SK130194A3 - Protein complexes with the efficiency of factor viii:c and process for their production - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka proteínových komplexov s účinnosťou faktoru VIII:C a spôsobov výroby zmienených komplexov expresiou vhodných polynukleotidových štruktúr. Proteínové komplexy sú vhodné na liečenie klasickej hemofílie (typ A).

Doterajší stav techniky

Hemofília A je dedičná choroba, spojená s X-chromozómami, ktorá postihuje jedného až dvoch jedincov z 10 000. Choroba je spôsobená neprítomnosťou deficitného faktoru VIII:C. Je to vysokomolekulárny glykoproteín (prirodzená M_r = 330 K - 360 K), ktorý je prítomný v plazme v mimoriadne nízkych koncentráciách. Ale je to nevyhnutný prvok v proteolytickej kaskáde, ktorý prevádza rozpustný fibrinogén na nerozpustný fibrín, tvoriaci chuchvalce, ktoré bránia strate krvi z traumatizovaného tkaniva. V krvnom obehu je v nekovalentnej väzbe s faktorom VIII:C (tzv. Willebrandov faktor), ktorý je stabilizujúcim proteínovým nosičom. Faktor VIII:C sa velmi lahko štiepi trombínom, plazmínom, proteázou C a dalšími serínovými proteázami. Zvyčajne sa izoluje z plazmy alebo plazmových produktov vo forme príbuzných polypeptidov s M_r v rozsahu 160 K až 40 K; v tejto sérii prevažuje species s M_r 92 K a M_r 80 K-77 K. Toto komplexné rozloženie je príčinou toho, že analyzovanie štruktúry účinného faktoru VIII:C je velmi nelahké.

Faktor VIII:C a príbuzné polypeptidy popísal F. Rotblat a spol., Biochemistry 24, 4294 - 4300 (1985), G. A. Vehar a spol., Náture 312, 337 - 342 (1984), Tooleet J. J. a spol., Náture 312, 342 - 347 (1984) a Truett a spolDNA 4, 333 - 349 (1985), ďalej Orr E. a spol., Molecular Genetics of Clotting Factors, str. 54, s321, kde sa poukazuje na jeho väznú úlohu ťažko glykozylovaných oblastí faktoru VIII:C. Sekvenciu popísali

J. J. Toole a spol., W. I. Wood a spol., Náture 312, 330 - 336 (1984) a M. A. Truett a spol., neuvedené citácie pozri vyššie. Proteín vo svojej celej dĺžke obsahuje trikrát opakovanú sekvenciu (I) a dvakrát opakovanú druhú sekvenciu (III). Tretia, silne glykozylovaná sekvencia (II) je vsunutá medzi druhou sekvenciou a tretím opakovaním sekvencie 'í a zrejme sa proteolyticky štiepi za vzniku M_r 92 K a M_r 80 K polypeptidov. Prvé dva opakované sledy I tvoria oblasť A, zatiaľ čo tretí sled I a obidva sledy III tvoria oblasť C. Sekvencia II tvorí oblasť

B. Takže proteín v celej svojej dĺžke má štruktúru:

1^^-13-11-13-1113^-1113 (A-B-C), zatiaľ čo polypeptidy o M_r 92 K a M_r 80 K (A a C) majú štruktúry I-j^-Ij a 13-1113-1113 v tom-ktorom prípade, pozri C. Fulcher a spol., J. Clin. Invest. 76, 117 - 124 (1985). Tí predpokladajú, že na podklade údajov antilátka - epitop a faktor VIII:C sú polypeptidy ako M_r 92 K, tak i M_r 80 K nevyhnutné pre funkciu faktora VIII:C.

Historicky vzaté bol faktor VIII:C izolovaný z krvi v koncentrovanej forme pre terapeutickú liečbu hemofílie. Ale s prihliadnutím na prenos HIV a ďalších chorôb v spojitosti s krvou boli stimulované snahy získať iné zdroje faktoru VIII:C. Je tu teda mimoriadny záujem získať kompozície s účinnosťou faktoru VIII:C bez možnosti prenosov vírových ochorení v spojitosti s prírodným faktorom VIII:C.

Hoci sa podarilo vyrobiť rekombinantný ľudský faktor VIII:C v jeho plnej dĺžke, dá sa neíahko čistiť a charakterizovať a v dôsledku proteolýzy je nestály. Účinná rekombinantná výroba či príprava tejto molekuly v jej plnej dĺžke pre klinické použitie je v tejto chvíli pochybná.

R. L. Búrke a spol., J. Biol.

(1986) popísali expresiu komplexu z buniek súčasne uvádzaných do

Chem. 261, 12574 - 12578 aktívneho faktora VIII:C s polynukleotidmi so zakódovanými polypeptidmi styku a M.

M_r 92 K

K. Ukázalo sa, že získaný proteín má účinnosť rovnú, ako klonovaný faktor VIII:C v plnej dĺžke, získaný za podobných podmienok. 0. Nordfang

- 3 a spol., J. Biol. Chem. 263, 1115 - 1118 (1988) popísali sústavu účinného faktora VIII:C in vitro z oddelených prípravkov o M_r 92 K a M_r 80 K proteínov (FVIII-HC ä LC), v tom-ktorom prípade. Úspešná zostava vyžaduje ióny dvojmocného kovu (obzvlášť mangánu a vápnika) a tioly, ale len malé množstvo FVIII-HC sa môže komplexne voviazať do účinného FVIII:C.

Podstata vynálezu

Našli sme teraz zlepšený spôsob pre expresiu rekombinantných proteínových komplexov a vysokou stálosťou a účinnosťou faktoru VIII:C. Polypeptid M_r 92 K (FVIII-HC) a M_r 80 K polypeptid (FVIII-LC) sú vyjadrené ako dva oddelené polypeptidy, to s kontrolou oddelených promótorov a v tej istej hostiteískej bunke. Každý z polypeptidov je s výhodou zapojený využitím signálnej sekvencie, ktorá ovláda jeho export do extracelulárneho priestoru so štiepením signálnej sekvencie. Podía prvého aspektu tohto vynálezu môže byť FVIII-HC charakterizovaný ako zložený proteín s predĺžením na C-konci. Toto predĺženie zahrňuje polypeptidovú sekvenciu homológnu k oblasti B N-koncovej sekvencie (čo môže tiež umožniť odštiepenie trombínom) polypeptidovú vložku s 3 až 100 aminokyselinami a sekvenciu homológnu k C-koncovke sekvencie B oblasti. K C-koncovému predĺženiu FVIII-HC dochádza vo vysokom výťažku aktívneho polypeptidu expresiou v eukaryotických bunkách hostiteía. Podía druhého predmetu tohto vynálezu môže dôjsť k expresii FVIII-HC bez akéhokoľvek C-koncového predĺženia, teda v autentickej forme so zodpovedajúcou C-koncovkou a v takom prípade sa možno vyhnúť neskoršiemu štiepeniu trombínom spojeného s rizikom ďalšej degradácie. FVIII-LC je s výhodou charakterizovaný ako LC-polypeptid s využitím signálneho peptidu. Polypeptid FVIII-LC vniká a vylučuje sa účinne so správnym N-koncovým aminokyselinovým zvyškom a správnou glykozyláciou. Kotransfekciou s polynukleotidmi so zakódovaním FVIII-HC a FVIII-LC vo vhodnej hostiteľskej bunke vznikajú rekombinantné proteínové komplexy s účinnosťou faktora VIII:C, a to vo vysokom výťažku.

Výraz polynukleotid, ako sa tu používa, sa vzťahuje na sekvenciu DNA alebo RNA, ktorý môže byt v jednoduchom alebo dvojitom reťazci (ss alebo ds, single či double) alebo ako heteroduplex DNA - RNA. Tu v najväčšom počte prípadov ide o polynukleotid s dvojitým reťazcom.

Výraz signálny peptid, ako sa tu používa, sa vzťahuje na peptidovú sekvenciu, ktorá je známa a reaguje na signál peptidázy počas expresie polypeptidu. Signálne peptidy zakódovávajú peptidové miesta pre signálne peptidázové štiepenie a spôsobujú prenos pripojeného polypeptidu do sekrečnej cesty vedúcej do extracelulárneho prostredia.

Výraz oblasť A sa týka tej časti ľudského faktoru VIII:C, ktorý predstavuje M_r 92 K proteínovú podjednotku. Oblasť A obsahuje od asi 740 do asi 760 aminokyselín a ako bolo zistené, je N-koncovkou natívneho ľudského faktoru VIII:C. Polypeptidová A oblasť bude siahať do aminokyseliny 10, zvyčajne aminokyseliny č. 1 po najmenej asi 620 aminokyselín, zvyčajne najmenej asi 675 aminokyselín, ale spravidla najmenej asi 740 aminokyselín. Polypeptid bude zahrňovať najmenej asi a spol., pozri vyššie) zvyčajne najmenej

100 % a môže prípadne zahrňovať časť N-koncovky oblasti B, typicky neprevyšujúcej asi 1 405 aminokyselín. Obzvlášť zaujímavý je N-koncový reťazec, obsahujúci celú sekvenciu trombolytickej štiepnej strany Arg₇₄₀-Ser₇₄₁.

Výraz oblasť B sa vzťahuje k tej časti natívneho ludského faktoru VIII:C, ktorý sa zvyčajne odštiepi intracelulárnym štiepením a ktorá je ťažko glykozylovaná za expresie v cicavčích bunkách ako COS7 a CHO. Oblasť B obsahuje N-koncovú sekvenciu, ktorá dovoľuje odštiepenie A oblasti od B oblasti trombínom. Oblasť B obsahuje tiež C-koncové procesné miesto dovoľujúce odštiepenie oblasti C od pôvodnej časti A-B enzýmom, obsiahnutým v Golgiho časti cicavčej bunky. Sekvencie N-koncových a C-koncových sledov sú uvedené v nasledujúcich príkladoch ďalej. Komplexy podľa tohto vynálezu s chýbajúcou podstatnou časťou oblasti B nemajú v podstate celú oblasť B s výnimkou N-koncových a C-koncových sekvencií.

Výraz oblasť C sa vzťahuje k tej časti natívneho ludského faktoru VIII:C, ktorá predstavuje C-koncovku plnej dĺžky proteínu % z oblasti A (Wood asi 90 %, s výhodou asi a štiepi sa intracelulárne za vzniku ľahkého reťazca faktoru VIII:C. Éahký reťazec bude mať sekvenciu aminokyselín v podstate tu istú, ako je sekvencia aminokyselín C-koncovky polypeptidového faktoru VIII:C, asi z 90 od aminokyseliny 1 570, zvyčajne najmenej z asi reťazca M_r 80 K faktoru VIII:C zvyčajne 1 600, %, zvyčajne najmenej spravidla so začiatkom obzvlášť potom 1 625, celkom obzvlášť 1 640 a s výhodou 1 649 ± 10 aminokyselín, lepšie ± 1 aminokyselín s pokračovaním najmenej k aminokyseline 2 300, bežne 2 310 ± 10 aminokyselín, s výhodou 2 325 ± 5 aminokyselín, najvýhodnejšie ku koncovej aminokyseline (2 332). Zvyčajne bude mať ľahký reťazec najmenej asi 85 %, bežnejšie najmenej 95 %,z oblastí C1-C2, vhodne oblastí A3-C1-C2.

Výraz koexpresia, ako sa tu používa, sa vzťahuje k súčasnej expresii polypeptidu oblasti A a polypeptidu oblasti C v tej istej hostiteľskej bunke. Polynukleotidové sekvencie zakódujúce oblasti A a C môžu byt na tých istých alebo rôznych expresiách kazetiek, či plazmidov. Koexpresia oblastí A a C dovoľuje správne zloženie, čo ďalej zaisťuje vznik komplexu A-C s vyššou účinnosťou a výkonnosťou sekrécie.

Výraz bunečné rastové prostredie, ako sa tu používa, sa vzťahuje ku ktorémukoľvek prostrediu, ktoré sa hodí pre kultivovanie hostiteľských buniek a zahrňuje prostredie vhodné na dosiahnutie expresie rekombinantných produktov, či už dôjde ku skutočnému bunečnému rastu alebo nie.

zvyčajne obsahujú rastové látky a energie vo vodnom roztoku. Ak je bunečné prostredia môžu tiež obsahovať látku, ktorá indukuje expresiu rekombinantných polypeptidov podľa tohto vynálezu. Voľba takejto indukujúcej zlúčeniny závisí na promótore, ktorý bol zvolený pre kontrolu expresie. Medzi typické prísady patria selekčné látky (t.j. lieky či ďalšie chemické zlúčeniny, ktoré sa pridávajú do prostredia na zaistenie toho, že iba transformované hostiteľské bunky prežijú v prostredí) a ďalej potom sérum, ako je plodové hovädzie sérum. Prostredím bez séra sa označuje roztok, ktorý bol doplnený tak, že nevyhnutné stopové faktory, obsiahnuté bežne v sére, nie je potrebné pridávať vo forme séra. Kvôli obchodným účelom je známych veľa vhodných rastových

Bunečné rastové prostredia zdroje metabolizovatelnej to žiaduce, potom rastové bunečných prostredí.

Výraz polypeptidový článok sa týka polypeptidovej sekvencie s asi 3 až 100 aminokyselinami, ktoré zvyčajne nie je homológny k oblasti B ludského faktoru VIII:C a ktorý obsahuje menej ako 5 potenciálnych miest glykozylovania na dusíku. S výhodou sú takéto miesta 2 alebo i menej. V tomto čase sa má za to, že podstatná veľkosť a vysoký stupeň glykozylovania v oblasti B predchádza účinnej expresii polypeptidu M_r 92 K. Tiež sa má za to, že oblasť A nemusí byt skladaná správne v súlade s neprítomnosťou oblasti B a že iba malé percento oblasti A je preložené správne s expresiou vhodnou.

Polypeptidový článok podlá prvého aspektu tohto vynálezu predstavuje C-koncové predĺženie oblasti A a zrejme stabilizuje polypeptid a zvyšuje jeho sekréciu v aktívnej forme. Takže sa môže stať, že použitie polypeptidu, ktorý je len lahko glykozylovaný, prípadne vôbec nie, znemožní konštrukciu článku v oblasti A s tým, že sa narazí na rovnaké problémy z hladiska velkosti, znemožňujúce expresiu faktoru VIII:C v plnej dĺžke. Článok, ktorý je v súčasnej dobe pokladaný za výhodný, sa odvodzuje od závesného ludského ťažkého reťazca Ig, obzvlášť potom ludského IgAl. Tento článok predstavuje flexibilné predĺženie bez pridania imunogénneho epitopu (pri podávaní ľudom). Podľa druhého predmetu tohto vynálezu možno dosiahnuť velmi vysokú a použiteľnú koagulačnú účinnosť za ko-expresie polypeptidu M_r 92 K, kedy je oblast B celkom odstránená spolu s reťazcom M_r 80 K.

Výraz homológia ako sa tu používa, znamená totožnosť alebo podstatnú podobu dvoch polynukleotidov alebo dvoch polypeptidov. Homológia sa určuje na podklade sekvencie nukleotidu alebó sekvencie aminokyselín v polynukleotide či polypeptide. Všeobecne povedané, zvyčajne sa najviac 10, ale spravidla najviac 5 hmotnostných percent a najvýhodnejšie najviac asi 1 hmotnostné percento aminokyselín v reťazci odlišuje od aminokyselín, ako sú prítomné v prírodných oblastiach A a C faktoru VIII:C. Obzvlášť potom najviac asi 5 %, bežnejšie najviac asi 1 % bude predstavovať nedôslednú substitúciu, pričom dôslednú substitúciu predstavujú:

Gly.....Ala

Via... íle ., Asp ... Glu

Leu

Lys ... Arg

Asn ... Gin, a

Phe ... Trp ... Tyr.

Nedôslednými zmenami sú zvyčajne substitúcie jednej či viacerých z vyššie uvedených aminokyselín aminokyselinou inej skupiny (napr. náhradou Asn za Glu) alebo substitúciou Cys, Met, His, alebo Pro za akúkoľvek z vyššie uvedených aminokyselín.

Výraz dostatočné množstvo proteínového komplexu podľa tohto vynálezu sa týka takého množstva proteínu, ktorý je dostatočný na vykonanie účinného ošetrenia jedinca, ktorý je postihnutý ťažkosťami, ktoré možno zvládnuť použitím prírodného ľudského faktora VIII:C. Všeobecne je proteínový komplex podľa tohto vynálezu v podstate tak účinný ako prírodný ľudský faktor VIII:C a môže sa podávať v podobných množstvách. Špecifická účinnosť proteínového komplexu podľa tohto vynálezu sa dá stanoviť postupmi, ako sú v tomto odbore známe a popisované i d’alej , napr. použitím bežne dostupného Coatestového zistenia.

Výraz účinná koncentrácia sa vzťahuje ku koncentrácii expresnej kazetky, ktorá je schopná transformovať hostiteľskú bunku za vhodných transformačných podmienok.

Štruktúrne zložky typu DNA sa bežne používajú na expresiu polypeptidov podľa tohto vynálezu. Každá zo štruktúr polynukleotidu bude mať v smere 5'-3'-transkripcie oblasť transkripčnej iniciácie a translačnej iniciácie, oblasť štruktúrneho génového kódovania zahrňujúceho kódovaciu sekvenciu pre sekvenciu signálneho peptidu a kódovaciu sekvenciu pre ťažké i ľahké reťazce faktoru VIII:C s nasledujúcimi sekvenciami translačného a transkripčného zakončenia. Voľba špecifických súčastí, ako sú tieto, spadá do oblasti skúseného v tomto odbore.

Iniciačná oblasť môže zahrňovať určitý počet rôznych sekvencii vo vzťahu k iniciácii transkripcie alebo translácie. Tieto sekvencie zahrňujú podporné sekvencie, miesta pre väzbu RNA-polymerázy, miesta na zachytenie RNA, ribozomálne väzné miesta, translačné iniciačné miesta a pod. Oblasťou transkripčnej iniciácie môže byť prírodná oblasť v spojitosti s faktorom

VIII:C, alebo to môže byt iná alternatívna sekvencia na zaistenie vyššej účinnosti transkripcie. Sekvencie možno získať z cicavčích vírov alebo génov hostiteľskej bunky alebo génov z rôznych cicavčích buniek, ktoré sú účinné v hostiteľskej bunke. Boli izolované mnohé transkripčné iniciačné oblasti s dôkazom, že sú účinné v cicavčích hostiteľských bunkách. Tieto oblasti zahrňujú oblasti skorého promótora SV 40 a neskorého promótora, oblasť adenovírového neskorého promótora, oblasť aktínového promótora, oblasť cytomegalovírového M_r 72 K bezprostredne skorého proteínového promótora, kovovo - tioneínového promótora a pod.

Koncová oblasť môže zahŕňať 3'-neprenosné sekvencie, polyadenylačné signálne sekvencie a pod. Koncovú oblasť možno získať z 3'-neprenosnej sekvencie faktoru VIII:C prírodnej cDNA, alebo môže byť z toho istého štruktúrneho génu či iného štruktúrneho génu, z ktorého bola získaná 5'-počiatočná oblasť. Táto 3'-oblasť nie je tak podstatná a závažná pre hladinu transkripcie, ako iniciačná oblasť, takže jej voľba je skôr predmetom vhodnosti ako špecifickej voľby.

Štruktúrne gény typicky zahrňujú vedúcu sekvenciu kódovania pre signálny peptidový signál, ktorý usmerňuje polypeptid do miesta endoplazrnového retikula pre ďalšie spracovanie a vyzretie. Zahrnuté môžu byť prípadne ďalšie sekvencie zakódovávajúce propeptidy, ktoré sú spracovávané posttranslačne endopeptidázami, kde endopeptidázy štiepia peptidovú väzbu, odstraňujú propeptid a generujú vhodný konečný polypeptid. Signálnym peptidom môže byť niektorý z prírodných, obzvlášť v prípade N-koncového peptidu, alebo to môže byt ktorýkoľvek signálny peptid, vhodný pre spracovanie a vyzretie polypeptidov.

Literatúra sa zmieňuje o rôznych signálnych peptidoch so zahrnutím takých sekvencií, ako je aktivátor tkanivového plazminogénu, ťažké a ľahké imunoglobulínové reťazce, vírové membránové glykoproteíny ako sú glykoproteín GB a GD víru oparu jednoduchého (Herpes Simplex), a₁~antitrypzín a pod. V súčasnej dobe sa dáva prednosť α-j^-antitrypzínu ako signálnemu peptidu pre sekréciu polypeptidu FVIII-LC so zreteľom na vysokú hladinu expresie peptidu so správnou N-koncovkou.

DNA - sekvencia, kódujúca vyzretý proteín a signálny peptid musia byť spojené tak, aby vytvorili čitateľný rámec. Ak sú tu dostupné vhodné obmedzovacie miesta, potom sa môžu vhodne napojiť kohézne alebo tupé konce. Avšak v najväčšom počte prípadov sa použijú adaptory, keď sa časti kódovacej sekvencie tvoria v syntetickom adaptore tak, že skrátený štruktúrny gén a/alebo skrátená signálna sekvencia bude viazaná adaptorom tak, aby bola v správne čitateľnom rámci. Signálne sekvencie a štruktúrny gén môžu byť s čiastočným obmedzením zmapované, takže možno identifikovať reštrikčné miesta, obzvlášť potom tie jednotlivé reštrikčné miesta, ktoré sa dajú využiť na spojenie dvoch sekvencií dokopy do vhodného čitateľného rámca s použitím vhodného adaptoru. Inak jednotlivé reštrikčné miesta sa môžu vsunúť v mieste spojenia signálnej sekvencie a kódovacej sekvencie vyzretého polypeptidu mutagenézou in vitro.

Translačný štart a stop-signály budú normálne častou zaistením pre iniciačný kód začiatku či viacerých stop-kódov na zakončenie kódy budú prvými kódmi signálnych ak je to vhodné - ako časť štruktúrneho génu so translácie a jedného translácie. Iniciačné zakódovávajúca jeden translačnou kontrolou sekvencií. Stop-kódy sa môžu pridať koncovej oblasti, alebo sa pridajú do kódovacej oblasti na zaistenie vhodnej 3'-koncovky kvôli väzbe transkripčnej koncovej oblasti tak, že vznikne kompletná koncová oblasť.

Rôzne oblasti expresnej kazetky (transkripčná a translačná iniciačná oblasť sekvencie nukleovej kyseliny, sekvencia štruktúrneho génu nukleovej kyseliny z polypeptidov a pod transkripčnou i iniciačnej oblasti a transkripčná i translačná koncová oblasť, kontrolujúca vývoj mRNA a translačné ukončovanie), ktoré identifikujú príslušné nukleotidové sekvencie, možno spojiť využitím vhodných postupov. Zvyčajne budú získané sekvencie obsahovať, alebo sa môžu modifikovať tak, že obsahujú reštrikčné miesta, ktoré možno spojiť, pokiaľ by tam boli vyhovujúce výčnelky alebo kohézne konce. Modifikovanie sa zvyčajne vykoná v nekódovacích oblastiach kohéznej koncovky. Konce budú zvyčajne spojené pred zavádzaním do hostiteľskej bunky, hoci možno umožnia hostiteľskej bunke, aby zaistila nevyhnutné prepojenie a väzbu.

Expresné kazetky možno prepojiť veľkým množstvom ďalších sekvencii pre ten alebo iný účel. Ak je žiaduce zvýšenie množstva vylučovaného proteínu, môžu sa expresné kazetky pre FVIII:C spojit v tandeme do génu, a vhodnou úpravou sa dá zvolit spontánny vzostup počtu opakovacích génov. Takéto gény zahrňujú ľudský kovovo - tioneínový gén a myší dihydrofolátový reduktázový gén. Tieto gény sa vnesú do kazetiek s tým, že majú svoje vlastné transkripčné a translačné regulačné sekvencie. Voľbou bunečných klonov, rezistentných pri vzrastajúcich koncentráciách iónov ťažkých kovov (napríklad kadmia) alebo metotrexatu sa môžu zaujímavé gény (expresné kazetky) znásobovať v hostiteľskej bunke.

Predmetné expresné kazsetky môžu byt častou vektoru, zahrňujúceho replikačný systém funkčný v hostiteľskej bunke a tento replikačný systém môže prispieť k stabilnej epizomálnej údržbe alebo integrácii expresnej kazetky do genómu hostiteľa. Vektor bude tiež obsahovať receptor pre selekciu, teda na určenie hostiteľských buniek obsahujúcich štruktúru DNA a vektor, ktorého pôsobením hostiteľské bunky stratia štruktúru DNA i vektora.

Je dostupný veľký výber a počet replikačných sústav, zvyčajne odvodených od vírov, ktoré infikujú ludské hostiteľské bunky. Ako príkladné replikačné sústavy možno uviesť systém zo Simian - vírusu 40, adenovírus, vírus z hovädzích papillónov, polyoma vírus, vírus Epsten Barr a pod.

Selekčné receptory, umožňujúce propagáciu vektoru v prokaryotickej hostiteľskej bunke sa môžu vyznačovať rezistenciou k biocídom, hlavne voči antibiotikám alebo doplnením auxotrofie kvôli zaisteniu prototrófneho hostiteľa. Obzvlášť zaujímavé gény ako receptory zahrňujú gény rezistentné na kanamycín (NPTII), na amfenikol (CAT), penicilinázu (β-laktamázu) a pod.

Vektor bude zvyčajne cirkulárny a bude obsahovať jedno či viac reštrikčných miest, ktoré dovolia vsunutie expresnej kazetký, postupne alebo naraz do vektoru. Často bude vektor tiež obsahovať systém bakteriálnej replikácie a selekcie, dovoľujúci klonovanie po každom z manipulačných stupňov. Týmto spôsobom možno pripraviť pomerne veľké množstvo štruktúr v každom zo stupňov s možnou izoláciou, čistením a testovaním na overenie, že

- 11 prišlo k správnemu spojeniu s možnosťou použitia v ďalšom stupni.

Môžu sa použiť početné hostitelské cicavčie bunky, kde sú funkčné regulačné sekvencie a replikačný systém. Medzi takéto bunky patrí COS7, bunky z vaječníka čínskeho škrečka (CHO), bunky z myších obličiek, bunky z obličiek škrečka, bunky HeLa, HepG2 a pod.

Expresné kazetky očakávaných polypeptidov sa môžu spojiť dohromady do jedného reťazca nukleovej kyseliny alebo môžu byť v molekulách rôznych nukleových kyselín. Expresné kazetky môžu byt častou rôznych vektorov alebo toho istého vektora. To je v prvom rade otázka vhodnosti, hoci v niektorých situáciách so špeciálnymi vektormi môže byť ten či onen postup vytvárania štruktúry výhodný.

-¹ 12

Príklady vyhotovenia vynálezu

Príklad 1

Prípravy vytváracích plazmidov (A) pSV7d

Vytváracie kazetky sa pripravujú s použitím vektoru ludských vyjadrovacích buniek pSV7d (2423 bp) .

Plazmid pSV7d (pozri Truett a spol., citácia prv) sa konštruuje takto: z pSVgtl (pozri Paul Berg, Stanford University, Kalifornia) sa oddelí 400 pb BamHI/HindlII-fragment, obsahujúci originálny alebo replikáciou SV40 a pôvodný promótor; ten sa čistí. Fragment 240 bp SV40 BcII/BamHI, obsahujúci adičné miesto SV40 polyA, sa oddelí z pSV2/DHFR (pozri Subramani a spol., Molec. and Celí Biol., 1, 854 - 864 (1981)) a fragmenty sa spoja spolu nasledujúcou väzbou:

Stop-kódy 12 3

5'-AGCTAGATCTCCCGGGTCTAGATAAGTAAT-3' TCTAGAGGGCCCAGATCTATTCATTACTAG

HindlII BglII Smal Xbal Bell previs

Tento väzobný útvar obsahuje 5 reštrikčných miest, ako i stop kódy na všetkých troch čítacích obrazcoch. Vzniknutý fragment 670 bp, obsahujúci základ SV40 replikácie, skorý promótor SV40, polyväzobný útvar so stop kódmi a polyadenylovacie miesto SV40 bol klonovaný do miesta BamHI, patriaceho pML, teda derivát pBR322 so zdržaním asi 1,5 Kb (pozri Lusky a Botchen, Celí 36, 391 (1984)), čím sa získa pSV6. Miesta EcoRI a EcoRV v sekvenciách pML v pSV6 sa eliminujú digesciou s EcoRI a EcoRV, pôsobením nukleázy Bal31 sa odstráni asi 200 bp z každého konca a potom sa religovaním získa pSV7a. Resekcia Bal31 tiež odstráni jedno reštrikčné miesto BamHI na bloku oblasti SV40, približne 200 bp od miesta EcoRV. Na eliminovanie druhého miesta BamHI na boku oblasti SV40 sa digeruje pSV7a s Hrul, čím dôjde k prerušeniu pML sekvencie smerom nahor od oblasti replikácie. Po recirkulácii otupením a spojením vznikne pSV7b.

pSV7c a pSV7d predstavujú následné polyväzobné náhrady. Najprv sa pSV7b digeruje s Stul a Xbal, načo sa ďalšia väzobná jednotka voviaže do vektora za vzniku pSV7c:

BglII EcoRI Smal KpnI Kbal

5'-AGATCTCGAATTCCCCGGGGGTACCT

TCTAGAGGTTAAGGGGCCCCCATGGAGATC

Potom sa pSV7c digeruje s BglII a Kbal, ďalej sa voviazanín ďalšej väzobnej jednotky získa pSV7d:

BglII EcoRI Smal Kbal BamHI Balí

I I I I I I

5'-GATCTCGAATTCCCCGGGTCTAGAGGATCCGTCGAC

AGCTTAAGGGGCCCAGATCTCCTAGGCACGTGGATC (B) PSVF8-92 pSVF8 je vytvárací plazmid pre reťazec M_r 92 K FVIII-HC. Vychádzajúc z miesta BamHI polyväzobného pSV7d, je pSVF8-92 zložený zo 49 bp syntetickej molekuly, prispôsobenej pre väzobné jednotky, a to od BamHI do Sací zakódujúcich nukleotidov -30 až +14 faktora VIII:C cDNA (číslovanie od prvej A translačného počiatočného miesta: sekvencia je znázornená dole na (D) 2267 bp Sací až HindlII-fragment z faktoru VIII:C DNA, obsiahnutej v pSVF8-200 podlá popisu ďalej (až k nukleotidu +2281) a pSV7d od HindlII k BamHI.

* Í4 (C) PSVF8-80 pSVF8-80 je vytvárací plazmid pre reťazec M_r 80 K FVIII-LC.· Vychádzajúc z miesta Sali polyväzobnej časti pSV7d, pozostáva pSVF8-80 z fragmentu 201 bp tkanivového plazminogénového aktivátora cDNA z nukleotidov -98 až +103 (relatívne k štartovaciemu kódu) so zakončením v mieste BglII (tPA sekvencia, ako ju uviedol S. J. F. Degan a spol., J. Biol. Chem. 261, 6972 - 6985, 1986), ďalej 29 bp syntetický BglII adapčný väzobný článok BglII na Bell, zakódovávajúce nukleotidy +5002 až 5031 faktora VIII:C viazaného na 2464 bp Bell fragment faktoru VIII:C, ktorý sa rozpína od miesta Bell, vytvoreného na nukleotide 5028 faktora VIII:C cDNA pôsobením mutagenézy in vitro (Zoller a Smith, Meth. Enzymol. 100, 468 (1983)) (pF8GM7) na stranu Bell v 3'-oblasti v nukleotide 7492 a 400 bg fragment tPA 3'-nezmenenej sekvencie, rozpínajúcej sa od miesta BglII k syntetickému miestu PstI, vzniknutému klonovaním cDNA, načo nasleduje polyväzobná časť z vektora M13mp9 (Vieira a Messing, Gena 19, 259 (1982)) a potom pSV7d.

(D) PSVF8-200

Vektor pSVF8-200 je vytvárací plazmid pre plnú dĺžku faktoru VIII:C cDNA. Plazmid pSVF8-200, ktorý popísal Truett a spol., pozri vyššie, ktorý obsahuje celý vektor VIII:C cDNA, jeho kód a 3'-nezmenené sekvencie s 5'-nezmenenými sekvenciami, ako boli popísané vyššie pre pSVF8-92, sa pripravuje takto.

Plazmid pSV7d sa digeruje s BamHI tak, aby sa oddelil v polyväzobnej oblasti smerom dole skorý promótor SV40. Následný 49 bp BamHI-SacI väzobný adaptér, ktorý kóduje naposledy 30 bp 5'-nezasiahnuté oblasti a prvý 15 pb kódujúci sekvencie ludského faktoru VIII:C, sa syntetizuje chemicky a naviaže sa na pSV7d.

	-35	-30	-25	-20	-15	-10	-5
5 '	GATCC	TCTCC	AGTTG	AACAT	TTGTA	GCAAT	AAGTG
3 '	BamHI G	AGAGG	TCAAV	TTGTA	AACAT	CGTTA	TTCAG
Met	Gin íle	Glu
ATG	CAA ATA	GAG CT 3'
TAC	GTT TAT	CSacI	5'

Tento viazaný plazmid sa potom digeruje s Sací tak, že sa odstráni nadbytok väzobných častí a pomocou Sali sa vytvorí Sali previs.

Fragment 1, ďalej 2,9 K Sací fragment z 5'-kódovacej oblasti ľudského faktoru VIII:C, obsahujúci pF8-102, ďalej fragment 2, teda 6,5 K Sacl-Sall fragment z pF8-6,5, ktorý obsahuje 3'-kódovaciu oblasť faktoru a modifikovaný pSV7d vektor, obsahujúci väzobný adaptér, sa viažu dohromady, pozri Truett a spol., prv uvedené. Táto väzobná zmes sa potom použije na transformáciu E. coli HB101 a vhodné kolónie sa oddelia a vyčlenia rezistenciou na ampicilín.

300 transformovaných buniek bolo oddelených filtračnou hybridizáciou kolónií s použitím adaptéru BamHI-SacI 5' alebo

2,9 Sací fragmentu ako sond. Takéto kolónie, ktoré boli pozitívne na obidve sondy, boli analyzované reštrikčným mapovaním.Týmto spôsobom sa získa plazmid pSVF8-200, ktorý obsahuje celú kódovaciu oblasť pre gén ľudského faktoru VIII:C a 5'-neprenesenú oblasť správne napojenú v transkripčnej orientácii na skorý SV40 promótor.

(E) Prenesenie a kultúra buniek COS7

Vyššie popísané plazmidy boli prenesené do buniek COS7, pozri Guzman, Celí 23, 175 (1981) s použitím postupu koprecipitácie s fosforečnanom vápenatým, pozri Van der Eb a Graham, Meth. Enzymol. 65, 828 - 839 (1980) v kombinácii s pôsobením difosfátu chlorochínu, pozri Luthman a Magnusson, Nucl. Acids Res. 11, 1295 - 1308 (1983)), to s použitím 50 ug plazmidu DNA na 5.10⁵ buniek počas 14 hodín. Bunky sa môžu tiež preniesť DEAE-dextránovou metódou, pozri Sompayrac a Danna, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7575 - 7578 (1981).

Bunky COS7 sa kultivujú v Eagleovom prostredí, modifikácia Dulbecco s pridaním 10 % plodového teľacieho séra, 100 U/ml penicilínu, 100 pg/mL streptomycínu, 292 gg/mL glutamínu a 110 μg/mL sodnej soli kyseliny pyrohroznovej. Vzorky možno získať z prostredia séra s ďalšími prísadami (48 hodín uchovávania), a to za 88 hodín po vykonanom prenose.

(F) Testy

V špecifických intervaloch po prenose sa prostredie oddelí od buniek, alikvotné podiely sa uskladnia pri -70 “C. Vzorky sa potom testujú na schopnosť znížiť predĺženú parciálnu tromboplastínovú dobu plazmy, deficitnú na faktor VIII:C s použitím štandardizovaného koagulačného testu, pozri Hardisty a spol., Thromb et Diathesis Haemolog. 72, 215 (1962). Špecifickejšia Coatestová skúška, pozri Ronen a spol., Thromb and Haemostasis 54, 818 - 823 (1985), ktorá meria generovanie aktivovaného faktora X (Xa) ako lineárnej funkcie koncentrácie exogénne dodaného faktoru VIII:C, bola použitá na overenie výsledkov koagulačného testu. Koncentrácia imunologický reaktívneho faktora VIII:C ako proteínu v prostredí bola stanovená použitím rádioimunotestu (RIA), orientovaného na zistenie polypeptidu M_r 92 K a testom s enzýmom, viazaným na imunosorbant (ELISA), špecifickým na polypeptid M_r 80 K, pozri Nordfang a spol., Thromb and Haemostasis 53, 346 (1985).

Ako je to zrejmé z tabulky 1, vyjadrenie polypeptidu M_r 92 K alebo polypeptidu M_r 80 K jednotlivo nie je spojené so zistitelnou účinnosťou, hoci v upravenom prostredí sú obidva jednotlivé proteíny vo vysokej koncentrácii. Ak ' sú bunky prenesené do styku s pSVF8-92 a pSVF8-80 plazmidmi, obsahujú prostredie asi 20 mU/mL koagulačnej účinnosti. K tej istej relatívnej hladine koagulačnej účinnosti sa dospeje s bunkami, prenesenými k plazmidu pSVF8-200 so zakódovaným kompletným faktorom VIII:C.

Pokial sa upravené prostredia po prenosoch (jednotlivo pSVF8-92 a pSVF8-80 zmiešajú dohromady (za použitia rôznych podmienok, ako je to zrejmé z tabulky 1), nemožno zistiť meratelnú účinnosť.

Tieto výsledky naznačujú, že komplex koncových aminoa karboxy-oblastí faktoru VIII:C si udržiava vnútornú koagulačnú účinnosť a že vnútorný priestor nie je podstatný pre účinnosť ani pre sústavu aktívneho komplexu z oddelených reťazcov.

Tabulka 1 Test účinnosti rekombinantného faktoru VIII:C v upravenom prostredí buniek COS7

Plazmid	Koagulácia	Účinnosť Coatest mU/mL	Test HC-RIA U/mL	Test LC-ELISA U/mL
Doba (sek)	Učinnost mU/mL
pSVF8-92	95.7	0.9	0.1	0.15	0.0002
PSVF8-80	97.2	0.9	0.1	0.01	1.36
PSVF8-92 +
PSVF8-20 a	56.1	22.5	20.4	0.05	1.13
PSVF8-200	47.7	70.0	43.2	0.12	0.28
žiadny	94.6	0.9	0.1	0.01	0.0002
pSVF8-92J +
pSVF8-80 b	95.7	0.9	0.1	—	—

^a plazmidy boli prenesené do rovnakých buniek

H ^D plazmidy boli prenesené do oddelených buniek a kvapalina nad bunkami zmiešaná 48 hodín neskôr.

Boli testované mnohé obmeny podmienok pri miešaní, počítajúc do toho predinkubovanie po určitý čas až do 2 hodín pri 37 C, 20 C alebo 4 °C za prítomnosti 10 mM chloridu vápenatého alebo bez tejto látky. Hodnoty uvedené v tejto tabuľke sú pokladané za príklad získaných údajov.

V tabulke 1 sa k údajom koagulačných dôb a účinností dospelo takto:

Alikvotné podiely po 75 μΐ prostredia, upraveného na rast buniek COS7 s prenesenými uvedenými plazmidmi boli testované na ich schopnosť znížiť predĺženú parciálnu tromboplastínovú dobu tvorby plazmy s nedostatkom faktoru VIII:C pri jednostupňovom teste. Krátko povedané: 75 μΐ, platelínu (General Diagnostics) sa inkubuje 3 minúty pri 37 ’C, potom sa pridá 75 μύ plazmy s nedostatkom faktoru VIII:C a 75 μύ testovanej vzorky na ďalšie inkubovanie po dobu ďalších 5 minút pri 37 C. Pridá sa 75 μΣ predhriateho 0,025 M roztoku chloridu vápenatého a doba zrážania sa meria v Decton-Dickinsonovom fibrometri. Ako štandard sa použije normálna ľudská plazma, zriedená v COS7 bunečnom prostredí. 1 mU účinnosti sa pokladá za zodpovedajúce asi 100 pg proteínu faktoru VIII:C, pozri Fay a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 7200 (1982).

V tabuľke 1 bol použitý Coatest - test (Kabi) na sledovanie generovania aktivovaného faktoru X (Xa) ako lineárnej funkcie koncentrácie faktoru VIII:C. Koncentrácia faktoru Ka sa meria proteolytickým štiepením chromogénu p-nitranilínu zo syntetického peptidového substrátu pre faktor Xa. Ako štandard sa použije normálna ľudská plazma, riedená v 50 mM Tris-hydrochloridu, pH

7,3, 0,2 % BSA.

Pre RIA test v tabuľke 1 sa nanesie čistený psí inhibičný faktor VIII:C IgG doštičky (96 jamiek) uhličitanu sodného, Doštičky sa premyjú mikrotitračnej v 0,1 M pufre noc pri 37 “C.

do jamiek polystyrénovej s koncentráciou 3,5 μg/mL pH 9,8 s inkubáciou cez trikrát 0,1 M roztokom chloridu sodného, ďalej 0,05 % roztokom Tween-u 20 s nasledujúcim inkubovaním so zmesou vzoriek testovaného prostredia a jódovaného proteínu FVIII:C M_r 92 K, v obidvoch prípadoch za riedenia 0,05 M roztokom

- 19 imidazolu, 0,1 M roztokom chloridu sodného, 1 % albumínu z hovädzieho séra, 0,05 % Tween-U 20, pH 7,3. Proteín FVIIIjC M_r 92 K bol izolovaný z plazmy a bol viac ako z 50 % homogénny, ako to bolo zistené postupom SDS-PAGE a vyfarbovaním striebrom. Po inkubovaní počas 16 hodín za teploty miestnosti sa doštičky umyjú a množstvo ¹²⁵I v jednotlivých jamkách sa zmeria gama - počítačom. Ako štandard sa použije prečistený obchodný prípravok Factor VIII:C (Factor VIII, NORDISK) so špecifickou aktivitou 0,5 jednotiek koagulačnej aktivity na mg. Tento štandard bol kalibrovaný oproti štandardu VIII:C The World Health Organization, Third International. Definovali sme náš prečistený štandard, že pomer M_r 92 K RIA/koagulačná aktivita faktoru VIII:C = 1.

Po vykonaní testu ELISA v inhibičný faktor VIII:C tabulke 1 sa vyčistený ludský IgG nanesie do jamiek polyvinylchloridovej mikrotitračnej doštičky (96 jamiek) za koncentrácie 4,5 μg/mL v 0,1 M roztoku uhličitanu sodného, pH 9,8, a všetko sa inkubuje cez noc pri teplote 37 C. Jamky sa premyjú ako vyššie a pridajú sa zlomky konjugovanej peroxidázy F(ab')₂ ludského inhibičného IgG za riedenia 0,1 M roztoku imidazolu, 0,15 M roztokom chloridu sodného, 1 % BSA a 0,05 % Tween-u 20 s pH 7,3. Všetko sa inkubuje 16 hodín za teploty miestnosti. Sfarbenie sa vyvolá roztokom o-fenyléndiamínu a ako štandard sa použije normálne ludské sérum.

Na overenie toho, že pozorovaná koagulačná aktivita je v súvislosti s faktorom VIII:C, sa stanoví citlivosť koagulácie na inhibovanie antilátkou špecifickou pre faktor VIII:C. Pred testom sa alikvotné podiely upraveného prostredia inkubujú po 2 hodiny pri 37 C za prítomnosti roztokov normálneho ludského séra alebo séra hemofilika, u ktorého došlo k vývoju vysokého titra inhibičných antilátok na faktor VIII:C. Ako jé zrejmé z tabulky 2, zredukuje sa špecificky inhibičným sérom aktivita celej molekuly, ako i komplexu M_r 92 K-80 K. K tým istým výsledkom sa dospelo pri použití troch rôznych inhibičných monoklonálnych antilátok s väzbou na M_r 80 K species. Inhibovanie účinnosti faktoru VIII:C s použitím inhibičného séra sa študuje takto: 160 μ!, už uvedeného prostredia, upraveného a s bunkami COS7 sa inkubuje spolu s 20 μΐ, stonásobného riedenia séra ludského faktoru VIII:C (titer Bethesda: 1500 jednotiek) alebo podobne riedeného normálneho ľudského séra alebo i samotného pufru (50 mM roztoku imidazolu, 0,1 M roztoku chloridu sodného, 100 μg/mL BSA s pH 7,3) po 2 hodiny pri 37 C. Tieto vzorky sa potom testujú postupom, ako je to popísané vyššie, na zvyšnú koagulačnú účinnosť.

Tabuľka 2

Test koagulačnej inhibície

Plazmid	Sérum	Koagulačná doba (sek.)
pSVF8-80 + pSVF8-92	normálne	51.9
	imúnne	74.5
	pufor	54.4
pSVF8-200	normálne	46.4
	imúnne	69.4
	pufor	46.8

Inhibičný pokus bol opakovaný s použitím monoklonálnych antilátok, a to takto: 100 μΐ, upraveného prostredia sa inkubuje na 2 hodiny pri 37 “C buď s 10 μΗ/μΙ roztoku monoklonálnej antilátky antifaktoru VIII:C z Hybritech (Bethesda titer: 14 000 jednotiek) alebo pufru a potom sa vykoná test, ako je to popísané vyššie. Výsledky sú zrejmé z tabuľky 3.

Tabuľka 3 Test koagulačného inhibovania

Plazmid	Sérum	Koagulačná doba (sek.)
pSVF8-92 + pSVF8-80	imúnne	72.9
	pufor	48.0
pSVF8-200	imúnne	60.9
	pufor	44.9

Kvôli jasnejšiemu preukázaniu existencie komplexu dvoch reťazcov bola aktívna látka čiastočne zbavená prostredia buniek COS7 priechodom MAb kolónou, špecifickou pre časť M_r 80 K. Ako je to zrejmé z tabuľky 4, asi 65 % z pôvodnej účinnosti sa zadrží

- 21 kolónou a 50 % tohto podielu, viazaného kolónou, sa eluuje v účinnej forme a v päťnásobne vyššej koncentrácii v porovnaní s pôvodným prostredím. Možno teda účinný komplex izolovať afinitnou chromatografiou s použitím antilátky špecifickej nielen na spécies M_r 80 K.

100 anti-80 K monoklonálnej antilátky (56 IgG, pozri Nordfang a spol., Thromb Haemostasis 53, 346 (1985)) vo väzbe na Sefarózu CL4B sa inkubuje cez noc za teploty 20 ’C s 1,4 μΣ prostredia, obsahujúceho celkom 6,2 mU účinnosti (merané skúškou Coatest s použitím buniek COS7 prenesených do plazmidov pSVF8-92 a pSVF8-80). Po inkubovaní sa suspenzia nanesie na kolónu a berie sa frakcia, ktorá pretečie. Kolóna sa premyje s použitím 300 μΣ pufra A (50 mM imidazolu, 0,1 M roztok chloridu sodného, 0,1 % nátriuminzulínu, 0,2 % azidu sodného, pH 7,3) a potom ešte za použitia 300 μΣ pufru B (2,5 M roztok chloridu sodného, 5 P % etylénglykolu, 0,5 M imidazolu, 0,1 M chloridu vápenatého, 0,1% nátriuminzulínu, 0,2 % azidu sodného, pH 7,3.

Tabulka 4 Čiastočné čistenie koagulačného komplexu M_r 92 K-80 K

Frakcia	Coatest U/mL	80 K ELISA U/mL
Prostredie	0.0044	0.175
Priamy prietok	0.0017	0.15
Eluát	0.0200	0.76

Z výsledkov tu uvedených je zrejmé, že vyjadrenie väzobnej oblasti (B) obsahujúcej 918 aminokyselín alebo asi 40 % z celku pôvodného nedotknutého proteínu nie je nevyhnutné pre účinnosť faktoru VIII:C. Súčasné vyjadrenie jednotlivých oblastí M_r 92 K a M_r 80 K je spojené s výsledkom, že totiž hladina účinnosti faktoru VIII:C je porovnatelná s hladinou vyjadrenou kódovacou oblasťou celého faktoru VIII:C. Tieto proteíny sa združujú in vivo za vzniku aktívneho komplexu, viazaného vápnikovým mostíkom. Takto združený útvar nevyžaduje prítomnosť oblasti B a je dostatočne účinný pre dva reťazce v postavení trans.

Z vyššie uvedených výsledkov je zrejmé, že účinnosť faktoru VIII:C sa dá dosiahnuť priamo pripravením fragmentov s N-koncovkou a C-koncovkou, ktoré sú vyjadrené vzájomne nezávisle a každý z nich má vlastnú signálovú sekvenciu. Takže faktor VIII:C sa dá získať účinnejšie, pretože nie je potrebné klonovať veíkého predchodcu a nemusí sa použiť jeho kódovacia sekvencia pre účinnosť faktoru VIII:C. Takže bunky sa môžu použiť na vyjadrenie faktoru VIII:C, ktorý môže byt deficitný z hladiska vlastnej schopnosti priameho zrenia proteínu s celkovou dĺžkou faktoru VIII:C.

Príklad 2

Vytváranie proteínu M_r 92 K v bunkách COS7 za použitia štruktúry pSVF8-92 bolo nízke v porovnaní s množstvom vzniknutého proteínu M_r 80 K. Pravdepodobne je protein M_r 92 K zadržiavaný a/alebo odbúravaný Golgiho spôsobom a nie je účinne pripravený či odovzdávaný ďalej. V tomto zmysle bola štruktúra modifikovaná hladinu proteínu uvedených typov: VIII:C ako génu;

M_r 92 K.

Boli vykonané zmeny v 5'-nepremenenej zahrnutie heterológnych s úmyslom zvýšiť modifikácie ďalej sekvencií faktoru

5'-nepremenených a vedúcich sekvencií; zmeny v 3'-nepremenenej sekvencií. Tieto štruktúry sú súborne uvádzané ďalej.

(A) Modifikácia 5'-nepremenených oblastí

Plazmid PSVF8-92B

Tento plazmid je derivátom pSVF8-92, kde 30 bp 5'nepremenená sekvencia pSVF8-92 sa nahradí celou 5'-nepremenenou oblasťou íudského faktoru VIII:C cDNA (nukleotidy 1 až 171, pozri vyobr. 8 v práci Truetta a spol., pozri vyššie) s oddelením G-C-konca (miestne - špecifickou mutagenézou in vitro) vykonajú sa tri základné zmeny vo východiskovom ATG, pozri dole (v polohe

I +172, vyobr. 8, Truett a spol., tu vyššie) tak, aby to vyhovovalo výhodným Kotakovým sekvenciám na účinný prenos v eukaryotických

- 23 bunkách:

faktor VIII:C Kozákova zhoda:

GTCATG CAA

ACCATG G

Táto zmena vymení druhú aminokyselinu signálneho peptidu z Gin na Glu.

Plazmid PSVF8-92E

Tento plazmid je derivátom pSVF8-92B, kde sa polyväzobná časť siahajúca od pSV7d 5' k sekvenciám faktoru VIII:C odstráni s výnimkou miesta Sali a ATG kód v 5'-nepremenenej časti (v mieste 41 podľa Truetta, pozri vyššie) sa zamení za ATT, a to mutagenézou in vitro.

(B) Adícia heterolóqnych 5'-sekvencií Plazmid PSVF8-92 G, H a I

Tieto plazmidy sú deriváty pSVF8-92B, kde '-nepremenená oblasť, ako i signálna sekvencia prírodného faktoru VIII:C, sa nahradí podobnou oblasťou z ludského tkanivového plazminogénového aktivátora (tPA) cDNA. V pSVF8-92G sa prvých 35 aminokyselín (signálne a pro-sekvencie) pôvodnej tPA pre-pro-oblasti napoja na vyzretý faktor VIII:C M_r 92 K s tým, že v časti M_r 92 K proteínu sa prvá aminokyselina (alanín) nahradí serínom. V pSVF8-92H sa prvých 32 aminokyselín tPA pre-pro-oblasti napojí na vyzretý faktor VIII:C 92 K proteín. V pSVF8-92I sa prvých 23 aminokyselín tPA pre-pro-oblasti napojí na vyzretý faktor VIII:C M_r 92 K proteín. Sekvencie tPA sú tie isté, ako ktoré sú popísané pre pSVF8-80. Plazmid pSVF8-92J

Tento plazmid je derivátom pSVF8-92G, v ktorom je oblasť tPA

- 24 5' nahradená gD 5'-neprevedenými sekvenciami 75 bp víru oparu obyčajného (Herpes simplex, vírus-l, HSV-1) a 75 bp signálnej sekvencie HSV-1 gD. pSVF8-92J tiež nemá substitúciu Ala za Ser, pozri R J. Watson a spol., Science 218, 381 - 384 (1982)).

(C) Zmeny 3¹-neprevedenej oblasti

Plazmid pSVF8-92C

Tento plazmid je variáciou pSVF8-92B, kedy je kódovacia oblasť M_r 92 K priamo napojená na vykonávací stop-kód a prírodné 3'-neprevedené sekvencie iudského faktoru VIII:C cDNA.

Plazmid PSVF8-92L

Tento plazmid je derivátom pSVF8-92C, kde 3'-neprevedená oblasť pSVF8-92C je nahradená 3'-neprevedenou oblasťou pSVF8-80.

(D) Výsledky

Každý z plazmidov z častí A až C vyššie bol uvedený do styku s bunkami COS7 spolu s pSVF8-80, ako je to popísané v príklade 1 a prostredia boli testované na účinnost faktoru VIII:C ako v príklade 1(F).

U prvého testovaného pSVF8-92B bola zistená hladina účinnosti v rozsahu dvakrát až osemkrát lepšom než ako to platí pre pSVF8-92. Zo zvyšných plazmidov sa ukázal byt ako najlepší pSVF8-92E, ktorý je 1,65 x lepší ako pSVF8-92B. Tiež u pSVF8-92J a I sa javí byt podstatne vyššia hladina účinnosti ako u pSVF8-92, a je skoro tesne pri účinnosti pSVF8-92E. Hladina pSVF8-92G je približne zhodná s pSVF8-92, zatial čo pSVF8-92H má účinnost podstatne nižšiu ako pSVF8-92. U obidvoch pSVF8-92C a pSVF8-92L je účinnost v podstate rovnaká ako u pSVF8-92E.

Príklad 3

V tomto príklade sa popisuje príprava štruktúry pre vznik polypeptidov, ktorá pozostáva z reťazca M_r 92 K a časti oblasti B. Tieto deriváty boli pripravované v snahe pripraviť ťažký reťazec, ktorý by bol stálejší a/alebo sa zapojil účinnejšie do aktívneho komplexu s ľahkým reťazcom. Tieto deriváty boli vybrané z umelých molekulárnych druhov, ktoré boli pozorované v prípravkoch faktoru VIII:C z plazmy i v bunečných lyzátoch, ako i upravených prostrediach z buniek, obsahujúcich rekombinantný faktor VIII:C v plnej jeho dĺžke. Polypeptidy s približne rovnakou veľkosťou môžu asi vznikať pri štiepení faktoru VIII:C s plnou dĺžkou trombínom.

(A) PSVF8-92S

Tento plazmid zahrňuje ťažký reťazec s 982 aminokyselinami a bol pripravený z cDNA plazmid pSVF8-302 s plnou dĺžkou najprv odštiepením v mieste Sací kódovacieho pásma oblasti B. Oligonukleotidový adaptér bol použitý na inštalovanie prevádzacieho stop-kódu a na napojenie kódovacej sekvencie na 3'-neprenesenú sekvenciu prírodného ľudského faktoru VIII:C so začiatkom na prvom mieste Balí. Tento plazmid zahrňuje prvých 978 aminokyselín prírodného íudského faktora VIII:C a 4 substituované aminokyselinové zvyšky na karboxylovom konci.

(B) PSVF8-160

Tento plazmid predstavuje ťažký reťazec s 1323 aminokyselinami a bol pripravený z klonu s plnou dĺžkou (s označením pSVF8-303) podobne ako v prípade pSVF8-200, ale s 5'-neprenesenou oblasťou pSVF8-92E. Pomocou EcoRV a Smal bol štiepený pSVF8-303, skrátené konce boli navzájom spojené za vzniku pSVF8-160. Tento plazmid zahrňuje prvých 1315 aminokyselín faktoru VIII:C. Ku karboxylovému koncu bolo pripojených 8 substituovaných aminokyselín ako výsledok spojenia s polyväzobnou časťou vektoru pSV7d.

(C) PSVF8-1790

Tento plazmid predstavuje ťažký reťazec 1416 aminokyselín a bol tiež pripravený z pSVF8-303, ktorý bol čiastočne digerovaný s BglII a vzniknutý fragment 6811 bp, izolovaný ako gel, poskytol spojením koncov pSVF8-170. Tento plazmid zahrňuje prvých 1405 aminokyselín faktoru VIII:C s tým, že na karboxylovom konci má predĺženie o 11 aminokyselín v dôsledku napojenia polyväzobnej časti vektoru pSV7d.

(D) PSVF8-120

Tento plazmid predstavuje ťažký reťazec s 1107 aminokyselinami a bol pripravený z pSVF8-303. Ten bol digerovaný s Apal a kohézne konce boli spojené T4-polymerázou. Takto získaná molekula bola ďalej digerovaná s Smal, DNA bola samoviazaná a propagovaná v Eschericchia coli HB101. Tento plazmid zahrňuje 1102 aminokyselín z aminokonca faktoru VIII:C a 5 ďalších aminokyselín na karboxylovom konci, pripojené polyväzobnou častou pSV7d.

(E) Výsledky

Každý z plazmidov, popísaných v častiach A až D, bol uvedený do styku s bunkami COS7 spolu s pSVF8-80, ako to bolo popísané v príklade 1 a prostredia boli testované na účinnosť faktoru VIII:C, rovnako ako v príklade 1.

U všetkých týchto plazmidov sa javí podstatne znížená hladina účinnosti v porovnaní s účinnosťou pSVF8-92E. Je zaujímavé, že pomer účinnosti podľa RIA k Coatestu pre pSVF8-160 a pSVF8-170 je asi 1,8 pri porovnaní k 7,2 pre pSVF8-92E. Tento výsledok nabáda k uváženiu, že tieto deriváty s dlhým ťažkým reťazcom majú vyššiu špecifickú účinnosť, to znamená, že sú lepšie zoradené do komplexov aktívnych podjednotiek ako samotná molekula M_r 92 K. Tiež pomer koagulačnej účinnosti k Čoatestovej účinnosti je nižší pre ťažké a dlhé reťazce, a to asi 1,7 v porovnaní s 2,3 pre M_r 92 K a 1,35 pre kompletnú molekulu, čo asi znamená, že tieto dlhé polypeptidy tvoria komplexy, ktoré nie sú tak aktivované ako komplex M_r 92 K + M_r 80 K.

Príklad 4

Tu sa popisuje príprava stabilných CHO bunečných zoskupení, ktoré produkujú komplex reťazca faktoru VIII:C M_r 92 K-80K.

(A) Príprava plazmidu, zahrňujúceho voliteľný značkovač

Plazmid pAd-DHFR, obsahujúci DHFR cDNA, sa zostaví napojením väčšieho promótora z adenovírusu - 2 (Ad-MLP, jednotky 16

- 27,3) na 5'-nepremenenej sekvencii myší DHFR cDNA, pozri J. H. Nunberg a spol., Celí. 19, 355 - 364 (1980). SV40 DNA zakódovacia časť skorej transkripčnej jednotky, zahrňujúca intrón malého t antigénu a obsahujúca SV40 pôvodnú oblasť transkripčnej zakončovacej oblasti, bola získaná z pSV2-neo, pozri Southern a Berg, J. Mol. Appl. Gen. 1, 327 - 341 (1982); potom bola napojená na 3'-nepremenený koniec DHFR cDNA. Tieto tri segmenty boli subklonované do pBR322 za vzniku plazmidu pAd-DHFR.

(B) Prenesenie a kultivovanie CHO-buniek

Bunky CHO-DUKX-B11 s nefunkčnými génmi pre dihydrofolátovú reduktázu, pozri Urlaub a Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 - 4220 (1981) sa prevedú do styku s koprecipitátom fosforečnanu vápenatého troch plazmidov: pSVF8-92C, pSVF8-92E alebo pSVF8-80 a pAD-DHFR podľa postupu Grahama a Van der Eba, pozri vyššie, ako i s prihliadnutím k modifikácii Wiglera a spol., Celí 14, 725 - 731 (1978) a Lewisa a spol., Somatic Celí. Genet. 6, 333 - 347 (1980). Koprecipitáty obsahovali až do μ9 každého plazmidu. Bunky sa vyčlenia na vyjadrenie DHFR (pozitívneho) fenotypu v prostredí, deficitnom na hypoxantín a tymidín.

Po izolovaní DHFR pozitívnych klonov a identifikovaní tých, u ktorých je zrejmá účinnosť faktoru VIII:C sa takto získané bunečné skupiny pestujú v metotrexate so DHFR génov a ich koordinovanie s génmi vyčlenenie sa vykonáva umiestnením obsahujúcom metotrexat v koncentráciách zreteľom na zosilnenie faktoru VIII:C. Takéto buniek v prostredí, od 0,025 do 0,2 μΜ.

Klony, rezistentné na metotrexat sa opäť testujú na účinnosť faktoru VIII:C.

(C) Testovacie spôsoby

Upravené prostredia z týchto DHFR-pozitívnych klonov sa testujú postupom ELISA na imunoreaktivitu ľahkého reťazca VIII:C postupom, ktorý popísal Nordfang a spol., Thromb Haemostas. 53, 346 - 350 (1985). Imunoreaktivita ťažkého reťazca faktoru VIII:C sa vyhodnotí s použitím rádioimunitného testu (RIA), ako to popísali R. L. Búrke a spol., J. Biol. Chem. 261, 12574 - 12578 (1986). Komplexy s aktivitou faktoru VIII:C, vzniknuté spoločným vyjadrením glykoproteínov 92K a 80K sa vyhodnotia s použitím COATEST-u testu, popísaného v príklade 1.

(D) CHO skupiny, vyjadrujúce komplexy aktívnych

K 80 K M_r

V tabuľke 5 sú štyri nezávislé CHO bunečné skupiny, ktoré súčasne vyjadrujú produkty všetkých troch plazmidov, použitých pri prenose. Hodnoty účinnosti faktoru VIII:C, uvedené v tabuľke 5, sú tie, ktoré boli pôvodne pozorované. Vyjadrenie glykoproteínov formou stabilných bunečných skupín sa zlepší priechodom v kultúrach fliaš T-75. Takýmto príkladom je skupina 10-C2, ktorá napokon produkuje 200 mU účinnosti faktoru VIII:C na mL upraveného prostredia (tabuľka 6). Klonovanie týchto stabilných bunečných skupín ozrejmuje, že vzájomne nezávisle vyjadrené ťažké a ľahké reťazce faktoru VIII:C sa môžu spojiť do formy aktívneho komplexu a môžu sa vylúčiť cestou vaječníkových buniek čínskeho škrečka.

Tabuľka 5 CHO bunečné skupiny produkujúce aktívne komplexy 92 K-80 K

Kloň	Prenesená	DNA		mU Coatest/mL
11-D6	PSVF8-92C,	pSVF8-80,	pAD-DHFR	43
11-D5	PSVF8-92C,	PSVF8-80,	pAD-DHFR	30
8-C1	PSVF8-92-E	PSVF8-80	, pAD-DHFR	18.2
10-C2	PSVF8-92E,	pSVF8-80,	pAD-DHFR	70.0

To, že tieto 3 plazmidy integrujú do chromozómov CHObuniek, zdá sa, že vyplýva z faktu, že bunečné skupiny, uvedené v tabulke 5 možno pestovať s použitím mnohých priechodov bez straty vyjadrenia.faktoru VIII:C. Potom by však bolo potrebné stanoviť, či vyjadrenie glykoproteínov faktoru VIII:C možno zosilniť metotrexatovou selekciou. Všetky štyri z týchto bunečných skupín boli umiestnené za selekcie v niekolkých rôznych koncentráciách metotrexatu. Boli získané z každej takejto skupiny rezistentné kolónie (zosilnené DHFR gény) a tie boli testované na účinnosť faktoru VIII:C. Charakteristika faktoru VIII:C bola stratená alebo nezmenená v klonoch 11-D5 a 11-D6, rezistentných na metotrexat. Charakteristika faktoru VIII:C kolísala u klonov rezistentných na metotrexat, odvodených od 10-C2 a 8-C1 (pozri tabulka 6).

Bolo vyhodnotených 22 8-C1 klonov, rezistentných na metotrexat a údaje o 10 z nich sú uvedené v tabulke 6. Podiel zosilnenia faktoru VIII:c kolíše medzi klonmi, čo môže znamenať, že buď jeden z podjednotkových génov sa môže zosilniť v DHFR kazetke, alebo obidva takéto alebo žiaden z nich. Klony 8C1-A2, 8C1-C2 a 8C1-C5 sú príklady týchto štyroch možností. Podobne bolo vyhodnotených 30 derivátov, vyčlenených metotrexatom, odvodených od 10-C2 a údaje pre 20 z nich sú uvedené v tabulke 6. Týchto 20 derivátov je tam i uvedených so spektrom účinnosti. Pozri klony 10C2-A2, 10C2-D2, 10C2-B5 a 10C2-06 ako príklady týchto štyroch zosilňujúcich možností.

- 30 Tabulka 6

Kloň	Koncentrácia HTX (μΜ)	Coatest (mU/mL)	LC-ELISA (mU/mL)	HC-RIA (mU/mL)
8-C1	0	18	1275
8-C1-A1	0.1	pod 50	1750	80
8-C1-A2	0.1	60	1950	nad 1000
8-C1-A5	0.05	2	100	10
8-C1-B3	0.025	33	1950	1000
8-C1-B4	0.025	50	3550	820
8-C1-B5	0.025	35	1950	n<?d 1000
8-C1-C2	0.025	130	13100	nad 1000
8-C1-C3	0.025	165	3900	nad 1000
8-C1-C5	0.025	30	1750	760
10-C2	0	200	1400	700
10-C2-A1	0.05	61	1600	400
10-C2-A2	0.1	67	6700	700
10-C2-A4	0.05	63	2250	1200
10-C2-A5	0.05	183	9450	2660
10-C2-A6	0.05	320	8600	7400
10-C2-B1	0.05	408	8100	4300
10-C2-B3	0.05	134	800	9800
10-C2-B4	0.05	394	18000	7800
10-C2-B5	0.05	461	15000	8400
10-C2-B6	0.05	247	2200	8800
10-C2-C1	0.1	160	8100	7600
10-C2-C2	0.05	228	6000	5600
10-C2-C3	0.05	294	14850	2650
10-C2-C5	0.05	294	12400	5400
10-C2-C6	0.05	100	1350	520
10-C2-D2	0.05	496	1560	16400
10-C2-D3	0.05	242	10200	2260
10-C2-D4	0.05	165	14100	3500
10-C2-D5	0.05	316	7800	5200
10-C2-D6	0.05	141	1600	6400

Medzi skupinami CHO-buniek, popísanými v tabulke 6, je jedna (10C2-B2), ktorá produkuje 0,5 U/mL komplexu aktívneho faktoru VIII:C, a to je polovica koncentrácie, ktorá sa nachádza v normálnej ludskej plazme. Na analýzu a čistenie materiálu s obsahom faktoru VIII:C sa pestujú CHO bunečné skupiny s polypeptidmi faktoru VIII:C v laboratórnom fermentačnom prostredí za vzniku litrových až dvojlitrových množstiev tkanivovej kultivačnej kvapaliny. Test tohto materiálu ukazuje, že asi 10 % až 20 % imunoreaktívneho faktor,u VIII: C

- 31 z nezosilnených skupín je aktívnych v Coateste. V zosilnených skupinách percento aktívneho materiálu klesá z 2 % na 5 % pôvodného imunoreaktívneho produktu. To znamená, že sa iba frakcia z ťažkých a ľahkých reťazcov faktoru VIII:C sústreďuje do aktívneho komplexu. Zvyšok môže existovať ako voľné .podjednotky alebo v degradovanej forme.

Plazmidy pSVF8-92 a pSVF8-80 boli deponované 24.1.1986 v American Type Culture Collection (ATCC) a tam dostali registračné čísla 40222 a 40223. Plazmid pSVF8-200 bol tiež tam deponovaný 17.7.1985 pod číslom 40190.

Príklad 5

V tomto príklade sa popisuje modifikovanie plazmidu pSVF8-80 so zreteľom na opravu aminokyseliny na amínovej koncovke ľahkého reťazca glykoproteínu FVIII:C. Sled postupov, ktorý je nevyhnutný na zaistenie peptidového signálu, nevyhnutného na nezávislé vylučovanie glykoproteínu 80 K M_r (príklad 1), spočíva v substituovaní serínu za normálny amino-koncovkový zvyšok ľahkého reťazca FVIII:C ľudskej plazmy. Boli pripravené nové plazmidy pri pokusoch zmeniť tPA pre-pro-peptidovú sekvenciu, takže ľahký reťazec FVIII:C bude obsahovať na amínovom konci zvyšok glukózy namiesto mutujúceho serínového zvyšku po proteolytickom spracovaní.

Predpokladá sa, že ľahký reťazec FVIII:C sa odštiepi z východiskového FVIII:C s plnou dĺžkou ešte pred vylučovaním, t.j. intracelulárne, a to proteázou, ktorá je v Golgiho prístroji. K tomuto štiepeniu dôjde medzi aminokyselinovými zvyškami 1648 a 1649 (Arg-Glu). Na polyakryloamidovom géli sa ľahký reťazec objaví ako dublet pásov 77 a 80 K M_r, čo znamená polypeptidy, majúce jeden alebo dva oligosacharidy viazané na dusíkovom atóme. Nezávislé vylúčenie ľahkých reťazcov sa dosiahlo pripojením kódujúcej oblasti ľahkého reťazca FVIII:C cDNA na cDNA, patriacej tPA. Pri postupe odovzdávania tPA-signálneho peptidu sa však zamení amínová koncovka ľahkého reťazca FVIII:C '

- 32 z pôvodného zvyšku glutámovej kyseliny na serín. Hoci tento mutant rekombinantného ľahkého reťazca má molekulárne charakteristiky podobné reťazcu, odvodenému od rekombinantného FVIII:C s plnou dĺžkou, je tu už predbežne náznak toho, že

1. sa nemusí pre zmenu glykozylovať rovnakým spôsobom ako reťazec odštiepený z východiskového FVIII:C,

2. môže sa inak správať počas čistenia ionomeničovou chromatografiou alebo na vWF-separóze, a

3. môže byť z hľadiska antigénneho odlišný od autentického íahkého reťazca.

tPA pre-pro-peptidová sekvencia vyžaduje tri proteolytické štiepenia na uvoľnenie vyzretého polypeptidu. Dole je uvedené vyhotovenie proteínovej kódovacej sekvencie pSVF8-80 do oblasti

spojenia tPA-FVIII:C 80	K.
	PSVF8-80
-35 Met	-30 Asp Ala Met Lys Arg	-25 Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu
ATG	GAT GCA ATG AAG AGA	GGG CTC TGG TGG TGT GTG CTG CTG
Cys	-20 Gly Ala Val Phe Val	-5 + -10 + Ser Pro Ser Gin Glu íle His Ala
TGT	GGA GCA GTC TTC GTT	TCG CCC AGC CAG GAA ATC CAT GCC
Arg	- 5 § Phe Arg Arg Gly Ala	1 5 Arg Ser íle Thr Arg Thr Thr Leu

Gin Ser Asp

CAG TCT GAT

Predpokladá sa, že signálne peptidázové štiepenie prebehne na karboxylovej strane buď v mieste Ser (poloha -13) alebo Ala (poloha 8) ako je to označené krížikom. Druhé štiepenie prebehne pravdepodobne na karboxylovej strane v mieste Arg (poloha -4, označená §). Tretím spôsobom spracovania je proteolýza väzby Arg-Ser k odštiepeniu Gly-Ala-Arg, teda tripeptidu a ponechanie Ser (poloha 1) ako aminokoncovku konečného tPA alebo polypeptidov lahkého reťazca FVIII:C.

(A) Príprava plazmidov (1) PSVF8-80KG

Kodón Ser (poloha 1) bol zamenený miestne riadenou mutagenézou za kodón Glu (poloha l). To bolo zámerne vykonané s úmyslom, aby prvé dva proteolytické postupy prebehli normálne a so zretelom na zistenie, či proteáza Arg-Glu môže rozpoznať a štiepiť dipeptid v pozmenenom zmysle, t.j. či je tPA tripeptid substituovaný za oblasť B FVIII:C. Oblasť spojenia tPA-80 K reťazca je znázornená dole. Inak je tento plazmid totožný s pSVF8-80. PSVF8-80KG

-15

-30

-25

Met

Asp

Ala

Met

Lys

Arg

Gly

Leu

Cys

Cys

Val

Leu

Leu

Leu

ATG

GAT

GCA

ATG

AAG

AGA

GGG

CTC

TGC

TGC

TGT

GTG

CTG

CTG

-20

- 5

+

-10

+

Cys

Gly

Ala

Val

Phe

Val

Ser

Pro

Ser

Gin

Glu

íle

His

Ala

TGT

GGA

GCA

GTC

TTC

GTT

TCG

CCC

AGC

CAG

GAA

ATC

CAT

GCC

- 5

§

1

5

Arg

Phe

Arg

Arg

Gly

Ala

Arg

Glu

íle

Thr

Arg

Thr

Thr

Leu

CGA

TTC

AGA

AGA

GGA

GCC

AGA

GAA

ATA

ACT

CGT

ACT

CTT

CAG

10

Gin

Ser

Asp

CAG

TCT

GAT

(2) PSVF8-80S

Z pSVF8-80 bolo odstránených mutagenézou in vitro 12 kodónov a kodón Ser (poloha 1) bol zamenený za kodón pre Glu. To umiestnilo zvyšok lahkého reťazca Glu FVIII:C za Ser23 predpokladaného tPA signálneho peptidu (označeného +). Štiepením signálnou peptidázou na karboxylovej strane Ser23 sa uvolní ako nemutant ľahký reťazec FVIII:C. Oblasť spojenia tPA-80 K reťazca pSVF8-80 S je znázornená dole. Inak je tento plazmid totožný s pSVF8-80.

OSVF8-80S

-23 Met Asp	-20 Ala Met GCA ATG	Lys AAG	-15	-10
Arg Gly Leu	Cys TGC	Cys TGC	Val TGT	Leu Leu	Leu CTG
ATG	GAT	AGA	GGG CTC	GTG	CTG
			- 5			+	1				5
Cys	Gly	Ala Val	Phe	Val	Ser Pro	Ser	Glu	íle	Thr	Arg	Thr
TGT	GGA	GCA GTC	TTC	GTT	TCG CCC	AGC	GAG	ATA	ACT	CGT	ACT
			10
Thr	Leu	Gin Ser	Asp	Gin	Glu Glu	íle	Asp	Tyr	Asp	Asp	Thr
CTT	CAG	CAG TCT	GAT	CAA	GAG GAA	ATT	GAC	TAT	GAT	GAT	ACC
	(3)	OSVF8-Í	30R
	Boli odstránené 3	pSVF8-80 kodóny ε	: úmyslom odobrať

pro-tripeptid, a to mutagenézou in vitro a kodón Ser (poloha 1) bol zamenený za Glu. Tým sa umiestni zvyšok Glu za Arg32 tPA pro-peptidu, čo je označené ! nad spojenou oblasťou reťazca tPA-80K, patriaceho pSVF8-80R, ako je to uvedené ďalej:

I

PSVF8-

8 OR

-32

-30

-25

-20

Met

Asp. Ala

Met

Lys

Arg

Gly

Leu

Cys

Cys

Val

Leu

Leu

Leu

ATG

GAT GCA

ATG

AAG

AGA

GGG

CTC

TGC

TGC

TGT

GTG

CTG

CTG

		-15					-10				- 5
Cys	Gly	Ala Val	Phe	Val	Ser	Pro	Ser Gin	Glu	íle	His	Ala
TGT	GGA	GCA GTC	TTC	GTT	TCG	CCC	AGC CAC	GAA	ATC	CAT	GCC
		§	1								10
Arg	Phe	Arg Arg	Glu	íle	Thr	Arg	Thr Thr	Leu	Gin	Ser	Asp
CGA	TTC	AGA AGA	GAG	ATA	ACT	CGT	ACT CTT	CAG	CAG	TCT	GAT
	Táto štruktúra	. bola vytvorená v	nádej i,	že	sa

Golgiho-rezistentnou proteázou s dibázickou špecifitou uvoinia iahké reťazce FVIII: s Glu na amínových koncoch.

(4) PSVF8-80A

Bolo odstránených miestne riadenou mutagenézou 7 kodónov z pSVF8-80, čím sa odstráni DNA zakódovävajúca údajné tPA pro-sekvencie a kodón Ser (poloha 1) bol nahradený kodónom Glu za kodónom 28 (Ala) domnelej tPA signálnej peptidovej kódujúcej sekvencie (ako je to naznačené + dole). Štiepením signálnou peptidázou na karboxylovej strane Ala 28 odštiepi nemutantný lahký reťazec FVIII:C. Spojená oblasť reťazca tPA-80 K je uvedená ďalej. Inak je tento plazmid totožný s pSVF8-80.

PSVF8-80A

-28 -25 -20 -15

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu

ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGC TGT GTG CTG CTG

-10 - 5 +

Cys Gly Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gin Glu íle His Ala TGT GGA GAC GTC TTC GTT TCG CCC AGC CAG GAA ATC CAT GCC

10 Glu íle Thr Arg Thr Thr Leu Gin Ser Asp Gin Glu Glu íle CAG ATA ACT CGT ACT CTT CAG CAG TCT GAT CAA GAG GAA ATT (B) Vytvorenie a analýza proteínovej sekvencie (1) Premena na bunky COS7

Bunky COS7 boli premenené s použitím postupu s DEAE-dextránom, ako to bolo popísané v príklade 1 a upravené prostredia boli testované pomocou LC-ELISA. Všetky 4 deriváty pSVF8-80 zakódovávajú glykoproteíny 80 K M , ktoré sú reaktívne pri teste LC-ELISA a ktoré možno imunitné vyzrážať po biosyntetickom označení rádioaktívnymi izotopmi s použitím rôznych antilátok anti-FVIII:C ľahkých reťazcov. S výnimkou pSVF8-80R majú všetky deriváty snahu vylučovať zhruba rovnaké množstvá glykoproteínu 80K ako pSVF8-80. Vylučovanie glykoproteínu 80K z buniek, prenesených z pSVF8-80R je veľmi slabé, spravidla pod 25 % v porovnaní s množstvom, ktoré vzniká z ďalších plazmidov. Ďalej potom sa javia tieto ľahké reťazce FVIII:C odlišne pri gélovej elektroforéze, kde sú pásy vždy difúzne.

(2) Vytvorenie v CHO-bunkách

Každý z týchto plazmidov bol zavedený do DUKX-B11 CHO buniek s pAd-DHFR, ako to bolo popísané v príklade 4. Prišlo k ustanoveniu stálych bunečných skupín na produkciu každého typu ľahkého reťazca. Vyjadrenie glykoproteínov 80 K M_r v CHO-bunkách je velmi podobné vyjadreniu v COS7-bunkách, a to so,zreteľom na množstvo vylúčeného glykoproteínu a vzhľad 80K pásov pri gélovej spektroforéze. CHO.-bunky s prenesenými pSVF8-80R sa vyznačujú tak nízkou hladinou vylučovaného 80 K glykoproteínu, že analýza takéhoto materiálu nebola vôbec vykonávaná.

3. Čistenie a analýza sekvencie aminokyselín

Boli pripravené upravené prostredia buď z transfekcií (na velko) COS7 na pSVF8-80KG alebo z transfikovaných či pomnožených VHO-bunečných skupín (pSVF8-80 K bunečná línia 10C2B5; pSVF8-80A, bunečná línia A1N; pSVF8, bunečná línia SIR). Ako prostredie sa použije DME H12 s 10 % FBS. FVIII-LC sa čistí s prihliadnutím na sekvencovanie dvojstupňovým postupom, zahrňujúcim iónomeničovú chromatografiu a nasledujúcu afinitnú chromatograf iu.

Iónomeničová chromatografia sa vykonáva takto: kolóna S-FF separózy (15 na 0,8 cm) sa uvedie do rovnovážneho stavu za použitia 0,02 M MES, 0,05 M chloridu sodného, 0,01 M chloridu vápenatého, pH 5,8, lambda 20 C = 7,2 mS. Takto upravené prostredie (500 - 1300 mL) sa nanesie na kolónu po úprave pH na 5,8 s rýchlosťou toku 100 mL/hod. Kolóna sa premyje 10-timi kolónovými objemami 0,05 M imidazolu, 0,05 M chloridu sodného, 0,02 M chloridu vápenatého, pH 7,35, lambda 20 °C + 8,8 mS s prietokovou rýchlosťou 200 mL/hodina. FVIII-LC bol eluovaný pridaním 0,1 M chloridu vápenatého k premývajúcemu pufru, prietoková rýchlosť 50 mL/hod. Všetky tieto postupy sa vykonávajú pri teplote 4 °C.

Afinitná chromatografia sa vykonáva takto: monoklonálna anti-FVIII-LC antilátka 56-IgG sa spojí so separózou 4B metódou CNBr na hustotu 2,5 mg/ml gélu. Eluát, obsahujúci FVIII-LC, sa inkubuje s imunosorbentom cez noc pri teplote miestnosti, 1 mL gélu na 1000 jednotiek FVIII-LC. Gel sa potom nanesie do kolóny a tá sa vymýva 20 kolónovými objemami pufra s nízkym obsahom solí (0,05 M imidazolu, 0,15 M chloridu sodného, 0,01 M chloridu vápenatého, 10 % glycerolu, 0,02 % amidu sodného, pH 7,3) s nasledujúcim vymývaním 20-timi kolónovými objemami pufra s vysokým obsahom soli (0,05 M imidazolu, 1,0 M chloridu sodného, 10 % glycerolu s pH 7,3). FVIII-LC sa eluuje z imunosorbentu s použitím 1 M chloridu vápenatého v 0,05 m imidazolu, 0,15 M chloridu sodného a 10 % glycerolu po inkubovaní počas jednej hodiny. Eluát sa bezprostredne odsolí na kolóne sepadexu G-25 v roztoku 0,05 M imidazolu, 0,15 M

M chloridu vápenatého, 10 % glycerolu, % azidu sodného, pH 7,3 s uskladnením pri -80 “C. Analýza N-koncovej sekvencie sa vykoná na sekvenčnom zariadení Applied Biosystem 477 A.

chloridu sodného, 0,01 0,02 % Tween-u 80, 0,02

Výsledky tejto analýzy sú zrejmé z tabuľky 7. Glykoproteín 80K zakódovaný pSVF8-80 KG má na amínovom zakončení tripeptidové predĺženie. Asi je to tPA pro-tripeptid Gly-Ala-Arg, ktorý nemôže byť spracovaný Arg-Glu-proteázou, ktorá ovláda oblasť B FVIII:C. Ďalej potom N-terminálne sekvencie objasňujú, že signálny peptid tPA je čo do dĺžky vlastne zvyšok 22 aminokyselín s tým, že signálna peptidáza štiepi na karboxylovej strane v mieste Pro 22. Takže plazmidové štruktúry pSVF8-80S a pSVF8-80A predpovedané v tom-ktorom prípade zo signálu peptidázového štiepenia za Ser 23 a Ala 28 vedú k nesprávnym aminokoncovým zvyškom na ľahkých reťazcoch 80 K.

Tabuľka 7 N-koncové sekvencie 80 K reťazcov s modifikovanými tPA pre-pro-oblastami

Plazmid	N-koncová sekvencia	Množstvo (pmól)
pSVF8-80	X-Ile-X-Arg-Thr-X-Leu-Gln-X-Asp-Gln-	10
pSVF8-80 KG	X-X-Arg-Glu-Ile-Thr-Arg-Thr-Thr-Leu-	20
pSVF8-80S	Ser-Glu-Ile-Thr-Arg-Thr-	40
pSVF8-80A	X-Gln-Glu-Ile-	40

Z výsledkov uvedených v tomto príklade, je zrejmá problematickosť predpovedania, ako sa bude vylúčený polypeptid ďalej spracovávať transkripciou a transláciou. Modifikovanie proteínových sekvencií má neočakávané dôsledky pre proteolytické

- 39 -v t · spracovávanie a pripájanie oligosacharidov a môže ovplyvniť celkovú účinnosť vylučovania.

Príklad 6

V tomto príklade sa popisuje spôsob vytvorenia autentických lahkých reťazcov FVIII:C s použitím signálneho peptidu ľudského al-antitrypsínu.

A. Príprava plazmidov

1. pSV lAT.Met

Bol zhromaždený hotový ludský αΐ-antitrypsínový polypeptid, zakódovaný v cDNA, a to s použitím fragmentov z ludských klonov pečeňových cDNA a syntetického oligonukleotidu; sústava bola naviazaná ako BamHI-SalI fragment na pBR322 za vzniku plazmidu pAT(Met), pozri Rosemberg a spol., Náture 312, 77 - 80 (1984). Syntetický oligonukleotidový väzobný adaptér a časť klonu cDNA so zakódovaným signálnym peptidom boli použité na pripojenie signálnej peptidovej kódovacej sekvencie s AcoRI obmedzovacím miestom na 5'-konci na BamHI namiesto pAT(Met). Takto vznikajúci 1271 bp EcoRI-Sall fragment, zakódujúci prenesené sekvencie ludského al-antitrypsínu bol naviazaný na EcoRI-Sall namiesto pSV7d, ako je to popísané v príklade 1 za vzniku pSValAT.Met.

2. PSVF8-80AT

Plazmid pSValAT-Met bol otvorený na strane BamHI, k čomu dôjde na hranici medzi kodónmi signálneho peptidu a hotovými αΐ-antitrypsínovými sekvenciami. Kohézny koniec tohto obmedzovacieho miesta sa odstráni pôsobením nukleázy z mungových bôbov, čím zostane GAG(Glu) kodón a αΐ-antitrypsínové sekvencie sa odstránia digerovaním so Sali. Kódovacie sekvencie FVIII:C

4Ó

K sa pripravia na pripojenie mutagenézou in vitro kodónov 1 a 2 pSVF8-80 za vzniku EcoRV miesta (čo zachová kodón 2 ako íle kodón). To umožní, aby kódovacia sekvencia ľahkého reťazca FVIII:C (ako EcoRV-Sall sekvencie vychádzajúce od ag kodónu 2) bola spojená v správnom čítacom obraze na kodón . 1 αΐ-antitrypsínu a nahradí tak kódovacie sekvencie hotového ľudského al- antitrypsínu.

Kódovacie sekvencie pSVF8-80AT v oblasti spojenia sú uvedené tu dole. S výnimkou, že kódovacia sekvencia tPA je nahradená kódovacou sekvenciou signálneho peptidu al-antitrypsínu, je tento plazmid totožný s pSVF8-80.

	PSVF8-80AT (amino-koncová	oblasť):
-24	-20	-15 -10
Met	Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly	íle Leu Leu Leu Ala Gly Leu
ATG	CCC TCG AGC GTC TCG TGG GGC	ATC CTC CTG CTG GCA TGC CTG
	- 5	1 5
Cys	Cys Leu Val Pro Val Ser Leu	Ala Glu íle Thr Arg Thr Thr
TGC	TGC CTG CTC CCT GTC TCC CTG	GCT GAG ATC ACT GCT ACT ACT
	10	15 20
Leu	Gin Ser Asp Gin Glu Glu íle	Asp Tyr Asp Asp Thr íle Ser
CTT	CAG TCT GAT CAA GAG GAA ATT	GAC TAT GAT GAT ACC ATA TCA

B. Vytvorenie a analýza sekvencie aminokyselín

1. Vyjadrenie pSVF9-80AT	v bunkách COS7
COS7 bunky boli uvedené	do styku s pSVF8-80AT a	plazmidom
s vyjadreným ťažkým reťazcom, zvyčajne	pSVF8-92C.	Upravené
prostredia boli testované	s použitím	LC-ELISA,	HC-ELISA
A COATEST.

Takto prenesené bunky boli tiež značené rádioaktívnym Met,

4ί takže biosynteticky pripravené a rádioaktívne značené ľahké reťazce FVIII:C možno imunitné vyzrážať a ozrejmiť po elektroforéze na polyakrylovom geli. Plazmid pSVF8-80AT ovláda syntézu ľahkých reťazcov FVIII:C tak, že sa prejaví dublet 77 -80 K M_r. Množstvo vzniknuté v bunkách COS7 je rovnaké ako v prípade pSVF8-80. Súčasne vyjadrenie s pSVF8-92C alebo inými plazmidmi s ťažkými reťazcami FVIII:C vedie k vzniku aktívnych komplexov FVIII:C podľa merania Coatestovou skúškou.

2. Čistenie a analýza sekvencie aminokyselín

Materiál na čistenie bol pripravený prenesením buniek COS7 do fľaštičiek T-175 za použitia zvyšujúcej sa hustoty buniek a klesajúcej koncentrácie difosfátu chlorochínu. Takto upravené prostredie bolo použité za 60 hodín po prenesení. Čistenie a analýza sekvencie aminokyselín boli vykonané ako sa popisuje v príklade 5. Výsledky analýzy sekvencie amino-koncoviek (pozri tabulka 8) naznačujú, že lahký reťazec FVIII:C zakódovaný v pSVF8-80AT má rovnakú sekvenciu amino-koncoviek ako autentický ľahký reťazec ľudskej plazmy FVIII:C.

Tabulka 8 N-koncová sekvencia reťazcov 80 K vylučovaných s použitím signálneho peptidu al-antitrypsínu

Plazmid N-koncová sekvencia Množstvo (pmól)

PSVF8-80 X-Ile-X-Arg-Thr-X-Leu-Gln-X-Asp-Gln- 10 pSVF8-80AT Glu-Ile-Thr-Arg-Thr-X-Leu-Gln-Ser-Asp-Gln- 10

3. Sústredenie ľahkých reťazcov 80 AT FVIII:C in vitro

Schopnosť ľahkých reťazcov 80 AT FVIII:C rekombinovať in vitro s vyčistenými ťažkými reťazcami FVIII:C bola testovaná v pokusoch, uvedených v tabuľke 9. Čistené ľahké reťazce FVIII:C boli inkubované za koncentrácií 3,7 U/mL s čistenými rekombinantnými ťažkými reťazcami (z ludského FVIII:C s plnou dĺžkou) pri 17 U/mL v pufre, obsahujúcom 50 mM Mn²⁺ a 150 μΜ β-merkaptoetano.lu. Kvôli kontrole bolo umožnené, aby vyčistené ťažké a ľahké reťazce sa mohli prepájať za rovnakých podmienok a množstvo takto získaného aktívneho FVIII:C bolo vyhodnotené Coatest-om. Z týchto výsledkov možno odvodiť, že ľahký reťazec 80 AT FVIII:C môže byt in vitro spojený, s ‘ vyčisteným rekombinantným ťažkým reťazcom.

Tabuľka 8 Kombinácia rekombinantných ľahkých a ťažkých reťazcov FVIII:C in vitro

Vyčistený	Vyčistený	Percento kontrolovanej
FVIII-LR	FVIII-TR	aktivity
80 AT	plná dĺžka	86
80 S	plná dĺžka	51
80 A	plná dĺžka	92
80 KG	plná dĺžka	233

Príklad 7

Tento príklad popisuje plazmidy na zlepšené vytvorenie ťažkých reťazcov faktoru VIII:C. Boli vykonané modifikácie v sekvenciách DNA, zodpovedných za iniciovanie prepisu a boli vykonané modifikácie v nekódovaných sekvenciách so zreteľom zvýšiť účinnosť prepisu a stabilitu pôvodnej (messenger) RNA. Glykoproteín s ťažkým reťazcom sa modifikuje predĺžením na karboxylovom konci s použitím segmentov B oblasti, pripojených krátkym peptidom. To sa vykonáva s úmyslom získať ťažký reťazec, ktorý by bol vylučovaný z buniek účinnejšie, bol by stabilnejší v prostredí tkanivovej kultúry a účinnejšie sa spájal s ľahkým reťazcom.

A. Príprava plazmidov

1. PCMVF8-92/6X

V snahe zlepšiť úroveň prepisu a stabilitu pôvodnej (messenger) RNA pre ťažký reťazec faktoru VIII:C 92 K M_r bola pôvodná SV40 transkripčná iniciačná oblasť nahradená sekvenciami z ludského cytomegalovírusu, a to z jeho bezprostrednej pôvodnej oblasti, pozri Boshart a spol., Celí 4, 521 - 530 (1985). Ďalej potom 5'-nepremenené sekvencie poskytnuté pôvodnej oblasti SV40 pre pôvodnú (messenger) RNA boli nahradené 5'-nepremenenými sekvenciami génu HCMV 1E1 so zahrnutím zodpovedajúceho prvého intrónu. Ten je zahrnutý za predpokladu, že spojené prepisy povedú k rýchlejšiemu spracovaniu a stabilnejšej mRNA. Expresný vektor má tiež SV40 základ replikácie, aby sa umožnilo prechodné vyjadrenie v bunkách COS7 a ďalej gén bakteriálnej β-laktamázy, aby bolo možné klonovanie DNA selekciou na ampicilínovú rezistenciu.

Plazmid bol zostavený z fragmentu 700 bp Sall-Pvul, patriaceho pSV7d (pozri príklad 1), obsahujúceho SV40 polyadenylátovú oblasť, fragmentu 1400 bp-EcoRI (doplneného Klenowovou polymerázou) z pSVT2, pozri Myers a spol., Celí 25, 373 - 384 (1981), ďalej Rio a spol., Celí 32, 1227 - 1240 (1983), ktorý zaisťuje SV40 pôvod replikácie a zvyšok β-laktamázového génu, fragment 1700 bp, odvodeného od plazmidového subklonu ludského cytomegalovírusu (kmeň Towne), do ktorého sa zavedie strana Sali mutagenézou in vitro blízko translačného východiskového miesta pre protein 1EI a 4300 bp fragment Sall-Sall z pSVF8-92C (pozri príklad 2), obsahujúci cDNA so zakódovaným glykoproteínom faktoru VIII:C 92 K M_r.

2. pSVF8-92tB

Tento plazmid je derivátom pSVF8-92C so zakódovaným ťažkým rekombinantným reťazcom 92 K M_r s predĺžením na C-konci, zloženým zo zvyškov N-koncových a C-koncových aminokyselín stredovej (B) oblasti východiskovej látky pre faktor VIII:C spojeným spôsobom peptid-záves-peptid podobným α-ťažkému reťazcu ludského imunoglobulínu. Je zložený z fragmentu 4900 bp HindlII-Sall z pSVF8-92C, do ktorého bol vsunutý syntetický väzobný adaptér

- 44 110 bp HindlII-SalI (pozri dole).

- N-koniec oblasti B :--:SerPheSerGlnAsnSerArgHisProSerThrArgGlnLysGlnPheAsnAla

AGCTTCTCCCAGAATTCTAGACACCCTAGCACTAGGCAAAÁGCAATTTAATGCC

AGAGGGTCTTAAGATCTGTGGGATCCTGATCCGTTTTCGTTAAATTACGG

HindlII

AcoRI

Xbal — > <- IgA záves —> <— C-koniec oblasti B ->

ThrProProThrProProThrProProValLeuLysArgHisGlnArgOP OC

ACCCCTCCTACACCACCAACCCCACCAGTACTGAAACGCCATCAACGGTGATAAG

TGGGGAGGATGTGGTGGTTGGGGTGGTCATGACTTTGCGGTAGTTGCCACTATTCAGCT

Seal

Sali

Väzobný adaptér zakódováva karboxy-koncové predĺženie zvyšku ďalších 34 aminokyselín a jedno potenciálne miesto glykozylovania na dusíku. C-koncový peptid má zvýšiť molekulárnu hmotnosť ťažkého reťazca asi na 96 K M_r a asi na 99 K M_r, ak je glykozylovaný.

B. Test na antigén ťažkého reťazca FVIII:C a FVIII:C tvorbou komplexu i

Kofaktor účinnosti komplexu íahkého reťazca ’ a ťažkého reťazca FVIII:C bol stanovený s použitím bežne, dostupného testovacieho gitu Kabivitrum (Coatest). Imurioreaktívny íahký reťazec FVIII:C bol zmeraný pomocou ELISA s použitím krycej antilátky HZIgG a antilátok, konjugovaných s peroxidázou od Nordisk Gentofte. Imunoreaktivita ťažkého reťazca FVIII:C bola kvantitatívne vyhodnotená s použitím ELISA testu (Nordisk Gentofte) s použitím ľudskej polyklonálnej látky inhibičných pacientov (E-IgG).

C. Prechodné vytvorenie pCDMVF8-92/6x

Plazmid pCMVF8-92/6x bol prenesený spolu s rôznymi plazmidmi s lahkými reťazcami FVIII:C (pozri príklad 5) do buniek COS7 s použitím DEAE-dextránového postupu. Výsledky takýchto prenosov sú zrejmé z tabulky 10. Z údajov vyplýva, že pridaním promočného podporného CMV 1E1 a 5'-nepremenených sekvencií génu 1E1 sa dosiahne 2,5 násobné zlepšenie (priemerne) vymenenia ťažkých reťazcov FVIII:C.

Tabulka 10 Vytvorenie pCMVF8-92/6x v bunkách COS7 proti pSVF8-92C

Plazmid s	Účinnosť FVIII:C (mU/mL)
ťažkým reťazcom	lahkým reťazcom	COAa	RIAb
pSVF8-92C	pSVF8-80	46	160
PSVF8-92C	pSVF8-80A	34	72
PSVF8-92C	pSVF8-80R	61	310
pSVF8-92C	pSVF8-80S	31	46
pCMVF8-92/6x	-80	87	290
pCMVF8-92/6x	-80A	131	140
pCMVF8-92/6x	-80R	178	330
PCMVF8-92/6X	-80S	114	690

^a test COATEST ^b rádioimunotest pre ťažký reťazec

D. Prechodné vytvorenie pSVF8-92tg v bunkách COS7

V tabulke 11 sú výsledky spoločného prenosu pSVF8-92tO s plazmidóm s ľahkými reťazcami faktoru FVIII:C (pSVF8-80AT, i

pozri príklad 6) do buniek COS7. Ťažké reťazce 92tp sa vylučujú glykoproteínu 92 ίβ ako pre na vyššej úrovni v porovnaní s ťažkým reťazcom 92C, ktorý má jednoduché C-koncové aminokyselinové predĺženie (Ser). Pomer Coatestovej aktivity (COA) k ELISA-reaktivnemu (t.j. miera tvorby komplexu) je vyšší pre reťazce reťazce 92C. Naviac sa ťažký reťazec 92tp vylučuje v prostredí bez séra dobre a javí sa byť stály s pomerom aktivity k proteinu takmer zhodnej ako v 10 % FBS. Z týchto výsledkov je zrejmé, že predĺžením karboxylového zakončenia o 34 aminokyselín sa zlepší vylučovanie a stabilizuje sa rekombinantný ťažký reťazec FVIII:C.

Tabuíka 11 Vyjadrenie pSVF8-92tp v bunkách COS7

Pokus	Prostredie	Plazmid 1	Plazmid 2	mU/mL FVIII
COATEST	a	b
1.	10 % FBS	pSVF8-92t	pSVF8-80AT	41	487	98
		pSVF8-92C	pSVF8-80AT	23	442	49
2.	10 % FBS	pSVF8-92t	pSVF8-80AT	80	484	162
		pSVF8-92C	PSVF8-80AT	30	639	90
3 .	HB CHO	pSVF8-92t	pSVF8-80AT	38	262	125

^a lahké reťazce, testom ELISA, špecifickým pre tieto k ťažké reťazce, testom ELISA, špecifických pre tieto

Monovrstvy buniek COS7 v dvojitom vyhotovení boli vystavené účinku DNA a DEAE-dextránu, premyté a potom sa ne pôsobilo prostredím, obsahujúcim difosfát chlorochínu počas 8 hodín. Bunky boli potom premytím zbavené tejto látky, prekryté použitím 5 ml DME H21 s obsahom 10 % FBS na 12 - 16 hodín a prekryté HB CHO (Hana Biologicals). Takto upravené prostredia boli testované na účinnosť FVIII:C ako to bolo popísané.

Hoci predložený vynález bol popísaný v podrobnostiach prostredníctvom príkladov so zreteíom na jasnosť porozumenia, predpokladá sa, že sa môžu vykonávať mnohé obmeny a modifikácie v rámci rozsahu pripojených nárokov.

Príklad 8

V tomto príklade sa popisuje spôsob vyjadrenia ťažkého reťazca FVIII:C s C-koncovkou Arg_74Q.

A. Príprava plazmidu pCMVF8-92R

Ťažký reťazec FVIII:. C zakódovaný do plazmidu pCMVF8-92/6x má ako C-koncové predĺženie Ser_?41. S úmyslom získať ťažký reťazec FVIII:C s Arg_74Q ako C-koncovkou, bol vyčistený fragment 1588 bp BamHI z pCMVF8-92/6x so zakódovaným 3'-koncom kódovacej sekvencie z pSVF8-92C. Tento fragment bol klonovaný do ml3mpl8 a zvyšok Ser₇₄₁ bol zamenený translačným stop-kodónom mutagenézou in vitro. Vyjadrovací plazmid pCMVF8-92R bol sústredený klonovaním mutagenizovaného fragmentu BamHI do fragmentu 5840 bp BamHI pôvodného vektoru. Týmto spôsobom bolo odstránené 680 bp 3'-nepremenenej sekvencie FVIII:C.

B. Prechodné vytvorenie PCMVF8-92R v bunkách COS7

Plazmid pCMVF8-92R bol prenesený spolu s plazmidom pSVF8-80AT s ľahkými reťazcami FVIII:C (pozri príklad 6) do buniek COS7 s použitím postupu s fosforečnanom vápenatým, pozri Graham a Van der Eb, Virol. 52, 456 - 467 (1973). Prostredia boli vymenené za 18 a 42 hodín po prenose a za 66 hodín po prenose boli vzorky prostredí testované. Výsledky týchto testov sú v tabuľke 12 dole. Z údajov je zrejmé, že došlo ku generovaniu účinnosti FVIII:C, ak pCMVF8-92R bol prenesený spolu s plazmidom, ktorý zaručoval vytvorenie FVIII:C, resp. jeho íahkých reťazcov.

Tabuľka 12 Súčasné vytvorenie pCMVF8-92R a pSVF8-80AT

Prenos	COA (mU/mL)	Ťažký ret.: Ag (mU/mL)	Ľahký reť.: Ag (mU/mL)
A	243	400	990
B	263	460	1190

Plazmidy pSVF8-92 a pSVF8-80 boli uložené v American Type Culture Collection (ATCC) registračné čísla 40222 a 40223 v tom-ktorom pSVF8-200 bol uložený tiež tam 17. júla 1985 pod

24. januára 1986 a dostali tu prípade. Plazmid číslom 40.190.

Claims (19)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Štruktúrna zložka DNA, zahrňujúca proteínový komplex s účinnosťou ľudského faktoru VIII:C s tým, že zmienený komplex zahrňuje prvý polypeptid homológny k oblasti A ľudského faktoru VIII:C naviazaný na druhý polypeptid homológny k oblasti C ludského faktoru VIII:C polypeptidovým článkom odlišujúcim sa od plnej dľžky B ľudského faktoru VIII:C.

I

2. Štruktúrna zložka DNA podľa nároku 1, kde zmienený polypeptidový článok obsahuje peptid, homológny k závesnej oblasti ľudského Ig ťažkého reťazca.

3. Štruktúrna zložka podľa nároku 2, kde zmienená sekvencia aminokyselín polypeptidového článku obsahuje Pro-Pro-Thr-Pro-Pro -Thr.

4. Štruktúrna zložka DNA podľa nároku 2, kde zmienený prvý polypeptid zahrňuje najmenej asi 90 % zo sekvencie aminokyselín ľudského faktoru VIII:C 1-740 a zmienený druhý polypeptid zahrňuje najmenej asi 90 % zo sekvencie aminokyselín ľudského faktoru VIII:C 1649-2332.

5. Štruktúrna zložka DNA podľa nárokov 1 až 4 obsahujúca ďalej kontrolné sekvencie schopné riadiť expresiu zmieneného proteínového komplexu, ak je zmienená štruktúrna zložka DNA prítomná v eukaryotickej hostiteľskej bunke.

6. Eukaryotická hostiteľská bunka obsahujúca štruktúrnu zložku DNA podľa nároku 5.

7. Eukaryotická hostiteľská bunka podľa nároku 6, kde zmienenou hostiteľskou bunkou je cicavčia bunka. i

I

8. Spôsob výroby rekombinantného proteínového komplexu s účinnosťou ludského faktoru VIII:C, vyznačujúci sa tým, že sa kultivujú hostiteľské bunky podlá nárokov 6 alebo 7 za podmienok, kedy dôjde k expresii zakódovaného proteínového komplexu pôsobením uvedenej štruktúrnej zložky DNA. ,

9. Spôsob podlá nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa najviac asi 5 hmotnostných percent z aminokyselín prvého a druhého polypeptidu líši od prírodných sekvencii aminokyselín, ktoré sú v oblastiach A a C faktoru VIII:C.

10. Spôsob podlá nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sekvencia aminokyselín druhého polypeptidu je totožná so sekvenciou aminokyselín 1649 - 2322 ludského faktoru VIII:C.

11. Spôsob podlá bodu 8, vyznačujúci sa tým, že sekvencia aminokyselín prvého polypeptidu je totožná so sekvenciou aminokyselín 1 - 740 ludského faktoru VIII:C.

12. Spôsob podlá nároku 8, vyznačujúci sa tým, že polypeptidový rozdeľovači článok obsahuje peptid, homológny k ľudskému Ig ťažkému reťazcu závesnej oblasti.

13. Proteínový komplex s účinnosťou ludského faktoru VIII:C, obsahujúci prvý polypeptid homológny k oblasti A ludského faktoru VIII:C viazaný na druhý polypeptid homológny k oblasti C ludského faktoru VIII:C polypeptidovým spojovacím článkom a to iným, ako zodpovedá plnej dĺžke oblasti B ludského faktoru VIII:C.

14. Proteínový komplex podľa nároku 13, kde zmienený polypeptidový spojovací článok obsahuje peptid homológny k ľudskému Ig ťažkému reťazcu závesnej oblasti.

15. Proteínový komplex podľa nároku 14, kde sekvencia aminokyselín polypeptidovej spojovacej časti zahrňuje Pro-Pro-Thr-Pro-Pro-Thr. i

16. Proteínový komplex podľa nároku 11, kde najviac asi 5 hmotnostných percent z aminokyselín zmienenej aminokyselinovej sekvencie prvého polypeptidu sa líši od sekvencie;prírodných aminokyselín v oblasti A faktoru VIII:C.

17. Proteínový komplex podľa nároku 13, kde sekvencia aminokyselín zmieneného prvého polypeptidu je totožná so sekvenciou aminokyselín 1 - 740 ľudského faktoru VIII:C.

18. Proteínový komplex' s účinnosťou ľudského faktoru VIII:C, ale ktorému chýba úplne,alebo časť - oblasti B ľudského faktoru VIII:C, pripraveného postupom podľa nároku 17.

. 19. Proteínový komplex s účinnosťou ľudského faktoru VIII:C, ale ktorému chýba úplne alebo čast - oblasti B ľudského faktoru VIII:C, pripraveného podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 -12.