SK125697A3 - A dna molecule for expression of bile salt-stimulated lipase (bssl) - Google Patents
A dna molecule for expression of bile salt-stimulated lipase (bssl) Download PDFInfo
- Publication number
- SK125697A3 SK125697A3 SK1256-97A SK125697A SK125697A3 SK 125697 A3 SK125697 A3 SK 125697A3 SK 125697 A SK125697 A SK 125697A SK 125697 A3 SK125697 A3 SK 125697A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- ala
- gly
- thr
- leu
- wall
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
DNA molekula na expresiu žlčovými soľami stimulovanej lipázy (BSSL)
Oblasť techniky
Vynález sa týka DNA molekúl, rekombinantných vektorov a bunkových kultúr na použitie v metódach na expresiu žlčovými soľami stimulovanej lipázy (BSSL) v metylotrofickej kvasinke Pichia pastoris.
Doterajší stav techniky
Žlčovými soľami stimulovanej lipáze (BSSL) (pozri Wang and Hartsuck, 1993) sa pripočítava väčšina lipolytickej aktivity ľudského mlieka. Charakteristickou vlastnosťou tejto lipázy je to, že vyžaduje primárnu žlčovú soľ na aktivity proti emulzifikovaným triacylglycerolom s dlhým reťazcom. BSSL bola doteraz nájdená len v mlieku od ľudí, goríl, mačiek a psov (Hernell et al., 1989).
BSSL bola prisúdená zásadná úloha pri trávení mliečnych lipidov v čreve kojených detí (Fredrikzon et al., 1978). BSSL je syntetizovaná u ľudí v laktujúcej mliečnej žľaze a je secernovaná s mliekom (Blacberg et al., 1987). Tvorí asi 1 % celkových mliečnych proteínov (Blackberg and Hernell, 1981).
Bolo predpokladané, že BSSL je hlavným limitujúcim faktorom pri absorpcii tukov a následnom raste, hlavne nezrelých detí, ktoré majú deficientnú ich vlastnú produkciu BSSL, a že suplementácia prípravkami s purifikovaným enzýmom signifikantne zlepšuje trávenie a rast týchto detí (US 4944944, Oklahoma Medical ' Research Foundation). Toto je klinicky významné pre prípravu detských prípravkov, ktoré obsahujú relatívne vysoké percento triglyceridov, a ktoré sú založené na rastlinných proteínoch alebo na proteínoch iných ako z ľudského mlieka, pretože deti kŕmené týmito prípravkami nie sú schopné tráviť tuk za neprítomnosti pridané BSSL.
cDNA štruktúry ako pre mliečnu BSSL, tak pre pankreatickú karboxylovú ester hydrolázu (CEH) boli charakterizované (Baba et al., 1991, Hui and Kissel, 1991, Nilsson et al., 1991, Reue et al., 1991) a bol vyvodený záver, že mliečny enzým a pankreatický enzým sú produktmi rovnakého génu, CEL génu. cDNA sekvencia (SEQ ID NO: 1) CEL génu je popísaná v US 5200183 (Oklahoma Medical Research Foundation ), WO 91/18293 (Aktiebolaget Astra), Nilsson et al., (1990), a Baba et al., (1991). Dedukovaná aminokyselinová sekvencia BSSL, vrátane signálnej sekvencie s 23 aminokyselinami je ukázaná ako SEQ ID NO: 2 v zozname sekvencii, zatiaľ čo sekvencia natívneho proteínu s 722 aminokyselinami je ukázaná ako SEQ ID NO: 3.
C-terminálny región proteínu obsahuje 16 repeatov, každý s 11 aminokyselinami, po ktorých nasleduje 11 aminokyselín konzervovaného úseku. Natívny proteín je vysoko glykozylovaný a bol popísaný veľký rozsah pozorovaný molekulových hmotností. Toto môže pravdepodobne byť vysvetlené rôznym rozsahom glykozylácie (Abouakil et al., 1988). N-terminálna polovica proteínu je homológna s acetylcholín esterázou a niektorými inými esterázami (Nilsson et al., 1990).
Rekombinantné BSSL môže byť produkované expresiou vo vhodných hostiteľských bunkách ako je E. coli, Saccharomyces cerevisiae, alebo v cicavčích bunkových líniách. Na zvýšenie BSSL expresného systému na dosiahnutie komerčne uplatniteľnej produkcie môže byť počítané s použitím heterológnych expresných systémov. Ako bolo uvedené vyššie, ľudský BSSL má 11 repeatov s 11 aminokyselinami na C-terminálnom konci. Na určenie biologickej dôležitosti týchto opakujúcich sa regiónov boli konštruované rôzne mutanty ľudského BSSL, ktorým chýbala časť alebo všetky tieto opakujúce sa regióny (Hansson et al., 1993).
Variant BSSL-C (SEQ ID NO; 4), napríklad má deléciu od aminokyselinového zvyšku 591 do 711. Expresné štúdie s použitím cicavčej bunkovej línie C127 ako ' 1 .
hostiteľa a expresného vektora hovädzieho papilôma vírusu ukázali, že rôzne varianty môžu byť exprimované v aktívnej forme (Hansson et al., 1993). Z expresných štúdií bolo tiež odvodené, že na prolín bohaté repeaty v ľudskom BSSK nie sú zásadné pre katalytickú aktivitu alebo aktiváciu BSSL žlčovými soľami. Avšak produkcia BSSL alebo jej mutantov v cicavčích expresných systémoch by mohla byť príliš nákladná na rutinné terapeutické použitie.
Eukaryotické systémy, ako sú kvasinky, môžu poskytnúť signifikantné výhody v porovnaní s prokaryotickými systémami, na produkciu istých polypeptidov
J kódovaných rekombinantnou DNA. Napríklad, kvasinky môžu byť vo všeobecnosti kultivované vo vyšších bunkových hustotách ako baktérie a môžu byť schopné glykozylácie exprimovaných polypeptidov tam, kde je taká glykozylácia významná pre biologickú aktivitu. Avšak použitie kvasinky Saccharomyces cerevisiae ako hostiteľského organizmu často vedie k nízkym hladinám expresie a slabej sekrécii rekombinantného proteínu (Cregg et al., 1987). Maximálne hladiny heterológnych proteínov sú pri Saccharomyces cerevisiae v oblasti 5 % celkových bunečných proteínov (Kingsman et al., 1985). Ďalšou nevýhodou použitia Saccharomyces cerevisiae ako hostiteľa je to, že rekombinantné proteíny majú tendenciu byť nadmerne glykozylované, čo môže ovplyvniť aktivitu glykozylovaných cicavčích proteínov.
Pichia pastoris je metylotrofná kvasinka, ktorá môže rásť na metanole ako jedinom zdroji uhlíka a energie, pretože obsahuje vysoko regulovanú dráhu využitia metanolu (Ellis et al., 1985). Pichia pastoris je tiež prístupná účinnej fermentačnej technológii s vysokou hustotou buniek. Preto rekombinantná DNA technológia a účinné metódy na transformáciu kvasiniek umožňujú vyvinúť Pichia pastoris ako hostiteľa pre expresiu heterológnych proteínov vo veľkom množstve, s expresným systémom založeným na promotore metanol oxidázy (Cregg et al., 1987).
V odbore je známe použitie Pichia pastoris ako hostiteľa na expresiu napr. nasledujúcich heterológnych proteínov: ľudského tumor nekrozis faktoru (EP-A0263311), Bordetella pertactin antigénu (WO 91/15571), povrchového antigénu hepatitídy B (Cregg et al., 1987), ľudského lyzozýmového proteínu (WO 92/04441), aprotinínu (WO 92/01048). Avšak, úspešná expresia heterológnych proteínov v aktívnej, solubilnej a secernovanej forme závisí na mnohých faktoroch, napr. správnej voľbe signálneho peptidu, správnej konštrukcii fúzneho spojenia medzi signálnym peptidom a zrelým proteínom, kultivačných podmienkach, atď.
Podstata vynálezu
Účelom vynálezu je prekonať vyššie uvedené nedostatky skôr uvedených systémov a poskytnúť metódu na produkciu ľudského BSSL, ktorá by bola finančne efektívna a ktorá by dávala výťažok porovnateľný, alebo vyšší, ako produkcia v iných organizmoch. Tento účel bol dosiahnutý poskytnutím metódy na expresiu BSSL v bunkách Pichia pastoris.
Týmto vynálezom je preto ukázané, že ľudská BSSL a variantná BSSL-C môžu byť exprimované v aktívnej forme a secernované z Pichia pastoris. Natívny signálny peptid, rovnako ako heterológny signálny peptid odvodený od Saccharomyces cerevisiae invertázového proteínu boli použité na translokáciu zrelého proteínu do kultivačného média v aktívnej, správne spracovanej forme.
V prvom aspekte poskytuje vynález DNA molekulu obsahujúcu:
a) región kódujúci polypeptid, ktorým je ľudská BSSL alebo jej biologicky aktívny variant,
b) spojený 5'-koniec uvedeného polypeptid kódujúceho regiónu, regiónu kódujúceho signálny peptid schopný riadenia sekrécie uvedeného polypeptidu z buniek Pichia pastoris transformovaných uvedenou molekulou DNA, a
c) promotor metanol oxidázy Pichia pastoris alebo funkčne ekvivalentný promotor operatívne naviazaný na uvedené kódujúce regióny definované v (a) a (b).
Termínom biologicky aktívny variant BSSL je mienený polypeptid majúci BSSL aktivitu a obsahujúci časť aminokyselínovej sekvencie ukázanej v SEQ ID NO: 3 v zozname sekvencií. Termínom polypeptid majúci BSSL aktivitu je v tomto kontexte mienený polypeptid majúci nasledujúce vlastnosti: (a) je vhodný na orálne podanie, (b) je aktivovaný špecifickými žlčovými soľami, a (c) účinkuje ako 'nešpecifická lipáza v obsahu tenkého čreva, t. j. je schopný hydro,lyžovať lipidy relatívne nezávisle na ich chemickej štruktúre a fyzikálnom stave (emulzifikované, micelárne, solubilné).
Uvedený BSSL variant môže byť napr. variant, ktorá obsahuje menej ako 16 opakujúcich sa jednotiek, kde opakujúcou sa jednotkou je mienená opakujúca sa jednotka s 11 aminokyselinami, kódovaná nukleotidovou sekvenciou ukázanou ako opakujúca sa jednotka pod nadpisom (ix) Vlastnosti v Informácii o SEQ ID NO: 1 v zozname sekvencií. Jednotlivo, variantom BSSL môže byť varianta BSSL-C, v ktorom sú aminokyseliny 536 až 568 a 591 až 711 deletované (SEQ ID NO: 4 v zozname sekvencií). V súlade s tým je DNA molekula podľa vynálezu výhodne DNA molekula, ktorá kóduje BSSL (SEQ ID NO: 3) alebo BSSL-C (SEQ ID NO: 4).
Avšak, DNA molekuly podľa vynálezu nie sú prísne obmedzené na DNA molekuly, ktoré kódujú polypeptidy s aminokyselinovou sekveciou identickou s SEQ ID NO: 3 alebo 4 v zozname sekvencií. Skôr vynález zahŕňa DNA molekuly, ktoré kódujú polypeptidy nesúce modifikácie ako sú substitúcie, malé delécie, inzercie alebo inverzie, pričom však tieto polypeptidy majú biologickú aktivitu BSSL. Vo vynáleze sú následne obsiahnuto DNA molekuly kódujúce varianty BSSL ako boli uvedené vyššie a tiež DNA molekuly kódujúce polypeptidy, ktorých aminokyselinová sekvencia je aspoň na 90 % homológna, lepšie aspoň na 95 % homológna s aminokyselinovou sekveciou ukázanou ako SEQ ID NO: 3 alebo 4 v zozname sekvencií.
Signálnym peptidom popísaným vyššie môže vyť peptid, ktorý je identický, alebo významne podobný s peptidom s aminokyselinovou sekvenciou ukázanou ako aminokyseliny -20 až -1 SEQ ID NO: 2 v zozname sekvencií. Alternatívne, môže to byť peptid, ktorý obsahuje invertázový signálny peptid Saccharomyces cerevisiae.
V ďalšom aspekte poskytuje predkladaný vynález vektor obsahujúci DNA molekulu ako je definovaná vyššie. Výhodne je taký vektor replikovateľný expresný vektor, ktorý nesie a je schopný sprostredkovať expresiu DNA sekvencie kódujúcej ľudskú BSSL alebo jej biologicky aktívnu variantu v bunkách rodu Pichia. Takým vektorom môže napríklad byť vektor pARC 5771 (NCIMB 40721), pARC 5799 (NCIMB 40723) alebo pARC 5797 (NCIMB 40722).
V inom aspekte poskytuje vynález kultúru hostiteľských buniek, ktorá obsahuje bunky rodu Pichia transformované DNA molekulou alebo vektorom ako boli definované vyššie. Výhodne sú uvedenými hostiteľskými bunkami bunky Pichia pastoris kmeňov ako je napríklad PPF-1 alebo GS115. Uvedenými bunkovými kultúrami môžu byť napríklad kultúry PPF-1 (pARC 5771) (NCIMB 40721), GS115 pARC 5799 (NCIMB 40723) alebo GS115 pARC 5797 (NCIMB 40722).
Ešte v inom aspekte poskytuje vynález postup na produkciu polypeptidu, ktorým je ľudská BSSL, alebo jej biologicky aktívny variant, pričom uvedený postup obsahuje kultiváciu uvedených hostiteľských buniek podľa vynálezu v podmienkach, kedy je uvedený polypeptid secernovaný do kultivačného média a získanie uvedeného polypeptidu z kultivačného média.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1: Expresia BSSL v Pichia pastoris PPF-1
1.1. Konštrukcia pARC 0770 cDNA sekvencia (SEQ ID NO: 1) kódujúca BSSL proteín, obsahujúca natívny signálny peptid (ďalej označovaný ako NSP) bola klonovaná v pTZ19R (Pharmacia) ako EcoRI-SacI fragment. Klonovanie NSP-BSSL cDNA do Saccharomyces cerevisiae expresného vektora pSCW 231 (získaného od profesora L. Prakashe, University of Rochester, NY, USA), ktorý je kvasinkovým expresným vektorom s nízkym počtom kópií, kde je expresia pod kontrolou konštitutívneho ADH1 promotora, bolo dosiahnuté v dvoch krokoch. Najprv bola NSP BSSL cDNA klonovaná do pYES2.0 (Invitrogen, USA) ako EcoRI-Sphl fragment z pTZ19R-SP-BSSL. Prebytočných 89 bázových párov medzi EcoRi a Ncol na začiatku signálny peptid kódujúcej sekvencie bolo odstránených vytvorením EcoRI/Ncol (89) fúzie a regenerovaním EcoRI miesta. Vzniknutý kloň pARC 0770 obsahoval ATG kodón, pôvodne kódovaný v Ncol mieste, ktoré bolo ihneď nasledované regenerovaným EcoRi miestom v čítacom rámci sso zostávajúcou NSP-BSSL sekvenciou.
1.2. Konštrukcia pARC 5771 plazmidu
Na konštrukciu vhodného expresného vektora na expresiu BSSL bol cDNA fragment kódujúci BSSL proteín spolu s natívnym signálnym peptidom klonovaný do Pichia pastoris expresného vektora pDM148. Vektor pDM 148 (získaný od Dr. S. Subramani, UCSD) bol konštruovaný nasledujúcim spôsobom: upstream netranslatovaný región (5'-UTR) a downstream netranslatovaný región (3'-UTR) metanoloxidázového génu boli izolované PCR a umiestnené v tandeme v polylinkery (MCS) E. coli vektora pSK+ (dostupného od Stratagene, USA).
Na správnu selekciu možných Pichia pastoris transformantov bola DNA sekvencia kódujúca Saccharomyces cerevisiae ARG4 gén spolu s jej vlastnou promotorovou sekvenciou inzertovaná medzi 5'- a 3' UTR v pSK- Vzniknutý konštrukt pDM148 mal nasledujúce vlastnosti: v MCS regióne pSK- 5'-UTR MOX, Saccharomyces cerevisiae ARG4 genómová sekvencia a 3'-UTR MOX boli klonované. Medzi 5'-UTR MOX a ARG4 genómovou sekvenciou bola umiestnená séria jedinečných reštrikčných miest (Sali, Clal, EcoRI, Pstl, Smal a SamH/), do ktorých môže byť klonované akákoľvek heterológny proteín kódujúca sekvencia na expresiu pod kontrolou MOX promotora v Pichia pastoris. Na uľahčenie integrácie, môže byť expresná kazeta vyštiepená zo zvyšku pSK- vektora štiepením Notl reštrikčným enzýmom.
5'-UTR M0X1 Pichia pastoris klonovaný do pDM148 mal dĺžku asi 500 bp, zatiaľ čo 3'UTR MOX1 z Pichia pastoris klonovaný do pDM148 mal dĺžku asi 1000 bp. Na inzerciu NSP BSSL cDNA sekvencie medzi 5'- UTR MOX1 a Saccharomyces cerevisiae ARG4 kódujúcej sekvencie do pDM148 bol cDNA inzert (SP-BSSL) izolovaný z pARC 0770 štiepením EcoRI a BamHI (približne 2,2 kb DNA fragment) a bol klonovaný medzi EcoRI a BamHI miesta do pDM148.
Vzniknutý konštrukt pARC 5771 (NCIMB 40721) obsahoval Pichia pastoris MOX1 5'-UTR nasledovaný NSP BSSL kódujúcou sekvenciou nasledovanou Saccharomyces cerevisiae ARG4 génovou sekvenciou a 3'UTR MOX1 génu Pichia pastoris, zatiaľ čo celý DNA segment od 5'-UTR MOX1 do 3'- UTR MOX1 bol klonovaný do MCS pSK-.
1.3. Transformácia BSSL v Pichia pastoris hostiteľovi PPF-1.
Na expresiu BSSL v Pichia pastoris hostiteľovi PPF-1 (his4, arg4, získaná od Phillips Petroleum Co.), bol plazmid pARC 5771 štiepený Notl a celá štiepna zmes (10 pg celkovej DNA) bola použitá na transformáciu PPF-1. Použitý transformačný protokol bola v podstate kvasinková sféroplastová metóda popísaná Creggom et al., (1987). Transformanty boli regenerované na minimálnom médiu postrádajúcom arginín, takže Arg+ kolónie mohli byť selektované. Regeneračný vrchný agar obsahujúci transformanty bol prenesený a homogenizovaný vo vode a kvasinkové bunky boli umiestnené s hustotou asi 250 kolónií na platňu na glukózové minimálne platne postrádajúce arginín. Mutantné kolónie boli potom identifikované opätovným umiestnením na minimálne metanolové platne. Asi 15 % všetkých transformantov vykazovalo Muts (metanol pomaly rastúci) fenotyp.
1.4. Vyšetrenie transformantov exprimujúcich BSSL
Na rýchle vyšetrenie veľkého množstva transformantov na expresiu lipázy bola vyvinutá metóda lipázového testu na platni. Postup na prípravu týchto platní bol nasledujúci: Do roztoku 2 % agarózy (konečného) bolo pridané 10 x Na-cholát roztok vo vode do konečnej koncentrácie 1 %. Lipidový substrát tributín bol pridaný v zmesi do konečnej koncentrácie 1 % (objem/objem). Na podporu rastu transformantov bola zmes ďalej doplnená 0,25 % kvasinkovou dusíkatou bázou (konečnou) a 0,5 % metanolom (konečným). Prísady boli riadne premiešané a vyliate na platne do hrúbky 3-5 mm. Akonáhle sa zmes stala pevnou, boli transformanty umiestnené na platne a platne boli ďalej inkubované pri 37 °C počas 12 hodín. Lipázu produkujúce klony vykazovali jasné haló okolo klonu. V typickom experimente bolo identifikovaných 7 z celkových 93 transformantov ako BSSL produkujúcich transformantov. Dva klony (č. 39 a 86) produkujúce najväčšie haló okolo umiestnených kolónií boli zoškriabané na ďalšiu charakterizáciu.
1.5. Expresia BSSĽ z PPF-1 (pARC 5771)
Dva transformanty č. 39 a 86 popísané v sekcii 1.4. boli zoškriabané a kultivované v BMGY kvapalnom médiu (1 % kvasinkový extrakt, 2 % bactopeptón, 1,34 % kvasinková dusíkatá báza bez aminokyselín, 100 mM KPO4 pufru, pH 6,0, 400 pg/ml a 2 % glycerol) 24 hodín pri 30 °C pokiaľ kultúry nedosiahli A6oo blízke 40. Kultúry boli peletované a znovu rozsuspendované v BMMY (2 % glycerol nahradený 0,5 % metanolom v BMY) médiu pri A600 300. Indukované kultúry boli inkubované pri 30 °C s trepaním 120 hodín. Supernatanty kultúr boli odoberané v rôznom čase na analýzu expresie BSSL testom aktivity enzýmu, SDS-PAGE analýzou a Western blotingom.
1.6. Detekcia BSSL enzýmovej aktivity v supernatantoch kultúr klonov č. 39 a 86.
Na určenie enzýmovej aktivity v supernatantoch bez buniek indukovaných kultúr č. 39 a 86 ako sú popísané v sekcii 1.5., boli kultúry scentrifugované a supernatant bez buniek bol testovaný na BSSL enzýmovú aktivitu podľa metódy, ktorú popísal Hernell a Olivecrona (1974). Ako je ukázané v tabuľke 1, pri oboch kultúrach bolo zistené, že obsahujú BSSL enzýmovú aktivitu s maximom aktivity v 96 hodine po indukcii.
1.7. Western blot analýza supernatantov kultúr PPF-1 :pARC 5771 transformantov (č. 39 a 86).
Na určenie prítomnosti rekombinantnej BSSL v supernatantoch kultúr č. 39 a 86 PPF-1 (pARC 5771) transformantov boli kultúry kultivované a indukované ako je popísané v sekcii 1.5. Kultúry boli odoberané v rôznom čase po indukcii a boli podrobené Western blot analýze s použitím anti-ASSL polyklonálnej protilátky. Výsledky ukázali prítomnosť BSSL v supernatante kultúry ako 116 kDa pásika.
Príklad 2: Expresia BSSL v Pichia pastoris GS115
2.1. Konštrukcia pARC 5799
Pretože 5'-M0X UTR a 3'MOX UTR neboli správne definované a pretože pDM 148 vektoru chýba akýkoľvek iný vhodný marker (napr. gén rezistencie na G418) na monitorovanie počtu kópií BSSL integrovaných v chromozóme Pichia, bol cDNA inzert natívnej BSSL spolu so signálnym peptidom klonovaný do iného Pichia pastoris expresného vektora, pHIL D4. Integratívny plazmid pHIL D4 bol získaný od Phillips Petroleum Company. Plazmid obsahoval 5'-M0X1, približne 1000 bp segment alkohol oxidázového promótora a jedinečné EcoRI klonovacie miesto. Tiež obsahoval približne 250 bp 3'M0X1 regiónu obsahujúceho alkoholoxidzázovú terminačnú sekvenciu, nasledovanú EcoRI klonovacím miestom. Terminačný región bol nasledovaný Pichia pastoris histidinol dehydrogenázovým génom HIS4 obsiahnutým na 2,8 kb fragmente na doplnenie defektného HIS4 génu v hostiteľovi GS115 (pozri nižšie). 650 bp región obsahujúci 3'-MOX1 DNA bol fúzovaný na 3'-konci HIS4 génu, ktorý bol spolu s 5'-M0X1 regiónom nevyhnutný na miestne riadenú integráciu. Bakteriálny gén rezistencie na kanamycín z pUC-4K (PL-Biochemicals) bol inzertovaný do jedinečného Nael miesta medzi HIS4 a 3'-M0X región v 3'HIS4 géne.
Kloň NSP-BSSL kódujúci cDNA fragment v jedinečnom EcoRI mieste pHIL D4, dvojreťazcový oligolinker majúci BamHl-EcoRI štiepnu pozíciu bol ligovaný do BamHI štiepeného plazmidu pARC 5771 a celá NSP-BSSL kódujúca sekvencia bola vybraná ako 2,2 kb EcoRI fragment. Tento fragment bol klonovaný do EcoRI miesta pHIL D4 a správne orientovaný plazmid bol označený ako pARC 5799 (NCIMB 40723).
2.2. Transformácia pARC 5799
Na uľahčenie integrácia NSP-BSSL kódujúcej sekvencie v genómovom lokuse MOX1 v Pichia pastoris bol plazmid pARC 5799 štiepený Bglll a použitý na transformáciu Pichia pastoris kmeňa GS115(his4) (Phillips Petroleum Company) podľa protokolu popísanom v sekcii 1.5. Avšak v tomto prípade sa jednalo o selekciu His prototrofov. Transformanty boli zoškriabané po sériovom riadení platní regenerovaného vrchného agaru a testované priamo v lipázovom platňovom teste ako je popísané v sekcii 1.4. Dva klony transformantov (č. 9 a 21) boli zoškriabané na základe veľkosti ich haló na lipázovej testovacej platni a boli ďalej testované na expresiu BSSL. Bolo zistené, že klony boli Mut+.
2.3. Detekcia BSSL enzýmovej aktivity v supernatantoch kultúr GS115(pARC 5799) transformantov č. 9 a 21.
Dva transformované klony č. 9 a 21 GS115(pARC 5799) boli kultivované v podstate podľa protokolu popísaného v sekcii 1.5. Supenatanty kultúr boli v rôznom čase po indukcii testované na BSSL enzýmovú aktivitu ako je popísané v sekcii 1.6. Ako je ukázané v tabuľke 1, obsahovali oba supernatanty kultúr BSSL enzýmovú aktivitu a enzýmová aktivita bola najvyššia 72 hodín po indukcii. Oba klony vykazovali vyššiu expresiu BSSL v porovnaní s klonmi PPF-1 (pARC 5771).
2.4. SDS-PAGE a Western blot analýzy supernatantov kultúr GS115(pARC 5799) transformantov č. 9 a 21.
Supernatanty kultúr odoberané v rôznom čase, ako je popísané v sekcii 2.3., boli podrobené SDS-PAGE a Western blot analýze. Z SDS-PAGE profilu bolo vyhodnotené, že asi 60-75 % celkových proteínov prítomných v supernatantoch indukovaných kultúr bol BSSL. Molekulová hmotnosť'proteínu bola okolo 116 kDa. Western blot údaje tiež potvrdili, že hlavný proteín prítomný v supernatante kultúry bol BSSL. Proteín mal zjavne rovnakú molekulovú hmotnosť ako natívny BSSL.
Príklad 3: Zvýšenie BSSL expresie
3.1. Zvýšenie BSSL expresie z transformovaného klonu GS115(pARC 5799) (č. 21).
Bol použitý B. Braun fermentor s kapacitou 23 I. 5 litrov média obsahujúceho 1 %YE, 2 % peptón, 1,34 YNB a 4 % hmotnosť/objem glycerol bolo autoklávovaných pri 121 °C 30 minút a biotín (400 pg/l konečná koncentrácia) boi pridaný počas inokulácie po sterilizácii na filtri. Pre inokulum bol použitý glycerolový zásobník GS115(pARC 5799) (č.21) inokulovaný do syntetického média obsahujúceho YNB (67 %) plus 2 % glycerol (150 ml) a bol kultivovaný pri +30 °C 36 hodín. Fermentačné podmienky boli nasledujúce: teplota bola +30 °C, pH 5,0 bolo udržiavané použitím 3,5 N NH4OH a 2 N HCl, rozpustený kyslík od 20 do 40 % saturácie, polypropylénglykol 2000 bol použitý ako protipenivá látka.
Kultúra bola monitorovaná v pravidelných intervaloch meraním OD pri 600 nm. Αβοο dosiahla maxima 50-60 v 24 hodine. V tomto bode bola vsádková rastová fáza prekonaná ako je ukázané zvýšenými hladinami rozpusteného kyslíka.
Rastová fáza bola ihneď nasledovaná indukčnou fázou. Behom tejto fázy bol ako krmivo použitý metanol obsahujúci 12 ml/l PTM1 solí. Stupeň podávania metanolu bol 6 μΙ/hod. behom prvých 10-12 hodín, potom bol postupne zvyšovaný o 6 ml/h každých 7-8 hodín do maxima 36 ml/hod. Amoniak použitý na kontrolu pH účinkoval ako zdroj dusíka. Akumulácia metanolu bola testovaná každých 6-8 hodín, pričom sa použilo stanovenie obsahu rozpusteného kyslíku a bolo objavené, že je limitovaný behom celej indukčnej fázy. OD pri 600 nm sa zvýšilo z 50-60 na 150-170 behom 86 hod. podávania metanolu. Kvasinkový extrakt a peptón boli pridávané každých 24 hodín na vytvorenie konečnej koncentrácie 0,25 % a 0,5 % v príslušnom poradí.
Vzorky boli odoberané v 24 hodinovom intervale a boli testované na BSSL enzýmovú aktivitu v bujóne bez buniek. Bujón bol tiež podrobený SDS-PAGE a Western blot analýze.
3.2. Proteínová analýza secernovaného BSSL z kultúry GS115(pARC 5799) (č. 21) kultivovanej vo fermentore.
BSSL enzýmová aktivita v bujóne bez buniek sa zvýšila z 40-71 mg/l (ekvivalentov natívneho proteínu) v 24. hodine na 200-227,7 mg/l (ekvivalentov natívneho proteínu) na konci 86-90. hodiny. SDS-PAGE analýza bujónu bez buniek ukázala prominentný Coomasie blue farebný pásik s molekulovou hmotnosťou 116 kDa. Identita pásika bola potvrdená Western blotom uskutočneným ako bolo popísané v sekcii 1.7. pre natívny BSSL.
3.3 Purifikácia rekombinantného BSSL secernovaného do supernatantu kultúry GS115(pARC 5799) (č. 21) klonov.
Pichia pastoris kloň GS115(pARC 5799) bol kultivovaný a indukovaný vo fermentore ako je popísané v sekcii 3.1. Na purifikácii rekombinantného BSSĽ bolo 250 ml kultivačného média (indukovaného 90 hodín) centrífugované pri 12000xg 30 minút na odstránenie všetkých častíc. Supernatant bez buniek bol ultrafiltrovaný na Amicon sete pričom sa použila membrána s rozlišovacou schopnosťou 10kDa. Soli a proteiny a peptidy s nízkou molekulovou hmotnosťou boli z kultivačného supernatantu odstránené opakovaným riedeným behom filtrácie. Pufor použitý na takéto riedenia bol 5mM Barbitol pH 7,4. Po koncentrácii supernatantu kultúr bol retentát rekonštituovaný na 250 ml použitím 5 mM Barvitolu, pH 7,4 a 50 mM NaCl a bol zavedený do Heparín-Sefarózovej kolóny (15 ml objem lôžka), ktorá bola predekvilibrovaná rovnakým pufrom. Zavádzanie vzorky bolo uskutočnené prietokom 10 ml/hod. Po zavedení bola kolóna premytá 5 mM barbitolom pH 7,4 a 0,1 M NaCl (200 μΙ premývací pufor) pokiaľ sa absorpcia pri 250 nm neznížila pod hladinu detekcie. BSSL bola eluovaná 200 ml Barbitol pufru (2mM, pH 7,4) a lineárnym gradientom NaCl v rozmedzí od 0,1 do 0,7 M. Frakcie (2,5 ml) boli odoberané a testované na eluovaný proteín monitorovaním absorbancie pri 260 nm. Frakcie obsahujúce proteín boli testované na BSSL enzymatickú aktivitu. Vhodné frakcie boli analyzované na 8,0 % SDS-PAGE na vyšetrenie ich purifikačného profilu.
3.4. Charakterizácia purifikovného rekombinantného BSSL secernovaného do supernatanu kultúr GS115(pARC 5799).
SDS-PAGE a Western tplot analýzy frakcií (popísané v sekcii 3.3) ukazujúce maximálnu enzymatickú aktivitu BSSL enzýmu ukázali, že rekombinantný proteín bol približne na 90 % čistý. Molekulová hmotnosť purifikovaného proteinu bola okolo 116 kDa ako je určené SDS-PAGE a Western blot analýzami. Pokiaľ boli vzorky podrobené SDS-PAGE analýze, potom mohol byť detekovaný proteínový pásik s nízkou molekulovou hmotnosťou farbením Coomasie Brilliant Blue, ktorý nebol znázornený na Western blot. Purifikovaný proteín bol podrobený Nterminálnej analýze na automatizovanom proteínovom sekvenátore. Výsledky ukázali, že proteín bol správne spracovaný z natívneho signálneho peptidu a že rekombinantný proteín mal N-terminálnu sekvenciu A K L G A V Y. Špecifická aktivita purifikovaného rekombinantného proteinu bola zistená podobná ako aktivita natívneho proteinu.
Príklad 4; Expresia BSSL-C Pichia pastorís GS115
4.1. Konštrukcia pARC 5797 cDNA kódujúca sekvencia pre BSSL variantu BSSL-C bola fúzovaná na svojom 5'-konci so signálny peptid kódujúcou sekvenciou Saccharomyces cerevisiae SUC2 génovým produktom (invertázou), pričom sa zachováva integrita otvoreného čítacieho rámca začínajúceho prvým ATG kodónom invertázového signálneho peptidu. Tento fúzny génový konštrukt bol najprv klonovaný do Saccharomyces cerevisiae expresného vektora pSCW 231 (pSW 231 kvasinkový expresný vektor s nízkymi počtom kópií a expresia je pod kontrolou konštitutívneho ADH1 promotora) medzi EcoRI a BamHI miesta na generovanie expresného vektora pARC 0788.
cDNA fúzneho génu bola ďalej subklonovaná do Pichia pastorís expresného vektora pDM 148 (popísaného v sekcii 1.2) uvolnením vhodného 1,8 kb fragmentu EcoPI a BamHI štiepením pARC 0788 a subklonovaním fragmentu do pDM 148 poštiepeného EcoRI a BamHI. Vzniknutý konštrukt pARC 5790 bol štiepený BamHI a dvojreťazcový oligonukleotidový linker s fyzikálnou štruktúrou BamHl-EcoRIBamHI bol ligovaný do konštruktu pARC 5796 v podstate na izoláciu cDNA fragmentu fúzneho génu, podľa stratégie popísanej v sekcii 2.1.
Nakoniec bol 1,8 kb fragment obsahujúci invertázový signálny peptid/BSSLC fúzny gén vybraný z pARC 5797 štiepením EcoRI a bol klonovaný do pHIL D4 v EcoRI mieste. Vhodnou reštrikčnou analýzou bol identifikovaný expresný vektor obsahujúci inzert v správnej orientácii a bol označený pARC 5797 (NCIMB 40722).
4.2. Expresia rekombinantného BSSL-C z Pichia pastorís
Na expresiu rekombinantného BSSL-C z Pichia pastorís bol Pichia pastorís hostiteľ GS115 transformovaný pARC 5797 podľa metódy popísanej v sekciách 1.3 a 2.2. Jeden transformant (č. 3) bol zoškriabaný na základe schopnosti produkovať veľa lipázy podľa detekčnej metódy lipázového testu na platni a bol ďalej analyzovaný na produkciu BSSL enzymatickej aktivity do kultivačného supernatantu v podstate podľa metódy popísanej v sekciách 1.6 a 2.3. Ako je ukázané v tabuľke 1, supernatant GS115 (pARC 5797) (č. 3) obsahoval BSSL enzymatickú aktivitu a jej množstvo sa progresívne zvyšovalo do 72. hodiny po indukcii.
4. 3. SDS-PAGE a Western blot analýzy supernatantov kultúr GS115 (pARC 5797) transformantu (č. 3).
Supernatanty kultúr odoberané v rôznom čase, ako je popísané v sekcii 4.2., boli podrobené SDS-PAGE a Western blot analýze ako je popísané v sekciách 1.7 a 2.4. Z SDS-PAGE profilu bolo vyhodnotené, že asi 75-80 % z celkového množstva extracelulárnych proteínov je BSSL-C. Molekulová hmotnosť proteínu bola okolo 66 kDa, ako bolo vyhodnotené SDS-PAGE analýzou. Na Western blot analýze boli nájdené len dva pásiky (dublet) okolo 66 kDa, ktoré boli imunoreaktívne a tak potvrdzovali expresiu rekombinantného BSSL-C.
Príklad na porovnanie: Expresía BSSL v Saccharomyces cerevisiae
Boli uskutočnené pokusy exprimovať BSSL v Saccharomyces cerevisiae. BSSL bola v Saccharomyces cerevisiae slabo secernovaná a natívny signálny peptid nepracoval účinne. Okrem toho, natívny signálny peptid nebol vyštiepený zo zrelého proteínu v Saccharomyces cerevisiae.
Referencie;
Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. and Lombardo, D. (1988) Biochim. Biophys. Acta. 961,299-308.
i
I
Baba, T.,’ Downs, D., Jackson, K.W., Táng, J. and Wang, C-S (1991) Biochemistry 30, 500-510.
Bläckberg, L. and Hemell, O. (1981) Eur. J. Biochem. 116, 221-225.
Bläckberg, L., Ängquist, K.A. and Hernell, O. (1987) FEBS Lett. 217, 37-41.
Cregg, J.M. et al. (1987) Bio/Technology 5, 479-485.
Ellis, S.B. et al. (1985) Mol. Celí. Biol. 5, 1111-1121.
Fredrikzon, B., Hernell, O., Bläckberg, L. and Olivecrona, T. (1978) Pediatrie Res. 12, 1048-1052.
Hansson, L., Bläckberg, L., Edlund, M., Lundberg, L., Strômqvist, M. and Hernell, O. (1993) J. Biol. Chem. 268, 26692-26698.
Hernell, O. and Olivecrona, T. (1974) Biochim. Biophys. Acta 369, 234244.
Hemell, O., Bläckberg, L and Olivecrona, T. (1989) in: Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy (Lebenthal, E., ed.) 347-354, Raven Press, NY.
Hemell, O. and Bläckberg, L. (1982) Pediatrie Res. 16, 882-885.
I
Hui, D. Y. and Kissel, J. A. (1990) FEBS Letters 276, 131-134.
Kingsman, etal. (1985) Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 3, 377-416.
Nilsson, J., Bläckberg, L., Carlsson, P., Enerbäck, S., Hemell, O. and Bjursell, G. (1990) Eur. J. Biochem. 192, 543-550.
Reue, K., Zambaux, J., Wong, H., Lee, G., Leete, ΤΉ., Ronk, M., Shively,
J.E., Stemby, B., Borgstrom, B., Ameis, D. and Scholtz, M.C. (1991)
J. Lipid. Res. 32, 267-276.
Wang, C-S, and Hartsuck, J.A. (1993) Biochim. Biphys Acta 1166, 1-19.
Deponovanie mikroorganizmov
Nasledujúce plazmidy, transformované do kultúr Pichia pastoris boli deponované podľa Budapeštianskej zmluvy v National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), Aberdeen, Schotland, UK. Dátum deponovania je 2.5. 1995.
Kmeň (plazmid) NCIMB č.
PPF-1 (pARC 5771) 40721
GS115 (pARC 5799) 40723
GS115 (pARC 5797)
40722
Tabuľka 1
Enzymatické aktivita supernatantov kultúr Pichia pastoris transformantov
Enzymatické aktivita v mg/l ekvivalentov natívneho BSSĹ
Hodiny po PPF-l(pARC 5771) GS115 (pARC 5799) GS115 (pARC 5797)
indukcii | č. 39 | Č.86 | Č.9 | č. 21 | Č .3 |
24 | 0,254 | 0,135 | 1,53 | 1,72 | 0,37 |
48 | 2,69 | 3,12 | 17,28 | 34,70 | 40,9 |
72 | 3,96 | 8,25 | 37,37 | 50,60 | 44,9 |
96 | 11,26 | 13,60 | 26,34 | 50, 60 | 35,6 |
120 | 8,42 | 13,13 | 13,60 | 22,30 | 17, 8 |
Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie:
(i) Prihlasovateľ:
(A) Meno: ASTRA AB (B) Ulica: Vastra Malarehamnen 9 (C) Mesto: Sodertälje (D) Štát: Švédsko (F) Poštový kód (ZIP): S-151 85 (G) Telefón: +46 8 553 260 00 (H) Telefax: +46 8 553 288 20 (I) Telex: 19237 astra s (ii) Názov vynálezu: DNA sekvencia na expresiu polipeptidov (iii) Počet sekvencií: 4 (iv) Počítačová čítacia forma:
(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release#1.0, verzia #1.30 (EPC (2) Informácie ku SEQ ID NO? 1:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 2428 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: nie (iv) Antisense: nie (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Homo sapiens (B) Typ tkaniva: mliečna žľaza (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 82...2319 (C) Iné informácie:/produkt = žlčovými soľami stimulovaná lipáza (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: exón (B) Umiestnenie: 985...1173 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: exón (B) Umiestnenie: 1174...1377 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: exón (B) Umiestnenie: 1378...1575 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: exón (B) Umiestnenie: 1576...2415 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: mat_peptid (B) Umiestnenie: 151...2316 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: poly A_signál (B) Umiestnenie: 2397...2402 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: repeat región (B) Umiestnenie: 1756...2283 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: 5'UTR (B) Umiestnenie: 1...81 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 1756...1821 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 1789...1821 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 1822...1854 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 1855...1887 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 1888...1920 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: repeatJednotka (B) Umiestnenie: 1921...1953 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 1954...1986 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 2020...2052 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: repeatJednotka (B) Umiestnenie: 2053...2085 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 2086...2118 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 2119...2151 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 2152...2184 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie; 2185...2217 (ix) Vlastnosti;
(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 2218...2250 (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 2251...2283 (x) Publikačné informácie;
(A) Autori: Nilsson, Jeanette
Blacberg, Lars Carlsson, Peter Enerback, Sven Hernell, Olle Bjursell, Gunnar (B) Názov: cDNA klonujúca žlčovými soľami stimulovanú lipázu ľudského mlieka a dôkazy jej identity s pankreatickou karboxylovou exterovou hydrolázou (C) Časopis: Eur. J. Biochem.
(D) Zväzok: 192 , ' (F) Strany: 543 - 550 (G) Dátum: September 1990 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 1:
ACCTTCTGTA TCAGTTAAGT GTCAAGATGG AAGGAACAGC AGTC. ľAAGA TAATGCAAAG
AGTTTATTCA TCCAGAGGCT G ATG Met | CTC ACC Leu Thr | ATG Met -20 | GCC CCC | - - -T L-t- | CAA CTG GTT | 111 | |||
Gly | Arg | Gin | Leu Val -'S | ||||||
-23 | |||||||||
CTG TTG | GGC CTC ACC TGC TGC | TGG GCA | GTG | GCG | AGT | 3-Σ2 | .j'iG | AAG CTG | 159 |
Val Leu | Gly Leu Thr Cys Cys -10 | Trp Ala -5 | Val | Ala | Ser | Ala 1 | Ľ/3 Leu | ||
GGC GCC | GTG TAC ACA GAA GGT | GGC TTC | GTG | GAA | GGC | AAT | AAG AAG | 207 | |
Gly Ala 5 | Val Tyr Thr Clu Gly 10 | Gly Phe | Val | Glu | Gly 15 | • 2.— | Asn | Lys Lys | |
CTC GGC | CTC CTG GGT GAC TCT | GTG GAC | ATC | TTC | AAG | ATC | CCC TTC | 255 | |
Leu Gly 20 | Leu Leu Gly Asp Ser 25 | Val Asp | íle | Phe 30 | Lys | •X—*» | íle | Pro Phe 35 | |
GCA GCT | CCC ACC AAG CCC CTG | GAA AAT | cct | CAG | CCA | CCT | GGC TGG | 303 | |
Ala Ala | Pro Thr Lys Ala Leu 40 | Glu Asn | Pro 45 | Gin | Pro | Pro | Gly Trp 50 | ||
CAA GGG | ACC CTG AAG CCC AAG | AAC TTC | AAG | AAG | ACA | ·“**» —· w | CTG | CAG GCC | 351 |
Gin Gly | Thr Leu Lys Ala Ly3 55 | Asn Pho 60 | Lys | Lys | Arg | Cvs | Leu. 65 | Gin Ala | |
ACC ATC | ACC CAG GAC AGC ACC | TAC CGG | GAT | GAA | GAC | X · | CTG | TAC CTC | 399 |
Thr íle | Thr Gin Asp Ser Thr 70 | Tyr Gly 75 | íle p | Glu | Asp | cys 80 | Leu | Tyr Leu | |
AAC ATT | TGC GTG CCC CAG GGC | AGG AAG | CAA | GTC | TCC | CCC | CAC | CTG CCC | 447 |
Ann Ilo 85 | Trp Val Pro Gin Gly 90 | Arg Lya | Gin | Val | Ser 95 | Arg | Asp | Leu Pro | |
CTT ATG | ATC TGC ATC TAT CCA | GGC GCC | TTC | CTC | ATG | CCC | TCC | CCC CAT | 49S |
Val Met 100 | íle Trp Ilo Tyr Gly 105 | Gly Ala | Phe | Leu 110 | Met | Cly | Ser | cly His 115 |
GGG | GCC | AAC | TTC | CTC | AAC | AAC | TAC | CTG | TAT | GAC | CGC | GAG | GAG | ATC | GCC | 543 | |
Gly | Ala | Asn | Phe | Leu | Asn | Asn | Tyr | LeU | Tyr | Asp | Gly | Glu | Glu | íle | Ala | ||
4 | 120 | 125 | 130 | ||||||||||||||
ACA | CCC | GCA | AAC | GTC | ATC | CTG | CTC | ACC | TTC | AAC | TAC | CCT | GTC | GGC | CCC | 591 | |
Thr | Arg | Gly | Asn | Val | Ilo | Val | Val | Thr | Phe | Asn | Tyr | Arg | Val | Gly | Pro |
135 140 145
CTT GGG TTC CTC AGC ACT GGG GAC GCC AAT CTG CCA GGT AAC TAT GGC 639
Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly
150 155 160
CTT CGG CAT CAG CAC ATG CCC ATT GCT TGC CTG AAG AGC AAT ATC GCG 687
LeU Arg Asp Gin His Met Ala íle Ala Trp Val Lys Arg Asn íle Ala
165 170 175
GCC Ala 180 | TTC.GGG CGG | GAC CCC | AAC AAC ATC | ACC Thr | CTC TTC CGG GAG TCT | GCT Ala 195 | |||||||||
Phe | Gly | Gly | Asp | Pro 185 | Asn | Asn | íle | Leu 190 | Phe | Gly | Glu | Ser | |||
GGA | GGT | CCC | AGC | GTC | TCT | CTG | CAG | ACC | CTC | TCC | CCC | TAC | AAC | AAG | GGC |
Gly | Gly | Ala | S«r | Val | Ser | Leu | Gin | Thr | Leu | Ser | Pro | Tyr | Asn | Lys | Cly |
200 | 205 | 210 | |||||||||||||
CTC | ATC | CGG | CCA | CCC | ATC | ACC | CAG | AGC | GGC | CTG | GCC | CTG | AGT | CCC | TGG |
Leu | íle | Arg | Arg | Ala | íle | Ser | Gin | Ser | Gly | Val | Ala | Leu | Ser | Pro | Trp |
215 | 220 | 225 |
831
GTC Val | ATC CAG AAA íle Gin Lys 230 | AAC Asn | CCA CTC TTC TGC GCC AAA AAG GTG: GCT GAG AAG | 879 | ||||||||||||
Pro | Leu | Phe 235 | Trp Ala | Lys | Lys | Val 240 | Ala | Glu | Lys | |||||||
GTC | GGT | TGC | CCT | GTG | GGT | GAT | GCC | GCC | AGG | ATG | GCC | CAG | TGT | CTG | AAG | 927 |
Val | Glv | Cys | Pro | Val | Gly | Asp | Ala | Ala | Arg | Met | Ala | Gin | Cys | Leu | Ly3 | |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
GTT | ACT | GAT | CCC | CGA | GCC | CTG | ACG | CTG | GCC | TAT | AAG | GTG | CCG | CTG | GCA | 975 |
Val | Thr | Asp | Pro | Arg | Ala | Leu | Thr | Leu | Ala | Tyr | Lya | Val | Pro | Leu | Ala | |
260 | 265 | 270 | 275 | |||||||||||||
GGC | CTG | GAG | TAC | CCC | ATG | CTG | CAC | TAT | GTG | GGC | TTC | GTC | CCT | GTC | ATT | 1023 |
Gly | Leu | Glu | Tyr | Pro | Met | Leu | Hio | Tyr | Val | Gly | Pho | Val | Pro | Val | íle | |
230 | 285 | 290 | ||||||||||||||
GAT | GCA | GAC | TTC | ATC | CCC | GCT | GAp | CCG | ATC | AAC | CTG | TAC | GCC | AAC | GCC . | 1071 |
Asp | Gly | Asp | Phe | Ilo | Pro | Ala | Asp | Pro | Ilo | Asn | Leu | Tyr | Ala | Asn | Ala ' | |
295 | 300 | 305 | ||||||||||||||
GCC | GAC | ATC | GAC | TAT | ATA | GCA | GGC | ACC | AAC | AAC | ATG | GAC | GGC | CAC | ATC | 1119 |
Ala | Asp | íle | Asp | Tyr | íle | Ala | Gly | Thr | Asn | Asn | Met | Asp | Gly | His | íle | |
310 | 315 | 320 | ||||||||||||||
TTC | GCC | AGC | ATC | GAC | ATG | CCT | GCC | ATC | AAC | AAG | GGC | AAC | AAG | AAA | CTC | 1167 |
Pho | Ala | Ser | Ilo | Asp | Mat | Pro | Ala | Ilo | Asn | Lys | Gly | Asn | Lyo | Lys | Val | |
325 | 330 | - | 335 | |||||||||||||
ACG | GAG | CAG | GAC | TTC | TAC | AAC | CTG | GTC | ACT | GAG | TTC | ACA | ATC | ACC | AAG | 1215 |
Thr | Glu | Glu | Asp | Phe | Tyr | Lys | Leu | Val | Ser | Glu | Phe | Thr | íle | Thr | Lys | |
340 | 345 | 350 | 355 | |||||||||||||
GCC | CTC | AGA | GGC | CCC | AAG | ACG | ACC | TTT | GAT | GTC | TAC | ACC | GAG | TCC | TGG | 1263 |
Gly | Leu | Arg | Gly | Ala | Lyo | Thr | Thr | Phe | Asp | Val | Tyr | Thr | Glu | Ser | Trp | |
360 | 365 | 370 | ||||||||||||||
GCC | CAG | GAC | CCA | TCC | CAG | GAG | AAT | AAG | AAG | AAG | ACT | GTG | GTG | GAC | TTT | 1311 |
Ala | Gin | Asp | Pro | Sor | Gin | Glu | Asn | Lyo | Lys | Lys | Thr | Val | Val | Asp | Pho | |
375 | 380 | 385 |
GAG ACC Glu Thr | GAT GTC CTC TTC | CTG GTG CCC | ACC CAG | ATT íle | CCC CTA GCC CAG · Ala Leu Ala Gin 400 | 13 5í | ||||||
Asp 390 | Val | Leu | Phe | Leu | Val 395 | Pro | Thr | Clu | ||||
CAC AGA | GCC | AAT | GCC | AAG | AGT | GCC | AAG | ACC | TAC | GCC | TAC CTG TTT TCC | 14 0'; |
His Arg 405 | Ala | Asn | Ala | Lys | Ser 410 | Ala | Lye | Thr | Tyr | Ala 415 | Tyr Leu Phe Ser | |
CAT CCC | TCT | CGC | ATG | CCC | GTC | TAC | CCC | AAA | TCG | GTG | GGG GCC GAC CAT | 1455 |
His Pro 420 | Ser | Arg | Met | Pro 425 | Val | Tyr | Pro | Lys | Trp 430 | Val | Gly Ala Asp His 1 435 | |
GCA GAT | CAC | ATT | CAG | TAC | GTT | TTC | GGG | AAG | CCC | TTC | GCC ACC CCC ACG | 1503 |
Ala Asp | Asp | íle | Gin 440 | Tyr | Val | Phe | Gly | Lys 445 | Pro | Phe | Ala Thr Pro Thr 450 | |
GGC TAC | CCG | CCC | CAA | GAC | AGG | ACA | GTC | TCT | AAG | GCC | ATG ATC GCC TAC | 1551 |
Cly Tyr | Arg | Pro 455 | Gin | A3p | Arg | Thr | Val 460 | Ser | Lys | Ala | Met íle Ala Tyr 465 | |
TGG ACC | AAC | ITT | CCC | AAA | ACA | GGG | GAC | CCC | AAC | ATG | GGC GAC TCG GCT | 1599 |
Trp Thr | Asn 470 | Phe | Ala | Lys | Thr | Gly 475 | Asp | Pro | Asn | Met | Gly Asp Ser Ala 480 | |
GTG CCC | ACA | CAC | TGG | GAA | CCC | TAC | ACT | ACG | GAA | AAC | AGC GGC TAC CTG | 1647 |
Val Pro 485 | Thr | His | Trp | Glu | Pro 490 | Tyr | Thr | Thr | Clu | Asn 495 | Ser Gly Tyr Leu |
GAG | ATC | ACC | AAG | AAG | ATG | GGC | AGC | AGC | TCC | ATG | AAG | CCG | AGC CTG AGA | 1695 |
Glu 500 | íle | Thr | Lys | Lys | Mec 505 | Gly | Ser | Sor | Ser | Met 510 | Lys | Arg | Sor Leu Arg 515 | |
ACC | AAC | TTC | CTG | CGC | TAC | TGG | ACC | CTC | ACC | TAT | CTG | CCG | CTG CCC ACA | 1743 |
Thr | Asn | Phe | Leu | Arg 520 | Tyr | Trp | Thr | Leu | Thr 525 | Tyr | Leu | Ala | 'Leu Pro Thr 530 | |
GTG | ACC | GAC | CAG | GAG | GCC | ACC | CCT | GTG | CCC | CCC | ACA | GGG | GAC TCC GAG | 1791 |
Val | Thr | Asp | Gin 535 | Glu | Ala | Thr | Pro | Val 540 | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp Ser Glu 545 | |
GCC | ACT | CCC | GTG | CCC | CCC | ACG | GGT | GAC | TCC | GAG | ACC | GCC | CCC CTC CCG | 1839 |
Ala | Thr | Pro 550 | Val | Pro | Pro | Thr | Gly 555 | Asp | Ser | Glu | Thr | Ala 560 | Pro Val Pro | |
CCC | ACG | GGT | GAC | TCC | GGG | GCC | CCC | CCC | CTG | CCG | CCC | ACG | GGT GAC TCC | 1887 |
Pro | Thr 565 | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala 570 | Pro | Pro | Val | Pro | Pro 575 | Thr | Gly Asp Ser | |
GGG | GCC | CCC | CCC | GTG | cca | CCC | ACG | GGT | GAC | TCC | GGG | GCC | CCC CCC GTG | 1935 |
Gly 580 | Ala | Pro | Pro | Val | Pro 585 | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser 590 | Gly | Ala | Pro Pro Val 595 | |
CCG | ccc | ACG | GGT | GAC | TCC | GGG | GCC | CCC | CCC | GTG | CCG | CCC | ACG GGT GAC | 1983 |
Pro | Pro | Thr | Gly | Asp 600 | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro 605 | Val | Pro | Pro | Thr Gly Anp 610 | |
rcc | GGG | GCC | CCC | CCC | GTG | CCG | CCC | ACG | GGT | GAC | TCC | GGG | GCC CCC CCC | 2031 |
Ser | Gly | Ala | Pro 61S | Pro | Val | Pro | Pro | Thr 620 | Gly | Asp | Sor | Gly | Ala Pro Pro 625 | |
GTG | ccc | CCC | ACG | GGT | GAC | TCC | GGC | GCC | CCC | CCC | GTG | CCG | CCC ACG GGT | • 2079 |
Val | Pro | Pro 630 | Thr | Gly | Asp | Sor | Gly 635 | Ala | Pro | Pro | Val | Pro 640 | Pro Thr Gly | |
GAC | GCC | CGG | CCC | CCC | CCC | GTG | CCG | CCC | ACG | GGT | GAC | TCC ' | GGC GCC CCC | 2127 |
Anp | Ala 645 | Gly | Pro | Pro | Pro | Val 650 | Pro | Pro | Thr | Gly Arp 655 | Ser 1 | Gly Ala Pro | ||
CCC | GTG | CCG | CCC | ACG | GGT | GAC | TCC | GGG | GCC | CCC | CCC | GTG | í ACC CCC ACG | 2175 |
Pro 660 | Val | Pro | Pro | Thr | Cly 665 | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro 670 | Pro | Val | Thr Pro Thr 675 | |
GGT | GAC | TCC | GAG | ACC | GCC | CCC | GTG | CCG | CCC | ACG | GGT | GAC | TCC CCS CCC | 2223 |
Gly | Asp | Ser | Glu | Thr 680 | Ala | Pro | Val | Pro | Pro 685 | Thr | Gly | Asp | Ser Gly Ala ó 90 | |
CCC | CCT | GTG | CCC | CCC | ACG | GGT | GAC | TCT | GAG | GCT | GCC | CCT | GTG CCC CCC | 2271 |
Pro | Pro | Val | Pro 695 | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser 700 | Glu | Ala | Ala | Pro | Val Pro Pro 705 | |
ACA | GAT | GAC | TCC | AAG | GAA | GCT | CAG | ATG | CCT | GCA | GTC | ATT | ACG TCT TAG | 2319 |
Thr | Ašp | Asp 710 | Ser | Lys | Glu | Ala | Gin 715 | Met | Pro | Ala | Val | íle 720 | Arg Pha * |
CGTCCCATGA GCCTTGGTAT CAAGAGGCCA CAAGAGTGCG ACCCCAGGGG CTCCCCTCCC 2379
ATCTTGAGCT CTTCCTGAAT AAAGCCTCAT ACCCCTAAAA AAAAAAAAA
2428 (2) Informácie o SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 746 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 2
Met -23 | Leu | Thr | Met -20 | Gly | Arg | Leu | Gin | Leu -15 | Val | Val | Leu | Gly | Leu -i·: | Thr Cy3 |
Cys | Trp | Ala -S | Val | Ala | Ser | Ala | Ala 1 | Lye | Leu | Gly | Ala 5 | Val | Tyr | Thr Glu |
Gly 10 | Gly | Phe | Val | Glu | Gly 1S | Val | Asn | Lys | Lys | Leu 20 | Gly | Leu | Leu | Gly Asp 25 |
Ser | Val | Asp | íle | Phe 30 | Lys | Gly | íle | Pro | Phe 35 | Ala | Ala | Pro | Thr | L‘.·s Ala 40 |
Leu | Glu | Asn | Pro 45 | Gin | Pro | His | Pro | Gly 50 | Trp | Gin | Gly | Thr | Leu 55 | Lys Ala |
Lys | Asn | Phe 60 | Lys | Lys | Arg | Cys | Leu 65 | Gin | Ala | Thr | íle | Thr 70 | Glr. | Asp Ser |
Thr | Tyr 75 | Gly | Asp | Glu | Asp | Cys 80 | Leu | Tyr | Leu | Asn | íle 85 | Trp | Val | Gin |
Gly 90'-· | Arg | Lys | Gin | Val | Ser 95 | Arg | Asp | Leu | Pro | Val 100 | Met | íle | Trp | íle Tyr 105 |
Gly | Gly | Ala | Phe | Leu 110 | Met | Gly | Ser | Gly | His 115 | Gly | Ala | Asn | Phe | Leu Asn 120 |
Asn | Tyr | Leu | Tyr 125 | Asp | Gly | Glu | Glu | íle 130 | Ala | Thr | Arg | Gly | Asn 135 | Val íle |
Val | Val | Thr | Phe | Asn | Tyr | Arg | Val | Gly | Pro | Leu | Gly | Phe | Leu | Ser Thr |
140 145 150
Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly Leu Arg Aep Gin His Hot 155 160 165
Ala. 170 | 11« | Ala | Trp | Val | Lys 17S | Arg | Asn | íle | Ala | Ala 180 | Phe | Gly | Gly | Asp Pro 185 |
Asn | Asn | íle | Thr | Leu 190 | Phe | Gly | Glu | Ser | Ala 195 | Gly | Gly | Ala | Ser | Val Ser 200 |
Leu | Gin | Thr | Leu 205 | Ser | Pro | Tyr | Asn | Lys 210 | Gly | Leu | íle | .Arg | Arg 215 | Ala íle |
Ser | Gin | Šer 220 | Gly | Val | Ala | Leu | Ser 225 | Pro | Trp | Val | íle | Gin 23 0 | Lys | Asn Pro |
Leu | 'Phe 235 | Trp | Ala | Lys | Lys | Val 240 | Ala | Glu | Lys | Val | Gly 24S | Cys | Pro | Val Gly |
Asp 250 | Ala | Ala | Arg | Met | Ala 255 | Gin | Cys | Leu | Lys | Val 260 | Thr | Asp | Pro | Arg Ala 265 |
Leu | Thr | Leu | Ala | Tyr 270 | Lys | Val | Pro | Leu | Ala 275 | Gly | Leu | Glu | Tyr | Pro Met 280 |
Leu | His | Tyr | Val 285 | Gly | Phe | Val | Pro | Val 290 | íle | Asp | Gly | Asp | Phe 295 | íle Pro |
Ala | Asp | Pro 300 | íle | Asn | Leu | Tyr | Ala 305 | Asn | Ala | Ala | Asp | íle 310 | Asp | Tyr íle |
Ala | Gly 315 | Thr | Asn | Asn | Met | Asp 320 | Gly | His | íle | Phe | Ala 325 | Ser | íle | Asp Met |
Pro 330 | Ala | íle | Asn | Lys | Gly 335 | Asn | Lys | Lye | Val | Thr 340 | Glu | Glu | Asp | Pho Tyr 345 |
Lys | Leu | Val | Ser | Glu 350 | Phe | Thr | íle | Thr | Lys 355 | Gly | Leu | Arg | Gly | Ala Lys 360 |
Thr | Thr | Phe | Asp 365 | Val | Tyr | Thr | Glu | Ser 370 | Trp | Ala | Gin | Asp | Pro 375 | Ser Cln |
Glu | Asn | Lys 380 | Lys | Lys | Thr | Val | Val 385 | Asp | Phe | Glu | Thr | Asp 390 | Val | Leu Phe |
Leu | Val 395 | Pro | Thr | Glu | íle | Ala 400 | Leu | Ala | Gin | His | Arg 405 | Ala | Asn | Ala Lys |
Ser 410 | Ala | Ly3 | Thr | Tyr | Ala 415 | Tyr | Leu | Pho | Ser | His 420 | Pro | Ser | Arg | Met Pro 425 |
Val | Tyr | Pro | Ly3 | Trp 430 | Val | Gly | Ala | Asp | His 435 | Ala | Asp | Asp | íle | Gin Tyr 440 |
Val | Phe | Gly, | Lys 445 | Pro | Phe | Ala | Thr | Pro 450 | Thr | Gly | Tyr | Arg | Pro 455 | Gin Asp |
Arg | Thr | Val 460 | Ser | Lys | Ala | Met | íle 465 | Ala | Tyr | Trp | Thr | Asn 470 | Phe | Ala Lys |
Thr | Gly 475 | Asp | Pro | Asn | Met | Gly 480 | Asp | Sor | Ala | Val | Pro 485 | Thr | His | Trp Glu |
Pro 490 | Tyr | Thr | Thr | Glu | Asn 495 | Ser | Gly | Tyr | Leu | Glu 500 | íle | Thr | Lye | Lye Met 50S |
Gly | Ser | Ser | Ser | Met 510 | Lys | Arg | Ser | Leu | Arg 515 | Thr | Acn | Phe | Leu | Arg Tyr 520 |
Trp | Thr | Leu | Thr 525 | Tyr | Leu | Ala | Leu | Pro 530 | Thr | Val | Thr | Asp | Gin 535 | Glu Ala |
Thr | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Glu | Ala | Thr | Pro | Val | Pro | Pro |
540 | 545 | 550 | |||||||||||||
Thr | Gly | Asp | Ser | Glu | Thr | Ala | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly |
555 | 560 | 565 | |||||||||||||
Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro |
570 | 575 | 580 | 585 | ||||||||||||
Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser |
590 | 595 | 600 | |||||||||||||
Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val |
605 | 610 | 615 | |||||||||||||
Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp |
620 | 625 | 630' | |||||||||||||
Ser .Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ala | Gly | Pro | Pro | Pro | |
635 | 640. | 645 | |||||||||||||
Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly |
650 | 655 | 660 | 665 | ||||||||||||
Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Thr | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Glu | Thr | Ala |
670 | 675 | 680 | |||||||||||||
Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro | Val | Pro | Pro | Thr |
685 | 690 | 695 | |||||||||||||
Gly | Asp. | Ser | Glu | Ala | Ala | Pro | Val | Pro | Pro | Thr | Asp | Asp | Ser | Lys | Glu |
700 | 705 | 710 | |||||||||||||
Ala | Gin | Met | Pro | Ala | Val | íle | Arg | Phe | * | ||||||
715 | 720 |
(2) Informácie ku SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 722 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec:
(D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (iii) Hypotetická: nie (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Homo sapiens (B) Typ tkaniva: mliečna žľaza (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 3:
Ala 1 | Lya | Leu | Gly | Ala 5 | Val | Tyr | Thr | Glu | Gly 10 | Gly | Phe | Val | Glu | Gly 15 | Val |
Asn | Lys | Lya- | Leu 20 | Gly | Leu | La u | Gly | Aep 25 | Ser | Val | Asp | íle | Phe 30 | Lya | Gly |
Ila | Pro | Pho 35 | Ala | Ala | Pro | Thr | Lys 40 | Ala | Leu | Glu | Asn | Pro 45 | Gin | Pro | His |
Pro | Gly 50 | Trp | Gin | Gly | Thr | L® u 55 | Lya | Ala | Lys | Asn | Phe 60 | Lys | Lys | Arg | Cys |
—30—
Leu 65 | Gin | Ala | Thr | 11« | Thr 70 | Gin | Asp | Ser | Thr | Tyr 75 | Gly | Asp | Glu | Asp | Cys 80 |
Leu | Tyr | Leu | Asn | íle 85 | Trp | Val | Pro | Gin | Gly 90 | Arg | Lys | Gin | Val | Ser 95 | Arg |
Asp | Leu | Pro | Val 100 | Met | íle | Trp | íle | Tyr 105 | Gly Gly | Ala | Phe | Leu 110 | Met | Gly | |
Ser | Gly | His 115 | Gly | Ala | Asn | Phe | Leu 120 | Asn | Asn | Tyr | Leu | Tyr 125 | Asp | Gly | Glu |
Glu | íle 130 | Ala | Thr | Arg | Gly | Asn 135 | Val | íle | Val | Val | Thr 140 | Phe | Asn | Tyr | Arg |
Val 145 | Gly | Pro | Leu | Gly | Phe 150 | Leu | Ser | Thr | Gly | Asp 155 | Ala | Asn | Leu | Pro | Gly 160 |
Asn | Tyr | Gly | Leu | Arg I6S | Asp | Gin | H4 s | Met | Ala 170 | íle | Ala | Trp | Val | Lys 175 | Arg |
Asn | íle | Ala | Ala 180 | Phe | Gly | Gly | Asp | Pro 185 | Asn | Asn | íle | Thr | Leu 190 | Phe | Cly |
Glu | Ser | Ala 195 | Gly | Gly | Ala | Ser | Val 200 | Ser | Leu | Gin | Thr | Leu 20S | Ser | Pro | Tyr |
Asn | Lys 210 | Cly | Leu | íle | Arg | Arg 215 | Ala | íle | Ser | Gin | Ser 220 | Gly | Val | Ala | Leu |
Ser 225 | Pro | Trp | Val | íle | Gin 230 | Ly3 | Asn | Pro | Leu | Phe 235 | Trp | Ala | Lys | Ly3 | Val 240 |
Ala | Glu | Lys | Val | Gly 245 | Cys | Pro | Val | Gly | Asp 250 | Ala | Ala | Arg | Met | Ala 25S | Gin |
Cys | Leu | Lys | Val 260 | Thr | Asp | Pro | Arg | Ala 265 | Leu | Thr | Leu | Ala | Tyr 270 | Lys | Val |
Pro | Leu | Ala 275 | Gly | Leu | Glu | Tyr | Pro 280 | Met | Leu | His | Tyr | Val 28S | Gly | Phe | Val |
Pro | Val 290 | íle | Asp | Gly | Asp | Phe 295 | íle | Pro | Ala | Asp | Pro 300 | íle | Asn | Leu | Tyr |
Ala 305 | Asn | Ala | Ala | Asp | íle 310 | Asp | Tyr | íle | Ala | Gly 315 | Thr | Asn | Asn | Met | Asp 320 |
Gly | His | íle | Phe | Ala | Ser | íle | Asp | Met | Pro | Ala | íle | Asn | Lys | Gly | Asn |
32S 330 335
Lys Ly3 Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Sar Clu Phe Thr 340 345 350
Ila Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr 355 360 . ' 365
Glu Ser Trp Ala Gin Asp Pro Ser Gin Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val 370 375 380
Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu íle Ala
385 390 395 400
Leu Ala Gin Hie Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr
405 410 415
Leu Pho Ser Hlo Pro Ser Arg Mot Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly 420 425 430
11» ><
Ala | Asp | His 435 | Ala | Asp | Asp | íle | Gin 440 | Tyr | Val | Phe | Gly | Lys 445 | Pro | ' Phe | Ala |
Thr | Pro 450 | Thr | Gly | Ty r | Arg | Pro 455 | Gin | Asp | Arg | Thr | Val 460 | Ser | Lys | Ala | Met |
Zle 4 55 | Ala | Ty r | Trp | Thr | Asn 470 | Phe | Ala | Lys | Thr | Gly 475 | Asp | Pro | Asn | Met | Gly 430 |
Äsp | S«r | Ala | Val | Pro 485 | Thr | His | Trp | Glu | Pro 490 | Tyr | Thr | Thr | Glu | Asn 495 | Ser |
Gly | Ty r | Leu | Glu 500 | íle | Thr | Lys | Lys | Het 505 | Gly | Ser | Ser | Ser | Het 510 | Ly3 | Arg |
Ser | Leu | Arg 515 | Thr | Asn | Pha | Leu | Arg 520 | Tyr | Trp | Thr | Leu | Thr 525 | Tyr | Leu | Ala |
Leu | Pre 53 0 | Thr | Val | Thr | Asp | Gin 535 | Glu | Ala | Thr | Pro | Val 540 | Pro | Pro | Thr | Gly |
Asp 545 | Sar | Glu | Ala | Thr | Pro 550 | Val | Pro | Pro | Thr | Gly 555 | Asp | Ser | Glu | Thr | Ala 560 |
Pro | Val | Pro | Pro | Thr 565 | Gly | Asp | Ser | Gly | Ala 570 | Pro | Pro | Val | Pro | Pro 575 | Thr |
—L·* | Asp | Ser | Gly 580 | Ala | Pro | Pro | Val | Pro 585 | Pro. Thr | Gly | Asp | Ser 590 | Gly | Ala | |
?ro | Pre | Val 595 | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp 600 | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro 605 | Val | Pro | Pro |
~~~ | Gly 610 | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro 615 | Pro | Val | Pro | Pro | Thr 620 | Gly | Asp | Ser | Gly |
λ^Λ 525 | Pro | Pro | Val | Pro | Pro 630 | Thr | Gly | Asp | Ser | Gly 635 | Ala | Pro | Pro | Val | Pro 640 |
Pro | Thr | Gly | Asp | Ala 645 | Gly | Pro | Pro | Pro | Val 650 | Pro | Pro | Thr | Gly | Asp 65S | Ser |
Ala | Pro | Pro 660 | Val | Pro | Pro | Thr | Gly 665 | Asp | Ser | Gly | Ala | Pro 670 | Pro | Val | |
“ v* | Pro | Thr 675 | Gly | Asp | Ser | Glu | Thr 680 | Ala | Pro | Val | Pro | Pro 685' | Thr | Gly | Asp |
C a *· | Gly 690 | Ala | Pro | Pro | Val | Pro 695 | Pro | Thr | Gly | Asp | Ser 700. | Glu | Ala | Ala | Pro |
Val 705 | Pro | Pro | Thr | Acp | Asp 710 | Ser | Lys | Glu | Ala | Gin 715 | Met | Pro | Ala | Val | íle 720 |
Arg Pha (2) Informácie o SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristiky sekvencie:
(A) Dĺžka: 568 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec:
(D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (iii) Hypotetická: nie (vi) Pôvodný zdroj:
(A) Organizmus: Homo sapiens (B) Typ tkaniva: mliečna žľaza (ix) Vlastnosti:
(A) Meno/Kľúč: peptid (B) Umiestnenie: 1...568 (C) Iné informácie:/značka =Variant_C (x) Publikačné informácie:
(A) Autori: Nilsson, Jeanette
Blacberg, Lars Carlsson, Peter Enerback, Sven Hernell, Olle Bjursell, Gunnar (B) Názov: Rekombinantná žlčovými soľami stimulovaná lipáza ľudského mlieka (C) Časopis: Eur. J. Biochem.
(D) Zväzok: 268 (E) Ročník: 35 (F) Strany: 26692-26698 (G) Dátum: 15.12.1993 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 4:
Ala 1 | Lys | Leu | Gly | Ala 5 | Val | Tyr | Thr | Glu | Gly Cly 10 | Phe | Val | Glu | Gly 15 | Val | |
Asn | Lys | Lys | Leu 20 | Gly | Leu | Leu | Gly | Asp 25 | Ser Val | Asp | íle | Phe 30 | Lys | Gly | |
» | íle | Pro | Phe 35 | Ala | Ala | Pro | Thr | Lys 40 | Ala | Leu Glu | Asn | Pro 45 | Gin | Pro | His |
* | Pro | Gly 50 | Trp | Gin | Gly | Thr | Leu 55 | Lys | Ala | Ly3 Asn | Pho 60 | Lys | Lys | Arg | Cys |
Leu 65 | Gin | Ala | Thr | Πβ | Thr 70 | Gin | Asp | Ser | Thr Tyr 7S | Gly | Asp | Clu | Asp | Cya 80 | |
Leu | Tyr | Leu | Asn | Ila 85 | Trp | Val | Pro | Gin | Cly Arg 90 | Lys | Gin | Val | Ser 95 | Arg | |
Asp | Leu | Pro | Val 100 | Met | íle | Trp | íle | Tyr 105 | Gly Gly Ala | Phe | Leu 110 | Met | Gly | ||
Ser | Gly | His 115 | Gly | Ala | Asn. | Phe | Leu 120 | Asn | Asn Tyr | Leu | Tyr 12S | Αερ | Gly | Glu | |
Glu | Ila 130 | Ala | Thr | Arg | Gly | Asn 135 | Val | íle | Val Val | Thr 140 | Pho | Asn | Tyr | Arg | |
* | Val 145 | Gly | Pro | Leu | Gly | Phe ISO | Leu | Ser | Thr | Cly Asp 155 | Ala | Asn | Leu | Pro | Cly 160 |
3 | Asn | Tyr | Gly | Leu | Arg 165 | Asp | Gin | Hio | Met | Ala íle 170 | Ala | Trp | Val | Lys 175 | Arg |
Asn | íle | Ala | Ala 180 | Phe | Gly | Gly | Asp | Pro 185 | Asn Asn | Ilo | Thr | Leu 190 | Phe | Gly | |
Glu | Ser | AJ a 195 | Cly | Gly | Ala | Ser | Val 200 | Ser | Leu Gin | Thr | Leu 205 | Sor | Pro | Tyr |
4-
Asn | Lys | Gly | Leu | íle | Arg | Arg | Ala | íle Ser | Gin | S«r Gly | Val | Ala | Leu |
210 | 215 | 220 | |||||||||||
Ser | Pro | Trp | Val | íle | Gin | Lys | Asn | Pro Leu | Ph« | Trp Ala | Lys | Lys | Val |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||
Ala | Glu | Lys | Val | Gly | Cys | Pro | Val | Gly Asp | Ala | Ala Arg | Met | Ala | Gin |
• | 245 | 250 | 2S5 | ||||||||||
Cys | Leu | Lys | Val | Thr | Asp | Pro | Arg | Alá Leu | Thr | Leu Ala | Tyr | Lys | Val |
260 | 265 | 270 | |||||||||||
Pro | Leu | Ala | Gly | Leu | Glu | Tyr | Pro | Met Leu | His | Tyr Val | Gly | Phe | Val |
275 | 280 | 235 | |||||||||||
Pro | Val | íle | Asp | Gly | Asp | Phe | íle | Pro Ala | Asp | Pro 11« | Asn | Leu | Tyr |
290 | 295 | - | - | 300 · | |||||||||
Ala | Asn | Ala | Ala | Asp | íle | Asp | Tyr | íle Ala | Gly | Thr Asn | Asn | Met | Asp |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||
Gly | His | íle | Phe | Ala | Ser | íle | Asp | Met Pro | Ala | íle Asn | Lys | Gly | Asn |
325 | 330 | 335 | |||||||||||
Lys | Lys | Val | Thr | Glu | Glu | Asp | Phe | Tyr L-.·s | Leu | Val Ser | Glu | Phe | Thr |
340 | 345 | 350 | |||||||||||
íle | Thr | Lys | Gly | Leu | Arg | Gly | Ala | Lys Thr | Thr | Phe Asp | Val | Tyr | Thr |
355 | - | • | 360 · | • | • | 365 | |||||||
Glu | Ser | Trp | Ala | Gin | Asp | Pro | Ser | Gin Glu | Asn | Lys Lys | Lys | Thr | Val |
370 | 375 | 330 | |||||||||||
Val | Asp | Phe | Glu | Thr | Asp | Val | Leu | Phe L-t u | Val | Pro Thr | Glu | íle | Ala |
385 390 395 400
Leu Ala Gin HÍ3 Arg Ala Asn Ala Lys Šer Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr 405 410. , 415
Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly 420 425 430
Ala Asp ΗΪ3 Ala Asp Asp 11« Gin Tyr Val Pha Gly Lys Pro Phe Ala . 435 440 445
Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gin Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met 450 455· 460
íle 465 | Ala | Tyr | Trp | Thr | Asn 470 | Phe | Ala | Lys | Thr | Gly 475 | Asp | Pro | Asn | Met | Gly 480 |
Asp | Ser | Ala | Val | Pro 485 | Thr | His | Trp | Glu | Pro 490 | Tyr | Thr | Thr | Glu | Asn 495 | Ser |
Gly | Tyr | LeU | Glu SOO | íle | Thr | Lys | Lys | Met 505 | Gly | Ser | Ser | Ser | Het 510 | Lys | Arg |
Ser | Leu | Arg 515 | Thr | Asn | Phe | Leu | Arg 520 | Tyr | Trp | Thr | Leu | Thr 525 | Tyr | Leu | Ala |
Leu | Pro 530 | Thr | Val | Thr | Asp | Gin 535 | Gly | Ala | Pro | Pro | Val 540 | Pro | Pro | Thr | Gly |
Asp 545 | Ser | Gly | Ala | Pro | Pro 550 | Val | Pro | Pro | Thr | Gly 555 | Asp | Ser | Lys | Glu | Ala 560 |
Gin Met Pro Ala Val íle Arg Phe 565
WO 96/37622
-Í5“
PCT/SE96AK)318
INDICATIONS RE LA TI N G T.O A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13ÓÓ)
A. The indications nude below relite to the rnicroorgmiini referred to ia tbc deicriptioa on page θ , lioe θ.
B. IDENTIFICATION OF DEPOSlľ Further deposia ire identified on »n addiuotul ibeei
Naxne of de po» i u ry iniututioa
The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB)
Addrexi of depositary initjtutícn (uscItUtngposlil code ud eauttry)
St Machar Drive Aberdeen AB2 1RY Scotiand, UK
Dáte of depaeit | Accasion Number |
2 May 1995 | NCIMB 40721 |
C. ADDmONAL INDICATIONS (Zeaveblaxi if aot tpfdicM:) Thii infonnetíoa a coatinaed on »n idditlcoil sbeet
In respect of all designated States in which súch action is possible and to the extern that it is legally permissible under the law of the designsted state, it is requested that a sample of the deposŕted micro-organism be rnade available onfy by the issue thereof to an indepondent expert, in accordance with the relevant patent legislation, e.g. Rule 28(4) EPC, and generally similar provisions mutatis murandis for any other designated state. .
D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (>f trt tet for tU kápMíal Si&
E. SEPARÁTE FURNTSH1NG OF INDICATIONS /ZoveiWifxot ippGcMj
The indicatioru listed below will besubmilted to the lnienutional Bureau Uter (spcôfyikegenerálnetere efiheix£cttion}c.g., Mrrrm Netxbcr of Depošt*} - · .
' For receiving Office use only
This xheet wu received with the interní tionil ipplication
For Intenutkxul Bureiu tne only f' 1 Thil iheet wis received by the Interní honil Búra n er
Authonzed officer
Autborized officer
CHRISTINA SENFTEN
Fonn PCT/RO/134 (July 1992)
WO 96/37622
-36,
PCT/SE96/00318
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13ó£r)
A- The indiejtiom nude below relite to tbe tniarooranúra referred to in tbe deicripóoa ,· 13-20 on poge __, lme ___
B. IDENTIFICATION OFDEPOSrT
Furthcr deposiu tre idcntifjed on »n additxxul theet j~
Nime of dcpocitiry imrituóoa
The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB)
Addrexc of depoiitary imtitution (ixcht£agpostilcoit txi cauxtry)
St Machar Drive Aberdeen AB2 1RY Scotiand, UK
Dete of depasit
May 1995
Acceuioo Number
NCIMB 40723
C. ADDITIONAL INDICATIONS bíutk if aot ippGccíí:) Tbii Information ô continued oa m sdditioeul ibeet [ [
In respect of all designated States in which súch action is possibla and to the exteňt that ŕt is legalfy permissible under the law of the designated state, it is requested thaťa sample of the deposŕted micro-organism ba mada available only by the issue thereof to an indapendent expert, in accordance with tha relevant patent legislation, a.g. Ruta 28(4) EPC, and generally sirrular proyisions mistatis mutandis for any other designated state.
D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE
E. SEPARÁTE FURNISHING OF INDICATIONS (íeove bhná if^ot ippt&ók)
The indicalioru liitcdbelow will be jubmilted to tbe Interrutiorul Burciu later (specify tkegenerálnabtrc of tkeia&celiom e^, Actcoit Ntuobcr of Depozit) ' '
For receivíng Office me only
For Intenutional B určia uie oaly
Tbii xbeet wu reocivcd with tbc intematkwul ipplication | | Thii ibeet wxj received by the Intenutional Borca u eru
Authorized ofBccr
Authorized officer
CHRISTINA SENFTEN
Forca PCTZÄO/l X (July 1992)
WO 96737622
-37_
PCTZSE96/00318
INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13ótí)
A. Tbc indicitioni nude beJow relale to tbc tnicrooremhrn referred to in tbc dcscripóoa >·„. 18-19 oa pige *, Ime.
B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further depotitt tre identiCcd oo m idditioail iheet
Nuoc of depoiitiry tmuruiioa
Tha National Coliactions of Industrial and Marine Bactaria Limited (NCIMB)
Addrcxx of depositary nuútutioo (ιλ:1*£λ[ pastel c&ie t*áccastry)
St Machar Drive Aberdeen AB2 1RY Scodand, UK
Dáte of dcpaait 2 May 1995
Acceuioo Nutnber
NCIMB 40722
C. ADDrnONÁL INDICATIONS (l&nv hlasí if κο( tppGcablc} Thia informaboa á ccnteued oa an addjttcoi] sbcet
In respact of all designatad States in which súch actíon is possibla and to tha extern that it is legally permissible undar tha iaw of tha designatad state, it is requested that a ssmple of tha dapositad micro-organism ba mada a va i to big cniy by tha issua therecf to en independent export, in accordanca with tha ralavant patent lagislation, a.g. Ruta 28(4) EPC, and genaralfy similsr provisions mutatis mutandís for any othar designatad stata. ·
D. DESIGNATÉD STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (Iftieh&tiixtt tnsotfor tB Αραιοί Stok
E. SEPARÁTE FURNISHING OF INDICATIONS (love hlasí tfaet tppCatbl^
The iná taliani lixtedbelowwillbcsubrniited (o tiu: lnternatiotulBurcauUterp/>ec(frtáe;ovre/*‘a<re<ytAetai££ittňare£, 'Xnzxt
Nmber ofDcpaôť)
For rccciving Office uie only
Tbix xbeet wu rccervcd with tbe intcrrutiotul appliatioa ——-· For Interná tksoal Borca u usc ooJy —— f | Tbňt theet wrs reccived by tbe International Burean a
Fonn PCTXO/154 (July 1992)
Autborized ofBoer
Autborized ofEcer
CHRIST1NA SENFTEN
Claims (14)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. DNA molekula obsahujúca:(a) región kódujúci polypeptid, ktorý je ľudská BSSL alebo jej biologicky aktívna forma (b) región kódujúci signálny peptid schopný riadenia sekrécie uvedeného polypeptidu z Pichia pastoris transformovanej uvedenou DNA molekulou pripojený na 5'-koniec regiónu, ktorý kóduje uvedený polypeptid, a (c) metanol oxidázový promotor Pichia pastoris alebo funkčne ekvivalentný < promotor operatívne naviazaný na uvedené kódujúce regióny definované v (a) a (b).
- 2. DNA molekula podľa nároku 1, kde uvedený signálny peptid je identický s, alebo významne podobný s, peptidom s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako aminokyseliny -20 až -1 SEQ ID NO: 1 v zozname sekvencií.
- 3. DNA molekula podľa nároku 1, kde uvedený signálny peptid obsahuje invertázový signálny peptid Saccharomyces cerevisiae.
- 4. DNA molekula podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 kódujúca biologicky aktívnu variantu BSSL, v ktorej je aspoň jedna z opakujúcich sa jednotiek s 11 » aminokyselinami. deletovaná, kde uvedené opakujúce sa jednotky sú ‘ vyznačené v SEQ ID NO: 1.
- 5. DNA molekula podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4 kódujúca polypeptid, ktorý má BSSL aktivitu a aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň na 95 % homológna so sekvenciou podľa SEQ ID NO: 3 alebo SEQ ID NO: 4.
- 6. DNA molekula podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 kódujúca polypeptid, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ ID NO: 3 alebo SEQ ID NO: 4.
- 7. Vektor obsahujúci DNA molekulu podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 6.
- 8. Replikovateľný expresný vektor podľa nároku 7, ktorý je schopný sprostredkovať expresiu ľudskej BSSL, alebo jej biologicky aktívnej varianty, v bunkách Pichia pastoris.
- 9. Vektor podľa nároku 8, ktorý je plazmidový vektor pARC 5771 (NCIMB 40721), pARC 5799 (NCIMB 40723) alebo pARC 5797 (NCIMB 40722).
- 10. Hostiteľské bunky rodu Pichia transformované vektorom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 7 až 9.
- 11. Hostiteľské bunky podľa nároku 10, ktoré sú Pichia pastoris bunky.
- 12. Hostiteľské bunky podľa nároku 11, ktoré sú Pichia pastoris bunky kmeňaGS115.
- 13. Hostiteľské bunky podľa nároku 12, ktoré sú PPF-1 (pARC 5771) (NCIMB 40721), GS115( pARC 5799 )(NCIMB 40723) alebo GS115(pARC 5797) (NCIMB 40722).
- 14. Spôsob na produkciu polypeptidu, ktorý je ľudská BSSL, alebo jej biologicky aktívny variant, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kultiváciu hostiteľských buniek podľa akéhokoľvek z nárokov 10 až 13 v podmienkach, kedy je uvedený peptid secernovaný do kultivačného média, a získanie uvedeného polypeptidu z kultivačného média.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IN351MA1995 | 1995-03-23 | ||
SE9501939A SE9501939D0 (sv) | 1995-05-24 | 1995-05-24 | DNA molecules for expression of polypeptides |
PCT/SE1996/000318 WO1996037622A1 (en) | 1995-05-24 | 1996-03-12 | A dna molecule for expression of bile salt-stimulated lipase (bssl) |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK125697A3 true SK125697A3 (en) | 1998-05-06 |
Family
ID=26324779
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK1256-97A SK125697A3 (en) | 1995-03-23 | 1996-03-12 | A dna molecule for expression of bile salt-stimulated lipase (bssl) |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20030040040A1 (sk) |
AR (1) | AR001410A1 (sk) |
AU (1) | AU715297B2 (sk) |
BR (1) | BR9607920A (sk) |
CA (1) | CA2172447A1 (sk) |
GB (1) | GB2299085B (sk) |
HK (1) | HK1011048A1 (sk) |
IE (1) | IE960211A1 (sk) |
NO (1) | NO974318L (sk) |
NZ (1) | NZ286234A (sk) |
SK (1) | SK125697A3 (sk) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2024133849A1 (en) * | 2022-12-22 | 2024-06-27 | The Protein Brewery B.V. | Ovalbumin fermentation |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0464922A1 (en) * | 1990-07-06 | 1992-01-08 | Unilever N.V. | Production of active pseudomonas glumae lipase in homologous or heterologous hosts |
WO1992005249A1 (en) * | 1990-09-13 | 1992-04-02 | Novo Nordisk A/S | Lipase variants |
JPH07111891A (ja) * | 1993-09-30 | 1995-05-02 | Meiji Milk Prod Co Ltd | 組換え胆汁酸塩活性化リパーゼの高収率発現方法 |
-
1996
- 1996-03-12 SK SK1256-97A patent/SK125697A3/sk unknown
- 1996-03-12 BR BR9607920A patent/BR9607920A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-03-12 IE IE960211A patent/IE960211A1/en not_active IP Right Cessation
- 1996-03-13 AU AU48033/96A patent/AU715297B2/en not_active Ceased
- 1996-03-21 NZ NZ286234A patent/NZ286234A/en unknown
- 1996-03-22 CA CA002172447A patent/CA2172447A1/en not_active Abandoned
- 1996-03-22 GB GB9606023A patent/GB2299085B/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-03-22 AR AR33588496A patent/AR001410A1/es unknown
-
1997
- 1997-09-19 NO NO974318A patent/NO974318L/no not_active Application Discontinuation
-
1998
- 1998-11-10 HK HK98111871A patent/HK1011048A1/xx not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-10-13 US US09/418,176 patent/US20030040040A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU715297B2 (en) | 2000-01-20 |
NZ286234A (en) | 1997-07-27 |
AU4803396A (en) | 1996-10-03 |
NO974318L (no) | 1997-11-11 |
NO974318D0 (no) | 1997-09-19 |
US20030040040A1 (en) | 2003-02-27 |
CA2172447A1 (en) | 1996-09-24 |
BR9607920A (pt) | 1998-06-09 |
GB2299085B (en) | 1999-03-17 |
GB2299085A (en) | 1996-09-25 |
AR001410A1 (es) | 1997-10-22 |
HK1011048A1 (en) | 1999-07-02 |
IE960211A1 (en) | 1996-10-02 |
GB9606023D0 (en) | 1996-05-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI113474B (fi) | Pichia pastoris-hiivan happaman fosfataasin geenin DNA-kappale | |
US6090574A (en) | Process for preparing a protein by a fungus transformed by multicopy integration of an expression vector | |
FI104497B (fi) | DNA-sekvenssi, joka koodittaa hiivan alkoholioksidaasi II:n säätelyaluetta | |
den Herder et al. | Cloning and expression of a member of the Aspergillus niger gene family encoding α-galactosidase | |
US5795776A (en) | Expression plasmids regulated by an OSMB promoter | |
JPH08507695A (ja) | Eg ▲iii▼セルラーゼの精製及び分子クローニング | |
DE60036647T2 (de) | Klonierung und expression einer extrazellulären säurebeständigen lipase aus yarrowia lipolytica | |
US5705358A (en) | Process for producing/secreting a protein by a transformed mould using expression/secretion regulating regions derived from a aspergillus endoxylanase II gene | |
US5516679A (en) | Penicillin V amidohydrolase gene from Fusarium oxysporum | |
KR19980703238A (ko) | 답즙산염-자극 리파제(bssl)의 발현을 위한 dna 분자 | |
SK125697A3 (en) | A dna molecule for expression of bile salt-stimulated lipase (bssl) | |
JPH08336387A (ja) | ピキア属酵母由来の糖鎖伸長タンパク及びそのdna | |
Phongdara et al. | Cloning and characterization of the gene encoding a repressible acid phosphatase (PHO1) from the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha | |
FI120589B (fi) | Modifioituja Kluyveromyces-hiivoja, niiden valmistus ja käyttö sekä menetelmä yhdistelmä-DNA-proteiinien tuottamiseksi | |
CA2325571A1 (en) | Promoter and constructions for expression of recombinant proteins in filamentous fungi | |
EP0704527A2 (en) | DNA sequences encoding biosynthetic insulin precursors and process for prepation of insulin | |
JP3329472B2 (ja) | 新規な真菌発現系 | |
Daldal et al. | Cloning and expression of Clostridium pasteurianum galactokinase gene in Escherichia coli K-12 and nucleotide sequence analysis of a region affecting the amount of the enzyme | |
JPH08510905A (ja) | ブレビバクテリウム・ステロリカム由来のコレステロールオキシダーゼ | |
EP0570096B1 (en) | Ornithine carbamoyl transferase gene and its use as a marker gene in a host-vector system for the production of proteins in basidiomycetes | |
EP0154350A2 (en) | Novel expression plasmids containing the full cDNA sequence of calf prochymosin | |
JPH04229188A (ja) | 融合タンパク質の試験管内プロセシング | |
MXPA97006853A (en) | A dna molecule for expression of bile salt-stimulated lipase (bssl) | |
DE60120456T2 (de) | Neue lösliche endoproteasen für die in vitro prozessierung von rekombinanten proteinen | |
JP3379133B2 (ja) | オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子およびその利用 |