SK125697A3

SK125697A3 - A dna molecule for expression of bile salt-stimulated lipase (bssl)

Info

Publication number: SK125697A3
Application number: SK1256-97A
Authority: SK
Inventors: Goutam Das
Original assignee: Astra Ab
Priority date: 1995-03-23
Filing date: 1996-03-12
Publication date: 1998-05-06
Also published as: AU715297B2; NZ286234A; AU4803396A; NO974318L; NO974318D0; US20030040040A1; CA2172447A1; BR9607920A; GB2299085B; GB2299085A; AR001410A1; HK1011048A1; IE960211A1; GB9606023D0

Description

DNA molekula na expresiu žlčovými soľami stimulovanej lipázy (BSSL)

Oblasť techniky

Vynález sa týka DNA molekúl, rekombinantných vektorov a bunkových kultúr na použitie v metódach na expresiu žlčovými soľami stimulovanej lipázy (BSSL) v metylotrofickej kvasinke Pichia pastoris.

Doterajší stav techniky

Žlčovými soľami stimulovanej lipáze (BSSL) (pozri Wang and Hartsuck, 1993) sa pripočítava väčšina lipolytickej aktivity ľudského mlieka. Charakteristickou vlastnosťou tejto lipázy je to, že vyžaduje primárnu žlčovú soľ na aktivity proti emulzifikovaným triacylglycerolom s dlhým reťazcom. BSSL bola doteraz nájdená len v mlieku od ľudí, goríl, mačiek a psov (Hernell et al., 1989).

BSSL bola prisúdená zásadná úloha pri trávení mliečnych lipidov v čreve kojených detí (Fredrikzon et al., 1978). BSSL je syntetizovaná u ľudí v laktujúcej mliečnej žľaze a je secernovaná s mliekom (Blacberg et al., 1987). Tvorí asi 1 % celkových mliečnych proteínov (Blackberg and Hernell, 1981).

Bolo predpokladané, že BSSL je hlavným limitujúcim faktorom pri absorpcii tukov a následnom raste, hlavne nezrelých detí, ktoré majú deficientnú ich vlastnú produkciu BSSL, a že suplementácia prípravkami s purifikovaným enzýmom signifikantne zlepšuje trávenie a rast týchto detí (US 4944944, Oklahoma Medical ' Research Foundation). Toto je klinicky významné pre prípravu detských prípravkov, ktoré obsahujú relatívne vysoké percento triglyceridov, a ktoré sú založené na rastlinných proteínoch alebo na proteínoch iných ako z ľudského mlieka, pretože deti kŕmené týmito prípravkami nie sú schopné tráviť tuk za neprítomnosti pridané BSSL.

cDNA štruktúry ako pre mliečnu BSSL, tak pre pankreatickú karboxylovú ester hydrolázu (CEH) boli charakterizované (Baba et al., 1991, Hui and Kissel, 1991, Nilsson et al., 1991, Reue et al., 1991) a bol vyvodený záver, že mliečny enzým a pankreatický enzým sú produktmi rovnakého génu, CEL génu. cDNA sekvencia (SEQ ID NO: 1) CEL génu je popísaná v US 5200183 (Oklahoma Medical Research Foundation ), WO 91/18293 (Aktiebolaget Astra), Nilsson et al., (1990), a Baba et al., (1991). Dedukovaná aminokyselinová sekvencia BSSL, vrátane signálnej sekvencie s 23 aminokyselinami je ukázaná ako SEQ ID NO: 2 v zozname sekvencii, zatiaľ čo sekvencia natívneho proteínu s 722 aminokyselinami je ukázaná ako SEQ ID NO: 3.

C-terminálny región proteínu obsahuje 16 repeatov, každý s 11 aminokyselinami, po ktorých nasleduje 11 aminokyselín konzervovaného úseku. Natívny proteín je vysoko glykozylovaný a bol popísaný veľký rozsah pozorovaný molekulových hmotností. Toto môže pravdepodobne byť vysvetlené rôznym rozsahom glykozylácie (Abouakil et al., 1988). N-terminálna polovica proteínu je homológna s acetylcholín esterázou a niektorými inými esterázami (Nilsson et al., 1990).

Rekombinantné BSSL môže byť produkované expresiou vo vhodných hostiteľských bunkách ako je E. coli, Saccharomyces cerevisiae, alebo v cicavčích bunkových líniách. Na zvýšenie BSSL expresného systému na dosiahnutie komerčne uplatniteľnej produkcie môže byť počítané s použitím heterológnych expresných systémov. Ako bolo uvedené vyššie, ľudský BSSL má 11 repeatov s 11 aminokyselinami na C-terminálnom konci. Na určenie biologickej dôležitosti týchto opakujúcich sa regiónov boli konštruované rôzne mutanty ľudského BSSL, ktorým chýbala časť alebo všetky tieto opakujúce sa regióny (Hansson et al., 1993).

Variant BSSL-C (SEQ ID NO; 4), napríklad má deléciu od aminokyselinového zvyšku 591 do 711. Expresné štúdie s použitím cicavčej bunkovej línie C127 ako ' 1 .

hostiteľa a expresného vektora hovädzieho papilôma vírusu ukázali, že rôzne varianty môžu byť exprimované v aktívnej forme (Hansson et al., 1993). Z expresných štúdií bolo tiež odvodené, že na prolín bohaté repeaty v ľudskom BSSK nie sú zásadné pre katalytickú aktivitu alebo aktiváciu BSSL žlčovými soľami. Avšak produkcia BSSL alebo jej mutantov v cicavčích expresných systémoch by mohla byť príliš nákladná na rutinné terapeutické použitie.

Eukaryotické systémy, ako sú kvasinky, môžu poskytnúť signifikantné výhody v porovnaní s prokaryotickými systémami, na produkciu istých polypeptidov

J kódovaných rekombinantnou DNA. Napríklad, kvasinky môžu byť vo všeobecnosti kultivované vo vyšších bunkových hustotách ako baktérie a môžu byť schopné glykozylácie exprimovaných polypeptidov tam, kde je taká glykozylácia významná pre biologickú aktivitu. Avšak použitie kvasinky Saccharomyces cerevisiae ako hostiteľského organizmu často vedie k nízkym hladinám expresie a slabej sekrécii rekombinantného proteínu (Cregg et al., 1987). Maximálne hladiny heterológnych proteínov sú pri Saccharomyces cerevisiae v oblasti 5 % celkových bunečných proteínov (Kingsman et al., 1985). Ďalšou nevýhodou použitia Saccharomyces cerevisiae ako hostiteľa je to, že rekombinantné proteíny majú tendenciu byť nadmerne glykozylované, čo môže ovplyvniť aktivitu glykozylovaných cicavčích proteínov.

Pichia pastoris je metylotrofná kvasinka, ktorá môže rásť na metanole ako jedinom zdroji uhlíka a energie, pretože obsahuje vysoko regulovanú dráhu využitia metanolu (Ellis et al., 1985). Pichia pastoris je tiež prístupná účinnej fermentačnej technológii s vysokou hustotou buniek. Preto rekombinantná DNA technológia a účinné metódy na transformáciu kvasiniek umožňujú vyvinúť Pichia pastoris ako hostiteľa pre expresiu heterológnych proteínov vo veľkom množstve, s expresným systémom založeným na promotore metanol oxidázy (Cregg et al., 1987).

V odbore je známe použitie Pichia pastoris ako hostiteľa na expresiu napr. nasledujúcich heterológnych proteínov: ľudského tumor nekrozis faktoru (EP-A0263311), Bordetella pertactin antigénu (WO 91/15571), povrchového antigénu hepatitídy B (Cregg et al., 1987), ľudského lyzozýmového proteínu (WO 92/04441), aprotinínu (WO 92/01048). Avšak, úspešná expresia heterológnych proteínov v aktívnej, solubilnej a secernovanej forme závisí na mnohých faktoroch, napr. správnej voľbe signálneho peptidu, správnej konštrukcii fúzneho spojenia medzi signálnym peptidom a zrelým proteínom, kultivačných podmienkach, atď.

Podstata vynálezu

Účelom vynálezu je prekonať vyššie uvedené nedostatky skôr uvedených systémov a poskytnúť metódu na produkciu ľudského BSSL, ktorá by bola finančne efektívna a ktorá by dávala výťažok porovnateľný, alebo vyšší, ako produkcia v iných organizmoch. Tento účel bol dosiahnutý poskytnutím metódy na expresiu BSSL v bunkách Pichia pastoris.

Týmto vynálezom je preto ukázané, že ľudská BSSL a variantná BSSL-C môžu byť exprimované v aktívnej forme a secernované z Pichia pastoris. Natívny signálny peptid, rovnako ako heterológny signálny peptid odvodený od Saccharomyces cerevisiae invertázového proteínu boli použité na translokáciu zrelého proteínu do kultivačného média v aktívnej, správne spracovanej forme.

V prvom aspekte poskytuje vynález DNA molekulu obsahujúcu:

a) región kódujúci polypeptid, ktorým je ľudská BSSL alebo jej biologicky aktívny variant,

b) spojený 5'-koniec uvedeného polypeptid kódujúceho regiónu, regiónu kódujúceho signálny peptid schopný riadenia sekrécie uvedeného polypeptidu z buniek Pichia pastoris transformovaných uvedenou molekulou DNA, a

c) promotor metanol oxidázy Pichia pastoris alebo funkčne ekvivalentný promotor operatívne naviazaný na uvedené kódujúce regióny definované v (a) a (b).

Termínom biologicky aktívny variant BSSL je mienený polypeptid majúci BSSL aktivitu a obsahujúci časť aminokyselínovej sekvencie ukázanej v SEQ ID NO: 3 v zozname sekvencií. Termínom polypeptid majúci BSSL aktivitu je v tomto kontexte mienený polypeptid majúci nasledujúce vlastnosti: (a) je vhodný na orálne podanie, (b) je aktivovaný špecifickými žlčovými soľami, a (c) účinkuje ako 'nešpecifická lipáza v obsahu tenkého čreva, t. j. je schopný hydro,lyžovať lipidy relatívne nezávisle na ich chemickej štruktúre a fyzikálnom stave (emulzifikované, micelárne, solubilné).

Uvedený BSSL variant môže byť napr. variant, ktorá obsahuje menej ako 16 opakujúcich sa jednotiek, kde opakujúcou sa jednotkou je mienená opakujúca sa jednotka s 11 aminokyselinami, kódovaná nukleotidovou sekvenciou ukázanou ako opakujúca sa jednotka pod nadpisom (ix) Vlastnosti v Informácii o SEQ ID NO: 1 v zozname sekvencií. Jednotlivo, variantom BSSL môže byť varianta BSSL-C, v ktorom sú aminokyseliny 536 až 568 a 591 až 711 deletované (SEQ ID NO: 4 v zozname sekvencií). V súlade s tým je DNA molekula podľa vynálezu výhodne DNA molekula, ktorá kóduje BSSL (SEQ ID NO: 3) alebo BSSL-C (SEQ ID NO: 4).

Avšak, DNA molekuly podľa vynálezu nie sú prísne obmedzené na DNA molekuly, ktoré kódujú polypeptidy s aminokyselinovou sekveciou identickou s SEQ ID NO: 3 alebo 4 v zozname sekvencií. Skôr vynález zahŕňa DNA molekuly, ktoré kódujú polypeptidy nesúce modifikácie ako sú substitúcie, malé delécie, inzercie alebo inverzie, pričom však tieto polypeptidy majú biologickú aktivitu BSSL. Vo vynáleze sú následne obsiahnuto DNA molekuly kódujúce varianty BSSL ako boli uvedené vyššie a tiež DNA molekuly kódujúce polypeptidy, ktorých aminokyselinová sekvencia je aspoň na 90 % homológna, lepšie aspoň na 95 % homológna s aminokyselinovou sekveciou ukázanou ako SEQ ID NO: 3 alebo 4 v zozname sekvencií.

Signálnym peptidom popísaným vyššie môže vyť peptid, ktorý je identický, alebo významne podobný s peptidom s aminokyselinovou sekvenciou ukázanou ako aminokyseliny -20 až -1 SEQ ID NO: 2 v zozname sekvencií. Alternatívne, môže to byť peptid, ktorý obsahuje invertázový signálny peptid Saccharomyces cerevisiae.

V ďalšom aspekte poskytuje predkladaný vynález vektor obsahujúci DNA molekulu ako je definovaná vyššie. Výhodne je taký vektor replikovateľný expresný vektor, ktorý nesie a je schopný sprostredkovať expresiu DNA sekvencie kódujúcej ľudskú BSSL alebo jej biologicky aktívnu variantu v bunkách rodu Pichia. Takým vektorom môže napríklad byť vektor pARC 5771 (NCIMB 40721), pARC 5799 (NCIMB 40723) alebo pARC 5797 (NCIMB 40722).

V inom aspekte poskytuje vynález kultúru hostiteľských buniek, ktorá obsahuje bunky rodu Pichia transformované DNA molekulou alebo vektorom ako boli definované vyššie. Výhodne sú uvedenými hostiteľskými bunkami bunky Pichia pastoris kmeňov ako je napríklad PPF-1 alebo GS115. Uvedenými bunkovými kultúrami môžu byť napríklad kultúry PPF-1 (pARC 5771) (NCIMB 40721), GS115 pARC 5799 (NCIMB 40723) alebo GS115 pARC 5797 (NCIMB 40722).

Ešte v inom aspekte poskytuje vynález postup na produkciu polypeptidu, ktorým je ľudská BSSL, alebo jej biologicky aktívny variant, pričom uvedený postup obsahuje kultiváciu uvedených hostiteľských buniek podľa vynálezu v podmienkach, kedy je uvedený polypeptid secernovaný do kultivačného média a získanie uvedeného polypeptidu z kultivačného média.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1: Expresia BSSL v Pichia pastoris PPF-1

1.1. Konštrukcia pARC 0770 cDNA sekvencia (SEQ ID NO: 1) kódujúca BSSL proteín, obsahujúca natívny signálny peptid (ďalej označovaný ako NSP) bola klonovaná v pTZ19R (Pharmacia) ako EcoRI-SacI fragment. Klonovanie NSP-BSSL cDNA do Saccharomyces cerevisiae expresného vektora pSCW 231 (získaného od profesora L. Prakashe, University of Rochester, NY, USA), ktorý je kvasinkovým expresným vektorom s nízkym počtom kópií, kde je expresia pod kontrolou konštitutívneho ADH1 promotora, bolo dosiahnuté v dvoch krokoch. Najprv bola NSP BSSL cDNA klonovaná do pYES2.0 (Invitrogen, USA) ako EcoRI-Sphl fragment z pTZ19R-SP-BSSL. Prebytočných 89 bázových párov medzi EcoRi a Ncol na začiatku signálny peptid kódujúcej sekvencie bolo odstránených vytvorením EcoRI/Ncol (89) fúzie a regenerovaním EcoRI miesta. Vzniknutý kloň pARC 0770 obsahoval ATG kodón, pôvodne kódovaný v Ncol mieste, ktoré bolo ihneď nasledované regenerovaným EcoRi miestom v čítacom rámci sso zostávajúcou NSP-BSSL sekvenciou.

1.2. Konštrukcia pARC 5771 plazmidu

Na konštrukciu vhodného expresného vektora na expresiu BSSL bol cDNA fragment kódujúci BSSL proteín spolu s natívnym signálnym peptidom klonovaný do Pichia pastoris expresného vektora pDM148. Vektor pDM 148 (získaný od Dr. S. Subramani, UCSD) bol konštruovaný nasledujúcim spôsobom: upstream netranslatovaný región (5'-UTR) a downstream netranslatovaný región (3'-UTR) metanoloxidázového génu boli izolované PCR a umiestnené v tandeme v polylinkery (MCS) E. coli vektora pSK⁺ (dostupného od Stratagene, USA).

Na správnu selekciu možných Pichia pastoris transformantov bola DNA sekvencia kódujúca Saccharomyces cerevisiae ARG4 gén spolu s jej vlastnou promotorovou sekvenciou inzertovaná medzi 5'- a 3' UTR v pSK- Vzniknutý konštrukt pDM148 mal nasledujúce vlastnosti: v MCS regióne pSK- 5'-UTR MOX, Saccharomyces cerevisiae ARG4 genómová sekvencia a 3'-UTR MOX boli klonované. Medzi 5'-UTR MOX a ARG4 genómovou sekvenciou bola umiestnená séria jedinečných reštrikčných miest (Sali, Clal, EcoRI, Pstl, Smal a SamH/), do ktorých môže byť klonované akákoľvek heterológny proteín kódujúca sekvencia na expresiu pod kontrolou MOX promotora v Pichia pastoris. Na uľahčenie integrácie, môže byť expresná kazeta vyštiepená zo zvyšku pSK- vektora štiepením Notl reštrikčným enzýmom.

5'-UTR M0X1 Pichia pastoris klonovaný do pDM148 mal dĺžku asi 500 bp, zatiaľ čo 3'UTR MOX1 z Pichia pastoris klonovaný do pDM148 mal dĺžku asi 1000 bp. Na inzerciu NSP BSSL cDNA sekvencie medzi 5'- UTR MOX1 a Saccharomyces cerevisiae ARG4 kódujúcej sekvencie do pDM148 bol cDNA inzert (SP-BSSL) izolovaný z pARC 0770 štiepením EcoRI a BamHI (približne 2,2 kb DNA fragment) a bol klonovaný medzi EcoRI a BamHI miesta do pDM148.

Vzniknutý konštrukt pARC 5771 (NCIMB 40721) obsahoval Pichia pastoris MOX1 5'-UTR nasledovaný NSP BSSL kódujúcou sekvenciou nasledovanou Saccharomyces cerevisiae ARG4 génovou sekvenciou a 3'UTR MOX1 génu Pichia pastoris, zatiaľ čo celý DNA segment od 5'-UTR MOX1 do 3'- UTR MOX1 bol klonovaný do MCS pSK-.

1.3. Transformácia BSSL v Pichia pastoris hostiteľovi PPF-1.

Na expresiu BSSL v Pichia pastoris hostiteľovi PPF-1 (his4, arg4, získaná od Phillips Petroleum Co.), bol plazmid pARC 5771 štiepený Notl a celá štiepna zmes (10 pg celkovej DNA) bola použitá na transformáciu PPF-1. Použitý transformačný protokol bola v podstate kvasinková sféroplastová metóda popísaná Creggom et al., (1987). Transformanty boli regenerované na minimálnom médiu postrádajúcom arginín, takže Arg+ kolónie mohli byť selektované. Regeneračný vrchný agar obsahujúci transformanty bol prenesený a homogenizovaný vo vode a kvasinkové bunky boli umiestnené s hustotou asi 250 kolónií na platňu na glukózové minimálne platne postrádajúce arginín. Mutantné kolónie boli potom identifikované opätovným umiestnením na minimálne metanolové platne. Asi 15 % všetkých transformantov vykazovalo Mut^s (metanol pomaly rastúci) fenotyp.

1.4. Vyšetrenie transformantov exprimujúcich BSSL

Na rýchle vyšetrenie veľkého množstva transformantov na expresiu lipázy bola vyvinutá metóda lipázového testu na platni. Postup na prípravu týchto platní bol nasledujúci: Do roztoku 2 % agarózy (konečného) bolo pridané 10 x Na-cholát roztok vo vode do konečnej koncentrácie 1 %. Lipidový substrát tributín bol pridaný v zmesi do konečnej koncentrácie 1 % (objem/objem). Na podporu rastu transformantov bola zmes ďalej doplnená 0,25 % kvasinkovou dusíkatou bázou (konečnou) a 0,5 % metanolom (konečným). Prísady boli riadne premiešané a vyliate na platne do hrúbky 3-5 mm. Akonáhle sa zmes stala pevnou, boli transformanty umiestnené na platne a platne boli ďalej inkubované pri 37 °C počas 12 hodín. Lipázu produkujúce klony vykazovali jasné haló okolo klonu. V typickom experimente bolo identifikovaných 7 z celkových 93 transformantov ako BSSL produkujúcich transformantov. Dva klony (č. 39 a 86) produkujúce najväčšie haló okolo umiestnených kolónií boli zoškriabané na ďalšiu charakterizáciu.

1.5. Expresia BSSĽ z PPF-1 (pARC 5771)

Dva transformanty č. 39 a 86 popísané v sekcii 1.4. boli zoškriabané a kultivované v BMGY kvapalnom médiu (1 % kvasinkový extrakt, 2 % bactopeptón, 1,34 % kvasinková dusíkatá báza bez aminokyselín, 100 mM KPO₄ pufru, pH 6,0, 400 pg/ml a 2 % glycerol) 24 hodín pri 30 °C pokiaľ kultúry nedosiahli A₆oo blízke 40. Kultúry boli peletované a znovu rozsuspendované v BMMY (2 % glycerol nahradený 0,5 % metanolom v BMY) médiu pri A₆₀₀ 300. Indukované kultúry boli inkubované pri 30 °C s trepaním 120 hodín. Supernatanty kultúr boli odoberané v rôznom čase na analýzu expresie BSSL testom aktivity enzýmu, SDS-PAGE analýzou a Western blotingom.

1.6. Detekcia BSSL enzýmovej aktivity v supernatantoch kultúr klonov č. 39 a 86.

Na určenie enzýmovej aktivity v supernatantoch bez buniek indukovaných kultúr č. 39 a 86 ako sú popísané v sekcii 1.5., boli kultúry scentrifugované a supernatant bez buniek bol testovaný na BSSL enzýmovú aktivitu podľa metódy, ktorú popísal Hernell a Olivecrona (1974). Ako je ukázané v tabuľke 1, pri oboch kultúrach bolo zistené, že obsahujú BSSL enzýmovú aktivitu s maximom aktivity v 96 hodine po indukcii.

1.7. Western blot analýza supernatantov kultúr PPF-1 :pARC 5771 transformantov (č. 39 a 86).

Na určenie prítomnosti rekombinantnej BSSL v supernatantoch kultúr č. 39 a 86 PPF-1 (pARC 5771) transformantov boli kultúry kultivované a indukované ako je popísané v sekcii 1.5. Kultúry boli odoberané v rôznom čase po indukcii a boli podrobené Western blot analýze s použitím anti-ASSL polyklonálnej protilátky. Výsledky ukázali prítomnosť BSSL v supernatante kultúry ako 116 kDa pásika.

Príklad 2: Expresia BSSL v Pichia pastoris GS115

2.1. Konštrukcia pARC 5799

Pretože 5'-M0X UTR a 3'MOX UTR neboli správne definované a pretože pDM 148 vektoru chýba akýkoľvek iný vhodný marker (napr. gén rezistencie na G418) na monitorovanie počtu kópií BSSL integrovaných v chromozóme Pichia, bol cDNA inzert natívnej BSSL spolu so signálnym peptidom klonovaný do iného Pichia pastoris expresného vektora, pHIL D4. Integratívny plazmid pHIL D4 bol získaný od Phillips Petroleum Company. Plazmid obsahoval 5'-M0X1, približne 1000 bp segment alkohol oxidázového promótora a jedinečné EcoRI klonovacie miesto. Tiež obsahoval približne 250 bp 3'M0X1 regiónu obsahujúceho alkoholoxidzázovú terminačnú sekvenciu, nasledovanú EcoRI klonovacím miestom. Terminačný región bol nasledovaný Pichia pastoris histidinol dehydrogenázovým génom HIS4 obsiahnutým na 2,8 kb fragmente na doplnenie defektného HIS4 génu v hostiteľovi GS115 (pozri nižšie). 650 bp región obsahujúci 3'-MOX1 DNA bol fúzovaný na 3'-konci HIS4 génu, ktorý bol spolu s 5'-M0X1 regiónom nevyhnutný na miestne riadenú integráciu. Bakteriálny gén rezistencie na kanamycín z pUC-4K (PL-Biochemicals) bol inzertovaný do jedinečného Nael miesta medzi HIS4 a 3'-M0X región v 3'HIS4 géne.

Kloň NSP-BSSL kódujúci cDNA fragment v jedinečnom EcoRI mieste pHIL D4, dvojreťazcový oligolinker majúci BamHl-EcoRI štiepnu pozíciu bol ligovaný do BamHI štiepeného plazmidu pARC 5771 a celá NSP-BSSL kódujúca sekvencia bola vybraná ako 2,2 kb EcoRI fragment. Tento fragment bol klonovaný do EcoRI miesta pHIL D4 a správne orientovaný plazmid bol označený ako pARC 5799 (NCIMB 40723).

2.2. Transformácia pARC 5799

Na uľahčenie integrácia NSP-BSSL kódujúcej sekvencie v genómovom lokuse MOX1 v Pichia pastoris bol plazmid pARC 5799 štiepený Bglll a použitý na transformáciu Pichia pastoris kmeňa GS115(his4) (Phillips Petroleum Company) podľa protokolu popísanom v sekcii 1.5. Avšak v tomto prípade sa jednalo o selekciu His prototrofov. Transformanty boli zoškriabané po sériovom riadení platní regenerovaného vrchného agaru a testované priamo v lipázovom platňovom teste ako je popísané v sekcii 1.4. Dva klony transformantov (č. 9 a 21) boli zoškriabané na základe veľkosti ich haló na lipázovej testovacej platni a boli ďalej testované na expresiu BSSL. Bolo zistené, že klony boli Mut⁺.

2.3. Detekcia BSSL enzýmovej aktivity v supernatantoch kultúr GS115(pARC 5799) transformantov č. 9 a 21.

Dva transformované klony č. 9 a 21 GS115(pARC 5799) boli kultivované v podstate podľa protokolu popísaného v sekcii 1.5. Supenatanty kultúr boli v rôznom čase po indukcii testované na BSSL enzýmovú aktivitu ako je popísané v sekcii 1.6. Ako je ukázané v tabuľke 1, obsahovali oba supernatanty kultúr BSSL enzýmovú aktivitu a enzýmová aktivita bola najvyššia 72 hodín po indukcii. Oba klony vykazovali vyššiu expresiu BSSL v porovnaní s klonmi PPF-1 (pARC 5771).

2.4. SDS-PAGE a Western blot analýzy supernatantov kultúr GS115(pARC 5799) transformantov č. 9 a 21.

Supernatanty kultúr odoberané v rôznom čase, ako je popísané v sekcii 2.3., boli podrobené SDS-PAGE a Western blot analýze. Z SDS-PAGE profilu bolo vyhodnotené, že asi 60-75 % celkových proteínov prítomných v supernatantoch indukovaných kultúr bol BSSL. Molekulová hmotnosť'proteínu bola okolo 116 kDa. Western blot údaje tiež potvrdili, že hlavný proteín prítomný v supernatante kultúry bol BSSL. Proteín mal zjavne rovnakú molekulovú hmotnosť ako natívny BSSL.

Príklad 3: Zvýšenie BSSL expresie

3.1. Zvýšenie BSSL expresie z transformovaného klonu GS115(pARC 5799) (č. 21).

Bol použitý B. Braun fermentor s kapacitou 23 I. 5 litrov média obsahujúceho 1 %YE, 2 % peptón, 1,34 YNB a 4 % hmotnosť/objem glycerol bolo autoklávovaných pri 121 °C 30 minút a biotín (400 pg/l konečná koncentrácia) boi pridaný počas inokulácie po sterilizácii na filtri. Pre inokulum bol použitý glycerolový zásobník GS115(pARC 5799) (č.21) inokulovaný do syntetického média obsahujúceho YNB (67 %) plus 2 % glycerol (150 ml) a bol kultivovaný pri +30 °C 36 hodín. Fermentačné podmienky boli nasledujúce: teplota bola +30 °C, pH 5,0 bolo udržiavané použitím 3,5 N NH₄OH a 2 N HCl, rozpustený kyslík od 20 do 40 % saturácie, polypropylénglykol 2000 bol použitý ako protipenivá látka.

Kultúra bola monitorovaná v pravidelných intervaloch meraním OD pri 600 nm. Αβοο dosiahla maxima 50-60 v 24 hodine. V tomto bode bola vsádková rastová fáza prekonaná ako je ukázané zvýšenými hladinami rozpusteného kyslíka.

Rastová fáza bola ihneď nasledovaná indukčnou fázou. Behom tejto fázy bol ako krmivo použitý metanol obsahujúci 12 ml/l PTM1 solí. Stupeň podávania metanolu bol 6 μΙ/hod. behom prvých 10-12 hodín, potom bol postupne zvyšovaný o 6 ml/h každých 7-8 hodín do maxima 36 ml/hod. Amoniak použitý na kontrolu pH účinkoval ako zdroj dusíka. Akumulácia metanolu bola testovaná každých 6-8 hodín, pričom sa použilo stanovenie obsahu rozpusteného kyslíku a bolo objavené, že je limitovaný behom celej indukčnej fázy. OD pri 600 nm sa zvýšilo z 50-60 na 150-170 behom 86 hod. podávania metanolu. Kvasinkový extrakt a peptón boli pridávané každých 24 hodín na vytvorenie konečnej koncentrácie 0,25 % a 0,5 % v príslušnom poradí.

Vzorky boli odoberané v 24 hodinovom intervale a boli testované na BSSL enzýmovú aktivitu v bujóne bez buniek. Bujón bol tiež podrobený SDS-PAGE a Western blot analýze.

3.2. Proteínová analýza secernovaného BSSL z kultúry GS115(pARC 5799) (č. 21) kultivovanej vo fermentore.

BSSL enzýmová aktivita v bujóne bez buniek sa zvýšila z 40-71 mg/l (ekvivalentov natívneho proteínu) v 24. hodine na 200-227,7 mg/l (ekvivalentov natívneho proteínu) na konci 86-90. hodiny. SDS-PAGE analýza bujónu bez buniek ukázala prominentný Coomasie blue farebný pásik s molekulovou hmotnosťou 116 kDa. Identita pásika bola potvrdená Western blotom uskutočneným ako bolo popísané v sekcii 1.7. pre natívny BSSL.

3.3 Purifikácia rekombinantného BSSL secernovaného do supernatantu kultúry GS115(pARC 5799) (č. 21) klonov.

Pichia pastoris kloň GS115(pARC 5799) bol kultivovaný a indukovaný vo fermentore ako je popísané v sekcii 3.1. Na purifikácii rekombinantného BSSĽ bolo 250 ml kultivačného média (indukovaného 90 hodín) centrífugované pri 12000xg 30 minút na odstránenie všetkých častíc. Supernatant bez buniek bol ultrafiltrovaný na Amicon sete pričom sa použila membrána s rozlišovacou schopnosťou 10kDa. Soli a proteiny a peptidy s nízkou molekulovou hmotnosťou boli z kultivačného supernatantu odstránené opakovaným riedeným behom filtrácie. Pufor použitý na takéto riedenia bol 5mM Barbitol pH 7,4. Po koncentrácii supernatantu kultúr bol retentát rekonštituovaný na 250 ml použitím 5 mM Barvitolu, pH 7,4 a 50 mM NaCl a bol zavedený do Heparín-Sefarózovej kolóny (15 ml objem lôžka), ktorá bola predekvilibrovaná rovnakým pufrom. Zavádzanie vzorky bolo uskutočnené prietokom 10 ml/hod. Po zavedení bola kolóna premytá 5 mM barbitolom pH 7,4 a 0,1 M NaCl (200 μΙ premývací pufor) pokiaľ sa absorpcia pri 250 nm neznížila pod hladinu detekcie. BSSL bola eluovaná 200 ml Barbitol pufru (2mM, pH 7,4) a lineárnym gradientom NaCl v rozmedzí od 0,1 do 0,7 M. Frakcie (2,5 ml) boli odoberané a testované na eluovaný proteín monitorovaním absorbancie pri 260 nm. Frakcie obsahujúce proteín boli testované na BSSL enzymatickú aktivitu. Vhodné frakcie boli analyzované na 8,0 % SDS-PAGE na vyšetrenie ich purifikačného profilu.

3.4. Charakterizácia purifikovného rekombinantného BSSL secernovaného do supernatanu kultúr GS115(pARC 5799).

SDS-PAGE a Western tplot analýzy frakcií (popísané v sekcii 3.3) ukazujúce maximálnu enzymatickú aktivitu BSSL enzýmu ukázali, že rekombinantný proteín bol približne na 90 % čistý. Molekulová hmotnosť purifikovaného proteinu bola okolo 116 kDa ako je určené SDS-PAGE a Western blot analýzami. Pokiaľ boli vzorky podrobené SDS-PAGE analýze, potom mohol byť detekovaný proteínový pásik s nízkou molekulovou hmotnosťou farbením Coomasie Brilliant Blue, ktorý nebol znázornený na Western blot. Purifikovaný proteín bol podrobený Nterminálnej analýze na automatizovanom proteínovom sekvenátore. Výsledky ukázali, že proteín bol správne spracovaný z natívneho signálneho peptidu a že rekombinantný proteín mal N-terminálnu sekvenciu A K L G A V Y. Špecifická aktivita purifikovaného rekombinantného proteinu bola zistená podobná ako aktivita natívneho proteinu.

Príklad 4; Expresia BSSL-C Pichia pastorís GS115

4.1. Konštrukcia pARC 5797 cDNA kódujúca sekvencia pre BSSL variantu BSSL-C bola fúzovaná na svojom 5'-konci so signálny peptid kódujúcou sekvenciou Saccharomyces cerevisiae SUC2 génovým produktom (invertázou), pričom sa zachováva integrita otvoreného čítacieho rámca začínajúceho prvým ATG kodónom invertázového signálneho peptidu. Tento fúzny génový konštrukt bol najprv klonovaný do Saccharomyces cerevisiae expresného vektora pSCW 231 (pSW 231 kvasinkový expresný vektor s nízkymi počtom kópií a expresia je pod kontrolou konštitutívneho ADH1 promotora) medzi EcoRI a BamHI miesta na generovanie expresného vektora pARC 0788.

cDNA fúzneho génu bola ďalej subklonovaná do Pichia pastorís expresného vektora pDM 148 (popísaného v sekcii 1.2) uvolnením vhodného 1,8 kb fragmentu EcoPI a BamHI štiepením pARC 0788 a subklonovaním fragmentu do pDM 148 poštiepeného EcoRI a BamHI. Vzniknutý konštrukt pARC 5790 bol štiepený BamHI a dvojreťazcový oligonukleotidový linker s fyzikálnou štruktúrou BamHl-EcoRIBamHI bol ligovaný do konštruktu pARC 5796 v podstate na izoláciu cDNA fragmentu fúzneho génu, podľa stratégie popísanej v sekcii 2.1.

Nakoniec bol 1,8 kb fragment obsahujúci invertázový signálny peptid/BSSLC fúzny gén vybraný z pARC 5797 štiepením EcoRI a bol klonovaný do pHIL D4 v EcoRI mieste. Vhodnou reštrikčnou analýzou bol identifikovaný expresný vektor obsahujúci inzert v správnej orientácii a bol označený pARC 5797 (NCIMB 40722).

4.2. Expresia rekombinantného BSSL-C z Pichia pastorís

Na expresiu rekombinantného BSSL-C z Pichia pastorís bol Pichia pastorís hostiteľ GS115 transformovaný pARC 5797 podľa metódy popísanej v sekciách 1.3 a 2.2. Jeden transformant (č. 3) bol zoškriabaný na základe schopnosti produkovať veľa lipázy podľa detekčnej metódy lipázového testu na platni a bol ďalej analyzovaný na produkciu BSSL enzymatickej aktivity do kultivačného supernatantu v podstate podľa metódy popísanej v sekciách 1.6 a 2.3. Ako je ukázané v tabuľke 1, supernatant GS115 (pARC 5797) (č. 3) obsahoval BSSL enzymatickú aktivitu a jej množstvo sa progresívne zvyšovalo do 72. hodiny po indukcii.

4. 3. SDS-PAGE a Western blot analýzy supernatantov kultúr GS115 (pARC 5797) transformantu (č. 3).

Supernatanty kultúr odoberané v rôznom čase, ako je popísané v sekcii 4.2., boli podrobené SDS-PAGE a Western blot analýze ako je popísané v sekciách 1.7 a 2.4. Z SDS-PAGE profilu bolo vyhodnotené, že asi 75-80 % z celkového množstva extracelulárnych proteínov je BSSL-C. Molekulová hmotnosť proteínu bola okolo 66 kDa, ako bolo vyhodnotené SDS-PAGE analýzou. Na Western blot analýze boli nájdené len dva pásiky (dublet) okolo 66 kDa, ktoré boli imunoreaktívne a tak potvrdzovali expresiu rekombinantného BSSL-C.

Príklad na porovnanie: Expresía BSSL v Saccharomyces cerevisiae

Boli uskutočnené pokusy exprimovať BSSL v Saccharomyces cerevisiae. BSSL bola v Saccharomyces cerevisiae slabo secernovaná a natívny signálny peptid nepracoval účinne. Okrem toho, natívny signálny peptid nebol vyštiepený zo zrelého proteínu v Saccharomyces cerevisiae.

Referencie;

Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. and Lombardo, D. (1988) Biochim. Biophys. Acta. 961,299-308.

i

I

Baba, T.,’ Downs, D., Jackson, K.W., Táng, J. and Wang, C-S (1991) Biochemistry 30, 500-510.

Bläckberg, L. and Hemell, O. (1981) Eur. J. Biochem. 116, 221-225.

Bläckberg, L., Ängquist, K.A. and Hernell, O. (1987) FEBS Lett. 217, 37-41.

Cregg, J.M. et al. (1987) Bio/Technology 5, 479-485.

Ellis, S.B. et al. (1985) Mol. Celí. Biol. 5, 1111-1121.

Fredrikzon, B., Hernell, O., Bläckberg, L. and Olivecrona, T. (1978) Pediatrie Res. 12, 1048-1052.

Hansson, L., Bläckberg, L., Edlund, M., Lundberg, L., Strômqvist, M. and Hernell, O. (1993) J. Biol. Chem. 268, 26692-26698.

Hernell, O. and Olivecrona, T. (1974) Biochim. Biophys. Acta 369, 234244.

Hemell, O., Bläckberg, L and Olivecrona, T. (1989) in: Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy (Lebenthal, E., ed.) 347-354, Raven Press, NY.

Hemell, O. and Bläckberg, L. (1982) Pediatrie Res. 16, 882-885.

I

Hui, D. Y. and Kissel, J. A. (1990) FEBS Letters 276, 131-134.

Kingsman, etal. (1985) Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 3, 377-416.

Nilsson, J., Bläckberg, L., Carlsson, P., Enerbäck, S., Hemell, O. and Bjursell, G. (1990) Eur. J. Biochem. 192, 543-550.

Reue, K., Zambaux, J., Wong, H., Lee, G., Leete, ΤΉ., Ronk, M., Shively,

J.E., Stemby, B., Borgstrom, B., Ameis, D. and Scholtz, M.C. (1991)

J. Lipid. Res. 32, 267-276.

Wang, C-S, and Hartsuck, J.A. (1993) Biochim. Biphys Acta 1166, 1-19.

Deponovanie mikroorganizmov

Nasledujúce plazmidy, transformované do kultúr Pichia pastoris boli deponované podľa Budapeštianskej zmluvy v National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), Aberdeen, Schotland, UK. Dátum deponovania je 2.5. 1995.

Kmeň (plazmid) NCIMB č.

PPF-1 (pARC 5771) 40721

GS115 (pARC 5799) 40723

GS115 (pARC 5797)

40722

Tabuľka 1

Enzymatické aktivita supernatantov kultúr Pichia pastoris transformantov

Enzymatické aktivita v mg/l ekvivalentov natívneho BSSĹ

Hodiny po PPF-l(pARC 5771) GS115 (pARC 5799) GS115 (pARC 5797)

indukcii	č. 39	Č.86	Č.9	č. 21	Č .3
24	0,254	0,135	1,53	1,72	0,37
48	2,69	3,12	17,28	34,70	40,9
72	3,96	8,25	37,37	50,60	44,9
96	11,26	13,60	26,34	50, 60	35,6
120	8,42	13,13	13,60	22,30	17, 8

Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie:

(i) Prihlasovateľ:

(A) Meno: ASTRA AB (B) Ulica: Vastra Malarehamnen 9 (C) Mesto: Sodertälje (D) Štát: Švédsko (F) Poštový kód (ZIP): S-151 85 (G) Telefón: +46 8 553 260 00 (H) Telefax: +46 8 553 288 20 (I) Telex: 19237 astra s (ii) Názov vynálezu: DNA sekvencia na expresiu polipeptidov (iii) Počet sekvencií: 4 (iv) Počítačová čítacia forma:

(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release#1.0, verzia #1.30 (EPC (2) Informácie ku SEQ ID NO? 1:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 2428 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: dvojitý (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNA k mRNA (iii) Hypotetická: nie (iv) Antisense: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Homo sapiens (B) Typ tkaniva: mliečna žľaza (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: CDS (B) Umiestnenie: 82...2319 (C) Iné informácie:/produkt = žlčovými soľami stimulovaná lipáza (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: exón (B) Umiestnenie: 985...1173 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: exón (B) Umiestnenie: 1174...1377 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: exón (B) Umiestnenie: 1378...1575 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: exón (B) Umiestnenie: 1576...2415 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: mat_peptid (B) Umiestnenie: 151...2316 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: poly A_signál (B) Umiestnenie: 2397...2402 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: repeat región (B) Umiestnenie: 1756...2283 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: 5'UTR (B) Umiestnenie: 1...81 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 1756...1821 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 1789...1821 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 1822...1854 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 1855...1887 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 1888...1920 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: repeatJednotka (B) Umiestnenie: 1921...1953 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 1954...1986 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 2020...2052 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: repeatJednotka (B) Umiestnenie: 2053...2085 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 2086...2118 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 2119...2151 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 2152...2184 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie; 2185...2217 (ix) Vlastnosti;

(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 2218...2250 (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: repeatjednotka (B) Umiestnenie: 2251...2283 (x) Publikačné informácie;

(A) Autori: Nilsson, Jeanette

Blacberg, Lars Carlsson, Peter Enerback, Sven Hernell, Olle Bjursell, Gunnar (B) Názov: cDNA klonujúca žlčovými soľami stimulovanú lipázu ľudského mlieka a dôkazy jej identity s pankreatickou karboxylovou exterovou hydrolázou (C) Časopis: Eur. J. Biochem.

(D) Zväzok: 192 , ' (F) Strany: 543 - 550 (G) Dátum: September 1990 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 1:

ACCTTCTGTA TCAGTTAAGT GTCAAGATGG AAGGAACAGC AGTC. ľAAGA TAATGCAAAG

AGTTTATTCA TCCAGAGGCT G ATG Met	CTC ACC Leu Thr	ATG Met -20	GCC CCC	- - -T L-t-	CAA CTG GTT	111
Gly	Arg	Gin	Leu Val -'S
	-23
CTG TTG	GGC CTC ACC TGC TGC	TGG GCA	GTG	GCG	AGT	3-Σ2	.j'iG	AAG CTG	159
Val Leu	Gly Leu Thr Cys Cys -10	Trp Ala -5	Val	Ala	Ser		Ala 1	Ľ/3 Leu
GGC GCC	GTG TAC ACA GAA GGT	GGC TTC	GTG	GAA	GGC		AAT	AAG AAG	207
Gly Ala 5	Val Tyr Thr Clu Gly 10	Gly Phe	Val	Glu	Gly 15	• 2.—	Asn	Lys Lys
CTC GGC	CTC CTG GGT GAC TCT	GTG GAC	ATC	TTC	AAG		ATC	CCC TTC	255
Leu Gly 20	Leu Leu Gly Asp Ser 25	Val Asp	íle	Phe 30	Lys	•X—*»	íle	Pro Phe 35
GCA GCT	CCC ACC AAG CCC CTG	GAA AAT	cct	CAG	CCA		CCT	GGC TGG	303
Ala Ala	Pro Thr Lys Ala Leu 40	Glu Asn	Pro 45	Gin	Pro		Pro	Gly Trp 50
CAA GGG	ACC CTG AAG CCC AAG	AAC TTC	AAG	AAG	ACA	·“**» —· w	CTG	CAG GCC	351
Gin Gly	Thr Leu Lys Ala Ly3 55	Asn Pho 60	Lys	Lys	Arg	Cvs	Leu. 65	Gin Ala
ACC ATC	ACC CAG GAC AGC ACC	TAC CGG	GAT	GAA	GAC	X ·	CTG	TAC CTC	399
Thr íle	Thr Gin Asp Ser Thr 70	Tyr Gly 75	íle p	Glu	Asp	cys 80	Leu	Tyr Leu
AAC ATT	TGC GTG CCC CAG GGC	AGG AAG	CAA	GTC	TCC	CCC	CAC	CTG CCC	447
Ann Ilo 85	Trp Val Pro Gin Gly 90	Arg Lya	Gin	Val	Ser 95	Arg	Asp	Leu Pro
CTT ATG	ATC TGC ATC TAT CCA	GGC GCC	TTC	CTC	ATG	CCC	TCC	CCC CAT	49S
Val Met 100	íle Trp Ilo Tyr Gly 105	Gly Ala	Phe	Leu 110	Met	Cly	Ser	cly His 115

GGG

GCC

AAC

TTC

CTC

AAC

TAC

CTG

TAT

GAC

CGC

GAG

ATC

GCC

543

Gly

Ala

Asn

Phe

Leu

Asn

Tyr

LeU

Tyr

Asp

Gly

Glu

íle

Ala

4

120

125

130

ACA

CCC

GCA

AAC

GTC

ATC

CTG

CTC

ACC

TTC

AAC

TAC

CCT

GTC

GGC

CCC

591

Thr

Arg

Gly

Asn

Val

Ilo

Val

Thr

Phe

Asn

Tyr

Arg

Val

Gly

Pro

135 140 145

CTT GGG TTC CTC AGC ACT GGG GAC GCC AAT CTG CCA GGT AAC TAT GGC 639

Leu Gly Phe Leu Ser Thr Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly

150 155 160

CTT CGG CAT CAG CAC ATG CCC ATT GCT TGC CTG AAG AGC AAT ATC GCG 687

LeU Arg Asp Gin His Met Ala íle Ala Trp Val Lys Arg Asn íle Ala

165 170 175

GCC Ala 180

TTC.GGG CGG

GAC CCC

AAC AAC ATC

ACC Thr

CTC TTC CGG GAG TCT

GCT Ala 195

Phe

Gly

Asp

Pro 185

Asn

íle

Leu 190

Phe

Gly

Glu

Ser

GGA

GGT

CCC

AGC

GTC

TCT

CTG

CAG

ACC

CTC

TCC

CCC

TAC

AAC

AAG

GGC

Gly

Ala

S«r

Val

Ser

Leu

Gin

Thr

Leu

Ser

Pro

Tyr

Asn

Lys

Cly

200

205

210

CTC

ATC

CGG

CCA

CCC

ATC

ACC

CAG

AGC

GGC

CTG

GCC

CTG

AGT

CCC

TGG

Leu

íle

Arg

Ala

íle

Ser

Gin

Ser

Gly

Val

Ala

Leu

Ser

Pro

Trp

215

220

225

831

GTC Val

ATC CAG AAA íle Gin Lys 230

AAC Asn

CCA CTC TTC TGC GCC AAA AAG GTG: GCT GAG AAG

879

Pro

Leu

Phe 235

Trp Ala

Lys

Val 240

Ala

Glu

Lys

GTC

GGT

TGC

CCT

GTG

GGT

GAT

GCC

AGG

ATG

GCC

CAG

TGT

CTG

AAG

927

Val

Glv

Cys

Pro

Val

Gly

Asp

Ala

Arg

Met

Ala

Gin

Cys

Leu

Ly3

245

250

255

GTT

ACT

GAT

CCC

CGA

GCC

CTG

ACG

CTG

GCC

TAT

AAG

GTG

CCG

CTG

GCA

975

Val

Thr

Asp

Pro

Arg

Ala

Leu

Thr

Leu

Ala

Tyr

Lya

Val

Pro

Leu

Ala

260

265

270

275

GGC

CTG

GAG

TAC

CCC

ATG

CTG

CAC

TAT

GTG

GGC

TTC

GTC

CCT

GTC

ATT

1023

Gly

Leu

Glu

Tyr

Pro

Met

Leu

Hio

Tyr

Val

Gly

Pho

Val

Pro

Val

íle

230

285

290

GAT

GCA

GAC

TTC

ATC

CCC

GCT

GAp

CCG

ATC

AAC

CTG

TAC

GCC

AAC

GCC .

1071

Asp

Gly

Asp

Phe

Ilo

Pro

Ala

Asp

Pro

Ilo

Asn

Leu

Tyr

Ala

Asn

Ala '

295

300

305

GCC

GAC

ATC

GAC

TAT

ATA

GCA

GGC

ACC

AAC

ATG

GAC

GGC

CAC

ATC

1119

Ala

Asp

íle

Asp

Tyr

íle

Ala

Gly

Thr

Asn

Met

Asp

Gly

His

íle

310

315

320

TTC

GCC

AGC

ATC

GAC

ATG

CCT

GCC

ATC

AAC

AAG

GGC

AAC

AAG

AAA

CTC

1167

Pho

Ala

Ser

Ilo

Asp

Mat

Pro

Ala

Ilo

Asn

Lys

Gly

Asn

Lyo

Lys

Val

325

330

-

335

ACG

GAG

CAG

GAC

TTC

TAC

AAC

CTG

GTC

ACT

GAG

TTC

ACA

ATC

ACC

AAG

1215

Thr

Glu

Asp

Phe

Tyr

Lys

Leu

Val

Ser

Glu

Phe

Thr

íle

Thr

Lys

340

345

350

355

GCC

CTC

AGA

GGC

CCC

AAG

ACG

ACC

TTT

GAT

GTC

TAC

ACC

GAG

TCC

TGG

1263

Gly

Leu

Arg

Gly

Ala

Lyo

Thr

Phe

Asp

Val

Tyr

Thr

Glu

Ser

Trp

360

365

370

GCC

CAG

GAC

CCA

TCC

CAG

GAG

AAT

AAG

ACT

GTG

GAC

TTT

1311

Ala

Gin

Asp

Pro

Sor

Gin

Glu

Asn

Lyo

Lys

Thr

Val

Asp

Pho

375

380

385

GAG ACC Glu Thr

GAT GTC CTC TTC

CTG GTG CCC

ACC CAG

ATT íle

CCC CTA GCC CAG · Ala Leu Ala Gin 400

13 5í

Asp 390

Val

Leu

Phe

Leu

Val 395

Pro

Thr

Clu

CAC AGA

GCC

AAT

GCC

AAG

AGT

GCC

AAG

ACC

TAC

GCC

TAC CTG TTT TCC

14 0';

His Arg 405

Ala

Asn

Ala

Lys

Ser 410

Ala

Lye

Thr

Tyr

Ala 415

Tyr Leu Phe Ser

CAT CCC

TCT

CGC

ATG

CCC

GTC

TAC

CCC

AAA

TCG

GTG

GGG GCC GAC CAT

1455

His Pro 420

Ser

Arg

Met

Pro 425

Val

Tyr

Pro

Lys

Trp 430

Val

Gly Ala Asp His ¹ 435

GCA GAT

CAC

ATT

CAG

TAC

GTT

TTC

GGG

AAG

CCC

TTC

GCC ACC CCC ACG

1503

Ala Asp

Asp

íle

Gin 440

Tyr

Val

Phe

Gly

Lys 445

Pro

Phe

Ala Thr Pro Thr 450

GGC TAC

CCG

CCC

CAA

GAC

AGG

ACA

GTC

TCT

AAG

GCC

ATG ATC GCC TAC

1551

Cly Tyr

Arg

Pro 455

Gin

A3p

Arg

Thr

Val 460

Ser

Lys

Ala

Met íle Ala Tyr 465

TGG ACC

AAC

ITT

CCC

AAA

ACA

GGG

GAC

CCC

AAC

ATG

GGC GAC TCG GCT

1599

Trp Thr

Asn 470

Phe

Ala

Lys

Thr

Gly 475

Asp

Pro

Asn

Met

Gly Asp Ser Ala 480

GTG CCC

ACA

CAC

TGG

GAA

CCC

TAC

ACT

ACG

GAA

AAC

AGC GGC TAC CTG

1647

Val Pro 485

Thr

His

Trp

Glu

Pro 490

Tyr

Thr

Clu

Asn 495

Ser Gly Tyr Leu

GAG

ATC

ACC

AAG

ATG

GGC

AGC

TCC

ATG

AAG

CCG

AGC CTG AGA

1695

Glu 500

íle

Thr

Lys

Mec 505

Gly

Ser

Sor

Ser

Met 510

Lys

Arg

Sor Leu Arg 515

ACC

AAC

TTC

CTG

CGC

TAC

TGG

ACC

CTC

ACC

TAT

CTG

CCG

CTG CCC ACA

1743

Thr

Asn

Phe

Leu

Arg 520

Tyr

Trp

Thr

Leu

Thr 525

Tyr

Leu

Ala

'Leu Pro Thr 530

GTG

ACC

GAC

CAG

GAG

GCC

ACC

CCT

GTG

CCC

ACA

GGG

GAC TCC GAG

1791

Val

Thr

Asp

Gin 535

Glu

Ala

Thr

Pro

Val 540

Pro

Thr

Gly

Asp Ser Glu 545

GCC

ACT

CCC

GTG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GAG

ACC

GCC

CCC CTC CCG

1839

Ala

Thr

Pro 550

Val

Pro

Thr

Gly 555

Asp

Ser

Glu

Thr

Ala 560

Pro Val Pro

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

CTG

CCG

CCC

ACG

GGT GAC TCC

1887

Pro

Thr 565

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala 570

Pro

Val

Pro

Pro 575

Thr

Gly Asp Ser

GGG

GCC

CCC

GTG

cca

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC CCC GTG

1935

Gly 580

Ala

Pro

Val

Pro 585

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser 590

Gly

Ala

Pro Pro Val 595

CCG

ccc

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG GGT GAC

1983

Pro

Thr

Gly

Asp 600

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro 605

Val

Pro

Thr Gly Anp 610

rcc

GGG

GCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC CCC CCC

2031

Ser

Gly

Ala

Pro 61S

Pro

Val

Pro

Thr 620

Gly

Asp

Sor

Gly

Ala Pro Pro 625

GTG

ccc

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGC

GCC

CCC

GTG

CCG

CCC ACG GGT

• 2079

Val

Pro

Pro 630

Thr

Gly

Asp

Sor

Gly 635

Ala

Pro

Val

Pro 640

Pro Thr Gly

GAC

GCC

CGG

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC '

GGC GCC CCC

2127

Anp

Ala 645

Gly

Pro

Val 650

Pro

Thr

Gly Arp 655

Ser ¹

Gly Ala Pro

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC

GGG

GCC

CCC

GTG

í ACC CCC ACG

2175

Pro 660

Val

Pro

Thr

Cly 665

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro 670

Pro

Val

Thr Pro Thr 675

GGT

GAC

TCC

GAG

ACC

GCC

CCC

GTG

CCG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCC CCS CCC

2223

Gly

Asp

Ser

Glu

Thr 680

Ala

Pro

Val

Pro

Pro 685

Thr

Gly

Asp

Ser Gly Ala ó 90

CCC

CCT

GTG

CCC

ACG

GGT

GAC

TCT

GAG

GCT

GCC

CCT

GTG CCC CCC

2271

Pro

Val

Pro 695

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser 700

Glu

Ala

Pro

Val Pro Pro 705

ACA

GAT

GAC

TCC

AAG

GAA

GCT

CAG

ATG

CCT

GCA

GTC

ATT

ACG TCT TAG

2319

Thr

Ašp

Asp 710

Ser

Lys

Glu

Ala

Gin 715

Met

Pro

Ala

Val

íle 720

Arg Pha *

CGTCCCATGA GCCTTGGTAT CAAGAGGCCA CAAGAGTGCG ACCCCAGGGG CTCCCCTCCC 2379

ATCTTGAGCT CTTCCTGAAT AAAGCCTCAT ACCCCTAAAA AAAAAAAAA

2428 (2) Informácie o SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 746 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 2

Met -23

Leu

Thr

Met -20

Gly

Arg

Leu

Gin

Leu -15

Val

Leu

Gly

Leu -i·:

Thr Cy3

Cys

Trp

Ala -S

Val

Ala

Ser

Ala

Ala 1

Lye

Leu

Gly

Ala 5

Val

Tyr

Thr Glu

Gly 10

Gly

Phe

Val

Glu

Gly 1S

Val

Asn

Lys

Leu 20

Gly

Leu

Gly Asp 25

Ser

Val

Asp

íle

Phe 30

Lys

Gly

íle

Pro

Phe 35

Ala

Pro

Thr

L‘.·s Ala 40

Leu

Glu

Asn

Pro 45

Gin

Pro

His

Pro

Gly 50

Trp

Gin

Gly

Thr

Leu 55

Lys Ala

Lys

Asn

Phe 60

Lys

Arg

Cys

Leu 65

Gin

Ala

Thr

íle

Thr 70

Glr.

Asp Ser

Thr

Tyr 75

Gly

Asp

Glu

Asp

Cys 80

Leu

Tyr

Leu

Asn

íle 85

Trp

Val

Gin

Gly 90'-·

Arg

Lys

Gin

Val

Ser 95

Arg

Asp

Leu

Pro

Val 100

Met

íle

Trp

íle Tyr 105

Gly

Ala

Phe

Leu 110

Met

Gly

Ser

Gly

His 115

Gly

Ala

Asn

Phe

Leu Asn 120

Asn

Tyr

Leu

Tyr 125

Asp

Gly

Glu

íle 130

Ala

Thr

Arg

Gly

Asn ¹³⁵

Val íle

Val

Thr

Phe

Asn

Tyr

Arg

Val

Gly

Pro

Leu

Gly

Phe

Leu

Ser Thr

140 145 150

Gly Asp Ala Asn Leu Pro Gly Asn Tyr Gly Leu Arg Aep Gin His Hot 155 160 165

Ala. 170

11«

Ala

Trp

Val

Lys 17S

Arg

Asn

íle

Ala

Ala 180

Phe

Gly

Asp Pro 185

Asn

íle

Thr

Leu 190

Phe

Gly

Glu

Ser

Ala 195

Gly

Ala

Ser

Val Ser 200

Leu

Gin

Thr

Leu 205

Ser

Pro

Tyr

Asn

Lys 210

Gly

Leu

íle

.Arg

Arg 215

Ala íle

Ser

Gin

Šer 220

Gly

Val

Ala

Leu

Ser 225

Pro

Trp

Val

íle

Gin 23 0

Lys

Asn Pro

Leu

'Phe 235

Trp

Ala

Lys

Val 240

Ala

Glu

Lys

Val

Gly 24S

Cys

Pro

Val Gly

Asp 250

Ala

Arg

Met

Ala 255

Gin

Cys

Leu

Lys

Val 260

Thr

Asp

Pro

Arg Ala 265

Leu

Thr

Leu

Ala

Tyr 270

Lys

Val

Pro

Leu

Ala 275

Gly

Leu

Glu

Tyr

Pro Met 280

Leu

His

Tyr

Val 285

Gly

Phe

Val

Pro

Val 290

íle

Asp

Gly

Asp

Phe 295

íle Pro

Ala

Asp

Pro 300

íle

Asn

Leu

Tyr

Ala 305

Asn

Ala

Asp

íle 310

Asp

Tyr íle

Ala

Gly 315

Thr

Asn

Met

Asp 320

Gly

His

íle

Phe

Ala 325

Ser

íle

Asp Met

Pro 330

Ala

íle

Asn

Lys

Gly 335

Asn

Lys

Lye

Val

Thr 340

Glu

Asp

Pho Tyr 345

Lys

Leu

Val

Ser

Glu 350

Phe

Thr

íle

Thr

Lys 355

Gly

Leu

Arg

Gly

Ala Lys 360

Thr

Phe

Asp 365

Val

Tyr

Thr

Glu

Ser 370

Trp

Ala

Gin

Asp

Pro 375

Ser Cln

Glu

Asn

Lys 380

Lys

Thr

Val

Val 385

Asp

Phe

Glu

Thr

Asp 390

Val

Leu Phe

Leu

Val 395

Pro

Thr

Glu

íle

Ala 400

Leu

Ala

Gin

His

Arg 405

Ala

Asn

Ala Lys

Ser 410

Ala

Ly3

Thr

Tyr

Ala 415

Tyr

Leu

Pho

Ser

His 420

Pro

Ser

Arg

Met Pro 425

Val

Tyr

Pro

Ly3

Trp 430

Val

Gly

Ala

Asp

His 435

Ala

Asp

íle

Gin Tyr 440

Val

Phe

Gly,

Lys 445

Pro

Phe

Ala

Thr

Pro 450

Thr

Gly

Tyr

Arg

Pro 455

Gin Asp

Arg

Thr

Val 460

Ser

Lys

Ala

Met

íle 465

Ala

Tyr

Trp

Thr

Asn 470

Phe

Ala Lys

Thr

Gly 475

Asp

Pro

Asn

Met

Gly 480

Asp

Sor

Ala

Val

Pro 485

Thr

His

Trp Glu

Pro 490

Tyr

Thr

Glu

Asn 495

Ser

Gly

Tyr

Leu

Glu 500

íle

Thr

Lye

Lye Met 50S

Gly

Ser

Met 510

Lys

Arg

Ser

Leu

Arg 515

Thr

Acn

Phe

Leu

Arg Tyr 520

Trp

Thr

Leu

Thr 525

Tyr

Leu

Ala

Leu

Pro 530

Thr

Val

Thr

Asp

Gin 535

Glu Ala

Thr

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

Ala

Thr

Pro

Val

Pro

540

545

550

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

Thr

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

555

560

565

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

570

575

580

585

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

590

595

600

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

605

610

615

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

620

625

630'

Ser .Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ala

Gly

Pro

635

640.

645

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

650

655

660

665

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Thr

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Glu

Thr

Ala

670

675

680

Pro

Val

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

685

690

695

Gly

Asp.

Ser

Glu

Ala

Pro

Val

Pro

Thr

Asp

Ser

Lys

Glu

700

705

710

Ala

Gin

Met

Pro

Ala

Val

íle

Arg

Phe

*

715

720

(2) Informácie ku SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 722 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec:

(D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (iii) Hypotetická: nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Homo sapiens (B) Typ tkaniva: mliečna žľaza (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 3:

Ala 1

Lya

Leu

Gly

Ala 5

Val

Tyr

Thr

Glu

Gly 10

Gly

Phe

Val

Glu

Gly 15

Val

Asn

Lys

Lya-

Leu 20

Gly

Leu

La u

Gly

Aep 25

Ser

Val

Asp

íle

Phe 30

Lya

Gly

Ila

Pro

Pho 35

Ala

Pro

Thr

Lys 40

Ala

Leu

Glu

Asn

Pro 45

Gin

Pro

His

Pro

Gly 50

Trp

Gin

Gly

Thr

L® u 55

Lya

Ala

Lys

Asn

Phe 60

Lys

Arg

Cys

—30—

Leu 65

Gin

Ala

Thr

11«

Thr 70

Gin

Asp

Ser

Thr

Tyr 75

Gly

Asp

Glu

Asp

Cys 80

Leu

Tyr

Leu

Asn

íle 85

Trp

Val

Pro

Gin

Gly 90

Arg

Lys

Gin

Val

Ser 95

Arg

Asp

Leu

Pro

Val 100

Met

íle

Trp

íle

Tyr 105

Gly Gly

Ala

Phe

Leu 110

Met

Gly

Ser

Gly

His 115

Gly

Ala

Asn

Phe

Leu 120

Asn

Tyr

Leu

Tyr 125

Asp

Gly

Glu

íle 130

Ala

Thr

Arg

Gly

Asn 135

Val

íle

Val

Thr 140

Phe

Asn

Tyr

Arg

Val 145

Gly

Pro

Leu

Gly

Phe 150

Leu

Ser

Thr

Gly

Asp 155

Ala

Asn

Leu

Pro

Gly 160

Asn

Tyr

Gly

Leu

Arg I6S

Asp

Gin

H⁴ s

Met

Ala 170

íle

Ala

Trp

Val

Lys 175

Arg

Asn

íle

Ala

Ala 180

Phe

Gly

Asp

Pro 185

Asn

íle

Thr

Leu 190

Phe

Cly

Glu

Ser

Ala 195

Gly

Ala

Ser

Val 200

Ser

Leu

Gin

Thr

Leu 20S

Ser

Pro

Tyr

Asn

Lys 210

Cly

Leu

íle

Arg

Arg 215

Ala

íle

Ser

Gin

Ser 220

Gly

Val

Ala

Leu

Ser 225

Pro

Trp

Val

íle

Gin 230

Ly3

Asn

Pro

Leu

Phe 235

Trp

Ala

Lys

Ly3

Val 240

Ala

Glu

Lys

Val

Gly 245

Cys

Pro

Val

Gly

Asp 250

Ala

Arg

Met

Ala 25S

Gin

Cys

Leu

Lys

Val 260

Thr

Asp

Pro

Arg

Ala 265

Leu

Thr

Leu

Ala

Tyr 270

Lys

Val

Pro

Leu

Ala 275

Gly

Leu

Glu

Tyr

Pro 280

Met

Leu

His

Tyr

Val 28S

Gly

Phe

Val

Pro

Val 290

íle

Asp

Gly

Asp

Phe 295

íle

Pro

Ala

Asp

Pro 300

íle

Asn

Leu

Tyr

Ala 305

Asn

Ala

Asp

íle 310

Asp

Tyr

íle

Ala

Gly 315

Thr

Asn

Met

Asp 320

Gly

His

íle

Phe

Ala

Ser

íle

Asp

Met

Pro

Ala

íle

Asn

Lys

Gly

Asn

32S 330 335

Lys Ly3 Val Thr Glu Glu Asp Phe Tyr Lys Leu Val Sar Clu Phe Thr 340 345 350

Ila Thr Lys Gly Leu Arg Gly Ala Lys Thr Thr Phe Asp Val Tyr Thr 355 360 . ' 365

Glu Ser Trp Ala Gin Asp Pro Ser Gin Glu Asn Lys Lys Lys Thr Val 370 375 380

Val Asp Phe Glu Thr Asp Val Leu Phe Leu Val Pro Thr Glu íle Ala

385 390 395 400

Leu Ala Gin Hie Arg Ala Asn Ala Lys Ser Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr

405 410 415

Leu Pho Ser Hlo Pro Ser Arg Mot Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly 420 425 430

11» ><

Ala

Asp

His 435

Ala

Asp

íle

Gin 440

Tyr

Val

Phe

Gly

Lys 445

Pro

' Phe

Ala

Thr

Pro 450

Thr

Gly

Ty r

Arg

Pro 455

Gin

Asp

Arg

Thr

Val 460

Ser

Lys

Ala

Met

Zle 4 55

Ala

Ty r

Trp

Thr

Asn 470

Phe

Ala

Lys

Thr

Gly 475

Asp

Pro

Asn

Met

Gly 430

Äsp

S«r

Ala

Val

Pro 485

Thr

His

Trp

Glu

Pro 490

Tyr

Thr

Glu

Asn 495

Ser

Gly

Ty r

Leu

Glu 500

íle

Thr

Lys

Het 505

Gly

Ser

Het 510

Ly3

Arg

Ser

Leu

Arg 515

Thr

Asn

Pha

Leu

Arg 520

Tyr

Trp

Thr

Leu

Thr 525

Tyr

Leu

Ala

Leu

Pre 53 0

Thr

Val

Thr

Asp

Gin 535

Glu

Ala

Thr

Pro

Val 540

Pro

Thr

Gly

Asp 545

Sar

Glu

Ala

Thr

Pro 550

Val

Pro

Thr

Gly 555

Asp

Ser

Glu

Thr

Ala 560

Pro

Val

Pro

Thr 565

Gly

Asp

Ser

Gly

Ala 570

Pro

Val

Pro

Pro 575

Thr

—L·*

Asp

Ser

Gly 580

Ala

Pro

Val

Pro 585

Pro. Thr

Gly

Asp

Ser 590

Gly

Ala

?ro

Pre

Val 595

Pro

Thr

Gly

Asp 600

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro 605

Val

Pro

~~~

Gly 610

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro 615

Pro

Val

Pro

Thr 620

Gly

Asp

Ser

Gly

λ^Λ 525

Pro

Val

Pro

Pro 630

Thr

Gly

Asp

Ser

Gly 635

Ala

Pro

Val

Pro 640

Pro

Thr

Gly

Asp

Ala 645

Gly

Pro

Val 650

Pro

Thr

Gly

Asp 65S

Ser

Ala

Pro

Pro 660

Val

Pro

Thr

Gly 665

Asp

Ser

Gly

Ala

Pro 670

Pro

Val

“ v*

Pro

Thr 675

Gly

Asp

Ser

Glu

Thr 680

Ala

Pro

Val

Pro

Pro 685'

Thr

Gly

Asp

C a *·

Gly 690

Ala

Pro

Val

Pro 695

Pro

Thr

Gly

Asp

Ser 700.

Glu

Ala

Pro

Val 705

Pro

Thr

Acp

Asp 710

Ser

Lys

Glu

Ala

Gin 715

Met

Pro

Ala

Val

íle 720

Arg Pha (2) Informácie o SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 568 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec:

(A) Organizmus: Homo sapiens (B) Typ tkaniva: mliečna žľaza (ix) Vlastnosti:

(A) Meno/Kľúč: peptid (B) Umiestnenie: 1...568 (C) Iné informácie:/značka =Variant_C (x) Publikačné informácie:

(A) Autori: Nilsson, Jeanette

Blacberg, Lars Carlsson, Peter Enerback, Sven Hernell, Olle Bjursell, Gunnar (B) Názov: Rekombinantná žlčovými soľami stimulovaná lipáza ľudského mlieka (C) Časopis: Eur. J. Biochem.

(D) Zväzok: 268 (E) Ročník: 35 (F) Strany: 26692-26698 (G) Dátum: 15.12.1993 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 4:

Ala 1

Lys

Leu

Gly

Ala 5

Val

Tyr

Thr

Glu

Gly Cly 10

Phe

Val

Glu

Gly 15

Val

Asn

Lys

Leu 20

Gly

Leu

Gly

Asp 25

Ser Val

Asp

íle

Phe 30

Lys

Gly

»

íle

Pro

Phe 35

Ala

Pro

Thr

Lys 40

Ala

Leu Glu

Asn

Pro 45

Gin

Pro

His

*

Pro

Gly 50

Trp

Gin

Gly

Thr

Leu 55

Lys

Ala

Ly3 Asn

Pho 60

Lys

Arg

Cys

Leu 65

Gin

Ala

Thr

Πβ

Thr 70

Gin

Asp

Ser

Thr Tyr 7S

Gly

Asp

Clu

Asp

Cya 80

Leu

Tyr

Leu

Asn

Ila 85

Trp

Val

Pro

Gin

Cly Arg 90

Lys

Gin

Val

Ser 95

Arg

Asp

Leu

Pro

Val 100

Met

íle

Trp

íle

Tyr 105

Gly Gly Ala

Phe

Leu 110

Met

Gly

Ser

Gly

His 115

Gly

Ala

Asn.

Phe

Leu 120

Asn

Asn Tyr

Leu

Tyr 12S

Αερ

Gly

Glu

Ila 130

Ala

Thr

Arg

Gly

Asn 135

Val

íle

Val Val

Thr 140

Pho

Asn

Tyr

Arg

*

Val 145

Gly

Pro

Leu

Gly

Phe ISO

Leu

Ser

Thr

Cly Asp 155

Ala

Asn

Leu

Pro

Cly 160

3

Asn

Tyr

Gly

Leu

Arg 165

Asp

Gin

Hio

Met

Ala íle 170

Ala

Trp

Val

Lys 175

Arg

Asn

íle

Ala

Ala 180

Phe

Gly

Asp

Pro 185

Asn Asn

Ilo

Thr

Leu 190

Phe

Gly

Glu

Ser

AJ a 195

Cly

Gly

Ala

Ser

Val 200

Ser

Leu Gin

Thr

Leu 205

Sor

Pro

Tyr

4-

Asn

Lys

Gly

Leu

íle

Arg

Ala

íle Ser

Gin

S«r Gly

Val

Ala

Leu

210

215

220

Ser

Pro

Trp

Val

íle

Gin

Lys

Asn

Pro Leu

Ph«

Trp Ala

Lys

Val

225

230

235

240

Ala

Glu

Lys

Val

Gly

Cys

Pro

Val

Gly Asp

Ala

Ala Arg

Met

Ala

Gin

•

245

250

2S5

Cys

Leu

Lys

Val

Thr

Asp

Pro

Arg

Alá Leu

Thr

Leu Ala

Tyr

Lys

Val

260

265

270

Pro

Leu

Ala

Gly

Leu

Glu

Tyr

Pro

Met Leu

His

Tyr Val

Gly

Phe

Val

275

280

235

Pro

Val

íle

Asp

Gly

Asp

Phe

íle

Pro Ala

Asp

Pro 11«

Asn

Leu

Tyr

290

295

-

300 ·

Ala

Asn

Ala

Asp

íle

Asp

Tyr

íle Ala

Gly

Thr Asn

Asn

Met

Asp

305

³¹⁰

315

320

Gly

His

íle

Phe

Ala

Ser

íle

Asp

Met Pro

Ala

íle Asn

Lys

Gly

Asn

325

330

335

Lys

Val

Thr

Glu

Asp

Phe

Tyr L-.·s

Leu

Val Ser

Glu

Phe

Thr

340

345

350

íle

Thr

Lys

Gly

Leu

Arg

Gly

Ala

Lys Thr

Thr

Phe Asp

Val

Tyr

Thr

355

-

•

360 ·

•

365

Glu

Ser

Trp

Ala

Gin

Asp

Pro

Ser

Gin Glu

Asn

Lys Lys

Lys

Thr

Val

370

375

330

Val

Asp

Phe

Glu

Thr

Asp

Val

Leu

Phe L-t u

Val

Pro Thr

Glu

íle

Ala

385 390 395 400

Leu Ala Gin HÍ3 Arg Ala Asn Ala Lys Šer Ala Lys Thr Tyr Ala Tyr 405 410. , 415

Leu Phe Ser His Pro Ser Arg Met Pro Val Tyr Pro Lys Trp Val Gly 420 425 430

Ala Asp ΗΪ3 Ala Asp Asp 11« Gin Tyr Val Pha Gly Lys Pro Phe Ala . 435 440 445

Thr Pro Thr Gly Tyr Arg Pro Gin Asp Arg Thr Val Ser Lys Ala Met 450 455· 460

íle 465

Ala

Tyr

Trp

Thr

Asn 470

Phe

Ala

Lys

Thr

Gly 475

Asp

Pro

Asn

Met

Gly 480

Asp

Ser

Ala

Val

Pro 485

Thr

His

Trp

Glu

Pro 490

Tyr

Thr

Glu

Asn 495

Ser

Gly

Tyr

LeU

Glu SOO

íle

Thr

Lys

Met 505

Gly

Ser

Het 510

Lys

Arg

Ser

Leu

Arg 515

Thr

Asn

Phe

Leu

Arg 520

Tyr

Trp

Thr

Leu

Thr 525

Tyr

Leu

Ala

Leu

Pro 530

Thr

Val

Thr

Asp

Gin 535

Gly

Ala

Pro

Val 540

Pro

Thr

Gly

Asp 545

Ser

Gly

Ala

Pro

Pro 550

Val

Pro

Thr

Gly 555

Asp

Ser

Lys

Glu

Ala 560

Gin Met Pro Ala Val íle Arg Phe 565

WO 96/37622

-Í5“

PCT/SE96AK)318

INDICATIONS RE LA TI N G T.O A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13ÓÓ)

A. The indications nude below relite to the rnicroorgmiini referred to ia tbc deicriptioa on page θ , lioe θ.

B. IDENTIFICATION OF DEPOSlľ Further deposia ire identified on »n addiuotul ibeei

Naxne of de po» i u ry iniututioa

The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB)

Addrexi of depositary initjtutícn (uscItUtngposlil code ud eauttry)

St Machar Drive Aberdeen AB2 1RY Scotiand, UK

Dáte of depaeit	Accasion Number
2 May 1995	NCIMB 40721

C. ADDmONAL INDICATIONS (Zeaveblaxi if aot tpfdicM:) Thii infonnetíoa a coatinaed on »n idditlcoil sbeet

In respect of all designated States in which súch action is possible and to the extern that it is legally permissible under the law of the designsted state, it is requested that a sample of the deposŕted micro-organism be rnade available onfy by the issue thereof to an indepondent expert, in accordance with the relevant patent legislation, e.g. Rule 28(4) EPC, and generally similar provisions mutatis murandis for any other designated state. .

D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (>f trt tet for tU kápMíal Si&

E. SEPARÁTE FURNTSH1NG OF INDICATIONS /ZoveiWifxot ippGcMj

The indicatioru listed below will besubmilted to the lnienutional Bureau Uter (spcôfyikegenerálnetere efiheix£cttion}c.g., Mrrrm Netxbcr of Depošt*} - · .

' For receiving Office use only

This xheet wu received with the interní tionil ipplication

For Intenutkxul Bureiu tne only f' 1 Thil iheet wis received by the Interní honil Búra n er

Authonzed officer

Autborized officer

CHRISTINA SENFTEN

Fonn PCT/RO/134 (July 1992)

WO 96/37622

-36,

PCT/SE96/00318

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13ó£r)

A- The indiejtiom nude below relite to tbe tniarooranúra referred to in tbe deicripóoa ,· 13-20 on poge __, lme ___

B. IDENTIFICATION OFDEPOSrT

Furthcr deposiu tre idcntifjed on »n additxxul theet j~

Nime of dcpocitiry imrituóoa

The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB)

Addrexc of depoiitary imtitution (ixcht£agpostilcoit txi cauxtry)

St Machar Drive Aberdeen AB2 1RY Scotiand, UK

Dete of depasit

May 1995

Acceuioo Number

NCIMB 40723

C. ADDITIONAL INDICATIONS bíutk if aot ippGccíí:) Tbii Information ô continued oa m sdditioeul ibeet [ [

In respect of all designated States in which súch action is possibla and to the exteňt that ŕt is legalfy permissible under the law of the designated state, it is requested thaťa sample of the deposŕted micro-organism ba mada available only by the issue thereof to an indapendent expert, in accordance with tha relevant patent legislation, a.g. Ruta 28(4) EPC, and generally sirrular proyisions mistatis mutandis for any other designated state.

D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE

E. SEPARÁTE FURNISHING OF INDICATIONS (íeove bhná if^ot ippt&ók)

The indicalioru liitcdbelow will be jubmilted to tbe Interrutiorul Burciu later (specify tkegenerálnabtrc of tkeia&celiom e^, Actcoit Ntuobcr of Depozit) ' '

For receivíng Office me only

For Intenutional B určia uie oaly

Tbii xbeet wu reocivcd with tbc intematkwul ipplication | | Thii ibeet wxj received by the Intenutional Borca u eru

Authorized ofBccr

Authorized officer

CHRISTINA SENFTEN

Forca PCTZÄO/l X (July 1992)

WO 96737622

-37_

PCTZSE96/00318

INDICATIONS RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT Rule 13ótí)

A. Tbc indicitioni nude beJow relale to tbc tnicrooremhrn referred to in tbc dcscripóoa >·„. 18-19 oa pige *, Ime.

B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further depotitt tre identiCcd oo m idditioail iheet

Nuoc of depoiitiry tmuruiioa

Tha National Coliactions of Industrial and Marine Bactaria Limited (NCIMB)

Addrcxx of depositary nuútutioo (ιλ:1*£λ[ pastel c&ie t*áccastry)

St Machar Drive Aberdeen AB2 1RY Scodand, UK

Dáte of dcpaait 2 May 1995

Acceuioo Nutnber

NCIMB 40722

C. ADDrnONÁL INDICATIONS (l&nv hlasí if κο( tppGcablc} Thia informaboa á ccnteued oa an addjttcoi] sbcet

In respact of all designatad States in which súch actíon is possibla and to tha extern that it is legally permissible undar tha iaw of tha designatad state, it is requested that a ssmple of tha dapositad micro-organism ba mada a va i to big cniy by tha issua therecf to en independent export, in accordanca with tha ralavant patent lagislation, a.g. Ruta 28(4) EPC, and genaralfy similsr provisions mutatis mutandís for any othar designatad stata. ·

D. DESIGNATÉD STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (Iftieh&tiixtt tnsotfor tB Αραιοί Stok

E. SEPARÁTE FURNISHING OF INDICATIONS (love hlasí tfaet tppCatbl^

The iná taliani lixtedbelowwillbcsubrniited (o tiu: lnternatiotulBurcauUterp/>ec(frtáe;ovre/*‘a<re<ytAetai££ittňare£, 'Xnzxt

Nmber ofDcpaôť)

For rccciving Office uie only

Tbix xbeet wu rccervcd with tbe intcrrutiotul appliatioa ——-· For Interná tksoal Borca u usc ooJy —— f | Tbňt theet wrs reccived by tbe International Burean a

Fonn PCTXO/154 (July 1992)

Autborized ofBoer

Autborized ofEcer

CHRIST1NA SENFTEN

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. DNA molekula obsahujúca:

(a) región kódujúci polypeptid, ktorý je ľudská BSSL alebo jej biologicky aktívna forma (b) región kódujúci signálny peptid schopný riadenia sekrécie uvedeného polypeptidu z Pichia pastoris transformovanej uvedenou DNA molekulou pripojený na 5'-koniec regiónu, ktorý kóduje uvedený polypeptid, a (c) metanol oxidázový promotor Pichia pastoris alebo funkčne ekvivalentný < promotor operatívne naviazaný na uvedené kódujúce regióny definované v (a) a (b).
2. DNA molekula podľa nároku 1, kde uvedený signálny peptid je identický s, alebo významne podobný s, peptidom s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou ako aminokyseliny -20 až -1 SEQ ID NO: 1 v zozname sekvencií.
3. DNA molekula podľa nároku 1, kde uvedený signálny peptid obsahuje invertázový signálny peptid Saccharomyces cerevisiae.
4. DNA molekula podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 kódujúca biologicky aktívnu variantu BSSL, v ktorej je aspoň jedna z opakujúcich sa jednotiek s 11 » aminokyselinami. deletovaná, kde uvedené opakujúce sa jednotky sú ‘ vyznačené v SEQ ID NO: 1.
5. DNA molekula podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4 kódujúca polypeptid, ktorý má BSSL aktivitu a aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň na 95 % homológna so sekvenciou podľa SEQ ID NO: 3 alebo SEQ ID NO: 4.
6. DNA molekula podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 kódujúca polypeptid, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu podľa SEQ ID NO: 3 alebo SEQ ID NO: 4.
7. Vektor obsahujúci DNA molekulu podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 6.
8. Replikovateľný expresný vektor podľa nároku 7, ktorý je schopný sprostredkovať expresiu ľudskej BSSL, alebo jej biologicky aktívnej varianty, v bunkách Pichia pastoris.
9. Vektor podľa nároku 8, ktorý je plazmidový vektor pARC 5771 (NCIMB 40721), pARC 5799 (NCIMB 40723) alebo pARC 5797 (NCIMB 40722).
10. Hostiteľské bunky rodu Pichia transformované vektorom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 7 až 9.
11. Hostiteľské bunky podľa nároku 10, ktoré sú Pichia pastoris bunky.
12. Hostiteľské bunky podľa nároku 11, ktoré sú Pichia pastoris bunky kmeňa

GS115.
13. Hostiteľské bunky podľa nároku 12, ktoré sú PPF-1 (pARC 5771) (NCIMB 40721), GS115( pARC 5799 )(NCIMB 40723) alebo GS115(pARC 5797) (NCIMB 40722).
14. Spôsob na produkciu polypeptidu, ktorý je ľudská BSSL, alebo jej biologicky aktívny variant, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kultiváciu hostiteľských buniek podľa akéhokoľvek z nárokov 10 až 13 v podmienkach, kedy je uvedený peptid secernovaný do kultivačného média, a získanie uvedeného polypeptidu z kultivačného média.