated with mu MAb PB1.3 compared to PNB1.6.

Obr. 9 znázorňuje sekvenciu a transláciu signálneho peptidu a variabilnej oblasti ťažkého reťazca PB1.3.Fig. 9 shows the sequence and translation of the PB1.3 heavy chain signal peptide and variable region.

Obr. 10 znázorňuje sekvenciu a transláciu signálneho peptidu a variabilnej oblasti ľahkého reťazca PB1.3.Fig. 10 shows the sequence and translation of the signal peptide and the light chain variable region of PB1.3.

Obr. 11 znázorňuje sekvenciu a transláciu signálneho peptidu a variabilnej oblasti ťažkého reťazca A CY1748.Fig. 11 depicts the sequence and translation of CY1748 heavy chain A signal peptide and variable region.

Obr. 12 znázorňuje sekvenciu a transláciu signálneho peptidu a variabilnej oblasti ťažkého reťazca B CY1748.Fig. 12 depicts the sequence and translation of the CY1748 heavy chain B signal peptide and variable region.

Obr. 13 znázorňuje sekvenciu a transláciu signálneho peptidu a variabilnej oblasti ťažkého reťazca C CY1748.Fig. 13 depicts the sequence and translation of the CY1748 heavy chain C signal peptide and variable region.

Obr. 14 znázorňuje sekvenciu a transláciu signálneho peptidu a variabilnej oblasti ľahkého reťazca A CY1748.Fig. 14 depicts the sequence and translation of CY1748 light chain A signal peptide and variable region.

Obr. 15 znázorňuje sekvenciu a transláciu signálneho peptidu a variabilnej oblasti ľahkého reťazca B CY1748.Fig. 15 depicts the sequence and translation of the CY1748 light chain B signal peptide and variable region.

Obr. 16 znázorňuje sekvenciu a transláciu signálneho peptidu a variabilnej oblasti ľahkého reťazca C CY1748.Fig. 16 depicts the sequence and translation of the CY1748 light chain C signal peptide and variable region.

Obr. 17 znázorňuje sekvenciu a transláciu signálneho peptidu a variabilnej oblasti ľahkého reťazca D CY1748.Fig. 17 depicts the sequence and translation of the CY1748 light chain D signal peptide and variable region.

Obr. 18 znázorňuje fyzikálnu mapu neo-plazmidu exprimujúceho ľudský ťažký reťazec (konštantná oblasť t-1).Fig. 18 depicts a physical map of a neo-plasmid expressing the human heavy chain (t-1 constant region).

Obr. 19 znázorňuje fyzikálnu mapu neo-plazmidu exprimujúceho ľudský ľahký reťazec (konštantná oblasť s).Fig. 19 depicts a physical map of a neo-plasmid expressing a human light chain (s constant region).

Obr. 20 znázorňuje väzbové krivky chimérickej PB1.3 a pretvorené verzie CY1748 k rsP-selektinu.Fig. 20 shows the binding curves of chimeric PB1.3 and reshaped versions of CY1748 to rsP-selectin.

Obr. 21 znázorňuje väzbové krivky chimérickej PB1.3 a pretvorené verzie CY1748 k rsP-selektínu.Fig. 21 shows binding curves of chimeric PB1.3 and reshaped versions of CY1748 to rsP-selectin.

Obr. 22 znázorňuje väzbové krivky chimérickej PB1.3 a pretvorené verzie CY1748 k rsP-selektínu.Fig. 22 depicts the binding curves of chimeric PB1.3 and reshaped versions of CY1748 to rsP-selectin.

Obr. 23 znázorňuje fyzikálnu mapu dhfr-plazmidu exprimujúceho ľudský ťažký reťazec (konštantná oblasť t-1).Fig. 23 shows a physical map of a dhfr plasmid expressing the human heavy chain (t-1 constant region).

Obr. 24 znázorňuje fyzikálnu mapu dhfr-plazmidu exprimujúceho ľudský ťažký reťazec (konštantná oblasť t-4).Fig. 24 depicts a physical map of a dhfr plasmid expressing the human heavy chain (t-4 constant region).

Obr. 25 znázorňuje inhibíciu väzby biotinylovanej PB1.3 na rsP-selektín pôsobením PB1.3 a CY1748 RH_Ä/RL_Ä-IgGl.Fig. 25 shows the inhibition of biotinylated PB1.3 binding to rsP-selectin by PB1.3 and CY1748 RH _Ä / RL _Ä -IgG1.

Obr. 26 znázorňuje inhibíciu väzby biotinylovanej PB1.3 na rsP-selektín pôsobením PB1.3 a CY1748 RH_B/RL_D-IgG4.Fig. 26 shows inhibition of biotinylated PB1.3 binding to rsP-selectin by PB1.3 and CY1748 RH _B / RL _D -IgG4.

Obr. 27 ukazuje, že protilátka PB1.3 znižuje opuch králičieho ucha, spojený s ischémiou a reperfúziou.Fig. 27 shows that PB1.3 reduces rabbit ear swelling associated with ischemia and reperfusion.

Obr. 28 ukazuje, že protilátka PB1.3 bráni vývinu nekrózy po ischémii a reperfúzii králičieho ucha.Fig. 28 shows that PB1.3 prevents the development of necrosis following ischemia and reperfusion of rabbit ear.

Obr. 29 ukazuje, že protilátka PB1.3 inhibuje interakcie leukocyt-endoteliálna bunka, vyvolané degranulačným prostriedkom žírnych buniek zlúčeninou 48/80.Fig. 29 shows that PB1.3 inhibits leukocyte-endothelial cell interactions induced by mast cell degranulation compound 48/80.

Obr. 30 znázorňuje navrhovanú zvinovaciu schému domén P-selektínu.Fig. 30 depicts a proposed rolling scheme of P-selectin domains.

Obr. 31 predstavuje schematické znázornenie delečných mutantov P-selektínu, použitých na mapovanie epitopu, ktorý PB1.3 rozpoznáva.Fig. 31 is a schematic representation of deletion mutants of P-selectin used to map the epitope that PB1.3 recognizes.

Obr. 32 znázorňuje väzbu PB1.3 a králičích polyklonálnych protilátok na delečné mutanty P-selektínu.Fig. 32 shows the binding of PB1.3 and rabbit polyclonal antibodies to deletion mutants of P-selectin.

Obr. 33 znázorňuje väzbu PB1.3 a P6H6 na P-selektín a na P-selektín 5CRP, čo je delečný mutant P-selektínu, ktorému chýba piaty CRP.Fig. 33 shows the binding of PB1.3 and P6H6 to P-selectin and to P-selectin 5CRP, which is a deletion mutant of P-selectin lacking the fifth CRP.

Obr. 34 znázorňuje sekvencie syntetických peptidov, odvodených od aminokyselinovej sekvencie 5. CRP ľudského P-selektínu a reaktivitu PB1.3 voči týmto imobilizovaným peptidom. Aminokyseliny sú číslované v súlade s konvenciou Johnstona a ď., Celí 56:1033-1044 (1989) pre plnú dĺžku polypeptidu P-selektínu.Fig. 34 shows the synthetic peptide sequences derived from amino acid sequence 5. of human P-selectin CRP and the reactivity of PB1.3 to these immobilized peptides. Amino acids are numbered according to the convention of Johnston et al., Cell 56: 1033-1044 (1989) for the full-length P-selectin polypeptide.

Skratky pre dvadsať prirodzene sa vyskytujúcich aminokyselín sa riadia konvenčným použitím (Immunology - A Synthesis (2. vyd., ed. E.S. Golub & O.R. Gren, Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1991)). Stereoizoméry (napríklad D-aminokyseliny) dvadsiatich konvenčných aminokyselín, neprírodné aminokyseliny, ako sú α,α-disubstituované aminokyseliny, N-alkylaminokyseliny, mliečna kyselina a ďalšie nekonvenčné aminokyseliny môžu taktiež byť vhodnými zložkami polypeptidov podía vynálezu. Príklady nekonvenčných aminokyselín zahrnujú 4-hydroxyprolín, τ-karboxyglutamát, e-N,N,N-trimetyl lyzín, e-N-acetyllyzín, O-fosfoserín, N-acetylserín, N-formylmetionín, 3-metylhistidín, 5-hydroxylyzín, -N-metylarginín a ďalšie podobné aminokyseliny a iminokyseliny (napríklad 4-hydroxyprolín). Aminokyseliny môžu byť okrem toho modifikované glykozyláciou, fosforyláciou a podobne.Abbreviations for the twenty naturally occurring amino acids are guided by conventional use (Immunology - A Synthesis (2nd ed., Eds. E.S. Golub & O.R. Gren, Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1991)). Stereoisomers (e.g., D-amino acids) of twenty conventional amino acids, non-natural amino acids such as α, α-disubstituted amino acids, N-alkylamino acids, lactic acid, and other unconventional amino acids may also be suitable components of the polypeptides of the invention. Examples of unconventional amino acids include 4-hydroxyproline, τ-carboxyglutamate, eN, N, N-trimethyl lysine, eN-acetyllysine, O-phosphoserine, N-acetylserine, N-formylmethionine, 3-methylhistidine, 5-hydroxylysine, -N-methylarginine and other similar amino acids and imino acids (e.g. 4-hydroxyproline). In addition, the amino acids may be modified by glycosylation, phosphorylation, and the like.

Peptidy sú tu v súlade so štandardným používaním a konvenciou uvádzané tak, že smer doíava je smer k aminoterminálnemu koncu a smer doprava je smer ku karboxytermináInému koncu. Podobne, ak nie je uvedené ináč, íavý koniec jednoreťazcových polynukleotidových sekvencií je 5'-koniec; na íavý smer dvojreťazcových polynukleotidových sekvencií sa odkazuje ako na 5'-smer. Na smer adície nascentných transkriptov RNA 5' k 3' sa odkazuje ako na smer transkripcie; oblasti sekvencií v reťazci DNA, majúce rovnakú sekvenciu ako RNA, ktoré sú 5' k 5'-koncu transkriptu RNA, sa označujú ako sekvencie proti smeru expresie; oblasti sekvencií v reťazci DNA, majúce rovnakú sekvenciu ako RNA, ktoré sú 3' k 3'-koncu transkriptu RNA, sa označujú ako sekvencie po smere expresie.Peptides are referred to herein in accordance with standard usage and convention such that the left-hand direction is towards the amino terminal end and the right-hand direction is towards the carboxyterminal end. Similarly, unless otherwise indicated, the left-hand end of single-stranded polynucleotide sequences is the 5'-end; the left-hand direction of double-stranded polynucleotide sequences is referred to as the 5'-direction. The direction of addition of nascent RNA 5 'to 3' transcripts is referred to as the transcription direction; sequence regions in the DNA strand having the same sequence as RNA that are 5 'to the 5' end of the RNA transcript are referred to as upstream sequences; regions of sequences in the DNA strand having the same sequence as RNA that are 3 'to the 3' end of the RNA transcript are referred to as downstream sequences.

Výraz polynukleotidová sekvencia sa vzťahuje na jednoreťazcový alebo dvojreťazcový polymér deoxyribonukleotidových alebo ribonukleotidových báz, čítaný od 5'-konca ku 3'-koncu. Zahrnuje autoreplikujúce plazmidy, infekčné polyméry DNA alebo RNA a nefunkčné DNA alebo RNA.The term polynucleotide sequence refers to a single- or double-stranded polymer of deoxyribonucleotide or ribonucleotide bases, read from the 5'-end to the 3'-end. Includes self-replicating plasmids, infectious DNA or RNA polymers, and non-functional DNA or RNA.

K opisu sekvenčných vzťahov medzi dvoma alebo viac polynukleotidmi sa používajú tieto termíny: referenčná sekvencia, porovnávacie okno, sekvenčná identita, percento sekvenčnej identity a podstatná identita. Referenčná sekvencia'' je definovaná sekvencia, používaná ako základ pre porovnávanie sekvencií; referenčná sekvencia môže byt podjednotkou väčšej sekvencie, napríklad ako segment plnej dĺžky cDNA alebo sekvencie génu uvedenej v zozname sekvencií, napríklad ako je polynukleotidová sekvencia na obr. 9 až 17, alebo môže zahrnovať kompletnú sekvenciu DNA alebo génu. Všeobecne má referenčná sekvencia dĺžku aspoň 20 nukleotidov, obvykle aspoň 25 nukleotidov a často aspoň 50 nukleotidov. Pretože v prípade dvoch polynukleotidov môže každý (1) zahrnovať sekvenciu (t.j. čast kompletnej polynukleotidovej sekvencie), ktorá je medzi oboma polynukleotidmi podobná a (2) môže dalej zahrnovať sekvenciu, ktorá sa medzi oboma polynukleotidmi líši, uskutočňujú sa porovnania sekvencie medzi dvoma (alebo viac) polynukleotidmi najčastejšie porovnaním sekvencií oboch nukleotidov cez porovnávacie okno, aby bolo možné identifikovať a porovnať miestne oblasti sekvenčnej podobnosti. Tu používaný termín porovnávacie okno sa vzťahuje na konceptuálny segment aspoň 20 susediacich nukleotidových polôh, kde polynukleotidová sekvencia môže byť porovnávaná s referenčnou sekvenciou s aspoň 20 susediacimi nukleotidmi a kde časť polynukleotidovej sekvencie v porovnávacom okne môže zahrnovať adície alebo delécie (t.j. medzery) v rozsahu 20 % alebo menej voči referenčnej sekvencii (ktorá neobsahuje adície alebo delécie) pre optimálne priradenie oboch sekvencií. Optimálne priradenie sekvencií pre priradenie porovnávacieho okna je možné uskutočniť pomocou algoritmu lokálnej homológie podlá Smitha & Watermana, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), algoritmu porovnávaní homológie podlá Needlemana & Wunscha, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), metódou hladania podobnosti podlá Pearsona & Lipmana, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988) (ktoré materiály sú tu pre všetky účely zahrnuté vo svojom celku formou odkazu, pomocou komputerizovaných aplikácií týchto algoritmov (GAP, BESTFIT, FASTA a TFASTA vo Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) alebo inšpekciou, načo sa vyberie najlepšia zhoda (t.j. vedúca k najvyššiemu percentu podobnosti sekvencií v porovnávacom okne), získaná rôznymi metódami. Výraz sekvenčná identita znamená, že dve polynukleotidové sekvencie sú v porovnávacom okne identické (tj. nukleotid po nukleotide). Percento sekvenčnej identity sa vypočíta z porovnania dvoch optimálne priradených sekvencií pomocou porovnávacieho okna, pričom sa stanoví počet polôh, v ktorých sa v oboch sekvenciách vyskytuje identická nukleová báza (napríklad A, T, C, G, U alebo I), čím sa získa počet súhlasiacich polôh, ktorý sa potom vydelí celkovým počtom polôh v porovnávacom okne (tj. velkosťou okna) a výsledok sa násobí 100 a poskytne percento identity sekvencií. Výraz podstatná identita, ako je tu používaný, označuje charakteristiku polynukleotidovej sekvencie, keď polynukleotid zahrnuje sekvenciu, ktorá má sekvenčnú identitu aspoň 85 %, prednostne aspoň 90 až 95 %, obvyklejšie aspoň 99 % v porovnaní s referenčnou sekvenciou v porovnávacom okne s aspoň 20 polohami nukleotidov, obvykle s aspoň 25 až 50 nukleotidmi, pričom percento sekvenčnej identity sa vypočíta z porovnania referenčnej sekvencie s polynukleotidovou sekvenciou, ktorá môže zahrnovať delécie alebo adície, ktoré celkove činia 20 % alebo menej referenčnej sekvencie v porovnávacom okne. Referenčná sekvencia môže byť podúsekom väčšej sekvencie, napríklad sekvencie znázornenej na obr. 10 až 17.The following terms are used to describe the sequence relationships between two or more polynucleotides: reference sequence, comparison window, sequence identity, percent sequence identity, and substantial identity. A reference sequence '' is a defined sequence used as a basis for sequence comparison; the reference sequence may be a subunit of a larger sequence, for example, as a full-length segment of a cDNA, or a sequence of a gene listed in the sequence, for example, such as the polynucleotide sequence of FIG. 9 to 17, or may comprise a complete DNA or gene sequence. Generally, the reference sequence is at least 20 nucleotides in length, usually at least 25 nucleotides, and often at least 50 nucleotides. Since, in the case of two polynucleotides, each (1) may comprise a sequence (ie a portion of the complete polynucleotide sequence) that is similar between the two polynucleotides, and (2) may further comprise a sequence that differs between the two polynucleotides, more) polynucleotides most often by comparing the sequences of both nucleotides through a comparison window to identify and compare local regions of sequence similarity. As used herein, the term comparison window refers to a conceptual segment of at least 20 contiguous nucleotide positions, wherein the polynucleotide sequence can be compared to a reference sequence of at least 20 contiguous nucleotides, and wherein a portion of the polynucleotide sequence in the comparison window can include additions or deletions (i.e., gaps). % or less relative to a reference sequence (which does not include additions or deletions) for optimal alignment of both sequences. Optimal alignment of sequences for alignment of the comparison window can be performed using the local homology algorithm of Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), the homology comparison algorithm of Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), by the search for similarity method of Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444 (1988) (which materials are incorporated herein by reference in their entirety) using computerized applications of these algorithms (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575). Science Dr., Madison, WI) or by inspecting for the best match (i.e., leading to the highest percent sequence similarity in the comparison window) obtained by different methods, the term sequence identity means that the two polynucleotide sequences are identical in the comparison window (i.e. The percent sequence identity is calculated by comparing the two optimally aligned sequences using a comparison window to determine the number of positions at which an identical nucleobase is present in both sequences (e.g., A, T, C, G, U, or I) to obtain the number of matching positions, which is then divided by the total number of positions in the comparison window (i.e. (window size), and the result is multiplied by 100 to give a percent sequence identity. The term substantial identity as used herein refers to a polynucleotide sequence characteristic when the polynucleotide comprises a sequence having a sequence identity of at least 85%, preferably at least 90 to 95%, more typically at least 99% compared to a reference sequence in a comparison window with at least 20 positions nucleotides, usually with at least 25 to 50 nucleotides, wherein the percent sequence identity is calculated from a comparison of the reference sequence with a polynucleotide sequence, which may include deletions or additions totaling 20% or less of the reference sequence in the comparison window. The reference sequence may be a subset of a larger sequence, for example the sequence shown in FIG. 10 to 17.

Vo vzťahu k polypeptidom výraz sekvenčná identita znamená, že peptidy zdieľajú v zodpovedajúcich polohách identické aminokyseliny. Výraz sekvenčná podobnosť znamená, že peptidy majú v zodpovedajúcich polohách identické alebo podobné aminokyseliny (t.j. konzervatívna substitúcia). Výraz podstatná identita znamená, že dve peptidové sekvencie, ak sú optimálne priradené, napríklad pomocou programu GAP alebo BESTFIT s použitím implicitných hmotností medzier, zdielajú aspoň 80 % sekvenčnej identity, prednostne aspoň 90 % sekvenčnej identity, obzvlášť aspoň 95 % sekvenčnej identity alebo viac (napríklad 99 % sekvenčnej identity). Prednostne sa polohy zvyškov, ktoré nie sú identické, líšia konzervatívnymi substitúciami aminokyselín. Výraz podstatná podobnosť znamená, že dve peptidové sekvencie zdielajú zodpovedajúce percento sekvenčnej podobnosti.In relation to polypeptides, the term sequence identity means that the peptides share identical amino acids at the corresponding positions. Sequence similarity means that the peptides have identical or similar amino acids at the corresponding positions (i.e., a conservative substitution). Substantial identity means that two peptide sequences, when optimally aligned, for example by GAP or BESTFIT using implicit gap weights, share at least 80% sequence identity, preferably at least 90% sequence identity, in particular at least 95% sequence identity or more ( for example, 99% sequence identity). Preferably, the positions of residues that are not identical differ by conservative amino acid substitutions. Substantial similarity means that two peptide sequences share a corresponding percentage of sequence similarity.

Výraz v podstate čistý znamená, že cieľová entita je prevládajúcou prítomnou entitou (t.j. na molárnej báze je hojnejšia než ktorákoľvek iná jednotlivá entita v zmesi), a podstatne prečistená frakcia je zmes, v ktorej cielová entita činí aspoň asi 50 % (na molárnej báze) všetkých prítomných makromolekulárnych druhov. V podstate čistá zlúčenina obvykle tvorí viac než asi 80 až 90 % všetkých makromolekulárnych druhov prítomných v zmesi. Prednostne sa cielová entita čistí do podstatnej homogenity (bežnými detekčnými metódami v zmesi nemožno detegovať kontaminujúce entity), keď je zmes tvorená v podstate jediným makromolekulárnym druhom.Substantially pure means that the target entity is the predominant entity present (ie, on a molar basis is more abundant than any other single entity in the mixture), and the substantially purified fraction is a mixture in which the target entity is at least about 50% (on a molar basis) of all macromolecular species present. The substantially pure compound typically constitutes more than about 80 to 90% of all macromolecular species present in the composition. Preferably, the target entity is purified to a substantial homogeneity (contaminating entities cannot be detected by conventional detection methods in the composition) when the composition is essentially a single macromolecular species.

Pre účely klasifikácie substitúcie aminokyseliny ako konzervatívnej alebo nekonzervatívnej sa aminokyseliny delia takto: skupina I (hydrofóbny postranný reťazec): norleucín, met, ala, val, leu, ile, skupina II (neutrálny hydrofilný postranný reťazec): cys, ser, thr, skupina III (kyslý postranný reťazec): asp, glu, skupina IV (bázický postranný reťazec): asn, gin, his, lys, arg, skupina V (zvyšky ovplyvňujúce orientáciu reťazca): gly, pr·, skupina VI (aromatický postranný reťazec): trp, tyr, phe. Konzervatívne substitúcie sú zámeny aminokyselín z rovnakej skupiny. Nekonzervatívne substitúcie tvoria zámeny člena jednej z týchto tried za člena inej triedy.For the purposes of classifying amino acid substitution as conservative or non-conservative, amino acids are classified as follows: group I (hydrophobic side chain): norleucine, met, ala, val, leu, ile, group II (neutral hydrophilic side chain): cys, ser, thr, group III (acidic side chain): asp, glu, group IV (basic side chain): asn, gin, his, lys, arg, group V (residues affecting chain orientation): gly, pr ·, group VI (aromatic side chain) : trp, tyr, phe. Conservative substitutions are amino acid substitutions from the same group. Non-conservative substitutions constitute a substitution of a member of one of these classes for a member of another class.

Aminokyseliny z variabilných oblastí matúrovaných ťažkých a ľahkých reťazcov imunoglobulínov sa označujú Hx, resp. Lxx, kde x je číslo označujúce polohu aminokyseliny podľa schémy Kabata a ď., Sequences of Proteins of Immunological interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987) a (1991); ďalej označované ako Kabat a d., zahrnuté vo svojom celku formou odkazu pre všetky účely). Kabat a d. uvádza mnohé aminokyselinové sekvencie pre protilátky z každej podtriedy a najčastejšie sa vyskytujúcu aminokyselinu pre polohu každého zvyšku v tejto podtriede. Používa metódu označovania každej aminokyseliny v uvedenej sekvencii číslom zvyšku, ktorá sa stala v odbore štandardná. Schému Kabata a d. je možné rozšíriť na ďalšie protilátky, nezahrnuté v kompendiu, tak, že sa daná protilátka priradí k protilátke v Kabatovi a d. s konsenzuálnymi sekvenciami. Použitím číslovacieho systému podľa Kabata a ď. je možné ľahko identifikovať aminokyseliny v ekvivalentných polohách v rôznych protilátkach. Napríklad aminokyselina v polohe L50 ľudskej protilátky zaujíma ekvivalentnú polohu ako aminokyselina v polohe L50 myšej protilátky.Amino acids from the variable regions of the mature immunoglobulin heavy and light chains are designated Hx, respectively. Lxx, where x is an amino acid position number according to the scheme of Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987) and (1991); hereinafter referred to as Kabat et al. as a link for all purposes). Kabat et al. lists many amino acid sequences for antibodies from each subclass and the most commonly occurring amino acid for the position of each residue in that subclass. It uses a method of labeling each amino acid in said sequence with a residue number that has become standard in the art. Kabat and d. can be extended to other antibodies not included in the compendium by associating the antibody with an antibody in Kabat; and d. with consensus sequences. Using the Kabat et al. it is possible to readily identify amino acids at equivalent positions in different antibodies. For example, the amino acid at position L50 of a human antibody occupies an equivalent position to the amino acid at position L50 of a mouse antibody.

Výrazy imunoglobulín, protilátka” alebo peptidická protilátka sa vzťahujú na intaktnú protilátku alebo na jej väzbový fragment, ktorý s intaktnou protilátkou súťaží pri špecifickej väzbe na P-selektín.The terms immunoglobulin, antibody, or peptide antibody refer to an intact antibody or binding fragment thereof that competes with the intact antibody for specific binding to P-selectin.

Podstatná inhibícia znamená inhibíciu aspoň asi 50 %, prednostne asi 60 až asi 80 %, a najčastejšie vyššiu než asi 85 % alebo viac (merané v kompetitívnom bioteste in vitro).Substantial inhibition means inhibition of at least about 50%, preferably about 60 to about 80%, and most often greater than about 85% or more (measured in a competitive in vitro bioassay).

Chimérické protilátky sú protilátky, ktorých ľahký a ťažký reťazec bol konštruovaný, najčastejšie genetickým inžinierstvom, z imunoglobulínových génových segmentov, prináležiacich k rôznym druhom. Napríklad je možné spojiť variabilné (V) segmenty génov z myšej monoklonálnej protilátky s ľudskými konštantnými (C) segmentami, ako sú a τ₄· Typická terapeutická chimérická protilátka je teda hybridný proteín, tvorený oblasťou V čiže na antigén sa viažúcou doménou z myšej protilátky a C čiže efektorovou doménou z ľudskej protilátky, i kedf je možné použiť aj iné druhy cicavcov.Chimeric antibodies are antibodies whose light and heavy chains have been constructed, most often by genetic engineering, from immunoglobulin gene segments belonging to different species. For example, it is possible to link variable (V) gene segments from a mouse monoclonal antibody to human constant (C) segments, such as α τ _4. Thus, a typical therapeutic chimeric antibody is a hybrid protein consisting of the V region or antigen-binding domain of a mouse antibody; The C-effector domain of a human antibody, although other mammalian species may be used.

Vynález poskytuje prípravky a spôsoby pre inhibíciu ochorení a stavov imunitného systému, sprostredkovaných P-selektínom. Konkrétne vynález poskytuje imunoglobulíny, ktoré majú schopnosť inhibovať P-selektínom sprostredkovanú adhéziu buniek in vivo.The invention provides compositions and methods for inhibiting P-selectin mediated diseases and conditions of the immune system. In particular, the invention provides immunoglobulins having the ability to inhibit P-selectin-mediated cell adhesion in vivo.

I. Charakteristika imunoglobulínovI. Characteristics of immunoglobulins

A - všeobecneAnd - in general

Je známe, že základná štruktúrna jednotka protilátky zahrnuje tetramér. Každý tetramér je zložený z dvoch identických dvojíc polypeptidových reťazcov, pričom každá dvojica obsahuje jeden ľahký (asi 25 kDa) a jeden ťažký (asi 50 až 70 kDa) reťazec. Aminoterminálna časť každého reťazca zahrnuje variabilnú oblasť s asi 100 až 110 alebo viac aminokyselinami, primárne zodpovednú za rozpoznanie antigénu. Karboxyterminálna časť každého reťazca definuje konštantnú oblasť, primárne zodpovednú za efektorovú funkciu.It is known that the basic structural unit of an antibody comprises a tetramer. Each tetramer is composed of two identical pairs of polypeptide chains, each pair comprising one light (about 25 kDa) and one heavy (about 50 to 70 kDa) chain. The amino terminal portion of each chain comprises a variable region of about 100 to 110 or more amino acids primarily responsible for antigen recognition. The carboxyterminal portion of each chain defines a constant region primarily responsible for effector function.

Ľahké reťazce sa klasifikujú ako buď kappa ae alebo lambda Λ*Light chains are classified as either kappa ae or lambda Λ *

Ťažké reťazce sa klasifikujú ako gama t, mí μ , alfa a, delta S alebo epsilon e a definujú izotyp protilátky ako IgG, IgM, IgA, IgD, resp. IgE. Vo vnútri ľahkého a ťažkého reťazca sú variabilné a konštantné oblasti spojené oblasťou J s asi 12 alebo viac aminokyselinami, pričom ťažký reťazec dalej zahrnuje oblasť D s asi 10 alebo viac aminokyselinami. Všeobecne vid Fundamental Immunology (ed. Paul, W. 2. vyd., Raven Press, N.Y., 1989), kap. 7 (tu zahrnuté ako celok formou odkazu pre všetky účely).Heavy chains are classified as gamma t, mu µ, alpha a, delta S or epsilon e and define the isotype of the antibody as IgG, IgM, IgA, IgD, respectively. IgE. Within the light and heavy chains, the variable and constant regions are joined by an J region of about 12 or more amino acids, the heavy chain further comprising a D region of about 10 or more amino acids. In general, Fundamental Immunology (ed. Paul, W. 2nd ed., Raven Press, N.Y., 1989), Chap. 7 (herein incorporated by reference in its entirety for all purposes).

Variabilné oblasti každej dvojice ľahkého a ťažkého reťazca tvoria väzbové miesto protilátky. Všetky reťazce vykazujú rovnakú všeobecnú štruktúru s relatívne zachovalými úsekmi základnej štruktúry (framework regions, FR), spojenými tromi hypervarlabilnými oblasťami, nazývanými taktiež oblasti určujúce komplementaritu (complementarity determining regions, CDR). CDR z oboch reťazcov každej dvojice sú navzájom priradené pomocou úsekov základnej štruktúry, čo umožňuje väzbu na špecifický epitop. Zbytky CDR a FR sa zobrazujú podľa štandardnej definície sekvencií podľa Kabata a d. Alternatívna štruktúrna definícia bola navrhnutá Chothiom ad., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)? Náture 342:878-883 1989) a J. Mol. Biol. 196:651-663 (1989) (dalej tu kolektívne uvádzané ako Chothia a d. a zahrnuté ako celok formou odkazu pre všetky účely).The variable regions of each light and heavy chain pair form the antibody binding site. All chains have the same general structure, with relatively well-preserved framework regions (FRs), joined by three hypervarlabile regions, also called complementarity determining regions (CDRs). The CDRs from both chains of each pair are aligned with each other by framework regions, allowing binding to a specific epitope. CDR and FR residues are displayed according to the standard definition of Kabat et al. An alternative structural definition has been suggested by Chothio et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987). Nature 342: 878-883 1989) and J. Mol. Biol. 196: 651-663 (1989) (hereinafter collectively referred to as Chothia et al., And incorporated herein by reference in its entirety for all purposes).

B. Väzbová šoecificita a afinitaB. Binding shock and affinity

Imunoglobulíny (alebo protilátky) podľa vynálezu selektívne viažu funkčný epitop na P-selektíne, spojovaný s odpoveďou na poranenie a zápal tkaniva. Väzba protilátok na funkčný epitop na P-selektíne obvykle účinne inhibuje adhéziu leukocytov k aktivovaným doštičkám a/alebo k aktivovanému vaskulárnemu endotelu in vivo. Protilátky vykazujúce túto vlastnosť sa označujú ako blokujúce protilátky. Prednostné blokujúce protilátky zhoršujú adhéziu leukocytov k aktivovanému vaskulárnemu endotelu, a tak zamedzujú alebo inhibujú zápalové alebo trombotické stavy.The immunoglobulins (or antibodies) of the invention selectively bind a functional epitope to P-selectin, associated with a response to tissue injury and inflammation. Binding of antibodies to a functional epitope on P-selectin usually effectively inhibits leukocyte adhesion to activated platelets and / or activated vascular endothelium in vivo. Antibodies exhibiting this property are referred to as blocking antibodies. Preferred blocking antibodies impair leukocyte adhesion to activated vascular endothelium and thus prevent or inhibit inflammatory or thrombotic conditions.

Mnohé blokujúce protilátky podlá vynálezu súťažia pri špecifickej väzbe na P-selektín s príkladnou protilátkou, označenou mu MAb PB1.3. Hybridom, produkujúci protilátku mu MAb PB1.3, bol podlá Budapeštianskej zmluvy uložený v American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod prírastkovým číslom HB11041. Produkcia tejto monoklonálnej protilátky je opísaná v príklade 1. Ďalšie blokujúce protilátky podlá vynálezu súťažia s druhou príkladnou protilátkou, označenou 84/26.Many blocking antibodies of the invention compete for specific binding to P-selectin with an exemplary antibody designated mu MAb PB1.3. The hybridoma producing mu MAb PB1.3 was deposited under the Budapest Treaty with the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, under accession number HB11041. The production of this monoclonal antibody is described in Example 1. Other blocking antibodies of the invention compete with the second exemplary antibody, designated 84/26.

Kompetitívne naväzovanie sa sleduje testom, pri ktorom skúmaný imunoglobulín inhibuje špecifickú väzbu referenčnej protilátky (napríklad mu MAb PB1.3) na antigénnu determinantu na molekule P-selektínu. Sú známe rôzne typy testov kompetitívne j väzby, napríklad priama alebo nepriama rádioimunoanalýza v pevnej fáze (RIA), priama alebo nepriama enzýmová imunoanalýza v pevnej fáze (EIA), sendvičová kompetitívna analýza (vid stahli a d., Methods in Enzynology 9:242-253 (1983)), priama EIA biotín-avidín v pevnej fáze (vid Kirkland ad., J. Innunol. 137:3614-3619 (1966)), priama značená analýza v pevnej fáze, priama značená sendvičová analýza v pevnej fáze (vid Harlow a Lane, Antibodies, A Laboratory Manuál, Cold Spring Harbor Press (1988)), priama značená RIA v pevnej fáze so značením 1-125 (vid Morel a d., Molec. Innunol. 25(1):7-15 (1988)), priama EIA biotín-avidín v pevnej fáze (Cheung a d., Virology 176:546-552 (1990)) a priama značená RIA (Moldenhauer a d., Scand. J. Inununol. 32:77-82 (1990)). V opísaných testoch sa typicky používa čistený P-selektín alebo bunky nesúce P-selektín viazané na pevný povrch, neznačený testovaný imunoglobulín a značený referenčný imunoglobulín. Kompetitívna inhibícia sa meria stanovením množstva značeného materiálu, naviazaného na pevný povrch v prítomnosti testovaného imunoglobulínu. Testovaný imunoglobulín je obvykle prítomný v prebytku. Príklad vhodného testu kompetitívnej väzby je uvedený v príklade 8. Protilátky, identifikované kompetitívnym testom (konkurenčné protilátky), zahrnujú protilátky viažúce sa na rovnaký epitop ako referenčná protilátka a protilátky viažúce sa na priľahlý epitop dostatočne blízky k epitopu, viazanému referenčnou protilátkou, aby mohlo dôjsť ku stérickej zábrane. Ak je konkurenčná protilátka prítomná v prebytku, obvykle inhibuje špecifickú väzbu referenčnej protilátky na P-selektín o aspoň 10, 25, 50 alebo 75 %.Competitive binding is followed by an assay in which the immunoglobulin of interest inhibits specific binding of a reference antibody (e.g., mu MAb PB1.3) to an antigenic determinant on the P-selectin molecule. Various types of competitive binding assays are known, such as direct or indirect solid phase radioimmunoassay (RIA), direct or indirect solid phase enzyme immunoassay (EIA), sandwich competitive analysis (see Download, et al., Methods in Enzynology 9: 242- 253 (1983)), solid phase direct biotin-avidin EIA (see Kirkland et al., J. Innunol. 137: 3614-3619 (1966)), solid phase direct labeled analysis, solid phase direct labeled sandwich analysis (vid. Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)), direct labeled solid phase RIA labeled 1-125 (see Morel et al., Molec. Innunol. 25 (1): 7-15 ( 1988)), direct EIA solid-state biotin-avidin (Cheung et al., Virology 176: 546-552 (1990)) and direct labeled RIA (Moldenhauer et al., Scand. J. Inununol. 32: 77-82 ( 1990)). Typically, purified P-selectin or solid-surface bound P-selectin-bearing cells, unlabeled test immunoglobulin, and a labeled reference immunoglobulin are used in the assays described. Competitive inhibition is measured by determining the amount of labeled material bound to a solid surface in the presence of the test immunoglobulin. The immunoglobulin tested is usually present in excess. An example of a suitable competitive binding assay is given in Example 8. Antibodies identified by a competitive assay (competing antibodies) include antibodies binding to the same epitope as the reference antibody and antibodies binding to an adjacent epitope sufficiently close to the epitope bound by the reference antibody. to steric inhibition. When a competing antibody is present in excess, it usually inhibits the specific binding of the reference antibody to P-selectin by at least 10, 25, 50 or 75%.

Epitop viazaný mu MAb PB1.3 bol mapovaný k epitopu medzi aminokyselinami 448 a 467 ľudského P-selektínu, viď obr. 34 a Johnson a ď., Celí 56:1033-1044 (1989); zahrnuté tu ako celok formou odkazu pre všetky prípady. Epitop sa objavuje v piatej doméne CRP P-selektínu, viď obr. 30. Protilátky, ktoré súťažia s mu MAb PB1.3, sa obvykle viažu na segment aminokyselín medzi polohami 448 a 467 alebo na iný segment vnútri piatej domény CRP.The epitope bound to mu MAb PB1.3 was mapped to the epitope between amino acids 448 and 467 of human P-selectin, see FIG. 34 and Johnson et al., Cell 56: 1033-1044 (1989); are incorporated herein by reference in their entirety. The epitope appears in the fifth CRP domain of P-selectin, see FIG. 30. Antibodies that compete with mu MAb PB1.3 typically bind to an amino acid segment between positions 448 and 467 or to another segment within the fifth CRP domain.

Väzbová špecificita mnohých blokujúcich protilátok podľa vynálezu je ďalej definovaná ich schopnosťou viazať P-selektín v úplnej alebo podstatnej neprítomnosti Ca²⁺ (napríklad v prítomnosti 25 mM EDTA (chelatačný prostriedok pre vápnik) a neprítomnosti Ca²⁺ v teste in vitro). Protilátky, vyžadujúce pre blokovanie aktivity kofaktor Ca²⁺, nemusia byť účinné za podmienok in vivo, ak je očakávaná fluktuácia hladiny Ca²⁺.The binding specificity of many blocking antibodies of the invention is further defined by their ability to bind P-selectin in the complete or substantial absence of Ca ²⁺ (e.g. in the presence of 25 mM EDTA (calcium chelating agent) and absence of Ca ²⁺ in an in vitro assay). Antibodies requiring Ca ²⁺ cofactor to block activity may not be effective under in vivo conditions if fluctuations in Ca ²⁺ levels are expected.

Protilátky, ktoré súťažia s protilátkou mu MAb PB1.3, sú ďalej charakterizované zistením, že ich schopnosť špecificky sa viazať na P-selektín, nie je inhibovaná fragmentom P-selektínu so sekvenciou aminokyselín CQNRYTDLVAIQNKNE. Mo21 lárny prebytok tohoto fragmentu obvykle inhibuje špecifickú väzbu takých protilátok o menej než 5 %. Hu MAb PB1.3 a konkurenčné protilátky sú takto odlíšené od opísaných myších protilátok označených Gl, G2 a G3 (Geng ad., The Journal of Biological Chemistry 266:22313-22318 (1981)), ktorých väzba na P-selektín je vyššie uvedeným peptidom čiastočne alebo celkom blokovaná.Antibodies that compete with mu MAb PB1.3 are further characterized by the finding that their ability to specifically bind to P-selectin is not inhibited by the P-selectin fragment having the amino acid sequence CQNRYTDLVAIQNKNE. The Mo21 molar excess of this fragment usually inhibits the specific binding of such antibodies by less than 5%. Hu MAb PB1.3 and competing antibodies are thus distinguished from the described murine antibodies designated G1, G2 and G3 (Geng et al., The Journal of Biological Chemistry 266: 22313-22318 (1981)), whose binding to P-selectin is as described above. peptide partially or totally blocked.

Niektoré protilátky podľa vynálezu sú dalej charakterizované schopnosťou selektívne inhibovať niektoré P-selektínom sprostredkované odpovede a ostatné ponechať nezhoršené. Napríklad niektoré protilátky sú schopné blokovať špecifickú väzbu neutrofilov na aktivované endoteliálne bunky in vivo bez inhibície agregácie doštičiek. Takéto protilátky sú zvlášť vhodné na liečbu zápalových porúch bez zhoršenia schopnosti pacienta iniciovať odpoveď na stavy (napríklad poranenie), kde je agregácia doštičiek žiadúca.Some of the antibodies of the invention are further characterized by the ability to selectively inhibit some P-selectin-mediated responses and others to remain undeterred. For example, some antibodies are capable of blocking specific binding of neutrophils to activated endothelial cells in vivo without inhibiting platelet aggregation. Such antibodies are particularly useful for treating inflammatory disorders without impairing the patient's ability to initiate a response to conditions (e.g., injury) where platelet aggregation is desirable.

Protilátky podľa vynálezu obvykle vykazujú špecifickú väzbovú afinitu k P-selektínu aspoň 10⁷, 10®, 10⁹ alebo 10¹⁰ M^-1. Horná hranica väzbovej afinity protilátok proti P-selektínu je obvykle v rozmedzí asi troj-, päť- alebo desaťnásobku tejto hodnoty pre mu HAb PB1.3. Spodná hranica väzbovej afinity je taktiež v rozmedzí asi troj-, päť- alebo desaťnásobku tejto hodnoty pre mu MAb PB1.3. Výraz asi v tomto kontexte zahrnuje malý stupeň experimentálnej chyby, ktorá môže typicky nastať pri meraní väzbovej afinity.Antibodies of the invention typically exhibit a specific binding affinity for P-selectin of at least 10 ⁷ , 10 ®, 10 ⁹ or 10 ¹⁰ M ^-1 . The upper limit of binding affinity of anti-P-selectin antibodies is usually in the range of about three, five, or ten times this value for mu HAb PB1.3. The lower limit of binding affinity is also in the range of about three, five, or ten times this value for mu MAb PB1.3. In about this context, the term includes a small degree of experimental error that can typically occur when measuring binding affinity.

II. Výroba imunocrlobulínovII. Production of immunocrlobulins

A. Protilátkv iné než ľudskéA. Non-human antibodies

Výroba iných než ľudských monoklonáIných protilátok, napríklad myších, lagomorfa, konských, je známa a je možné ju uskutočňovať napríklad imunizáciou zvieraťa prípravkom obsahujúcim bunky nesúce P-selektín (napríklad trombínom aktivo22 vané doštičky), izolované molekuly P-selektínu alebo ich fragmenty, ako sú extracelulárne domény. Bunky produkujúce protilátku, získané z imunizovaných zvierat, sa usmrtia a podrobia screeningu alebo najprv sa podrobia screeningu na produkciu protilátky, ktorá sa viaže na P-selektín, a potom sa usmrtia, vidí vyššie Harlow a Lane. Alternatívne je možné produkovať populácie v podstate monošpecifických protilátok chromatografickým čistením polyklonálnych sér.The production of non-human monoclonal antibodies, e.g., murine, lagomorph, equine, is known and can be accomplished, for example, by immunizing an animal with a preparation comprising cells bearing P-selectin (e.g. thrombin-activated platelets), isolated P-selectin molecules or fragments thereof such as extracellular domains. Antibody-producing cells obtained from immunized animals are sacrificed and screened, or first screened for production of an antibody that binds to P-selectin, and then sacrificed, see Harlow and Lane above. Alternatively, populations of substantially monospecific antibodies can be produced by chromatographic purification of polyclonal sera.

B. Ľudské Drot-iiétkv Droti P-selektínuB. Human Drot-Etot P-Selectin Drots

V inom aspekte sú predmetom vynálezu ľudské protilátky proti P-selektínu. Niektoré ľudské protilátky sa vyberajú pomocou testov kompetitívnej väzby alebo iným spôsobom tak, aby mali rovnakú epitopovú špecificitu ako konkrétna myšia protilátka, napríklad mu MAb PB1.3. Takéto protilátky sú zvlášť náchylné ku zdielaniu užitočných terapeutických vlastností, demonštrovaných pre mu MAb PB1.3. Ľudské protilátky proti P-selektínu je možné vyrábať tak, že sa knižnica DNA z ľudských B buniek podrobí screeningu podľa všeobecného protokolu, ktorý navrhol Huse a ď., Science 246:1275-1281 (1989). Vyberú sa protilátky, viažúce sa na P-selektín alebo jeho fragment. Sekvencie kódujúce tieto protilátky (alebo väzbové fragmenty) sa potom klonujú a amplifikujú. Účinnosť Huseovho protokolu je možné zvýšiť v kombinácii s technológiou zobrazovania fágov, viď napríklad Dower a ď., WO 91/17271, a McCafferty a ď., WO 92/01047 (ktoré dokumenty sú tu ako celky zahrnuté formou odkazu pre všetky účely). Pri týchto postupoch sa vyrobia knižnice fágov, v ktorých členovia vykazujú na vonkajších povrchoch rôzne protilátky. Protilátky sa obvykle zobrazujú ako fragmenty Fv alebo Fab. Fágy, zobrazujúce protilátky s požadovanou špecificitou, sa vyberú afinitnýro obohatením na polypeptid P-selektínu alebo jeho fragment.In another aspect, the invention provides human antibodies against P-selectin. Some human antibodies are selected by competitive binding assays or otherwise to have the same epitope specificity as a particular murine antibody, for example mu MAb PB1.3. Such antibodies are particularly susceptible to sharing useful therapeutic properties demonstrated for mu MAb PB1.3. Human anti-P-selectin antibodies can be produced by screening a DNA library from human B cells according to the general protocol proposed by Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989). Antibodies binding to P-selectin or a fragment thereof are selected. The sequences encoding these antibodies (or binding fragments) are then cloned and amplified. The efficiency of the Huse protocol can be increased in combination with phage display technology, see, for example, Dower et al., WO 91/17271, and McCafferty et al., WO 92/01047 (which documents are incorporated herein by reference in their entirety). These methods produce phage libraries in which members display different antibodies on the outer surfaces. Antibodies are usually displayed as Fv or Fab fragments. Phages displaying antibodies of the desired specificity are selected by affinity enrichment for the P-selectin polypeptide or fragment thereof.

Pri obmene postupu zobrazovania fágov je možné vyrábať ľudské protilátky, majúce väzbovú špecificitu zvolenej myšej protilátky, viď Winter, WO 92/20791. Pri tomto postupe sa ako východiskový materiál použije variabilná oblasť buď ťažkého alebo ľahkého reťazca zvolenej myšej protilátky (napríklad mu MAb PB1.3). Ak sa ako východiskový materiál zvolí napríklad variabilná oblasť ľahkého reťazca, konštruuje sa knižnica fágov, ktorej členovia zobrazujú rovnakú variabilnú oblasť ľahkého reťazca (tj. myšieho východiskového materiálu) a odlišnú » variabilnú oblasť ťažkého reťazca. Variabilné oblasti ťažkého reťazca sa získajú z knižnice preskupených variabilných ob¹ lastí ľudského ťažkého reťazca. Vyberie sa fág, vykazujúci silnú špecifickú väzbu na P-selektín (napríklad aspoň 10® a prednostne aspoň 10⁹ M“¹). Variabilná oblasť ľudského ťažkého reťazca z tohoto fága potom slúži ako východiskový materiál pre konštrukciu ďalšej fágovej knižnice. V tejto knižnici každý fág zobrazuje tú istú variabilnú oblasť ťažkého reťazca (tj. oblasť identifikovanú z prvej zobrazovacej knižnice) a odlišnú variabilnú oblasť ľahkého reťazca. Variabilné oblasti ľahkého reťazca sa získajú z knižnice preskupených variabilných oblastí ľudského ľahkého reťazca. Opäť sa vyberú . fágy, vykazujúce silnú špecifickú väzbu na L-selektín. Tieto fágy vykazujú variabilné oblasti kompletne ľudských . anti-P-selektínových protilátok. Tieto protilátky majú obvykle rovnakú alebo podobnú epitopovú špecificitu ako východiskový myší materiál (napríklad mu MAb PB1.3).In a variation of the phage display process, it is possible to produce human antibodies having the binding specificity of the selected murine antibody, see Winter, WO 92/20791. In this procedure, either the heavy or light chain variable region of the selected murine antibody (e.g. mu MAb PB1.3) is used as the starting material. For example, if a light chain variable region is chosen as the starting material, a phage library is constructed whose members display the same light chain variable region (i.e., the murine starting material) and a different heavy chain variable region. Heavy chain variable regions are obtained from a library of rearranged variable taking ^one last-human heavy chain. A phage showing a strong specific binding to P-selectin (for example at least 10 @ 6 and preferably at least 10 ^{@ 9} M ^{@ -1} ) is selected. The human heavy chain variable region from this phage then serves as a starting material for the construction of another phage library. In this library, each phage displays the same heavy chain variable region (i.e., the region identified from the first display library) and a different light chain variable region. The light chain variable regions are obtained from a library of rearranged human light chain variable regions. They are removed again. phages showing strong specific binding to L-selectin. These phages display variable regions of completely human. anti-P-selectin antibodies. These antibodies typically have the same or similar epitope specificity as the starting murine material (e.g. mu MAb PB1.3).

C. Humanizované nrotilátkvC. Humanized nrotilátkv

Vynález poskytuje humanizované imunoglobulíny, majúce úsek základnej štruktúry variabilnej oblasti v podstate z ľudského imunoglobulínu (nazývaného akceptorový imunoglobulín) a oblasti určujúcej komplementaritu v podstate z myšieho imunoglobulínu s označením mu MAb PB1.3 (nazývaného donorový imunoglobulín). Konštantné oblasti, ak sú prítomné, sú taktiež v podstate z ľudského imunoglobulínu. Humanizované protilátky podľa vynálezu ponúkajú niekoľko výhod oproti myšej donorovej protilátke, ktoré už boli preukázané na zvieracích modeloch:The invention provides humanized immunoglobulins having a framework region of a variable region consisting essentially of human immunoglobulin (termed acceptor immunoglobulin) and a complementarity determining region essentially from murine immunoglobulin designated mu MAb PB1.3 (termed donor immunoglobulin). The constant regions, if present, are also essentially human immunoglobulin. The humanized antibodies of the invention offer several advantages over the murine donor antibody already demonstrated in animal models:

1) Ľudský imunitný systém by nemal rozpoznávať úsek základnej štruktúry alebo konštantnú oblasť humanizovanej protilátky ako cudziu, a teda by odpoveď protilátok proti injekcii takejto protilátky mala byť menšia než proti celkom cudzej myšej protilátke alebo čiastočne cudzej chimérickej protilátke.1) The human immune system should not recognize the framework or constant region of a humanized antibody as foreign, and thus the response of antibodies to injection of such an antibody should be less than a totally foreign mouse antibody or a partially foreign chimeric antibody.

» 2) Pretože efektorová časť humanizovanej protilátky je ľudská, môže lepšie interagovať s s ostatnými časťami ľudské« ho imunitného systému.2) Because the effector portion of the humanized antibody is human, it can better interact with other parts of the human immune system.

3) Bolo opísané, že injekčné vpravené myšie protilátky majú v ľudskom obehu polčas oveľa kratší než je polčas normálnych ľudských protilátok (Shaw a ď., «7. Immunol.3) Injection injected mouse antibodies have been reported to have a half-life in human circulation much shorter than that of normal human antibodies (Shaw et al., Immunol.

138:4534-4538 (1987)). Injekčné vpravené humanizované protilátky majú polčas v podstate ekvivalentný prirodzene sa vyskytujúcim ľudským protilátkam, čo umožňuje menšie a menej časté dávky.138: 4534-4538 (1987)). Injectable humanized antibodies have a half-life substantially equivalent to naturally occurring human antibodies, allowing smaller and less frequent doses.

(1) Klónovanie a sekvencovanie variabilných oblastí mu MAb _Λ ΡΒΊ.3(1) Cloning and sequencing of variable regions mu MAb _Λ ΡΒΊ.3

Klónovanie a sekvencovanie cDNA, kódujúcej variabilné oblasti ťažkého a ľahkého reťazca protilátky mu MAb PB1.3, je opísané v príklade 10 a sekvencie nukleotidov a predpokladané sekvencie aminokyselín sú uvedené na obr. 11 a 12. Tabuľky 1 a 2 ilustrujú rozdelenie kódujúcej sekvencie aminokyselín do úsekov základnej štruktúry a domén určujúcich komplementaritu. Od N-terminálneho k C-terminálnemu koncu obsahujú ľahký i ťažký reťazec domény FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Pridelenie aminokyselín do jednotlivých domén je v súlade s konvenciou o číslovaní podľa Kabata a ď., viď vyššie.Cloning and sequencing of the cDNA encoding the heavy and light chain variable regions of mu MAb PB1.3 is described in Example 10 and the nucleotide and putative amino acid sequences are shown in FIG. 11 and 12. Tables 1 and 2 illustrate the division of the coding amino acid sequence into framework regions and complementarity determining domains. From the N-terminal to the C-terminal end, the light and heavy chains contain the domains FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, and FR4. The assignment of amino acids to individual domains is in accordance with the convention of numbering according to Kabat et al., Supra.

(2) Výber ľudských protilátok na získanie zvvškov základnej štruktúry(2) Selection of human antibodies to obtain framework residues

Substitúcia myších CDR do základnej štruktúry ľudskej va25 riabilnej oblasti bude mať velmi pravdepodobne za následok uchovanie ich správnej priestorovej orientácie, ak základná štruktúra ľudskej variabilnej oblasti prijme rovnakú alebo podobnú konformáciu, akú má myšia základná variabilná štruktúra, z ktorej CDR pochádza. Toto sa dosahuje tak, že sa ľudské variabilné oblasti získavajú z ľudských protilátok, ktorých sekvencie základnej štruktúry vykazujú vysoký stupeň sekvenčnej identity so štruktúrou myších variabilných oblastí, od ktorých boli CDR odvodené. Úseky štruktúry variabilných oblastí ťažkého a ľahkého reťazca môžu byť odvodené od rovnakých alebo podobných sekvencií ľudských protilátok. Sekvencie ľudských protilátok môžu byť sekvencie prirodzene sa vyskytujúcich ľudských protilátok alebo môže ísť o súhlasné sekvencie niekoľkých ľudských protilátok, vid Kettleborough a d., Proteín Engineering 4:773 (1991), Kolbinger a d., Protein Engineering 6:971 (1993).Substitution of the murine CDRs into the framework of the human va25 variable region is very likely to result in maintaining their correct spatial orientation if the framework of the human variable region adopts the same or similar conformation to that of the murine variable framework from which the CDR originates. This is accomplished by obtaining human variable regions from human antibodies whose framework sequences exhibit a high degree of sequence identity to the structure of the murine variable regions from which the CDRs were derived. The framework regions of the heavy and light chain variable regions may be derived from the same or similar human antibody sequences. The human antibody sequences may be naturally occurring human antibody sequences, or may be the consensus sequences of several human antibodies, see Kettleborough et al., Protein Engineering 4: 773 (1991), Kolbinger et al., Protein Engineering 6: 971 (1993).

Vhodné sekvencie ľudských protilátok sa identifikujú komputerovým porovnaním sekvencií aminokyselín myších variabilných oblastí so sekvenciami známych ľudských protilátok. Porovnanie sa uskutočňuje oddelene pre ťažký a ľahký reťazec, ale princíp je pre obidva podobný. Týmto porovnaním sa zisťuje, že ľahký reťazec mu MAb PB1.3 vykazuje najväčšiu sekvenčnú identitu s ľudskými ľahkými reťazcami subtypu -l a že ťažký reťazec mu PB1.3 vykazuje najväčšiu sekvenčnú identitu s ľudskými ťažkými reťazcami subtypu 1, definovaného Rabatom ad., vid vyššie. Úseky základnej štruktúry ľahkého a ťažkého ľudského reťazca sa teda obvykle odvodzujú od ľudských protilátok týchto subtypov alebo zo súhlasných sekvencií takýchto subtypov. Prednostné variabilné oblasti ľudského ťažkého a ľahkého reťazca, vykazujúce najväčšiu sekvenčnú identitu so zodpovedajúcimi oblasťami z mu MAb PB1.3, sú z protilátok 21/28'CL, resp. DEN.Suitable human antibody sequences are identified by computer comparison of the amino acid sequences of murine variable regions with those of known human antibodies. The comparison is made separately for the heavy and light chains, but the principle is similar for both. This comparison reveals that the mu MAb PB1.3 light chain has the greatest sequence identity to human subtype-1 light chains and that the mu PB1.3 heavy chain has the greatest sequence identity to human subtype 1 heavy chains, as defined by Rabat et al., Supra. Thus, the framework regions of the light and heavy human chains are usually derived from human antibodies of these subtypes or from consensus sequences of such subtypes. Preferred human heavy and light chain variable regions showing the greatest sequence identity to the corresponding regions from mu MAb PB1.3 are from antibodies 21 / 28'CL, respectively. DAY.

(3) Počítačové modelovanie(3) Computer modeling

Neprirodzené umiestnenie myších oblastí CDR vedia základnej štruktúry ludskej variabilnej oblasti môže mať za následok neprirodzené konformačné obmedzenia, ktoré, pokial sa neopravia substitúciou určitých aminokyselinových zvyškov, vedú ku strate väzbovej afinity. Výber aminokyselinových zvyškov pre substitúciu je čiastočne určovaný počítačovým modelovaním. Počítačový hardware a Software na vytvorenie trojrozmerných obrazov imunoglobulínových molekúl je široko dostupný. Molekulové modely sa všeobecne vytvárajú na základe vyriešených štruktúr imunglobulínových reťazcov a ich domén. Reťazce, ktoré sa majú modelovať, sa porovnávajú z hladiska podobnosti aminokyselinovej sekvencie s reťazcami alebo doménami vyriešených trojrozmerných štruktúr a reťazce alebo domény vykazujúce najväčšiu sekvenčnú podobnosť sa volia ako východiskové body pre konštrukciu molekulárneho modelu. Napríklad v prípade lahkého reťazca mu MAb PB1.3 bol východiskovým bodom pre modelovanie ludský lahký reťazec DEN. Vyriešené východiskové štruktúry sa modifikujú tak, aby umožnili rozdiely medzi skutočnými aminokyselinami v modelovaných reťazcoch alebo doménach imunoglobulínu a aminokyselinami vo východiskovej štruktúre. Modifikované štruktúry sa potom zostavia do zloženého imunoglobulínu. Nakoniec sa model dočisťuje z hladiska minimalizácie energie a overenia, či všetky atómy sú navzájom v správnych vzdialenostiach a či dĺžky väzieb a uhly sú v chemicky prijateľných medziach. Takýto model potom môže slúžiť ako východiskový bod pre predpoveď trojrozmernej štruktúry protilátky obsahujúcej oblasti určujúce komplementaritu mu MAb PB1.3, substituovanej do ludských základných štruktúr. Je možné konštruovať ďalšie modely, reprezentujúce štruktúru pri zavedení ďalej opísaných ďalších substitúcií aminokyselín.The unnatural placement of murine CDRs outside the framework of the human variable region may result in unnatural conformational constraints which, unless corrected by substitution of certain amino acid residues, result in loss of binding affinity. The choice of amino acid residues for substitution is partially determined by computer modeling. Computer hardware and software for generating three-dimensional images of immunoglobulin molecules are widely available. Molecular models are generally generated based on solved structures of the imunglobulin chains and their domains. The chains to be modeled are compared for amino acid sequence similarity to the chains or domains of the resolved three-dimensional structures, and the chains or domains showing the greatest sequence similarity are chosen as starting points for the construction of the molecular model. For example, in the light chain, mu MAb PB1.3 was the starting point for modeling the human light chain DEN. The resolved starting structures are modified to allow differences between the actual amino acids in the modeled immunoglobulin chains or domains and the amino acids in the starting structure. The modified structures are then assembled into a folded immunoglobulin. Finally, the model is refined from the point of view of minimizing energy and verifying that all atoms are at the correct distances to each other and that bond lengths and angles are within chemically acceptable limits. Such a model can then serve as a starting point for predicting the three-dimensional structure of the antibody containing the complementarity determining regions of mu MAb PB1.3, substituted into human frameworks. It is possible to construct other models representing the structure in the introduction of the further amino acid substitutions described below.

íaI Substitúcia aminokvselinovvch zvvškovSubstitution of amino acid residues

Ako je vyššie uvedené, humanizované protilátky podlá vynálezu zahrnujú základnú štruktúru variabilných oblastí v podstate z ludského imunoglobulínu a oblasti určujúcej komplementaritu v podstate z myšieho imunoglobulínu s označením mu MAb PB1.3. Po identifikácii oblastí určujúcich komplementaritu mu MAb PB1.3 a príslušných ľudských akceptorových imunoglobulínov je ďalším krokom určenie, či a ktoré zvyšky z týchto komponentov majú byť substituované pre optimalizáciu vlastností získanej humanizovanéj protilátky. Substitúcia ľudských aminokyselinových zvyškov myšími by všeobecne mala byť minimalizovaná, pretože zavedenie myších zvyškov zvyšuje riziko, že protilátka vyvolá u človeka odpoveď HAMA. Aminokyseliny pre substitúciu sa volia na základe ich možného vplyvu na konformáciu CDR a/alebo väzbu k antigénu. Vyšetrovanie týchto možných vplyvov sa uskutočňuje modelovaním, skúmaním charakteristík aminokyselín v jednotlivých polohách alebo empirickým pozorovaním účinkov substitúcie alebo mutagenézy jednotlivých aminokyselín.As mentioned above, the humanized antibodies of the invention comprise a framework of variable regions consisting essentially of human immunoglobulin and complementarity determining regions consisting essentially of a murine immunoglobulin designated mu MAb PB1.3. After identifying the complementarity determining regions of mu MAb PB1.3 and the corresponding human acceptor immunoglobulins, the next step is to determine whether and which residues of these components should be substituted to optimize the properties of the obtained humanized antibody. Substitution of human amino acid residues by mice should generally be minimized since the introduction of mouse residues increases the risk that the antibody elicits a HAMA response in humans. The amino acids for substitution are selected based on their possible effect on CDR conformation and / or antigen binding. Investigation of these possible effects is accomplished by modeling, examining amino acid characteristics at individual positions, or empirically observing the effects of substitution or mutagenesis of individual amino acids.

Pokiaľ sa aminokyselina líši medzi základnou štruktúrou variabilnej oblasti mu MAb PB1.3 a ekvivalentnou ludskou základnou štruktúrou variabilnej oblasti, mala by byt aminokyselina ľudskej základnej štruktúry substituovaná ekvivalentnou myšou aminokyselinou obvykle vtedy, ak je možné odôvodnene predpokladať, že táto aminokyselina:If the amino acid differs between the mu MAb variable region framework PB1.3 and the equivalent human variable region framework, the human framework amino acid should be substituted with the equivalent mouse amino acid usually when it can reasonably be assumed that the amino acid:

(1) nekovalentne viaže antigén priamo (napríklad aminokyseliny v polohách Hl, H2 a L60 mu MAb PB1.3), (2) susedí s oblasťou CDR, je časťou oblasti CDR podľa alternatívnej definície, navrhnutej vyššie citovaným Chothiom a ď., alebo inak interaguje s oblasťou CDR (napríklad je vo vzdialenosti do asi 3 angstrômov od oblasti CDR) (napríklad H73 mu MAb PB1.3, tabulky 1 a 3), alebo (3) participuje na rozhraní V_L-V_H.(1) non-covalently binds antigen directly (e.g., amino acids at positions H1, H2 and L60 of mu MAb PB1.3), (2) adjacent to the CDR region, is part of a CDR region according to an alternative definition proposed by Chothio et al. interacts with a CDR region (e.g., at a distance of about 3 angstroms from the CDR region) (e.g., H73 mu MAb PB1.3, Tables 1 and 3), or (3) participates in the V _L -V _H interface.

Ďalšími kandidátmi substitúcie sú aminokyseliny akceptorovej ľudskej základnej štruktúry, ktoré sú pre ludský imunoglobulín v tejto polohe neobvyklé. Tieto aminokyseliny môžu byt substituované aminokyselinami z ekvivalentných polôh typickejších ľudských imunoglobulínov. Alternatívne môžu byt aminokyseliny z ekvivalentných polôh mu MAb PB1.3 zavedené do ľudských oblastí základnej štruktúry, ak sú také aminokyseliny typické pre ludský imunoglobulín v ekvivalentných polohách.Other candidate substitutions are acceptor human framework amino acids that are unusual for human immunoglobulin at this position. These amino acids may be substituted with amino acids from equivalent positions of more typical human immunoglobulins. Alternatively, amino acids from equivalent positions of mu MAb PB1.3 can be introduced into human framework regions if such amino acids are typical of human immunoglobulin at equivalent positions.

Všeobecne je substitúcia všetkých alebo väčšiny aminokyselín, splňujúcich uvedené kritériá, žiadúca. V niektorých prípadoch však panuje určitá nejednoznačnost v tom, či konkrétna aminokyselina tieto kritériá splňuje, a vytvoria sa alternatívne variantné imunoglobulíny, z ktorých jeden túto konkrétnu substitúciu má a druhý nie. Ako príklad uvedená humanizovaná protilátka, označovaná ako pretvorený MAb PB1.3 (H_bL_d), prekvapivo obsahuje iba jednu substitúciu zvyškov základnej štruktúry variabilnej oblasti ľudského ťažkého reťazca a iba dve substitúcie zvyškov základnej štruktúry variabilnej oblasti ľudského ľahkého reťazca, a napriek tomu vykazuje v podstate podobnú (v rozsahu faktora dve) väzbovú aktivitu ako myšia alebo chimérická protilátka s intaktnými myšími variabilnými oblasťami, fúzovanými k ľudskej konštantnej oblasti (s označením chi MAb PB1.3).In general, substitution of all or most of the amino acids meeting the above criteria is desirable. However, in some cases there is some ambiguity as to whether a particular amino acid meets these criteria, and alternative variant immunoglobulins are produced, one of which has that particular substitution and the other not. Examples of the humanized antibody, designated reshaped MAb PB1.3 _(Hb L _d), surprisingly contains only one substitution of residues of the variable region of human heavy chain and only two substitutions of residues of the variable region of human light chains, and yet has essentially similar (within a factor of two) binding activity to a mouse or chimeric antibody with intact mouse variable regions fused to a human constant region (designated chi MAb PB1.3).

Niektoré humanizované protilátky podľa vynálezu obsahujú substitúciu zvyšku základnej štruktúry ľudského ľahkého reťazca zodpovedajúcim zvyškom mu MAb PB1.3 v aspoň 1, 2 alebo 3 a niekedy 4 z týchto polôh: L21, L46, L60 a L70 (vičf tabuľky 2 a 4). Niektoré humanizované protilátky obvykle obsahujú substitúciu zvyšku základnej štruktúry ľudského ťažkého reťazca v aspoň 1, 2 alebo 3 a niekedy 4 z týchto polôh: Hl, H2 a H71 a H73 (vid tabuľky la 3). Mnohé humanizované protilátky obsahujú substitúcie základnej štruktúry variabilnej oblasti ako ľahkého, tak ťažkého reťazca. Prednostné pro29 tilátky obsahujú substitúciu zvyšku základnej štruktúry ľudského ťažkého reťazca aspoň v polohe H71 a substitúcie zvyškov základnej štruktúry ľudského ľahkého reťazca aspoň v polohách 21 a 46.Some humanized antibodies of the invention comprise a substitution of a human light chain framework residue corresponding to mu MAb PB1.3 residues in at least 1, 2 or 3 and sometimes 4 of the following positions: L21, L46, L60 and L70 (see Tables 2 and 4). Some humanized antibodies typically comprise a substitution of a human heavy chain framework residue in at least 1, 2 or 3 and sometimes 4 of the following positions: H1, H2 and H71 and H73 (see Tables 1 and 3). Many humanized antibodies contain both light and heavy chain variable region framework substitutions. Preferred antibodies comprise a substitution of a human heavy chain framework residue at least at position H71 and a substitution of a human light chain framework residue at least at positions 21 and 46.

Oblasti CDR v humanizovaných protilátkach sú obvykle v podstate identické a častejšie identické so zodpovedajúcimi oblasťami CDR v protilátke mu MAb PB1.3. Aj keď to obvykle nie je žiadúce, je niekedy možné uskutočniť jednu alebo viac konzervatívnych substitúcií aminokyselín vo zvyškoch CDR bez zistiteľného ovplyvnenia väzbovej afinity výsledného humanizovaného imunoglobulínu. V niektorých prípadoch môže substitúcia oblastí CDR viest ku zvýšenej väzbovej afinite.The CDRs in humanized antibodies are typically substantially identical and more often identical to the corresponding CDRs in mu MAb PB1.3. Although not usually desirable, it is sometimes possible to make one or more conservative amino acid substitutions in CDR residues without appreciably affecting the binding affinity of the resulting humanized immunoglobulin. In some cases, substitution of CDRs may result in increased binding affinity.

Okrem vyššie uvedených konkrétnych substitúcií aminokyselín sú oblasti základnej štruktúry humanizovaných imunoglobulínov obvykle v podstate identické a často identické s oblasťami základnej štruktúry ľudských protilátok, z ktorých boli odvodené. Mnohé z aminokyselín v oblasti základnej štruktúry však majú malý alebo nemajú žiadny priamy príspevok ku špecificite alebo afinite protilátky. Je teda možné tolerovať mnohé jednotlivé konzervatívne substitúcie zvyškov základnej štruktúry bez pozorovateľnej zmeny špecificity alebo afinity výsledného humanizovaného imunoglobulínu. Všeobecne sú však tieto substitúcie nežiadúce.In addition to the specific amino acid substitutions mentioned above, the framework regions of humanized immunoglobulins are generally substantially identical and often identical to the framework regions of the human antibodies from which they were derived. However, many of the amino acids in the framework region have little or no direct contribution to the specificity or affinity of the antibody. Thus, it is possible to tolerate many individual conservative substitutions of framework residues without observing a change in the specificity or affinity of the resulting humanized immunoglobulin. In general, however, these substitutions are undesirable.

(5) Ρτ-nrtukcia variabilných oblastí(5) Ρτ-reduction of variable regions

Potom, čo boli definované a vybrané komponenty oblastí CDR a základnej štruktúry humanizovaných imunoglobulínov, sú k dispozícii rôzne metódy výroby takýchto imunoglobulínov. V dôsledku degenerácie kódu je každá aminokyselinová sekvencia imunoglobulínu kódovaná niekoľkými rôznymi sekvenciami nukleových kyselín. Požadované sekvencie nukleových kyselín je možné vyrobiť novou syntézou DNA v pevnej fáze alebo mutagenézou PCR skôr pripraveného variantu požadovaného nukleoti30 du. Prednostnou metódou prípravy substitučných, delečných a inzerčných variantov DNA cieľového polypeptidu je oligonukleotidovo sprostredkovaná mutagenéza, viď Adelman a d., DNA 2:183 (1983). Stručne ju možno opísať tak, že DNA cieľového polypeptidu sa pozmení hybridizáciou oligonukleotidu, kódujúceho požadovanú mutáciu, k templátu jednoreťazcovej DNA. Po hybridizácii sa použije DNA polymeráza na syntézu celého druhého komplementárneho reťazca templátu, ktorý zahrnuje oligonukleotidový primér a kóduje zvolenú alteráciu DNA cieľového polypeptidu.Once the components of the CDRs and the framework of humanized immunoglobulins have been defined and selected, various methods for making such immunoglobulins are available. Due to the degeneracy of the code, each amino acid sequence of an immunoglobulin is encoded by several different nucleic acid sequences. Desired nucleic acid sequences can be produced by new solid phase DNA synthesis or by PCR mutagenesis of a previously prepared variant of the desired nucleotide 30 du. A preferred method for preparing substitution, deletion and insertion variants of the target polypeptide DNA is oligonucleotide-mediated mutagenesis, see Adelman et al., DNA 2: 183 (1983). Briefly, the DNA of the target polypeptide is altered by hybridizing the oligonucleotide encoding the desired mutation to a single-stranded DNA template. After hybridization, DNA polymerase is used to synthesize the entire second complementary strand of the template that includes the oligonucleotide primer and encodes the selected DNA alteration of the target polypeptide.

(fi) Vvber konštantnej oblasti(fi) Selection of constant area

Variabilné segmenty humanizovaných protilátok, vyrobené vyššie opísaným spôsobom, sa v typickom prípade napoja k aspoň časti konštantnej oblasti imunoglobulínu (Fc), typicky ľudského imunoglobulínu. Sekvencie DNA ľudskej konštantnej oblasti možno izolovať známymi postupmi z rôznych ľudských buniek, ale prednostne z usmrtených B-buniek (vid vyššie Kabat ad. a WO 87/02671; obidva tieto dokumenty sú tu vo svojom celku zahrnuté formou odkazu pre všetky účely). Protilátka potom obvykle bude obsahovať konštantné oblasti ľahkého i ťažkého reťazca. Konštantná oblasť ťažkého reťazca obvykle obsahuje oblasti CH1, pántovú oblasť, CH2, CH3 a CH4.The humanized antibody variable segments produced as described above are typically attached to at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically a human immunoglobulin. The DNA sequences of the human constant region can be isolated by known procedures from various human cells, but preferably from killed B cells (see Kabat et al., And WO 87/02671 above; both of which are incorporated herein by reference in their entirety). Typically, the antibody will then comprise both light and heavy chain constant regions. The heavy chain constant region typically comprises CH1, hinge, CH2, CH3, and CH4 regions.

Humanizované protilátky zahrnujú protilátky majúce všetky typy konštantných oblastí včítane IgM, IgG, IgD, IgA a IgE a ktoréhokoľvek izotypu včítane IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4. Ak sa požaduje, aby humanizované protilátka vykazovala cytotoxickú aktivitu, jedná sa v prípade konštantnej domény obvykle o konštantnú doménu fixujúcu komplement a typicky o triedu IgG·^. Pokial cytotoxická aktivita nie je žiadúca, môže byt konštantná doména triedy IgG^. Humanizované protilátka môže obsahovať sekvencie z viac než jednej triedy alebo izotypu.Humanized antibodies include antibodies having all types of constant regions including IgM, IgG, IgD, IgA and IgE and any isotype including IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. When a humanized antibody is desired to exhibit cytotoxic activity, the constant domain is usually a complement-fixing constant domain, and typically an IgG class. If cytotoxic activity is not desired, the constant domain may be of the IgG class. The humanized antibody may comprise sequences from more than one class or isotype.

(7) Exnresné svstémv(7) Exnresné svstémv

Nukleové kyseliny, kódujúce variabilné oblasti humanizovaného ľahkého a ťažkého reťazca, poprípade spojené s konštantnými oblasťami, sa vkladajú do expresných vektorov. Ľahký a ťažký reťazec môže byť klonovaný v rovnakom alebo odlišnom expresnom vektore. Segmenty DNA, kódujúce reťazce imunoglobulínu, sú operatívne naviazané ku kontrolným sekvenciám v expresných vektoroch, ktoré zaisťujú expresiu imunoglobulínových polypeptidov. Tieto kontrolné sekvencie zahrnujú signálnu sekvenciu, promótor, zosilňovač transkripcie a terminačnú sekvenciu transkripcie. Expresné vektory sú typicky replikovateľné v hostiteľských organizmoch buď ako epizómy alebo ako integrálna časť chromozomálnej DNA hostiteľa. Expresné vektory bežne obsahujú selekčné markéry, napríklad tetracyklín alebo neomycín, aby bolo možné detegovať tieto bunky transformované požadovanými sekvenciami DNA (viď napríklad patent US 4,704.362).Nucleic acids encoding humanized light and heavy chain variable regions, optionally linked to constant regions, are inserted into expression vectors. The light and heavy chains may be cloned in the same or different expression vector. DNA segments encoding immunoglobulin chains are operably linked to control sequences in expression vectors that provide for expression of immunoglobulin polypeptides. These control sequences include a signal sequence, a promoter, a transcription enhancer, and a transcription termination sequence. Expression vectors are typically replicable in host organisms either as episomes or as an integral part of the host chromosomal DNA. Expression vectors commonly contain selection markers, for example tetracycline or neomycin, to detect these cells transformed with the desired DNA sequences (see, for example, U.S. Patent 4,704,362).

Jedným z prokaryotických hostiteľov, zvlášť vhodných pre klonovanie polynukleotidov podľa vynálezu, je E. coli. Ďalší použiteľní mikrobiálni hostitelia zahrnujú bacily, ako je Bacillus subtilis, a ďalšie enterobaktérie, ako je Salmonella, Serratia, a rôzne druhy Pseudomonas. V týchto prokaryotických hostiteľoch je taktiež možné produkovať expresné vektory, ktoré budú typicky obsahovať kontrolné sekvencie kompatibilné s hostiteľskou bunkou (napríklad počiatok replikácie). Okrem toho bude prítomný veľký počet rôznych známych promótorov, ako je laktózový promótorový systém, tryptofánový (trp) promótorový systém, β-laktamázový promótorový systém alebo promótorový systém z fága λ . Promótory typicky budú kontrolovať expresiu, poprípade s operátorovou sekvenciou a budú mať sekvencie ribozómových väzbových miest apod. pre iniciáciu a dokončenie transkripcie a translácie.One prokaryotic host particularly useful for cloning polynucleotides of the invention is E. coli. Other useful microbial hosts include bacilli such as Bacillus subtilis, and other enterobacteria such as Salmonella, Serratia, and various Pseudomonas species. It is also possible in these prokaryotic hosts to produce expression vectors that will typically contain control sequences compatible with the host cell (e.g., an origin of replication). In addition, a large number of different known promoters will be present, such as the lactose promoter system, the tryptophan (trp) promoter system, the β-lactamase promoter system, or the phage λ promoter system. Promoters will typically control expression, optionally with an operator sequence, and will have ribosome binding site sequences and the like. to initiate and complete transcription and translation.

Na expresiu je možné použiť aj iné mikróby, napríklad kvasinky. Prednostným hostiteľom je Saccharomyces podľa potreby s vhodnými vektormi majúcimi expresné kontrolné sekvencie, ako promótory včítane 3-fosfoglyceratkinázy alebo iných glykolytických enzýmov, a počiatok replikácie, terminačnej sekvencie a pod.Other microbes, such as yeast, may also be used for expression. The preferred host is Saccharomyces, as appropriate, with suitable vectors having expression control sequences, such as promoters including 3-phosphoglycerate kinase or other glycolytic enzymes, and an origin of replication, termination sequence, and the like.

Okrem mikroorganizmov je možné na expresiu a produkciu polypeptidov podľa vynálezu použiť bunkovú kultúru tkaniva cicavcov (vid Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987)). V súčasnosti sú preferované eukaryotické bunky, nakoľko bolo vyvinuté veľké množstvo vhodných hostiteľských bunkových línií, schopných sekrécie intaktného imunoglobulínu. Prednostné hostiteľské bunky pre expresiu nukleových kyselín, kódujúcich imunoglobulíny podľa vynálezu, zahrnujú: líniu CV1 opičej obličky transformovanú SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), líniu ľudskej embryonálnej obličky (293) (Graham ad¹., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)), obličkové bunky mláďatá škrečka (BHK, ATCC CCL 10), DHFR ovariálne bunky čínskeho škrečka (CHO, Urlaub a Chásin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216 (1980)), myšie Sertoliho bunky (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)), opičie obličkové bunky (CVl ATCC CCL 70). obličkové bunky african green monkey (VERO-76, ATCC CRL 1587), bunky ľudského cervikálneho karcinómu (HELA, ATCC CCL 2), psie obličkové bunky (MDCK, ATCC CCL 34), pečeňové bunky buffalo rat (BRL 3A, ATCC CRL 1442), ľudské pľúcne bunky (W138, ATCC CCL 75), ľudské pečeňové bunky (Hep G2, HB 8065), myší tumor mliečnej žľazy (MMT 060562, ATCC CCL 51) a bunky TRI (Mather a ď., Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-46 (1982)), bunky baculovírusu.In addition to microorganisms, a mammalian tissue cell culture can be used to express and produce the polypeptides of the invention (see Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publishers, NY, NY, 1987)). Currently, eukaryotic cells are preferred because a large number of suitable host cell lines capable of secreting intact immunoglobulin have been developed. Preferred host cells for expressing nucleic acids encoding the immunoglobulins of the invention include: monkey kidney CV1 line transformed by SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), human embryonic kidney line (293) (Graham d ^1., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)), baby hamster kidney cells (BHK, ATCC CCL 10), Chinese hamster DHFR ovary cells (CHO, Urlaub and Hasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 4216 (1980)) , mouse Sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)), monkey kidney cells (CV1 ATCC CCL 70). african green monkey kidney cells (VERO-76, ATCC CRL 1587), human cervical carcinoma cells (HELA, ATCC CCL 2), canine kidney cells (MDCK, ATCC CCL 34), buffalo rat liver cells (BRL 3A, ATCC CRL 1442) , human lung cells (W138, ATCC CCL 75), human liver cells (Hep G2, HB 8065), mouse mammary tumor (MMT 060562, ATCC CCL 51) and TRI cells (Mather et al., Annals NY Acad. Sci. 383: 44-46 (1982)), baculovirus cells.

Vektory, obsahujúce príslušné polynukleotidové sekvencie (napríklad sekvencie kódujúce ťažký a ľahký reťazec a expresné kontrolné sekvencie), môžu byť do hostiteľskej bunky prenesené známymi metódami, ktoré sa líšia v závislosti na type bunkového hostiteľa. Napríklad pre prokaryotické bunky sa bežne používa transfekcia chloridom vápenatým, zatiaľ čo pre iných bunkových hostiteľov možno použiť spracovanie fosforečnanom vápenatým alebo elektroporáciu (všeobecne viď Sambrook ad., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2. vyd., 1989? zahrnuté tu ako celok formou odkazu pre všetky účely). Pokiaľ sa ťažký a ľahký reťazec klonujú na oddelených expresných vektoroch, potom sa vektory kotransfikujú na získanie expresie a zostavenie intaktných imunoglobulínov. Po zavedení rekombinačnej DNA sa uskutoční bunková selekcia bunkových línií exprimujúcich imunoglobulínové produkty. Preferujú sa bunkové línie schopné stabilnej expresie (t.j. neznížená hladina expresie po päťdesiatich pasážach bunkovej línie).Vectors containing appropriate polynucleotide sequences (e.g., heavy and light chain encoding sequences and expression control sequences) can be transferred to the host cell by known methods, which vary depending on the type of cell host. For example, calcium chloride transfection is commonly used for prokaryotic cells, while calcium phosphate treatment or electroporation may be used for other cell hosts (generally see Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2nd Ed., 1989). If the heavy and light chains are cloned on separate expression vectors, the vectors are cotransfected to obtain expression and assembly of intact immunoglobulins, and after the introduction of recombinant DNA, the cell lines are selected for cell lines expressing the immunoglobulin products. cell lines capable of stable expression (ie, unabated expression level after fifty passages of the cell line).

Akonáhle sú exprimované, môžu byť celé protilátky, ich diméry, jednotlivé ľahké a ťažké reťazce alebo iné formy imunoglobulínov podľa vynálezu čistené štandardnými známymi metódami, zahrnujúcimi zrážanie síranom amónnym, afinitné kolóny, stĺpcovú chromatografiu, gélovú elektroforézu a pod. (všeobecne vid Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982). Pre farmaceutické použitie sú preferované v podstate čisté imunoglobulíny s homogenitou aspoň asi 90 až 95 % a obzvlášť preferované s homogenitou 98 až 99 % alebo viac.Once expressed, the whole antibodies, their dimers, individual light and heavy chains, or other forms of immunoglobulins of the invention can be purified by standard known methods including ammonium sulfate precipitation, affinity columns, column chromatography, gel electrophoresis, and the like. (generally see Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982).) For pharmaceutical use, substantially pure immunoglobulins with a homogeneity of at least about 90 to 95% and particularly preferred with a homogeneity of 98 to 99% or more are preferred.

Vyššie opísané techniky rekombinácie môžu byt použité tiež pre expresiu natívnych sekvencií, kódujúcich ľudské alebo myšie protilátky. Tento prístup je obzvlášť výhodný pre expresiu ľudských protilátok, ktoré sa izolujú ako nestabilné bunkové línie.The above-described recombination techniques can also be used to express native sequences encoding human or mouse antibodies. This approach is particularly advantageous for the expression of human antibodies that are isolated as unstable cell lines.

III. Fragmenty protilátokIII. Antibody fragments

V inom uskutočnení sú predmetom vynálezu vyššie uvedené fragmenty intaktných protilátok. Tieto fragmenty typicky súťažia s intaktnou protilátkou, z ktorej boli odvodené, o špecifickú väzbu na P-selektín a viažu sa s afinitou aspoň 10⁷,In another embodiment, the above intact antibody fragments are provided. These fragments typically compete with the intact antibody from which they were derived for specific binding to P-selectin and bind with an affinity of at least 10 ⁷ ,

ΙΟ⁸' ΙΟ⁹ alebo 10^1θ Μ¹. Fragmenty protilátok zahrnujú Fab, Fab' F(ab')₂, Fabc a Fv oddelených ťažkých a ľahkých reťazcov. Fragmenty je možné získať enzymatickou alebo chemickou separáciou intaktných imunoglobulínov. Napríklad fragment F(ab’)₂ môže byt získaný z molekuly IgG proteolytickou digesciou s pepsínom pri pH 3,0 až 3,5 pomocou štandardných metód, aké sú napríklad opísané v Harlow a Lane, Antibodies: A Labo• ratory Manual, Cold Spring Harbor Pubs., N.Y. (1988). Fragmenty Fab je možné získať z fragmentov F(ab')₂ obmedzenou re dukciou alebo z celých protilátok digesciou s papaínom v prítomnosti redukčných činidiel (viď tamtiež). Fragmenty je možné vyrobiť taktiež technikami rekombinácie DNA. Segmenty nukleových kyselín, kódujúce zvolené fragmenty, sa získajú digesciou plnej dľžky kódujúcich sekvencií reštrikčnými enzýmami alebo novou syntézou. Fragmenty sa často exprimujú vo forme fúznych proteínov s fágovým plášťom. Tento spôsob expresie je výhodný pre zostrenie afinity protilátok, opísanej v oddiele IV.ΙΟ ⁸ 'ΙΟ ⁹ or 10 ^1θ Μ ¹ . Antibody fragments include Fab, Fab 'F (ab') ₂ , Fabc and Fv separated heavy and light chains. Fragments can be obtained by enzymatic or chemical separation of intact immunoglobulins. For example, the F (ab ') ₂ fragment can be obtained from an IgG molecule by proteolytic digestion with pepsin at pH 3.0 to 3.5 using standard methods such as described in Harlow and Lane, Antibodies: A Labory Manual, Cold Spring Harbor Pubs, NY (1988). Fab fragments can be obtained from F (ab ') ₂ fragments by limited reduction or whole antibodies by digestion with papain in the presence of reducing agents (see ibid.). Fragments can also be produced by recombinant DNA techniques. Nucleic acid segments encoding selected fragments are obtained by digesting full length coding sequences with restriction enzymes or by new synthesis. Fragments are often expressed as phage coat fusion proteins. This expression method is advantageous for enhancing the affinity of the antibodies described in Section IV.

. IV. Protilátkv so zostrenou afinitou • V mnohých vyššie opísaných imunoglobulínoch je možné uskutočňovať nekritické substitúcie, adície alebo delécie aminokyselín ako vo variabilných, tak v konštantných oblastiach bez straty väzbovej špecificity alebo efektorových funkcií alebo netolerovateľného zníženia väzbovej afinity (tj. pod 10⁷ M^-1). Imunoglobulíny, v ktorých boli uskutočnené takéto zmeny, obvykle vykazujú podstatnú sekvenčnú identitu s referenčným imunoglobulínom, z ktorého boli odvodené. V niektorých prípadoch je možné selekciou získať mutovaný imunoglobulín s rovnakou špecificitou a zvýšenou afinitou v porovnaní s referenčným imunoglobulínom, z ktorého bol odvodený. Technológia zobrazovania fágov ponúka účinné techniky selekcie takýchto imunoglobulínov, viď napríklad Dower a ď., WO 91/17271, McCafferty a ď., WO 92/01047, a Huse, WO 92/06204.. IV. Enhanced Affinity Antibodies • In many of the immunoglobulins described above, non-critical amino acid substitutions, additions or deletions can be made in both variable and constant regions without loss of binding specificity or effector functions or intolerable reduction in binding affinity (ie below 10 ⁷ M ^-1 ) . Immunoglobulins in which such changes have been made usually exhibit substantial sequence identity to the reference immunoglobulin from which they were derived. In some cases, it is possible to select a mutated immunoglobulin with the same specificity and increased affinity as compared to the reference immunoglobulin from which it was derived. Phage display technology offers efficient techniques for selecting such immunoglobulins, see, for example, Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al., WO 92/01047, and Huse, WO 92/06204.

V- Hvbridné nrotilátkvV- Hybrid nrotilátkv

Vynález poskytuje taktiež hybridné protilátky, ktoré zdielajú špecificitu blokujúcich protilátok proti P-selektínu, ale sú schopné sa špecificky viazať tiež na druhú jednotku. V týchto hybridných protilátkach je obvykle jedna dvojica ťažkého a ľahkého reťazca z anti-P-selektínovej protilátky a druhá dvojica z protilátky pôsobiacej proti inému epitopu. Z toho vyplýva multifunkčná valencia, t.j. schopnosť viazať sa na aspoň dva rôzne epitopy súčasne, pričom aspoň jedným epitopom je epitop, ku ktorému sa viaže protilátka blokujúca P-selektín. Takéto hybridy je možné vytvárať fúziou hybridómov, produkujúcich zodpovedajúce jednotlivé protilátky, alebo rekombinačnými technikami.The invention also provides hybrid antibodies that share the specificity of blocking antibodies against P-selectin, but are also capable of specifically binding to a second unit. In these hybrid antibodies, usually one pair of the heavy and light chains is from an anti-P-selectin antibody and the other pair of an antibody is directed against another epitope. This results in a multifunctional valence, i. the ability to bind to at least two different epitopes simultaneously, wherein the at least one epitope is the epitope to which the P-selectin blocking antibody binds. Such hybrids can be generated by fusing hybridomas producing the corresponding individual antibodies or by recombinant techniques.

Imunoglobulíny je taktiež možné fúzovať k funkčným oblastiam z iných génov (napríklad enzýmov) a získavať tak fúzne proteíny (napríklad imunotoxíny) s novými vlastnosťami.Immunoglobulins can also be fused to functional regions from other genes (e.g., enzymes) to yield fusion proteins (e.g., immunotoxins) with novel properties.

vi. Nukleové kvselinvvi. Nucleic kvselinv

Intaktné protilátky a fragmenty protilátok, opísané vyššie, sa často získavajú expresiou nukleových kyselín. Všetky nukleové kyseliny, kódujúce ktorúkoľvek protilátku alebo protilátku opísanú v tejto prihláške, sú výslovne zahrnuté vo vynáleze. Modifikácie nukleových kyselín je možné ľahko uskutočňovať rôznymi známymi metódami, ako je miestne riadená mutagenéza (vičŕ Gillman a Smith, Gene 8:81-97 (1979), a Roberts a d., Náture 328:731-734 (1987)). Mnohé z nukleových kyselín podľa vynálezu vykazujú podstatnú sekvenčnú identitu s nukleovými kyselinami kódujúcimi ťažký a ľahký reťazec mu MAb PB1.3 alebo jeho humanizované deriváty, uvedené tu ako príklady.The intact antibodies and antibody fragments described above are often obtained by expression of nucleic acids. All nucleic acids encoding any antibody or antibody described in this application are expressly included in the invention. Nucleic acid modifications can be readily accomplished by various known methods, such as site-directed mutagenesis (see Gillman and Smith, Gene 8: 81-97 (1979), and Roberts et al., Nature 328: 731-734 (1987)). Many of the nucleic acids of the invention exhibit substantial sequence identity to nucleic acids encoding the heavy and light chains of mu MAb PB1.3, or humanized derivatives thereof, exemplified herein.

Vil. Počítače v ďalšom aspekte sú predmetom vynálezu počítače, programované tak, aby zobrazovali trojrozmerné obrazy protilátok na monitore alebo tlačiarni. Vhodná je napríklad pracovná stanica Silicon Graphics IRIS 4D, pracujúca pod operačným systémom UNIX, s použitím molekulárnej modelovacej sady QUANTA (Polygen Corp. USA). Počítače sú vhodné pre znázornenie modelov variantov humanizovaných protilátok. Protilátky podľa vynálezu všeobecne už poskytujú uspokojivú väzbovú afinitu. Je však pravdepodobné, že ďalšími obmenami určitých aminokyselinových zvyškov je možné identifikovať protilátky s ešte silnejšou väzbovou afinitou. Pomocou trojrozmerného obrazu je možné identifikovať i mnoho nekritických aminokyselín, ktoré môžu byť predmetom konzervatívnych substitúcií bez pozorovateľného ovplyvnenia väzbovej afinity protilátky.Villas. Computers in another aspect of the invention are computers programmed to display three-dimensional images of antibodies on a monitor or printer. For example, a Silicon Graphics IRIS 4D workstation operating under the UNIX operating system using the QUANTA molecular modeling kit (Polygen Corp. USA) is suitable. Computers are useful for illustrating models of humanized antibody variants. Antibodies of the invention generally already provide satisfactory binding affinity. However, it is likely that further variations of certain amino acid residues can identify antibodies with even stronger binding affinity. Many non-critical amino acids can be identified using a three-dimensional image that can be subject to conservative substitutions without observing affecting the binding affinity of the antibody.

VIII. Produkcia protilátok vo veľkom meradleVIII. Large-scale production of antibodies

Pre produkciu protilátok vo veľkom meradle sa produkujú stabilné bunky, obsahujúce v chromozómoch viacpočetné kópie génov, kódujúcich ťažké a ľahké reťazce imunoglobulínov. Viacpočetné kópie sa získajú amplifikáciou izolovaných oblastí bunkovej chromozomálnej DNA. Amplifikácia sa uskutočňuje pomocou selekčného prostriedku, napríklad metotrexátu (MTX), ktorý inaktivuje bunkový enzým (napríklad DHFR), ktorý je nevyhnutný za určitých rastových podmienok. Amplifikáciou, tj. akumuláciou viacpočetných kópií génu DHFR, sa dosiahne produkcia väčšieho množstva DHFR ako odpovede na väčšie množstvo MTX. Aroplifikačný postup sa aplikuje bez ohľadu na prítomnosť endogénnej DHFR prídavkom ešte väčšieho množstvo MTX k médiu. Amplifikácia požadovaných génov (tu génov kódujúcich ťažký a ľahký reťazec imunoglobulínu) sa dosiahne pripojením každého génu ku kópii génu DHFR na rovnakom alebo oddelenom plazmide alebo plazmidoch a kotransfekciou plazmidu alebo plazmidov. Amplifikáciou génov DHFR v odpoveď na MTX dochádza ku striedavému zvýšeniu počtu kópií požadovaných imunoglobulínových génov. Zvýšenie počtu kópií požadovaných génov má za následok vyššiu expresiu požadovaného heterológneho proteínu. Preferované sú stabilné bunkové línie, exprimujúce asi 10 až 100, 20 až 50 alebo asi 30 μg humanizovaného imunoglobulínu na 10⁶ buniek za deň.For large-scale production of antibodies, stable cells are produced containing multiple copies of genes encoding the immunoglobulin heavy and light chains in chromosomes. Multiple copies are obtained by amplifying isolated regions of cellular chromosomal DNA. Amplification is performed using a selection means, such as methotrexate (MTX), which inactivates a cellular enzyme (such as DHFR), which is necessary under certain growth conditions. Amplification, ie. By accumulating multiple copies of the DHFR gene, more DHFR is produced in response to a greater amount of MTX. The anoplification procedure is applied regardless of the presence of endogenous DHFR by adding an even greater amount of MTX to the medium. Amplification of the desired genes (here genes encoding the immunoglobulin heavy and light chains) is achieved by attaching each gene to a copy of the DHFR gene on the same or separate plasmid or plasmids and co-transfecting the plasmid or plasmids. Amplification of DHFR genes in response to MTX results in an alternate increase in copy number of the desired immunoglobulin genes. Increasing the copy number of the genes of interest results in higher expression of the heterologous protein of interest. Preferred are stable cell lines expressing about 10 to 100, 20 to 50 or about 30 µg of humanized immunoglobulin per 10 ⁶ cells per day.

IX. Fraomentv P-selektínuIX. Fraoment in P-selectin

V ďalšom aspekte sú predmetom vynálezu fragmenty P-selektínu. Fragmenty zahrnujú aminokyseliny z piatej regulačnej domény C3b-C4b P-selektínu (piata CRP). Fragmenty obsahujú epitop viazaný protilátkou mu MAb PB1.3 a/alebo proximálne epitopy viazané konkurenčnými protilátkami. Fragmenty obvykle obsahujú celkom až 5, 10, 20, 25, 50, 75, 100 alebo 200 aminokyselín. Väčšina fragmentov obsahuje niektoré alebo všetky aminokyseliny medzi polohami 448 a 467 sekvencie ludského P-selektínu, znázornené na obr. 34. Tieto aminokyseliny definujú epitop, špecificky viazaný protilátkou mu MAb PB1.3. V mnohých fragmentoch je aspoň päť súvislých aminokyselín z oblasti medzi polohami 448 a 467 sekvencie aminokyselín znázornenej na obr. 34. Iné fragmenty obsahujú celý súvislý segment aminokyselín medzi polohami 448 a 467. Niektoré fragmenty sú tvorené v podstate týmto súvislým segmentom aminokyselín. V týchto fragmentoch nie sú prítomné žiadne iné aminokyseliny, ktoré prispievajú k väzbovej špecificite alebo afinite fragmentu. Často nie sú prítomné žiadne iné akokoľvek opísateiné aminokyseliny.In another aspect, the invention provides P-selectin fragments. The fragments include amino acids from the fifth C3b-C4b regulatory domain of P-selectin (fifth CRP). The fragments contain an epitope bound by mu MAb PB1.3 and / or proximal epitopes bound by competing antibodies. Fragments typically contain up to 5, 10, 20, 25, 50, 75, 100 or 200 amino acids in total. Most fragments contain some or all of the amino acids between positions 448 and 467 of the human P-selectin sequence shown in FIG. 34. These amino acids define an epitope specifically bound by mu MAb PB1.3. In many fragments, there are at least five contiguous amino acids from the region between positions 448 and 467 of the amino acid sequence shown in FIG. 34. Other fragments comprise the entire contiguous amino acid segment between positions 448 and 467. Some fragments consist essentially of the contiguous amino acid segment. There are no other amino acids present in these fragments that contribute to the binding specificity or affinity of the fragment. Often, no other amino acids of any descriptive nature are present.

Polypeptidové fragmenty podlá vynálezu majú rôzne použitie. Fragmenty sú použiteľné ako imunogény pre tvorbu protilátok, ktoré súťažia pri špecifickej väzbe na P-selektín s mu MAb PB1.3. Použitie definovaných fragmentov ako imunogénov znižuje rozsah screeningu nutného k izolácii protilátky s požadovanou špecificitou. Polypeptidové fragmenty sú použiteľné taktiež pri určitých dalej opísaných diagnostických a terape38 utických metódach. Niektoré fragmenty súťažia s celými molekulami P-selektínu pri väzbe na aktivované neutrofily. Tieto fragmenty sú teda použiteľné k boju s nemocami a stavmi imunitného systému, sprostredkovanými interakciami P-selektínu s jeho ligandami na aktivovaných neutrofiloch. Tieto fragmenty sú taktiež použiteľné na monitorovanie prítomnosti aktivovaných neutrofilov väzbou na ligandy pre P-selektín, prítomné na povrchu týchto buniek. Malá veľkosť fragmentov ich činí obzvlášť vhodnými pre účinné uvoľňovanie po podaní in vivo. Výlučne ľudský pôvod fragmentov znižuje riziko vedľajších účinkov, ktoré by mohli nastať v prípade niektorých prostriedkov.The polypeptide fragments of the invention have various uses. The fragments are useful as immunogens for the production of antibodies that compete for specific binding to P-selectin with mu MAb PB1.3. The use of defined fragments as immunogens reduces the amount of screening required to isolate the antibody with the desired specificity. Polypeptide fragments are also useful in certain diagnostic and therapeutic methods described below. Some fragments compete with whole P-selectin molecules for binding to activated neutrophils. Thus, these fragments are useful for combating diseases and conditions of the immune system mediated by the interaction of P-selectin with its ligands on activated neutrophils. These fragments are also useful for monitoring the presence of activated neutrophils by binding to P-selectin ligands present on the surface of these cells. The small size of the fragments makes them particularly suitable for effective release after administration in vivo. The purely human origin of the fragments reduces the risk of side effects that might occur with some agents.

X. TeraDeutické a diaanostické metódvX. Therapeutic and diaanostic methods

Terapeutické metódy používajú protilátky (celé a väzbové fragmenty) a fragmenty P-selektínu, diskutované vyššie, ako terapeutické prostriedky pre liečbu rôznych ochorení. Terapeutické prostriedky sú vhodné pre profylaktické a terapeutické ošetrenie rôznych ochorení a porúch imunitného systému. Tieto ochorenia a poruchy zahrnujú odhojenie štepu, reakciu hostiteľa na štep, autoimunitné ochorenie, ako je diabetes mellitus so závislosťou na inzulíne, roztrúsená skleróza, stiff man syndróme, reumatická artritída, myastenia gravis a lupus erythematosus, a zápalové poruchy. Prostriedky sú vhodné taktiež pre prevenciu metastáz tumorov inhibíciou adhézie cirkulujúcich rakovinových buniek, ako sú karcinómy kolónu a melanómy. Niektoré terapeutické prostriedky fungujú tak, že blokujú alebo inak antagonizujú interakciu molekuly P-selektínu s jej ligandom. Iné terapeutické prostriedky fungujú tak, že usmrcujú bunky nesúce polypeptid, proti ktorému je prostriedok smerovaný.Therapeutic methods use antibodies (whole and binding fragments) and P-selectin fragments discussed above as therapeutic agents for the treatment of various diseases. The therapeutic compositions are suitable for the prophylactic and therapeutic treatment of various diseases and disorders of the immune system. Such diseases and disorders include graft rejection, graft host response, autoimmune diseases such as insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, stiff man syndrome, rheumatoid arthritis, myasthenia gravis and lupus erythematosus, and inflammatory disorders. The compositions are also suitable for preventing tumor metastasis by inhibiting the adhesion of circulating cancer cells, such as colon carcinomas and melanomas. Certain therapeutic agents function to block or otherwise antagonize the interaction of the P-selectin molecule with its ligand. Other therapeutic agents function to kill cells bearing the polypeptide against which the agent is directed.

Terapeutické prostriedky sú obzvlášť vhodné pre ošetrovanie zápalových a trombotických stavov včítane post-ischemického leukocytmi sprostredkovaného poškodenia tkaniva (reperfúzne poškodenie) vznikajúceho pri traumatickom šoku, mŕtvice, infarktu myokardu, akútneho odmietnutia transplantácie, omrzlín, compartment syndróme, a patofyziologických stavov spojených s kardio-pulmonárnym bypassom, akútnym poškodením pľúc sprostredkovaným leukocytmi (napríklad syndróm respiračnej núdze u dospelých), septickým šokom, sepsou spojenou s ranou po vírusovej infekcii, napríklad vírusom herpes simplex, IGE-sprostredkovanými alergickými reakciami, ako je akútna fáza astmatickej choroby, a chronických zápalových stavov včítane reumatickej artritídy, atopickej dermatitídy a psoriázy.The therapeutic agents are particularly suitable for the treatment of inflammatory and thrombotic conditions including post-ischemic leukocyte-mediated tissue damage (reperfusion injury) resulting from traumatic shock, stroke, myocardial infarction, acute transplant rejection, frostbite, pulmonary syndromes, pulmonary syndromes, compartment syndromes bypass, acute leukocyte-mediated lung injury (e.g., adult respiratory distress syndrome), septic shock, sepsis associated with a wound following viral infection, e.g., herpes simplex virus, IGE-mediated allergic reactions such as acute phase of asthmatic disease, and chronic asthmatic disease, and rheumatoid arthritis, atopic dermatitis and psoriasis.

Ischémia/reperfúzne poškodenie je zápalový stav, ku ktorému dochádza pri návrate prietoku krve do orgánov trpiacich obštrukciou prívodu spôsobujúcou ischémiu (zamedzenie prívodu kyslíka). Ak nedôjde k rýchlej úľave reperfúziou, spôsobuje ischémia odumretie okolitých buniek a nakoniec celého orgánu alebo smrť pacienta. Hromadiace sa dôkazy však ukazujú na to, že reperfúzia samotná môže pôsobiť zhubne na okolité tkanivo. Má sa za to, že nepriaznivé účinky reperfúzie aspoň čiastočne vyplývajú zo zápalovej odpovede, sprostredkovanej aktivovanými neutrofilmi v obnovenom krvnom riečišti. Niektorí pacienti majú ischémiu celého tela, zatiaľ čo u iných pacientov je ischémia obmedzená na konkrétne časti alebo orgány tela. Pacient môže napríklad trpieť epidermálnou, myokardiálnou, renálnou, cerebrálnou, splénickou, hepatickou, spinálnou, splanchnickou, pulmonárnou ischémiou, čiastočnou telesnou alebo celkovou telesnou ischémiou. Terapeutické prostriedky podľa vynálezu fungujú tak, že antagonizujú interakciu takýchto lymfocytov s P-selektínom.Ischemia / reperfusion injury is an inflammatory condition that occurs upon the return of blood flow to organs suffering from ischemic delivery obstruction (inhibition of oxygen supply). If reperfusion is not relieved quickly, ischemia causes the death of the surrounding cells and ultimately the whole organ or death of the patient. However, the accumulating evidence suggests that reperfusion alone can cause detrimental effects on surrounding tissue. The adverse effects of reperfusion are believed to result at least in part from an inflammatory response mediated by activated neutrophils in the restored bloodstream. Some patients have whole-body ischemia, while in other patients ischemia is limited to specific parts or organs of the body. For example, the patient may suffer from epidermal, myocardial, renal, cerebral, splenic, hepatic, spinal, splanchnic, pulmonary ischemia, partial body or total body ischemia. The therapeutic compositions of the invention function to antagonize the interaction of such lymphocytes with P-selectin.

Jedným z hlavných komponentov akútnych alergických stavov včítane astmy je degranulácia žírnych buniek po expozícii subjektov antigénom, na ktoré sú špecificky senzitívne. Dôsledky degranulácie žírnych buniek zahrnujú bronchokonštriktorovú odpoveď a tiež zápalovú odpoveď, charakterizovanú sčasti akumuláciou leukocytov. Histamín, ktorý je spolu s inými mediátormi zápalov obsiahnutý v žírnych bunkách, môže vyvolávať expresiu P-selektínu na vaskulárnych endoteliálnych bunkách, čo ukazuje, že degranulácia žírnych buniek môže viesť tiež k expresii P-selektínu a následnej akumulácii leukocytov. Pretože degranulácia žírnych buniek je kľúčovým prvkom patogenézy alergických stavov, môže byť podávanie protilátok proti P-selektínu použiteľné pri liečbe ľudských alergických stavov.One of the major components of acute allergic conditions, including asthma, is mast cell degranulation following exposure of subjects to antigen for which they are specifically sensitive. The consequences of mast cell degranulation include a bronchoconstrictor response as well as an inflammatory response, characterized in part by leukocyte accumulation. Histamine, which, along with other inflammatory mediators, is present in mast cells, can induce P-selectin expression on vascular endothelial cells, suggesting that mast cell degranulation may also lead to P-selectin expression and subsequent leukocyte accumulation. Since mast cell degranulation is a key element in the pathogenesis of allergic conditions, administration of P-selectin antibodies may be useful in the treatment of human allergic conditions.

Spôsoby sú obzvlášť vhodné pre ľudí, ale môžu byť aplikované i na veterinárne subjekty. Terapeutické metódy sa obvykle aplikujú na orgány, prítomné v živom subjekte. Niektoré metódy, ako je reperfúzna terapia ischémie, sú použiteľné taktiež na oddelené orgány, ak tieto orgány čakajú na transplantáciu príjemcami. Terapeutické metódy môžu byt uskutočňované i ex vivo.The methods are particularly suitable for humans, but can also be applied to veterinary subjects. Therapeutic methods are generally applied to organs present in a living subject. Some methods, such as reperfusion therapy for ischemia, are also applicable to separate organs when these organs are waiting for transplantation by recipients. Therapeutic methods can also be performed ex vivo.

Terapeutické prostriedky a prípravky, cielené proti P-selektínu, môžu byť taktiež používané v kombinácii s prostriedkami, cielenými proti iným molekulám, predovšetkým humanizovaným alebo ľudským protilátkam reagujúcim s odlišnými adhéznymi molekulami. Medzi vhodné imunoglobulíny patria imunoglobulíny špecifické pre CDlla, CDllb, CD18, E-selektín, L-selektín a ICAM-1. Imunoglobulíny by sa mali viazať na epitopy týchto adhéznych molekúl, aby inhibovali väzbu leukocytov, najmä neutrofilov, na endoteliálne bunky. Inými vhodnými protilátkami pre použitie v kombinačnej terapii sú protilátky špecifické pre lymfokíny, ako je IL-1, IL-2 a IFN-Ta ich receptory. Tieto protilátky slúžia na blokovanie aktivácie endoteliálnych buniek, a tak bránia ich interakcii s neutrofílmi v zápalovej odpovedi.Therapeutic compositions and compositions directed against P-selectin can also be used in combination with compositions directed against other molecules, particularly humanized or human antibodies reacting with different adhesion molecules. Suitable immunoglobulins include immunoglobulins specific for CD11a, CD11b, CD18, E-selectin, L-selectin and ICAM-1. Immunoglobulins should bind to epitopes of these adhesion molecules to inhibit the binding of leukocytes, especially neutrophils, to endothelial cells. Other suitable antibodies for use in combination therapy are lymphokine-specific antibodies such as IL-1, IL-2, and IFN-γ their receptors. These antibodies serve to block the activation of endothelial cells and thus prevent their interaction with neutrophils in the inflammatory response.

Blokujúce protilátky proti P-selektínu a farmaceutické prípravky podľa vynálezu sú obzvlášť vhodné pre parenterálne podávanie, t.j. subkutánnu, intramuskulárnu alebo intravenóz41 nu aplikáciu. Vzhíadom na prebiehajúci vývoj rôznych nových prístupov uvoľňovania liečiv sú farmaceutické prípravky podía vynálezu vhodné taktiež pre aplikáciu týmito novými metódami, vidf Langer, Science 249:1527-1533 (1990).Blocking P-selectin antibodies and pharmaceutical compositions of the invention are particularly suitable for parenteral administration, i. subcutaneous, intramuscular or intravenous administration. Due to the ongoing development of various new drug release approaches, the pharmaceutical compositions of the invention are also suitable for administration by these new methods, see Langer, Science 249: 1527-1533 (1990).

Blokujúce protilátky proti P-selektínu môžu byť priamo alebo nepriamo kombinované s chemoterapeutickým prostriedkom. Kombinácia, ktorá môže byť získaná všeobecne známymi prostriedkami, by nemala podstatne inhibovat schopnosť imunoglobulínu viazať sa na receptor ani podstatne znižovať aktivitu chemoterapeutického prostriedku. Pre cielené použitie je možné kombinovať rôzne chemoterapeutiká. Napríklad protizápalové prostriedky, ktoré môžu byt kombinované, zahrnujú imunomodulátory, antagonistov faktora aktivácie doštičiek (PAF), inhibítory cyklooxygenázy, inhibítory lipoxygenázy a antagonistov leukotriénov. Niektoré prednostné jednotky zahrnujú cyklosporín A, indometacín, naproxen, FK-506, mykofenolovú kyselinu apod. Podobne sú pri liečbe reperfúzneho poškodenia vhodné antioxidanty, napríklad superoxiddismutáza. Obdobne je možné pre cielenú aplikáciu použiť protirakovinové prostriedky, ako je daunomycín, doxorubicín, vinblastín, bleomycín a pod.Blocking P-selectin antibodies can be directly or indirectly combined with a chemotherapeutic agent. The combination, which may be obtained by means well known in the art, should not substantially inhibit the ability of the immunoglobulin to bind to the receptor or significantly reduce the activity of the chemotherapeutic agent. Various chemotherapeutic agents may be combined for targeted use. For example, anti-inflammatory agents that may be combined include immunomodulators, platelet activation factor (PAF) antagonists, cyclooxygenase inhibitors, lipoxygenase inhibitors, and leukotriene antagonists. Some preferred units include cyclosporin A, indomethacin, naproxen, FK-506, mycophenolic acid and the like. Similarly, antioxidants such as superoxide dismutase are useful in the treatment of reperfusion injury. Similarly, anticancer agents such as daunomycin, doxorubicin, vinblastine, bleomycin and the like can be used for targeted administration.

Cielenie na P-selektín môže byť taktiež uskutočňované pomocou amfipatov čiže molekúl s dvojakým charakterom (polárny-nepolárny), ktoré existujú vo vodnom roztoku ako agregáty. Amfipaty zahrnujú nepoláme lipidy, polárne lipidy, mono- a diglyceridy, sulfatidy, lyzolecitín, fosfolipidy, saponín, žlčové kyseliny a soli. Tieto molekuly môžu existovať ako emulzie a peny, micely, nerozpustné monovrstvy, tekuté kryštály, fosfolipidové disperzie a lamelárne vrstvy. Všetky sa tu všeobecne označujú ako lipozómy. V týchto prípravkoch je liečivo, ktoré má byt uvoíňované, obsiahnuté vo forme časti lipozómu, v ktorom je zabudovaný imunoglobulín proti P-selektínu. V tomto uskutočnení nemusí imunoglobulín viazať funkčný epitop na molekule P-selektínu, dokiaí imunoglobulín účinne zacieíuje lipozóm k molekulám P-selektínu. Ak sú lipo42 zómy privedené do blízkosti napadnutých buniek, uvoľňujú zvolené terapeutické prípravky.Targeting to P-selectin can also be accomplished using amphipaths or molecules of dual nature (polar-non-polar) that exist as aqueous aggregates in aqueous solution. Amphipaths include nonpolar lipids, polar lipids, mono- and diglycerides, sulfatides, lysolecithin, phospholipids, saponin, bile acids and salts. These molecules may exist as emulsions and foams, micelles, insoluble monolayers, liquid crystals, phospholipid dispersions and lamellar layers. All of these are generally referred to herein as liposomes. In these preparations, the drug to be released is contained in the form of a portion of the liposome in which the anti-P-selectin immunoglobulin is incorporated. In this embodiment, the immunoglobulin need not bind a functional epitope on the P-selectin molecule until the immunoglobulin effectively targets the liposome to the P-selectin molecules. When lipo42 zones are brought into proximity to the infected cells, they release selected therapeutic agents.

Pre prípravu lipozómov sú k dispozícii rôzne metódy, opísané napríklad v Szoka a df., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), patentoch US 4,235.871, 4,501.728 a 4,837.028, ktoré sú tu zahrnuté formou odkazu. Cielenie lipozómov s použitím rôznych zacieľovacích prostriedkov (napríklad ligandov, receptorov a monoklonálnych protilátok) je známe, vidf napríklad patenty US 4,957.773 a 4,603.044, ktoré sú tu zahrnuté formou odkazu. Je možné použiť štandardné metódy pre napojenie zacieľovacích prostriedkov k lipozómom. Lipozómy cielené protilátkami môžu byť napríklad konštruované s použitím lipozómov, ktoré zahrnujú proteín A (vidf Renneisen a df. , J. Biol. Chem. 265:16337-16342 (1991) a Leonetti a df., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:2448-2451 (1980).Various methods are available for preparing liposomes, as described, for example, in Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467 (1980), U.S. Pat. Nos. 4,235,871, 4,501,728 and 4,837,028, which are incorporated herein by reference. The targeting of liposomes using various targeting agents (e.g., ligands, receptors, and monoclonal antibodies) is known, see, for example, U.S. Patents 4,957,773 and 4,603,044, which are incorporated herein by reference. Standard methods for linking targeting agents to liposomes can be used. For example, antibody-targeted liposomes can be constructed using liposomes that include protein A (see Renneisen et al., J. Biol. Chem. 265: 16337-16342 (1991) and Leonetti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 2448-2451 (1980).

Farmaceutické prípravky pre parenterálnu aplikáciu obvykle obsahujú roztok terapeutického prostriedku (napríklad protilátky proti P-selektínu (intaktný alebo väzbový fragment alebo fragment P-selektínu)) alebo koktail niekoľkých takých prostriedkov, rozpustených v prijateľnom nosiči, prednostne vodnom. Je možné použiť rôzne vodné nosiče, napríklad vodu, pufrovanú vodu, 0,4% salinický roztok, 0,3% glycín a pod. Tieto roztoky sú sterilné a všeobecne bez častíc. Tieto prípravky môžu byt sterilizované bežnými známymi sterilizačnými technikami. Prípravky môžu obsahovať farmaceutický prijateľné pomocné látky, nutné k aproximácii fyziologických podmienok, ako sú prostriedky pre úpravu pH a pufre, prostriedky pre úpravu tónicity apod., napríklad acetát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, laktát sodný atd. Koncentrácia protilátky v týchto formuláciách sa môže veľmi líšiť, t.j. napríklad od menej než asi 0,5 %, obvykle od alebo aspoň asi 0,1 % do až 1,5 alebo 2,0 % hmotn. a primárne sa volí na základe objemu, viskozity tekutiny atdf. v súlade s konkrétnym zvoleným spôsobom podávania. Súčasné metódy prípravy parenterálne aplikovaných prípravkov sú odborníkom známe alebo zrejmé a podrobne sú opísané napríklad v Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. vyd., Mack Publishing Company, Easton, Pensylvánia (1985), ktorý dokument je tu zahrnutý formou odkazu.Pharmaceutical compositions for parenteral administration typically comprise a solution of a therapeutic agent (e.g., an anti-P-selectin antibody (intact or binding fragment or a P-selectin fragment)) or a cocktail of several such agents dissolved in an acceptable carrier, preferably aqueous. Various aqueous carriers can be used, for example water, buffered water, 0.4% saline, 0.3% glycine and the like. These solutions are sterile and generally free of particles. These compositions may be sterilized by conventional known sterilization techniques. The formulations may contain pharmaceutically acceptable excipients necessary to approximate physiological conditions such as pH adjusters and buffers, tonicity adjusters and the like, for example sodium acetate, sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sodium lactate, etc. The concentration of antibody in these formulations can vary widely, i. for example from less than about 0.5%, usually from or at least about 0.1% to up to 1.5 or 2.0% by weight. and is primarily selected on the basis of volume, fluid viscosity, etc. in accordance with the particular mode of administration chosen. Current methods of preparing parenterally applied formulations are known or obvious to those skilled in the art and are described in detail, for example, in Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1985), the disclosure of which is incorporated herein by reference.

Protilátky podlá vynálezu môžu byť pre skladovanie lyofilizované a pred použitím rekonštituované vo vhodnom nosiči. Táto technika sa ukázala ako účinná u bežných imunoglobulínov a je možné použiť známe metódy lyofilizácie a rekonštitúcie. Lyofilizácia a rekonštitúcia môže viesť k rôznemu stupňu straty aktivity protilátky (napríklad u bežných imunoglobulínov majú protilátky IgM tendenciu k väčšej strate aktivity než protilátky IgG) a môže nastať nutnosť kompenzácie adjustáciou používanej hladiny.The antibodies of the invention may be lyophilized for storage and reconstituted in a suitable carrier prior to use. This technique has been shown to be effective in conventional immunoglobulins and known methods of lyophilization and reconstitution can be used. Lyophilization and reconstitution may lead to varying degrees of antibody activity loss (for example, in conventional immunoglobulins, IgM antibodies tend to lose more activity than IgG antibodies) and may need to be compensated by adjusting the level used.

Prípravky obsahujúce protilátky podlá vynálezu alebo ich koktail môžu byt podávané pri profylaktickom a/alebo terapeutickom ošetrení. V terapeutickej aplikácii sa prípravky pacientovi podávajú v množstve dostatočnom k vyliečeniu alebo aspoň čiastočnému zastaveniu infekcie a jej komplikácií. Množstvo umožňujúce toto dosiahnuť sa definuje ako terapeuticky účinná dávka, účinné množstvo v tomto prípade bude závisieť od vážnosti ochorenia a celkového stavu vlastného imunitného systému pacienta, ale obvykle sa pohybuje od asi 0,05 do asi 5, prednostne medzi asi 0,2 a asi 1,5 mg/kg telesnej hmotnosti.Compositions comprising the antibodies of the invention or a cocktail thereof can be administered in a prophylactic and / or therapeutic treatment. In a therapeutic application, the compositions are administered to a patient in an amount sufficient to cure or at least partially stop the infection and its complications. The amount to achieve this is defined as a therapeutically effective dose, the effective amount in this case will depend on the severity of the disease and the general condition of the patient's own immune system, but usually ranges from about 0.05 to about 5, preferably between about 0.2 and about 1.5 mg / kg body weight.

Látky podlá vynálezu sú všeobecne použiteľné pri vážnych chorobných stavoch, tzn. v situáciách ohrozujúcich alebo potenciálne ohrozujúcich život. V takýchto prípadoch je vzhľadom na minimalizáciu vonkajších látok a nižšiu pravdepodobnosť odmietania cudzích látok (napríklad ΗΑΜΆ), dosahovanú ľudskými alebo humanizovanými formami protilátok podľa vynálezu, možné a môže byť ošetrujúcim lekárom pociťované ako žiadúce podávať tieto protilátky v podstatnom prebytku.The compounds of the invention are generally useful in severe disease states, i. in life-threatening or potentially life-threatening situations. In such cases, due to the minimization of extraneous substances and the lower likelihood of rejection of foreign substances (e.g., ΗΑΜΆ) achieved by the human or humanized forms of the antibodies of the invention, it is possible and may be felt by the attending physician to administer these antibodies in substantial excess.

V profylaktickej aplikácii sa prípravky obsahujúce protilátky podľa vynálezu alebo ich koktail podávajú pacientovi, ktorý ešte nie je v stave choroby, ku zvýšeniu jeho odolnosti. Takéto množstvo sa definuje ako profylaktický účinná dávka. V tomto prípade presné množstvo opäť závisí od zdravotného stavu pacienta a celkovej hladiny imunity, ale všeobecne je vo vyššie uvedených medziach.In a prophylactic application, the compositions comprising the antibodies of the invention or a cocktail thereof are administered to a patient who is not yet in a disease state to increase their resistance. Such an amount is defined as a prophylactically effective dose. In this case, the exact amount again depends on the patient's medical condition and overall immunity level, but is generally within the above limits.

Jednorazová alebo viacnásobná aplikácia prípravkov môže byť uskutočňovaná na základe stanovenia veľkosti dávky a schémy užívania ošetrujúcim lekárom. V každom prípade by farmaceutické formulácie mali poskytovať množstvo imunoglobulínov podľa vynálezu, dostatočné k účinnému ošetreniu pacienta.Single or multiple administrations of the formulations may be made based on the determination of the dose size and the schedule of use by the attending physician. In any case, the pharmaceutical formulations should provide a plurality of immunoglobulins of the invention sufficient to effectively treat the patient.

Protilátky podľa vynálezu (celé a ich väzbové fragmenty) a fragmenty P-selektínu môžu byt taktiež používané na diagnostické účely. Množstvo dostatočné pre tieto účely sa definuje ako diagnosticky účinná dávka. Presné množstvo pri diagnostickom použití bude závisieť od zdravotného stavu pacienta, spôsobu aplikácie a pod. Protilátky môžu byť bud značené alebo neznačené. Neznačené protilátky môžu byť používané v kombinácii s ďalšími značenými protilátkami (druhé protilátky), ktoré s protilátkou reagujú, ako sú protilátky špecifické pre konkrétnu konštantnú oblasť imunoglobulínu. Alternatívne môžu byť protilátky značené priamo. Môžu byť používané rôzne druhy značení, ako sú rádionuklidy, fluorescenčné činidlá, enzýmy, enzýmové substráty, enzýmové kofaktory, enzýmové inhibítory, ligandy (predovšetkým haptény).The antibodies of the invention (whole and binding fragments thereof) and P-selectin fragments can also be used for diagnostic purposes. An amount sufficient for these purposes is defined as a diagnostically effective dose. The exact amount for diagnostic use will depend on the patient's medical condition, route of administration, and the like. The antibodies may be either labeled or unlabeled. Unlabeled antibodies can be used in combination with other labeled antibodies (second antibodies) that react with the antibody, such as antibodies specific for a particular immunoglobulin constant region. Alternatively, the antibodies can be labeled directly. Various types of labels may be used, such as radionuclides, fluorescent agents, enzymes, enzyme substrates, enzyme cofactors, enzyme inhibitors, ligands (especially hapten).

Protilátky (celé a väzbové fragmenty) sú použiteľné na detekciu prítomnosti buniek nesúcich receptor P-selektínu. Prítomnosť týchto buniek diagnostikuje zápalový stav alebo ochorenie a môže signalizovať nutnosť zahájenia vyššie opísanej terapeutickej metódy. Diagnózu je možné stanoviť po odobratí vzorky pacientovi. Potom sa stanoví množstvo exprimova45 ného receptora P-selektínu v jednotlivých bunkách vzorky, napríklad imunohistochemickým farbením fixovaných buniek alebo westernovým prenosom bunkového extraktu s protilátkou podlá vynálezu. Fragmenty P-selektínu sú použitelné na monitorovanie prítomnosti aktivovaných neutrofilov, ktorá môže indikovať nežiadúcu imunitnú odpoveď.Antibodies (whole and binding fragments) are useful for detecting the presence of cells bearing the P-selectin receptor. The presence of these cells diagnoses an inflammatory condition or disease and may indicate the need to initiate a therapeutic method as described above. Diagnosis can be made after the patient has been sampled. The amount of expressed P-selectin receptor expressed in the individual cells of the sample is then determined, for example by immunohistochemical staining of fixed cells or by western blotting of the cell extract with the antibody of the invention. P-selectin fragments are useful for monitoring the presence of activated neutrophils that may indicate an undesired immune response.

Diagnózu je možné stanovovať taktiež podávaním značenej protilátky in vivo (prednostne humanizovanéj alebo ludskej protilátky) a detekciou zobrazovaním in vivo. Koncentrácia podávaného MAb by mala dostačovať na to, aby väzba na bunky, obsahujúce cielový antigén, bola detegovatelná oproti signálu pozadia. Diagnostické činidlo môže byť značené rádioizotopom pre zobrazovanie kamerou alebo paramagnetickým rádioizotopom pre zobrazovanie magnetickou rezonanciou alebo elektrónovou spinovou rezonanciou.The diagnosis can also be made by administering the labeled antibody in vivo (preferably a humanized or human antibody) and detecting in vivo imaging. The concentration of MAb administered should be sufficient for binding to cells containing the target antigen to be detectable against the background signal. The diagnostic agent may be labeled with a radioisotope for imaging with a camera or with a paramagnetic radioisotope for imaging with magnetic resonance or electron spin resonance.

Zmena (typicky zvýšenie) hladiny proteínu P-selektínu v bunkovej vzorke alebo v zobrazení jedinca, ktorá je mimo rozsahu klinicky stanovených normálnych hladín, môže indikovať prítomnosť nežiadúcej zápalovej reakcie u jedinca, od ktorého bola vzorka získaná, a/alebo predispozíciu jedinca k vývinu (alebo rozvíjaniu) takejto reakcie. P-selektín môže byť použitý taktiež ako rozlišovací markér na identifikáciu a typizáciu buniek určitých rodín a počiatkov vývoja. Táto typovo špecifická detekcia môže byť použitá na histopatologickú diagnózu nežiadúcich imunitných odpovedí.A change (typically an increase) in the level of P-selectin protein in a cell sample or in an individual image that is outside the range of clinically determined normal levels may indicate the presence of an adverse inflammatory response in the subject from which the sample was obtained and / or a predisposition of the individual to develop. or developing) such a reaction. P-selectin can also be used as a distinguishing marker for identifying and typing cells of certain families and origins of development. This type-specific detection can be used for the histopathological diagnosis of adverse immune responses.

Pre použitie s protilátkami podlá vynálezu je taktiež možné dodávať súpravy. Môžu obsahovať prípravok na báze protilátky podlá vynálezu, obvykle v lyofilizovanej forme v obale, buď samotný alebo v kombinácii s ďalšími protilátkami, špecifickými pre požadovaný bunkový typ. Protilátky, ktoré môžu byť vo forme konjugátu so značiacou látkou alebo s toxínom alebo nekonjugované, sú v súprave zahrnuté s puframi, ako je Tris, fosfátový, karbonátový atď., stabilizátormi, biocíd46 mi, inertnými proteínmi, napríklad sérovým albumínom a pod. a návodom na použitie. Všeobecne sú tieto látky prítomné v množstve menej než asi 5 % hmotn., vztiahnuté na množstvo účinnej protilátky, a obvykle sú prítomné v celkovom množstve aspoň asi 0,001 % hmotn., vztiahnuté na koncentráciu protilátky. Často je žiadúca prítomnosť inertného nadstavovadla alebo vehikulu na zriedenie účinných zložiek, ktoré môže byť prítomné v množstvo asi 1 až 99 % hmotn. z celkového prípravku. Pokial sa v teste používa druhá protilátka schopná viazať sa na protilátku k P-selektínu, je druhá protilátka obvykle v oddelenej fľaštičke. Druhá látka je typicky konjugovaná so značiacou látkou a upravovaná vyššie opísaným spôsobom.Kits can also be supplied for use with the antibodies of the invention. They may contain the antibody-based preparation of the invention, usually in lyophilized form in a container, either alone or in combination with other antibodies specific for the desired cell type. Antibodies, which may be in the form of a conjugate with a labeling agent or a toxin or unconjugated, are included in the kit with buffers such as Tris, phosphate, carbonate, etc., stabilizers, biocides, inert proteins such as serum albumin and the like. and instructions for use. Generally, they are present in an amount of less than about 5% by weight, based on the amount of active antibody, and usually present in a total amount of at least about 0.001% by weight, based on the antibody concentration. Often, the presence of an inert extender or vehicle for diluting the active ingredients, which may be present in an amount of about 1 to 99% by weight, is desirable. of the total preparation. When a second antibody capable of binding to an antibody to P-selectin is used in the assay, the second antibody is usually in a separate vial. The second agent is typically conjugated to a labeling agent and treated as described above.

Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Vynález je ozrejmený, avšak nie obmedzený, pomocou príkladov uskutočnenia.The invention is illustrated, but not limited, by way of examples.

Príklad 1Example 1

PrÍDrava činidielPREPARATION OF REAGENTS

Tento príklad opisuje prípravu alebo izoláciu činidiel, použitých na imunizáciu v príkladoch 2 a 3 a na analýzu ELISA v príklade 4.This example describes the preparation or isolation of reagents used for immunization in Examples 2 and 3 and for ELISA analysis in Example 4.

A. STARÉ DOŠTIČKYA. OLD PLATES

Príprava doštičiek, ktoré boli prečistené zo starých doštičiek, získaných z krvnej banky v San Diegu. Bola použitá modifikácia metódy, opísanej v Moore ad., J. Celí. Biol. 112:491-499 (1991), ktorá je tu zahrnutá formou odkazu. Stručne povedané spočíva v tom, že sa 25 jednotiek starej plazmy, bohatej na doštičky, podrobí dvakrát po 10 min od47 stredeniu pri otáčkach 1200 min^-1 (300 g), aby sa odstránili kontaminujúce nedoštičkové krvné bunky. Prečistený doštičkový preparát bol potom trikrát premytý pufrom obsahujúcim 0,1 M NaCl, 20 mM Tris a 5 mM benzamidínu. Ďalej obsahoval 3,8 % citrátu sodného. Hodnota pH bola pomocou IM HCI upravená naPreparation of platelets that have been cleaned from old platelets obtained from a blood bank in San Diego. A modification of the method described in Moore et al., J. Cell. Biol. 112: 491-499 (1991), which is incorporated herein by reference. Briefly, 25 units of old, platelet-rich plasma are subjected to a concentration of 1200 min ^-1 (300 g) twice after 10 min from47 at 300 rpm to remove contaminating non-platelet blood cells. The purified plate preparation was then washed three times with buffer containing 0.1 M NaCl, 20 mM Tris and 5 mM benzamidine. It also contained 3.8% sodium citrate. The pH was adjusted to pH 1 with 1M HCl

7,5. Prečistené doštičky boli skladované pri 70 °C a pred injekciou premyté jeden raz v PBS.7.5. Purified plates were stored at 70 ° C and washed once in PBS before injection.

B. ČISTENÝ P-SELEKTÍNB. PURIFIED P-SELECTINE

Frakcionácia doštičiek:Platelet fractionation:

Premyté staré doštičky boli frakcionované v podstate podía Moorea a d., 1991, vid vyššie; 25 jednotiek doštičiek bolo upravených na 100 μΜ v leupeptíne a 1 mM v 4-(2-aminoetyl)-benzénsulfonylfluoride (AEBSF), trikrát zmrazených a roztavených v suchom íade/metanole a homogenizovaných desiatimi rázmi homogenizéra Dounce. Suspenzia sa potom centrifugovala 60 min pri otáčkach 35000 min¹ pri 4 C v odstredivke Beckman Ti 70 rotor. Získaný supernatant bol východiskovým materiálom pre čistenie rozpustného P-selektínu. Peleta bola resuspendovaná v 1 mM MnCl₂, 1 mM CaCl₂, 5 mM benzamidín-HCl, 0,lM NaCl, 20 mM Tris, 2% Triton X-100, pH 7,5, homogenizovaná lOkrát homogenizérom Dounce a inkubovaná 1 h pri 4 °C. Suspenzia potom bola centrifugovaná i h pri 4 °c a otáčkach 35000 min¹ v zariadení Beckman Ti 70 rotor. Supernatant bol východiskovým materiálom pre izoláciu membránovo viazaného P-selektínu.The washed old plates were fractionated essentially according to Moore et al., 1991, supra; 25 unit plates were adjusted to 100 μ uprav in leupeptin and 1 mM in 4- (2-aminoethyl) -benzenesulfonyl fluoride (AEBSF), frozen three times and melted in dry ice / methanol and homogenized with ten shocks of a Dounce homogenizer. The suspension was then centrifuged for 60 minutes at a speed of 35000 min ¹ at 4 C in a Beckman Ti 70 rotor. The supernatant obtained was the starting material for the purification of soluble P-selectin. The pellet was resuspended in 1 mM MnCl ₂ , 1 mM CaCl ₂ , 5 mM benzamidine-HCl, 0.1 M NaCl, 20 mM Tris, 2% Triton X-100, pH 7.5, homogenized 10 times with a Dounce homogenizer and incubated for 1 h at Low: 14 ° C. The suspension then was centrifuged at 4 H CA 35000 rpm ¹ min in a Beckman Ti 70 rotor. The supernatant was the starting material for the isolation of membrane-bound P-selectin.

Izolácia P-selektínu z frakcionovanvch doštičiek:Isolation of P-selectin from fractionated plates:

Rozpustný a membránovo viazaný P-selektín potom boli oddelene čistené niektorými alebo všetkými z ďalej uvedených postupov. Pre izoláciu membránovo viazanej formy P-selektínu bol vo všetkých pufroch zahrnutý neiónový detergent Rennex 30 (Accurate Chemical and Scientific Corp.) v koncentráciiThe soluble and membrane bound P-selectin was then separately purified by some or all of the following procedures. To isolate the membrane bound form of P-selectin, a non-ionic Rennex 30 detergent (Accurate Chemical and Scientific Corp.) was included in all buffers at a concentration of

0,1 %. Všetky pufre tiež obsahovali 1 mM CaCl₂ a 1 mM MnCl₂. Frakcie, obsahujúce P-selektín, boli detegované westernovým prenosom s monoklonálnou protilátkou PNB1.6.0.1%. All buffers also contained 1 mM CaCl ₂ and 1 mM MnCl ₂ . Fractions containing P-selectin were detected by Western blotting with the monoclonal antibody PNB1.6.

Chromatoarafia šošovicového lektínu:Lentil lectin chromatography:

Supernatant rozpustného P-selektínu alebo detergentový extrakt membránovo viazaného P-selektínu z 25 jednotiek doštičiek bol vnesený na stĺpec (1,5 x 5,5 cm) lektínu z Lens culinaris (šošovicový lektín), naviazaného na Sepharose 4B (Sigma Chemical Co., L-0511). Stĺpec bol potom premytý 150 ml 20 mM Tris, O,1M NaCI, pH 7,5. Naviazané glykoproteíny boli zo stĺpca vymývané 10 x alikvotmi po 3 ml 20 mM Tris, 0,5M NaCI, 0,5M α-metyl-D-manopyranozid, pH 7,5. Frakcie, obsahujúce P-selektín, boli v zariadení Amicon Centriprep 30 skoncentrované na 1,5 až 2 ml.The soluble P-selectin supernatant or the membrane-bound P-selectin detergent extract from 25 units of platelets was applied to a column (1.5 x 5.5 cm) of Lens culinaris (Lentil Lectin) lectin bound to Sepharose 4B (Sigma Chemical Co., L-0511). The column was then washed with 150 mL of 20 mM Tris, 0.1 M NaCl, pH 7.5. Bound glycoproteins were eluted from the column by 10 x aliquots of 3 ml 20 mM Tris, 0.5 M NaCl, 0.5 M α-methyl-D-manopyranoside, pH 7.5. The P-selectin-containing fractions were concentrated to 1.5-2 ml in an Amicon Centriprep 30.

Gélová filtračná chromátoarafia:Gel Filter Chromatography:

Koncentrované frakcie z chromatografie šošovicového lektínu boli nastreknuté do HPLC kolóny Toso Haas G3000 SW (21,5 mm x 30 cm), ekvilibrovanej 20 mM Tris, 0,lM NaCI, pHConcentrated fractions from lentil lectin chromatography were injected onto a Toso Haas G3000 SW HPLC column (21.5 mm x 30 cm) equilibrated with 20 mM Tris, 0.1M NaCl, pH

7,5. Kolóna bola eluovaná rovnakým pufrom s prietokom 0,75 ml/min, boli zachytávané frakcie (1,5 ml) a analyzované westernovým prenosom. Frakcie obsahujúce P-selektín boli spojené a skoncentrované v zariadení Amicon Centriprep 30 na 1,5 až 2 ml, načo bol niekoíkokrát vymenený pufer za 20 mM Tris, pH7.5. The column was eluted with the same buffer at a flow rate of 0.75 ml / min, fractions were collected (1.5 ml) and analyzed by western blotting. Fractions containing P-selectin were pooled and concentrated in Amicon Centriprep 30 to 1.5 to 2 ml, after which the buffer was changed several times to 20 mM Tris, pH

7,5.7.5.

Heoarin-aaarózová chromátoqraf ia:Heoarin-aaarose chromatography:

Vzorka v 20 mM Tris, pH 7,5, bola nanesená na 1 ml stĺpca heparín-agarózy, stĺpec bol premytý rovnakým pufrom a eluovaný 20 mM Tris, 1,5M NaCI, pH 7,5.A sample in 20 mM Tris, pH 7.5, was loaded onto a 1 ml heparin-agarose column, the column was washed with the same buffer and eluted with 20 mM Tris, 1.5 M NaCl, pH 7.5.

Aniónová vvmenná chromatografia:Anion exchange chromatography:

Frakcie boli dialyzované do 20 mM Tris, pH 7,5 a nastreknuté do kolóny Toso Haas DEAE-5PW (7,5 mm x 7,5 cm), ktorá bola ekvilibrovaná 20 mM Tris, pH 7,5, a eluovaná soľným gradientom do IM NaCl. Frakcie obsahujúce P-selektín boli spojené a skoncentrované na zariadení Amicon Centriprep-30 a skladované pri -80 °C.Fractions were dialyzed to 20 mM Tris, pH 7.5 and injected onto a Toso Haas DEAE-5PW column (7.5 mm x 7.5 cm) which was equilibrated with 20 mM Tris, pH 7.5, and eluted with a salt gradient to IM NaCl. The P-selectin containing fractions were pooled and concentrated on an Amicon Centriprep-30 and stored at -80 ° C.

Katiónová vvmenná chromatoorafia:Cation exchange chromatography:

Vzorky boli dialyzované do 10 mM fosfát, pH 7, a nastreknuté na poréznu kolónu CM/P, ktorá bola ekvilibrovaná v rovnakom pufre a eluovaná soľným gradientom do IM NaCl.Samples were dialyzed to 10 mM phosphate, pH 7, and injected onto a porous CM / P column that was equilibrated in the same buffer and eluted with a salt gradient to 1 M NaCl.

C. IZOLÁCIA A AKTIVÁCIA ČERSTVÝCH ĽUDSKÝCH DOŠTIČIEKC. Isolation and activation of fresh human platelets

Všetky chemikálie, používané počas postupu izolácie doštičiek, boli získané od Sigma Chemical Company, St. Louis, MO.All chemicals used during the platelet isolation process were obtained from Sigma Chemical Company, St. Petersburg. St. Louis, MO.

1. Ľudskému dobrovoľnému darcovi bolo odobraté 42 ml krve do injekčnej striekačky obsahujúcej 7 ml antikoagulantu ACD (kyslý citrát-dextróza).1. 42 ml of blood was drawn from a human voluntary donor into a syringe containing 7 ml of ACD (acid citrate-dextrose) anticoagulant.

PrÍDrava antiaoakulanl-n ACD dextróza 2,0 g citrát sodný 2,49 g kyselina citrónová 1,25 g destilovaná voda do 100 mlPREPARATION antiaoakulanin-n ACD dextrose 2.0 g sodium citrate 2.49 g citric acid 1.25 g distilled water to 100 ml

2. Ihla bola oddialená a krv bola prenesená do dvoch sterilných skúmaviek po 50 ml.2. The needle was removed and the blood was transferred to two 50 ml sterile tubes.

3. Skúmavky boli centrifugované v odstredivke IECC-6000, vybavenej hlavou 921 (polomer 17,2 cm) pri otáčkach 800 min’¹ (približne 90 g) po dobu 15 min pri teplote miestnosti s prerušením.3. The tubes were centrifuged in a centrifuge IECC-6000, equipped with a 921 head (radius 17.2 cm) at a speed of 800 min ^-1 (approximately 90 g) for 15 minutes at room temperature to the suspension.

4. Supernatant bol odobraný plastovou pipetou. Supernatant bol odoberaný čo najbližšie k vrstve buniek.4. The supernatant was collected with a plastic pipette. The supernatant was collected as close to the cell layer as possible.

5. Supernatant bol centrifugovaný 6 min pri otáčkach 1200 min¹ (pribi. 300 g).5. The supernatant was centrifuged for 6 minutes at a speed of 1200 ^min-1 (aprox. 300 g).

6. Supernatant bol odobraný.6. The supernatant was collected.

7. Supernatant bol centrifugovaný 10 min pri otáčkach 2000 min^-1 (približne 1200 g). Doštičky sa objavili ako bunková zátka na dne skúmavky. Supernatant bol kanalizovaný.7. The supernatant was centrifuged 10 min at 2000 ^min-1 (approximately 1200 g). Plates appeared as a cell plug at the bottom of the tube. The supernatant was drained.

8. Doštičky boli premývané týmto spôsobom: boli pridané 2 ml pufru Tyrode-Hepes pH 6,5, obsahujúceho prostaglandín Ej (PGEj) v konečnej koncentrácii 100 nM, a doštičky boli opatrne resuspendované. Bolo pridaných ďalších 10 ml rovnakého pufru a vzorka bola 10 min centrifugovaná pri otáčkach 3000 min¹.8. Plates were washed as follows: 2 ml of Tyrode-Hepes pH 6.5 buffer containing prostaglandin Ej (PGE 3) at a final concentration of 100 nM was added, and the plates were carefully resuspended. Add another 10 ml of the same buffer, and the sample was centrifuged for 10 minutes at 3,000 min ^1st

Príprava Dufru Tyrode-HepesPreparation Dufru Tyrode-Hepes

NaCl 8,0 gNaCl 8.0 g

KC1 0,2 gKCl 0.2 g

NaH₂PO_4>H₂O 0,057 gNaH ₂ PO _4> H ₂ O 0.057 g

MgCl₂.6H₂O 0,184 gMgCl ₂ .6H ₂ O 0.184 g

NaHCO₃ o,1 g dextróza 1,0 gNaHCO ₃ 0.1 g dextrose 1.0 g

HEPES 2,383 g destilovaná voda do 11HEPES 2,383 g distilled water until 11

IN NaOH pre úpravu pH na 6,51N NaOH to adjust pH to 6.5

9. 8. krok bol ešte raz opakovaný a potom boli doštičky premyté jeden raz tým istým pufrom bez PGEj.Step 9 was repeated once more and then the plates were washed once with the same buffer without PGE 3.

10. Doštičky boli spočítané na prístroji Coulter Counter a zriedené na 2.10®/ml.10. Plates were counted on a Coulter Counter and diluted to 2.10 ® / ml.

11. pH suspenzie doštičiek bolo upravené na 7,2 a bolo stanovené množstvo trombínu (ludský trombín - Sigma,, nutné k maximálnej aktivácii. Existuje určitá variácia donorov, ale optimálna aktivácia sa obvykle dosiahne v rozmedzí 0,25 až 0,5 jednotiek/ml. Maximálna aktivácia, t.j. maximálna trombínom vyvolaná agregácia, zdá sa, zodpovedá maximálnej expresii P-selektínu.11. The pH of the platelet suspension was adjusted to 7.2 and the amount of thrombin (human thrombin - Sigma) required for maximal activation was determined. There is some variation of donors, but optimal activation is usually achieved in the range of 0.25 to 0.5 units / The maximal activation, ie the maximum thrombin-induced aggregation, appears to correspond to the maximal expression of P-selectin.

12. K doštičkovému preparátu bolo pridané požadované množstvo trombínu a zmes bola ponechaná 20 min pri teplote miestnosti bez miešania, aby sa zabránilo agregácii.12. The required amount of thrombin was added to the plate preparation and the mixture was left at room temperature for 20 min without stirring to prevent aggregation.

2.Second

Príklad 2Example 2

Príprava blokuήúcei protilátky proti P-selektínuPreparation of blocking anti-P-selectin antibody

Tento príklad opisuje prípravu mu MAb PB1.3, tj. monoklonálnej protilátky k P-selektínu, ktorá inhibuje väzbu trombínom aktivovaných doštičiek na neutrofily.This example describes the preparation of mu MAb PB1.3, i. a monoclonal antibody to P-selectin that inhibits the binding of thrombin-activated platelets to neutrophils.

Ako zdroj buniek produkujúcich protilátku bol použitý jeden myší samec RBF/DnJ, získaný od Jackson Laboratories, a bol imunizovaný podlá nasledujúceho plánu (všetky injekcie boli podávané intraperitoneálne):One male RBF / DnJ mouse, obtained from Jackson Laboratories, was used as the source of antibody producing cells and was immunized according to the following schedule (all injections were administered intraperitoneally):

1. Mesiac 1 - 200 μΐ zhluknutých starých doštičiek” obsahujúcich približne 6.10⁹ doštičiek.1. Month of 1 - 200 μ starých agglomerated old platelets ”containing approximately 6.10 ⁹ platelets.

Mesiac 2 - 250 μΐ zhluknutých starých doštičiek (8.10⁹ doštičiek).Month 2 - 250 μΐ clumped old platelets (8.10 ⁹ platelets).

3. Mesiac 4 - 250 μΐ zhluknutých starých doštičiek (8.10⁹ doštičiek).3. Month 4 - 250 μΐ clumped old platelets (8.10 ⁹ platelets).

4. Mesiac 5 - rozpustná frakcia P-selektínu, izolovaná na šošovicovom lektíne.4. Month 5 - soluble fraction of P-selectin isolated on lentil lectin.

5. Mesiac 6 - rozpustný P-selektín, čistený šošovicovým lektínom, gélovou filtráciou, heparín-agarózou a iónovo výmennou chrómatografiou.5. Month 6 - soluble P-selectin, purified by lentil lectin, gel filtration, heparin-agarose and ion-exchange chromatography.

Podrobnosti ohľadne prípravy všetkých činidiel, použitých pre imunizáciu, sú uvedené v príklade 1.Details of the preparation of all reagents used for immunization are given in Example 1.

A. MYELÓMOVÁ FÚZNA BUNKOVÁ LÍNIAA. MYELOMA FUSION CELL LINE

FOX-NY, myšia myelómová bunková línia, deficitná na adenozínfosforibozyltransferázu (APRT) a hypoxantínfosforibozyltransferázu (HPRT), bola získaná z American Type Culture Collection (CRL 1732) a udržovaná v RPMI 1640 s obsahom 10 % fetálneho hovädzieho séra (Hyclone) a 1 % L-glutamínu.FOX-NY, an adenosine phosphoribosyltransferase (APRT) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT) deficient mouse myeloma cell line, was obtained from the American Type Culture Collection (CRL 1732) and maintained in RPMI 1640 containing 10% fetal 1% bovine and fetal bovine% L-glutamine.

B. POSTUP FÚZIE BUNIEKB. CELL MERGER PROCEDURE

Po štyroch dňoch po konečnej injekcii bola vybraná sleziQ na a bolo získaných 1,2.10 splenocytov. Tie boli podrobené fúzii s myelómovými bunkami FOX-NY s použitím PEG 1500(BMB) podľa tohto protokolu: Izolované splenocyty boli dvakrát premyté v kultivačnom médiu, neobsahujúcom sérum. Splenocyty a myelómové bunky boli kombinované v pomere 1:4,8 (myelómové bunky ku splenocytom). Peleta kombinovaných buniek bola premytá dvakrát médiom prostým séra a potom odsávaním vysušená dosucha. Potom bola peleta buniek miernym poklepom resuspendovaná a zahrievaná 1 min na vodnom kúpeli pri 37 °C. Peleta bola distribuovaná pozdĺž stien a dna 50 ml kónickej odstredivkovej skúmavky. Počas 60 s bol za miešania k udržaniu tenkej vrstvy buniek pridaný 1 ml PEG 1500 (50 % hmotnosť/objem v 75mM HEPES, lot BMB 14702800), vopred zahriateho na 37 °C. Počas 60 s bol pomaly pridaný 1 ml média neobsahujúceho sérum. Ďalší 1 ml bol pridaný o niečo rýchlejšie. Bolo pridaných ďalších 8 ml média a skúmavka sa ponechala nerušene stáť 8 min a potom bola 5 min centrifugovaná pri 300 g. Konečná peleta bola resuspendovaná v RPMI 1640 s obsahom 10 % fetálneho hovädzieho séra (Hyclone), 1 % L-glutamínu, 1 % pyruvátu sodného a lxAAT (Sigma). Bunky boli naočkované na 10 96jamkových mikrotitračných platní s plochým dnom (COSTAR). Neboli použité žiadne doplnkové bunky.Four days after the final injection, the spleen was removed to obtain 1.2.10 splenocytes. These were fused to myeloma FOX-NY cells using PEG 1500 (BMB) according to the following protocol: Isolated splenocytes were washed twice in serum-free culture medium. Splenocytes and myeloma cells were combined at a ratio of 1: 4.8 (myeloma cells to splenocytes). The combined cell pellet was washed twice with serum-free medium and then aspirated to dryness. The cell pellet was then resuspended by gentle tapping and heated in a water bath at 37 ° C for 1 min. The pellet was distributed along the walls and bottom of a 50 ml conical centrifuge tube. 1 ml of PEG 1500 (50% w / v in 75 mM HEPES, lot BMB 14702800), pre-heated to 37 ° C, was added over 60 s with stirring to maintain a thin cell layer. 1 ml of serum-free medium was slowly added over 60 s. Another 1 ml was added a little faster. An additional 8 ml of medium was added and the tube was allowed to stand undisturbed for 8 min and then centrifuged at 300 g for 5 min. The final pellet was resuspended in RPMI 1640 containing 10% fetal bovine serum (Hyclone), 1% L-glutamine, 1% sodium pyruvate and 1xAAT (Sigma). Cells were plated in 10 96 well flat bottom microtiter plates (COSTAR). No supplemental cells were used.

Príklad 3Example 3

PrÍDrava neblokuiúcei Drotilátkv nroti P-selektínuPREPARATION OF NON-BLOCKING DROTATES AGAINST P-SELECTINE

Tento príklad opisuje prípravu monoklonálnej protilátky mu MAb PNB1.6 proti P-selektínu, ktorá neinhibuje väzbu trombínom aktivovaných doštičiek na neutrofily.This example describes the preparation of the monoclonal antibody mu MAb PNB1.6 against P-selectin, which does not inhibit the binding of thrombin-activated platelets to neutrophils.

Ako zdroj buniek, produkujúcich protilátku, bol použitý jeden myší samec RBF/DnJ, získaný od Jackson Laboratories, a bol imunizovaný podlá nasledujúceho plánu (všetky injekcie boli podávané intraperitoneálne):One male RBF / DnJ mouse, obtained from Jackson Laboratories, was used as the source of antibody producing cells and was immunized according to the following schedule (all injections were administered intraperitoneally):

1. Mesiac 1 - 100 μΐ trombínom aktivovaných čerstvo izolovaných doštičiek (približne 3.10⁹ doštičiek).1. Month 1 - 100 μΐ of thrombin-activated freshly isolated platelets (approximately 3.10 ⁹ platelets).

2. Mesiac 2 - 200 μΐ trombínom aktivovaných čerstvých doštičiek (6.10⁹ doštičiek).2. Month 2 - 200 μΐ thrombin activated fresh platelets (6.10 ⁹ platelets).

3. Mesiac 4 - 100 μΐ trombínom aktivovaných čerstvých doštičiek (3.10⁹ doštičiek).3. Month 4 - 100 μΐ thrombin activated fresh platelets (3.10 ⁹ platelets).

Po štyroch dňoch po konečnej injekcii bola odobraná slezina a získané splenocyty. Boli podrobené fúzii s myelómovými bunkami FOX-NY s použitím PEG 1500 (Sigma), všeobecne ako je opísané v Oi a ď., Immunoglobulin-Producing Hybrid Celí Lines v Selected Methods in Cellular Immunology, ed. Mishell a Shiigi, str. 351-372, 1980, ktorý dokument je tu zahrnutý formou odkazu.Four days after the final injection, the spleen and splenocytes were removed. They were fused to FOX-NY myeloma cells using PEG 1500 (Sigma), generally as described in Oi et al., Immunoglobulin-Producing Hybrid Cell Lines in Selected Methods in Cellular Immunology, ed. Mishell and Shiigi, p. 351-372, 1980, which document is incorporated herein by reference.

Príklad 4Example 4

Snreenino na DrotilátkuSnreenino on Drotter

Tento príklad opisuje screening supernatantových médií z fúzovaných buniek, produkovaných v príkladoch 2 a 3. Supernatanty z príkladu 2 boli testované analýzou ELISA proti (a) trombínom aktivovaným doštičkám, (b), čistenémuThis example describes the screening of supernatant media from fused cells produced in Examples 2 and 3. The supernatants of Example 2 were tested by ELISA against (a) thrombin activated platelets, (b) purified

P-selektínu a (c) rekombinačnému P-selektínu. Supernatanty z príkladu 2 boli testované analýzou ELISA proti trombínom aktivovaným doštičkám. Všetky tieto testy sú ďalej opísané. Príprava činidiel, použitých v jednotlivých testoch, je opísaná v príklade l.P-selectin; and (c) recombinant P-selectin. The supernatants of Example 2 were tested by ELISA against thrombin-activated platelets. All of these tests are described below. The preparation of reagents used in the individual assays is described in Example 1.

A. TROMBÍNOM AKTIVOVANÉ DOŠTIČKYA. Thrombin Activated Plates

1. 96jamková platňa s plochým dnom COSTAR bola potiahnutá1. A 96-well flat bottom COSTAR plate was coated

0,1 % želatíny (2% želatína - Sigma) prídavkom 100 μΐ/jamku a inkubáciou po dobu 15 min pri 37 °C.0.1% gelatin (2% gelatin - Sigma) by the addition of 100 μΐ / well and incubation for 15 min at 37 ° C.

2. Želatína bola odstránená a do každej jamky bolo pridaných2. Gelatin was removed and added to each well

100 μΐ trombínom aktivovaných doštičiek (10⁸/ml).100 μΐ thrombin-activated platelets (10 ⁸ / ml).

3. Platňa bola inkubovaná 15 min pri 37 °C.3. Incubate the plate at 37 ° C for 15 min.

4. Platňa bola odstreďovaná 2 min pri otáčkach 800 min^-1.4. The plate was centrifuged for 2 minutes at a speed of 800 min ^-1.

5. Nenaviazané doštičky boli odstránené a platňa bola premytá 2x PBS.5. Unbound plates were removed and the plate was washed 2x with PBS.

6. Do každej jamky bolo pridaných 100 μΐ PBS s obsahom 1 % BSA a platňa sa nechala stáť pri teplote miestnosti po dobu 60 min.6. Add 100 µl of PBS containing 1% BSA to each well and allow the plate to stand at room temperature for 60 min.

7. Do každej jamky bolo pridaných 100 μΐ supernatantu. Platňa bola na 60 min pri teplote miestnosti umiestnená na trepačku.7. Add 100 μΐ of supernatant to each well. The plate was placed on a shaker for 60 min at room temperature.

8. Platňa bola premytá 4x PBS.8. Wash plate 4 times with PBS.

9. Do každej jamky bolo pridaných 100 μΐ peroxidázového konjugátu kozieho anti-myšieho IgG zriedeného 1/1000 v PBS s obsahom 1 % BSA. Platňa bola ponechaná 30 min pri teplote miestnosti.9. Add 100 μΐ of goat anti-mouse IgG peroxidase conjugate diluted 1/1000 in PBS containing 1% BSA to each well. The plate was left at room temperature for 30 min.

10. Platňa bola premytá 7x PBS.10. Wash plate 7x with PBS.

11. Do každej jamky bolo pridaných 100 μΐ substrátového systému ABTS (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.).11. Add 100 μΐ ABTS substrate system (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.) to each well.

12. Platňa bola vyvíjaná pri teplote miestnosti po dobu až 30 min.12. The plate was developed at room temperature for up to 30 min.

13. Na prístroji Titertek Multiskan MCC/340 bolo uskutočnené meranie OD pri 414 nm.13. OD measurement at 414 nm was performed on a Titertek Multiskan MCC / 340.

B. ČISTENÝ P-selektínB. Purified P-selectin

1. Rozpustný alebo membránovo viazaný P-selektín, izolovaný chromatografiou na šošovicovom lektíne, gélovou filtráciou a kolónami DEAE, bol zriedený (1:50 až 1:1000) v DPBS (Dulbeccov fosfátom pufrovaný salinický roztok je fosfátom pufrovaný salinický roztok (PBS) s obsahom CaCl₂ (1 mM) a MgSO₄ (0,5 mM)) a na noc zakrytý pri 4 °C na 96jamkových mikrotitračných platniach Falcon.1. Soluble or membrane-bound P-selectin, isolated by Lactin Chromatography, gel filtration and DEAE columns, was diluted (1:50 to 1: 1000) in DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline is phosphate buffered saline (PBS) with containing CaCl ₂ (1 mM) and MgSO ₄ (0.5 mM)) and covered overnight at 4 ° C in Falcon 96-well microtiter plates.

2. Platne potom boli lh alebo ďalej blokované DPBS + 1 % BSA.2. Plates were then blocked 1h or further DPBS + 1% BSA.

3. Do jamiek potom boli pridané testované supernatanty a podrobené inkubácii pri teplote miestnosti po dobu 30 až 60 min.3. Test supernatants were then added to the wells and incubated at room temperature for 30 to 60 min.

4. Platne boli premyté DPBS a potom bol do jamiek pridaný konjugát chrenovej peroxidázy a ovčieho anti-myšieho IgG a platne boli inkubované 1 h pri teplote miestnosti.4. Plates were washed with DPBS and then horseradish peroxidase-sheep anti-mouse IgG conjugate was added to the wells and incubated for 1 hour at room temperature.

5. Platne potom boli premyté DPBS a vyvíjané so substrátovým systémom TMB Microwell (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.).5. Plates were then washed with DPBS and developed with the TMB Microwell substrate system (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.).

C. REKOMBINAČNÝ P-selektínC. RECOMBINATION P-SELECTINE

1. 96jamkové platne s plochým dnom boli cez noc potiahnuté pri 4 °C 100 μΐ P-selektínu, ktorý bol vypustený do média, neobsahujúceho sérum, fondu 293 bunkových klonov, transfikovaných rekombinačným génom P-selektínu. Tento supernatant obsahoval aspoň 8 ng/ml P-selektínu a bol na platne COSTAR nanášaný buď neriedený alebo zriedený médiom 1:8.1. Flat-bottom 96-well plates were coated overnight at 4 ° C with 100 µL of P-selectin, which was discharged into serum-free medium, a pool of 293 cell clones transfected with the recombinant P-selectin gene. This supernatant contained at least 8 ng / ml P-selectin and was applied to the COSTAR plates either undiluted or diluted 1: 8 with medium.

2. Platňa bola premytá jeden raz Dulbeccovým PBS (DPBS) a blokovaná po dobu 30 min pri teplote miestnosti s 200 μΐ DPBS s obsahom 1 % BSA.2. The plate was washed once with Dulbecco's PBS (DPBS) and blocked for 30 min at room temperature with 200 μΐ DPBS containing 1% BSA.

3. Platňa potom bola spracovaná pre analýzu ELISA podľa stupňov 7 až 13 v časti A.3. The plate was then processed for ELISA according to steps 7 to 13 in Part A.

D. IZOTYPIZAČNÁ ANALÝZA mAB k P-selektínuD. ISOTYPIZATION ANALYSIS of mAB to P-selectin

Izotypová analýza mu MAb PB1.3 a PNB1.6 ukázala, že obe monoklonálne protilátky patria k podtriede myšieho imunoglo57 bulínu IgGl. Izotypizácia bola uskutočnená s použitím záchytovej metódy súpravy Mouse-Hybridoma-Subtyping Kit Boehringer Mannheim.Isotype analysis of mu MAb PB1.3 and PNB1.6 showed that both monoclonal antibodies belong to the IgG1 mouse immunoglo57 subclass. Isotyping was performed using the Boehringer Mannheim capture-Mouse-Hybridoma-Subtyping Kit capture method.

Príklad 5Example 5

Detekcia P-selektínuDetection of P-selectin

Tento príklad opisuje detekciu P-selektínu westernovým prenosom. Vzorky obsahujúce P-selektín boli zmiešané s rovnakým objemom vzorkového pufru SDS-PAGE (neredukujúci), zahriate na 100 °c, podrobené gradientu 8-16 % gélu Novex a elektroforeticky prenesené na nitrocelulózu. Nitrocelulózová membrána potom bola blokovaná aspoň 1 h vo fosfátom pufrovanom salinickom roztoku (PBS) + 1 % hovädzieho sérového albumínu (BSA). Membrána potom bola inkubovaná 1 h alebo ďalej pri teplote miestnosti s každým supernatantom bunkovej kultúry z hybridómov exprimujúcich príslušnú monoklonálnu protilátku alebo čistenú protilátku (5 μg/ml) v PBS + 1 % BSA. Potom bola membrána niekoľkokrát premytá so zriedením 1:1000 konjugátom chrenovej peroxidázy a ovčieho anti-myšieho IgG (Sigma A-6782) v PBS + 1 % BSA. Potom bola membrána premytá a pásy boli vizualizované tetrametylbenzidínom/membránovým zosilňovačom (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.).This example describes the detection of P-selectin by Western blotting. Samples containing P-selectin were mixed with an equal volume of SDS-PAGE sample buffer (non-reducing), heated to 100 ° C, subjected to a gradient of 8-16% Novex gel and electrophoretically transferred to nitrocellulose. The nitrocellulose membrane was then blocked for at least 1 h in phosphate buffered saline (PBS) + 1% bovine serum albumin (BSA). The membrane was then incubated for 1 h or further at room temperature with each cell culture supernatant from hybridomas expressing the respective monoclonal antibody or purified antibody (5 µg / ml) in PBS + 1% BSA. Then, the membrane was washed several times with a 1: 1000 dilution of horseradish peroxidase and sheep anti-mouse IgG conjugate (Sigma A-6782) in PBS + 1% BSA. Then the membrane was washed and the bands were visualized with tetramethylbenzidine / membrane enhancer (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.).

Pre supernatanty tkanivových kultúr z mu MAb PB1.3 a PNB1.6 bol detegovaný protein s molekulovou hmotnosťou 140 kD. Ten sa objavoval v prípravkoch solubilizovaných doštičkových membrán i v čistenom P-selektíne.A protein with a molecular weight of 140 kD was detected for tissue culture supernatants from mu MAb PB1.3 and PNB1.6. This has occurred in solubilized platelet membrane preparations as well as purified P-selectin.

Príklad 6Example 6

Inhibícia akútneho zápalového poškodenia in vivo blokujúcou protilátkou proti P-selektínuInhibition of acute inflammatory damage in vivo by a blocking P-selectin antibody

Tento príklad poskytuje údaje demonštrujúce schopnosť blokujúcej protilátky proti P-selektínu podľa vynálezu liečiť akútne poškodenia pľúc. V tomto príklade bola systemická aktivácia komplementu dosiahnutá vaskulárnou infúziou faktora kobrieho jedu (CVF) do krýs. Poškodenie sa v tomto modeli vyvíjalo rýchlo a je známe, že je závislé na toxických kyslíkových produktoch, generujúcich sa z neutrofilov.This example provides data demonstrating the ability of the blocking anti-P-selectin antibody of the invention to treat acute lung injury. In this example, systemic complement activation was achieved by vascular infusion of cobra venom factor (CVF) into rats. Damage developed rapidly in this model and is known to be dependent on toxic oxygen products generated from neutrophils.

Pri týchto štúdiách boli použité dve monoklonálne protilátky, opísané v príkladoch 2 a 3. Pre túto štúdiu je obzvlášť významné, že blokujúca protilátka proti P-selektínu mu MAb PB1.3 inhibuje tiež adhéziu trombínom aktivovaných myších doštičiek k ľudským neutrofilom (obr. 1). Z týchto údajov vyplýva, že mu MAb PB1.3 pravdepodobne rozpoznáva konzervovaný funkčný P-selektínový epitop a že blokujúca protilátka proti P-selektínu by mohla byť použiteľná pri liečbe dalších zápalových poškodení.Two monoclonal antibodies described in Examples 2 and 3 were used in these studies. It is particularly important for this study that the blocking P-selectin antibody MAb PB1.3 also inhibits the adhesion of thrombin-activated mouse platelets to human neutrophils (Fig. 1). . These data suggest that MAb PB1.3 is likely to recognize a conserved functional P-selectin epitope and that a blocking P-selectin antibody might be useful in the treatment of other inflammatory lesions.

Pri experimentoch in vivo bolo 20 jednotiek CVF/kg telesnej hmotnosti vnesených intravenóznou infúziou do 300 g samcov krýs Long-Evans. Tým bola vyvolaná rýchla intrapulmonárna, intravaskulárna sekvestrácia krvných neutrofilov a z toho vyplývajúce poškodenie intersticiárnych kapilárnych endoteliálnych buniek v miestach fyzického kontaktu endoteliálnych buniek a neutrofilov. Pokiaľ boli použité mu MAb PB1.3 a PNB1.6, boli vnesené intravenóznou infúziou v uvedených množstvách spolu s CVF v celkovom objeme 0,5 ml. Negatívne kontrolné zvieratá dostávali intravenóznu infúziu fosfátom pufrovaného salinického roztoku (PBS). Vo všetkých prípadoch obsahoval infúzny materiál (¹²⁵I)-hovädzieho sérového (⁵¹Cr)-červené krvinky (RBC). Parametre pľúcneho poškodenia boli zisťované po 30 min zavedenými technikami, vid Mulligan ad., J. Clin. Invest. 88:1396 (1991).In in vivo experiments, 20 units of CVF / kg body weight were injected intravenously into 300 g of male Long-Evans rats. This induced rapid intrapulmonary, intravascular sequestration of blood neutrophils and resulting damage to interstitial capillary endothelial cells at the physical contact sites of endothelial cells and neutrophils. When mu MAb PB1.3 and PNB1.6 were used, they were injected intravenously in the indicated amounts together with CVF in a total volume of 0.5 ml. Negative control animals received intravenous infusion of phosphate buffered saline (PBS). In all cases, the infusion material contained ( ¹²⁵ L) -bovine serum ( ⁵¹ Cr) -red blood cells (RBC). Pulmonary injury parameters were determined after 30 min by established techniques, see Mulligan et al., J. Clin. Invest. 88: 1396 (1991).

tiež stopová množstvo albumínu a homologickéalso trace amounts of albumin and homologous

Výsledky týchto experimentov sú uvedené na obr. 2A a 2B.The results of these experiments are shown in FIG. 2A and 2B.

Súbežná infúzia 200 gg PNB1.6 (neblokujúca protilátka proti P-selektinu) s CVF nevyvolala žiadne zníženie poškodenia pľúc v porovnaní s hodnotami neošetrených CVF pozitívnych kontrol. Zvieratá, dostávajúce CVF PNB1.6 v PBS teda slúžili ako referenčná pozitívna kontrola. Keď bolo infúziou vnesených 100 μg protilátky mu MAb PB1.3 s CVF, bola permeabilita znížená o 19,2 % (p = 0,002) a hemoragia bola znížená o 37,5 % (p = 0,001 (údaje neznázornené). Keď bolo pridaných 200 μς mu MAb PB1.3, bola permeabilita znížená o 50,8 % (p < 0,001) (obr. 2A) a hemoragia o 70,0 % (p < 0,001), resp. 70,1 % (p < 0,001) (obr. 2B).Co-infusion of 200 gg PNB1.6 (a non-blocking anti-P-selectin antibody) with CVF did not induce any reduction in lung damage as compared to untreated CVF positive controls. Therefore, animals receiving CVF PNB1.6 in PBS served as a reference positive control. When 100 µg of mu MAb PB1.3 with CVF was infused, the permeability was reduced by 19.2% (p = 0.002) and hemorrhage was reduced by 37.5% (p = 0.001 (data not shown). μ mu mu MAb PB1.3, permeability was reduced by 50.8% (p <0.001) (Fig. 2A) and hemorrhage by 70.0% (p <0.001) and 70.1% (p <0.001) ( FIG. 2B).

pľúca zo spoločných skupín zvierat boli homogenizované, sonifikované a bola meraná myeloperoxidázová aktivita (MPO) za účelom získania odhadu obsahu neutrofilov v pľúcach. MPO bola stanovená rozkladom H2O2 v prítomnosti o-dianizidínu podľa štandardných metód, Warren a d., J. Clin. Invest. 84:1873 (1989). Ako je znázornené na obr. 3A, pri ošetrení 100, 200 alebo 400 μg mu MAb PB1.3 sa obsah MPO znížil pod hodnoty u referenčnej (neošetrenej) pozitívnej kontrolnej skupiny o 26 % (p = 0,024), 41 % (p < 0,001), resp. 50 % (p < 0,001). U zvierat, ktorým bolo injekčné podaných 200 μg PNB1.6 nedošlo ku zníženiu obsahu MPO (obr. 3A), čo je konzistentné s neschopnosťou tejto protilátky chrániť pred poškodením pľúc vyvolaným CVF. Ochranné účinky blokujúcej protilátky mu MAb PB1.3 teda korelujú s jej schopnosťou interferovať s akumuláciou neutrofilov v pľúcnom tkanive. Transmisným elektrónovým mikroskopickým skúmaním sektorov pľúc bolo potvrdené, že ošetrenie s mu MAb PB1.3 viedlo ku zníženej akumulácii neutrofilov v pulmonárnych intersticiálnych kapilárach, zníženej adhézii neutrofilov k endoteliálnym bunkám a zníženému množstvu dôkazov poškodených endoteliálnych buniek (obr. 3B).lungs from common animal groups were homogenized, sonicated, and myeloperoxidase activity (MPO) was measured to obtain an estimate of the neutrophil content of the lungs. MPO was determined by the decomposition of H2O2 in the presence of o-dianisidine according to standard methods, Warren et al., J. Clin. Invest. 84: 1873 (1989). As shown in FIG. 3A, when treated with 100, 200 or 400 µg mu MAb PB1.3, the MPO content decreased below the values in the reference (untreated) positive control group by 26% (p = 0.024), 41% (p <0.001), respectively. 50% (p < 0.001). Animals injected with 200 µg PNB1.6 showed no reduction in MPO content (Fig. 3A), consistent with the inability of this antibody to protect against lung damage induced by CVF. Thus, the protective effects of the blocking antibody MAb PB1.3 correlate with its ability to interfere with neutrophil accumulation in the lung tissue. Transmission electron microscopic examination of the lung sectors confirmed that treatment with mu MAb PB1.3 resulted in decreased neutrophil accumulation in pulmonary interstitial capillaries, decreased neutrophil adhesion to endothelial cells, and reduced evidence of damaged endothelial cells (Fig. 3B).

Za účelom skúmania pľúcnej expresie P-selektínu po intravenóznej injekcii CVF bol ďalšej skupine infúzne podaný CVF a zvieratá boli usmrtené po 0, 5, 10, 15, 20 a 60 min. Plúca boli nafúknuté O.C.T., rýchlo zmrazené a získané sekcie boli skúmané na prítomnosť P-selektínu imunohistochemickými metódami s použitím mu MAb PB1.3. V čase 0 bolo zistené málo detegovatelnej rádioaktivity v pulmonárnej vaskulatúre, zatial čo po 5 min bolo farbenie úplne evidentné a po 15 a 20 min po infúzii vzrástlo. Schéma farbenia zahrnovala pulmonárne venuly a septálne oblasti v schémate konzistentnom s farbením intersticiálnych kapilár. Po 60 min farbenie z velkej časti zmizlo (údaje neznázomené). Aj kečí je P-selektín pravdepodobne prítomný v intracelulárnych skladovacích granulách pred infúziou CVF, je zrejmé, že mobilizácia P-selektínu k povrchu endotelu dramaticky zvýšila jeho reaktivitu s protilátkou mu MAb PB1.3.To investigate pulmonary expression of P-selectin after intravenous injection of CVF, another group was infused with CVF and animals were sacrificed for 0, 5, 10, 15, 20 and 60 min. The lungs were inflated with O.C.T., rapidly frozen, and the sections obtained were examined for the presence of P-selectin by immunohistochemical methods using mu MAb PB1.3. At time 0, little detectable radioactivity was detected in the pulmonary vasculature, whereas after 5 min the staining was completely evident and increased after 15 and 20 min after the infusion. The staining scheme included pulmonary venules and septal areas in a scheme consistent with interstitial capillary staining. After 60 min the staining largely disappeared (data not shown). Although P-selectin is likely to be present in intracellular storage granules prior to CVF infusion, it is apparent that mobilizing P-selectin to the surface of the endothelium dramatically increased its reactivity with mu MAb PB1.3.

Príklad 7Example 7

Test konkurenčnej väzbvCompetitive binding test

Spôsoby izolácie doštičiek z ludskej krvi, aktivácia izolovaných doštičiek trombínom a izolácia PMN (neutrofílov) sú opísané vyššie v príklade 1.Methods for isolating platelets from human blood, activating isolated platelets with thrombin, and isolating PMNs (neutrophils) are described above in Example 1.

INKUBÁCIA TROMBÍNOM AKTIVOVANÝCH DOŠTIČIEK S MONOKLONÁT.NYMI PROTTT.ÁTKAMI PROTI P-SELEKTÍNUINCUBATION OF THROMBIN-ACTIVATED PLATES WITH MONOCLONATE ANTI-PROTATIVE PLATES AGAINST P-SELECTIN

a) Do každej z 24 Eppendorfových skúmaviek (1,5 ml) sa duplicitne vloží 20 μΐ trombínom aktivovaných doštičiek 2.10⁸/ml).(a) Into each of the 24 Eppendorf tubes (1.5 ml) duplicate 20 μΐ of thrombin-activated plates (2.10 ⁸ / ml).

b) K 8 týmto skúmavkám sa pridá 20 μΐ frakcie IgG čistenej z PNB1.6 v koncentrácii 10 ug/ml v pufre Tyrode-Hepes, pH 7,2, obsahujúcom 1 mM CaCl₂· K druhej rade 8 skúmaviek sa pridá 20 μΐ rovnakého prípravku IgG s koncentráciou 1 ug/ml. K tretej rade 8 skúmaviek sa pridá 20 μΐ samotného pufru.b) To 8 of these tubes, add 20 μΐ of the IgG purified fraction of PNB1.6 at 10 µg / ml in Tyrode-Hepes buffer, pH 7.2 containing 1 mM CaCl _2. To the second row of 8 tubes, add 20 μΐ of the same of an IgG preparation of 1 µg / ml. Add 20 μΐ of buffer alone to the third row of 8 tubes.

c) Skúmavky sa zamiešajú a ponechajú sa stáť 20 min pri teplote miestnosti.c) Stir tubes and allow to stand at room temperature for 20 min.

ď) Ku každej rade 8 skúmaviek sa pridá 20 μΐ frakcie IgG čistenej z mu MAb PB1.3 s koncentráciou pohybujúcou sa od 10 μg/ml do 0,03 μς/πιΐ.(d) To each row of 8 tubes add 20 μΐ of the IgG fraction purified from mu MAb PB1.3 at a concentration ranging from 10 μg / ml to 0,03 μς / πιΐ.

e) Skúmavky sa zamiešajú a ponechajú stáť 20 min pri teplote miestnosti.(e) Stir tubes and allow to stand at room temperature for 20 min.

f) Pridá sa 20 μΐ neutrofilov v koncentrácii 3.10⁶/ml.(f) Add 20 μΐ of neutrophils at a concentration of 3.10 ⁶ / ml.

g) Skúmavky sa zamiešajú a ponechajú stáť 20 min pri teplote miestnosti.g) Stir tubes and allow to stand at room temperature for 20 min.

h) Adhézia sa hodnotí mikroskopicky týmto spôsobom: V každej vzorke sa napočíta 100 neutrofilov. Bunka sa označí ako pozitívna, ak naviazala 2 alebo viac doštičiek, a ako negatívna, ak naviazala menej než 2 doštičky. Vypočíta sa percento pozitívnych buniek.(h) Adhesion is assessed microscopically as follows: 100 neutrophils are counted in each sample. A cell is marked as positive if it has bound 2 or more plates and as negative if it has bound less than 2 plates. The percentage of positive cells is calculated.

Ako je znázornené na obr. 1, predbežné ošetrenie trombínom aktivovaných doštičiek s mu MAb PNB1.6 neovplyvnilo schopnosť mu MAb PB1.3 blokovať ich P-selektínom sprostredkovanú adhéziu k neutrofilom.As shown in FIG. 1, pretreatment of thrombin-activated platelets with mu MAb PNB1.6 did not affect the ability of mu MAb PB1.3 to block their P-selectin-mediated adhesion to neutrophils.

Príklad 8Example 8

Charakterizácia väzbv blokujúcich Drôtilátok Droti P-selektínuCharacterization of Binding Blocking Drots Pots of P-selectin

I a) Čistenie monoklonálnvch nrotilátok:I (a) Purification of monoclonal antibodies:

Monoklonálne protilátky PNB1.6 a 84/26 boli izolované zo supernatantov tkanivových kultúr pasážou cez kolónu proteín G Sepharosa 4 Fast Flow (Pharmacia). Kolóna bola dôkladne premytá fosfátom pufrovaným salinickým roztokom (PBS) a naviazaná protilátka bola eluovaná s O,1M glycín-HCl, pH 2,7, do skúmaviek, obsahujúcich 0,2 až 0,5 objemu IM Tris, pH 8,8. Postup použitý na izoláciu mu MAb PB1.3 bol identický s výnimkou toho, že protilátka, naviazaná na proteín G, bola eluovaná s O,1M acetát-HCl, pH 2,5, do skúmaviek obsahujúcich 0,3 objemu 2M Tris, pH 10. Frakcie obsahujúce protilátku boli spojené a dialyzované proti niekoľkých zmenám PBS pri 4 °C.Monoclonal antibodies PNB1.6 and 84/26 were isolated from tissue culture supernatants by passage through a protein G Sepharosa 4 Fast Flow column (Pharmacia). The column was thoroughly washed with phosphate buffered saline (PBS) and bound antibody was eluted with 0.1 M glycine-HCl, pH 2.7, into tubes containing 0.2 to 0.5 volumes of IM Tris, pH 8.8. The procedure used to isolate mu MAb PB1.3 was identical except that the antibody bound to protein G was eluted with 0.1 M acetate-HCl, pH 2.5, into tubes containing 0.3 volumes of 2M Tris, pH 10 Fractions containing the antibody were pooled and dialyzed against several changes in PBS at 4 ° C.

b) Príprava afinitnej kolóny mu MAb PB1.3:(b) Preparation of the mu MAb PB1.3 affinity column:

Pre použitie pri čistení P-selektínu bol mu MAb PB1.3 naviazaný na trezyl-aktivovanú agarózu podľa inštrukcií výrobcu (Schleicher a Schuell).For use in the purification of P-selectin, mu MAb PB1.3 was bound to tresyl-activated agarose according to the manufacturer's instructions (Schleicher and Schuell).

c) Čistenie P-selektínu:(c) Purification of P-selectin:

K premytým starým ľudským doštičkám, pripraveným vyššie opísaným spôsobom, bola pridaná 1/100 objemu 5mg/ml leupeptínu a 1/100 objemu 35mg/ml AEBSF (Calbiochem). Po rozmiešaní boli doštičky trikrát zmrazené a rozmrazené buď v kúpeli suchý ľad/metanol alebo v kvapalnom dusíku, homogenizované desiatimi rázmi homogenizéra Dounce a centrifugované 1 h v zariadení Beckman 70TI rotor pri otáčkach 35000 min^-1 a pri 4 °C. Peleta bola resuspendovaná v Dulbeccovom fosfátom pufrovanom salinickom roztoku (DPBS, Whittaker Bioproducts, ktorý obsahuje približne 0,9 μΜ Ca²⁺ a 0,5 mM Mg²⁺) a upravená na koncentráciu 5 mM v benzamidíne-HCl, 100 μΜ v leupeptíne a 2 % v Tritone X-100. Suspenzia bola resuspendovaná a homogenizovaná 10 rázmi homogenizéra Dounce. Po 1 h inkubácie pri 4 °C bol roztok opäť centrifugovaný v zariadení Beckman 70TI rotor po dobu 1 h pri otáčkach 35000 min^-1 a 4 °C. Supernatant bol pasážovaný kolónou mu MAb PB1.3-agarózy, ktorá bola ekvilibrovaná s DPBS + 0,05 % Rennexu 30 (Accurate Che63 mical and Scientific Corp.). Kolóna bola dôkladne premytá s DPBS + 0,05 % Rennexu 30 a naviazaný P-selektín bol eluovaný s 0,1 M trietylamínom-HCl, 0,05 % Rennexom 30, pH 11,5, do skúmaviek obsahujúcich 0,01 objemu IM fosfátu, pH 6,8. Frakcie obsahujúce P-selektín boli spojené, dialyzované proti DPBS +0,05 % Rennexu 30, skoncentrované s použitím budí rotačnej odparky Centricon 30 alebo Centriprep 30 (Amicon), alikvotované a skladované pri -80 °C.1/100 volume of 5mg / ml leupeptin and 1/100 volume of 35mg / ml AEBSF (Calbiochem) were added to the washed old human platelets prepared as described above. After stirring, the plates were frozen and thawed either in a dry ice / methanol and liquid nitrogen, homogenized ten shocks Dounce homogenizer and centrifuged for 1 h in a Beckman 70Ti rotor at a speed of 35,000 ^min-1 and at 4 ° C. The pellet was resuspended in Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, Whittaker Bioproducts containing approximately 0.9 μ 0,9 Ca ²⁺ and 0.5 mM Mg ²⁺ ) and adjusted to a concentration of 5 mM in benzamidine-HCl, 100 μΜ in leupeptin, and 2% in Triton X-100. The suspension was resuspended and homogenized with 10 shocks of a Dounce homogenizer. After 1 h incubation at 4 ° C the solution was again centrifuged in a Beckman 70Ti rotor for 1 hour at a speed of 35,000 ^min-1, and 4 ° C. The supernatant was passaged with a mu MAb PB1.3-agarose column that was equilibrated with DPBS + 0.05% Rennex 30 (Accurate Chemical 63 and Scientific Corp.). The column was washed thoroughly with DPBS + 0.05% Rennex 30 and bound P-selectin was eluted with 0.1 M triethylamine-HCl, 0.05% Rennex 30, pH 11.5, into tubes containing 0.01 volume IM phosphate. pH 6.8. P-selectin containing fractions were pooled, dialyzed against DPBS + 0.05% Rennex 30, concentrated using a Centricon 30 or Centriprep 30 rotary evaporator (Amicon), aliquoted and stored at -80 ° C.

df) Príprava peptidu CQNRYTDLVAIQNKNE (Cvs-Gln-Asn-Arq-Tvr-Thr-Asp-Leu-Val-Ala-Ile-Gln-Asn-Lys-Asn-Glu-NH₂1:df) Preparation of the peptide CQNRYTDLVAIQNKNE (Cvs-Gln-Asn-Arq-Tvr-Thr-Asp-Leu-Val-Ala-Ile-Gln-Asn-Lys-Asn-Glu-NH ₂₁ ):

Peptid bol syntetizovaný na peptidovom syntetizátore Applied Biosystems (Foster City, CA) 430A s použitím Fmoc chránených aminokyselín a 2-(lH-benzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetrametyluróniumhexafluórfosfátových (HBATU) esterov pre aktiváciu aminokyselín. Každá aminokyselina bola rutinne kondenzovaná dvakrát. Fmoc chránené aminokyseliny a hydroxybenzotriazol boli zakúpené od Applied Biosystems. Všetky rozpúšťadlá boli zakúpené od Burdick and Jackson. HBTU bol zakúpený od Richelieu Biotechnologies (St. Hyacinthe, Canada). Piperidín a trifluóroctová kyselina, acetanhydrid, tioanizol, fenol a etánditiol boli zakúpené od Sigma Chemical Corporation.The peptide was synthesized on an Applied Biosystems peptide synthesizer (Foster City, CA) 430A using Fmoc protected amino acids and 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBATU) esters to activate amino acids. Each amino acid was routinely condensed twice. Fmoc protected amino acids and hydroxybenzotriazole were purchased from Applied Biosystems. All solvents were purchased from Burdick and Jackson. HBTU was purchased from Richelieu Biotechnologies (St. Hyacinthe, Canada). Piperidine and trifluoroacetic acid, acetic anhydride, thioanisole, phenol and ethanedithiol were purchased from Sigma Chemical Corporation.

Fmoc-amidová živica (Bachem Bioscience) bola vsadená do reakčnej nádoby pre syntézu peptidov a premytá jeden raz N-metylpyrolidónom (NMP). Postupne boli uskutočnené tieto operácie:The Fmoc-amide resin (Bachem Bioscience) was charged into a peptide synthesis reaction vessel and washed once with N-methylpyrrolidone (NMP). The following operations were carried out successively:

1. Bola odstránená Fmoc chrániaca skupina pôsobením 25% piperidínu v NMP.1. The Fmoc protecting group was removed by treatment with 25% piperidine in NMP.

2. Živica bola premytá 5krát NMP.2. The resin was washed 5 times with NMP.

3. Do reakčnej nádoby bola pridaná zmes obsahujúca τ-terc.butylester N—Fmoc-L-glutámovej kyseliny, diizopropyletylamín, HBTU a NMP a nechala sa reagovať 30 min za vírivého miešania.3. Add a mixture containing N-Fmoc-L-glutamic acid tert-butyl ester, diisopropylethylamine, HBTU and NMP to the reaction vessel and react for 30 minutes with vortexing.

4. Rozpúšťadlo bolo odpustené a živica bola premytá trikrát s NMP.4. The solvent was drained and the resin was washed three times with NMP.

5. Stupne (3) a (4) boli opakované ešte dvakrát.5. Steps (3) and (4) were repeated two more times.

6. Živica bola premytá ešte štyrikrát s NMP.6. The resin was washed four more times with NMP.

Stupne l až 6 boli opakované pre každú aminokyselinu peptidu. Po konečnom kondenzačnom cykle bol peptid naviazaný na živicu odblokovaný reakciou s 25% piperidínom v NMP, premytý 7 krát v NMP a dvakrát s dichlórmetánom. Živica bola sušená 24 h vo vákuu, peptid bol zo živice odštiepený pôsobením trifluóroctovej kyseliny obsahujúcej 2,5 % etándiolu, 5 % tioanizolu, 7,5 % fenolu a 5 % vody. Polystyrénová živica bola od roztoku trifluóroctovej kyseliny oddelená filtráciou. Trifluóroctová kyselina bola odparená vo vákuu. Surový peptid bol triturovaný s dietyléterom a rozpustený vo vode. Voda bola odstránená lyofilizáciou. Peptid bol potom čistený HPLC s reverznými fázami na stĺpci C₈ (VYDAC) s použitím gradienta acetonitrilu, vody, vždy s obsahom 0,1 % TFA ako modifikátora.Steps 1 to 6 were repeated for each amino acid of the peptide. After the final condensation cycle, the resin-bound peptide was unblocked by reaction with 25% piperidine in NMP, washed 7 times in NMP and twice with dichloromethane. The resin was dried under vacuum for 24 h, the peptide was cleaved from the resin by treatment with trifluoroacetic acid containing 2.5% ethanediol, 5% thioanisole, 7.5% phenol and 5% water. The polystyrene resin was separated from the trifluoroacetic acid solution by filtration. The trifluoroacetic acid was evaporated in vacuo. The crude peptide was triturated with diethyl ether and dissolved in water. Water was removed by lyophilization. The peptide was then purified by reverse phase HPLC on a C ₈ column (VYDAC) using a gradient of acetonitrile, water, each containing 0.1% TFA as a modifier.

e) Biotinvlácia monoklonálnvch Drotilátok:_e) Biotinlation of monoclonal antibodies: _

Protilátky boli dialyzované proti 0,1 M bikarbonátu sodnému, pH 8,5. Bol pridaný biotín NHS-LC (Pierce) do 0,3 mg/ml. Po 2 h pri teplote miestnosti boli protilátky dialyzované proti niekoíkých zmenám PBS.Antibodies were dialyzed against 0.1 M sodium bicarbonate, pH 8.5. Biotin NHS-LC (Pierce) was added to 0.3 mg / ml. After 2 h at room temperature, the antibodies were dialyzed against several changes in PBS.

f) Poťahoyanie mikrotitračnvfh platní we ft.tsa:f) Coating microtiter plates we ft.tsa:

96jamkové mikrotitračné platne (Falcon Microtest III) boli cez noc potiahnuté pri 4 °C s 50 μΐ/jamku z 2 μ9/πι1 afinitne čisteného P-selektínu v DPBS.96-well microtiter plates (Falcon Microtest III) were coated overnight at 4 ° C with 50 μΐ / well of 2 μ9 / πι1 affinity-purified P-selectin in DPBS.

g) W*»sternpyý prenos:(g) W * »sternpy transmission:

mu MAb PB1.3, PNB1.6 i 84/26 sa viažu na jediný pás 140 kD, kedf sú doštičky rozpustené v bežnom pufre SDS-PAGE (neredukovaný) , podrobené SDS-PAGE a prenesené na nitrocelulózu (údaje neznázornené). Zistili sme taktiež, že mu MAb PB1.3 a PNB1.6 pri westernovom prenose už nerozpoznávajú P-selektín, ak boli vzorky redukované s β-merkaptoetanolom.mu MAb PB1.3, PNB1.6 and 84/26 bind to a single 140 kD band when the plates are dissolved in conventional SDS-PAGE buffer (not reduced), subjected to SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose (data not shown). We also found that MAb PB1.3 and PNB1.6 no longer recognize P-selectin during western blotting when samples were reduced with β-mercaptoethanol.

II. Účinok chelatačnvch dvojväzbových katiónov na väzbu monoklonálnvch Drotilátok na P-s^iektín:II. Effect of chelating divalent cations on the binding of monoclonal antibodies to β-sectin:

Dve mikrotitračné platne boli vyššie uvedeným spôsobom potiahnuté afinitne čisteným P-selektínom. Platňa 1 bola blokovaná s 200 μΐ/jamku PBS +1 % BSA, zatiaľ čo platňa 2 bola blokovaná s 200 μΐ/jamku DPBS + 1 % BSA (DPBS obsahuje Ca ²⁺ n 1 a Mg ). Po 1 h boli platne premyté (v prípade platne 1 vždy s PBS, u platne 2 s DPBS). Do jamiek na platni 1 bolo pridaných 25 μΐ 25mM EDTA v PBS + i % BSA a na platňu 2 bolo pridaných 25 μΐ DPBS + 1 % BSA. Po 1 h bolo do jamiek na oboch platniach pridaných 25 μΐ riedenia príslušnej protilátky. Riedenie pre platňu 1 sa uskutočňovalo v PBS + 1 % BSA, pre platňu 2 v DPBS + 1 % BSA. Po 1 h boli platne premyté a bolo pridaných 50 μΐ konjugátu ovčieho anti-myšieho IgG a chrenovej peroxidázy v zriedení 1:1000 (riedenie pre platňu 1 sa uskutočňovalo v PBS +1 % BSA, pre platňu 2 v DPBS +1 % BSA). Po 1 h boli platne premyté a bolo pridaných 50 μΐ peroxidázového substrátu TMB (3,3,5',5'-tetrametyl- benzidín, Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.). Potom, čo sa vyvinula príslušná úroveň sfarbenia, bola reakcia so substrátom zastavená prídavkom 25 μΐ IM kyseliny fosforečnej a bola odčítaná absorbancia pri 450 nm.Two microtiter plates were coated with affinity purified P-selectin as described above. Plate 1 was blocked with 200 μΐ / well PBS + 1% BSA, while plate 2 was blocked with 200 μΐ / well DPBS + 1% BSA (DPBS contains Ca ²⁺ n 1 and Mg). After 1 h, the plates were washed (in the case of plate 1 always with PBS, in plate 2 with DPBS). 25 µL of 25 mM EDTA in PBS + i% BSA was added to wells of plate 1, and 25 µL DPBS + 1% BSA was added to plate 2. After 1 h, 25 µl dilutions of the respective antibody were added to the wells on both plates. Dilution for plate 1 was performed in PBS + 1% BSA, for plate 2 in DPBS + 1% BSA. After 1 h, the plates were washed and 50 µl of a 1: 1000 dilution of sheep anti-mouse IgG and horseradish peroxidase was added (dilution for plate 1 was performed in PBS + 1% BSA, for plate 2 in DPBS + 1% BSA). After 1 h, the plates were washed and 50 µL of TMB peroxidase substrate (3,3,5 ', 5'-tetramethylbenzidine, Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.) was added. After the appropriate staining level was developed, the reaction with the substrate was stopped by the addition of 25 μM of phosphoric acid and the absorbance at 450 nm was read.

Obr. 4 znázorňuje väzbu anti-P-selektínových monoklonálnych protilátok na P-selektín v pufre DPBS, ktorý obsahuje Ca²⁺ a Mg²⁺, a v PBS + 25 mM EDTA, čo je chelatačný prostriedok dvojmocných kovových katiónov. Koncentrácia dvojmocných katiónov prítomných v DPBS je viac než dostatočná na podporu adhézie neutrofilov k P-selektínu (Geng a df., 1991), zatiaľ čo chelátor EDTA v koncentrácii 25 mM je viac než dostatočný pre blokovanie adhézie neutrofilov k P-selektínu. Väzba všetkých monoklonáIných protilátok k P-selektínu je málo ovplyvnená prítomnosťou EDTA, čo ukazuje, že prítomnosť Ca²⁺ nie je nutná ku vzniku väzby. Mu MAb PB1.3 je blokujúca protilátka, tzn. je schopná blokovať väzbu neutrofilov k P-selektínu, napríklad na aktivovaných doštičkách. PNB1.6 je neblokujúca protilátka. Schopnosť 84/26 blokovať väzbu neutrofilov k P-selektínu nebola doposiaľ úplne charakterizovaná. Oproti tomu z anti-P-selektínových monoklonálnych protilátok, opísaných Gengom ad., je iba neblokujúca protilátka S12 schopná viazať sa v neprítomnosti Ca²⁺.Fig. 4 shows binding of anti-P-selectin monoclonal antibodies to P-selectin in DPBS buffer containing Ca ²⁺ and Mg ²⁺ , and in PBS + 25 mM EDTA, which is a chelating agent of divalent metal cations. The concentration of divalent cations present in DPBS is more than sufficient to promote neutrophil adhesion to P-selectin (Geng et al., 1991), while the 25 mM EDTA chelator is more than sufficient to block neutrophil adhesion to P-selectin. Binding of all monoclonal antibodies to P-selectin is little affected by the presence of EDTA, indicating that the presence of Ca ²⁺ is not required to bind. Mu MAb PB1.3 is a blocking antibody, i. it is able to block neutrophil binding to P-selectin, for example, on activated platelets. PNB1.6 is a non-blocking antibody. The ability of 84/26 to block neutrophil binding to P-selectin has not been fully characterized. In contrast, of the anti-P-selectin monoclonal antibodies described by Geng et al., Only the non-blocking S12 antibody is capable of binding in the absence of Ca ²⁺ .

III. Účinok DeDtidu CQNRYTDLVAIONKNE na väzbu mu MAb PB1.3 na P-selektín:III. Effect of DeDtid CQNRYTDLVAIONKNE on the binding of mu MAb PB1.3 to P-selectin:

Mikrotitračná platňa bola vyššie opísaným spôsobom potiahnutá afinitne čisteným s μΐ/jamku DPBS + 1 % BSA po MAb PB1.3 v DPBS + 1 % BSAThe microtiter plate was coated affinity purified with μΐ / well DPBS + 1% BSA to MAb PB1.3 in DPBS + 1% BSA as described above.

CQNRYTDLVAIQNKNE V PBS alebo sCQNRYTDLVAIQNKNE in PBS or p

P-selektínom, blokovaná 200 dobu Íha premytá. Riedenia mu boli zmiešané bud s 0,35 mg/ml PBS samotným ako kontrola. Po h bolo 50 μΐ každého riedenia protilátky pridaných k mikrotitračnej platni a inkubované 1 h. Platňa bola premytá DPBS a bolo pridané riedenie 1:1000 konjugátu ovčieho anti-myšieho IgG s chrenovou peroxidázou v DPBS + 1 % BSA. Po 1 h bola platňa premytá, bol pridaný substrát TMB a po zastavení vývinu sfarbenia boli platne odčítané vyššie uvedeným spôsobom.P-selectin, blocked for 200 hours, was washed. Dilutions were mixed with either 0.35 mg / ml PBS alone as a control. After h, 50 μΐ of each antibody dilution was added to the microtiter plate and incubated for 1 h. The plate was washed with DPBS and a 1: 1000 dilution of sheep anti-mouse IgG with horseradish peroxidase in DPBS + 1% BSA was added. After 1 h, the plate was washed, the TMB substrate was added, and after stopping the color development, the plates were read as above.

Obr. 5 ukazuje, že peptid CQNRYTDLVAIQNKNE, homologický ku zvyškom 19 až 34 lektínovej oblasti P-selektínu, nemá žiadny vplyv na väzbu mu MAb PB1.3 na P-selektín, ak je peptid prítomný v koncentrácii 0,35 mg/ml. Tým sa táto konkrétna monoklonálna protilátka odlišuje od monoklonálnych protilátok Gl, G2 a G3, ktorých väzba na P-selektín je čiastočne alebo úplne blokovaná týmto peptidom.Fig. 5 shows that the peptide CQNRYTDLVAIQNKNE, homologous to residues 19-34 of the P-selectin lectin region, has no effect on the binding of mu MAb PB1.3 to P-selectin when the peptide is present at a concentration of 0.35 mg / ml. Thereby, this particular monoclonal antibody differs from the monoclonal antibodies G1, G2 and G3 whose binding to P-selectin is partially or completely blocked by this peptide.

- 67 IV. Schopnosť Cvtel mu MAb PB1.3. PNB1.6 a R4/26 blokovať navzáiom väzbu na P-selektín:- 67 IV. The ability of Cvtel mu MAb PB1.3. PNB1.6 and R4 / 26 block P-selectin binding:

Mikrotitračné platne, potiahnuté afinitne čisteným P-selektínom vyššie opísaným spôsobom, boli po dobu 1 h blokované s DPBS + 1 % BSA a premyté. Do príslušných jamiek sa pridalo 25 μΐ 50 ^g/ml roztoku mu MAb PB1.3, PNB1.6 alebo 84/26 v DPBS + i % BSA a inkubovalo sa po dobu 1 h. Potom sa pridalo 25 μΐ zriedenia (v DPBS + i % BSA) biotinylovanej protilátky. Platňa potom bola inkubovaná 1 h na platňovej trepačke. Po premytí sa pridalo 50 μΐ riedenia 1:1000 streptavidínového konjugátu s chrenovou peroxidázou a inkubovalo sa po dobu 1 h. Po premytí DPBS bola platňa vyvíjaná vyššie uvedeným spôsobom so substrátom TMB.Microtiter plates coated with affinity purified P-selectin as described above were blocked with DPBS + 1% BSA for 1 h and washed. 25 μΐ of a 50 µg / ml solution of mu MAb PB1.3, PNB1.6 or 84/26 in DPBS + i% BSA was added to the appropriate wells and incubated for 1 h. Then, 25 μΐ dilution (in DPBS + i% BSA) of the biotinylated antibody was added. The plate was then incubated for 1 h on a plate shaker. After washing, 50 μΐ of a 1: 1000 dilution of horseradish peroxidase conjugate was added and incubated for 1 h. After washing with DPBS, the plate was developed as above with TMB substrate.

Obr. 6 znázorňuje schopnosť mu MAb PB1.3, PNB1.6 a 84/24 interferovať medzi sebou navzájom pri väzbe na P-selektín. Obr. 6A ukazuje, že iba mu MAb PNB1.6 je schopná blokovať väzbu biotinylovanej mu MAb PNB1.6 na P-selektín, čo demonštruje, že mu MAb PB1.3 a 84/26 musia rozpoznávať odlišné epitopy od mu MAb PNB1.6. Podobne na obr. 6B je mu MAb PB1.3, avšak nie mu MAb PNB1.6 alebo 84/26, schopná blokovať väzbu biotinylovanej PB1.3 na selektín, čo demonštruje, že ostatné dve protilátky musia rozpoznávať odlišné epitopy. Podía obr. 6C sú mu MAb 84/26 i PB1.3, avšak nie mu MAb PNB1.6, schopné blokovať väzbu biotinylovanej mu MAb 84/26 na P-selektín.Fig. 6 shows the ability of mu MAb PB1.3, PNB1.6 and 84/24 to interfere with each other when bound to P-selectin. Fig. 6A shows that only mu MAb PNB1.6 is able to block the binding of biotinylated mu MAb PNB1.6 to P-selectin, demonstrating that mu MAb PB1.3 and 84/26 must recognize different epitopes from mu MAb PNB1.6. Similarly, in FIG. 6B is mu MAb PB1.3 but not mu MAb PNB1.6 or 84/26, capable of blocking the binding of biotinylated PB1.3 to selectin, demonstrating that the other two antibodies must recognize different epitopes. According to FIG. 6C, both MAb 84/26 and PB1.3, but not MAb PNB1.6, are capable of blocking the binding of biotinylated mu MAb 84/26 to P-selectin.

V. Blokujúce protilátky proti P-selektínu neinhibujú trombínom indukovanú aqreqáciu ľudských doštičiek:V. Blocking antibodies against P-selectin do not inhibit thrombin-induced platelet transfection:

Tento príklad demonštruje, že protilátky proti P-selektínu mu MAb PB1.3 a PNB1.6 neinhibujú trombínom indukovanú agregáciu doštičiek. Čerstvé ľudské doštičky boli izolované vyššie opísaným spôsobom a suspendované v pufre Tyrode-Hepes, pH 7,2, v koncentrácii 2.10⁸/ml.This example demonstrates that anti-P-selectin antibodies to mu MAb PB1.3 and PNB1.6 do not inhibit thrombin-induced platelet aggregation. Fresh human platelets were isolated as described above and suspended in Tyrode-Hepes buffer, pH 7.2, at a concentration of 2.10 ⁸ / ml.

Agregometria bola uskutočnená v agregometre Lumi (Chrono-Log Corp.). Za účelom merania sa 0,45 ml suspenzie doštičiek vložilo do štandardnej silikónovanej kyvety. K tomu sa pridalo 10 μΐ protilátky alebo vehikula ako kontrola. Po 5 min pri 37 °C sa pridalo 0,1 jednotky trombínu (Human, Sigma) a bola zaznamenaná agregácia.Aggregometry was performed on a Lumi aggregometer (Chrono-Log Corp.). For measurement, 0.45 ml of the plate suspension was placed in a standard silicone cuvette. To this was added 10 μΐ of antibody or vehicle as a control. After 5 min at 37 ° C, 0.1 units of thrombin (Human, Sigma) was added and aggregation was recorded.

Keď bola agregácia meraná za podmienok kontroly v neprítomnosti protilátky, bola získaná agregačná odpoveď 71 jednotiek. Ekvivalentný rozsah agregácie bol získaný v prítomnosti 10 μΐ neriedených supernatantov kultúr z buniek produkujúcich protilátku mu MAb PB1.3 (obr. 7). K suspenzii doštičiek boli pridávané rôzne koncentrácie mu MAb PB1.3 (1 až 100 μς/ιαΐ). Pri žiadnej koncentrácii mu MAb PB1.3 nebola agregácia doštičiek odlišná od odpovede stanovenej v neprítomnosti protilátky (obr. 7).When aggregation was measured under control conditions in the absence of antibody, an aggregation response of 71 units was obtained. An equivalent range of aggregation was obtained in the presence of 10 μΐ undiluted culture supernatants from mu MAb PB1.3 antibody-producing cells (Fig. 7). Various concentrations of mu MAb PB1.3 (1 to 100 μς / ιαΐ) were added to the plate suspension. At no concentration, mu MAb PB1.3 was platelet aggregation different from the response determined in the absence of antibody (Fig. 7).

Príklad 9Example 9

Ochranné účinky blokujúcei protilátky proti P-selektinu muProtective effects blocking anti-P-selectin mu antibodies

MAb PB1.3 in vivo pri mvokardiálnej ischémii a reperfúzii u mačiekMAb PB1.3 in vivo in myocardial ischemia and reperfusion in cats

Model poškodenia myokardiálnou ischémiou a reperfúziou u mačky bol uskutočnený metódami podľa Tsao a ď., (Circulation 82:1402-1412 (1990)). Model možno stručne opísať tak, že samci mačiek (2,5 až 3,5 kg) boli anestetizovaní pentobarbitalom sodným (30 mg/kg, i.v.). Do rezu strednou čiarou bola vložená intratracheálna trubica a všetky zvieratá dostávali prerušovanú ventiláciu pozitívneho tlaku pomocou malého zvieracieho respirátora Harvard. Do externej jugulárnej žily bol vložený polyetylénový katéter a pravá femorálna žila bola kanylovaná a pripojená k tlakovému snímaču Statham P23Ac na meranie arteriálneho krvného tlaku. Bola uskutočnená torakotómia po strednej čiare, otvorené perikardium a odhalené srdce.A model of myocardial ischemia and reperfusion injury in a cat was performed by the methods of Tsao et al., (Circulation 82: 1402-1412 (1990)). Briefly, the male cats (2.5-3.5 kg) were anesthetized with sodium pentobarbital (30 mg / kg, i.v.). An intratracheal tube was inserted into the midline section and all animals received intermittent positive pressure ventilation using a small Harvard animal respirator. A polyethylene catheter was inserted into the external jugular vein and the right femoral vein was cannulated and connected to a Statham P23Ac pressure transducer to measure arterial blood pressure. Middle line thoracotomy, open pericardium and exposed heart were performed.

Okolo lavej prednej zostupnej tepny bol 10 až 12 mm od jej počiatku opatrne umiestnený šev hodvábom 2-0. Po 30 min stabilizácie bola iniciovaná nekardiálna ischémie úplným podviazaním tepny; po 1,5 h ischémie nasledovala 4,5 h reperfúzia. 10 min pred zahájením reperfúzie boli intravenózne v dávke 1 mg/kg podané blokujúce (mu MAb PB1.3) a neblokujúce (mu MAb PNB1.6) protilátky proti P-selektínu.Around the left anterior descending artery, a suture of 2-0 silk was carefully placed 10 to 12 mm from its start. After 30 min of stabilization, non-cardiac ischemia was initiated by complete ligation of the artery; after 1.5 h ischemia followed by 4.5 h reperfusion. Blocking (mu MAb PB1.3) and non-blocking (mu MAb PNB1.6) anti-P-selectin antibodies were administered intravenously at 1 mg / kg 10 min before the reperfusion started.

Ischemické myokardium bolo určené ako tá čast tkaniva, ktorá sa nefarbí tetrazóliovou nitro modrou a bolo vyjadrené ako percento ohrozenej oblasti. Ohrozená oblasť bola stanovená reoklúziou lávej zostupnej tepny po skončení reperfúzie a vstreknutí Evansovho modrého farbiva do lavého átria. Ohrozená oblasť bola teda stanovená negatívnym farbením.Ischemic myocardium was determined as that part of the tissue that did not stain with tetrazolium nitro blue and was expressed as a percentage of the area at risk. The endangered area was determined by reocclusion of the lava descending artery after reperfusion and injection of Evans blue dye into the left atrium. The endangered area was thus determined by negative staining.

Endoteliálne závislá relaxácia krúžkov z koronárnych tepien bola stanovená meraním acetylcholínom indukovanej relaxácie krúžkov, vopred kontrahovaných mimetikom tromboxánu A2 U 46619. Údaje sú uvedené ako percento relaxácie.Endothelial-dependent ring relaxation from coronary arteries was determined by measuring acetylcholine-induced ring relaxation pre-contracted with thromboxane A2 U 46619 mimetics. Data are shown as percent relaxation.

Akumulácia neutrofilov v myokardiu bola meraná ako myeloperoxidázová aktivita polytrónom homogenizovaného myokardiálneho tkaniva.Myocardial neutrophil accumulation was measured as myeloperoxidase activity by polytron homogenized myocardial tissue.

Výsledky týchto experimentov sú znázornené na obr. 8. U mačiek ošetrených neblokujúcou protilátkou proti P-selektínu mu MAb PNB1.6 činil rozsah myokardiálnej ischémie 33 ± 5 % ohrozenej oblasti. Oproti tomu rozsah ischémie u zvierat ošetrených PB1.3 bol významne (P < 0,01) nižší; 15 ±3 % ohrozenej oblasti. Endoteliálne závislá relaxácia na acetylcholín bola tiež významne zachovaná v ischemických-reperfúzovaných koronárnych artériách odobratých mačkám, ošetreným s mu MAb PB1.3, oproti mu MAb PNB1.6 (67 ± 6 oproti 11 ± 3 %, P < 0,01). Že sú tieto javy prisúditelné zníženiu myokardiálnej infiltrácie leukocytov, je pravdepodobné z významného (P < 0,1) zníženia počtu PMN v myokar70 diálnom tkanive zo zvierat ošetrených mu MAb PB1.3 (64 ± 7 PMN/mm²) oproti zvieratám ošetreným mu MAb PNB1.6 (136 + 12 PMN/mm²).The results of these experiments are shown in FIG. 8. In cats treated with a non-blocking anti-P-selectin antibody, the MAb PNB1.6 had a myocardial ischemia range of 33 ± 5% of the endangered area. In contrast, the extent of ischemia in animals treated with PB1.3 was significantly (P <0.01) lower; 15 ± 3% of the vulnerable zone. Endothelial-dependent acetylcholine relaxation was also significantly preserved in ischemic-reperfused coronary arteries collected from cats treated with mu MAb PB1.3, versus mu MAb PNB1.6 (67 ± 6 vs. 11 ± 3%, P <0.01). That these phenomena are attributable to a decrease in myocardial leukocyte infiltration is likely to result in a significant (P <0.1) reduction in PMN in myocar70 diary tissue from mu MAb PB1.3 (64 ± 7 PMN / mm ² ) treated animals compared to mu MAb treated animals. PNB1.6 (136 + 12 PMN / mm ² ).

Príklad 10 • Produkcia humanizovanvch protilátok proti P-selektínu • A. Klonóvanie a sekvencovanie variabilných oblastí mu MAb PB1.3Example 10 Production of humanized P-selectin antibodies A. Cloning and sequencing of mu MAb PB1.3 variable regions

Izolácia mu MAb PB1.3 je opísaná v príklade 2. Totálna RNA bola izolovaná z hybridómových buniek produkujúcich mu MAb PB1.3. Jednotlivé cDNA, kódujúce variabilné oblasti ťažkého a ľahkého reťazca mu MAb PB1.3, boli amplifikované reťazovou reakciou s polymerázou (PCR). Celá myšia variabilná oblasť bola amplifikovaná pomocou zmesi degenerátových primárov, ktoré hybridizovali vnútri vedúcej sekvencie, a jediného priméru, ktorý hybridizoval k myšej konštantnej oblasti blízko spojky V-C; viď Jonesá Bendig, Bio/Technology 9:88-89 • (1991) a Bio/Technology 9:579 (1991). PCR fragmenty boli klónované a sekvencované. Nukleotidové sekvencie a zodpovedajúce aminokyselinové sekvencie pre variabilné oblasti ťažkého, resp. ľahkého reťazca mu MAb PB1.3 sú uvedené na obr. 9, resp. 10.The isolation of mu MAb PB1.3 is described in Example 2. Total RNA was isolated from hybridoma cells producing mu MAb PB1.3. Individual cDNAs encoding the mu MAb PB1.3 heavy and light chain variable regions were amplified by polymerase chain reaction (PCR). The entire mouse variable region was amplified using a mixture of degenerate primers that hybridized within the leader sequence and a single primer that hybridized to the mouse constant region near the V-C junction; see Jonesá Bendig, Bio / Technology 9: 88-89 (1991) and Bio / Technology 9: 579 (1991). The PCR fragments were cloned and sequenced. Nucleotide sequences and corresponding amino acid sequences for the heavy and heavy chain variable regions, respectively. The mu MAb PB1.3 light chain are shown in FIG. 9, respectively. 10th

B. Modelovanie štruktúry variabilných oblastí mu MAb PB1.3B. Modeling the mu MAb PB1.3 variable region structure

Bol skonštruovaný model oblastí V_L a V_H mu MAb PB1.3. Model bol vypracovaný na pracovnej stanici Silicon Graphics IRIS 4D, pracujúcej pod operačným systémom UNIX, s použitím molekulárnej modelovacej sady QUANTA (Polygen Corp., USA). Aminokyselinové sekvencie variabilných oblastí mu MAb PB1.3 boli porovnané so sekvenciami variabilných oblastí štruktúrne vyriešeného imunoglobulínu, viď tabuľky 1 a 2.A model of the V _L and V _H regions of the MAb PB1.3 was constructed. The model was developed on a Silicon Graphics IRIS 4D workstation operating under the UNIX operating system using the QUANTA molecular modeling kit (Polygen Corp., USA). The amino acid sequences of the mu MAb PB1.3 variable regions were compared to the structurally resolved immunoglobulin variable region sequences, see Tables 1 and 2.

C. Návrh pretvorených variabilných oblasti mu MAb PB1.3C. Design of reshaped mu MAb PB1.3 variable regions

Boli vybrané ľudské variabilné oblasti, ktoré mali úseky základnej štruktúry najpodobnejšie tým, aké sa nachádzajú vo variabilných oblastiach mu MAb PB1.3. Variabilná oblasť ľahkého reťazca ľudskej mAB DEN a variabilná oblasť ťažkého reťazca ľudskej mAB 21/28'CL boli zvolené ako základné štruktúry k napojeniu na zodpovedajúce oblasti určujúce komplementaritu (CDR) mu MAb PB1.3. Ľudské úseky základnej štruktúry boli modifikované metodológiou opísanou v Monoclonal Antibodies, 2:£ Applications in Clinical Oncology (ed. A. Epenetos. Chapman Halí, 1992, ktorý dokument je tu zahrnutý formou odkazu; viď predovšetkým tam obsiahnutú prácu Bending a ď., The Humanization of Mouse Monoclonal Antibodies by CDR-Grafting: Examples with Anti-Viral and Anti-Tumor Celí Antibodies, ktorá je tu zahrnutá formou odkazu). Priradenie aminokyselín variabilných oblastí, vedúce k návrhu pretvorených variabilných oblastí humanizovanej PB1.3, je uvedené v tabuľkách 1 a 2.Human variable regions were selected that had framework regions most similar to those found in the mu MAb PB1.3 variable regions. The human mAB DEN light chain variable region and the human mAB 21 / 28'CL heavy chain variable region were selected as frameworks for attachment to the corresponding complementarity determining regions (CDRs) of mu MAb PB1.3. The human frameworks have been modified by the methodology described in Monoclonal Antibodies, 2: Applications in Clinical Oncology (ed. A. Epenetos. Chapman Hall, 1992, which is incorporated herein by reference; see in particular, Bending et al., The. Humanization of Mouse Monoclonal Antibodies (CDR-Grafting: Examples with Anti-Viral and Anti-Tumor Cell Antibodies, incorporated herein by reference). The amino acid allocation of the variable regions resulting in the design of reshaped variable regions of humanized PB1.3 is shown in Tables 1 and 2.

Boli modelované tri verzie variabilnej oblasti ťažkého reťazca a boli označené CY1748RH_A, CY1748RH_B a CY1748RH_C. Nukleotidové sekvencie a zodpovedajúce aminokyselinové sekvencie týchto variabilných oblastí a signálnych peptidov sú uvedené na obr. 11, 12, resp. 13. V prípade CY1748RH_B boli dva prvé myšie zvyšky, zachované v CY1748RH_A (glutámová kyselina a alanín), zmenené späť na pôvodné ľudské aminokyseliny (glutamín a valín), nachádzajúce sa v donore ľudskom FR1. V prípade CY1748RH_C z počítačového modelovania vyplývalo, že myší lyzín v polohe 73 by mohol tvoriť soľný môstik so zvyškom 55 (asparágová kyselina) v CDR2. Pokiaľ by to tak bolo, potom by bol lyzín dôležitý pre stabilizáciu slučky H2. Ľudský treonínový zvyšok v tejto polohe by bol neschopný takýto soľný môstik vytvoriť. Teda verzia CY1748RH_C substituuje myší lyzín v polohe CY1748RH_A. Verzia CY1748RH_B obsahuje najvyšší počet ľudských aminokyselinových zvyškov. Zhrnutie aminokyselinových rozdielov medzi týmito troma verziami ťažkého reťaz72 ca je uvedené v tabulke 3.Three versions of the heavy chain variable region were modeled and were designated CY1748RH _A , CY1748RH _B and CY1748RH _C. The nucleotide sequences and corresponding amino acid sequences of these variable regions and signal peptides are shown in FIG. 11, 12, respectively. 13. In the case of CY1748RH _B , the first two mouse residues retained in CY1748RH _A (glutamic acid and alanine) were changed back to the original human amino acids (glutamine and valine) found in the human FR1 donor. In the case of CY1748RH _C , computer modeling suggested that mouse lysine at position 73 could form a salt bridge with residue 55 (aspartic acid) in CDR2. If so, lysine would be important for stabilizing the H2 loop. A human threonine residue at this position would be incapable of forming such a salt bridge. Thus, the version of CY1748RH _C substitutes mouse lysine at position CY1748RH _A. Version CY1748RH _B contains the highest number of human amino acid residues. A summary of the amino acid differences between the three versions of the 72 c heavy chain is given in Table 3.

Boli modelované štyri verzie variabilnej oblasti lahkého reťazca a boli označené CY1748RL_Ä, CY1748RL_B, CY1748RL_C a CY1748RLq. Nukleotidové sekvencie a zodpovedajúce aminokyselinové sekvencie týchto variabilných oblastí a signálnych peptidov sú uvedené na obr. 14, 15, 16, resp. 17. Z počítačového modelovania vyplývalo, že myšia glutámová kyselina v polohe 60 by mohla byť dôležitá pri väzbe P-selektínu. Tento zvyšok bol začlenený vo verzii CY1748LR_A, ale vo verzii CY1748LR_B bol nahradený pôvodným serínom z ľudskej základnej štruktúry. Myšia asparágová kyselina by mohla mať nábojovú interakciu so zvyškom 24 v slučke 1 (Ll), a teda je CY1748LR_C identický s CY1748LR_Ä s výnimkou náhrady myšieho zvyšku asparágovej kyseliny v polohe 70 za glutámovú kyselinu z ľudskej základnej štruktúry. CY1748LR_D zahrnuje obe tieto náhrady aminokyselín a zo všetkých štyroch verzií obsahuje najväčší počet ľudských aminokyselinových zvyškov. Zhrnutie aminokyselinových rozdielov medzi týmito štyrmi verziami lahkého reťazca je uvedené v tabuľke 4.Four versions of the light chain variable region were modeled and were designated CY1748RL _Ä , CY1748RL _B , CY1748RL _C and CY1748RLq. The nucleotide sequences and corresponding amino acid sequences of these variable regions and signal peptides are shown in FIG. 14, 15, 16, respectively. 17. Computer modeling suggested that the mouse glutamic acid at position 60 could be important in the binding of P-selectin. This residue was incorporated in version CY1748LR _A , but in version CY1748LR _{B it} was replaced by the original serine from the human framework. Mouse aspartic acid could have a charge interaction with residue 24 in loop 1 (L1) and thus CY1748LR _{C is} identical to CY1748LR _Ä except for the replacement of the murine aspartic acid residue at position 70 by glutamic acid from the human backbone. CY1748LR _D includes both of these amino acid substitutions and contains the largest number of human amino acid residues of all four versions. A summary of the amino acid differences between the four light chain versions is given in Table 4.

D. Subklonovanie cDNA, kódujúcich variabilné oblasti ťažkého a ľahkého reťazca, do expresných vektorovD. Subcloning of cDNAs encoding the heavy and light chain variable regions into expression vectors

1) Konštrukcia expresných vektorov1) Construction of expression vectors

a) pHCMV-1748RL-KR-neo(a) pHCMV-1748RL-KR-neo

Expresný vektor obsahuje zosilňovač transkripcie a promótor ľudského cytomegalovírusu (HCMV) na uskutočnenie transkripcie ľahkého reťazca rekombinačného imunoglobulínu, kódujúce sekvencie bakteriálneho génu neo, ktoré pôsobia ako dominantný voliteľný markér počas stabilnej transformácie, a SV40 ako počiatok replikácie na dosiahnutie vysokých úrovní dočasnej expresie v bunkách cos. Za účelom konštrukcie vekto73 ra bol fragment HindlII-SacII z vektora pUC8, obsahujúci fragment Pstl-m z HCMV (Boshart a df., Celí 41:521-530 (1985)), konvertovaný pomocou príslušných adaptorových oligonukleotidov na fragment EcoRI-HindlII. Pri trojcestnej ligácii bol l,2kb fragment EcoRI-HindlII, obsahujúci zosilňovač transkripcia-promótor HCMV ligovaný k 5,05 kb fragmentu z pSV2neo (Southern a Berg, J. Mol. App. Gener. 1:327341 (1982)) a 0,5 kb fragmentu HindlII-BamHI, obsahujúcemu lahkú variabilnú oblasť V_Llys « (Foote a Winter, J. Mol. Biol. 224:487-499 (1982)). Miesto HindlII v pSV2neo bolo predtým odstránené vyplnením Klenowovou polymerázou za vzniku vektora označeného pHCMV-V_Llys-neo.The expression vector contains a transcription enhancer and a human cytomegalovirus (HCMV) promoter to effect transcription of the recombinant immunoglobulin light chain, encoding the bacterial neo gene sequences that act as the dominant selectable marker during stable transformation, and SV40 as the origin of replication to achieve high levels of transient expression. . For the construction of this fragment, the HindIII-SacII fragment of the pUC8 vector containing the PstI-m fragment of HCMV (Boshart et al., Cell 41: 521-530 (1985)) was converted to the EcoRI-HindIII fragment using the appropriate adapter oligonucleotides. For the three-way ligation, the 1.2 kb EcoRI-HindIII fragment containing the HCMV transcriptional promoter was ligated to the 5.05 kb fragment from pSV2neo (Southern and Berg, J. Mol. App. Gener. 1: 327341 (1982)) and 0, A 5 kb HindIII-BamHI fragment containing a light variable region of _L Lys (Foote and Winter, J. Mol. Biol. 224: 487-499 (1982)). The HindIII site in pSV2neo was previously removed by filling with Klenow polymerase to give a vector labeled pHCMV-V _L lys-neo.

Fragment “2,6 kb EcoRI genómovej ludskej oblasti bol klonovaný (Rabbitts a ď., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 113:166-171 (1984)) a subklonovaný do pUC vektora pUCKR17 (Mengle-Gaw, EMBO J. 6:1959-1965 (1987)). Miesta BamHI boli pridané k obom koncom fragmentu pomocou adaptérov EcoRI-BamHI. Tento fragment potom bol vložený do miesta BamHI v pHCMV-V_Llys-K_R-neo v príslušnej orientácii na vytvorenie pHCMV-V_Llys-K_R-neo. Na ulahčenie inzercie pretvorených ludských variabilných oblastí bolo miesto BamHI na 3'-strane ludskej konštantnej oblasti odstránené vyplnením Klenowovou polymerázou. Vo vzniknutom vektore, označenom pHCMV-l748RL-KR-neo, je fragment HindlII-BamHI, obsahujúci V_Llys, lahko nahradený s VL pretvorenej protilátky.The 2.6 kb EcoRI genomic human region fragment was cloned (Rabbitts et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 113: 166-171 (1984)) and subcloned into the pUC vector pUCKR17 (Mengle-Gaw, EMBO J. 6 1959-1965 (1987)). BamHI sites were added to both ends of the fragment using EcoRI-BamHI adapters. This fragment was then ligated into the BamHI site of pHCMV-V _L Lys-A neo _R in the appropriate orientation to form a V _{L pHCMV-Lys-R} The neo. To facilitate the insertion of reshaped human variable regions, the BamHI site on the 3'-side of the human constant region was removed by filling with Klenow polymerase. In the resulting vector, designated pHCMV-1748RL-KR-neo, the HindIII-BamHI fragment containing V _L lys is readily replaced with the VL of the reshaped antibody.

b) pHCMV-1748-TlC-neob) pHCMV-1748-T1C-neo

Konštrukcia tohto vektora bola zahájená rovnakou trojcestnou ligáciou, aká je opísaná vyššie pre tvorbu pHCMV-V_Llys-neo, avšak s inzerciou 0,7 kb fragmentu HindlII-BamHI, obsahujúceho ťažkú variabilnú oblasť V_Rlys (Verhoeyen a ď., Science 239:1534-1536 (1988), Foote a Winter, vidf vyššie) miesto 0,5 kb fragmentu HindlII-BamHI, obsahujúceho lahký reťazec V_Llys3f. Do miesta BamHI bola vložená cDNA, kódujúca ľudskú Tl konštantnú oblasť, za vzniku vektora označeného pHCMV-V_Hlys-neo. cDNA, kódujúca ľudskú Tl konštantnú oblasť, bola klonovaná z ľudskej bunkovej línie, vylučujúcej ľudskú Tl protilátku, amplifikáciou PCR. Na každom konci cDNA boli vytvorené miesta BamHI a na 5-koniec sekvencie cDNA bolo zavedené akceptorové miesto zostrihu a 65bp intrónová sekvencia. Fragment BamHI (1176 bp) obsahujúci ľudskú Tl cDNA plus akceptorové miesto zostrihu a intrónovú sekvenciu potom bol klonovaný do expresného vektora. Ako v prípade expresného vektora ľahkého reťazca bolo miesto BamHI na 3'-konci ľudskej τΐ konštantnej oblasti odstránené vyplnením Klenowovou polymerázou. U tohoto vektora, označeného pHCMV-1748-TlC-neo, je fragment HindlII-BamHI, obsahujúci nežiadúci V_Hlys, ľahko nahradený V_H pretvorenej protilátky.Construction of the vector was initiated by the same three-way ligation to that described above for the production of pHCMV-Lys in _L-neo, but with 0.7 kilobytes insertion of a HindIII-BamHI fragment containing the variable region of the heavy W _R lys (Verhoeyen et al., Science 239 (1534-1536 (1988), Foote and Winter, supra) instead of the 0.5 kb HindIII-BamHI fragment containing the light chain V _{L of} lys3f. A cDNA encoding the human T1 constant region was inserted into the BamHI site to produce a vector designated pHCMV-V _H lys-neo. The cDNA encoding the human T1 constant region was cloned from the human T1 antibody secreting cell line by PCR amplification. BamHI sites were created at each end of the cDNA and an acceptor splice site and a 65bp intron sequence were introduced at the 5-end of the cDNA sequence. The BamHI fragment (1176 bp) containing the human T1 cDNA plus the splice acceptor site and the intron sequence was then cloned into an expression vector. As with the light chain expression vector, the BamHI site at the 3'-end of the human τΐ constant region was removed by filling with Klenow polymerase. In this vector, designated pHCMV-1748-T1C-neo, a HindIII-BamHI fragment containing unwanted V _H lys is readily replaced by a V _H reshaped antibody.

2) Inzercia sekvencii kódujúcich imunoglobulín cDNA, kódujúce variabilnú oblasť ťažkého reťazca mu MAb PB1.3 a troch humanizovaných verzií, boli štandardnými technikami vložené do expresného vektora HCMV-TlC-neo za vzniku expresných plazmidov HCMV-1747CH-TlC-neo, HCMV-1748RH_a-t1C-neo, HCMV-1748RH_B-Tlc-neo a HCMV-1748RH_c-TlC-neo. Nukleotidová sekvencia cDNA konštantnej oblasti ľudského IgG a sekvencie zodpovedajúceho proteínu je uvedená v Ellison a d., Nuc. Acids Res. 10:4071-4079 (1982). cDNA, kódujúce variabilnú oblasť ľahkého reťazca CY1747(PB1.3) a štyroch humanizovaných verzií, boli vložené do expresného vektora HCMV-KR-neo za vzniku plazmidov HCMV-1747CL-KR-neo, HCMV-1748RL_A~KR-neo atd. Nukleotidová sekvencia génu ľudskéjVkonštantnej oblasti a sekvencia zodpovedajúceho proteínu je uvedená v Hieter a d., Celí 22:197-207 (1980; zahrnuté tu formou odkazu pre všetky účely). Schématické mapy expresných vektorov ťažkého a ľahkého reťazca sú uvedené na obr. 18 a 19. Súčasnou expresiou vhodných kombinácií ťažkého a ľahkého reťazca je možné exprimovať niekoľko protilátok. Napríklad súčasnou expresiou HCMV-1748RH_A-TlC-neo a HCMV-1748RL_A~KR-neo vzniká pretvorená2) Insertion of immunoglobulin cDNA coding sequences encoding the mu MAb heavy chain variable region PB1.3 and three humanized versions were inserted into the HCMV-TlC-neo expression vector by standard techniques to produce the expression plasmids HCMV-1747CH-TlC-neo, HCMV-1748RH _and -t1C-neo, HCMV-1748RH _B -Tlc-neo and HCMV-1748RH _c -TlC-neo. The nucleotide sequence of the human IgG constant region cDNA and the sequence of the corresponding protein is set forth in Ellison et al., Nuc. Acids Res. 10: 4071-4079 (1982). cDNAs encoding the light chain variable region of CY1747 (PB1.3) and four humanized versions were inserted into the expression vector HCMV-KR-neo to generate plasmids HCMV-1747CL-KR-neo, HCMV-1748RL _A -KR-neo, etc. The nucleotide sequence of the human constant region gene and the corresponding protein sequence is set forth in Hieter et al., Cell 22: 197-207 (1980; incorporated herein by reference for all purposes). Schematic maps of the heavy and light chain expression vectors are shown in FIG. 18 and 19. Several antibodies can be expressed by co-expressing suitable heavy and light chain combinations. For example, co-expression of HCMV-1748RH _A -TlC-neo and HCMV-1748RL _A -KR-neo results in a reshaped

MAb PB1.3 (H_A/L_A). Súčasnou expresiou HCMV-1747CH-TlC-neo a HCMV-1747CL-KR-neo vzniká chi MAb PB1.3 (tj. chimérická protilátka zahrnujúca myšie variabilné domény a ľudské konštantné domény).MAb PB1.3 (H _A / L _A ). Co-expression of HCMV-1747CH-T1C-neo and HCMV-1747CL-KR-neo produces chi MAb PB1.3 (i.e., a chimeric antibody comprising mouse variable domains and human constant domains).

E. Elektroporácia buniek COSE. Electroporation of COS cells

Konštrukcie DNA boli testované v bunkách COS na dočasnú expresiu chi MAb PB1.3 a rôzne pretvorené verzie protilátok MAb PB1.3. DNA bola do buniek zavedená elektroporáciou pomocou zariadenia Gene Pulser (Biorad). Bunky COS boli trypsinizované a premyté jeden raz fosfátom pufrovaným salinickým roztokom (PBS). DNA (po 10 plazmidu ťažkého reťazca a plazmidu príslušného ľahkého reťazca) a 0,8 ml alikvótu •7DNA constructs were tested in COS cells for transient expression of chi MAb PB1.3 and various reshaped versions of MAb PB1.3 antibodies. DNA was introduced into the cells by electroporation using a Gene Pulser (Biorad). COS cells were trypsinized and washed once with phosphate buffered saline (PBS). DNA (10 heavy chain plasmid and respective light chain plasmid) and 0.8 ml aliquot • 7

1.10 buniek/ml v PBS boli vložené do sterilnej kyvety Gene Pulser (Biorad, medzera 0,4 cm). Bol vytvorený pulz s 1900 V a kapacitanciou 25 μΕ. Po 10 min zotavení pri teplote miestnosti boli elektroporované bunky pridané k 20 ml média DMEM (GIBCO/BRL), obsahujúceho 10 % fetálneho hovädzieho séra. Po 48 h inkubácie bolo médium zhromaždené, centrifugované kvôli odstráneniu bunkových zlomkov a skladované krátkodobo za sterilných podmienok pri 4 °C.1.10 cells / ml in PBS were placed in a sterile Gene Pulser cuvette (Biorad, 0.4 cm gap). A pulse with 1900 V and a capacitance of 25 μΕ was generated. After 10 min recovery at room temperature, electroporated cells were added to 20 ml DMEM medium (GIBCO / BRL) containing 10% fetal bovine serum. After 48 h incubation, the medium was collected, centrifuged to remove cell debris, and stored briefly under sterile conditions at 4 ° C.

Príklad 11Example 11

Analýza humanizovanvch protilátokAnalysis of humanized antibodies

Médiá z transfikovaných buniek COS boli analyzované pomocou ELISA za účelom kvantifikácie hladín produkovanej ľudskej protilátky a analýzy schopnosti viazať sa na rekombinačný rozpustný P-selektín (rsP-selektín). Mikrotitračné platne Immulon (Dynatech, #011-010-3355) boli potiahnuté so 100 μΐ/jamku roztoku kozieho anti-ľudského IgG (celá molekula, Sigma #1-1886) na konečnú koncentráciu 12,5 μg/ml alebo roz76 tokom rsP-selektínu (1,2 mg/ml), zriedenom Dulbeccovým fosfátom pufrovaným salinickým roztokom (DPBS). Platne boli potiahnuté cez noc pri 4 °c alebo po dobu 2 h pri 37 °C. Potom boli platne premyté trikrát s DPBS. Potom boli platne 1 h alebo ďalej pri teplote miestnosti blokované so 400 μΐ/jamku DPBS + 1 % hovädzieho sérového albumínu (BSA, Sigma, #A-7888). Potom boli platne premyté trikrát s DPBS.Media from transfected COS cells were analyzed by ELISA to quantify the levels of human antibody produced and to analyze the ability to bind to recombinant soluble P-selectin (rsP-selectin). Immulon microtiter plates (Dynatech, # 011-010-3355) were coated with 100 μΐ / well of goat anti-human IgG solution (whole molecule, Sigma # 1-1886) to a final concentration of 12.5 μg / ml or with rsP- selectin (1.2 mg / ml) diluted with Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS). Plates were coated overnight at 4 ° C or for 2 h at 37 ° C. Plates were then washed three times with DPBS. Plates were then blocked for 1 h or further at room temperature with 400 μΐ / well DPBS + 1% bovine serum albumin (BSA, Sigma, # A-7888). Plates were then washed three times with DPBS.

K platniam boli pridané postupne riedené monoklonálne protilátky v DPBS + 1 % BSA (100 μΐ/jamku) a platne boli inkubované 1 h pri teplote miestnosti. Potom boli platne premyté trikrát s DPBS. K platniam bolo pridaných 100 μΐ/jamku druhej protilátky (peroxidázový konjugát kozieho anti -ludského IgG, Sigma #A-8867), zriedené 1:1000 v DPBS +1 % BSA a platne boli inkubované 1 h pri teplote miestnosti. Potom boli platne premyté trikrát s DPBS. K platniam bolo pridaných 100 μΐ/jamku tetrametylbenzidínperoxidázového substrátu/H₂O₂ (TMB, Kirkegaard and Perry Laboratories #50-76-00), bola ponechaná príslušná doba pre vývoj sfarbenia (obvykle 3 až 15 min) a reakcia bola zastavená prídavkom 100 μΐ/jamku IM kyseliny fosforečnej. Platne boli odčítané pri 450 nm v zariadení Titertek Multiskan MCC/340.Serially diluted monoclonal antibodies in DPBS + 1% BSA (100 μΐ / well) were added to the plates and incubated for 1 hour at room temperature. Plates were then washed three times with DPBS. 100 μ protilátky / well of the second antibody (goat anti-human IgG peroxidase conjugate, Sigma # A-8867) was added to the plates, diluted 1: 1000 in DPBS + 1% BSA and incubated for 1 hour at room temperature. Plates were then washed three times with DPBS. 100 μΐ / well of tetramethylbenzidine peroxidase substrate / H ₂ O ₂ (TMB, Kirkegaard and Perry Laboratories # 50-76-00) was added to the plates, the appropriate time for color development (usually 3 to 15 min) was allowed and the reaction was stopped by the addition of 100 μΐ / well IM phosphoric acid. Plates were read at 450 nm in a Titertek Multiskan MCC / 340.

Koncentrácia protilátok, produkovaných vo všetkých supernatantoch buniek COS, bola stanovená porovnaním výsledkov ELISA pre IgG s ludskou protilátkou IgGl (lahký reťazec ae, Sigma #1-3889) so známou koncentráciou.The concentration of antibodies produced in all supernatants of COS cells was determined by comparing the ELISA results for IgG with the human IgG1 antibody (light chain ae, Sigma # 1-3889) to a known concentration.

Väzba P-selektínu bola vynesená ako optická hustota proti koncentrácii IgG. Väzbové krivky chi PB1.3 a rôznych pretvorených verzií pretvorených MAb PB1.3 sú uvedené na obr. 20, 21 a 22. Účelom bolo vybrať humanizovanú protilátku, vykazujúcu v podstate nerozlíšitelné väzbové charakteristiky od chi MAb PB1.3. Pokial by takéto charakteristiky vykazovalo viac humanizovaných protilátok, bola by preferovaná tá z nich, ktorá obsahuje najviac ľudských aminokyselinových zvyškov (alebo najmenej myších aminokyselín), pretože u tejto verzie je najmenej pravdepodobná indukcia odpovede HAMA v klinickom použití. Všetky štyri pretvorené ľahké reťazce, exprimované súčasne s ťažkým reťazcom CY1748RH_Ä, generovali protilátky, ktoré sa viazali na P-selektín i na chi MAb PB1.3. Z nich bola pre ďalšie experimenty vybratá variabilná oblasť lahkého reťazca CY1748LR_D, pretože obsahuje najviac ľudských aminokyselinových zvyškov. Variabilné oblasti ťažkého reťazca CY1748RH_a a CY1748RHq, pokiaľ boli exprimované súčasne s variabilnými oblasťami ľahkého reťazca CY1748RL& a CY1748RL_D, taktiež generovali protilátky, ktoré sa viazali na rsP-selektín v rovnakom rozsahu ako chi MAb PB1.3 (obr. 22). Z týchto ťažkých reťazcov je preferovaný CY1748RH_B, pretože obsahuje najviac ľudských aminokyselinových zvyškov. Preferovaná humanizovaná protilátka je teda tvorená z ľahkého reťazca D a ťažkého reťazca B a označuje sa ako pretvorená MAb PB1.3 (H_b/L_d).P-selectin binding was plotted as the optical density against the IgG concentration. The binding curves of chi PB1.3 and various reshaped versions of reshaped MAb PB1.3 are shown in FIG. 20, 21 and 22. The purpose was to select a humanized antibody showing substantially indistinguishable binding characteristics from chi MAb PB1.3. If more humanized antibodies exhibit such characteristics, one that contains the most human amino acid residues (or at least murine amino acids) would be preferred because induction of the HAMA response in clinical use is least likely in this version. All four reshaped light chains, expressed concurrently with the heavy chain of CY1748RH _Ä , generated antibodies that bound to both P-selectin and chi MAb PB1.3. Of these, the CY1748LR _D light chain variable region was selected for further experiments because it contains the most human amino acid residues. The heavy chain variable regions of CY1748RH _α and CY1748RHq, when expressed concurrently with the light chain variable regions CY1748RL & and CY1748RL _D , also generated antibodies that bound rsP-selectin to the same extent as chi MAb PB1.3 (Fig. 22). Of these heavy chains, CY1748RH _B is preferred because it contains the most human amino acid residues. Thus, a preferred humanized antibody is comprised of light chain D and heavy chain B and is referred to as reshaped MAb PB1.3 (H _b / L _d ).

Príklad 12Example 12

Stabilná expresia pretvorenej MAb PB1.3 (H_B/L_p) v bunkách CHOStable expression of reshaped MAb PB1.3 (H _B / L _p) in CHO

A. Zavedenie humanizovaných imunoqlobulínovvch reťazcov do buniek CHOA. Introduction of humanized immunoglobulin chains into CHO cells

1) Konštrukcia vektorov1) Construction of vectors

a) pHCMV-1748RH-TlC-dhfra) pHCMV-1748RH-TlC-dhfr

Tento vektor je identický s pHCMV-1748RH-TlC-neo, opísaným v príklade 11, s tou výnimkou, že gén neo je nahradený dihydrofolátreduktázovým (dhfr) génom, naviazaným na defektnú sekvenciu SV40 promótor-zosilňovač transkripcie. Na odstránenie sekvencie zosilňovača z raného promótora SV40 bola plazmidová DNA pSV2-dhfr (Subramani a d., Mol. Celí. Biol.This vector is identical to the pHCMV-1748RH-T1C-neo described in Example 11 except that the neo gene is replaced by a dihydrofolate reductase (dhfr) gene linked to a defective SV40 promoter-enhancer sequence. To remove the enhancer sequence from the early SV40 promoter, plasmid DNA was pSV2-dhfr (Subramani et al., Mol. Cell. Biol.

1:854-864 (1981)) digerovaná so Sphl a PvuII, vyplnená Klenowovou polymerázou a autoligovaná za vzniku pSV2-dhfr- ΔΕ. Fragment ”3,7 kb EcoRI, obsahujúci promótor HCMV, variabilnú oblasť ťažkého reťazca Vjjlys a genómový kloň DNA ludskej Tl konštantnej oblasti, bol pomocou EcoRI vyrezaný z plazmidu pHCMV-V_Hlys-Tl-neo. Tento fragment bol ligovaný k EcoRI-digerovanému pSV2-dhfr-AE na vytvorenie pHCMV-V_Hlys-Tl-dhfr. Genomický kloň konštantnej oblasti Tl bol nahradený fragmentom BamHI obsahujúcim kloň cDNA ludskej konštantnej oblasti *rl - opísané v príklade 11. Miesto BamHI na 3'-konci ludskej konštantnej oblasti Tl potom bolo odstránené vyplnením Klenowovou polymerázou ako v príklade 11. Výsledný vektor bol označený pHCMV-174RH-TC-dhfr. Fragment HindlII-BamHI tohto vektora, obsahujúci nežiadúci V_Hlys, je lahko nahradený V_H pretvorenej protilátky.1: 854-864 (1981)) digested with SphI and PvuII, filled with Klenow polymerase and autoligated to give pSV2-dhfr- ΔΕ. The 3.7 kb EcoRI fragment containing the HCMV promoter, the Vjjlys heavy chain variable region and the human T1 constant region DNA genomic clone was excised from plasmid pHCMV-V _H lys-Tl-neo with EcoRI. This fragment was ligated to EcoRI-digested pSV2-dhfr-AE to generate pHCMV-V _H lys-T1-dhfr. The genomic T1 constant region was replaced with a BamHI fragment containing the human constant region * rl cDNA described in Example 11. The BamHI site at the 3'-end of the human T1 constant region was then removed by Klenow polymerase filling as in Example 11. The resulting vector was designated pHCMV. -174RH-TC-dhfr. The HindIII-BamHI fragment of this vector, containing the unwanted V _H lys, is readily replaced by the V _H reshaped antibody.

b) pHCMV-1748RH-T4-dhfrb) pHCMV-1748RH-T4-dhfr

Tento vektor je identický s vyššie opísaným pHCMV-1748RH-TlC-dhfr až na náhradu klonu cDNA ludskej konštantnej oblasti Tl genomickým klonom ludskej konštantnej oblasti t4. Za účelom konštrukcie tohoto vektora bol ”7,0 fragment HindlII DNA, obsahujúci genomický kloň ludskej konštantnej oblasti t4 (Bruggeman a df., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)) subklonovaný do miesta HindlII pUC19 na vytvorenie plazmidu s názvom 428D. Pretože ludský fragment t4 už mal v blízkosti 3'-konca miesto BamHI, bol subklon vložený do pUC19 v orientácii, ktorá toto miesto vzdialila od miesta BamHI v polylinkéri pUC19. Ľudský fragment t4 7,0 kb bol z 428D vyrezaný pomocou BamHI a ligovaný do pHCMV-V_Hlys-neo za vzniku plazmidu pHCMV-V_Hlys-T4-neo.This vector is identical to the above described pHCMV-1748RH-T1C-dhfr except for the replacement of the human T1 constant region cDNA clone by the genomic clone of the human t4 constant region. To construct this vector, a 7.0 HindIII DNA fragment containing the genomic clone of the human t4 constant region (Bruggeman et al., J. Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987)) was subcloned into the HindIII site of pUC19 to create a plasmid. called 428D. Since the human t4 fragment already had a BamHI site near the 3'-end, the subclone was inserted into pUC19 in the orientation that spaced this site from the BamHI site in the pUC19 polylinker. The 7.0 kb human t4 fragment was excised from BamHI from 428D and ligated into pHCMV-V _H lys-neo to give plasmid pHCMV-V _H lys-T4-neo.

Konečný plazmid bol konštruovaný trojcestnou ligáciou 5,4 kb fragmentu BamHI-HindlII, obsahujúceho zosilňovač-promótor HCMV a sekvenciu plazmidu pSV2-dhfr-ΔΕ, 0,5 kb fragmentu HindlII-BamHI, obsahujúceho VH pretvorené ľudské protilátky 1748, a 7,0 kb fragmentu BamHI-BamHI, obsahujúceho genomický kloň ľudskej konštantnej oblasti t4.The final plasmid was constructed by three-way ligation of a 5.4 kb BamHI-HindIII fragment containing the HCMV enhancer-promoter and the sequence of plasmid pSV2-dhfr-ΔΕ, a 0.5 kb HindIII-BamHI fragment containing the VH reshaped human 1748 antibodies, and 7.0 kb a BamHI-BamHI fragment containing the genomic clone of the human constant region t4.

2) Inzercia sekvencií kódujúcich imunoqlobulin cDNA, kódujúca variabilnú oblasť ťažkého reťazca 1748RH_Ä, bola klonovaná do expresného vektora HCMV-lC-dhfr za vzniku HCMV-1748RH_Ä-lC-dhfr. cDNA, kódujúca 1748RH_B, bola klonovaná do expresného vektora HCMV-lC-dhfr, resp. HCMV-4C-dhfr, za vzniku plazmidov HCMV-1748RH_B-lC-dhfr a HCMV-l748RH_B-4C-dhfr. Nukleotidovú sekvenciu génu konštantnej oblasti ľudského IgG4 a zodpovedajúcu sekvenciu aminokyselín uvádza Ellison a ď., DNA 1:11-18 (1981). Vektor HCMV-lC-dhfr exprimuje protilátku izotypu IgGl a vektor HCMV-T4C-dhfr protilátku izotypu IgG4, ak je každý z nich exprimovaný súčasne s vektorom ľahkého reťazca ae . Schematické mapy dhfr-expresných vektorov sú uvedené na obr. 23, resp. 24.2) inserting the cDNA encoding sequences imunoqlobulin, encoding the variable heavy chain 1748RHA _R, was cloned into the expression vector HCMV-lC-dhfr to yield the HCMV-1748RHA _R-LC-dhfr. The cDNA encoding 1748RH _B was cloned into the expression vector HCMV-1C-dhfr, respectively. HCMV-4C-dhfr, to form plasmids HCMV-1748RH _B -1C-dhfr and HCMV-1748RH _B -4C-dhfr. The nucleotide sequence of the human IgG4 constant region gene and the corresponding amino acid sequence is provided by Ellison et al., DNA 1: 11-18 (1981). The vector HCMV-1C-dhfr expresses an IgG1 isotype antibody and the vector HCMV-T4C-dhfr expresses an IgG4 isotype when each is expressed concurrently with the light chain vector ae. Schematic maps of dhfr-expression vectors are shown in FIG. 23, respectively. 24th

dhfr-Deficitné CHO bunky boli kultivované v aMEM (+ nukleozidy, GIBCO/BRL) a 10% fetálnom hovädzom sére. Plazmidová DNA bola do buniek zavedená elektroporáciou pomocou zariadenia Gene Pulser. CHO bunky boli trypsinizované a jeden raz premyté fosfátom pufrovaným salinickým roztokom (PBS). Do sterilnej kyvety Gene Pulser (medzera 0,4 cm) bola vložená DNA (po 10 μς plazmidu ťažkého reťazca a plazmidu príslušného ľahkého reťazca) a 0,8 ml alikvót 1.10⁷ buniek/ml v PBS. Bol generovaný pulz s 1900 V a kapacitanciou 25 μΕ. Po 10 min zotavení pri teplote miestnosti boli elektroporované bunky pridané ku 20 ml aMEM (+ nukleozidy)/10% FBS. Po 24 až 48 h inkubácie boli bunky trypsinizované a naočkované do misiek 100 mm v aMEM (- nukleozidy)/10% dialyzovanej FBS (za účelom výberu pre expresiu plazmidu obsahujúceho dhfr), doplnené 500 μg/ml G418 (GIBCO/BRL, za účelom výberu pre expresiu plazmidu obsahujúceho neo). Médiá boli menené každé 3 až 4 dni až do výskytu kolónií. Jednotlivé klony boli izolované pomocou klo80 novacích valcov, expandované a analyzované na produkciu IgG pomocou ELISA.dhfr-Deficient CHO cells were cultured in αMEM (+ nucleosides, GIBCO / BRL) and 10% fetal bovine serum. Plasmid DNA was introduced into cells by electroporation using a Gene Pulser. CHO cells were trypsinized and washed once with phosphate buffered saline (PBS). In a sterile Gene Pulser cuvette (0.4 cm gap) DNA was inserted (10 µL of the heavy chain plasmid and the respective light chain plasmid) and 0.8 ml aliquots of 1.10 ⁷ cells / ml in PBS. A pulse with 1900 V and a capacitance of 25 μΕ was generated. After 10 min recovery at room temperature, electroporated cells were added to 20 mL of αMEM (+ nucleosides) / 10% FBS. After 24-48 h incubation, cells were trypsinized and seeded in 100 mm dishes in aMEM (- nucleosides) / 10% dialyzed FBS (for selection for expression of plasmid containing dhfr), supplemented with 500 µg / ml G418 (GIBCO / BRL) for of choice for expression of a plasmid containing neo). Media was changed every 3-4 days until colonies occurred. Individual clones were isolated using cleavage rolls, expanded and analyzed for IgG production by ELISA.

Do dhfr-deficitných CHO buniek boli zavedené tri sady DNA: 1) HCMV-1748RH_Ä-TlC-dhfr a HCMV-1748RL_A~KR-neo exprimujúce pretvorenú MAb PB1.3 (H_Ä/L_Ä), izotyp IgGl, 2) HCMV-1748RH_B-TlC-dhfr a HCMV-1748RL_D-KR-neo exprimujúce pretvorenú MAb PB1.3 (H_b/L_d), izotyp IgGl, a HCMV-1748RHg-T4C-dhfr a HCMV-1748RL_D-KR-neo exprimujúce pretvorenú MAb PB1.3 (H_B/L_D), izotyp IgG4.Into DHFR-deficient CHO cells were established three sets of DNA: 1) HCMV-1748RHA _R -TlC-dhfr and HCMV-1748RL _A ~ KR-neo expressing reshaped MAb PB1.3 _(R H / _R L), the isotype IgGl, 2) HCMV-1748RH _B -TlC-dhfr and HCMV-1748RL _D -KR-neo expressing reshaped MAb PB1.3 (H _b / L _d ), IgG1 isotype, and HCMV-1748RHg-T4C-dhfr and HCMV-1748RL _D -KR- neo expressing reshaped MAb PB1.3 (H _B / L _D ), isotype IgG4.

Bunky CHO boli expandované a nasadené do lOkomorového (celkový povrch 6000 cm²) kultivátora Nunc celí factories. Médium bolo zobrané po 72 h a pasážované cez stĺpec protein A-Sepharose v kolóne Fast Flow (Pharmacia). Kolóna bola premytá a pri pH 4,5 bol eluovaný hovädzí IgG. Humanizované protilátky boli eluované pri pH 3,5, dialyzované v PBS alebo 20 mM acetátu, 0,15 M NaCl, pH 5,5. Koncentrácia protilátok bola stanovená spektrofotometricky a potvrdená metódou ELISA pre íudský IgG. (Ako kontrola pre mu MAb PB1.3 (H_B/L_D), izotyp IgG4, bola použitá íudská protilátka IgG4 (s , Sigma #1-4639). čistota bola potvrdená pomocou SDS-PAGE.CHO cells were expanded and seeded in a 10-chamber (6000 cm ² total surface) Nunc cell factories cultivator. The medium was collected after 72 h and passaged through a protein A-Sepharose column on a Fast Flow column (Pharmacia). The column was washed and bovine IgG was eluted at pH 4.5. Humanized antibodies were eluted at pH 3.5, dialyzed in PBS or 20 mM acetate, 0.15 M NaCl, pH 5.5. Antibody concentrations were determined spectrophotometrically and confirmed by human IgG ELISA. (Human IgG4 antibody (s, Sigma # 1-4639) was used as a control for mu MAb PB1.3 (H _B / L _D ), IgG4 isotype. Purity was confirmed by SDS-PAGE.

B. Test konkurenčnej väzbyB. Competitive Custody Test

Pomocou kompetitívneho testu ELISA boli stanovené relatívne väzbové afinity rôznych verzií pretvorených MAb PB1.3 k P-selektínu. Test meria koncentráciu neznačenej protilátky, ktorá inhibuje z 50 % väzbu značenej mu MAb PB1.3 na P-selektín.The relative binding affinities of the different versions of reshaped MAb PB1.3 to P-selectin were determined by competitive ELISA. The assay measures the concentration of unlabeled antibody that inhibits 50% binding of mu MAb PB1.3 labeled to P-selectin.

ml čistenej MAb PB1.3 (1 mg/ml) boli rozmiešané so 100,8 μΐ NHS-LC-biotínu (l mg/ml, Pierce) a bola uskutočnená inkubácia cez noc pri 4 °C. 2,lml vzorka bol vnesená na stĺpec NAP 25 (vylučovacia kolóna, Pharmacia). Kolóna bola eluovaná podielmi po 0,3 ml PBS. Každá frakcia bola odčítaná pri 280 nm. Frakcie s najvyššou optickou hustotou pri 280 nm boli spojené. Biotinylovaná MAb PB1.3 bola titrovaná proti rsP-selektínu, aby bolo možné zvoliť príslušnú koncentráciu pre použitie pri teste konkurenčnej väzby.ml of purified MAb PB1.3 (1 mg / ml) was mixed with 100.8 μΐ of NHS-LC-biotin (1 mg / ml, Pierce) and incubated overnight at 4 ° C. A 2.1 ml sample was loaded onto a NAP 25 column (exclusion column, Pharmacia). The column was eluted with aliquots of 0.3 ml PBS. Each fraction was read at 280 nm. Fractions with the highest optical density at 280 nm were pooled. Biotinylated MAb PB1.3 was titrated against rsP-selectin to select the appropriate concentration for use in the competitive binding assay.

96jamková platňa (Microtest III, Falcon #3912) bola potiahnutá s 50 μΐ/jamku rsP-selektínu (zriedený na 2 ^g/ml v DPBS) cez noc pri 4 °C alebo 90 min pri 37 °C. Platňa bola prevrátená a zvyšná tekutina bola sklepaná.A 96 well plate (Microtest III, Falcon # 3912) was coated with 50 µL / well of rsP-selectin (diluted to 2 µg / ml in DPBS) overnight at 4 ° C or 90 min at 37 ° C. The plate was inverted and the remaining fluid was celled.

Potiahnutá platňa s ďalšou prázdnou platňou boli 1 h pri teplote miestnosti blokované s 200 μΐ/jamku DPBS + 1 % hovädzieho sérového albumínu (BSA, Sigma #A-7888). Prázdna platňa bola prevrátená a zvyšná blokujúca tekutina bola sklepaná. Platňa potiahnutá rsP-selektínom bola blokovaná ďalej počas doby riedenia protilátok. K prázdnej platni bol pridaný rad postupne riedených vzoriek protilátok (v DPBS + l % BSA) v množstve 50 μΙ/jamku. Počiatočné koncentrácie protilátok činili 100 μg/ml. Ku vzorkám protilátok na prázdnej platni bola v množstvo 50 μΐ/jamku pridaná biotinylovaná PB1.3 (zriedená na 0,3 μg/ml v DPBS + 1 % BSA) a premiešaná opakovaným pipetovaním. Platňa potiahnutá rsP-selektínom bola premytá trikrát s DPBS. Zmes vzoriek protilátok a biotinylovanej PB1.3 bola po 50 μΐ/jamku napipetovaná na platňu potiahnutú rsP-selektínom a bola ponechaná inkubovať 1 h pri teplote miestnosti. Potom bola platňa premytá trikrát s DPBS.The coated plate with another empty plate was blocked for 1 h at room temperature with 200 μΐ / well DPBS + 1% bovine serum albumin (BSA, Sigma # A-7888). The empty plate was inverted and the remaining blocking fluid was cellared. The rsP-selectin coated plate was blocked further during antibody dilution time. A series of serially diluted antibody samples (in DPBS + 1% BSA) was added to the empty plate at 50 μΙ / well. Initial antibody concentrations were 100 µg / ml. Biotinylated PB1.3 (diluted to 0.3 µg / ml in DPBS + 1% BSA) was added to the 50 µΐ / well antibody blank samples and mixed by repeated pipetting. The rsP-selectin coated plate was washed three times with DPBS. The mixture of antibody samples and biotinylated PB1.3 was pipetted at 50 μΐ / well onto a rsP-selectin coated plate and allowed to incubate for 1 h at room temperature. Then, the plate was washed three times with DPBS.

Na platňu bol pridaný konjugát chrenovej peroxidázy a streptavidínu (Pierce #21124), zriedený 1:2000 v DPBS + 1 % BSA, v množstvo 50 μΐ/jamku a bol ponechaný inkubovať 1 h pri teplote miestnosti. Platňa potom bola premytá trikrát DPBS.Horseradish peroxidase-streptavidin conjugate (Pierce # 21124), diluted 1: 2000 in DPBS + 1% BSA, was added to the plate at 50 μΐ / well and allowed to incubate for 1 h at room temperature. The plate was then washed three times with DPBS.

Potom bolo k platniam pridaných 50 μΐ/jamku tetrametylbenzidínperoxidázového substrátu/H₂O₂ (TMB, Kirkegaard and Perry Laboratories #50-76-00), bola ponechaná príslušná doba pre vývoj sfarbenia (obvykle 3 až 15 min) a reakcia bola zastavená prídavkom 50 μ1(jamku IM kyseliny fosforečnej. Platne boli odčítané pri 450 nm na zariadení Titertek Multiskan MCC/340.Thereafter, 50 μΐ / well of tetramethylbenzidine peroxidase substrate / H ₂ O ₂ (TMB, Kirkegaard and Perry Laboratories # 50-76-00) was added to the plates, the appropriate time for color development (typically 3 to 15 min) was allowed, and the reaction was stopped by addition. 50 µl (well of IM phosphoric acid. Plates were read at 450 nm on a Titertek Multiskan MCC / 340.

Zdanlivá väzbová afinita sa vyjadruje ako koncentrácia protilátky, ktorá sa viaže na P-selektín pri polovici maximálnej optickej hustoty pri 450 nm. Pomer koncentrácií pri polovici maximálnej väzby vzorky protilátky ku kontrole (neznačená PB1.3) poskytuje odhad relatívnej väzbovej afinity testovanej protilátky k P-selektínu.The apparent binding affinity is expressed as the concentration of antibody that binds to P-selectin at half the maximum optical density at 450 nm. The ratio of concentrations at half the maximal binding of the antibody sample to the control (unlabeled PB1.3) provides an estimate of the relative binding affinity of the test antibody to P-selectin.

Výsledky dvoch typických experimentov konkurenčnej väzby sú uvedené na obr. 25 a 26. V prvom experimente je na inhibíciu väzby značenej PB1.3 na 50 % maxima nutné dvojnásobné množstvo pretvorenej MAb PB1.3 (H_AL_A), izotyp IgGl (2,0 μg/ml) oproti PB1.3 (1,0 μς/ηιΐ). Táto humanizovaná protilátka teda viaže rsP-selektín z 50 % tak dobre, ako PB1.3. Podobne v druhom experimente sa PB1.3/(HqLq) (izotyp IgG4) viaže na rsP-selektín z 50 % tak dobre ako PB1.3.The results of two typical competitive binding experiments are shown in FIG. 25 and 26. In the first experiment, doubling the amount of reshaped MAb PB1.3 (H _A L _A ), an IgG1 isotype (2.0 µg / ml) versus PB1.3 (1 , 0 μ / ηιΐ). This humanized antibody thus binds rsP-selectin to 50% as well as PB1.3. Similarly, in the second experiment PB1.3 / (HqLq) (IgG4 isotype) binds to rsP-selectin by 50% as well as PB1.3.

Príklad 13Example 13

Zvýšenie produkcie protilátok v bunkách CHO amplifikáciou dhfrIncrease of antibody production in CHO cells by dhfr amplification

Bunky CHO boli naočkované do baniek a ponechané, aby dosiahli konfluenciu pred výmenou média (8 ml pre banku T-25 cm² alebo 20 ml pre banku T-75 cm²). Po inkubácii po dobu 48 až 72 h bolo médium zobrané a testované pomocou ELISA na produkciu IgG. Bunky boli trypsinizované a spočítané. Produktivita protilátky bola vyjadrená ako množstvo protilátky v μς, vylúčené jedným miliónom buniek za 24 h.CHO cells were seeded into flasks and allowed to reach confluency prior to medium change (8 ml for T-25 cm ² flask or 20 ml for T-75 cm ² flask). After incubation for 48 to 72 h, the medium was harvested and tested by ELISA for IgG production. Cells were trypsinized and counted. Antibody productivity was expressed as the amount of antibody in μς secreted by one million cells per 24 h.

Tri až šesť najproduktívnejších klonov bolo amplifikova83 ných oddelene a zvyšných sedem najlepších klonov bolo spojených a amplifikovaných. Bunky boli naočkované v hustote 1.10⁵ buniek/100 mm misku v selekčnom médiu. Pre prvý cyklus amplifikácie boli bunky naočkované v troch sadách misiek obsahujúcich aMEM (- nukleozidy)/10% dialyzovanej FBS doplnené 500 μυ/πιΐ G418 a buď 10, 20 alebo 50 nM metotrexátu (Sigma #A-6770). Kultúry boli živené každé štyri dni. Po 10 až 14 dňoch boli klonovacími valcami izolované jednotlivé kolónie, expandované a testované pomocou ELISA na produkciu IgG. Ďalší cyklus amplifikácie bol uskutočnený na jednotlivých klonoch alebo pooloch klonov pri koncentráciách metotrexátu 5 až 10 krát vyšších než počiatočná koncentrácia metotrexátu.The three to six most productive clones were amplified separately and the remaining seven best clones were pooled and amplified. Cells were seeded at a density of 1.10 ⁵ cells / 100 mm dish in selection medium. For the first round of amplification, cells were seeded in three sets of dishes containing αMEM (- nucleosides) / 10% dialyzed FBS supplemented with 500 μυ / πιΐ G418 and either 10, 20 or 50 nM methotrexate (Sigma # A-6770). Cultures were fed every four days. After 10-14 days, single colonies were isolated by cloning cylinders, expanded and tested by ELISA for IgG production. A further cycle of amplification was performed on individual clones or clone pools at methotrexate concentrations 5 to 10 times higher than the initial methotrexate concentration.

Tabuľka 3 poskytuje súhrn produkcie protilátok pre bunky CHO exprimujúce tri humanizované verzie PB1.3. Jeden amplifikovaný kloň exprimujúci pretvorenú MAb PB1.3 (HgLp) (izotyp IgG4) vznikol z poolu klonov, ktoré exprimovali menej než 0,2 μg/10⁶ buniek/deň, amplifikovaných na 2,0 μg/10⁶ buniek/deň v prvom cykle, a dosiahol 33,0 μg/10⁶ buniek/deň po tretom cykle. Tento kloň bol vybratý pre kultiváciu pri produkcii pretvorenej MAb PB1.3 vo veľkom meradle.Table 3 provides a summary of antibody production for CHO cells expressing three humanized versions of PB1.3. One amplified clone expressing reshaped MAb PB1.3 (HgLp) (IgG4 isotype) arose from a pool of clones that expressed less than 0.2 µg / 10 ⁶ cells / day, amplified to 2.0 µg / 10 ⁶ cells / day in the first to reach 33.0 µg / 10 ⁶ cells / day after the third cycle. This clone was selected for culture to produce reshaped MAb PB1.3 on a large scale.

Príklad 14Example 14

Pokus v bioreaktoreExperiment in bioreactor

160 g mikroperličiek, potiahnutých kolagénom (150 až 200 μπι, JRH Bioscience #60142-100), bolo 30 min hydratovaných v 800 ml sterilnej vody a voda bola dekantovaná. Perličky boli resuspendované v 800 ml vody a 30 min autoklávované. Po ochladení na teplotu miestnosti boli perličky premyté dvakrát sterilným aMEM (- nukleozidy) prostým séra a resuspendované vil kompletného média aMEM (- nukleozidy)/5 % dialyzovaného FBS.160 g of collagen-coated microspheres (150-200 μπι, JRH Bioscience # 60142-100) were hydrated in 800 ml of sterile water for 30 min and the water was decanted. The beads were resuspended in 800 mL of water and autoclaved for 30 min. After cooling to room temperature, the beads were washed twice with sterile serum-free sterile αMEM (- nucleosides) and resuspended in 1 µl complete medium aMEM (- nucleosides) / 5% dialyzed FBS.

Bunková línia CHO-48B4, ktorá exprimuje pretvorenú MAb PB1.3 (H_bL_d) (izotyp IgG4) v množstve 33,0 μg/10⁶ buniek/deň, bola expandovaná do 36 T-225 cm² v aMEM (nukleozidy)/10 % dialyzovaného FBS/500 nM metotrexátu. Kedf bunky dosiahli konfluenciu, boli trypsinizované a resuspendované v 2 1 kompletného média (bez metotrexátu) v konečnej koncentrácii 5,0 až 8,0.10⁴ buniek/ml.The CHO-48B4 cell line, which expresses reshaped MAb PB1.3 (H _b L _d ) (IgG4 isotype) at 33.0 µg / 10 ⁶ cells / day, was expanded to 36 T-225 cm ² in aMEM (nucleosides) / 10% dialyzed FBS / 500 nM methotrexate. When the cells reached confluence, they were trypsinized and resuspended in 2 L of complete medium (without methotrexate) at a final concentration of 5.0 to 8.0 x 10 ⁴ cells / ml.

1 perličiek, 2 1 suspenzie buniek a 2 1 čerstvého kompletného média boli aseptický pridané do 101 autoklávovej nádoby bioreaktora Proteus 2000 (Wheaton). Horný priestor bol kontinuálne preplachovaný vzduchom a 5 % C0₂. Za účelom priľnutia buniek k mikroperličkám bolo miešanie suspenzie buniek a mikroperličiek v prístroji Proteus naprogramované na 70 otáčok min^-1 po dobu 1 min a 0 otáčok min^-1 po dobu 59 min. Po celkom 48 cykloch bolo 5 1 média pridaných do bioreaktora, ktorý bol naprogramovaný tak, aby udržoval teplotu suspenzie 37 °C, pH 7,0, rozpustený kyslík na hodnote 30 % vzduchu a ktorý bol kontinuálne miešaný rýchlosťou 50 otáčok min^-1.1 bead, 2 L cell suspension, and 2 L fresh complete medium were aseptically added to a 10 L Proteus 2000 bioreactor autoclave vessel (Wheaton). The upper space was continuously purged with air and 5% CO ₂ . To adhesion of cells to the microbeads were stirring a suspension of the cells and microbeads of Proteus apparatus programmed for 70 revolutions ^min-1 for 1 minute and 0 rpm ^min-1 for 59 min. After a total of 48 cycles was 5 1 media are added to the bioreactor, which was programmed to maintain the temperature of the slurry 37, pH 7.0, the dissolved oxygen value of 30% air and which is continuously stirred at 50 revolutions ^min-1.

Po 3 dňoch bol bioreaktor naprogramovaný pre výmenu kompletného média v množstve 5 l/deň pomocou gravitačného filtra, pripevneného k odoberaciemu výstupu (aby mikroperličky zostali v reaktore). Zobrané médium bolo do spracovania uchovávané pri 4 °C. Bioreaktor bežal 5 až 7 dní, dokiaľ nahromadené bunkové zlomky nezakalili zberané médium (v dôsledku poruchy aerácie).After 3 days, the bioreactor was programmed to replace the complete medium at 5 L / day using a gravity filter attached to the take-off outlet (to keep the micropellets in the reactor). The harvested medium was stored at 4 ° C until processing. The bioreactor was run for 5 to 7 days until accumulated cell debris clouded the harvested medium (due to aeration failure).

Zobrané médium bolo vyčírené prechodom filtrom Millipak-60 0,45 μπι (Millipore). 20 1 prefiltrovaného supernatantu bolo privádzaných v množstve 0,55 1/h na stĺpec (2,5 x 12 cm) proteín A-Sepharose (Fast Flow, Pharmacia). Potom, čo stĺpcom prešiel všetok supernatant, bol stĺpec premytý s 1,5 1 PBS (BioWhittaker, 17-516Y). Stĺpec bol predbežne eluovaný 8x 40 ml 0,2M acetátu sodného, pH 4,5 a potom eluovaný 8 x 40 ml 0,2M glycínu, 0,5M NaCl, pH 3,5, vždy do skú85 maviek obsahujúcich 10 ml 2M Tris-HCl, pH 8,0. Samostatná frakcia s najvyššou absorbanciou pri 280 nm bola dialyzovaná do 20mM acetátu, 0,15M NaCI, pH 5,5 a skladovaná pri 4 °C.The collected medium was clarified by passing a Millipak-60 0.45 μπι filter (Millipore). 20 L of filtered supernatant was fed at 0.55 L / h per column (2.5 x 12 cm) protein A-Sepharose (Fast Flow, Pharmacia). After all the supernatant had passed through the column, the column was washed with 1.5 L PBS (BioWhittaker, 17-516Y). The column was pre-eluted with 8x 40 ml 0.2M sodium acetate, pH 4.5, and then eluted with 8 x 40 ml 0.2M glycine, 0.5M NaCl, pH 3.5, each into test tubes containing 10 ml 2M Tris-HCl pH 8.0. The single fraction with the highest absorbance at 280 nm was dialyzed into 20 mM acetate, 0.15 M NaCl, pH 5.5 and stored at 4 ° C.

Po dobu 5 až 7 dní bolo zberané 200 mg protilátky za deň. výťažok čistenia bol približne 50 %. Jeden cyklus reaktora teda poskytuje 500 až 700 mg čistenej protilátky.200 mg of antibody per day were collected for 5-7 days. the purification yield was about 50%. Thus, one reactor cycle provides 500 to 700 mg of purified antibody.

Príklad 15Example 15

Účinok mu MAb PB1.3 na poškodenie tkaniva vyvolané ischémiou a reperfúziou po replántacii králičieho uchaEffect of mu MAb PB1.3 on tissue damage induced by ischemia and reperfusion after rabbit ear replantation

Králiky (New Zealand White) boli anestetizované kombináciou ketamínu a xylazínu s nasledujúcou infiltráciou lidokaínu do bázy ucha. Ľavé ucho bolo čiastočne amputované, pričom boli centrálna tepna, žila a chrupavkový môstik ponechané intaktné. Všetky nervy boli rozdelené, aby bolo ucho totálne anestetické. Potom bolo ucho znovu pripevnené a na artériu bola umiestnená mikrovaskulárna svorka na vyvolanie úplnej ischémie. Králiky boli držané 6 h v miestnosti, udržovanej na teplote 23,5 °C, potom bola mikrovaskulárna svorka odstránená, aby mohlo ucho reperfundovať. Ošetrenie bolo uskutočnené tesne pred reperfúziou buď mu MAb PB1.3 (2 mg/kg) alebo salinickým roztokom alebo izotypovo súhlasnou (IgGl) myšou monoklonálnou protilátkou označenou PNB1.6 (2 mg/kg). Po dobu 7 dní bol denne meraný objem ucha vytlačením vody ku kvantifikácii tkanivového edému. Na 7. deň bola stanovená nekróza ako percento celkového povrchu.Rabbits (New Zealand White) were anesthetized with a combination of ketamine and xylazine followed by lidocaine infiltration into the ear base. The left ear was partially amputated, leaving the central artery, vein and cartilage bridge intact. All nerves were divided to make the ear totally anesthetic. Then the ear was reattached and a microvascular clamp was placed on the artery to induce complete ischemia. The rabbits were kept in a room maintained at 23.5 ° C for 6 hours, after which the microvascular clip was removed to allow the ear to reperfuse. Treatment was performed just prior to reperfusion with either mu MAb PB1.3 (2 mg / kg) or saline or isotype-matched (IgG1) mouse monoclonal antibody designated PNB1.6 (2 mg / kg). Ear volume was measured daily for 7 days by extruding water to quantify tissue edema. On day 7, necrosis was determined as a percentage of total surface area.

U kontrolných zvierat, ktorým bol po reperfúzii ucha podávaný buď salinický roztok alebo PNB1.6, bolo stanovené významné zvýšenie objemu ucha (obr. 27). Pretože neboli zaznamenané rozdiely medzi týmito dvomi kontrolnými skupinami, boli ich výsledky spojené. Zväčšenie edému bolo pozorované aj u zvierat ošetrených MAb PB1.3, avšak magnitúda tohto zväčšenia v meraných časových bodoch bola významne menšia než u kontrolnej skupiny. Rozsah nekrózy, meraný 7. deň, bol u zvierat ošetrených mu MAb PB1.3 tiež významne znížený v porovnaní s kontrolnými zvieratami.Control animals receiving either saline or PNB1.6 after reperfusion of the ear were found to significantly increase their ear volume (Fig. 27). As there were no differences between the two control groups, their results were pooled. An increase in edema was also observed in animals treated with MAb PB1.3, but the magnitude of this increase at the measured time points was significantly less than in the control group. The extent of necrosis, measured on day 7, was also significantly reduced in animals treated with mu MAb PB1.3 compared to control animals.

Ischémia s nasledujúcou reperfúziou replantovaného králičieho ucha teda vyvoláva edematóznu odpoveď, spočiatku nasledovanú intenzívnou nekrózou tkaniva. Tieto dva prejavy poškodenia tkaniva sú podstatne a významne znížené u zvierat, vopred ošetrených protilátkou proti P-selektínu mu MAb PB1.3.Thus, ischemia followed by reperfusion of the replanted rabbit ear produces an edematous response, initially followed by intense tissue necrosis. These two manifestations of tissue damage are substantially and significantly reduced in animals pretreated with anti-P-selectin antibody mu MAb PB1.3.

Príklad 16Example 16

Účinok mu MAb PBl.3 na vaskulárnu priechodnosť po ischémii a reperfúzii psieho kostrového svaluEffect of mu MAb PB1.3 on vascular patency after ischemia and reperfusion of canine skeletal muscle

Tento experiment používa model ischémie a reperfúzie na izolovanom psom štíhlom svale. Jedným aspektom reperfúzneho poškodenia je jav zvaný no-reflow, pri ktorom je po reperfúzii neprítomný alebo silne redukovaný tok krvi mikroobehom predtým ischemického tkaniva.This experiment uses a model of ischemia and reperfusion on an isolated dog lean muscle. One aspect of reperfusion injury is the no-reflow phenomenon in which, after reperfusion, the blood flow of the previously circulating ischemic tissue is absent or severely reduced.

Bol použitý skôr opísaný preparát psieho štíhleho svalu (Carden a ď., Circ. Res. 66:1436-1444 (1990)). Stručne povedané dospelí nečistokrvní psi boli anestetizovaní pentobarbitalom sodným. Koža ležiaca nad štíhlym svalom bola rozdelená a sval bol uvoľnený zo spojivového tkaniva tupým oddelením. Uzavierací nerv bol prerezaný. Proximálna kaudálna tepna i žila boli kanylované a všetky ostatné cievy podviazané. Kanyla femorálnej tepny bola pripojená na perfúzne čerpadlo s konštantným prietokom a výtok z femorálnej žily bol odvedený do reperfúzneho zásobníka. Tepnový a žilný tlak bol sledovaný na postranných vetvách a prietok krvi bol nastavený tak, aby perfúzny tlak bol udržovaný na 100 mm Hg. Vaskulárna izo87 lácia bola považovaná za úplnú, ak arteriálny perfúzny tlak po vypnutí perfúzneho čerpadla klesol na menej než 20 mm Hg.The previously described canine lean muscle preparation was used (Carden et al., Circ. Res. 66: 1436-1444 (1990)). Briefly, adult non-blooded dogs were anesthetized with sodium pentobarbital. The skin lying above the lean muscle was split and the muscle was released from the connective tissue by blunt separation. The occluding nerve was cut. The proximal caudal artery and vein were cannulated and all other vessels bound. The femoral artery cannula was connected to a constant flow perfusion pump and the femoral vein outlet was led to a reperfusion reservoir. Arterial and venous pressure was monitored on the lateral branches and blood flow was adjusted to maintain the perfusion pressure at 100 mm Hg. Vascular isolation was considered complete when the arterial perfusion pressure dropped to less than 20 mm Hg after shutting off the perfusion pump.

Mikrovaskulárna priechodnosť bola po skončení experimentu zisťovaná perfúziou izolovaného štíhleho svalu kontrastným médiom (tuš). Komputerizované videozobrazenie bolo použité na kvantifikáciu počtu mikrociev obsahujúcich tuš (priemer < 10 μιη) na svalové vlákno v histologických rezoch získaných z izolovaných psích štíhlych svalov, podrobených kontinuálnej perfúzii po dobu 4,5 h, ischémii po dobu 4 h a potom po dobu 0,5 h reperfúzii alebo ischemickej reperfúzii v prítomnosti protilátky proti P-selektínu mu MAb PB1.3 v koncentrácii 40 μg/ml v perfuzáte.After completion of the experiment, microvascular patency was determined by perfusion of isolated lean muscle with contrast medium (ink). Computerized video imaging was used to quantify the number of ink containing microvessels (mean <10 μιη) per muscle fiber in histological sections obtained from isolated canine lean muscles, subjected to continuous perfusion for 4.5 h, ischemia for 4 h, and then 0.5 h reperfusion or ischemic reperfusion in the presence of an anti-P-selectin antibody mu MAb PB1.3 at a concentration of 40 µg / ml in the perfusate.

Uskutočnením ischémie a reperfúzie sa znížil počet priechodných mikrociev na 36 ± 3 % hodnoty stanovenej pre kontrolné zvieratá. Keď bola v perfuzáte zahrnutá mu MAb PB1.3, činil počet priechodných mikrociev po ischémii a reperfúzii 119 ± 18 % kontroly.By performing ischemia and reperfusion, the number of transit microvessels was reduced to 36 ± 3% of the value determined for control animals. When mu MAb PB1.3 was included in the perfusate, the number of transient microvessels after ischemia and reperfusion was 119 ± 18% of control.

Protilátka proti P-selektínu mu MAb PB1.3 teda kompletne zabraňovala vývoju javu no-reflow v ischemickom a reperfundovanom psom štíhlom svale, stanovené počtom priechodných mikrociev.Thus, the anti-P-selectin antibody mu MAb PB1.3 completely prevented the development of the no-reflow phenomenon in ischemic and reperfused lean muscle, as determined by the number of transient microvessels.

Príklad 17Example 17

Účinok mu MAb PB1.3 na interakcie leukocytov a endoteliálnych buniek vyvolané deqranuláciou žírnych buniek tkanivaEffect of mu MAb PB1.3 on Leukocyte and Endothelial Cell Interactions Induced by Degradation of Tissue Mast Cells

I. MetódyI. Methods

a) Intravitálna mikroskopia(a) Intravital microscopy

Samci krýs Wistar (200 až 250 g) boli získaní od HarlanMale Wistar rats (200-250 g) were obtained from Harlan

Sprague Dawley, Indianapolis, a pred chirurgickým procesom boli po dobu 12 až 24 h podrobení hladovaniu. Chirurgická anestézia bola vyvolaná intramuskulárnou injekciou ketamín/rompun/acepromazínu. Do lávej jugulárnej žily bol umiestnený katéter a pre uľahčenie spontánneho dýchania bola uskutočnená tracheotómia. Bolo oholené a umyté brucho a pozdĺž strednej čiary do peritoneálnej dutiny bol opatrne, aby nedošlo ku krvácaniu, uskutočnený rez dlhý 1,9 cm (3/4 ). Krysa bola položená na stojan mikroskopu, špeciálne upravený pre intravitálnu mikroskopiu. Bola vyňatá dobre vaskularizovaná zadná slučka ilea a mezentérium bolo pretiahnuté cez pozorovací podstavec, vyhrievaný na 37 °C. Počas celého experimentu bolo mezentérium superfundované zahrievaným bikarbonátom pufrovaným salinickým roztokom (37 °C, pH 7,4) v množstve 2 ml/min. Okrem toho boli na ileum a na oblasti mezentéria okolo pozorovanej plochy vložené malé kúsky Saran-Wrap (vopred máčané v alkohole a prepláchnuté v salinickom roztoku), aby boli udržané vlhké. Intravitálnym mikroskopom (Mikvybaveným okulármi lOx a objeknumerický otvor 0,4) bolo pozorované mikrocirkulačné riečište. Videozáznam mikroskopického obrazu bol umožnený videosystémom vysokého rozlíšenia, tvoreným videokamerou (Hitachi color CCD), nasadenou na mikroskop, časovačom videa (American Video Equipment), VCR (Sony SVO-9500MD) a monitorom (Sony Trinitron). V každom mezenteriálnom preparáte boli vybrané tri postkapilárne venulárne segmenty s dĺžkou približne 180 μπι pre opakované merania podía týchto kritérií: (l) skutočná postkapilárna venula, zásobovaná krvou z konfluentných kapilár, priemer 15 až 30 μιη, (2) čulý prietok krvi, takže nie je možno rozoznať jednotlivé červené krvinky, (3) určité bazálne hromadenie leukocytov (v ktoromkoľvek okamžiku je prítomných vo vaskulárnom segmente menej než 8 leukocytov), avšak žiadna pevná adhézia leukocytov. Pevná adhézia leukocytu sa definuje tak, že leukocyt zostane nepohyblivý pri stene cievy viac než 30 s.Sprague Dawley, Indianapolis, and were subjected to fasting for 12-24 hours prior to surgery. Surgical anesthesia was induced by intramuscular injection of ketamine / rompun / acepromazine. A catheter was placed in the lava jugular vein and tracheotomy was performed to facilitate spontaneous breathing. The abdomen was shaved and washed, and a 1.9 cm (3/4) long incision was made carefully to avoid bleeding along the midline of the peritoneal cavity. The rat was placed on a microscope stand, specially adapted for intravital microscopy. The well vascularized ileum back loop was removed and the mesentery was passed through an observation stand, heated to 37 ° C. Throughout the experiment, the mesentery was superfused with heated bicarbonate buffered saline (37 ° C, pH 7.4) at 2 ml / min. In addition, small pieces of Saran-Wrap (pre-soaked in alcohol and rinsed in saline) were placed on the ileum and the mesentery region around the observed area to keep them moist. A microcirculation bed was observed by an intravital microscope (Microscopic 10x eyepieces and 0.4n object-number aperture). Video recording of the microscopic image was made possible by a high definition video system consisting of a video camera (Hitachi color CCD) mounted on a microscope, a video timer (American Video Equipment), a VCR (Sony SVO-9500MD) and a monitor (Sony Trinitron). In each mesenteric preparation, three postcapillary venous segments of approximately 180 μπι were selected for repeated measurements according to the following criteria: (1) true postcapillary venus, supplied with blood from confluent capillaries, diameter 15 to 30 μιη, (2) clear blood flow, so no (3) a certain basal accumulation of leukocytes (less than 8 leukocytes present in the vascular segment at any one time) but no solid leukocyte adhesion. Fixed adhesion of a leukocyte is defined such that the leukocyte remains immobile at the vessel wall for more than 30 s.

ron Instruments, San Diego), tívom 20x (ponorený vo vode,ron Instruments, San Diego), three times 20 times (submerged in water,

b) Experimentálny postup a 25 min po dokončení chirurgického procesu boli urobené jednominútové videozáznamy bazálnej interakcie leukocytov vo vybraných venulách. Všetky ošetrenia boli uskutočnené intravenózne pred druhým bazálnym záznamom. 30 min po chirurgickom úkone bola zahájená infúzia zlúčeniny 48/80 (Sigma, katalóg #C4257) do superfúzneho pufra a trvala do konca experimentu. Tým sa dosiahla konečná koncentrácia 10 μg/ml v mezentériu a účelom bolo vyvolať degranuláciu žírnych buniek. Venuly boli podrobené záznamu opäť po 20 a 30 min po zahájení aplikácie 48/80. Rozsah interakcií leukocyty-endoteliálne bunky bol stanovený po skončení experimentu analýzou videozáznamov na páskach. Počet jasne viditeľných leukocytov (tj. buniek interagujúcich so stenou cievy) bol stanovený zo záberov zastavených presne v čase 0, 15, 30, 45 a 60 s zaznamenanej sekvencie a bol vypočítaný priemer z týchto piatich hodnôt. Počet leukocytov teda zahrnoval ako voľne sa pohybujúce, tak aj pevne adherované bunky.b) Experimental procedure and 25 min after completion of the surgical process, one-minute video recordings of basal leukocyte interaction in selected venules were made. All treatments were performed intravenously before the second baseline recording. 30 min after surgery, infusion of compound 48/80 (Sigma, catalog # C4257) was initiated into superfusion buffer and continued until the end of the experiment. This resulted in a final concentration of 10 µg / ml in the mesenterium and was intended to induce mast cell degranulation. The venules were recorded again at 20 and 30 min after starting 48/80 application. The extent of leukocyte-endothelial cell interactions was determined at the end of the experiment by analysis of the tape recordings. The number of clearly visible leukocytes (i.e. cells interacting with the vessel wall) was determined from images stopped at exactly 0, 15, 30, 45 and 60 sec of the recorded sequence and the average of these five values was calculated. Thus, the number of leukocytes included both free-moving and firmly adhered cells.

c) Štatistika(c) Statistics

Každá experimentálna skupina obsahovala 5 až 6 zvierat s 2 až 3 venulami z každého zvieraťa. Je uvedená stredná hodnota a jej štandardná odchýlka. Významné rozdiely medzi skupinami boli testované variačnou analýzou s nasledujúcim testom HSD podľa Tukey-Kramera. Rozdiely u jednotlivých venúl pred ošetrením a po ňom boli študované zdvojenými t-testami. Všetky testy boli uskutočňované s použitím Software JMP na Macintosh líši a významnosť bola uznaná pri p < 0,05.Each experimental group consisted of 5-6 animals with 2-3 venus from each animal. The mean value and its standard deviation are given. Significant differences between groups were tested by variation analysis followed by the Tukey-Kramer HSD test. Differences in individual venules before and after treatment were studied by duplicate t-tests. All assays were performed using JMP Software on Macintosh varying and significance was recognized at p < 0.05.

II. VýsledkyII. The results

Topická aplikácia zlúčeniny 48/80 na mezentérium krýs viedla k viditeľnej degranulácii viac než 90 % žírnych bu90 niek, ktorá prebehla do 3 min po aplikácii. V dôsledku toho bolo pozorované zvýšenie hromadenia a adhézie leukocytov. Nebol pozorovaný významný rozdiel v akumulácii leukocytov medzi časovými bodmi 20 min a 30 min po aplikácii 48/80, a preto bola v štatistickej analýze použitá stredná hodnota z týchto dvoch meraní. Variabilita od venuly k venule v tomto modeli bola značne vysoká, pričom bazálna interakcia sa pohybovala od prítomnosti 0 do 4,8 leukocytov v jednotlivých venulách a interakcia vyvolaná žírnymi bunkami sa pohybovala od 2,8 do 25,6 leukocytov v skupine ošetrenej PBS (koeficient variability cv = 37 %). Priemery pre zviera vykazovali oveľa nižšiu variabilitu (CV = 16 %),* každá jednotlivá venula preto bola pre štatistické účely považovaná za samostatnú experimentálnu j ednotku.Topical application of compound 48/80 to the mesentery of the rats resulted in a visible degranulation of more than 90% of the mast cells, which occurred within 3 min after application. As a result, an increase in leukocyte accumulation and adhesion was observed. No significant difference in leukocyte accumulation was observed between the time points 20 min and 30 min after 48/80 administration and therefore the mean of the two measurements was used in the statistical analysis. The variability from venus to venus in this model was considerably high, with basal interaction ranging from the presence of 0 to 4.8 leukocytes in individual venules and mast cell-induced interaction ranging from 2.8 to 25.6 leukocytes in the PBS-treated group (coefficient variability cv = 37%). Animal averages showed a much lower variability (CV = 16%), therefore each individual venula was considered a separate experimental unit for statistical purposes.

Ako je zrejmé z obr. 29, intravenózne ošetrenie s mu MAb PB1.3 vyvolalo inhibíciu žírnymi bunkami vyvolanej intravaskulárnej akumulácie leukocytov o 90 % oproti kontrolnej skupine ošetrovanej formuláciou s pufrom. Nereaktívna protilátka P6H6 nemala v tomto modeli žiadny účinok.As shown in FIG. 29, intravenous treatment with mu MAb PB1.3 induced mast cell-induced intravascular leukocyte accumulation inhibition by 90% over the control group treated with the buffer formulation. The non-reactive antibody P6H6 had no effect in this model.

Podávanie protilátky proti P-selektínu mu MAb PB1.3 krysám teda úplne bráni interakcii leukocytov s vaskulárnym endotelom a ich následnej migrácii do tkanív, indukovanej aplikáciou degranulačného prostriedku pre žírne bunky 48/80.Thus, administration of an anti-P-selectin antibody to mu MAb PB1.3 in rats completely prevents the interaction of leukocytes with the vascular endothelium and their subsequent migration into tissues induced by the application of 48/80 mast cell degranulation agent.

Príklad 18Example 18

Mapovanie epitopu mu MAb PB1.3Mu MAb epitope mapping PB1.3

P-selektín je integrálny membránový glykoproteín, nachádzajúci sa v sekréčnych granulách doštičiek a endoteliáIných buniek. Po bunkovej aktivácii je P-selektín rýchlo redistribuovaný do plazmovej membrány. Maturovaná molekula je proteín s rôznymi doménami, zahrnujúcimi lektínovú oblasť, oblasťP-selectin is an integral membrane glycoprotein found in secretory granules of platelets and endothelial cells. Following cellular activation, P-selectin is rapidly redistributed into the plasma membrane. A mature molecule is a protein with various domains including a lectin region, a region

EGF, deväť tandemových konvenčných repetícií (CRP) C3b-C4b Regulátory Protein, transmembránovú oblasť a cytoplazmatickú doménu. Klónovanie a popis P-selektínu viď Johnston a d., Celí 56:1033-1044 (1989, tu zahrnuté ako celok formou odkazu pre všetky účely). Obr. 30 znázorňuje navrhnutú schému zvinovania domén P-selektínu.EGF, nine tandem conventional repeats (CRPs) C3b-C4b Regulators Protein, transmembrane region and cytoplasmic domain. For the cloning and description of P-selectin, see Johnston et al., Cell 56: 1033-1044 (1989, incorporated herein by reference in its entirety for all purposes). Fig. 30 depicts a proposed winding scheme for P-selectin domains.

Delečné analýzy P-selektínuDeletion analysis of P-selectin

Za účelom mapovania epitopu, špecificky viazaného mu MAb PB1.3, bola uskutočnená konštrukcia mutantov rekombinačného P-selektínu vypustením postupných domén CRP (obr. 31). Táto miestne špecifická mutagenéza bola uskutočnená amplifikáciou PCR s použitím primérov špecifických pre každú doménu CRP (tabulka 6). Templátom, použitým pre PCR-mutagenézu, bol pUC DNA kloň P-selektínu, ktorý bol skrátený a mutovaný v polohe 2354 sekvencie DNA (polohy v sekvencii sú v súlade s publikovanou sekvenciou P-selektínu podlá Johnstona a d., vid vyššie). Tento templátový plazmid pG/tf,T, ktorý bol pôvodne derivovaný mutagenézou in vitro, postráda transmembránovú doménu a cytoplazmový karboxyterminálny koniec P-selektínu a miesto toho kóduje 11 karboxyterminálnych aminokyselinových zvyškov SV40 veľkého T antigénu. Tento SV40-derivovaný C-terminál je rozpoznávaný monoklonálnou protilátkou KT-3 (vid MacArthur a d., Journal of Virology 52:483-491 (1984)). Po amplifikácii PCR boli delečné molekuly DNA čistené, ligované, transformované do baktérií, klonované a sekvencované ďalej opísaným spôsobom. DNA s príslušným napojením CRP k sekvencii tag T-antigénu boli subklonované do expresného vektora pcDNAl (Invitrogén) a transfikované do buniek COS.In order to map an epitope specifically bound to mu MAb PB1.3, recombinant P-selectin mutants were constructed by deleting successive CRP domains (Fig. 31). This site-specific mutagenesis was performed by PCR amplification using primers specific for each CRP domain (Table 6). The template used for PCR-mutagenesis was the pUC DNA clone of P-selectin, which was truncated and mutated at position 2354 of the DNA sequence (the positions in the sequence are in accordance with the published P-selectin sequence of Johnston et al., See above). This template plasmid pG / tf, T, which was originally derived by in vitro mutagenesis, lacks the transmembrane domain and the cytoplasmic carboxyterminal end of P-selectin and instead encodes the 11 carboxyterminal amino acid residues of the SV40 large T antigen. This SV40-derived C-terminal is recognized by the monoclonal antibody KT-3 (see MacArthur et al., Journal of Virology 52: 483-491 (1984)). After PCR amplification, the deletion DNA molecules were purified, ligated, transformed into bacteria, cloned, and sequenced as described below. DNA with the appropriate fusion of CRP to the tag T-antigen sequence was subcloned into the pcDNA1 expression vector (Invitrogen) and transfected into COS cells.

Mutagenéza PCR bola uskutočnená na plazmide pGMPA4,T. Po fosforylácii na 5'-konci boli do jednotlivých reakcií PCR pridávané priméry v tabuľke 6 v množstve ΙχΜ spolu s primárom sekvencie T-antigénu lys-1. Metóda PCR bola uskutočňovaná v zariadení Perkin Elmer-Cetus po dobu 30 cyklov po 50 s pri 95 °C, 1 min pri 50 °C a 4 min pri 73 °C s použitím polymerázy Pfu (Stratagene) podľa podmienok doporučených výrobcom. Po prečistení elektroforézou na agarózovom géli a eluovaní pomocou Qiaex (Qiagen Corp.) boli mutované pUC DNA ligované a transformované do buniek InvF'XE. coli (Invitrogen). Klonované DNA, nesúce požadovanú mutáciu, boli identifikované sekvenčnou analýzou DNA a fragmenty Sall-Hpal, obsahujúce gén mutovaného P-selektínu, boli klonované do miest Xhol a Xbal expresného vektora pcDNAI (Invitrogen). Klony pcDNA boli transformované do kmeňa MC1061 E. coli (Invitrogen) a čistené plazmidové DNA boli použité pre transfekciu do COS.PCR mutagenesis was performed on plasmid pGMPA4, T. After phosphorylation at the 5'-end, primers in Table 6 were added to the individual PCR reactions in an amount of ΙχΜ along with the primer of the lys-1 T-antigen sequence. The PCR method was performed in a Perkin Elmer-Cetus for 30 cycles of 50 sec at 95 ° C, 1 min at 50 ° C and 4 min at 73 ° C using Pfu polymerase (Stratagene) according to the manufacturer's recommended conditions. After purification by agarose gel electrophoresis and elution with Qiaex (Qiagen Corp.), mutated pUC DNA were ligated and transformed into InvF'XE cells. coli (Invitrogen). The cloned DNA carrying the desired mutation was identified by DNA sequence analysis and SalI-HpaI fragments containing the mutated P-selectin gene were cloned into the XhoI and XbaI sites of the pcDNAI expression vector (Invitrogen). PcDNA clones were transformed into E. coli MC1061 strain (Invitrogen) and purified plasmid DNA was used for transfection into COS.

Metóda transfekcie DEAE-dextránDEAE-dextran transfection method

Táto metóda je opísaná v Kriegler, M., Gene Transfer and Express i on: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company (1990). Bunky COS boli naočkované v množstvo 1.10⁶ buniek/100 mm misku v DMEM (Biowhittaker), 10 % fetálneho hovädzieho séra (FBS). V deň 2 bola plazmidová DNA vyzrážaná etanolom a resuspendovaná v koncentrácii 20 μg/ml v sterilnom TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). 150 μΐ DNA bolo zmiešaných s 300 μΐ sterilného TBS (salinický roztok pufrovaný Tris, 140 mM NaCl, 5 mM KC1, 1,4 mM Na₂HPO₄, 25 mM Tris-bázy, pH 7,5, 1,0 mM CaCl₂ a 0,5 mM MgCl₂) a s 300 μΐ sterilného DEAE-dextránu (Sigma, #D-9885, 1 mg/ml v TBS). Rastové médium bolo odsaté a bunkové monovrstvy boli premyté jeden raz PBS a jeden raz TBS. K monovrstve bolo pridaných 750 μΐ zmesi DNA/DEAE-dextrán/TBS. Miska bola inkubovaná pri teplote miestnosti vnútri digestora s laminárnym prúdením a každých 5 min počas lh s ňou bolo kývané. Po 1 h bol roztok DNA odsatý a bunky boli premyté jeden raz TBS a potom jeden raz PBS. Potom boli bunky inkubované v kompletnom médiu, doplnenom 100 μΜ chlorochinu (Sigma, #C-6628) pri 37 °C, 5 % CO₂. Po 4 h bolo médium nahradené kompletným médiom a bunky boli inkubované pri 37 °C a 5 % C0₂. Po 48 h post-transfekcie bolo bunkám dodané rastové médium DMEM neobsahujúce sérum. Po ďalších 24 h bolo médium zobrané, bunkové zlomky boli odstránené odstredením pri otáčkach 1500 min“¹ po dobu 5 min v stolnej klinickej odstredivke.This method is described in Kriegler, M., Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, WH Freeman and Company (1990). COS cells were seeded at ^{10 6} cells / 100 mm dish in DMEM (Biowhittaker), 10% fetal bovine serum (FBS). On day 2, plasmid DNA was ethanol precipitated and resuspended at 20 µg / ml in sterile TE (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA). 150 μΐ DNA was mixed with 300 μΐ sterile TBS (Tris buffered saline, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.4 mM Na ₂ HPO ₄ , 25 mM Tris-base, pH 7.5, 1.0 mM CaCl ₂ and 0.5 mM MgCl ₂ ) and 300 µΐ sterile DEAE-dextran (Sigma, # D-9885, 1 mg / ml in TBS). The growth medium was aspirated and the cell monolayers were washed once with PBS and once with TBS. 750 μΐ of DNA / DEAE-dextran / TBS mixture was added to the monolayer. The dish was incubated at room temperature inside a laminar flow hood and rocked with it every 5 min for 1 h. After 1 h, the DNA solution was aspirated and the cells were washed once with TBS and then once with PBS. The cells were then incubated in complete medium supplemented with 100 μΜ chloroquine (Sigma, # C-6628) at 37 ° C, 5% CO ₂ . After 4 h, the medium was replaced with complete medium and the cells were incubated at 37 ° C and 5% CO ₂ . After 48 h post-transfection, serum-free DMEM growth medium was supplied to the cells. After another 24 hours, the medium was collected, cell fragments were removed by centrifugation at 1500 min ^"1 for 5 min in a tabletop clinical centrifuge.

Záchytová ELISA pre analýzu vylúčených mutačných proteínovCapture ELISA for analysis of secreted mutation proteins

P-selektinu simuláciaP-selectin simulation

P-selektínuP-selectin

96jamková platňa Costar bola cez noc pri 4 °C potiahnutá protilátkou KT-3 (produkovanou v ascites a čistenou na Protein G-Sepharose, Pharmacia) s koncentráciou 40 iig/ml v množstve 100 μΐ/jamku. Platňa bola premytá 3x DPBS, blokovaná 1 h pri teplote miestnosti s 250 μΐ/jamku DBPS + 1 % BSA. Potom bola platňa premytá 3x DPBS a inkubovaná 2 h pri teplote miestnosti so supernatantami buniek COS v množstve 100 μΐ/jamku. Po premytí platne 3x s DPBS bol naviazaný P-selektín detegovaný prídavkom buď 100 μΐ/jamku (a) 1 ng/ml králičieho anti-P-selektínového polyklonálneho Ig alebo (b) biotinylovanej mu MAb PB1.3 alebo (c) biotinylovanej P6H6, riedenej 1 h pri teplote miestnosti v DPBS/1 % BSA. Po premytí platne 3x DPBS bola detegovaná králičia protilátka s použitím 100 μΐ/jamku riedenia 1:1000 HRP-konjugovanej kozej anti-králičej protilátky (Biorad), blokovanej 30 min pri teplote miestnosti tkanivovým kultivačným médiom z bunkovej línie KT-3 (10%). Biotinylované protilátky boli detegované s použitím 100 μΐ/jamku riedenia 1:1000 HRP-streptavidínu (Pierce) po dobu 30 min pri teplote miestnosti. Naviazaná HRP bola inkubovaná s TMB a reakcia ukončená s IM kyselinou fosforečnou. Obr. 32 znázorňuje signál menší než pozadie zo supernatantov simulovane transfikovaných buniek COS. Stĺpec je supernatant z buniek transfikovaných formou s plnou dĺžkou, ktorej chýba tag SV40A Costar 96 well plate was coated overnight at 4 ° C with KT-3 antibody (produced in ascites and purified on Protein G-Sepharose, Pharmacia) at a concentration of 40 µg / ml at 100 µΐ / well. The plate was washed 3 times with DPBS, blocked for 1 h at room temperature with 250 μΐ / well DBPS + 1% BSA. The plate was then washed 3 times with DPBS and incubated for 2 h at room temperature with 100 μΐ / well COS cell supernatants. After washing the plate three times with DPBS, bound P-selectin was detected by adding either 100 μΐ / well (a) 1 ng / ml rabbit anti-P-selectin polyclonal Ig or (b) biotinylated mu MAb PB1.3 or (c) biotinylated P6H6, diluted 1 h at room temperature in DPBS / 1% BSA. After washing the plate 3 times with DPBS, rabbit antibody was detected using 100 μΐ / well 1: 1000 dilution of HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody (Biorad), blocked for 30 min at room temperature with KT-3 cell line tissue culture medium (10%). . Biotinylated antibodies were detected using 100 μΐ / well 1: 1000 dilution of HRP-streptavidin (Pierce) for 30 min at room temperature. Bound HRP was incubated with TMB and quenched with 1M phosphoric acid. Fig. 32 shows a signal less than background from supernatants of mock-transfected COS cells. The column is the supernatant of cells transfected with the full-length form lacking the SV40 tag

T-antigénu, a nie je preto detegovaná pri tejto metóde záchytovej ELISA pomocou KT-3. Na osi X sú uvedené počty CRP, ex94 primovaných cDNA rôznych mutantov P-selektínu, od všetkých 9 CRP v stĺpci 2 k jednému CRP v stĺpci 10. Výsledky ukazujú, že aj keď je možné mutanty P-selektínu, ktorým chýba 5 karboxy terminálnych CRP, detegovať polyklonálnym králičím Ig, nereagujú tieto molekuly s PBl.3. Z toho by vyplývalo, že väzbové miesto pre PBl.3 leží vnútri oblasti piatej repetície CRP.T-antigen and is therefore not detected in this capture ELISA method by KT-3. The X-axis shows the numbers of CRP, ex94 primed cDNAs of various P-selectin mutants, from all 9 CRPs in column 2 to one CRP in column 10. The results show that although P-selectin mutants lacking 5 carboxy terminal CRPs are possible , to detect polyclonal rabbit Ig, these molecules do not react with PB1.3. This would imply that the PB1.3 binding site lies within the fifth CRP repeat region.

Za účelom potvrdenia výsledkov z mapovania epitopu bola delečná analýza rozšírená na deléciu iba piatej oblasti CRP s ponechaním karboxyterminálnych sekvencií P-selektínu intaktnými (viď obr. 30). Na odstránenie oblasti P-selektínu, kódujúcu aminokyseliny 407 až 468 (tabuľka 6) boli navrhnuté ampliméry PCR rovnakým spôsobom ako vyššie. Supernatanty buniek boli analyzované priamo ELISA s protilátkami mu MAb PBl.3 a P6H6 (obr. 33). Aj keď sa mu MAb PBl.3 viaže na intaktný P-selektín, neviaže sa na delečnú molekulu. P6H6 sa viaže na obe molekuly ekvivalentne.In order to confirm the results from the epitope mapping, deletion analysis was extended to deletion of only the fifth region of CRP leaving the carboxyterminal P-selectin sequences intact (see Fig. 30). To remove the P-selectin region encoding amino acids 407 to 468 (Table 6), PCR amplimers were designed in the same manner as above. Cell supernatants were analyzed directly by ELISA with mu MAb PB1.3 and P6H6 antibodies (Fig. 33). Although MAb PB1.3 binds to intact P-selectin, it does not bind to the deletion molecule. P6H6 binds to both molecules equivalently.

Analýzy syntetických peptidovAnalysis of synthetic peptides

Epitop mu MAb PBl.3 bol ďalej charakterizovaný syntetizovaním peptidov preklenújúcich oblasť 62 aminokyselín piateho CRP P-selektínu (obr. 34) a screeningom väzby mu MAb PBl.3 pomocou ELISA. Piata oblasť CRP siaha od aminokyseliny 407 do 468 podľa nomenklatúry podľa Johnstona a ď. Peptidické sekvencie sú 968.01, aminokys. 408-426; 968.02, aminokys. 418-436; 968.04, aminokys. 408-433; 968.05, oxidovaná verzia 968.04; 968.06, aminokys. 428-447, a 968.08, aminokys. 448-467. Každý peptid bol rozpustený na 2 mg/ml v dimetylsulfoxide (DMSO) a nanesený na 96jamkovú mikrotitračnú platňu nariedením 1 μg do 100 μΐ PBS a sušený cez noc pri 37 °C. Potiahnuté jamky boli premyté PBS a blokované 30 min pri teplote miestnosti s 250 μΐ/jamku roztoku PBS/1 % BSA. Potom boli jamky premyté PBS a inkubované pri teplote miestnosti so 100 μΙ/jamku ΡΒ1.3, zriedeného na 1 μ9/πι1 v PBS/1 % BSA. Naviazaná mu MAb PB1.3 bola detegovaná HRP-konjugovanou kozou anti-myšou protilátkou a substrátom TMB, ako je opísané vyššie. Na obr. 34 je uvedené porovnanie reaktivity PB1.3 s peptidmi. Karboxyterminálny peptid č. 968.08 silne reagoval s PB1.3. Epitop rozpoznávaný PB1.3 je teda mapovaný medzi aminokyselinami 448 až 467 v piatej CRP ludského P-selektínu.The mu MAb PB1.3 epitope was further characterized by synthesizing peptides spanning the 62 amino acid region of the fifth CRP P-selectin (Fig. 34) and screening the binding of mu MAb PB1.3 by ELISA. The fifth region of the CRP ranges from amino acids 407 to 468 according to the nomenclature of Johnston et al. The peptide sequences are 968.01, amino acid. 408-426; 968.02, amino acid. 418-436; 968.04, amino acid. 408-433; 968.05, oxidized version 968.04; 968.06, amino acid. 428-447, and 968.08, amino acid. 448-467. Each peptide was dissolved at 2 mg / ml in dimethylsulfoxide (DMSO) and plated on a 96 well microtiter plate by diluting 1 µg to 100 µΐ PBS and dried overnight at 37 ° C. The coated wells were washed with PBS and blocked for 30 min at room temperature with 250 μΐ / well PBS / 1% BSA solution. The wells were then washed with PBS and incubated at room temperature with 100 μΙ / well ΡΒ1.3, diluted to 1 μ9 / πι1 in PBS / 1% BSA. Bound mu MAb PB1.3 was detected with HRP-conjugated goat anti-mouse antibody and TMB substrate as described above. In FIG. 34 shows a comparison of PB1.3 reactivity with peptides. Carboxyterminal peptide no. 968.08 strongly reacted with PB1.3. Thus, the epitope recognized by PB1.3 is mapped between amino acids 448 to 467 in the fifth human P-selectin CRP.

Vynález bol kvôli jasnosti a zrozumiteľnosti opísaný v týchto príkladoch a vo vyššie uvedenom opise o niečo podrobnejšie. Je však zrejmé, že v rozsahu pripojených patentových nárokov je možné uskutočňovať určité zmeny a modifikácie. Všetky vyššie citované publikácie a patentové prihlášky sú tu vždy ako celok zahrnuté formou odkazu pre všetky účely v takom rozsahu, ako by boli jednotlivo celé uvedené.For the sake of clarity and clarity, the invention has been described in more detail in these examples and in the above description. It will be understood, however, that certain changes and modifications may be made within the scope of the appended claims. All publications and patent applications cited above are hereby incorporated by reference in their entirety herein for all purposes to the extent that they are individually cited.

TABUĽKA 1TABLE 1

PRIRADENIE SEKVENCIÍ AMINOKYSELÍN VEDÚCE K NÁVRHU VARIABILNEJ OBLASTI ŤAŽKÉHO REŤAZCA PRETVORENEJ ĽUDSKEJ PB1.3ASSIGNMENT OF AMINO ACID SEQUENCES LEADING TO THE PROPOSAL FOR A VARIABLE AREA OF HIGH CHAINS RESOLVED HUMAN PB1.3

Kabat č. FR či myšia myšia íudská íudská RHVuA pozn.Kabat no. FR or mouse human human RHVuA note.

CDR 1747 II A I 21/28'CL 1747CDR 1747 II A 21 / 28'CL 1747

1 1 1 1 FR1 FR1 E E E E Q Q PCA PCA E E 2 2 2 2 1 1 A A V IN V IN V IN A A

klonovanie k Hl, možná úloha pri väzbe antigénu neobvyklá amino. kýs., klonovanie do Hl, možná úloha pri väzbe antigénucloning to H1, a possible role in unusual amino antigen binding. cloning into H1, a possible role in antigen binding

3 3 ³³ Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q 4 4 4 4 L L L L L L L L L L 5 5 5 5 Q Q Q Q V IN V IN V IN 6 6 ⁶⁶ Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q 7 7 7 7 S WITH S WITH S WITH S WITH S WITH 8 8 ⁸⁸ G G G G G G G G G G 9 9 ⁹⁹ P P P P A A A A A A 10 10 ¹⁰¹⁰ E E E E E E E E E E 11 11 11 11 L L L L V IN V IN V IN 12 12 12 12 V IN v in K The K The K The 13 13 13 13 E E K The K The K The K The 14 14 ¹⁴¹⁴ P P P P P P P P P P 15 15 15 15 G G G G G G G G G G 16 16 16 16 A A A A A A A A A A 17 17 17 17 S WITH S WITH S WITH S WITH S WITH 18 18 18 18 V IN V IN V IN V IN V IN 19 19 ¹⁹¹⁹ K The K The K The K The K The 20 20 20 20 V IN I I v in V IN v in 21 21 21 21 S WITH s with s with s with S WITH 22 22 22 22 C C C C C C C C C C 23 23 23 23 K The K The K The K The K The 24 24 24 24 A A A A A A A A A A 25 25 25 25 S WITH S WITH S WITH S WITH S WITH 26 26 26 26 G G G G G G G G G* G * 27 27 27 27 Y Y Y Y Y Y Y Y Y* Y * 28 28 28 28 T T T T T T T T T* T * 29 29 29 29 P P P P P P P P P* P * 30 30 30 FR1 T 29 FR1 T T T T T T T T* T * 31 31 31 CDR1 N 31 CDR1 N D D S WITH S WITH N* N * 32 32 32 32 Y Y Y Y Y Y Y Y Y* Y * 33 33 33 33 v in Y Y A A A A V IN 34 34 ³⁴³⁴ M M M M I I M M M* M * 35 35 35 ! 35! H H N N S WITH H H H H

pokračovanie TABUĽKY 1continuation of TABLE 1

ČDR1 CDR1 * * 36 36 FR2 FR2 w w w w w w w w w w 37 37 1 I 1 I v in v in v in v in v in 38 38 1 I 1 I K The K The R R R R R R 39 39 1 I 1 I Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q 40 40 1 I 1 I K The S WITH A A A A A A 41 41 1 I 1 I P P P P P P P P P P 42 42 1 I 1 I G G G G G G G G G G 43 43 1 I 1 I Q Q K The Q Q Q Q Q Q 44 44 1 I 1 I G G S WITH G G R R R R 45 45 1 I 1 I L L L L L L L L L L 46 46 I I I I E E E E E E E E E E 47 47 1 I 1 I W W W W W W W W W W 48 48 1 1 I I I I M M M M M M 49 49 FR2 FR2 G G G G G G G G G G 50 50 CDR2 CDR2 F F D D W W W W F F 51 51 1 I 1 I I I I I I I I I I I 52 52 1 I 1 I N N N N N N N N N N 53 53 1 I 1 I P P P P P P A A P* P * 1 I 1 I — - — - Y Y - - - - 1 I 1 I - - - - - - — - — - 54 54 1 I 1 I S WITH G G G G G G S* WITH* 55 55 1 I 1 I N N N N N N N N N* N * 56 56 1 I 1 I D D G G G G G G D* D * 57 57 1 I 1 I G G G G D D N N G G 58 58 1 I 1 I P P T T T T T T P P 59 59 I I I I K The S WITH N N K The K The 60 60 1 I 1 I Y Y Y Y Y Y T T Y Y 61 61 1 I 1 I N N N N A A s with N N 62 62 1 I 1 I E E Q Q Q Q Q Q E E 63 63 1 I 1 I R R K The K The K The R R 64 64 1 I 1 I F F F F F F F F F F 65 65 1 1 K The K The Q Q Q Q K The 66 66 CDR2 CDR2 N N G G G G G G N N 67 67 FR3 FR3 K The K The R R R R R R 68 68 1 I 1 I A A A A V IN V IN V IN 69 69 1 I 1 I T T T T T T T T T T 70 70 1 I 1 I L L L L I I I I I I 71 71 1 I 1 I T T T T T T T T T T 72 72 1 1 1 1 S WITH V IN A A R R s* with* 73 73 1 I 1 I D D D D D D D D D D 74 74 1 I 1 I K The K The T T T T T T 75 75 1 I 1 I S WITH S WITH S WITH S WITH S WITH 76 76 1 I 1 I S WITH S WITH T T A A A A 77 77 1 | 1 | s with s with S WITH S WITH S WITH 78 78 1 I 1 I T T T T T T T T T T 79 79 1 I 1 I A A A A A A A A A A 80 80 1 I 1 I Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 81 81 1 1 1 1 M M M M M M M M M M

kanón. struk. H2, môže podporovať H2 pokračovanie TABUÉKY 1gun. teat. H2, may support H2 continuation of TABLE 1

81 81 82 82 1 1 E E Q Q E E E E 82 82 83 83 I I L L L L L L L L 82A 82A 84 84 1 I 1 I S WITH S WITH S WITH S WITH 82B 82B 85 85 1 I 1 I S WITH S WITH s with S WITH 82C 82C 86 86 1 I 1 I L L L L L L L L 83 83 87 87 1 I 1 I T T T T R R R R 84 84 88 88 1 I 1 I S WITH S WITH S WITH S WITH 85 85 89 89 1 I 1 I E E E E E E E E 86 86 90 90 1 | 1 | V IN D D D D D D 87 87 91 91 1 I 1 I S WITH S WITH T T T T 88 88 92 92 1 1 1 1 A A A A A A A A 89 89 93 93 1 I 1 I V IN V IN V IN V IN 90 90 94 94 1 I 1 I Y Y Y Y Y Y Y Y 91 91 95 95 1 I 1 I P P Y Y Y Y Y Y 92 92 96 96 1 I 1 I c C c C C C C C 93 93 97 97 1 1 1 1 A A A A A A A A 94 94 98 98 FR3 FR3 R R R R R R R R 95 95 99 99 CDR3 CDR3 A A G G A A G G 96 96 100 100 1 I 1 I R R X X P P - - 97 97 101 101 1 I 1 I P P Y Y G G - - 98 98 102 102 1 I 1 I G G Y Y Y Y — - 99 99 103 103 1 I 1 I F F s with G G G G 100 100 104 104 1 I 1 I D D s with S WITH — - 100A 100A 1 I 1 I - - s with G G — - 100B 100B 1 I 1 I - - Y Y G G — - 100C 100C 1 I 1 I - - M M G G — - 100D 100D 1 I 1 I - - X X C C — - 100E 100E 1 I 1 I - - A A Y Y — - 100F 100F 1 I 1 I - - X X R R Y Y 100G 100G 1 I 1 I - - X X G G Y Y 100H 100H 1 I 1 I - - Y Y D D G G 1001 1001 105 105 1 I 1 I W W Y Y Y Y S WITH 100J 100J 106 106 1 I 1 I Y Y A A — - G G 100K 100K 107 107 1 I 1 I F F F F F F S WITH 101 101 108 108 1 1 D D D D D D N N 102 102 109 109 CDR3 CDR3 V IN Y Y Y Y Y Y 103 103 110 110 FR4 FR4 W W W W W W W W 104 104 111 111 I I G G G G G G G G 105 105 112 112 1 I 1 I A A Q Q Q Q Q Q 106 106 113 113 1 I 1 I G G G G G G G G 107 107 114 114 1 I 1 I T T T T T T T T 108 108 115 115 1 I 1 I T T T T L L L L 109 109 116 116 1 I 1 I V IN V IN V IN V IN 110 110 117 117 1 I 1 I T T T T T T T T 111 111 118 118 1 | 1 | V IN V IN V IN V IN 112 112 119 119 1 1 1 1 S WITH S WITH S WITH S WITH 113 113 120 120 FR4 FR4 S WITH s with S WITH S WITH

EE

LL

SWITH

SWITH

LL

RR

SWITH

EE

DD

TT

AA

YY

YY

Y c A R* A R P G F D Y c A R * G R P G F D

TABUĽKA 2TABLE 2

PRIRADENIE SEKVENCIÍ AMINOKYSELÍN VEDÚCE K NÁVRHU VARIABILNEJ OBLASTI ĽAHKÉHO REŤAZCA PRETVORENEJ ĽUDSKEJ PB1.3ASSIGNMENT OF AMINO ACID SEQUENCES TO THE PROPOSAL FOR A VARIABLE AREA OF LIGHT CHAIN OF RESOLVED HUMAN PB1.3

Kabat A coat Č. No. FR či CDR FR or CDR myšia 1747 murine 1747 myšia <-v murine <-v ľudská k-I human k-I ľudská DEN human DAY RH 17 RH 17 1 1 1 1 FR1 FR1 D D D D D D D D D D 2 2 2 2 1 I 1 I I I I I I I I I I* I * 3 3 3 3 1 I 1 I V IN Q Q Q Q Q Q Q Q 4 4 4 4 1 I 1 I M M M M M M M M M M 5 5 5 5 1 I 1 I T T T T T T T T T T 6 6 6 6 1 | 1 | Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q 7 7 7 7 1 I 1 I s with s with s with S WITH S WITH 8 8 8 8 i I and I Q Q P P P P P P P P 9 9 9 9 1 I 1 I K The s with S WITH S WITH S WITH 10 10 10 10 1 I 1 I F F s with s with T T T T 11 11 11 11 1 I 1 I M M L L L L L L L L 12 12 12 12 1 I 1 I S WITH S WITH S WITH S WITH S WITH 13 13 13 13 1 I 1 I T T A A A A A A A A 14 14 14 14 1 I 1 I s with S WITH S WITH S WITH S WITH 15 15 15 15 1 I 1 I v in L L V IN V IN V IN 16 16 16 16 1 I 1 I 6 6 6 6 G G G G G G 17 17 17 17 1 I 1 I D D D D D D D D D D 18 18 18 18 1 I 1 I R R R R R R R R R R 19 19 19 19 1 I 1 I V IN V IN V IN V IN V IN 20 20 20 20 1 I 1 I S WITH T T T T T T T T 21 21 21 21 1 1 1 1 V IN I I I I I I V IN 22 22 22 22 1 1 1 1 T T T T T T T T T T 23 23 23 23 FR1 FR1 C C c C c C c C C C 24 24 24 24 CDR1 CDR1 K The R R R R R R K The 25 25 25 25 1 I 1 I A A A A A A T T A* A * 26 26 26 26 1 I 1 I S WITH S WITH S WITH S WITH S* WITH* 27 27 27 27 1 I 1 I Q Q Q Q Q Q Q Q Q* Q * 27A 27A 28 28 1 I 1 I N N D D S WITH S WITH N N 27B 27B 1 I 1 I - - - - L L — - — - 27C 27C 1 I 1 I - - — - V IN — - — - 27D 27D 1 1 1 1 — - — - — - 27E 27E 1 1 1 1 — - — - — - — - 27F 27F 1 I 1 I — - — - — - 28 28 29 29 1 I 1 I v in D D s with I I v* in* 29 29 30 30 1 I 1 I A A I I I I A A A* A * 30 30 31 31 1 I 1 I T T S WITH s with R R T* T * 31 31 32 32 1 | 1 | N N N N N/S N / S W W N* N * 32 32 33 33 1 I 1 I V IN Y Y Y Y L L v* in* 33 33 34 34 1 1 1 1 V IN L L L L A A V* IN* 34 34 CDR1 CDR1 - - N N A A — - — - 35 35 35 35 FR2 FR2 W W W W W W w w w w 36 36 36 36 1 1 1 1 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y

podporujúce Ll.l môže prerušiť zónusupporting L1.1 can interrupt the zone

100 pokračovanie TABUĽKY 2100 continued TABLES 2

37 ! 37! Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q 38 38 1 I 1 I Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q 39 39 1 I 1 I R R K The K The K The K The 40 40 1 I 1 I P P P P P P P P P P 41 41 1 I 1 I G G G G G G G G G G 42 42 1 | 1 | Q Q Q Q K The E E E E 43 43 1 | 1 | S WITH S WITH A A A A A A 44 44 1 I 1 I P P P P P P P P P P 45 45 1 I 1 I K The K The K The K The K The 46 46 1 I 1 I A A L L L L L L A môže podporovať And can support 1 1 I 1 1 I L2. L môže zmeniť orientáciu L2 L2. L can change the orientation of L2 47 47 1 I 1 I L L L L L L L L L L 48 48 1 1 1 1 I I I I I I I I I* I * 49 49 FR2 FR2 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 50 50 CDR2 CDR2 T T Y Y A A G G T* T * 51 51 1 I 1 I A A A A A A A A A* A * 52 52 1 I 1 I S WITH S WITH S WITH S WITH S* WITH* 53 53 1 I 1 I Y Y R R S WITH N N Y Y 54 54 1 I 1 I R R L L L L L L R R 55 55 1 1 1 1 F F H H E E E E F F 56 56 CDR2 CDR2 S WITH S WITH S WITH S WITH S WITH 57 57 FR3 FR3 G G G G G G G G G G 58 58 1 1 1 1 V IN V IN V IN V IN V IN 59 59 1 I 1 I P P P P P P P P P P 60 60 1 1 1 1 E E S WITH S WITH S WITH E blízky zvyšku 54 E near residue 54 v L2, na povrchu a môže viazať Ag in L2, on the surface and can bind Ag 61 61 1 I 1 I R R R R R R R R R R 62 62 1 I 1 I F F F F F F F F F F 63 63 1 I 1 I S WITH S WITH S WITH S WITH S WITH 64 64 1 I 1 I G G G G G G G G G* G * 65 65 1 I 1 I S WITH S WITH S WITH S WITH S WITH 66 66 1 I 1 I G G G G G G G G G G 67 67 1 I 1 I S WITH S WITH S WITH S WITH S WITH 68 68 1 I 1 I G G G G G G G G G G 69 69 1 I 1 I T T T T T T T T T T 70 70 1 1 1 1 D D D D D D E E D môže mať nábojovú D may have a charge interakciu so zvyškom 24 v Ll interaction with residue 24 in L1 71 71 1 I 1 I F F Y Y F F F F F* F * 72 72 1 I 1 I T T S WITH T T T T T T 73 73 1 I 1 I L L L L L L L L L L 74 74 1 I 1 I T T T T T T T T T T 75 75 1 I 1 I I I I I I I I I I I 76 76 1 I 1 I T T S WITH s with s with s with 77 77 1 I 1 I N N N N s with s with s with 78 78 1 I 1 I V IN L L L L L L L L 79 79 1 I 1 I Q Q E E Q Q Q Q Q Q 80 80 1 1 1 1 S WITH Q Q P P S WITH S WITH

101 pokračovanie TABUÉKY 2101 continued TABLES 2

81 81 81 81 1 I 1 I E E E E E E D D D D 82 82 82 82 1 I 1 I D D D D D D D D D D 83 83 83 83 1 I 1 I L L I I F F F F F F 84 84 84 84 1 I 1 I A A A A A A A A A A 85 85 85 85 1 I 1 I D D T T T T T T T T 86 86 86 86 1 I 1 I Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 87 87 87 87 1 1 1 1 F F F F Y Y Y Y Y Y 88 88 88 88 FR3 FR3 C C C C c C c C C C 89 89 89 89 CDR3 CDR3 Q Q Q Q Q Q Q Q Q Q 90 90 90 90 1 I 1 I Q Q Q Q Q Q Q Q Q* Q * 91 91 91 91 1 I 1 I Y Y G G Y Y Y Y Y* Y * 92 92 92 92 1 I 1 I N N N N N N D D N* N * 93 93 93 93 1 I 1 I N N T T S WITH S WITH N* N * 94 94 94 94 1 I 1 I Y Y L L L L F F Y* Y * 95 95 95 95 1 I 1 I P P P P P P P P P* P * 95A 95A 1 I 1 I - - - - E E — - — - 95B 95B 1 I 1 I - - — - — - — - — - 95C 95C 1 I 1 I - - - - — - — - — - 95D 95D 1 I 1 I - - - - — - — - — - 95E 95E 1 I 1 I - - - - — - — - — - 95F 95F 1 I 1 I - - - - I I — - — - 96 96 96 96 1 1 1 1 Y Y R R W W Y Y Y* Y * 97 97 97 97 CDR3 CDR3 T T T T T T T T T T 98 98 98 98 FR4 FR4 F F F F F F F F F F 99 99 99 99 1 I 1 I G G G G G G G G G G 100 100 100 100 1 I 1 I G G G G Q Q Q Q Q Q 101 101 101 101 1 I 1 I G G G G G G G G G G 102 102 102 102 1 I 1 I T T T T T T T T T T 103 103 103 103 1 I 1 I K The K The K The K The K The 104 104 104 104 1 I 1 I V IN L L v in L L L L 105 105 105 105 1 I 1 I E E E E E E E E E E 106 106 106 106 1 I 1 I I I I I I I I I I I 106A 106A 1 1 1 1 - - - - — - — - — - 107 107 107 107 FR4 FR4 Q Q K The K The K The K The

102102

TABUĽKA 3TABLE 3

ROZDIELY V SEKVENCIÁCH AMINOKYSELÍN VO VARIABILNÝCH OBLASTIACH ŤAŽKÉHO REŤAZCA PRE TRI PRETVORENÉ VERZIE PB1.3DIFFERENCES IN AMINO ACID SEQUENCES IN VARIABLE HEAVY CHAIN AREAS FOR THREE CONFORMED VERSIONS PB1.3

KONŠTRUK. Construct. AMINOKYSELINA Amino acids 1 1 2 2 73 73 1748RH_Ä 1748RH _Ä GLU GLU ALA ALA THR THR 1748RH_B 1748RH _B GLN GLN VAL VAL THR THR 1748RH_C 1748RH _C GLU GLU ALA ALA LYS LYS

TABUĽKA 4TABLE 4

ROZDIELY V SEKVENCIÁCH AMINOKYSELÍN VO VARIABILNÝCH OBLASTIACH ĽAHKÉHO REŤAZCA PRE ŠTYRI PRETVORENÉ VERZIE PB1.3DIFFERENCES IN SEQUENCES OF AMINO ACIDS IN VARIABLE LIGHT CHAIN AREAS FOR THE FOUR CONVERSION OF PB1.3

KONŠTRUK. AMINOKYSELINAConstruct. Amino acids

60 60 70 70 1748RL_Ä 1748RL _Ä GLU GLU ASP ASP 1748RL_b 1748RL _b SER SER ASP ASP 1748RL_C 1748RL _C GLU GLU GLU GLU 1748RL_d 1748RL _d SER SER GLU GLU

103103

TABUĽKA 5TABLE 5

PRODUKTIVITA PROTILÁTOK AMPLIFIKOVANÝCH BUNKOVÝCH LÍNIÍ CHO PRODUKUJÚCICH TRI RÔZNE VERZIE HUMANIZOVANEJ PB1.3 (CY1748) (ng/10⁶ buniek/deň)PRODUCTIVITY OF ANTIBODIES OF AMPLIFIED CELL-LINES CHO PRODUCING THREE VARIOUS VERSIONS OF HUMANIZED PB1.3 (CY1748) (ng / 10 ⁶ cells / day)

protilátka antibody neamDlifikovaná neamDlifikovaná 1. beh 1st run 2. beh Run 2 3. beh 3. run 1748A-IgGl 1748-IgG 0,36 0.36 2,1 2.1 8,2 8.2 29,6 29.6 0,36 0.36 2,1 2.1 13,7 13.7 21,8 21.8 0,36 0.36 0,90 0.90 9,9 9.9 19,7 19.7 1748B-IgGl 1748B-IgG 0,10 0.10 1,6 1.6 23,9 23.9 0,24 0.24 1,5 1.5 21,1 21.1 < 0,2 <0.2 7,3 7.3 18,6 18.6 0,10 0.10 1,6 1.6 17,8 17.8 1748B-IgG4 1748B-IgG4 < 0,3 <0.3 < 2,0 <2.0 f 3 3 7Ô1 f 3 3 7Ô1 < 0,3 <0.3 < 2,0 <2.0 26,9 26.9 0,75 0.75 2,6 2.6 23,2 23.2 < 0,3 <0.3 3,0 3.0 20,8 20.8 0,80 0.80 6,5 6.5 20,8 20.8 < 0,3 <0.3 < 2,0 <2.0 19,4 19.4 0,78 0.78 2,5 2.5 18,6 18.6 0,78 0.78 8,8 8.8 17,8 17.8

104104

TABUĽKA 6TABLE 6

SEKVENCIE DNA AMPLIMÉROV PCR POUŽITÝCH NA GENEROVANIE CRP DELEČNÝCH MUTANTOV ĽUDSKÉHO P-SELEKTÍNUDNA sequences of PCR amplifiers used to generate CRP deletion mutants of human β-SELECTINE

3'-arnplimér PCR predpokladaná sekvencia na odstránenie čísla CRP_aminokyselín mutantaThe 3'-PCR amplifier put forward sequence to remove the CRP amino acid number of the mutant

9 9 5' 5 ' -TTTCACAGCTCTGCATGC-3' -TTTCACAGCTCTGCATGC-3 ' CRP ...CRAVK CRP ... CRAVK TIQEA TIQE TAg LK. TAg LK. 8-9 8-9 5' 5 ' -TGCTATGCCTTTGCAGGT-3' -TGCTATGCCTTTGCAGGT-3 ' ...CKGIA ... CKGIA TIQEA TIQE LK. LK. 7-8 7-8 5' 5 ' -CTTGATGGCTTCACACAT-3' -CTTGATGGCTTCACACAT-3 ' ...CEAIK ... CEAIK TIQEA TIQE LK. LK. 6-9 6-9 5' 5 ' -GGGAATGGCTTGGCATTC-3' -GGGAATGGCTTGGCATTC-3 ' ...CQAIP ... CQAIP TIQEA TIQE LK. LK. 5-9 5-9 5' 5 ' -CTGCAAAGCTTGACAGAC-3' -CTGCAAAGCTTGACAGAC-3 ' •··CQALQ • · · CQALQ TIQEA TIQE LK. LK. 4-9 4-9 5' 5 ' -CGAAATAGCCTCACAGGT-3' -CGAAATAGCCTCACAGGT-3 ' ...CEAIS ... CEAIS TIQEA TIQE LK. LK. 3-9 3-9 5' 5 ' -CTGCACAGCTTTACACAC-3’ -CTGCACAGCTTTACACAC-3 ' ...CKAVQ ... CKAVQ TIQEA TIQE LK. LK. 2-9 2-9 5' 5 ' -CTGGGCAGCTAAACACTG-3' -CTGGGCAGCTAAACACTG-3 ' ...CLAAQ ... CLAAQ TIQEA TIQE LK. LK.

5'-amplimér, lys-15'-amplimer, lys-1

5'-AAACCTCCCACACCCCCT-3'AAACCTCCCACACCCCCT the 5 '-3'

Na vypustenie iba CRP#5 boli použité tieto dva ampliméry: 5'-arnplimér 5'-TGCACACCTTTGCTAAGC-3'The following two amplimers were used to omit CRP # 5 only: the 5'-amplifier 5'-TGCACACCTTTGCTAAGC-3 '

3'-arnplimér 5'-CTGCAAAGCTTGACAGAC-3'3'-amino-5'-CTGCAAAGCTTGACAGAC-3 '

Claims (56)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Blokujúca protilátka proti P-selektínu, ktorá konkurenčne inhibuje väzbu protilátky, vylučovanej bunkovou líniou s prírastkovým číslom ATCC HB11041, na P-selektín, merané testom kompetitívnej inhibície.A blocking anti-P-selectin antibody that competitively inhibits the binding of an antibody secreted by the cell line with ATCC accession number HB11041 to P-selectin as measured by a competitive inhibition assay. 2. Blokujúca protilátka proti P-selektínu podľa nároku 1, ktorá inhibuje väzbu neutrofilov na P-selektín v neprítomnosti Ca²⁺.The blocking P-selectin antibody of claim 1, which inhibits neutrophil binding to P-selectin in the absence of Ca ²⁺ . 3. Blokujúca protilátka proti P-selektínu podľa nároku 1, ktorá inhibuje väzbu neutrofilov na P-selektín v prítomnosti peptidu CQNRYTDLVAIQNKNE.The blocking anti-P-selectin antibody of claim 1, which inhibits neutrophil binding to P-selectin in the presence of the peptide CQNRYTDLVAIQNKNE. 4. 4th Blokujúca ktorou je The blocker he is protilátka proti imunoglobulín IgG. anti-immunoglobulin IgG antibody. P-selektínu P-selectin podľa by nároku 1, Claim 1 5. 5th Blokujúca blocking protilátka proti anti - P-selektínu P-selectin podľa by nároku 1, Claim 1 ktorou je which is myšia protilátka. mouse antibody. 6. 6th Blokujúca blocking protilátka proti anti - P-selektínu P-selectin podľa by nároku 1, Claim 1 ktorá je produkovaná bunkovou líniou s prírastkovým číslom ATCC HB11041.which is produced by the cell line with ATCC accession number HB11041. 7. Blokujúca protilátka proti P-selektínu podľa nároku 1, ktorou je fragment Fab, Fab' F(ab’)₂, Fabc alebo Fv.The blocking P-selectin antibody of claim 1, which is a Fab, Fab 'F (ab') ₂ , Fabc or Fv fragment. - 106- 106 8. Spôsob detekcie P-selektínu, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:8. A method for detecting P-selectin comprising: podávanie protilátky podlá nároku 1 pacientovi alebo jeho tkanivovej vzorke a detekciu komplexov vytvorených špecifickou väzbou medzi protilátkou a P-selektínom prítomným v delovej vzorke.administering the antibody of claim 1 to a patient or a tissue sample thereof, and detecting complexes formed by specific binding between the antibody and P-selectin present in the cannon sample. 9. Spôsob liečenia ochorení imunitného systému, vyznačujúci sa tým, že sa pacientovi, trpiacemu týmto ochorením, podáva terapeuticky účinná dávka farmaceutického prípravku zahrnujúceho farmaceutický prijateľný nosič a blokujúcu protilátku proti P-selektínu podlá nároku 1.9. A method of treating immune system diseases, comprising administering to a patient suffering from the disease a therapeutically effective dose of a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and a blocking anti-P-selectin antibody according to claim 1. 10. Spôsob podlá nároku 9, vyznačujúci sa tým, že blokujúcou protilátkou proti P-selektínu je IgGj.10. The method of claim 9, wherein the blocking P-selectin antibody is IgG1. 11. Spôsob podlá nároku 9, vyznačujúci sa tým, že blokujúca protilátka proti P-selektínu je myšia.The method of claim 9, wherein the blocking P-selectin antibody is mouse. 12. Spôsob podlá nároku 9, vyznačujúci sa tým, že blokujúca protilátka proti P-selektínu je produkovaná bunkovou líniou s prírastkovým číslom ATCC HB11041.The method of claim 9, wherein the blocking P-selectin antibody is produced by a cell line with ATCC accession number HB11041. 13. Spôsob podlá nároku 9, vyznačujúci sa tým, že ochorenie je dôsledkom akútneho poškodenia plúc.The method of claim 9, wherein the disease is due to acute lung injury. 14. Spôsob podlá nároku 9, vyznačujúci sa tým, že ochorenie je poškodenie ischémiou-reperfúziou.The method of claim 9, wherein the disease is ischemia-reperfusion injury. - 107- 107 15. Spôsob podía nároku 9, vyznačujúci sa tým, že blokujúca protilátka proti P-selektínu sa podáva intravenózne.The method of claim 9, wherein the blocking P-selectin antibody is administered intravenously. 16. Spôsob liečenia stavu imunitného systému, vyznačujúci sa tým, že sa pacientovi podáva terapeuticky účinná dávka farmaceutického prípravku zahrnujúceho farmaceutický prijatelný nosič a blokujúcu protilátku proti P-selektínu podlá nároku 1.16. A method of treating an immune system condition comprising administering to the patient a therapeutically effective dose of a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and a blocking antibody to P-selectin according to claim 1. 17. Spôsob inhibície adhézie leukocytu k endoteliálnej bunke alebo doštičke, vyznačujúci sa tým, že sa podáva terapeuticky účinné množstvo farmaceutického prípravku zahrnujúceho blokujúcu protilátku podlá nároku 1 a farmaceutický prijateíný nosič.17. A method of inhibiting leukocyte adhesion to an endothelial cell or platelet comprising administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition comprising the blocking antibody of claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier. 18. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje farmaceutický prijateíný nosič a blokujúcu protilátku proti P-selektínu podlá nároku 1.18. A pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier and a blocking anti-P-selectin antibody according to claim 1. 19. Farmaceutický prípravok podlá nároku 18, vyznačujúci sa tým, že blokujúca protilátka proti P-selektínu je vylučovaná bunkovou líniou s prírastkovým číslom ATCC HB11041.The pharmaceutical composition of claim 18, wherein the blocking anti-P-selectin antibody is secreted by the cell line with ATCC accession number HB11041. 20. Farmaceutický prípravok podlá nároku 19, vyznačujúci sa tým, že protilátka je myšia.The pharmaceutical composition of claim 19, wherein the antibody is a mouse. 21. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že zahrnuje bunkovú líniu s prírastkovým číslom ATCC HB11041.21. A composition comprising a cell line with ATCC accession number HB11041. fďFD 108108 22. Humanizovaný imunoglobulín zahrnujúci humanizovaný ťažký reťazec a humanizovaný lahký reťazec, pričom (1) humanizovaný lahký reťazec zahrnuje tri oblasti určujúce komplementaritu (CDR1, CDR2 a CDR3), majúce aminokyselinové sekvencie zo zodpovedajúcich oblastí určujúcich komplementaritu lahkého reťazca myšieho imunoglobulínu PB1.3, a základnú štruktúru variabilnej oblasti zo sekvencie základnej štruktúry variabilnej oblasti ľudského lahkého reťazca x a (2) humanizovaný ťažký reťazec zahrnuje tri oblasti určujúce komplementaritu (CDR1, CDR2 a CDR3), majúce aminokyselinové sekvencie zo zodpovedajúcich oblastí určujúcich komplementaritu ťažkého reťazca myšieho imunoglobulínu PB1.3, a základnú štruktúru variabilnej oblasti zo sekvencie základnej štruktúry variabilnej oblasti ludského ťažkého reťazca, a pričom sa tento humanizovaný imunoglobulín špecificky viaže na P-selektín s väzbovou afinitou, ktorej dolná medza činí asi 10⁷ M^-1 a ktorej horná medza činí asi päťnásobok väzbovej afinity myšieho imunoglobulínu PB1.3.A humanized immunoglobulin comprising a humanized heavy chain and a humanized light chain, wherein (1) the humanized light chain comprises three complementarity determining regions (CDR1, CDR2 and CDR3) having amino acid sequences from the corresponding complementarity determining regions of the murine immunoglobulin PB1.3 light chain, and the variable region framework from the human light chain variable region framework sequence xa (2) the humanized heavy chain comprises three complementarity determining regions (CDR1, CDR2 and CDR3) having amino acid sequences from the corresponding complementary regions determining the murine immunoglobulin PB1.3 heavy chain, and a variable region framework from a human heavy chain variable region framework sequence, and wherein the humanized immunoglobulin specifically binds to a P-selectin with a binding affinity whose lower copper a is about 10 ⁷ M ^-1 and an upper limit of which is about five times the binding affinity of the mouse PB1.3 immunoglobulin. 23. Humanizovaný imunoglobulín podlá nároku 22, pričom sekvencia základnej štruktúry variabilnej oblasti ludského lahkého reťazca X je v aspoň jednej polohe vybranej z prvej skupiny zahrnujúcej L21, L46, L60 a L70 substituovaná aminokyselinou prítomnou v ekvivalentnej polohe sekvencie základnej štruktúry variabilnej oblasti lahkého reťazca myšieho imunoglobulínu PB1.3 a sekvencia základnej štruktúry variabilnej oblasti ludského ťažkého reťazca je v aspoň jednej polohe vybranej z druhej skupiny zahrnujúcej Hl, H2, H71 a H73 substituované aminokyselinou prítomnou v ekvivalentnej polohe sekvencie základnej štruktúry variabilnej oblasti ťažkého reťazca myšieho PB1.3.The humanized immunoglobulin of claim 22, wherein the human light chain variable region framework sequence X is at least one position selected from the first group consisting of L21, L46, L60 and L70 substituted with an amino acid present at the equivalent mouse immunoglobulin light chain variable region framework sequence position. PB1.3 and the human heavy chain variable region framework sequence is at least one position selected from the second group comprising H1, H2, H71 and H73 substituted with the amino acid present at the equivalent heavy chain variable region framework sequence of murine PB1.3. 109109 24. Humanizovaný imunoglobulín podľa nároku 23, kde základnou štruktúrou variabilnej oblasti humanizovaného ťažkého reťazca je sekvencie základnej štruktúry variabilnej oblasti ťažkého reťazca 21/28'CL.The humanized immunoglobulin of claim 23, wherein the framework of the humanized heavy chain variable region is the 21 / 28'CL heavy chain variable region framework. 25. Humanizovaný imunoglobulín podľa nároku 24, kde základnou štruktúrou variabilnej oblasti humanizovaného ľahkého reťazca je sekvenciá základnej štruktúry variabilnej oblasti ľahkého reťazca DEN.The humanized immunoglobulin of claim 24, wherein the humanized light chain variable region framework is a DEN light chain variable region framework sequence. 26. Humanizovaný imunoglobulín podľa nároku 25, kde základná štruktúra variabilnej oblasti humanizovaného ľahkého reťazca je v aspoň dvoch polohách substituovaná z prvej skupiny.The humanized immunoglobulin of claim 25, wherein the framework of the humanized light chain variable region is at least two positions substituted from the first group. 27. Humanizovaný imunoglobulín podľa nároku 26, kde základná štruktúra variabilnej oblasti humanizovaného ťažkého reťazca je v aspoň dvoch polohách substituovaná z druhej skupiny.The humanized immunoglobulin of claim 26, wherein the framework of the humanized heavy chain variable region is at least two positions substituted from the second group. 28. Humanizovaný imunoglobulín podľa nároku 22, kde humanizovaný ľahký reťazec zahrnuje sekvenciu aminokyselín variabilnej oblasti maturovaného ľahkého reťazca 1748RLA, znázornenú na obr. 14 (SEQ. ID. No ).The humanized immunoglobulin of claim 22, wherein the humanized light chain comprises the 1748RLA mature light chain variable region amino acid sequence shown in FIG. 14 (SEQ. ID. No.). 29. Humanizovaný imunoglobulín podľa nároku 22, kde humanizovaný ľahký reťazec zahrnuje sekvenciu aminokyselín variabilnej oblasti maturovaného ľahkého reťazca 1748RLB, znázornenú na obr. 15 (SEQ. ID. No ).The humanized immunoglobulin of claim 22, wherein the humanized light chain comprises the 1748RLB mature light chain variable region amino acid sequence shown in FIG. 15 (SEQ. ID. No.). - 110- 110 30. Humanizovaný imunoglobulín pódia nároku 22, kde humanizovaný ľahký reťazec zahrnuje sekvenciu aminokyselín variabilnej oblasti maturovaného ľahkého reťazca 1748RLC, znázornenú na obr. 16 (SEQ. ID. No ).The humanized immunoglobulin of claim 22, wherein the humanized light chain comprises the 1748RLC mature light chain variable region amino acid sequence shown in FIG. 16 (SEQ. ID. No.). 31. Humanizovaný imunoglobulín podľa nároku 22, kde humanizovaný ľahký reťazec zahrnuje sekvenciu aminokyselín variabilnej oblasti maturovaného ľahkého reťazca 1748RLD, znázornenú na obr. 17 (SEQ. ID. No ).The humanized immunoglobulin of claim 22, wherein the humanized light chain comprises the 1748RLD mature light chain variable region amino acid sequence shown in FIG. 17 (SEQ. ID. No.). 32. Humanizovaný imunoglobulín podľa nároku 22, kde humanizovaný ťažký reťazec zahrnuje sekvenciu aminokyselín variabilnej oblasti maturovaného ťažkého reťazca 1748RHA, znázornenú na obr. 11 (SEQ. ID. No ).The humanized immunoglobulin of claim 22, wherein the humanized heavy chain comprises the 1748RHA mature heavy chain variable region amino acid sequence shown in FIG. 11 (SEQ. ID. No.). 33. Humanizovaný imunoglobulín podľa nároku 22, kde humanizovaný ťažký reťazec zahrnuje sekvenciu aminokyselín variabilnej oblasti ťažkého reťazca 1748RHB, znázornenú na obr. 12 (SEQ. ID. No ).The humanized immunoglobulin of claim 22, wherein the humanized heavy chain comprises the 1748RHB heavy chain variable region amino acid sequence shown in FIG. 12 (SEQ. ID. No.). 34. Humanizovaný imunoglobulín podľa nároku 22, kde humanizovaný ťažký reťazec zahrnuje sekvenciu aminokyselín variabilnej oblasti maturovaného ťažkého reťazca 1748RHC, znázornenú na obr. 13 (SEQ. ID. No ).The humanized immunoglobulin of claim 22, wherein the humanized heavy chain comprises the 1748RHC mature heavy chain variable region amino acid sequence shown in FIG. 13 (SEQ. ID. No.). 35. Humanizovaný imunoglobulín podľa nároku 31, kde humanizovaný ťažký reťazec zahrnuje sekvenciu aminokyselín variabilnej oblasti maturovaného ťažkého reťazca 1748RHB, znázornenú na obr. 12 (SEQ. ID. No ).The humanized immunoglobulin of claim 31, wherein the humanized heavy chain comprises the 1748RHB mature heavy chain variable region amino acid sequence shown in FIG. 12 (SEQ. ID. No.). 36. Humanizovaný imunoglobulín podlá nároku 22, ktorým je fragment Fab, Fab', F(ab')₂, Fabc alebo Fv.36. The humanized immunoglobulin of claim 22 which is a Fab, Fab ', F (ab') ₂ , Fabc or Fv fragment. 37. Humanizovaný imunoglobulín podlá nároku 35, ďalej zahrnujúci doménu konštantnej oblasti.The humanized immunoglobulin of claim 35, further comprising a constant region domain. 38. Humanizovaný imunoglobulín podlá nároku 37, kde doména konštantnej oblasti má efektorovú funkciu.The humanized immunoglobulin of claim 37, wherein the constant region domain has an effector function. 39. Humanizovaný imunoglobulín podlá nároku 35, kde doméne konštantnej oblasti chýba efektorová funkcia.39. The humanized immunoglobulin of claim 35, wherein the constant region domain lacks effector function. 40. Humanizovaný imunoglobulín podlá nároku 38, kde efektorová funkcia je schopná fixácie komplementu alebo protilátkovo závislej bunkovej toxicity.The humanized immunoglobulin of claim 38, wherein the effector function is capable of complement fixation or antibody-dependent cellular toxicity. 41. Nukleová kyselina kódujúca ťažký reťazec humanizovaného imunoglobulínu podlá nároku 22.41. A nucleic acid encoding a humanized immunoglobulin heavy chain according to claim 22. 42. Nukleová kyselina kódujúca lahký reťazec humanizovaného imunoglobulínu podlá nároku 22.42. A nucleic acid encoding the light chain of a humanized immunoglobulin of claim 22. 43. Počítač, vyznačujúci sa tým, že je programovaný pre trojrozmerné zobrazovanie humanizovaného imunoglobulínu podlá nároku 22 na monitore alebo tlačiarni.43. A computer characterized in that it is programmed for the three-dimensional imaging of the humanized immunoglobulin of claim 22 on a monitor or printer. 44. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje humanizovanú protilátku podlá nároku 35 a farmaceutický i>v44. A pharmaceutical composition comprising the humanized antibody of claim 35 and the pharmaceutical composition - 112 prijatéIný nosič.112 received carrier. 45. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje humanizovanú protilátku podlá nároku 22 a farmaceutický prijatelný nosič.45. A pharmaceutical composition comprising the humanized antibody of claim 22 and a pharmaceutically acceptable carrier. 46. Farmaceutický prípravok podlá nároku 45, vyznačujúci sa tým, že humanizovaným imunoglobulinom je fragment Fab.46. The pharmaceutical composition of claim 45, wherein the humanized immunoglobulin is a Fab fragment. 47. Spôsob detekcie P-selektínu, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:47. A method for detecting P-selectin comprising: podávanie humanizovaného imunoglobulínu podlá nároku 35 pacientovi alebo jeho tkanivovej vzorke a detekciu komplexov vytvorených špecifickou väzbou medzi imunoglobulínom a P-selektínom prítomným v cielovej vzorke.administering the humanized immunoglobulin of claim 35 to a patient or a tissue sample thereof, and detecting complexes formed by specific binding between the immunoglobulin and P-selectin present in the target sample. 48. Spôsob inhibície adhézie leukocytu k endoteliálnej bunke alebo doštičke, vyznačujúci sa tým, že sa podáva terapeuticky účinné množstvo farmaceutického prípravku podlá nároku 45.48. A method of inhibiting leukocyte adhesion to an endothelial cell or platelet comprising administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition according to claim 45. 49. Spôsob liečenia pacienta s ochorením imunitného systému, vyznačujúci sa tým, že sa pacientovi podáva terapeuticky účinné množstvo farmaceutického prípravku podlá nároku 45.49. A method of treating a patient with a disease of the immune system, comprising administering to the patient a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of claim 45. 50. Spôsob podlá nároku 49, vyznačujúci sa tým, že ochorenie je dôsledkom akútneho poškodenia plúc.50. The method of claim 49, wherein the disease is due to acute lung injury. - 113 Τ'(/ 4b 99 - 95~- 113 Τ '(/ 4b 99-95 ~) 51. Spôsob podľa nároku 49, vyznačujúci sa tým, že ochorením je poškodenie ischémiou-reperfúziou.51. The method of claim 49, wherein the disease is ischemia-reperfusion injury. 52. Spôsob podľa nároku 51, vyznačujúci sa tým, že sa jedná o pacienta s epidermálnou, myokardiálnou, renálnou, cerebrálnou, splenickou, hepatickou, spinálnou, splanchnickou, pulmonárnou, čiastočnou telesnou alebo celkovou telesnou ischémiou.52. The method of claim 51, wherein the patient is epidermal, myocardial, renal, cerebral, splenic, hepatic, spinal, splanchnic, pulmonary, partial or total body ischemia. 53. Spôsob liečenia pacienta s chorobným stavom imunitného systému, vyznačujúci sa tým, že sa pacientovi podáva terapeuticky účinné množstvo farmaceutického prípravku podľa nároku 45.53. A method of treating a patient with a disease state of the immune system, comprising administering to the patient a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition of claim 45. 54. Stabilná bunková línia zahrnujúca:54. A stable cell line comprising: segment nukleovej kyseliny kódujúci ťažký reťazec humanizovaného imunoglobulínu podľa nároku 35, pričom je tento segment operatívne viazaný k promótoru na umožnenie expresie ťažkého reťazca, druhý segment nukleovej kyseliny kódujúci ľahký reťazec humanizovaného imunoglobulínu podľa nároku 35, pričom je tento druhý segment operatívne viazaný k druhému promótoru na umožnenie expresie ľahkého reťazca, pričom táto stabilná bunková línia je schopná produkovať humanizovaný imunoglobulín podľa nároku 35.a nucleic acid segment encoding a humanized immunoglobulin heavy chain according to claim 35, wherein said segment is operably linked to a promoter to allow expression of the heavy chain, a second nucleic acid segment encoding a humanized immunoglobulin light chain according to claim 35, wherein said second segment is operably linked to a second promoter allowing expression of the light chain, wherein the stable cell line is capable of producing the humanized immunoglobulin of claim 35. 55. Bunková línia podľa nároku 54, ktorá je schopná produkovať asi 30 yg humanizovaného imunoglobulínu/10⁶ buniek/deň.The cell line of claim 54, which is capable of producing about 30 µg of humanized immunoglobulin / 10 ⁶ cells / day. 56. Bunková línia podľa nároku 55 s označením CHO-48B4, ulo- 114 fa q?-96 žená ako ATCC CRL 11596.56. The cell line of claim 55 designated CHO-48B4, deposited 114 [deg.] Qq -96, as ATCC CRL 11596. 57. Čistený polypeptid P-selektín s až 100 aminokyselinami, pričom týchto až 100 aminokyselín zahrnuje päť po sebe idúcich aminokyselín z úseku medzi polohami 448 až 467 sekvencie aminokyselín, znázornenej na obr. 34 (SEQ. ID. No. ).57. A purified P-selectin polypeptide of up to 100 amino acids, wherein up to 100 amino acids comprise five contiguous amino acids from the region between positions 448 to 467 of the amino acid sequence shown in FIG. 34 (SEQ. ID. No.). 58. čistený polypeptid podlá nároku 57, kde až 100 aminokyselín zahrnuje súvislý segment aminokyselín medzi polohami 448 až 467 sekvencie aminokyselín, znázornenej na obr. 34 (SEQ. ID. No. ).The purified polypeptide of claim 57, wherein up to 100 amino acids comprise a contiguous segment of amino acids between positions 448 to 467 of the amino acid sequence shown in FIG. 34 (SEQ. ID. No.). 59. Čistený polypeptid podlá nároku 58, tvorený v podstate súvislým segmentom aminokyselín medzi polohami 448 až 467 sekvencie aminokyselín, znázornenej na obr. 34 (SEQ. ID. No. ).The purified polypeptide of claim 58, consisting of a substantially contiguous segment of amino acids between positions 448 to 467 of the amino acid sequence shown in FIG. 34 (SEQ. ID. No.).