SK11612001A3 - Benzaldehyde derivatives useful as anticancer agents - Google Patents

Abstract

The present invention relates to benzaldehyde derivatives which are useful as anticancer agents. Some of the compounds of this invention are novel per se.

Description

Vynález sa týka derivátov benzaldehydu vhodných ako protinádorové prostriedky. Niektoré z uvedených zlúčenín sú zlúčeniny nové.The invention relates to benzaldehyde derivatives useful as antitumor agents. Some of the compounds are novel.

Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Väčšina v súčasnosti používaných protinádorových liečiv má cytotoxický účinok. Hoci uvedené prostriedky majú pozitívne výsledky pri liečbe niektorých zhubných nádorových ochorení, ako je lymfóm, leukémia a testikulárne zhubné nádory, často pri ich použití dochádza k ťažkým a neprijateľným vedľajším účinkom, ktoré obmedzujú možnosti ich použitia v účinnej liečbe. Ďalej u niektorých typov zhubných nádorov, ako sú pevné tumory (karcinómy), sa doposiaľ ukazuje, že chemoterapia má obmedzenú pôsobnosť, pretože súčasné cytostatiká zriedkavo zlepšia prognózu ochorenia pacienta. Schopnosť nádorových buniek vyvinúť si rezistenciu proti cytotoxickým prostriedkom patrí medzi hlavné dôvody ich zlyhávania V odbore teda existuje protinádorových prostriedkov, pri liečbe pevných nádorov, značná potreba nových ktoré majú menej vedľajších účinkov a ktoré by mali selektívnejšie účinky na malígne bunky.Most currently used anticancer drugs have a cytotoxic effect. Although these compositions have had positive results in the treatment of some cancers, such as lymphoma, leukemia and testicular cancers, they often have severe and unacceptable side effects that limit their use in effective therapy. Furthermore, some types of malignant tumors, such as solid tumors (carcinomas), have so far been shown to have limited efficacy as current cytostatics rarely improve patient prognosis. The ability of tumor cells to develop resistance to cytotoxic agents is one of the main reasons for their failure. Thus, there is a need in the art for anticancer agents, in the treatment of solid tumors, a great need for new ones with fewer side effects and more selective effects on malignant cells.

Je známe, medzi inými z EP-0215395, JP-63264411, JP8800940, JP-55069510 a EP-0283139, že benzaldehydy a ich deriváty majú selektívny protinádorový účinok.It is known, among others from EP-0215395, JP-63264411, JP8800940, JP-55069510 and EP-0283139, that benzaldehydes and their derivatives have a selective antitumor effect.

Aldehydy reagujú s rôznymi nukleofilnými skupinami obsahujúcimi O, S alebo N, ako sú hydroxyskupiny, tiolové skupiny a am inoakupiny, za vzniku karbonylových >The aldehydes react with various nucleophilic groups containing O, S or N, such as hydroxy, thiol and amino groups, to form carbonyl groups.

kondenzačných produktov, ako sú acetály, merkaptaly, aminaly, atď. Avšak s primárnymi amínmi obvykle reagujú za vzniku aduktov, Schiffových báz (imínov). Je notoricky známe, že tvorba Schiffových báz in vivo je zahrnutá v kľúčových biochemických procesoch, ako je transaminácia, dekarboxylácia a ďalšie aminokyselinami modifikované reakcie sprostredkované pyridoxalfosfátom, pri pôsobení aldolázy alebo fruktózy-difosfátu pri glykolýze a pri kondenzácii retinolu s rodopsinom v procese videnia. Taktiež je známe, že karbonylové kondenzačné reakcie sú zahrnuté v transmembránových signálnych procesoch, napríklad v generácii imunitnej odpovede.condensation products such as acetals, mercaptals, aminals, etc. However, they usually react with primary amines to form adducts, Schiff bases (imines). It is notorious that the formation of Schiff bases in vivo is involved in key biochemical processes such as transamination, decarboxylation and other amino acid modified reactions mediated by pyridoxal phosphate, under the action of aldolase or fructose diphosphate during glycolysis and condensation of retinol with rhodopsin in the visual process. It is also known that carbonyl condensation reactions are involved in transmembrane signaling processes, for example in the generation of an immune response.

Tvorba imínov sa uskutočňuje dvojstupňovým mechanizmom: pridaním amínového nukleofilu ku karbonylovej skupine vznikne karbinolaminový (aminohydrínový) medziprodukt, v ktorom v následnom dehydratačnom stupni vznikne C=N dvojitá väzba. Oba stupne sú reverzibilné, pričom reakcia je podporovaná hodnotou pH. Reakcia sa teda uskutočňuje spôsobom, kde závislosť pH/rýchlosť má chrakteristický zvonovitý profil s najvyššími rýchlosťami reakcie v mierne kyslom prostredí.Imine formation is accomplished by a two-step mechanism: the addition of an amine nucleophile to the carbonyl group results in a carbinolamine (aminohydrin) intermediate in which a C = N double bond is formed in the subsequent dehydration step. Both steps are reversible, the reaction being supported by pH. Thus, the reaction is carried out in a manner where the pH / rate dependency has a characteristic bell-shaped profile with the highest rates of reaction in a slightly acidic environment.

aldehydaldehyde

H₂N—R' amínH ₂ N - R 'amine

OHOH

R—C—N—R' R—C=N—R' + H_ZOR — C — N — R 'R — C = N — R' + H _Z O

I III II

H HH karbinolaminiminH HH carbinolaminimine

Avšak tiež je známe, že Schiffove bázy ľahko vznikajú aj vo fyziologických podmienkach a že in vivo prebieha mnoho karbonylových kondenzačných reakcií (E. Schauenstein a kol., Aldehydes in biological systems, London, Pion Ltd., 1977).However, it is also known that Schiff bases are readily formed under physiological conditions and that many carbonyl condensation reactions take place in vivo (E. Schauenstein et al., Aldehydes in biological systems, London, Pion Ltd., 1977).

Schiffove bázy sú reaktívne, majú sklon zúčastniť sa ďalších reakcií, prostriedkov na obsahujúcich síru, ktoré vedú k adícii nukleofilných dvojitú väzbu. Z určitých aminov predovšetkým z aminokyselín, cysteinu, metionínu a taktiež glutatiónu, prvotne vzniknuté Schiffove bázy môžu podliehať reverzibilnej vnútornej cyklizácii, pri ktorej sa sulfhydrylová spojí s imínom za vzniku tiazolidínkarboxylátu (M. Friedman, The Chemistry and Biochemistry of Sulfhydryl Group in Amino Acids, Peptides and Proteins, Oxford, Pergamon Press, 1973) .Schiff's bases are reactive, tend to participate in other reactions, sulfur-containing compositions that lead to the addition of nucleophilic double bonds. Of certain amines, particularly amino acids, cysteine, methionine, and also glutathione, the initially formed Schiff bases may undergo reversible internal cyclization in which the sulfhydryl group is coupled with an imine to form a thiazolidine carboxylate (M. Friedman, The Chemistry and Biochemistry of Sulfhydryl Group in Amino Acids, Peptides and Proteins (Oxford, Pergamon Press, 1973).

//°// °

R—C \ HR = C \ H

S—ch₂ S — ch ₂

H₂O aldehyd cysteín tiazolidin-karboxylová kyselinaH ₂ O aldehyde cysteine thiazolidine-carboxylic acid

Výskyt reakcií prebiehajúcich medzi karbonylovými zlúčeninami a voľnými aminoskupinami proteínov, ktoré tvoria reverzibilné väzby Schiffových báz opísali G.E. Means a R. E. Feeney (Chemical Modification of Proteins, str. 125-138, San Francisco, Holden-Day, 1971). Aromatické aldehydy sú obyčajne reaktívnejšie ako nasýtené alifatické aldehydy a dokonca môžu tvoriť Schiffove bázy bez odstraňovania vody vzniknutej v priebehu reakcie. (R.W. Layer, Chem: Rev.63 (1963), 489-510). Táto skutočnosť je významná pri posudzovaní možnosti tvorby Schiffových báz vo fyziologických podmienkach. Zaugg a kol. (J. Biol. Chem. 252 (1977), 8542-8548) s použitím hemoglobínu ako zdroja aminoskupín preukázali, že aromatické aldehydy majú pre tvorbu Schiffových báz dvakrát až trikrát vyššiu reaktivitu v porovnaní s alifatickými aldehydmi. Vysvetlenie obmedzenej aktivity alkanalov spočíva v tom, že vo vodnom roztoku pri neutrálnom pH je pre posun rovnováhy v prospech tvorby Schiffových báz nutný veľmi veľký prebytok voľného aldehydu (E. Schauenstein a kol., Aldehydes in biologicalThe occurrence of reactions occurring between carbonyl compounds and free amino groups of proteins that form reversible Schiff base bonds is described by G.E. Means and R. E. Feeney (Chemical Modification of Proteins, pp. 125-138, San Francisco, Holden-Day, 1971). Aromatic aldehydes are usually more reactive than saturated aliphatic aldehydes and may even form Schiff bases without removing the water formed during the reaction. (R. W. Layer, Chem: Rev. 63 (1963), 489-510). This fact is important in assessing the possibility of Schiff base formation under physiological conditions. Zaugg et al. (J. Biol. Chem. 252 (1977), 8542-8548) using hemoglobin as the source of amino groups, have shown that aromatic aldehydes have two to three times higher reactivity to the formation of Schiff bases compared to aliphatic aldehydes. The explanation for the limited activity of alkanals is that in an aqueous solution at neutral pH, a very large excess of free aldehyde is required to shift the equilibrium in favor of Schiff base formation (E. Schauenstein et al., Aldehydes in biological

systems, London, systems, London, Pion Ltd., 1977). Pion Ltd., 1977). Benzaldehyd benzaldehyde a salicylaldehyd ľahko tvoria imínové and salicylaldehyde readily form imine

Schiffove bázy s aminoskupinami membrán, a pre reakciu benzaldehydu s iminmi boli zistené vysoké hodnoty rovnovážnych konštánt (J.J. Pesek a J.H. Frost, Org. Magnet. Res., 8 (1976), 173-176; J.N. Williams Jr. a R.M. Jacobs, Biochem. Biophys. Acta, 154, (1968), 323-331).Schiff bases with amino groups of membranes, and for the reaction of benzaldehyde with imines, high equilibrium constants were found (JJ Pesek and JH Frost, Org. Magnet. Res., 8 (1976), 173-176; JN Williams Jr. and RM Jacobs, Biochem Biophys Acta, 154, (1968), 323-331).

Autori vynálezu už predtým dokázali pomocou rádioaktívneho značenia, že benzaldehyd nepreniká do bunky, ale prilípa na bunkovej membráne (Dornish J.M. a Pettersen E.O.: Cancer Letters 29 (1985) 235-243). Tento poznatok je v zhode s predošlou štúdiou dokazujúcou, že benzaldehyd interaguje s membránovými proteínmi E.coli (K. Sakaguchi a kol., Agric. Biol. Chem., (1979), 43, 1775-1777). Taktiež bolo zistené, že pyridoxal aj pyridoxal-5-fosfát chránia bunky proti cytotoxickému a protinádorovému prostriedku cis-DDP. Cis-DPP je prostriedok pôsobiaci na jadro bunky. Zatiaľ čo pyridoxal v zásade môže prenikať lipofilnou bunkovou membránou, u pyridoxal-5-fosfátu túto možnosť blokuje iónovo pripojená fosfátová skupina. Pyridoxal-5fosfát teda musí vykazovať svoj chrániaci účinok pôsobením na bunkovú membránu zvonka. Tvorbe adukta, Schiffovej bázy vzniknutej medzi aldehydom a aminoskupinami bunkovej membrány taktiež odpovedá súčasne pozorovaný spektrálny posun absorbancie pyridoxal-5-fosfátu smerom k nižším vlnovým dĺžkam (J.M. Dornish a E.O. Pettersen, Cancer Lett., 29, (1985), 235-243).Previously, the inventors have demonstrated by radiolabeling that benzaldehyde does not penetrate the cell, but adheres to the cell membrane (Dornish J.M. and Pettersen E.O .: Cancer Letters 29 (1985) 235-243). This finding is consistent with a previous study demonstrating that benzaldehyde interacts with E.coli membrane proteins (K. Sakaguchi et al., Agric. Biol. Chem., (1979), 43, 1775-1777). It has also been found that both pyridoxal and pyridoxal-5-phosphate protect cells against the cytotoxic and antitumor agent cis-DDP. Cis-DPP is a cell core agent. While pyridoxal can basically penetrate the lipophilic cell membrane, in pyridoxal-5-phosphate, this possibility is blocked by the ionically attached phosphate group. Thus, pyridoxal-5-phosphate must exert its protective effect by acting on the cell membrane externally. The formation of the adduct, the Schiff base formed between the aldehyde and the amino groups of the cell membrane, also corresponds to the simultaneously observed spectral shift of pyridoxal-5-phosphate absorbance towards lower wavelengths (JM Dornish and EO Pettersen, Cancer Lett., 29, (1985), 235-243) .

Z týchto zistení vyplýva, že aldehydy sa viažu na amíny a ďalšie nukleofilné skupiny na bunkovej membráne za vzniku Schiffových báz a ďalších kondenzačných produktov.These findings suggest that aldehydes bind to amines and other nucleophilic groups on the cell membrane to form Schiff bases and other condensation products.

Tiež Too je známe, že stimulácia rastu buniek je it is known that stimulation of cell growth is

sprostredkovaná kaskádou procesov pôsobiacich na bunkovú membránu z vonkajšej strany. Rovnakým spôsobom môžu deriváty podľa predloženého vynálezu vyvolať tvorbou aduktov s ligandmi na bunkovej membráne spúšťacie impulzy vnútri bunky, významné pre parametre rastu buniek ako je syntéza proteínov a mitóza, a na expresiu génov supresie tumorov a imunitných reakcií. Pretože kondenzačné reakcie sú reverzibilné, účinky na bunku možno modulovať posunom rovnováhy v náväznosti od viažucich sa zložiek. Prítomnosť tejto existujúcej rovnováhy na chemickej úrovni je konzistentná, s reverzibilným a netoxickým účinkom pozorovaným u derivátov benzaldehydu.mediated by a cascade of processes affecting the cell membrane from outside. In the same way, the derivatives of the present invention can induce intracellular triggering pulses on the cell membrane, important for cell growth parameters such as protein synthesis and mitosis, and for the expression of tumor suppression genes and immune responses. Because the condensation reactions are reversible, the effects on the cell can be modulated by shifting the equilibrium following from the binding components. The presence of this existing equilibrium at the chemical level is consistent, with the reversible and non-toxic effect observed with benzaldehyde derivatives.

Inhibíciu syntézu proteínov vyvolanú derivátmi benzaldehydu dôkladne študuje in vitro výskumná skupina autorov vynálezu. U pevných tumorov môže mať redukcia syntézy proteínov za následok nedostatok vitálnych proteínov, ktorý vedie k bunkovej smrti. U normálnych buniek je potenciálna kapacita syntézy proteínov väčšia ako u väčšiny nádorových buniek pevných tumorov. Túto skutočnosť možno demonštrovať porovnaním času trvania bunkového cyklu normálnych kmeňových buniek, ktorý je často pod 10 hodín a je teda kratší ako u väčšiny nádorových buniek pevných tumorov, kde uvedený čas je obvykle 30 až 150 hodín (pozri Gustavo a Pileri „The Celí Cycle and Cancer, Ed. : Baserga, Marcel Dekker Inc., N.Y., 1971, str. 99) . Pretože bunky počas svojho bunkového cyklu v priemere zdvojnásobujú proteín, znamená to, že rastovo stimulované normálne bunky majú akumuláciu proteínu vyššiu ako väčšina typov nádorových buniek.Inhibition of protein synthesis induced by benzaldehyde derivatives has been thoroughly studied by the in vitro research group of the inventors. In solid tumors, a reduction in protein synthesis may result in a lack of vital proteins leading to cell death. In normal cells, the potential capacity of protein synthesis is greater than in most solid tumor tumor cells. This can be demonstrated by comparing the cell cycle time of normal stem cells, which is often below 10 hours, and is therefore shorter than most solid tumor cells, where said time is usually 30 to 150 hours (see Gustavo and Pileri "The Cell Cycle and Cancer, Ed., Baserga, Marcel Dekker Inc., NY, 1971, p. 99). Since cells on average double the protein during their cell cycle, this means that growth-stimulated normal cells have a protein accumulation higher than most tumor cell types.

Okrem znalosti vyššie uvedeného rozdielu medzi normálnymi a nádorovými bunkami existuje ešte ďalší rozdiel podobného významu. Zatiaľ čo normálne bunky majú odpoveď na regulačné rastové podnety, nádorové bunky majú uvedenú odpoveď zníženú alebo žiadnu. Takže kým normálne bunky v normálnych podmienkach rastu majú rezervu v rastovom potenciáli, nádorové bunky majú uvedenú rezervu malú alebo žiadnu. Ak sa inhibícia syntézy proteínov uplatní rovnaký dlhší čas na normálne aj na nádorové bunky, môžu tieto dva typy buniek reagovať odlišne. Normálne tkanivo môže využiť svoje rastové rezervy a tým si zachovať svoju normálnu tvorbu buniek. Avšak nádorové tkanivo má malé alebo žiadne rezervy. V rovnakom čase možno rýchlosť akumulácie proteínu u väčšiny nádorových buniek hodnotiť ako nízku (t.j. syntéza proteínu je len mierne vyššia ako jeho degradácia). Preto inhibícia syntézy proteínu môže byť dostatočným faktorom pre vyvolanie nerovnováhy v tumorovom tkanive, pokial ide o akumuláciu proteínu, a vyvolať tak negatívny posunvo vyváženosti určtých proteínov. Pri kontinuálnej liečbe počas niekoľkých dní tak možno dosiahnuť aktiváciu buniek a nekrózu tumorového tkaniva, zatiaľ čo normálne tkanivo zostáva nepoškodené.In addition to knowing the above difference between normal and tumor cells, there is another difference of similar significance. While normal cells respond to regulatory growth stimuli, the tumor cells have said response decreased or absent. Thus, while normal cells under normal growth conditions have a reserve in growth potential, the tumor cells have said reserve little or no. If inhibition of protein synthesis is applied for the same longer period of time to both normal and tumor cells, the two cell types may react differently. Normal tissue can use its growth reserves to maintain its normal cell formation. However, tumor tissue has little or no reserve. At the same time, the rate of protein accumulation in most tumor cells can be assessed as low (i.e., protein synthesis is only slightly higher than degradation). Therefore, inhibition of protein synthesis may be a sufficient factor to induce imbalances in tumor tissue in terms of protein accumulation, thereby causing a negative shift in the balance of certain proteins. Thus, in continuous treatment over several days, cell activation and necrosis of tumor tissue can be achieved, while normal tissue remains intact.

V súčasnosti najčastejšie hodnotenou zlúčeninou indukujúcou reverzibilnú inhibiciu proteínovej syntézy a vykazujúcou protinádorovú účinnosť je 5,6-benzylidén-diaskorbová kyselina, [zilaskorb(²H)]. Táto, už v odbore známa zlúčenina inhibujúca proteínovú syntézu je podrobne opísaná v práci autorov Petterson a kol., (Anticancer Res., Vol.ll, str. 1077-1082, 1991) a v EP-0283139. Zilaskorb (²H) indukuje nekrózu tumoru in vivo v ľudských tumorových xenoimplantátoch na holých myšiach (Petterson a kol., Br. J. Cancer, Vol. 67, str. 650-656, 1993). Okrem zilaskorbu (^kH) je najbližšou zatiaľ známou zlúčeninou v tejto oblasti na liečbu nádorových ochorení 4,6-0benzylidén-D-glukopyranóza (zlúčenina 1). O týchto dvoch zlúčeninách je známe, že majú všeobecnú protinádorovú účinnosť a boli už hodnotené v klinických skúškach proti viacerým nádorovým chorobám. Avšak žiadna navrhovaná liečba orgánov alebo tkanív postihnutých nádorovým ochorením, navrhovaná ako vhodná s použitím uvedených zlúčenín a obchodný vývoj týchto prostriedkov, neboli doteraz schválené.Currently, the most common by compound inducing reversible protein synthesis inhibition and displaying anti-cancer activity is 5,6-benzylidene-diascorbic acid [zilascorb ^(2H)]. This protein synthesis inhibiting compound, already known in the art, is described in detail in Petterson et al., (Anticancer Res., Vol. 11, pp. 1077-1082, 1991) and in EP-0283139. Zilascorb ^(2H) induces tumor necrosis in vivo in human tumor xenografts in nude mice (Pettersen et al., Br. J. Cancer, Vol. 67, pp. 650-656, 1993). In addition to zilaskorb ( ^to H), the closest known compound in the art for the treatment of cancer is 4,6-benzylidene-D-glucopyranose (Compound 1). These two compounds are known to have general antitumor activity and have already been evaluated in clinical trials against multiple cancer. However, no proposed treatment of organs or tissues afflicted with cancer, suggested to be suitable using the above compounds, and the commercial development of these compositions have not been approved to date.

Autori vynálezu teraz prekvapivo zistili, že benzaldehydové deriváty cukrov hexózového typu (zahŕňajúce 4,6-0-(benzylidén-dj)-D-glukopyranózu, zlúčeninu 2) majú neočakávane silný účinok na nádory v určitých orgánoch alebo v tkanivách. Doteraz nie je možné vysvetliť mechanizmus vyššie uvedenej selektivity, ale predpokladá sa, že súvisí s cukrovou skupinou uvedených derivátov pôsobiacich na učité bunky alebo tkanivá. Napríklad zlúčenina 2 (glukózový derivát deuterovaného benzaldehydu) má prekvapivo lepší účinok na nádor pečene ako zilaskorb (²H) (derivát deuterovaného benzaldehydu a kyseliny askorbovej) (pozri príklad 6). Takisto v pokusoch na bunkách Panc-1 pochádzajúcich z ľudského adenokarcinómu pankreasu bolo prekvapivo zistené, že zlúčenina 2 indukuje silnejšiu inhibíciu proteínu ako zilaskorb(²H) (pozri príklad 2, obr. 3). Uvedené tkanivá majú, spoločné, že obsahujú vysoké hladiny určitých prenášačov glukózy a ich receptorov. V literatúre nie je uvedená žiadna zmienka predpovedajúca lepšiu liečbu nádoru pečene alebo pankreasu zlúčeninou 2, v porovnaní so zilaskorbom(²H) . Naopak, na základe pokusov opísaných v EP-0283139 by sa dalo predpokladať, že zlúčenina 2 by mala vykazovať podobné alebo menšie účinky ako zilaskorb(²H) .Surprisingly, the inventors have now found that benzaldehyde derivatives of hexose type sugars (including 4,6-O- (benzylidene-dj) -D-glucopyranose, compound 2) have an unexpectedly potent effect on tumors in certain organs or tissues. To date, the mechanism of the above selectivity cannot be explained, but it is believed to be related to the sugar moiety of the aforementioned cell or tissue derivatives. For example, compound 2 (a glucose derivative of deuterated benzaldehyde) has a surprisingly better effect on the tumor in the liver than zilascorb ^(2H) (a derivative of deuterated benzaldehyde and ascorbic acid) (see Example 6). Also, in experiments on Panc-1 cells derived from human pancreatic adenocarcinoma, it was surprisingly found that compound 2 induces stronger protein inhibition than zilaskorb ( ² H) (see Example 2, Figure 3). These tissues have in common that they contain high levels of certain glucose transporters and their receptors. In the literature there is no reference predict an improved treatment of cancer of the liver or pancreas Compound 2 as compared to zilascorb ^(2H). On the other hand, on the experiments described in EP-0283139 one would expect that Compound 2 would show similar or less effect than zilascorb ^(2H).

Autori vynálezu vo svojich štúdiách taktiež zistili, že deuterované analógy uvedených zlúčenín sú účinnejšie ako ich odpovedajúce protónové analógy. Tento rozdiel je veľmi zrejmý v pokuse, ktorý hodnotí adhéziu na bunky (pozri príklad 3 a aj príklad 7). Pri nahradení atómu vodíka sThe inventors have also found in their studies that deuterated analogs of the compounds are more effective than their corresponding proton analogs. This difference is very obvious in an experiment that evaluates cell adhesion (see Example 3 and also Example 7). When replacing a hydrogen atom with p

dvojnásobne ťažkým atómom deuteriového izotopu, kinetické vlastnosti molekuly sa zmenia pomerom, v ktorom sa zníži rýchlosť prerušenia väzby C-D k rýhlosti prerušenia väzby C-H. Je známe, okrem iného z práce autorov M.I. Blake a kol., J. Pharm. Sci., 64(1975), 367-391, že deuterácia liečiv môže zmeniť ich farmakologickú funkciu.By doubly heavy deuterium isotope atom, the kinetic properties of the molecule are altered by the ratio in which the rate of C-D binding to the rate of C-H binding is reduced. It is known, inter alia, from the work of M.I. Blake et al., J. Pharm. Sci., 64 (1975), 367-391, that deuteration of drugs can alter their pharmacological function.

V odbore je taktiež známe (EP 0 283 139 a Anticancar Res. 15:1921-1928 /1995/), že nahradenie acetálového protónu v 4,6-0-benzylidén-D-glukopyranóze deutériom (zlúčenina 1 verzus zlúčenina 2), ovplyvňuje ako syntézu proteínu, tak frakciu prežívajúcich buniek stanovených in vitro. Autori vynálezu predpokladajú, že jedno z mnohých vysvetlení spočíva v tom, že účinok D-izotopu na chemickej úrovni súvisí so spomalením oxidácie deuterovaného benzaldehydu na aktívnu kyselinu benzoovú, čo taktiež vedie k ďalšiemu polčasu deuterovanej účinnej zložky na bunkovej úrovni. Avšak pre preukázanie významného rozdielu účinkov na prežívajúcu frakciu buniek NHIK 3025 exponovaných zlúčeninou 1 resp. 2, musí byť aplikovaná koncentrácia liečiva väčšia ako 6 mM. Rozdiel v účinkoch inhibujúcich syntézu proteínu je veľmi malý, pokiaľ sa bunky vystavia koncentráciám 1-10 mM.It is also known in the art (EP 0 283 139 and Anticancar Res. 15: 1921-1928 (1995)) that replacing the acetal proton in 4,6-O-benzylidene-D-glucopyranose with deuterium (compound 1 vs. compound 2) affects both protein synthesis and the fraction of surviving cells determined in vitro. The inventors assume that one of many explanations is that the effect of the D-isotope at the chemical level is related to the retardation of oxidation of deuterated benzaldehyde to the active benzoic acid, which also leads to an additional half-life of the deuterated active ingredient at the cellular level. However, to demonstrate a significant difference in effects on the surviving fraction of NHIK 3025 cells exposed to Compound 1 and Compound 1, respectively. 2, the drug concentration applied must be greater than 6 mM. The difference in protein synthesis inhibiting effects is very small when cells are exposed to concentrations of 1-10 mM.

Autori vynálezu uskutočnili úplne odlišný pokus. Pokus zahŕňa meranie adhéznej sily medzi bunkami NHIK 3025 a substrátom po preinkubácii buniek v roztokoch zlúčenín 1 a 2 (pozri príklad 3) . Aj pri koncentráciách 1 mM mal uvedený pokus s použitím D-izotopu prekvapujúce výsledky. S použitím zlúčeniny 2 došlo k významnej redukcii adhéznej sily na 1/3 vzhľadom na kontrolný pokus, zatiaľ čo u zlúčeniny 1 nedošlo k významnej redukcii adhéznej sily. Autori vynálezu predpokladajú, že zlúčenina 2 môže interferovať s biosyntézou integrinov pri zníženej schopnosti buniek pripojiť sa k substrátu. Integriny sú štrukturálne trans-membránové proteíny rozhodujúce pre väzbu buniek na extracelulárnu matricu a pre vzájomné bunkové interakcie. Inhibicia funkcie integrinov by tak mohla nepriamo pôsobiť na schopnosť nádorových buniek metastázovať. Z uvedeného pokusu vyplýva, že integríny by mohli byť mimoriadne senzitívne na inhibíciu syntézy proteínov. Podlá vyššie uvedeného by tak zlúčenina 2 mohla mať vhodné použitie pri prevencii šírenia metastáz pri nádorovom ochorení.The inventors carried out a completely different experiment. The experiment involves measuring the adhesion force between NHIK 3025 cells and the substrate after preincubation of the cells in solutions of compounds 1 and 2 (see Example 3). Even at concentrations of 1 mM, the experiment using D-isotope showed surprising results. Using compound 2 there was a significant reduction in adhesion strength to 1/3 relative to the control, while compound 1 did not significantly reduce adhesion strength. The inventors hypothesize that compound 2 may interfere with integrin biosynthesis while reducing the ability of cells to attach to the substrate. Integrins are structural trans-membrane proteins critical for cell binding to the extracellular matrix and for cell-cell interactions. Thus, inhibition of integrin function could indirectly affect the ability of tumor cells to metastasize. The above experiment suggests that integrins could be extremely sensitive to inhibition of protein synthesis. Accordingly, Compound 2 could thus have a useful use in preventing the spread of metastasis in cancer.

Účinok zlúčeniny 1 a 2 bol porovnaný v in vivo modeli, kde nádorové bunky ľudskej kolorektálnej nádorovej bunkovej línie C170HM2 napádajúce pečeň boli injikované i.p. holým myšiam podrobeným liečbe. U zvierat ošetrených zlúčeninou 2 bol výskyt pečeňových tumorov prekvapivo menší ako u zvierat ošetrených zlúčeninou 1 (pozri príklad 7).The effect of Compounds 1 and 2 was compared in an in vivo model where human liver colorectal cancer cell line C170HM2 tumor cells were injected i.p. nude mice treated. Surprisingly, the incidence of liver tumors in Compound 2-treated animals was less than in Compound 1-treated animals (see Example 7).

Vo vyššie opísaných pokusoch bolo dokázané, že účinok D-izotopov by pri liečbe aldehydovými derivátmi mohol viesť k účinnejšej liečbe nádorov než sú doteraz známe výsledky. Z uvedených dvoch pokusov posúdených spoločne (príklady 3 a 7) vyplýva, že zlúčenina 2 a podobné liečivá by mohli byť mimoriadne vhodné na liečbu primárnych a sekundárnych nádorov pečene.In the experiments described above, it has been shown that the effect of D-isotopes in treatment with aldehyde derivatives could lead to a more effective treatment of tumors than previously known results. From the two experiments considered together (Examples 3 and 7), it follows that Compound 2 and similar drugs could be particularly suitable for the treatment of primary and secondary liver tumors.

Použitie zlúčeniny 1 (4,6-O-benzylidén-D-glukopyranóza) medzi iným na liečbu nádorov pečene je opísané v US 4,882,314. Podlá pokusu 2 v US 4,882,314 bol liečený pacient s karcinómom hrubého čreva, ktorý metastázoval v pečeni. Avšak v pokuse 5 podlá uvedeného US patentu pacient s primárnym tumorom pečene zomrel 4 mesiace po liečbe.The use of compound 1 (4,6-O-benzylidene-D-glucopyranose) inter alia for the treatment of liver tumors is described in US 4,882,314. Experiment 2 in US 4,882,314 treated a colon cancer patient who metastasized in the liver. However, in Experiment 5 of the aforementioned US patent, a patient with a primary liver tumor died 4 months after treatment.

Neskôr G. Tannum a kol., Am. J. Clin. Oncol. (CCT), 13(2), 1990, str. 161-163 prišli k záveru, že zlúčenina 1 nie je účinná na liečbu kolorektálneho nádoru. Liek bol v uvedenej štúdii podávaný 2 mesiace raz denne a účinok bol hodnotený meraním veľkosti nádoru.Later, G. Tannum et al., Am. J. Clin. Oncol. (CCT), 13 (2), 1990, p. 161-163 concluded that Compound 1 was not effective for the treatment of colorectal tumor. In this study, the drug was administered 2 months once a day and the effect was evaluated by measuring the tumor size.

V pokuse, ktorý uskutočnili autori vynálezu na chemicky indukovanom nádore pečene u krýs Wistar, ktoré boli 10 dni liečené intravenóznym podávaním liečiva, bolo prekvapujúco zistené, že u 2 z 5 zvierat liečených zlúčeninou 2 vznikli masívne nekrotické plochy, zatiaľ čo u zvierat liečených zlúčeninou 1 k tomuto javu neprišlo u žiadneho z 5 ošetrovaných zvierat.Surprisingly, in an experiment performed on chemically induced liver tumor in Wistar rats treated for 10 days by intravenous drug administration, it was surprisingly found that 2 out of 5 animals treated with compound 2 developed massive necrotic areas, whereas in animals treated with compound 1 this phenomenon did not occur in any of the 5 treated animals.

Autori vynálezu uskutočnili ďalšiu štúdiu, v ktorej holé myši injikovali bunkami C170HM2 ošetrili zlúčeninou 1 a zlúčeninou 2. Tumorová línia C170HM2 je ľudská bunková línia odvodená od primárneho kolorektálneho nádoru pacienta. Na konci pokusu bola pečeň vyňatá a boli spočítané viditeľné tumory pečene a ich celková prierezová plocha. Účinok zlúčeniny 2 na inváziu ľudského kolorektálneho tumoru C170HM2 do pečene bol oveľa lepší ako pri použití zlúčeniny 1 (príklad 7).The inventors conducted another study in which nude mice injected with C170HM2 cells treated with Compound 1 and Compound 2. The C170HM2 tumor line is a human cell line derived from the patient's primary colorectal tumor. At the end of the experiment, the liver was removed and the visible liver tumors and their total cross-sectional area were counted. The effect of compound 2 on invasion of human colorectal tumor C170HM2 into the liver was much better than that of compound 1 (Example 7).

Ďalej autori vynálezu prekvapujúco zistili, že zlúčenina 2 má podstatne lepši účinok na vývoj nádoru pečene u krýs ako zilaskorb (²H) . Po počiatočnej aplikácii nitrozamínu mladým krysám a čiastočnej hepatoektómii sa v priebehu 3 až 6 mesiacov u zvierat vyvinie nádor pečene. Po ďalších 11 mesiacoch, kedy zvieratá boli liečené buď zilaskorbom(²H) alebo zlúčeninou 2 sa zistilo, že ako počet zvierat s vývojom nádorov, tak veľkosť nádorového tkaniva v pečeni je u zvierat liečených zlúčeninou 2 niekoľkonásobne nižšia v porovnaní so zvieratami liečenými zilaskorbom (²H) (pozri príklad 6).Further, the inventors have surprisingly found that Compound 2 has a much better effect on development of liver cancer in rats than zilascorb ^(2H). After initial administration of nitrosamine to young rats and partial hepatoectomy, the animals develop a liver tumor within 3 to 6 months. After an additional 11 months of treatment with either zilaskorb ( ² H) or compound 2, both the number of tumor-developing animals and the liver tissue size in the compound 2 treated animals were found to be several times lower compared to the animals treated with zilaskorb ( ² H) (see Example 6).

IIII

Bolo teda zistené, že terapeutický metastázy známych terapií.Thus, therapeutic metastases of known therapies have been found.

zlúčenina prekvapujúco (primárne s výsledkami lepší aj na doteraz účinok na pečeni) poskytuje nádory pečene v porovnaní inbredného kmeňa Wistarsurprisingly (primarily with better results to date on liver effect), the compound provides liver tumors as compared to the inbred Wistar strain

Krysámrats

Path. Microbiol. Scand., 34, (1954), (pozriPath. Microbiol. Scand., 34, (1954), (cf.

554-562) boli vplyvom autosomálneho dominantného génu vyvolané veku 11 mesiacov boli zvieratá operované, či sa im vyvinul nádor (50 % zvierat malo pokusu boli zahrnuté zvieratá s nádorom základe skúsenosti, nekrotické oblasti.554-562) caused by the autosomal dominant gene induced at 11 months of age, the animals were operated on whether they developed a tumor (50% of the animals attempted included tumor-based animals, necrotic areas).

Eker R., Acta že v týchto malých zvieratám sa nádory ladvín. Vo aby bolo zistené nádor ladvín). velkým 2-4 mm nádoroch nieEker R., Acta. (In order to detect a tumor of the ladvin). large 2-4 mm tumors do not

Do na súTo the are

Týmto solný zilaskorb (²H) , sol dni injekčné roztok (placebo) alebo solný nedeuterovaný analóg (sodnú sol 5,6-benzylidén-askorbovej zlúčeninu 2. Zatiaľ čo po 10 dňoch liečenia ktorým bol podávaný nedeuterovaný analóg podával izotonický roztok obsahujúci zilaskorbu (²H) kyseliny) alebo tumory zvierat, zilaskorbu(²H) rovnako tak ako placebo, vykazovali len malé alebo žiadne nekrózy, polovica tumorov zvierat ošetrených zilaskorbom(²H) alebo zlúčeninou 2 bola nekrotická (pozri príklad 8).Thus, saline zilaskorb ( ² H), saline solution for injection (placebo) or saline undeuterated analogue (sodium salt of 5,6-benzylidene-ascorbic compound 2), whereas after 10 days of treatment with a non-deuterated analogue, administered an isotonic solution containing zilaskorb ( ² H) acid), or animal tumors, zilascorb ⁽² H) as well as a placebo, exhibited little or no necrosis, half of the tumors of animals treated with zilascorb ^(2H) and compound 2 was necrotic (see example 8).

Chemicky indukovaná karcinogenéza (pozri príklad 6) má podobný mechanizmus ako karcinogenéza indukovaná určitými typmi vírusov, ako sú vírusy hepatitídy B a C, určité papilómové vírusy, určité herpetické vírusy atď. Ide najmä o prípad nádorového ochorenia pečene u pacientov infikovaných hepatitídou B a C. Preto možno predpokladať, že profylaktická liečba týchto pacientov zlúčeninami podľa vynálezu by mohla zabrániť alebo oddialiť vznik nádorového ochorenia pečene. Taktiež skutočnosť, že uvedené prostriedky majú nízku toxicitu ich robí vhodnými na použitie v uvedenej liečbe.Chemically induced carcinogenesis (see Example 6) has a similar mechanism to carcinogenesis induced by certain types of viruses, such as hepatitis B and C viruses, certain papilloma viruses, certain herpes viruses, etc. This is particularly the case with liver cancer in patients infected with hepatitis B and C. Therefore, it can be assumed that prophylactic treatment of these patients with compounds of the invention could prevent or delay the onset of liver cancer. Also, the fact that said compositions have low toxicity makes them suitable for use in said treatment.

V imunologickom rozpoznávacom procese sa fragment cudzieho proteinu zachytí v záreze proteinu MHC triedy II na povrchu bunky prezentujúcej antigén (APC). K tomuto komplexu MHC-protilátka je pripojený aj receptor Tpomocného lymfocytu. Pre aktiváciu T-pomocného lymfocytu sú potrebné najmenej dva signály: primárny signál poskytuje samotný antigén prostredníctvom komplexu MHC triedy II a zosilňuje sa koreceptormi CD4. Druhý signál poskytuje špecifická, na plazmovej membráne naviazaná signálna molekula na povrchu APC. Ligandový koreceptorový proteín je lokalizovaný na povrchu T-pomocného lymfocytu. Obidva signály sú potrebné pre aktiváciu T-lymfocytov. Hneď ako dôjde k ich aktivácii, stimulujú vlastnú proliferáciu sekréciou interleukínových rastových faktorov a syntézou ligandových povrchových bunkových receptorov. Väzba interleukínov na tieto receptory potom priamo stimuluje proliferáciu T-lymfocytov.In the immunological recognition process, the foreign protein fragment is captured in the MHC class II protein notch on the surface of the antigen presenting cell (APC). The T helper lymphocyte receptor is also attached to this MHC-antibody complex. At least two signals are required for T-helper lymphocyte activation: the primary signal is provided by the antigen itself through the MHC class II complex and amplified by CD4 co-receptors. The second signal provides a specific, plasma-bound signaling molecule on the surface of the APC. The ligand co-receptor protein is located on the surface of the T-helper lymphocyte. Both signals are required for T-cell activation. Once activated, they stimulate intrinsic proliferation by secretion of interleukin growth factors and synthesis of ligand surface cell receptors. Binding of interleukins to these receptors then directly stimulates T-cell proliferation.

V dekáde rokov 1980 sa zistilo, že inklúzny cyklodextrin-benzaldehydový inklúzny komplex môže stimulovať imunitný systém zosilnením lymfokínmi aktivovaných vraždiacich buniek v modeli na myšiach (Y.Kuroki a kol., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117, (1991),In the decade of 1980, it was found that the inclusion cyclodextrin-benzaldehyde inclusion complex can stimulate the immune system by enhancing lymphokine-activated murder cells in a mouse model (Y.Kuroki et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117, (1991),

109-114). V neskôr uskutočnených štúdiách in vitro bola zistená podstata chemických reakcií na miestach interakcie APC-donor/receeptor T-lymfocytu zodpovedných za druhý kostimulačný signál a že uvedené reakcie majú formu karbonylaminových kondenzácií (tvorba Schiffových báz). Okrem toho sa zistilo, že uvedené reakcie možno napodobniť syntetickými chemickými zložkami. Tieto zistenia otvárajú nové terapeutické možnosti prostredníctvom umelej potenciácie imunitného systému. Vo WO 94/07479 je v patentových nárokoch uvedené použitie určitých aldehydov a ketónov, ktoré tvoria Schiffove bázy a hydrazóny s aminoskupinami na povrchu T-lymfocytov. V EP 0509606A1 je ako výhodná imunostimulačná zlúčenina uvedená 4-(2-formyl3-hydroxyfenoxymetyl)benzoová kyselina (tukaresol), zlúčenina pôvodne navrhnutá na liečenie srpkovitej anémie. Táto zlúčenina sa podáva orálne a je systémovo biologicky dostupná. Možné terapeutické možnosti tukaresolu, ktoré zahŕňajú viac chorôb zo skupiny zahŕňajúcej bakteriálne, vírusové a protozoálne infekcie, choroby súvisiace s autoimunitou a nádorové ochorenia, sú v súčasnosti v štádiu skúšania (H. Chen a J. Rhodes, J. Mol. Med., (1996), 74:497-504) a súčasný vývoj liečiv zahŕňa aj kombinačné stratégie podávania, kde sa tukaresol podáva spolu s vakcínou na liečbu chronickej hepatitídy B, HIV a malígneho melanómu.109-114). In later in vitro studies, the nature of the chemical reactions at the APC-donor / T-lymphocyte receptor sites responsible for the second costimulatory signal was found to be in the form of carbonylamine condensations (Schiff base formation). In addition, it has been found that these reactions can be mimicked by synthetic chemical components. These findings open up new therapeutic options through artificial potentiation of the immune system. WO 94/07479 discloses the use of certain aldehydes and ketones that form Schiff bases and hydrazones with amino groups on the surface of T lymphocytes. In EP 0509606A1, a preferred immunostimulatory compound is 4- (2-formyl-3-hydroxyphenoxymethyl) benzoic acid (tukaresol), a compound originally designed for the treatment of sickle cell anemia. This compound is administered orally and is systemically bioavailable. Possible therapeutic options for tukaresol, which include multiple diseases from the group consisting of bacterial, viral and protozoal infections, autoimmune related diseases and cancer, are currently under investigation (H. Chen and J. Rhodes, J. Mol. Med., ( 1996), 74: 497-504), and the current drug development also includes combination administration strategies where tukaresol is administered with a vaccine for the treatment of chronic hepatitis B, HIV and malignant melanoma.

Taktiež sa zistilo stanovením imunologický významných krivka závislosti dávka/odpoveď má J. Rhodes, J. Mol. Med., inak neobvyklý vysvetliť predpokladom, aldehydového liečiva ligandy potrebné pre efektívnu preto pôsobia imhibične. Zdá dávka dostatočná hodnôt in vitro, že zvonovitý priebeh (H. (1996), 74:497-504).It was also determined by determining immunologically significant dose / response curves by J. Rhodes, J. Mol. Med., Otherwise unusual to explain by the assumption that the aldehyde drug ligands required for effective therefore act inhibitory. There appears to be sufficient in vitro values that a bell-like course (H. (1996), 74: 497-504).

Chen aChen a

Tento závislosti dávka/odpoveď možno vysoké koncentrácie stimulačné priebeh že lymfocyt a dávkou je rovnováhy, intercelulárnej ligácie.This dose / response relationship can be a high concentration stimulating course that the lymphocyte and dose is of equilibrium, intercellular ligation.

pre dosiahnutie sa, nasýtia väzbu APC koná že pre dosiahnutie ko-stimulácie bez optimálnou dynamickej blokovaniato achieve, saturate binding APC acts that to achieve co-stimulation without optimal dynamic blocking

Samotné aldehydy sú vo všeobecnosti vďaka oxidácii nestabilné. 4-(2-formyl-3-hydroxyfenoxymezyl)benzoová kyselina (tukaresol), opísaná v EP-0609606, je významne stabilnejšia in vivo ako in vitro. Dôvod tohto javu môže byť v náchylnosti k oxidácii vo vodných roztokoch in vitro (H. Chen a J. Rhodes, J. Mol. Med., (1996), 74:497-504).The aldehydes themselves are generally unstable due to oxidation. The 4- (2-formyl-3-hydroxyphenoxymethyl) benzoic acid (tukaresol) described in EP-0609606 is significantly more stable in vivo than in vitro. The reason for this may be the susceptibility to oxidation in aqueous solutions in vitro (H. Chen and J. Rhodes, J. Mol. Med., (1996), 74: 497-504).

Mnohé aldehydy sú príliš reaktívne pre ich podávanie ako takých, a aj keď majú overený účinok in vitro ako protinádorové liečivá, pri priamej aplikácii in vivo dráždia a sú pre uvedené podanie nevhodné. V biotickom systéme karbonylová skupina aldehydu rýchlo reaguje s nukleofilnými skupinami, ktoré sú predovšetkým prítomné vo všetých telových tekutinách. Tieto nežiaduce vedľajšie reakcie môžu viesť k rýchlej metabolizácii liečiva a obťažnému riedeniu hladiny účinnej zložky v sére. Pre dosiahnutie účinnej imunopotenciácie je rozhodujúce riadenie koncentrácie liečiva na bunkovej úrovni v úzkom rozmedzí. Tukrezol sa podáva orálne ako nechránený aldehyd a je podozrenie, že dochádza k rozkladu liečiva a k problémom pri riadení jeho farmakokinetiky.Many aldehydes are too reactive for their administration as such, and although they have a proven in vitro effect as anticancer drugs, they are irritating to direct application in vivo and are unsuitable for such administration. In the biotic system, the carbonyl group of the aldehyde reacts rapidly with nucleophilic groups, which are primarily present in all body fluids. These undesirable side reactions can lead to rapid drug metabolism and difficult dilution of serum levels of the active ingredient. Control of drug concentration at the cellular level within a narrow range is critical to achieving effective immunopotentiation. Tucresol is administered orally as an unprotected aldehyde and it is suspected that drug decomposition and problems in controlling its pharmacokinetics occur.

U benzaldehydových derivátov 4,6-benzylidén-D-glukózy a ich deuterovaných analógov (zlúčenina 1 a 2) bolo preukázané, že majú vysokú biologickú dostupnosť buď pri i.v. podaní alebo po p.o. podaní. Zistilo sa, že biologická dostupnosť stanovená koncentráciou liečiva v sére po orálnom podaní zlúčeniny 2 myšiam BALB je 93-99 % (C. B. Dunsaed, J. M. Dornish a E. 0. Pettersen, Cancer Chemother. Pharmacol. (1995), 35:464-470). Okrem toho glukózová skupina môže vykazovať afinitu k receptorom prítomným na povrchu bunky a tým zlepšiť dostupnosť liečiva na bunkovej úrovni. Voľný aldehyd možno ľahko uvoľniť hydrolýzou acetálu, čím nastane uvoľnenie karbonylovej skupiny, ktorá sa stane dostupnou pre tvorbu Schiffových báz na cieľových ligandoch.The benzaldehyde derivatives of 4,6-benzylidene-D-glucose and their deuterated analogs (compounds 1 and 2) have been shown to have high bioavailability either at i.v. administration or after p.o. administration. The bioavailability determined by the drug concentration in the serum following oral administration of compound 2 to BALB mice was found to be 93-99% (CB Dunsaed, JM Dornish and E. O. Pettersen, Cancer Chemother. Pharmacol. (1995), 35: 464-470 ). In addition, the glucose moiety may exhibit affinity for receptors present on the cell surface and thereby improve drug availability at the cellular level. The free aldehyde can be easily released by hydrolysis of the acetal, thereby releasing the carbonyl group, which becomes available for the formation of Schiff bases on the target ligands.

Podľa predloženej patentovej prihlášky sa aldehydy derivatizujú biologicky prijateľnými glycidmi, ako je glukóza, galaktóza a ďalšie, za vzniku acetálov. Cukrová zložka prispieva k zlepšenej stabilite a taktiež zvyšuje biologickú dostupnosť aldehydovej funkčnej skupiny pre cieľové bunky. V porovnaní s doteraz známymi zlúčeninami, v spôsoboch s použitím zlúčenín podľa vynálezu sa prekvapivo zvyšuje účinnosť kondenzačných reakcii a ich farmakokinetika sa riadi ľahšie.According to the present patent application, aldehydes are derivatized with biologically acceptable carbohydrates such as glucose, galactose and others to form acetals. The sugar component contributes to improved stability and also increases the bioavailability of the aldehyde functionality for the target cells. Surprisingly, the efficacy of the condensation reactions increases and their pharmacokinetics are more easily controlled in comparison with the compounds known to date.

Pre porovnanie zlúčeniny 2 s tukaresolom z hľadiska ich účinkov na inaktiváciu buniek a proteínovú syntézu, bolo uskutočnené stanovenie týchto dvoch účinkov v prítomnosti rovnakých koncentrácií oboch týchto liečiv. Ako je zrejmé z obr. 1 a 2, bolo dokázané, že zlúčenina 2 je v obidvoch sledovaných parametroch účinnejšia ako tukaresol.To compare compound 2 with tukaresol for their effects on cell inactivation and protein synthesis, the two effects were determined in the presence of the same concentrations of both drugs. As shown in FIG. 1 and 2, compound 2 has been shown to be more effective than tukaresol in both endpoints.

Imunostimulačný účinok zlúčenín podľa vynálezu možno využiť aj na liečbu určitých vírusových chorôb v kombinácii s ďalšou protivírusovou terapiou, ako je použitie antivirotík alebo vakcín. Mnohé druhy vírusov sa po prvej infikácii inkorporujú do bunkového jadra a zostávajú dlhý čas inaktívne. Onkogénne vírusy, ako sú vírusy hepatitídy B a C, určité retrovírusy a určité papilómové vírusy môžu vyvolať vývin nádorového ochorenia. V uvedených latentných obdobiach je veľmi ťažké liečiť vírusovú infekciu. Následkom imunitných odpovedí sa uvedené vírusy uvoľňujú za vzniku virémie a v tomto štádiu ich možno z organizmu odstrániť. Schopnosť benzaldehydových derivátov vyvolať imunitnú odpoveď možno použiť pre vývoj liečby uvedených chorôb, v kombinácii s antivirotikami alebo vakcínami.The immunostimulatory effect of the compounds of the invention can also be used to treat certain viral diseases in combination with other antiviral therapies, such as the use of antivirals or vaccines. Many types of viruses are incorporated into the cell nucleus after the first infection and remain inactive for a long time. Oncogenic viruses such as hepatitis B and C viruses, certain retroviruses and certain papilloma viruses can induce the development of cancer. In these latent periods, it is very difficult to treat a viral infection. As a result of the immune responses, said viruses are released to form viremia and at this stage can be removed from the body. The ability of the benzaldehyde derivatives to elicit an immune response can be used for the development of treatment of said diseases, in combination with antivirals or vaccines.

Hlavným cieľom vynálezu je poskytnúť nové zlúčeniny na prevenciu a/alebo liečbu nádorových ochorení.The main object of the invention is to provide novel compounds for the prevention and / or treatment of cancer.

Ďalším cieľom vynálezu je poskytnúť zlúčeniny vhodné na prevenciu ale boli ečbu nádor ových ochoren í vedľajších toxických účinkov.It is a further object of the invention to provide compounds useful for preventing but treating cancer of side effects of toxic effects.

Tretím cieľom vynálezu je poskytnúť zlúčeniny na účinnú a priaznivú prevenciu a/alebo liečbu nádorov pečene bez (primárnych nádorov pečene alebo metastáz iných nádorov, ako je kolorektálny nádor). Preventívna liečba môže mať veľký význam aj pri prevencii vzniku nádoru pečene u pacientov infikovaných hepatitídou B alebo C.A third object of the invention is to provide compounds for the effective and beneficial prevention and / or treatment of liver tumors without (primary liver tumors or metastasis of tumors other than colorectal tumor). Preventive treatment can also be of great importance in preventing liver cancer in patients infected with hepatitis B or C.

Štvrtým cieľom vynálezu je poskytnúť zlúčeniny na účinnú a priaznivú prevenciu a/alebo liečbu nádorov tkanív a buniek obsahujúcich receptory s afinitou k odpovedájúcim cukrovým zložkám.A fourth object of the invention is to provide compounds for the effective and beneficial prevention and / or treatment of tumor and tissue tumors containing receptors with an affinity for the corresponding sugar components.

Piatym cieľom vynálezu je poskytnúť zlúčeniny na účinnú a priaznivú prevenciu a/alebo liečbu nádoru ľadvín.A fifth object of the invention is to provide compounds for the effective and beneficial prevention and / or treatment of kidney tumor.

Šiestym cieľom vynálezu je poskytnúť zlúčeniny na účinnú a priaznivú prevenciu a/alebo liečbu nádoru pankreasu.A sixth object of the invention is to provide compounds for the effective and beneficial prevention and / or treatment of pancreatic cancer.

Uvedené dosiahnuté sú predmetom pripojených a ďalšie dosiahnuté ciele vynálezu patentových nárokov.Said attained are the subject matter of the appended and other achieved objects of the invention.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Vynález sa vzťahuje na nasledujúce zlúčeniny:The invention relates to the following compounds:

4.6- (0)-(benzylidén-di) -D-glukopyranóza4.6- (O) - (Benzylidene-di) -D-glucopyranose

4.6- (0)-(benzylidén)-L-glukopyranóza4.6- (O) - (Benzylidene) -L-glucopyranose

4.6- (0)-(benzylidén-dj)-L-glukopyranóza (zlúčenina (zlúčenina (zlúčenina4.6- (O) - (benzylidene-dj) -L-glucopyranose (compound (compound (compound

2)2)

3)3)

4) alebo ich farmaceutický prijateľné soli.4) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

Zlúčeniny 3 a 4 sú zlúčeniny nové.Compounds 3 and 4 are novel compounds.

Zmenený listModified letter

Podrobný opis vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Vynález je v ďalšom objasnený príkladmi uskutočnenia vynálezu a tabuľkami a priloženými obrázkami.The invention is further elucidated by the following examples and tables and the attached figures.

Prehľad obrázkov na výkresochBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Na obr. 1 sú znázornené výsledky pokusu, v ktorom bunky NHIK 3025 boli ošetrené zlúčeninou 2 (Δ) alebo tukaresolom (·) počas 20 hodín pri 37 ’C, za ich naviazania na Petriho misky z plastickej hmoty. Prežívajúca frakcia znamená frakciu buniek tvoriacich makroskopickú kolóniu po ošetrení. Každý bod znamená strednú hodnotu počtu kolónií z 5 paralelne ošetrených misiek. Štandardné chyby sú menšie ako je veľkosť použitých symbolov.In FIG. 1 shows the results of an experiment in which NHIK 3025 cells were treated with compound 2 (Δ) or tukaresol (·) for 20 hours at 37 C C, binding them to a plastic petri dish. Surviving fraction means the fraction of cells forming a macroscopic colony after treatment. Each point represents the mean number of colonies from 5 parallel treated plates. Standard errors are smaller than the size of the symbols used.

Na obr. 2 sú znázornené výsledky stanovenia rýchlosti syntézy proteínu v pokuse, v ktorom bunky NHIK 3025 boli ošetrené zlúčeninou 2 () alebo tukaresolom (▲) počas 1 hodiny pri 37 °C, vzhľadom na neošetrené kontrolné bunky. Rýchlosť syntézy proteínu bola stanovená zistením množstva [³H]-valinu inkorporovaného počas prvej hodiny ošetrenia liečivom. Rýchlosť syntézy proteínu bola stanovená vzhľadom na celkový obsah proteínu v bunkách. Výsledky predstavujú štvornásobné uskutočnenie jedného pokusu. Štandardné chyby sú zaznamenané pokiaľ prevyšujú veľkosť použitých symbolov.In FIG. 2 shows the results of the protein synthesis rate determination in an experiment in which NHIK 3025 cells were treated with compound 2 () or tukaresol (▲) for 1 hour at 37 ° C relative to untreated control cells. Protein synthesis rate was determined by determining the amount of [ ³ H] -valine incorporated during the first hour of drug treatment. Protein synthesis rate was determined with respect to total protein content in cells. The results represent a four-fold run of one experiment. Standard errors are recorded if they exceed the size of the symbols used.

Na obr. 3 sú znázornené výsledky stanovenia rýchlosti syntézy proteínu vzhľadom na kontrolu v pokuse, v ktorom bunky Panc-1 boli ošetrené zlúčeninou 2 () alebo zilaskorbom(²H) (ä) . Rýchlosť syntézy proteínu bola stanovená zistením množstva [³H]-valinu inkorporovaného počas prvej hodiny ošetrenia liečivom. Rýchlosť syntézy proteínu bola stanovená vzhľadom na celkový obsah proteínuIn FIG. 3 shows the results of determining the rate of protein synthesis relative to the control in the experiment in which the cells Panc-1 were treated with Compound 2 () or zilascorb ⁽² H) (R). Protein synthesis rate was determined by determining the amount of [ ³ H] -valine incorporated during the first hour of drug treatment. Protein synthesis rate was determined relative to total protein content

IS v bunkách. Štandardné chyby sú menšie ako je veľkosť použitých symbolov.IS in cells. Standard errors are smaller than the size of the symbols used.

Obr. 4 znázorňuje medián adhéznych síl buniek exponovaných rôznymi derivátmi benzaldehydu. Bunky boli exponované 1 mM koncentráciami zlúčeniny 1 a 2.Fig. 4 shows the median adhesion forces of cells exposed to various benzaldehyde derivatives. Cells were exposed to 1 mM concentrations of Compounds 1 and 2.

Obr. 5 Periférne krvné mononukleárne bunky a Superantigén v médiu ex vivo 30 boli vystavené pôsobeniu buď benzaldehydu, deuterovaného benzaldehydu, zlúčenine 2 alebo zilaskorbu(²H) . Proliferácia periférnych mononukleárnych krvných buniek bola stanovená inkorporáciou tritiovaného tymidínu pri rôznych koncentráciách liečiva.Fig. 5 Peripheral blood mononuclear cells and Superantigen in serum ex vivo 30 were exposed to either benzaldehyde, deuterated benzaldehyde, Compound 2 or zilascorb ^(2H). Proliferation of peripheral mononuclear blood cells was determined by incorporation of tritiated thymidine at various drug concentrations.

Obr. 6 NMRI myši boli infikované i.p. podaním vírusu Friend-erytroleukémie, ktorý napáda slezinu. Infikované a neinfikované myši boli ošetrené i.p. dennou dávkou 5 mg/kg zlúčeniny 2. Po liečbe trvajúcej 19 dní boli sleziny odobrané a boli odvážené.Fig. 6 NMRI mice were infected i.p. administration of Friend-erythroleukemia virus which attacks the spleen. Infected and uninfected mice were treated i.p. with a daily dose of 5 mg / kg of Compound 2. After treatment for 19 days, spleens were harvested and weighed.

Obr. 7 znázorňuje podiel zvierat so zisteným nádorovým tkanivom počas pitvy.Fig. 7 shows the proportion of animals with detected tumor tissue during necropsy.

Obr. 8 znázorňuje stredné množstvo nádorového tkaniva v pečeni zvierat s tumorom.Fig. 8 shows the mean amount of tumor tissue in the liver of tumor-bearing animals.

Obr. 9 znázorňuje rastové krivky na základe telesnej hmotnosti prepočítanej na jedno zviera v každej skupine.Pre lepšie znázornenie kriviek sú štandardné odchýlky znázornené len u niektorých prípadov.Fig. 9 shows growth curves based on body weight calculated per animal in each group. For better representation of the curves, standard deviations are shown only in some cases.

Obr. 10 znázorňuje ako početnosť, tak veľkosť pečeňových tumorov na rovnakej krivke, s použitím logaritmickej mierky na osi x.Fig. 10 shows both the frequency and size of liver tumors on the same curve, using a logarithmic scale on the x-axis.

Na obr. 11 je znázornený účinok zlúčeniny 1 a 2 na inváziu ľudského kolorektálneho tumoru C170HM2 do pečene.In FIG. 11 shows the effect of compounds 1 and 2 on invasion of human colorectal tumor C170HM2 into the liver.

Obr. 12 Rýchlosť syntézy proteínu v bunkách ľudského cervikálneho karcinómu NHIK 3025 ošetrených zlúčeninou 1 alebo zlúčeninou 3 bola zistená stanovením množstva inkorporovaného [³H]-valínu buď v priebehu do jednej hodiny od bezprostredného podania testovanej zlúčeniny (tmavé symboly) alebo počas jednej hodiny o 2 hodiny neskôr (svetlé symboly).Fig. The rate of protein synthesis in human cervical carcinoma cells of NHIK 3025 treated with Compound 1 or Compound 3 was determined by determining the amount of [ ³ H] -valine incorporated either within one hour of immediate administration of the test compound (dark symbols) or within 2 hours. later (bright symbols).

Obr. 13 Rýchlosť syntézy proteínu v bunkách ľudského cervikálneho karcinómu NHIK 3025, ošetrených zlúčeninou 2 alebo zlúčeninou 4, bola zistená stanovením množstva inkorporovaného [³H]-valínu buď v priebehu do jednej hodiny od bezprostredného podania testovanej zlúčeniny (tmavé symboly) alebo počas jednej hodiny o 2 hodiny neskôr (svetlé symboly).Fig. The rate of protein synthesis in human cervical carcinoma NHIK 3025 cells treated with compound 2 or compound 4 was determined by determining the amount of [ ³ H] -valine incorporated either within one hour of immediate administration of the test compound (dark symbols) or within one hour. 2 hours later (bright symbols).

Obr. 14 znázorňuje prežitie buniek ľudského cervikálneho karcinómu NHIK 3025 stanovené schopnosťou vytvárať kolónie, po 20 hodinovom ošetrení buď zlúčeninou 1 (·) alebo zlúčeninou 3 (o).Fig. 14 depicts the survival of human cervical carcinoma NHIK 3025 cells, determined by colony forming ability, after treatment for 20 hours with either Compound 1 (·) or Compound 3 (o).

Obr. 15 znázorňuje prežitie buniek ľudského cervikálneho karcinómu NHIK 3025 stanovené schopnosťou vytvárať kolónie, po 20 hodinovom ošetrení buď zlúčeninou 2 (o) alebo zlúčeninou 4 (A).Fig. 15 shows the survival of human cervical carcinoma NHIK 3025 cells, determined by colony forming ability, after treatment for 20 hours with either Compound 2 (o) or Compound 4 (A).

Obr. 16 znázorňuje prežitie buniek zistené schopnosťou ľudského pľúcneho karcinómu T47-D vytvárať kolónie po 20 hodinovom ošetrení buď L-glukózou (·) alebo zlúčeninou 3 (O) .Fig. 16 shows cell survival as determined by the ability of human lung carcinoma T47-D to form colonies after 20 hours treatment with either L-glucose (·) or compound 3 (0).

Tabuľka 2: histologické výsledky zistené u normálnehoTable 2: Histological results found in normal

Opis tabuliek a nádorového tkaniva. Skupina 1: neošetrená kontrolná skupinaDescription of Tables and Tumor Tissue. Group 1: untreated control group

Tabuľka 3: histologické výsledky zistené u normálneho a nádorového tkaniva. Skupina 2: placeboTable 3: Histological results found in normal and tumor tissue. Group 2: placebo

Tabuľka 4: histologické výsledky zistené u normálneho a nádorového tkaniva. Skupina 3: 85 mg/kg/deň zlúčeniny 2Table 4: Histological results found in normal and tumor tissue. Group 3: 85 mg / kg / day of compound 2

zlúčenina č. compound no. chemická štruktúra chemical structure názov title 1 1 H OH OH H OH OH 4,6-O-benzylidén-D-glukopyranóza 4,6-O-benzylidene-D-glucopyranose 2 2 D OH OH D OH OH 4,6-0-(benzylidén-di) -D-glukopyranóza 4,6-O- (benzylidene-di) -D-glucopyranose 3 3 ίΡΊ O. H ^H0 ΡΊΡΊ O. H ^H0 4,6-0-benzylidén-L-glukopyranóza 4,6-0-benzylidene-L-glucopyranose 4 4 D ^H0 D ^H0 4,6-0-(benzylidén-dj -L-glukopyranóza 4,6-O- (benzylidene-d1-L-glucopyranose)

Prípravapreparation

Je známe, kondenzačných že aldehydy reagujú s alkoholmi v reakciách podporovaných prítomnosťou kyseliny, pričom vznikajú acetály. Súčasne sa ako vedľajší produkt tvorí voda. Táto reakcia je reverzibilná a v roztoku sa tvorí rovnovážna zmes aldehyd/alkohol a acetál/voda. Stav rovnováhy určuje predovšetkým reaktivita a koncentrácie každej z reakčných zložiek. Aby sa reakcia posunula smerom k jej úplnému priebehu, obvykle sa jeden z produktov reakcie (acetál alebo voda) z reakčnej zmesi odstraňuje.It is known that condensation aldehydes react with alcohols in acid-assisted reactions to form acetals. At the same time, water is formed as a by-product. This reaction is reversible and an equilibrium mixture of aldehyde / alcohol and acetal / water is formed in the solution. The equilibrium state is determined primarily by the reactivity and concentration of each of the reactants. To move the reaction towards its full course, one of the reaction products (acetal or water) is usually removed from the reaction mixture.

Podľa vynálezu sa D(+) alebo L(-) glukóza kondenzuje s benzaldehydom alebo so zlúčeninou ekvivalentnou s benzaldehydom za vzniku odpovedajúcich benzylidén-acetálov glukózy. Výhodná je najmä stratégia reacetalizácie, kde miesto samotného benzaldehydu sa použije benzaldehyd chránený vo forme dimetylacetálu. Ako koprodukt reakcie pritom vzniká metanol. Hneď po vzniku metanolu sa reakčná zmes mierne zohreje pri zníženom tlaku, aby sa metanol odstránil. Vo väčšine prípadov dochádza k posunu rovnováhy v uvedených reakčných podmienkach plynulé, v prospech acetálu.According to the invention, D (+) or L (-) glucose is condensed with benzaldehyde or a benzaldehyde equivalent compound to form the corresponding benzylidene glucose acetals. Particularly preferred is a reacetalization strategy wherein instead of benzaldehyde itself, benzaldehyde protected in the form of dimethylacetal is used. Methanol is formed as the co-product of the reaction. Immediately after methanol formation, the reaction mixture was gently heated under reduced pressure to remove the methanol. In most cases, the equilibrium shifted continuously under the reaction conditions in favor of the acetal.

Acetalizácia cukrov obvykle vedie k zmesi regio- a steroizomérov. Môže dôjsť aj ku kontrakčným kruhovým transformáciám, ktoré vedú k vzniku zmesi pyranóz a furanóz a v niektorých prípadoch k tvorbe diacetálových aduktov. Dôsledkom toho je, pokiaľ sa nepoužije stratégia chránenia, tvorba veľmi zložitej reakčnej zmesi. Avšak ďalej opísaným spracovaním, najmä s použitím kvapalinovej chromatografie, boli získané prekvapivo čisté podiely čistých produktov, rovnako ako v prípade prípravy vo veľkom meradle, s použitím kryštalizačných spôsobov. Totožnosť produktov sa uskutočňuje GC-MC spektroskopiou a rôznymi spôsobmi NMR.Acetalization of sugars usually results in a mixture of regio- and steroisomers. Contractual ring transformations may also occur, resulting in a mixture of pyranoses and furanoses and, in some cases, formation of diacetal adducts. As a result, unless a protection strategy is employed, a very complex reaction mixture is formed. However, the processing described below, in particular using liquid chromatography, gave surprisingly pure proportions of pure products, as in the case of large-scale preparation, using crystallization methods. The identity of the products is performed by GC-MC spectroscopy and various NMR methods.

Špecifické použité reakčné podmienky, rozpúšťadlo a katalyzátor sa môžu líšiť podľa skúsenosti pracovníka. Ako katalyzátor možno použiť minerálnu kyselinu, napr. kyselinu sírovú, organickú kyselinu, napríklad kyselinu paratoluénsulfónovú, kyslú ionovýmennú živicu, napr. Amberlyst 15, Lewisovu kyselinu vo forme minerálnej hlinky, napr. Montmorillonit K-10 alebo superkyselinu na nosnej živici, napr. Nafion NR 50. Reakciu možno výhodne uskutočniť v dipolárnom aprotickom rozpúšťadle, ako je dimetylformamid, dimetylacetamid, dimetylsulfoxid,' N-metylpyrolidón, dimetoxyetán a pod. Najvýhodnejšie a najčastejšie aplikované reakčné podmienky zahŕňajú uskutočnenie s kyselinou para-toluénsulfónovou v dimetylformamide.The specific reaction conditions used, the solvent and the catalyst may vary according to the person skilled in the art. A mineral acid, e.g. sulfuric acid, an organic acid, for example paratoluenesulfonic acid, an acidic ion exchange resin, e.g. Amberlyst 15, a Lewis acid in the form of a mineral clay, e.g. Montmorillonite K-10 or a superacid on a carrier resin, e.g. Nafion NR 50. The reaction may conveniently be carried out in a dipolar aprotic solvent such as dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethylsulfoxide, N-methylpyrrolidone, dimethoxyethane and the like. The most preferred and most commonly applied reaction conditions include an embodiment with para-toluenesulfonic acid in dimethylformamide.

Deuterované zlúčeniny možno pripraviť vyššie opísaným spôsobom tak, že sa použije východiskový dimetylacetál benzaldehydu-di. Prípravu deutero-benzaldehydu možno uskutočniť modifikovanou redukciou podľa Rosenmunda, s použitím plynného D₂ v deuterovanom rozpúšťadle, spôsobom opísaným v EP 0 283 139 BI.The deuterated compounds can be prepared as described above, starting from benzaldehyde-di-dimethylacetal. The preparation of deuterobenzaldehyde can be carried out by a modified reduction according to Rosenmund, using D ₂ gas in a deuterated solvent, as described in EP 0 283 139 B1.

Možné spôsoby prípravy zlúčenín podľa vynálezu sú opísané v nižšie uvedených príkladoch.Possible methods for preparing the compounds of the invention are described in the Examples below.

Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Zlúčenina 1Compound 1

4,6-O-benzylidén-D-glukopyranóza4,6-O-benzylidene-D-glucopyranose

Uvedená zlúčenina známa v odbore sa pripraví spôsobom opísaným pre zlúčeninu 2, s použitím nedeuterovaného benzaldehyd-dimetylacetálu ako východiskovej zložky. Totožnosť sa potvrdí ^XH NMR spektroskopiou v DMSO-d₆:Said compound known in the art is prepared as described for compound 2, using non-deuterated benzaldehyde dimethyl acetal as starting material. The identity was confirmed by NMR spectroscopy ^X H in _DMSO-d6:

δ vzhľadom na TMS: 7,58-7,29 (5H, m, Ar-H), 6,83 (0,4H, d, ΟΗ-1β), 6,60 (0,6H, d, ΟΗ-1-α), 5,61 (1H, s + s, acetál-H), 5,25 (0,4H, d, ΟΗ-3-β) , 5,21 (0,4H, d, ΟΗ-2-β) ,δ relative to TMS: 7.58-7.29 (5H, m, Ar-H), 6.83 (0.4H, d, ΟΗ-1β), 6.60 (0.6H, d, ΟΗ-1) -α), 5.61 (1H, s + s, acetal-H), 5.25 (0.4H, d, ΟΗ-3-β), 5.21 (0.4H, d, ΟΗ-2- β),

5,62 (0,6H, d, ΟΗ-3-α), 5,00 (0,6H, Η-1-α), 4,82 (0,6H, d,5.62 (0.6H, d, ΟΗ-3-α), 5.00 (0.6H, Η-1-α), 4.82 (0.6H, d,

ΟΗ-2-α), 4,49 (0,4H, t, Η-1-β) , 4,18-4,02 (1H, m, H-6'α+β), 3,89-3,77 (0,6H, m, Η-5-α), 3,75-3,57 (1,6H, m, H6-α+β3 Η-3-α) , 3,45-3, 27 (2,5H, m, Η-3-β, Η-4-α+β, H-5paH-2-α) a 3,11-3,00 (0,4H, m, Η-2-β).ΟΗ-2-α), 4.49 (0.4H, t, Η-1-β), 4.18-4.02 (1H, m, H-6'α + β), 3.89-3 , 77 (0.6H, m, Η-5-α), 3.75-3.57 (1.6H, m, H6-α + β3 Η-3-α), 3.45-3, 27 ( 2.5H, m, Η-3-β, Η-4-α + β, H-5paH-2-α) and 3.11-3.00 (0.4H, m, Η-2-β).

Zlúčenina 2Compound 2

4,6-0-(benzylidén-di) -D-glukopyranóza4,6-O- (benzylidene-di) -D-glucopyranose

Spôsobom opísaným v EP 0 283 139 BI sa pripraví benzaldehyd-di a prevedie sa na benzaldehyd-dimetylacetáldi- PrípravaBenzaldehyde-di is prepared as described in EP 0 283 139 B1 and converted to benzaldehyde dimethylacetal.

4,6-0-(benzylidén-di)-D-glukopyranózy je opísaná aj v EP4,6-O- (benzylidene-di) -D-glucopyranose is also described in EP

283 139 BI, ale z prednostných dôvodov pre dosiahnutie vysokej čistoty sa v tomto prípade pripraví nižšie opísaným alternatívnym spôsobom.283,139 B1, but for preferred reasons to achieve high purity, in this case, it is prepared in the alternative manner described below.

V suchej aparatúre, pre destiláciu pripojenej spätným chladičom k vákuovej výveve sa zmieša D(+)glukóza (706 g, 3,92 mol), benzaldehyd-dimetylacetál-di (571 g, 3,73 mol), suchý DMF (1,68 kg) a para-toluénsulfónová kyselina (4,5 g, 24 mmol). Mechanicky miešaná zmes sa ohreje na najviac 69 °C pri tlaku 4 kPa (30 Torr) pre oddestilovanie metanolu a po 2 hodinách sa oddelí 235 g. Potom sa spätný chladič vypne a teplota sa zvýši na asi 73 °C, aby sa oddestiloval DMF. Po ďalších 2 hodinách sa oddelí ďalších 1385 g a potam sa destilácia preruší.D (+) Glucose (706 g, 3.92 mol), benzaldehyde dimethylacetal-di (571 g, 3.73 mol), dry DMF (1.68) are mixed in a dry apparatus, for distillation connected to a reflux condenser. kg) and para-toluenesulfonic acid (4.5 g, 24 mmol). The mechanically stirred mixture is heated to a maximum of 69 ° C at 30 Torr for distilling off methanol and after 2 hours 235 g are collected. Then the reflux condenser is turned off and the temperature is raised to about 73 ° C to distill off the DMF. After a further 2 hours a further 1385 g are collected and the distillation is then discontinued.

Zvyšok sa ochladí na asi 40 °C a počas 5 minút sa pridá zmes ľad/voda (2,9 1). Potom sa teplota pomaly zníži pod 0 °C, pričom sa vyzráža zrazenina, čiastočne vo veľkých zhlukoch. Potom sa zmes prevedie do kadičky a pridá sa ďalších 8 až 9 1 zmesi ľad/voda, aby sa zhluky rozpadli a vznikla tak suspenzia. Suspenzia sa potom prefiltruje na dvoch odsávacích filtroch a získané dva filtračné koláče sa cez noc nechajú na filtroch za odsávania vodnou vývevou, pričom sa premývajú atmosférou dusíka, ktorý sa privedie cez opačne pripojený lievik. Potom sa filtračné koláče rozprestrú na dve dosky a 20 hodín sa sušia vo vákuovej sušičke pri 32 °C. Vákuum sa najprv nastaví na 1300 Pa (13 mbar) a potom sa zvýši na 100 Pa (1 mbar).The residue was cooled to about 40 ° C and ice / water (2.9 L) was added over 5 minutes. Then, the temperature is slowly lowered to below 0 ° C, whereupon a precipitate precipitates, partly in large clumps. The mixture is then transferred to a beaker and an additional 8 to 9 liters of ice / water are added to disintegrate to form a slurry. The suspension is then filtered on two suction filters and the resulting two filter cakes are left on the suction filters overnight with a water pump, purging with a nitrogen atmosphere which is passed through an inverted funnel. The filter cakes are then spread on two plates and dried in a vacuum dryer at 32 ° C for 20 hours. The vacuum is first set at 1300 Pa (13 mbar) and then increased to 100 Pa (1 mbar).

Surový produkt sa rekryštalizuje (aby sa odstránili dibenzylidén-acetály) a premýva sa vodou (pre odstránenie DMF a glukózy) až do odstránenia všetkých uvedených kontaminantov. Surový produkt (500 g) sa potom rozpustí v horúcom dioxáne (800 ml) a získaný roztok sa pridá cez skladaný filter do vriaceho chloroformu (9 1). Potom sa roztok nechá vychladnúť, najprv na izbovú teplotu a potom sa cez noc chladí v ľadovom kúpeli. Zrazenina sa odfiltruje, 2 hodiny sa suší na filtri (za premývania N₂, ako je to opísané vyššie) a ďalej sa suší pri 31 °C vo vákuu na rotačnej odparke. Produkt (142 g) sa potom suspenduje v zmesi ľad/voda (1 1), prefiltruje sa na filtroch pomocou odsávania (s premytím 200 ml zmesi ľad/voda) a suší sa cez noc na filtri, ako je opísané vyššie. Potom sa produkt rozomlie, preoseje sa (oká veľkosti 0,5 mm) a 5 hodín sa suší pri 31 °C na rotačnej odparovačke. Potom sa produkt ešte raz suspenduje v zmesi ľad/voda (500 ml), prefiltruje sa (za premytia 150 ml ľad/voda) a vysuší sa (7 hodín za premývania N₂) . Nakoniec sa rozomlie v trecej miske, preoseje sa (0,5 mm) a vysuší sa vo vákuovej sušičke.The crude product is recrystallized (to remove dibenzylidene acetals) and washed with water (to remove DMF and glucose) until all contaminants are removed. The crude product (500 g) was then dissolved in hot dioxane (800 mL) and the resulting solution was added through a pleated filter to boiling chloroform (9 L). The solution was then allowed to cool, first to room temperature and then cooled overnight in an ice bath. The precipitate was filtered off, dried on the filter for 2 hours (under N ₂ purification as described above), and further dried at 31 ° C under vacuum on a rotary evaporator. The product (142 g) was then suspended in ice / water (1 L), filtered on the filters by suction (washing with 200 ml of ice / water) and dried overnight on the filter as described above. The product is then milled, sieved (0.5 mm mesh) and dried on a rotary evaporator at 31 ° C for 5 hours. The product was then slurried once more in ice / water (500 ml), filtered (washed with 150 ml ice / water) and dried (7 hours with N ₂ wash). Finally, it is ground in a mortar, sieved (0.5 mm) and dried in a vacuum dryer.

Produkt vo forme bieleho, jemne deleného prášku vysokej čistoty sa analyzuje metódou HPLC. Výťažok je 95 %, 10 % teoretického výťažku. Pomer anomérov α : β zistený NMR. v DMSO-dc je asi 7 : 3.The product as a white, finely divided powder of high purity was analyzed by HPLC. The yield is 95%, 10% of the theoretical yield. Anomeric ratio of α: β as determined by NMR. in DMSO-dc is about 7: 3.

*H- a ¹³C- NMR (DMSO-dg) δ vzhľadom na TMS: 7,55-7,28 (5,00H, m, Ar-H), 6,85 (0,27H, d, ΟΗ-1-β), 6,58 (0,71H, d,1 H- and ¹³ C-NMR (DMSO-d 6) δ with respect to TMS: 7.55-7.28 (5.00H, m, Ar-H), 6.85 (0.27H, d, ΟΗ-1) -β), 6.58 (0.71H, d,

ΟΗ-1-α), 5,24 (0,27H, d, ΟΗ-3-β) , 5,19 (0,28H, d, ΟΗ-2-β) ,ΟΗ-1-α), 5.24 (0.27H, d, ΟΗ-3-β), 5.19 (0.28H, d, ΟΗ-2-β),

5,61 (0,71H, d, ΟΗ-3-α), 4,99 (0,72H, Η-1-α), 4,82 (0,71H, d, ΟΗ-2-α), 4,48 (0,29H, t, Η-1-β), 4,20-4,04 (l,04H, m, H6'-α+β), 3,88-3,73 (0,78H, m, Η-5-α), 3,73-3,56 (1,72H, m, H-6-a+pa Η-3-α) , 3,46-3,21 (2,61H, m, Η-3-β, Η-4-α+β, H5-paH-2-a) a 3, 09-2, 99 (0,28H, m, Η-2-β) ; 137,881,5.61 (0.71H, d, ΟΗ-3-α), 4.99 (0.72H, Η-1-α), 4.82 (0.71H, d, ΟΗ-2-α), 4 48 (0.29H, t, Η-1-β), 4.20-4.04 (1.04H, m, H6'-α + β), 3.88-3.73 (0.78H, m, Η-5-α), 3.73-3.56 (1.72H, m, H-6-a + p-3-α), 3.46-3.21 (2.61H, m , Β-3-β, β-4-α + β, H5-paH-2-a) and 3.09-2, 99 (0.28H, m, Η-2-β); 137.881.

128,854, 128,042, 126,435 (Ar-C), 100,462 (acetál-C),128.854, 128.042, 126.435 (Ar-C), 100.462 (acetal-C),

97,642 (C-1-α), 93,211 (C-1-α), 81,729 (C-4-α), 80,897 (C4-β), 75, 796 (C-2-β), 72, 906 (C-2-a a C-3-β) , 69,701 (C-3a), 68,431 (C-6-α), 68,055 (C-6-β) , 65,810 (C-5-β) a 62,032 (C-5-α).97.642 (C-1-α), 93.211 (C-1-α), 81.729 (C-4-α), 80.897 (C4-β), 75, 796 (C-2-β), 72, 906 (C -2-a and C-3-β), 69.701 (C-3a), 68.431 (C-6-α), 68.055 (C-6-β), 65.810 (C-5-β) and 62.032 (C-5) -α).

Zlúčenina 3Compound 3

4,6-O-benzylidén-L-glukopyranóza4,6-O-benzylidene-L-glucopyranose

V destilačnej aparatúre sa zmieša L(-)-glukóza (5,0 g, 27,8 rnniol), benzaldehyd-dimetylacetál (4,66 g, 30,6 mmol) a para-toluénsulfónová kyselina (32 mg, 0,17 mmol) v suchom DMF (20ml). Potom sa pripojí vodná výveva na destiláciu s krátkou cestou pár a destiláciou vo vákuu sa odstráni metanol a DMF. Počas 0,5 hodiny sa pri 55 °C bezfarebná suspenzia rozpustí a získaný roztok sa pol hodiny mieša pri 12 000 Pa (120 mbar) pri postupnom zvyšovaní teploty na 65 °C. Potom sa vákuum zvýši na maximum a reakčná zmes sa ďalších 45 minút odparuje. Na konci destilácie sa reakčná teplota zvýši na 75 °C. Zvyšok je bledožtltkastý sirup, ktorý sa zneutralizuje pridaním NaHCO₃ (29 mg) a nechá sa vychladnúť.Mix L (-) - glucose (5.0 g, 27.8 mmol), benzaldehyde dimethylacetal (4.66 g, 30.6 mmol) and para-toluenesulfonic acid (32 mg, 0.17 mmol) in the distillation apparatus. ) in dry DMF (20ml). A water pump for short vapor distillation is then connected and methanol and DMF are removed by vacuum distillation. The colorless suspension is dissolved at 55 ° C for 0.5 hour and the solution is stirred at 120 mbar for 0.5 hour while gradually raising the temperature to 65 ° C. The vacuum was then increased to maximum and the reaction mixture evaporated for a further 45 minutes. At the end of the distillation, the reaction temperature was raised to 75 ° C. The residue is a pale yellowish syrup which is neutralized by the addition of NaHCO ₃ (29 mg) and allowed to cool.

Surový produkt sa rozpusti v metanole (10 ml) a prečisti sa chromatografiou na reverznej fáze P.P-8, s použitím zmesi metanol/voda 1:1. Frakcie obsahujúce produkt sa spoja a odparením sa odstráni metanol. Zvyšok roztoku sa ďalej zriedi vodou a vysuší sa vymrazením. Z troch samostatných pokusov sa získa biela vločkovitá tuhá hmota v celkovom množstve 2,42 g, ktoré odpovedajú 32,5 % teoretického výťažku.The crude product was dissolved in methanol (10 mL) and purified by reversed phase P.P-8 chromatography using 1: 1 methanol / water. Fractions containing product were combined and evaporated to remove methanol. The remainder of the solution was further diluted with water and freeze-dried. Three separate experiments yielded a white flocculent solid in a total amount of 2.42 g corresponding to 32.5% of the theoretical yield.

Z výsledkov GC chromatografie silylovaných vzoriek vyplýva, že produkt obsahuje dva izoméry (a a β anomér) v pomere 35/65. ^ΣΗ NMR posuny v DMSO-dg sú podobné posunomGC chromatographic results of silylated samples show that the product contains two isomers (aa and β anomer) in a ratio of 35/65. ^{Σ Η} NMR shifts in DMSO-d are similar shift

4.6- O-benzylidén-D-glukopyranózy: 7,51-7,30 (5H, m, Ar-H), 6,86 (0,6H, široké s, OH-Ιβ) , 6,58 (0,3H, široké s, OH-1a) , 5,58 (0,9H, s+s, acetál-Η-α+β), 5,23 (0,7H, d, ΟΗ-3-β), 5,20 (0,6H, d, ΟΗ-2-β), 5,11 (0,4H, d, ΟΗ-3-α), 5,00 (0,4H, H-l-Ot), 4,82 (0,3H, d, ΟΗ-2-α) , 4,47 (0,7H, d, Η-1-β) , 4,21-4,08 (1H, m, Η-6'-α+β), 3,87-3,73 (0,4H, m, Η-5-α), 3,73-3,59 (1,3H, m, H-6' '-α+βa Η-3-α), 3,46-3,22 (3,7H, m, Η-3-β, Η-4-α+β, Η-5-βaΗ-2-α) a 3,09-2,99 (0,6H, m, Η-2-β).4.6-O-benzylidene-D-glucopyranose: 7.51-7.30 (5H, m, Ar-H), 6.86 (0.6H, broad s, OH-β), 6.58 (0.3H , broad s, OH-1a), 5.58 (0.9H, s + s, acetal-Η-α + β), 5.23 (0.7H, d, ΟΗ-3-β), 5.20 (0.6H, d, ΟΗ-2-β), 5.11 (0.4H, d, ΟΗ-3-α), 5.00 (0.4H, H-Ot), 4.82 (0, 3H, d, ΟΗ-2-α), 4.47 (0.7H, d, Η-1-β), 4.21-4.08 (1H, m, Η-6'-α + β), 3.87-3.73 (0.4H, m, Η-5-α), 3.73-3.59 (1.3H, m, H-6'-α + βa-3-α) , 3.46-3.22 (3.7H, m, Η-3-β, Η-4-α + β, Η-5-βaΗ-2-α) and 3.09-2.99 (0, 6H, m, Η-2-β).

Zlúčenina 4Compound 4

4.6- 0-(benzylidén-di) -L-glukopyranóza4.6-O- (benzylidene-di) -L-glucopyranose

L-glukóza (5,14 g, 28,6 mmol) sa zohrieva v DMF (20 ml) pri 95 °C až do vzniku číreho roztoku. Potom sa banka s reakčnou zmesou vloží do vodného kúpeľa s teplotou 65 °C a pridá sa para-toluénsulfónová kyselina (33 mg, 0,17 mmol). Potom sa do miešaného roztoku glukózy v prostredí s tlakom 8 000 Pa (80 mbar) pomocou vodnej vývevy pridá po kvapkách v priebehu 20 minút injekčnou striekačkou benzylidéndimetylacetál-di (4,7 ml, 31 mmol). Potom sa DMF odstráni vo vákuu (200 Pa /2 mbar/) pri 65 ’C a tak sa získa veľmi bledožlto sfarbený olej, ku ktorému sa potom pridá NaHCOj (345 mg) a zmes sa 5 minút mieša. Do oleja s teplotou 65 ’C sa za miešania (magnetický miešací korálik) pridá horúca voda (67 °C, 15 ml) a obsah banky sa pretriasa vo vodnom kúpeli, dokiaľ sa olej očividne nerozpustí. Potom sa banka s reakčnou zmesou vloží na asi 5 minút do prúdu chladnej vody. Už asi za jednu alebo dve minúty sa vylúči amofrná tuhá hmota. Vodná zmes sa potom na 40 minút umiestni do kúpela lad-voda. Vylúčená zrazenina sa potom izoluje filtráciou pomocou vákua (po dekantácii amorfného materiálu), premytím studenou vodou (25 ml) a potom studeným izopropanolom (5 °C, 2x5 ml) a vysušením v prúde dusíka a získa sa 1,85 g suchého bieleho prášku. Silylovaný produkt sa potom analyzuje plynovou chromatografiou a z výsledkov vyplýva 99 % čistota požadovaného produktu.L-glucose (5.14 g, 28.6 mmol) was heated in DMF (20 mL) at 95 ° C until a clear solution was formed. The flask with the reaction mixture was then placed in a 65 ° C water bath and para-toluenesulfonic acid (33 mg, 0.17 mmol) was added. Benzylidenedimethylacetal-di (4.7 mL, 31 mmol) was then added dropwise over 20 minutes to a stirred solution of glucose under 80 mbar using a water pump. The DMF was then removed in vacuo (200 Pa / 2 mbar) at 65 ° C to give a very pale yellow oil, to which was added NaHCO 3 (345 mg) and stirred for 5 minutes. Hot water (67 ° C, 15 ml) is added to the oil at 65 ° C with stirring (magnetic stirring bead) and the contents of the flask are shaken in a water bath until the oil is clearly dissolved. The flask with the reaction mixture was then placed in a stream of cold water for about 5 minutes. In about one or two minutes, an amorphous solid is deposited. The aqueous mixture was then placed in an ice-water bath for 40 minutes. The precipitate was collected by vacuum filtration (after decantation of the amorphous material), washed with cold water (25 mL) and then with cold isopropanol (5 ° C, 2 x 5 mL) and dried under a stream of nitrogen to give 1.85 g of dry white powder. The silylated product is then analyzed by gas chromatography to give 99% purity of the desired product.

^XH NMR δ (DMSO-de) δ vzhladom na TMS: 7,55-7,25 (5H, m, Ar-H), 6,85 (0,48H, d, ΟΗ-1-β), 6,55 (s, 0,33H, ΟΗ-1-α), ^X H-NMR δ (DMSO-de) δ relative to TMS: 7.55-7.25 (5H, m, Ar-H), 6.85 (0.48H, d, ΟΗ-1-β), 6, 55 (s, 0.33H, ΟΗ-1-α),

5,25 (d, 0,48H, ΟΗ-3-β) , 5,20 (d, 0,49H, ΟΗ-2-β), 5,10 (d, 0,35 ΟΗ-3-α), 4,98 (d, 0,35H, Η-1-α), 4,82 (d, 0,34H, 0H-2a) , 4,48 (d, 0,51H, Η-1-β), 4,20-4,05 (m+m, 0,53H + 0,42H, Η-6'-α+β), 3,85-3,73 (m, 0,44H, Η-5-α), 3,72-3,57 (m,5.25 (d, 0.48H, ΟΗ-3-β), 5.20 (d, 0.49H, ΟΗ-2-β), 5.10 (d, 0.35 ΟΗ-3-α), 4.98 (d, 0.35H, Η-1-α), 4.82 (d, 0.34H, 0H-2a), 4.48 (d, 0.51H, Η-1-β), 4 , 20-4.05 (m + m, 0.53H + 0.42H, Η-6'-α + β), 3.85-3.73 (m, 0.44H, Η-5-α), 3.72-3.57 (m,

1,27H, m, H-6-a+pa Η-3-α) , 3, 45-3, 20 (m, 7,8H, Η-3-β, H4-α+β, Η-5-βaΗ-2-α) a 3,10-2,98 (m, 0,56H, Η-2-β).1.27H, m, H-6-a + p Η-3-α), 3, 45-3, 20 (m, 7.8H, Η-3-β, H4-α + β, Η-5- βaΗ-2-α) and 3.10-2.98 (m, 0.56H, Η-2-β).

Biologické príkladyBiological examples

Príklad 1Example 1

Biologické materiály a spôsoby použité na preukázanie účinkovBiological materials and methods used to demonstrate effects

Techniky kultivácie buniekCell culture techniques

Ľudské bunky, NHIK 3025, pôvodom z karcinómu in situ krčka maternice (Nordbye, K., a Oftebro, R., Exp. Celí Res. 58: 458, 1969; Oftebro, R., a Nordbye, K., Exp. Celí Res. 58: 459-460, 1969) boli kultivované v Eaglovom minimálnom esenciálnom médiu (MEM) doplnenom 15% fetálnym teľacím sérom (Gibco BRL, Ltd.). Ľudské bunky karcinómu prsníka, T47D (Keydar, I. et al., Eur. J. Cancer, zväzok 15, str. 659-670, 1979) sa kultivovali v médiu RPMI-1640 doplnenom 10% fetálnym teľacím sérom, 0,2 j/ml inzulínu, 292 mg/ml Lglutamínu, 50 j/ml penicilínu, 50 mg/ml streptomycínu. Bunky sa kultivovali bežným spôsobom ako monovrstvy pri 37 °C v skúmavkách pre tkanivové kultúry. Pre udržiavanie buniek v kontinuálnom exponenciálnom raste sa bunky spracovali trypsínom a trikrát za týždeň sa rekultivovali.Human cells, NHIK 3025, originating from in situ cervical carcinoma (Nordbye, K., and Oftebro, R., Exp. Cell Res. 58: 458, 1969; Oftebro, R., and Nordbye, K., Exp. Cell Res. 58: 459-460, 1969) were cultured in Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) supplemented with 15% fetal calf serum (Gibco BRL, Ltd.). Human breast cancer cells, T47D (Keydar, I. et al., Eur. J. Cancer, Volume 15, pp. 659-670, 1979) were cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum, 0.2 µl. / ml insulin, 292 mg / ml Lglutamine, 50 µl / ml penicillin, 50 mg / ml streptomycin. Cells were cultured in a conventional manner as monolayers at 37 ° C in tissue culture tubes. To keep cells in continuous exponential growth, cells were trypsinized and recultivated three times per week.

Prežívanie buniekCell survival

Prežívanie buniek sa meralo podľa schopnosti vytvárať kolónie.Cell survival was measured by colony-forming ability.

Pred naočkovaním sa exponenciálne rastúce bunky trypsinizovali, suspendovali sa ako jednotlivé bunkyPrior to seeding, exponentially growing cells were trypsinized, suspended as single cells

a naočkovali sí and inoculated the net a priamo and directly na on the 5 cm plastové 5 cm plastic disky. discs. Počet Count naočkovaných inoculated buniek cell sa the vybral tak, chose so aby to počet count životaschopných viable buniek cell bol he was približne 150 approximately 150 na disk to disk . Po . After

dvojhodinovej inkubácii pri 37 °C sa bunky naviazali na dno diskov. Potom sa zahájila aplikácia liekov pomocou nahradenia média médiom obsahujúcim požadovanú koncentráciu lieku. Po aplikácii lieku sa bunky raz premyli teplým (37 °C) Hankovým vyváženým roztokom solí a potom bolo pridané čerstvé médium. Po 10 až 12 dňoch sa bunky pri 37 °C v CO₂ inkubátore fixovali etanolom a farbili sa metylénovou modrou a potom sa spočítali kolónie.After incubating at 37 ° C for 2 hours, the cells were bound to the bottom of the disks. Thereafter, drug delivery was initiated by replacing the medium with a medium containing the desired drug concentration. After drug administration, cells were washed once with warm (37 ° C) Hank balanced salt solution and then fresh medium was added. After 10-12 days, cells were fixed with ethanol at 37 ° C in a CO ₂ incubator and stained with methylene blue, and then colonies were counted.

Obrázok 1 znázorňuje, že zlúčenina 2 indukuje väčšiu inaktiváciu buniek ako tukaresol.Figure 1 shows that compound 2 induces greater cell inactivation than tukaresol.

syntézy proteínom bolaprotein synthesis was

O.W. a kol.,O. W. et al.,

1981) . Stručne, bunkový proteín činidlom počas [¹⁴C] valinom s (0,5 Ci/mol).1981). Briefly, the cellular protein reagent for [ ¹⁴ C] valine with (0.5 Ci / mol).

špecifickej rádioaktivity saspecific radioactivity

Príklad 2Example 2

Syntéza proteínuProtein synthesis

Rýchlosť opísaným spôsobom (Ronning, 107: 47-57, značkovacím minimálne preinkubácie rádioaktivitou konštantnouRate as described (Ronning, 107: 47-57, labeling minimal preincubations with constant radioactivity

Na udržanie vypočítaná skôr J. Celí. Physiol. sa nasýtil dvojdňovej špecifickou konštantnej v médiu použili vysoké koncentrácie valínu (1,0 mM). Pri tejto koncentrácii valínu je zriedenie [¹⁴C] valínu intracelulárnym valinom a proteolyticky produkovaným valinom zanedbateľné (Ronning, 0. et al., Exp. Celí Res. 123: 63-72, 1979). Rýchlosť syntézy proteínu sa vypočíta z inkorporácie [³H]-valínu vzhľadom na celkovú [¹⁴⁰C] rádioaktivitu v proteíne na začiatku príslušného merania a vyjadrí sa v percentách na hodinu (Ronning, O.W. a kol., J. Celí Physiol. 107: 47-57, 1981).To keep calculated previously J. Cell. Physiol. was saturated with a two-day specific constant in the medium using high concentrations of valine (1.0 mM). At this valine concentration, dilution of [ ¹⁴ C] valine with intracellular valine and proteolytically produced valine is negligible (Ronning, 0 et al., Exp. Cell Res. 123: 63-72, 1979). Protein synthesis rate is calculated from the incorporation of [ ³ H] -valine relative to total [ ¹⁴⁰ C] radioactivity in the protein at the beginning of the respective measurement and expressed as a percentage per hour (Ronning, OW et al., J. Cell Physiol. 107: 47 57, 1981).

Z obr. 2 je zrejmé, že zlúčenina 2 indukuje lepšiu inhibíciu syntézy proteínu ako tukaresol.FIG. 2, compound 2 induces better inhibition of protein synthesis than tukaresol.

Z obr. 3 je zrejmé, že zlúčenina 2 indukuje silnejšiu inhibíciu syntézy proteínov ako zilaskorb[²H] . Bunky použité v tomto pokuse sú Panc-1 bunky pochádzajúce z ľudského adenokarcinómu slinivky brušnej (Lieber a kol., Int. J. Cancer, 15: 741-747, 1975), kultivované v médiu E2a.FIG. 3, compound 2 induces a stronger inhibition of protein synthesis than zilaskorb [ ² H]. The cells used in this experiment are Panc-1 cells derived from human pancreatic adenocarcinoma (Lieber et al., Int. J. Cancer, 15: 741-747, 1975) grown in E2a medium.

Príklad 3Example 3

Meranie bunkovej adhézieMeasurement of cell adhesion

Bunkové adhézne sily sa merali pomocou mikroskopu na meranie manipulačnej sily (G. Sagvolden, Manipulation force mocroscope, Ph.D. thesis, University of Oslo, 1998, a G. Sagvolden, I. Giaver a J. Feder, Characteristic protein adhesion forces on glass and polystyréne substrates by atomic force microscopy, Langmuir 14(21): 5984-5987, 1998). Stručne, NHIK 3025 karcinómové bunky sa kultivovali v CO₂independentnom médiu obsahujúcom 15% fetálne teľacie sérum. Tieto bunky sa vystavili na 20 hodín pôsobeniu 1 mM koncetrácie zlúčeniny 1 alebo zlúčeniny 2 pred tým, ako sa uvoľnili z bunkových kultivačných skúmaviek pomocou trypsínu. Bunky sa udržiavali v suspenzii a miestnili sa v médiu so zlúčeninou 1 alebo zlúčeninou 2 na polystyrénové tkanivové kultivačné substráty, 90 minút po ukončení trypsínovej reakcie. Adhézne sily medzi bunkami a substrátom sa merali pomocou odstránenia buniek s použitím šikmej konzoly mikroskopu na meranie sily pôsobiacej ako snímač sily. V jednom momente sa odstránila jedna bunka a každá bunka sa odstránila len raz.Cell adhesion forces were measured using a microscope to measure the manipulation force (G. Sagvolden, Manipulation force mocroscope, Ph.D. thesis, University of Oslo, 1998, and G. Sagvolden, I. Giaver and J. Feder, Characteristic protein adhesion forces on glass and polystyrene substrates by atomic force microscopy, Langmuir 14 (21): 5984-5987, 1998). Briefly, NHIK 3025 carcinoma cells were cultured in CO ₂ independent medium containing 15% fetal calf serum. These cells were treated for 20 hours with a 1 mM concentration of Compound 1 or Compound 2 before being released from the cell culture tubes by trypsin. Cells were kept in suspension and plated in medium with compound 1 or compound 2 on polystyrene tissue culture substrates, 90 minutes after the trypsin reaction was complete. The adhesion forces between the cells and the substrate were measured by removing the cells using a slant microscope console to measure the force acting as a force sensor. One cell was removed at a time and each cell was removed only once.

Maximálna sila zistená pre každú bunku sa zaznamenala ako funkcia času, pretože bunky boli umestnené na substráte. Medián sily pre skupinu 19 meraní je na obr. 4 uvedený ako funkcia priemerného času pre bunky vystavené pôsobeniu zlúčeniny 1 alebo zlúčeniny 2, spolu s adhéznymi silami buniek nevystavených pôsobeniu týchto zlúčenín. Zlúčenina 2 má značné účinky v redukcii adhéznej sily pri tejto koncentrácii, zatiaľ čo zlúčenina 1 nemá významné účinky. Efekt zlúčeniny spočíva hlavne v redukcii adhéznej sily buniek a nie v priebehu adhézie.The maximum force found for each cell was recorded as a function of time since the cells were placed on the substrate. The median force for the group of 19 measurements is shown in FIG. 4 as a function of the mean time for cells exposed to compound 1 or compound 2, together with the adhesion forces of cells not exposed to these compounds. Compound 2 has significant effects in reducing the adhesion force at this concentration, while Compound 1 has no significant effects. The effect of the compound is mainly to reduce the adhesion strength of the cells and not during the adhesion.

Znížená schopnosť väzby na substrát môže súvisieť s blokovaním zakotvenia buniek sprostredkovaného integrínmi.The reduced ability to bind to the substrate may be related to blocking integrin-mediated anchoring of cells.

Bolo dokázané, že takéto blokovanie môže indukovať programovanú bunkovú smrť u hepatómových a melanómových buniek (Paulsen, P.E., Halí, K.S., Rugstad, H.E., Reichelt, K.L., a Elgjo, K., The synthetic hepatic peptides pyroglutamylgutamylglycylserylasparagin and pyroglutamylglutamylglycylserylasparatic acid inhibit growth of MH1C1 rat hepatoma cells transplanted into buffalo rats and athymic mice. Cancer Res. 52(1992), 1218-1221; a Mason, M.D., Allman, R. a Quibell, M. „Adhesion molecules in melanoma - more then just superglue?, J. Royal Soc. Med. 89(1992), 393-395).It has been shown that such blocking can induce programmed cell death in hepatoma and melanoma cells (Paulsen, PE, Hall, KS, Rugstad, HE, Reichelt, KL, and Elgjo, K., The synthetic hepatic peptides MH1C1 rat hepatoma cells transplanted into buffalo rats and athymic mice Cancer Res. 52 (1992), 1218-1221; and Mason, MD, Allman, R. and Quibell, M. "Adhesion molecules in melanoma - more then just superglue ?," J. Royal Soc., Med 89 (1992), 393-395).

Adhézna sila medzi NHIK 3025 bunkami a substrátom bola meraná po pre-inkubácii buniek v roztoku zlúčeniny 1 a 2.The adhesion strength between NHIK 3025 cells and the substrate was measured after pre-incubation of the cells in solution of compounds 1 and 2.

Aj pri koncentrácii 1 mM bol pozorovaný prekvapujúci efekt D-izotopu. Prekvapivo, zlúčenina 2 významne znižuje adhéznu silu na 1/3 v porovnaní s kontrolou, zatiaľ čo zlúčenina 1 nevedie k významnému zníženiu. Autori vynálezu usudzujú, že zlúčenina 2môže interferovať s biosyntézou integrínov, čo znižuje schopnosť buniek viazať sa na substrát. Integríny sú štrukturálne transmembránové proteíny, zásadné pre väzbu extŕacelulárnu matricu a pre medzibunkové Inhibícia funkcie integrínov tak môže priamo nádorových buniek, citlivé najmä na 2 môže byť použitá buniek na interakcie.Even at a concentration of 1 mM a surprising effect of the D-isotope was observed. Surprisingly, compound 2 significantly reduced the adhesion force to 1/3 compared to control, while compound 1 did not lead to a significant decrease. The inventors conclude that compound 2 can interfere with integrin biosynthesis, which reduces the ability of cells to bind to the substrate. Integrins are structural transmembrane proteins essential for the binding of the extracellular matrix and for intercellular inhibition of integrin function can thus directly tumor cells, particularly sensitive to 2 cells can be used for interactions.

schopnosť metastázovania ukázal, že integríny môžu byť inhibíciu syntézy proteínov. Zlúčenina na prevenciu metastázovania pri vývoji nádoru.the ability to metastasize has shown that integrins may be an inhibition of protein synthesis. A compound for preventing metastasis in tumor development.

ovplyvňovať PokusInfluence Attempt

Príklad 4Example 4

Pokusy so zlúčeninou 2 na NMRI myšiach infikovaných FRIEND vírusom erytroleukémie (FLV)Experiments with compound 2 in NMRI mice infected with FRIEND erythroleukemia virus (FLV)

Vírus: Eveline bunky boli získané od prof. Gerharda Hunsmana, Mníchov. Autori vynálezu dokázali, že tento vírus, ktorý bol pôvodne používaný ako zdroj Friend pomocného vírusu, obsahuje defektný vírus rovnakej veľkosti ako Spleen Focis Forming Vírus (SFFV), ktorý indukuje erytroleukémiu u NMRI myší po 4 až 8 týždňoch.Virus: Eveline cells were obtained from prof. Gerhard Hunsman, Munich. The inventors have shown that this virus, which was originally used as a source of Friend helper virus, contains a defective virus of the same size as Spleen Focis Forming Virus (SFFV), which induces erythroleukemia in NMRI mice after 4 to 8 weeks.

Myši: NMRI myši boli získané z Old Bomholt Farm, Dánsko a boli kúpené prostredníctvom SIFF. Myši boli získané 6. mája a do pokusu bolu zaradené 11. mája. Myši sa infikovali intraperitoneálne 50 μΐ supernatanta z Eveline kultúry. Po 24 hodinách bola liečba zahájená. Zlúčenina 2 a zlúčenina 5 sa rozpustili v sterilnom izotonickom glycerolovom roztoku v koncentrácii odpovedajúcej 5 mg na kg pri intraperitoneálne j aplikácii 50 μΐ.Mice: NMRI mice were obtained from Old Bomholt Farm, Denmark and purchased via SIFF. The mice were obtained on 6 May and included in the experiment on 11 May. Mice were infected intraperitoneally with 50 μΐ supernatant from Eveline culture. Treatment was started after 24 hours. Compound 2 and compound 5 were dissolved in sterile isotonic glycerol solution at a concentration corresponding to 5 mg per kg by intraperitoneal administration of 50 μΐ.

Pokus bol uskutočnený takto:The experiment was performed as follows:

myší - neinfikovaná kontrola myši -infikovaná kontrola myší - neinfikované, liečené zlúčeninou 2 myší -infikované, liečené zlúčeninou 2mice - uninfected mouse control -infected mouse control - uninfected, treated with compound 2 mice -infected, treated with compound 2

Myšiam sa podávali intraperitoneálne injekcie raz denne 19 dní. Od 1.6. do 16.6., kedy boli myši zabité, sa nepodávala žiadna liečba. 16.6. boli myši zabité. Odobrala sa im krv (pre následnú analýzu). Odstránili sa sleziny a odvážili sa (pozri tabuľku 3) . Časť sleziny sa zmrazila dusíkom pre prípravu tenkých plátkov a časť sa fixovala formalínom.Mice were injected intraperitoneally once daily for 19 days. Od 1.6. no treatment was given until June 16, when the mice were killed. 6.16 mice were killed. Blood was collected (for subsequent analysis). Spleens were removed and weighed (see Table 3). A portion of the spleen was frozen with nitrogen to prepare thin slices and a portion fixed with formalin.

Tabuľka 1Table 1

Neinfikované uninfected Infikované infected Zlúčenina 2, Compound 2, Zlúčenina 2, Compound 2, kontroly inspection kontroly inspection neinfikované uninfected infikované infected 125 125 154 154 266 266 151 151 160 160 240 240 143 143 153 153 94 94 214 214 106 106 168 168 146 146 212 212 153 153 145 145 118 118 165 165 117 117 149 149 120 120 171 171 157 157 127 127 115 115 190 190 63,284 63,284 131 131 103 103 204 204 170 170 130 130 203 203 127 127 147 147 148 148 148 148 125, 8 125, 8 190,1 190.1 157 157 146, 9 146, 9 20, 5 20, 5 24,5 24.5 63 63 15,228 15,228

Výsledky sú uvedené aj na obr. 6.The results are also shown in FIG. 6th

Ako je zrejmé, existuje významný rozdiel v hmotnosti slezín pri porovnaní infikovaných zvierat s neinfikovanými kontrolami. Hmotnosti slezín neinfikovaných zvierat liečených zlúčeninou 2 sú vyššie ako hmotnosti neinfikovaných kontrol, aj keď rozdiel nie je štatisticky významný. Možno povedať, že infikované zvieratá, ktoré boli liečené zlúčeninou 2 mali skutočne nižšiu priemernú hmotnosť sleziny v porovnaní s neinfikovanými zvieratami, ktoré boli liečené podobným spôsobom (tu sa predpokladá, že výsledok pramení od jedného zvieraťa v kontrolnej skupine, ktoré malo významne väčšiu slezinu).As can be seen, there is a significant difference in spleen weight when compared to infected animals with uninfected controls. The spleen weights of uninfected animals treated with Compound 2 are higher than the weights of uninfected controls, although the difference is not statistically significant. It can be said that infected animals treated with Compound 2 had indeed a lower average spleen weight compared to uninfected animals treated similarly (here it is assumed that the result stems from one animal in the control group that had a significantly larger spleen) .

Histologické vyšetrenie ukázalo, že neinfikované kontroly majú normálnu anatómiu sleziny. Všetky zvieratá v infikovanej neliečenej skupine mali inváziu patologických leukemických buniek do červenej drene. Sleziny neinfikovaných zvierat liečených zlúčeninou 2 mali hypertrofické zárodočné centrá, ktoré sú interpretované ako dôsledok imunostimulácie. Leukemické zmeny nebolo možné nájsť v slezinách infikovaných zvierat liečených zlúčeninou 2.Histological examination revealed that uninfected controls had normal spleen anatomy. All animals in the infected untreated group had invasion of pathological leukemic cells into the red marrow. The spleens of uninfected animals treated with Compound 2 had hypertrophic germinal centers that are interpreted as a result of immunostimulation. Leukemic changes could not be found in the spleens of infected animals treated with compound 2.

Tieto výsledky sú sľubné, ak sa vezme do úvahy agresívny charakter FLV u myší a tiež, keď sa porovnajú s účinkami azidotymidinovej a inej antivírusovej liečby.These results are promising considering the aggressive nature of FLV in mice and also when compared to the effects of azidothymidine and other antiviral treatments.

Príklad 5Example 5

Proliferácia mononukleárnych buniek periférnej krviProliferation of peripheral blood mononuclear cells

Vynálezcovia uskutočnili pokus, v ktorom boli mononukleárne bunky periférnej krvi vystavené pôsobeniu superantigénu spolu s benzaldehydom, deuterizovaným benzaldehydom, zlúčeninou 2 alebo zilaskorbom(²H) . Superantigén sa použil ako veľmi aktívny štandard pre proliferáciu T-lymfocytov a je prezentovaný T-lymfocytom bunkami prezentujúcimi antigén.The inventors conducted an experiment in which the peripheral blood mononuclear cells exposed to the superantigen together with benzaldehyde, deuterated benzaldehyde, Compound 2 or zilascorb ^(2H). Superantigen has been used as a very active standard for T-cell proliferation and is presented by T-cell presenting antigen cells.

Pokus dokázal (pozri obr, 5) , že pridanie benzaldehydu, deuterizovaného benzaldehydu alebo zlúčeniny 2 štatisticky významne zvyšuje proliferáciu mononukleárnych buniek periférnej krvi spôsobom závislým od dávky s krivkou v tvare zvona, zatiaľ čo u zilaskorbu(²H) bol pozorovaný veľmi malý efekt. Skutočnosť, že sme boli schopní zosilniť proliferačný signál zo superantigénu naznačuje, že zlúčeniny majú ďalší ko-stimulačný efekt na T-lymfocyty.The experiment demonstrated (see Figure 5) that the addition of benzaldehyde, deuterated benzaldehyde or compound 2 statistically significantly increased peripheral blood mononuclear cell proliferation in a dose-dependent manner with a bell-shaped curve, while a very small effect was observed with zilaskorb ( ² H). The fact that we were able to amplify the proliferation signal from the superantigen suggests that the compounds have an additional co-stimulatory effect on T cells.

Protinádorové účinky u nádorov pečene indukovanýchAnti-tumor effects in liver-induced tumors

Príklad 6 nitrozamínom u krýsExample 6 nitrosamine in rats

V tomto pokuse bolo testované, či 11 mesačná liečba zlúčeninou 2 alebo zilaskorbom (²H) môže zabrániť vývoju karcinómu v pečeni u krýs po parciálnej hepatektómii pomocou dietylnitrozamínu (DENA) a fenobarbitalu.In this experiment, it was tested whether the 11-month treatment with Compound 2 or zilascorb ⁽² H) inhibit the development of cancer of the liver in rats after partial hepatectomy using dietylnitrozamínu (DENA) and phenobarbital.

Materiály a metódyMaterials and methods

Boli použité Wistar Kyoto krysy od Versuchtierzucht Inštitút, Hannover. Perciála hepatektómia (odstránené 70 %) bola uskutočnená v Rádium Hospital u krýs starých 4 týždne pred intraperitoneálnou aplikáciou dietylnitrozamínu (DENA) a štvortýždňovou aplikáciou fenobarbitálu. Karcinómy pečene vznikli u väčšiny zvierat počas 10 mesiacov po tejto iniciácii karcinogenézy. Šesť a pol mesiaca po iniciácii karcinogenézy, t. j. pred vznikom akéhokoľvek nádoru sa zahájila liečba v National Inštitúte of Occupational Health.Wistar Kyoto rats from the Versuchtierzucht Institute, Hannover were used. Percental hepatectomy (70% removed) was performed at Radium Hospital in rats 4 weeks old prior to intraperitoneal administration of diethylnitrosamine (DENA) and four weeks of phenobarbital administration. Liver carcinomas developed in most animals within 10 months after this initiation of carcinogenesis. Six and a half months after initiation of carcinogenesis, i. j. prior to the onset of any tumor, treatment was initiated at the National Institute of Occupational Health.

zvierat bolo náhodne rozdelených do 4 skupín po 14 zvieratách a týmto skupinám boli i.v. podávané tieto dávky liekov:animals were randomly divided into 4 groups of 14 animals each and these groups were i.v. the following doses of medicines administered:

Skupina 1:Group 1:

Skupina 2:Group 2:

Skupina 3:Group 3:

Skupina 4:Group 4:

kontrola, žiadne injekcie len injekcie salinického roztoku mg/kg zlúčeniny 2control, no injections only saline mg / kg compound 2 injections

100 mg/kg zilaskorbu (²H)100 mg / kg zilaskorb ( ² H)

Liečba bola aplikovaná v päťtýždňových cykloch: prvé 3 týždne denne i.v. injekcie, potom pauza. Celkom bolo aplikovaných 9 kompletných, päťtýždňových cyklov. Celkový čas od prvej liečby do konca liečby a autopsie bol 11 mesiacov.Treatment was given in five-week cycles: first 3 weeks daily i.v. injection, then pause. A total of 9 complete, five-week cycles were applied. The total time from the first treatment to the end of treatment and autopsy was 11 months.

Pri pitve bolo uskutočnené približné zhodnotenie objemu pečeňových nádorov, ale bez dôkladného prerezania pečene. Po fixácii vo formalíne vykonal profesor Jahn M. Nesland, vedúci oddelenia patológie v Norwegian Raduim Hospital, po prvýkrát presné hodnotenie nádorovej hmoty narezaním a makroskopickým zhodnotením tkaniva a potom histologickým vyšetrením ako nádorového tkaniva (prítomného najmä v pečeni), tak normálneho tkaniva zo všetkých relevantných orgánov a tkanív.At autopsy, an approximate assessment of liver tumor volume was performed, but without thorough liver incision. Following fixation in formalin, Professor Jahn M. Nesland, Head of Pathology at Norwegian Raduim Hospital, performed an accurate tumor mass evaluation for the first time by incision and macroscopic evaluation of the tissue, and then histological examination of both tumor tissue (present mainly in the liver) and normal tissue from all relevant organs and tissues.

U každého zvieraťa sa histologický vyšetrili mnohopočetné ložiská, rovnako ako pre-maligne noduly.Multiple foci as well as pre-malignant nodules were examined histologically for each animal.

VýsledkyThe results

Protinádorový efekt lieku bol analyzovaný podía frekvencie zvierat s nádormi pečene v čase pitvy a zistilo sa, že štatisticky významne nižší počet zvierat s nádormi pečene je v skupine liečenej zlúčeninou 2, v porovnaní so skupinou liečenou placebom. Analýza pomocou jednostranného Fisherovho exaktného testu poskytla hodnotu p 0,05. Keď sa obe kontrolné skupiny zlúčili dohromady, tak sa u 25 zvierat z 28 vyvinuli nádory pečene, zatiaľ čo v skupine liečenej zlúčeninou 2 došlo k vzniku nádorov pečene u 7 zvierat zo 14. V tomto prípade je počet zvierat dosť vysoký pre chĺ-kvadrátový test, ktorý ukazuje, že rozdiel je štatisticky významný pri p = 0,015. V skupine liečenej zilaskorbom (²H) sa nádory pečene vyvinuli u 11 zo 14 zvierat. To je len o jedno zviera menej ako v kontrolnej skupine a rozdiel nie je štatisticky význemný.The anti-tumor effect of the drug was analyzed according to the frequency of animals with liver tumors at the time of necropsy, and it was found that a statistically significantly lower number of animals with liver tumors was in the Compound 2 treated group compared to the placebo treated group. Analysis by one-sided Fisher's exact test gave a p value of 0.05. When the two control groups were pooled together, 25 animals out of 28 developed liver tumors, whereas in the Compound 2 treated group, 7 animals out of 14 developed liver tumors. In this case, the number of animals is fairly high for the chad-square test. , which shows that the difference is statistically significant at p = 0.015. In the zilaskorb ( ² H) group, liver tumors developed in 11 of 14 animals. This is only one animal less than in the control group and the difference is not statistically significant.

Velkosť nádorov je najlepšie analyzovaná na obr. 7 a obr. 8. Tu je zjavné, že zlúčenina 2 má presvedčivý účinok: zatial čo 50 % zvierat v skupine liečenej placebom malo nádory pečene väčšie ako 10 cm³, žiadne zviera v skupine liečenej zlúčeninou 2 nemalo tak veľké nádory (chĺ-kvadrátový test: p = 0,0038). Ďalej, zatiaľ čo v skupine liečenej zlúčeninou 2 len 3 zvieratá (t. j. 21 %) mali nádory väčšie ako 1 cm³, v skupine liečenej placebom malo 10 zvierat (t.j. 71 %) nádory väčšie ako toto ohraničenie (Fisherov exaktný test: p = 0,0002). Tak je pre zlúčeninu 2 protinádorový účinok ešte zreteľnejší, ak sa berie do úvahy veľkosť nádorov spolu s frekvenciou vývoja nádorov.Tumor size is best analyzed in FIG. 7 and FIG. 8. Here it is evident that Compound 2 has a convincing effect: while 50% of the animals in the placebo group had liver tumors greater than 10 cm ³ , no animal in the Compound 2 group had such large tumors (chl-square test: p = 0.0038). Furthermore, while in the group treated with Compound 2 only 3 animals (ie 21%) had tumors greater than 1 cm ³ , in the placebo group, 10 animals (ie 71%) had tumors larger than this limitation (Fisher's exact test: p = 0 , 0002). Thus, the anti-tumor effect for Compound 2 is even more pronounced when considering the size of the tumors along with the frequency of tumor development.

Obrázok 9 znázorňuje meranie priemernej telesnej hmotnosti pre každú skupinu zvierat počas celého obdobia od parciálnej hepatektómie a liečby nitrozamínom (čas 0). Merania telesnej hmotnosti, aj histologické vyšetrenia normálnych tkanív jasne dokazujú úplnú neprítomnosť vedľajších účinkov. Kolísanie kriviek telesnej hmotnosti (obr. 9) je nepochybne spôsobené liečbou, no nie liekmi. Zvieratá patrne ovplyvňujú injekcie samotné, pretože zvieratá liečené salinickým roztokom majú v podstate rovnaké variácie telesnej hmotnosti ako zvieratá liečené salinickým roztokom a liekmi.Figure 9 shows the mean body weight measurement for each group of animals over the entire period from partial hepatectomy and nitrosamine treatment (time 0). Both body weight measurements and histological examinations of normal tissues clearly demonstrate the complete absence of side effects. The variation in body weight curves (Fig. 9) is undoubtedly caused by treatment, but not by drugs. The animals appear to affect the injections themselves because animals treated with saline have essentially the same body weight variations as animals treated with saline and medications.

To, že zvieratá 11 mesiacov liečené 210 i.v. injekciami majú zmenenú telesnú hmotnosť, nie je prekvapujúce. Pri každej injekcii boli zvieratá mierne prehriate pod elektrickým vykurovaním a potom boli imobilizované v špeciálne pripravenom fixačnom zariadení, aby mohla byť aplikovaná injekcia. Napriek tomu, že tento postup uskutočnil v kľudnej miestnosti skúsený pracovník, ktorý bol vyškolený na ukľudnenie zvierat, nie je prekvapujúce, že môže vyvolať biologickú reakciu u zvierat.That animals treated for 11 months with 210 i.v. injections have altered body weight, not surprisingly. At each injection, the animals were slightly warmed up under electric heating and then immobilized in a specially prepared fixation device for injection. Although this procedure was carried out in a quiet room by an experienced worker trained to calm the animals, it is not surprising that it can induce a biological response in the animals.

Jedným aspektom testu, ktorý súvisí s vedľajšími účinkami, je histologické vyšetrenie normálnych tkanív z rôznych orgánov tela. Táto rozsiahla štúdia je zhrnutá v tabuľkách 2 až 4 (priložených). V žiadnom prípade neboli zistené žiadne abnormality, ktoré by mohli súvisieť s liečbou liekom. Treba uviesť, že ani chvosty krýs v regióne, kde boli i.v. injekcie aplikované denne dlhý čas, neboli liečbou poškodené.One aspect of the test that is related to side effects is the histological examination of normal tissues from different organs of the body. This extensive study is summarized in Tables 2 to 4 (attached). In no case were any abnormalities that could be associated with drug treatment detected. It should be noted that even the tails of rats in the region where they were i.v. injections given daily for a long time were not damaged by treatment.

Z frekvencii preneoplastických zaujímavý záver. Podľa zvierat vyvinuli mnohopočetné ložiská, považované za skoré štádium v procese sa, že by boli vznik preneoplastických zvierat, neukazujú umocňuje vyvodený u všetkých lézie sú lézií v pečeni môže byť sa tabuliek 2 ažFrom the frequency of pre-neoplastic interesting conclusion. According to the animals have developed multiple lesions, considered to be an early stage in the process that would be the emergence of pre-neoplastic animals, do not show potentiated deduced in all lesions are lesions in the liver may be with Tables 2 to

Tieto vzniku malignity liečbou.These onset of malignancy treatment.

obmedzený skupinách. tieto lézie, nádorové-špecifické účinky len v v pečeni a nezdálimited groups. These lesions, tumor-specific effects only in the liver and does not appear

Ďalej, na niekoľkoNext, for a few

Údaje preto čo ďalej ovplyvnené nodúl, hoci je prítomný vo všetkých akýkoľvek efekt liekov na názor, že zlúčenina 2 má pečeni.The data therefore continue to be affected by the nodules, although it is present in all any effect of drugs on the view that compound 2 has liver.

Na obr. 10 sú frekvencie a veľkosť pečeňových nádorov vnesené do grafu na rovnakej krivke, s použitím logaritmickej mierky na osi x.In FIG. 10, the frequencies and size of liver tumors are plotted on the same curve, using a logarithmic scale on the x-axis.

Frekvencia nádorov vzniknutých v pečeni. Počet zvierat v kontrolnej skupine a v skupine liečenej placebom, u ktorých sa rozvinuli nádory v pečeni, bo] 13 a 12, v príslušnom poradí, zo 14 zvierat v každej skupine (tabuľky 2 a 3). V skupine 3 (85 mg/kg zlúčeniny 2) sa len u 7 zvierat zo 14 rozvinuli nádory pečene (tabuľka 4). Pri testovaní rozdielu medzi skupinou 2 (placebo) a 3 je počet prípadov príliš malý pre chi-kvadrátový test. Avšak jednostranný Fisherov exaktný test môže byť uskutočnený a dokazuje, že tieto dve skupiny sú z hľadiska frekvencie vzniku pečeňových nádorov štatisticky významne rozdielne (p = 0,05). Avšak tento rozdiel je ešte štatisticky významnejší, ak v teste zahrnieme do kontrolnej skupiny aj neliečené kontrolné zvieratá (skupina 1). V tomto prípade je 28 kontrolných zvierat, z ktorých u 25 vznikli nádory pečene, a chĺ-kvadrátový test je prijateľný. V tomto prípade je rozdiel medzi skupinou 3 a kontrolami štatisticky významný, s p = 0,015.Frequency of liver tumors. The number of animals in the control group and the placebo group who developed liver tumors, respectively, 13 and 12, respectively, out of 14 animals in each group (Tables 2 and 3). In Group 3 (85 mg / kg Compound 2), only 7 animals out of 14 developed liver tumors (Table 4). When testing the difference between Group 2 (placebo) and 3, the number of cases is too small for the chi-square test. However, a one-sided Fisher's exact test can be performed and demonstrates that these two groups are statistically significantly different in terms of the frequency of liver tumor formation (p = 0.05). However, this difference is even more statistically significant if untreated control animals are included in the test group (Group 1). In this case, there are 28 control animals, 25 of whom have developed liver tumors, and the square test is acceptable. In this case, the difference between group 3 and controls is statistically significant, with p = 0.015.

V skupine 4 (100 mg/kg zilaskorbu (²H) ) sa u 11 zo 14 zvierat vyvinuli nádory pečene. To je len o jedno zviera menej ako v placebo skupine a rozdiel nie je štatisticky významný. Analýza frekvencie vzniku nádorov pečene musí mať ten záver, že liečba zlúčeninou 2 štatisticky významne znižuje vznik nádorov pečene, kým zilaskorb(²H) nemá taký účinok.In group 4 (100 mg / kg zilascorb ^(2H)), 11 of 14 animals developed liver tumors. This is only one animal less than in the placebo group and the difference is not statistically significant. Analysis of the frequency of tumors of the liver has to be concluded that the treatment with Compound 2 significantly reduced the formation of tumors of the liver, while zilascorb ⁽² H) has no such effect.

Velkosť vzniknutých nádorov pečene. Veľkosť nádorov pečene je najlepšie znázornená na obr. 10, a je takisto uvedená v tabuľkách 2 až 4. Tu má zlúčenina 2 presvedčivý účinok: zatiaľ čo 50 % zvierat v skupine liečenej placebom a v kontrolnej skupine malo nádory pečene väčšie ako 10 cm³, žiadne zviera v skupine liečenej zlúčeninou 2 nemalo tak velké nádory (chi-kvadrátový test: p = 0,0038). Ďalej, zatial čo v skupine liečenej zlúčeninou 2 len 3 zvieratá (t. j. 21 %) mali nádory väčšie ako 1 cm³, v skupine liečenej placebom a v kontrolnej skupine, v príslušnom poradí, malo 10 a 13 zvierat (t. j. 71 % a 93 %) nádory väčšie ako toto ohraničenie (Fisherov exaktný test: p = 0,0002 a p = 0,011, v príslušnom poradí).Size of resulting liver tumors. The size of the liver tumors is best shown in FIG. 10, and is also shown in Tables 2 to 4. Here, Compound 2 has a convincing effect: while 50% of the animals in the placebo and control group had liver tumors greater than 10 cm ³ , no animal in the Compound 2 treated group was so large tumors (chi-square test: p = 0.0038). Furthermore, while in the Compound 2-treated group only 3 animals (ie 21%) had tumors greater than 1 cm ³ , in the placebo-treated group and in the control group, respectively, 10 and 13 animals (ie 71% and 93%) tumors larger than this limit (Fisher's exact test: p = 0.0002 and p = 0.011, respectively).

Pre zlúčeninu 2 je protinádorový účinok ešte zreteľnejší, ak sa berie do úvahy veľkosť nádorov spolu s frekvenciou vývoja nádorov. V skutočnosti je tak silný, že počas pitvy bolo obťažné pri makroskopickej prehliadke pečene zistiť nádory.For Compound 2, the antitumor effect is even more pronounced when considering the size of the tumors along with the frequency of tumor development. In fact, it is so strong that during autopsy it was difficult to detect tumors during macroscopic examination of the liver.

Pre zvieratá liečené zilaskorbom (²H) je efekt oveľa slabší ako pre zvieratá liečené zlúčeninou 2, aj keď je do úvahy braná veľkosť nádorov. Počet zvierat liečených zilaskorbom(²H), ktoré majú nádor väčší ako 1 cm³, je 7. Test významnosti oproti kontrolnej skupine a skupine liečenej placebom, ako bol uskutočnený so zvieratami liečenými zlúčeninou 2, poradí.For animals treated zilascorb ⁽² H) effect is much weaker than for animals treated with compound 2, although it is to account for tumor size. The number of animals treated with zilaskorb ( ² H) having a tumor greater than 1 cm ³ is 7. Significance test over control and placebo treated groups, as performed with Compound 2 treated animals, respectively.

kontrolou príslušnom neliečenou ukázal hodnoty p = 0,036 a 0,44, Tak je rozdiel v porovnaní štatisticky významný, zatiaľ so skupinou liečenou placebom nie významný. Pokiaľ sa berie do úvahy, že 3 čo porovnaní štatisticky je zo zvierat v skupine liečenej placebom mali nádory menšie ako cm³ a pokiaľ by bolo porovnanie uskutočnené pre 0,5 cm³, tak by bol štatisticky významný rozdiel aj pre placebo skupinu (pozri obr. 10). Avšak predkladaná analýza ukazuje, že efekt zilaskorbu (²H) je slabý a pravdepodobne na hranici štatistickej významnosti. Ďalej pre zvieratá, ktoré majú nádory 3 až 5 cm^J nie je rozdiel medzi skupinou liečenou zilaskorbom(²H) a placebom alebo kontrolnou skupinou.control of the untreated control showed p = 0.036 and 0.44. Thus, the difference in comparison was statistically significant, but not significant with the placebo group. Taking into account that 3 of the statistically comparable animals in the placebo group had tumors smaller than cm ^3, and if the comparison were to be performed for 0.5 cm ³ , there would be a statistically significant difference for the placebo group as well (see fig. 10). However, the present analysis indicates that the effect of zilascorb ^(2H) is weak, and probably at the limit of statistical significance. Next, the animals with tumors of 3-5 cm ^J, the difference between the treated group zilascorb ^(2H) and a placebo control group.

V samotnom pokuse, v ktorom boli zilaskorb (²H) a zlúčenina 2 podávané krysám len 10 dní, neukázalo histologické vyšetrenie tkaniva žiaden rozdiel v skupine liečenej zilaskorbom(²H), zatiaľ čo u 2 z 5 zvierat liečených zlúčeninou 2 bola pozorovaná zvýšená nekrózia nádorov.In a single experiment in which zilaskorb ( ² H) and compound 2 were administered to rats only for 10 days, histological tissue examination showed no difference in the zilaskorb ( ² H) treated group, whereas increased necrosis was observed in 2 of 5 animals treated with compound 2. tumors.

Tabuľka 2:Table 2:

Výsledky histologického vyšetrenia normálneho a nádorového tkaniva: skupina 1 - neošetrená kontrolná skupinaResults of histological examination of normal and tumor tissue: Group 1 - untreated control group

zviera č. animal no. tkanivá okrem pečene tissues other than liver pečeň liver hypofýza hypophysis hart, aorta, týmus hart, aorta, team plúca, tyro-, pankreas lung, tyro-, pancreas testes, prostata testes, prostate žalúdok, kolón stomach, column slezina, kostná dreň spleen, bone marrow chvost, labka tail, paw ladv. L/R nekróza * neighborhood. L / R necrosis * preneopl. noduly preneopl. nodules ložiská bearings nekróza tumoru tumor necrosis 3 3 0/+ 0 / + 0 0 MF MF nie not 11 11 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF ( + ) (+) 22 22 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF + + 24 24 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF áno Yes MF MF + + 25 25 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF áno Yes MF MF nie not 27 27 NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF+C MF + C + + 31 31 NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF + + 33 33 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF + + 35 35 NF NF NF NF NF NF kare. ++ kare. ++ 0 0 MF MF + + 38 38 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF áno Yes MF MF tumor tumor 51 51 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF + + 54 54 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF kare, nie kare, no 0 0 MF MF nie not 56 56 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF + + 60 60 TUnie Tuni NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF + +

Skratky: NF - výsledok histológie, normálny nálezAbbreviations: NF - result of histology, normal finding

MF - mnohopočetné ložisko nie - bez známok nekrózy * U niektorých zvierat bola vyšetrená labka ľavej prednej končatiny. Vo všetkých prípadoch bol zistený normálny nález.MF - multiple lesion no - no signs of necrosis * In some animals, the left paw was examined. In all cases a normal finding was found.

Tabuľka 3:Table 3:

Výsledky histologického vyšetrenia normálneho a nádorového tkaniva: skupina 2 - placeboResults of histological examination of normal and tumor tissue: Group 2 - placebo

zviera Č. the animal No. tkanivá okrem pečene tissues other than liver pečeň liver hypofýza hypophysis ha r t, aorta, týmus ha r t, aorta, team plúca, tyro-, pankreas lung, tyro-, pancreas testes, prostata testes, prostate žalú- dok, kolón žalú- dock, columns slezina, kostná dreň spleen, bone marrow chvost, labka tail, paw Iadv. L/R nekróza » Iadv. L / R necrosis » preneopi. nodu1 y preneopi. nodu1 y ložiská bearings nekróza tumoru tumor necrosis 4 4 NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF tumor tumor 18 18 kare. kare. NF NF NF NF NF NF kare. kare. 0 0 MF MF Nie Not 19 19 adeno adeno NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF Nie Not 23 23 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF áno Yes MF MF + + 26 26 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF + + 34 34 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF Nie Not 39 39 N F N F NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF + + 44 44 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF tumor tumor 45 45 0 0 MF MF + + 46 46 N F? N F? NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF áno Yes MF MF Nie Not 50 50 NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF Nie Not 52 52 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 1mf 1mF + + 55 55 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF + + 59 59 NF NF NF NF NF NF MF MF Nie Not

Skratky: NF - výsledok histológie, normálny nálezAbbreviations: NF - result of histology, normal finding

MF - mnohopočetné ložisko nie - bez známok nekrózy * U niektorých zvierat bola vyšetrená labka ľavej prednej končatiny. Vo všetkých prípadoch bol zistený normálny nález.MF - multiple lesion no - no signs of necrosis * In some animals, the left paw was examined. In all cases a normal finding was found.

Tabuľka 4:Table 4:

Výsledky histologického vyšetrenia normálneho a nádorového tkaniva: skupina 3-85 mg/kg/deň zlúčeniny 2Results of histological examination of normal and tumor tissue: group 3-85 mg / kg / day of compound 2

zviera Č. the animal No. tkanivá okrem pečene tissues other than liver pečeň liver hypofýza hypophysis hart, aorta, týmus hart, aorta, team pluca, tyro-, pankreas pluca, tyro-, pancreas testes, prostata testes, prostate žalúdok, kolón stomach, column slezina, kostná dreň spleen, bone marrow chvost, labka tail, paw ladv. L/R nekróza * neighborhood. L / R necrosis * preneopl. noduly preneopl. nodules ložiská bearings nekróza tumoru tumor necrosis 5 5 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF + + 7 7 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF (+) (+) 13 13 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF áno Yes MF MF tumor tumor 14 14 NF NF NF NF áno Yes MF MF tumor tumor .15 .15 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF áno Yes MF MF + + 17 17 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF áno Yes MF MF tumor tumor .20 .20 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF kare. + kare. + 0 0 DFF DFF tumor tumor 29 29 OLIGL OLIGL NF NF 0 0 MF MF tumor tumor 30 30 NF NF GRANU grant NF NF NF NF 0 0 MF MF + + 32 32 NF NF NF . NF. NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF + + 37 37 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF tumor tumor 42 42 tumor tumor NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF ++ ++ 49 49 tumor tumor 53 53 NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF NF 0 0 MF MF + +

Skratky: NF - výsledok histológie, normálny nálezAbbreviations: NF - result of histology, normal finding

MF - mnohopočetné ložiskoMF - multiple bearing

DFF - difúzna ložisková zmenaDFF - diffusion bearing change

OLIGL - oligodendrogliómOLIGL - oligodendroglioma

GRANU - granulómy * Zviera č. 15 malo spinocelulárny karcinóm trachey. Bol cystický a v určitom rozsahu nekrotizoval mimo cystickej oblasti (+). Zviera č. 20 malo cystické degenerativne zmeny v pečeni.GRANU - Granulomas * Animal no. 15 had squamous cell carcinoma of the trachea. It was cystic and did not necrotize outside the cystic region (+) to some extent. Animal no. 20 had cystic degenerative changes in the liver.

Príklad 7Example 7

Efekt na metastázy kolorektálneho karcinómu do pečene holých myšiEffect on colorectal carcinoma metastases in liver of nude mice

Materiál a postupyMaterial and procedures

Použitá bunková línia C170HM2 je známa línia ľudského kolorektálneho karcinómu (S.A.Watson a kol., Eur. J. Cancer 29A (1993), 1740-1745) a pochádza pôvodne z primárneho nádoru pacienta. C170HM2 bunky sa kultivovali in vitro v RPMI 1640 kultivačnom médiu (Gibco, Paisley, UK) obsahujúcom 10% (obj./obj.) teplom inaktivované fetálne teľacie sérum (Sigma, Poole, UK) , pri 37 °C v 5% CO₂ a zvlhčenej atmosfére. Bunky zo semi-konfluentných monovrstiev sa získali pomocou 0,025% EDTA a boli dvakrát premyté vo vyššie opísanom kultivačnom médiu.The C170HM2 cell line used is a known human colorectal carcinoma line (SAWatson et al., Eur. J. Cancer 29A (1993), 1740-1745) and originates originally from the patient's primary tumor. C170HM2 cells were cultured in vitro in RPMI 1640 culture medium (Gibco, Paisley, UK) containing 10% (v / v) heat inactivated fetal calf serum (Sigma, Poole, UK) at 37 ° C in 5% CO ₂ and a humid atmosphere. Cells from semi-confluent monolayers were obtained with 0.025% EDTA and were washed twice in the culture medium described above.

C170HM2 bunky získané zo semi-konfluentných monovrstiev sa resuspendovali v koncentrácii lxl0⁶/ml v sterilnom, fosfátom pufrovanom salinickom roztoku, pH 7,4 (PBS)a injikovali sa v objeme 1 ml do peritoneálnej dutiny 20 MFI samcom holých myši (chovaných v Cancer Studies Unit na University of Nottingham). Myši boli identifikované elektronickým systémom (RS Biotech DL2000 Datalogger). Desiaty deň po injekcii buniek boli myši náhodne rozdelené do kontrolnej skupiny (placebo, n = 2 myši) a do pokusných skupín (n = 6/skupinu):C170HM2 cells obtained from semi-confluent monolayers were resuspended at 1x10 ⁶ / ml in sterile, phosphate buffered saline, pH 7.4 (PBS) and injected in a volume of 1 ml into the peritoneal cavity of 20 MFI male nude mice (Cancer-reared) Studies Unit at the University of Nottingham). Mice were identified by an electronic system (RS Biotech DL2000 Datalogger). On the 10th day after cell injection, mice were randomized into control group (placebo, n = 2 mice) and experimental groups (n = 6 / group):

Skupina 1: Group 1: Zlúčenina 1 Compound 1 5 30 90 5 30 90 mg/kg mg/kg mg/kg mg / kg mg / kg mg / kg (n = 2 (n = 2 (n = 2 (n = 2 (n = 2 (n = 2 myši) myši) myši) mouse) mouse) mouse) Skupina 2: Group 2: Zlúčenina 2 Compound 2 5 5 mg/kg mg / kg (n = 2 (n = 2 myši) mouse) 30 30 mg/kg mg / kg (n = 2 (n = 2 myši) mouse)

mg/kg (n = 2 myši)mg / kg (n = 2 mice)

Lieky boli aplikované intravenózne (i.v.) od desiateho dňa do ukončenia terapie. Pokus sa skončil 40. deň po implantácii buniek. Myši boli vážené v pravidelných intervaloch počas pilotnej štúdie.Drugs were administered intravenously (i.v.) from day 10 to discontinuation of therapy. The experiment was completed on day 40 after cell implantation. Mice were weighed at regular intervals during the pilot study.

Na konci testu sa odobrala pečeň a spočítali sa viditeľné nádory pečene a odmerali sa ich rezné plochy. Nádory sa aj vyfotografovali. Skvapalnenie nádorov nebolo pozorované a preto všetky nádory boli vyrezané z normálneho pečeňového tkaniva, odvážili sa a fixovali sa vo formaldehydovom salinickom roztoku. Peritoneálne uzly sa odobrali a odmerala sa ich rezná plocha a hmotnosť. Uskutočnilo sa podrobné patologické hodnotenie nádorov.At the end of the test, liver was harvested and visible liver tumors were counted and their incision areas measured. Tumors were also photographed. Tumor fluidization was not observed and therefore all tumors were excised from normal liver tissue, weighed and fixed in formaldehyde saline. Peritoneal nodes were removed and their cutting area and weight measured. A detailed pathological evaluation of tumors was performed.

Efekt zlúčenín 1 a 2 na pečeňovú inváziu ľudského kolorektálneho nádoru C170HM2 je uvedený na obr. 11.The effect of compounds 1 and 2 on liver invasion of human colorectal C170HM2 tumor is shown in FIG. 11th

Príklad 8Example 8

Nekrotizujúci účinok na bunky krysieho primárneho adenónu ľadvínNecrotizing effect on rat primary kidney adenone cells

V pokuse na nededičných krysích adenómoch ľadvín (Eker a Mossige, Náture 189 (1961), 858-859) bola zistená rozsiahla nekróza nádoru po desiatich dňoch i.v. injekcií 85 mg/kg telesnej hmotnosti zlúčeniny 2 u dvoch zvierat. U zvierat, ktorým bol aplikovaný salinický roztok, bola pozorovaná malá alebo žiadna nekróza.In a non-hereditary rat kidney adenoma experiment (Eker and Mossige, Nature 189 (1961), 858-859), extensive tumor necrosis was found after ten days i.v. injections of 85 mg / kg body weight of compound 2 in two animals. Little or no necrosis was observed in animals treated with saline.

Príklad 9Example 9

Biologické účinky zlúčenín 3 a 4 v porovnaní so zlúčeninami 1, 2a glukózouBiological effects of compounds 3 and 4 compared to compounds 1, 2a by glucose

Syntéza proteínovProtein synthesis

Obr. 12 znázorňuje rýchlosť syntézy proteínov v bunkách ľudského karcinómu krčka maternice, NHIK 3025, ako je meraná množstvom inkorporovaného [³H]-valinu počas pulzného obdobia 1 hodina, ktoré je zahájené bezprostredne po pridaní testovanej zlúčeniny (plné symboly) alebo o 2 hodiny neskôr (prázdne symboly). Testované zlúčeniny, zlúčenina 1 a zlúčenina 3, boli prítomné od času 0 do konca pulzov. Bunky boli vopred značkované [¹⁴C]-valínom počas 4 dní preto, aby boli všetky bunkové proteíny značkovacím činidlom. Inkorporované množstvo vztiahnuté na inkorporované množstvo [¹⁴C] tak, saturované [³H] bolo že syntéza proteínov bola vypočítaná ako percento z celkového množstva proteínu v bunkách. Rýchlosť syntézy proteínov je uvedená ako percento rýchlosti vzhľadom na neliečenú kontrolu. Graf pre syntézu proteínov predstavuje priemerné hodnoty zo 4 simultánne a podobne ošetrených jamiek. Štandardné odchýlky sú uvedené vertikálnymi stĺpcami vo všetkých prípadoch, kedy presiahli veľkosť symbolov. Dáta ukazujú, že zlúčenina indukuje inhibíciu syntézy proteínov, ktorá sa zvyšuje lineárne so zvyšujúcou sa koncentráciou lieku, zatiaľ čo pre zlúčeninu 3 bol pozorovaný slabý alebo žiadny efekt.Fig. 12 depicts protein synthesis rate in human cervical carcinoma cells, NHIK 3025, as measured by the amount of [ ³ H] -valine incorporated over a 1-hour pulse period that begins immediately after addition of test compound (solid symbols) or 2 hours later ( blank symbols). The test compounds, compound 1 and compound 3, were present from time 0 to the end of the pulses. Cells were pre-labeled with [ ¹⁴ C] -valine for 4 days to make all cell proteins a labeling reagent. The incorporated amount relative to the incorporated amount of [ ¹⁴ C] so saturated [ ³ H] was that protein synthesis was calculated as a percentage of the total amount of protein in the cells. Protein synthesis rate is given as a percentage of rate relative to untreated control. The protein synthesis graph represents the mean of the 4 wells treated similarly. Standard deviations are indicated by vertical bars whenever they exceed the symbol size. The data show that the compound induces an inhibition of protein synthesis that increases linearly with increasing drug concentration, while for compound 3 little or no effect was observed.

Obr. 13 znázorňuje rýchlosť syntézy proteínov v bunkách ľudského karcinómu krčka maternice, NHIK 3025, ako je meraná množstvom inkorporovaného [³H]-valinu počas pulzného obdobia 1 hodina, ktoré je zahájené bezprostredne po pridaní testovanej zlúčeniny (plné symboly) alebo o 2 hodiny neskôr (prázdne symboly). Testované zlúčeniny, zlúčenina 2 a zlúčenina 4, boli prítomné od času 0 do konca pulzov. Bunky boli vopred značkované [ ¹⁴C]-valínom počas 4 dni preto, aby boli všetky bunkové proteíny značkovacím činidlom. Inkorporované množstvo vztiahnuté na inkorporované množstvo [¹⁴C] Lak, saturované [^JH] bolo že syntéza proteínov bola vypočítaná ako percento z celkového množstva proteínu v bunkách. Rýchlosť syntézy proteínov je uvedená ako percento rýchlosti vzhľadom na neliečenú kontrolu. Graf pre syntézu proteínov predstavuje priemerné hodnoty zo 4 simultánne a podobne ošetrených jamiek. Štandardné odchýlky sú uvedené vertikálnymi stĺpcami vo všetkých prípadoch, kedy presiahli veľkosť symbolov. Dáta ukazujú, že zlúčenina 2 a zlúčenina 4 indukujú účinnú inhibíciu syntézy proteínov približne rovnakej úrovne pre obe zlúčeniny. Obidve tieto deuterizované zlúčeniny sú účinnejšie ako príslušné nedeuterizované zlúčeniny, ako je uvedené na obr. 12.Fig. 13 depicts protein synthesis rate in human cervical carcinoma cells, NHIK 3025, as measured by the amount of [ ³ H] -valine incorporated over a 1-hour pulse period that begins immediately after addition of test compound (solid symbols) or 2 hours later ( blank symbols). The test compounds, compound 2 and compound 4, were present from time 0 to the end of the pulses. Cells were pre-labeled with [ ¹⁴ C] -valine for 4 days to make all cellular proteins a labeling reagent. Incorporated relative to the amount of the incorporated amount of ^[14 C] Nail, saturated ^[lH] was that protein synthesis was calculated as a percentage of the total protein in the cells. Protein synthesis rate is given as a percentage of rate relative to untreated control. The protein synthesis graph represents the mean of the 4 wells treated similarly. Standard deviations are indicated by vertical bars whenever they exceed the symbol size. The data show that Compound 2 and Compound 4 induce effective inhibition of protein synthesis of approximately the same level for both compounds. Both of these deuterated compounds are more effective than the respective non-deuterated compounds as shown in FIG. 12th

Prežívanie buniekCell survival

Obr. 14 znázorňuje prežívanie buniek merané schopnosťou buniek maternice, tvoriť kolónie, pre ľudské bunky karcinómu krčkaFig. 14 depicts cell survival measured by the ability of uterine cells to form colonies for human cervical cancer cells

NHIK 3025, po 20 hodinovej liečbe zlúčeninou 1 (·) alebo otvorených inkubátoroch zlúčeninou 3 (o) . Bunky plastových Petriho miskách, pri teplote 37 °C.NHIK 3025, after 20 hours of treatment with Compound 1 (·) or open incubators with Compound 3 (o). Cells of plastic Petri dishes at 37 ° C.

priemerné hodnoty z misiek. Štandardné stĺpcami vo všetkých prípadoch, kedy kriviek dávka-odpoveď, ktoré rôzny tvar, zlúčenina 1 vaverage values from the dishes. Standard columns in all cases where dose-response curves that vary in shape, compound 1 in

Graf boli ošetrené v inkubovaných v CO2hodnôt prežívania a podobne uvedené simultánne odchýlky sú predstavuje ošetrených vertikálnymi velkosť symbolov. Z tieto dve zlúčeniny je účinnejšia ako nízkych koncentráciách ukazuje na v inaktivácii zlúčeniny.The graphs were treated in incubated CO 2 survival values, and likewise the simultaneous deviations are represented by the vertical symbol size. Of these two compounds is more potent than low concentrations indicates in the inactivation of the compound.

odlišný mechanizmus buniek.different mechanism of cells.

presiahli majú pre je zrejmé, že zlúčenina 3 inaktivácii buniek pri v tvare kriviekExceeding have shown that compound 3 inactivates cells in the shape of a curve

Rozdiel týchto dvoch zlúčenínThe difference of the two compounds

Obr. 15 znázorňuje prežívanie buniek merané schopnosťou buniek tvoriť kolónie, pre ľudské bunky karcinómu krčka maternice, NHIK 3025, po 20 hodinovej liečbe zlúčeninou 2 (o) alebo zlúčeninou 4 (A). Bunky boli ošetrené v otvorených plastových Petriho miskách, inkubovaných v C0₂Graf hodnôt prežívania a podobne uvedené inkubátoroch pri teplote 37 °C.Fig. 15 shows cell survival as measured by colony forming capacity, for human cervical cancer cells, NHIK 3025, after 20 hours of treatment with Compound 2 (o) or Compound 4 (A). Cells were treated in open plastic Petri dishes, incubated in a CO ₂ graph of survival values, and similar incubators at 37 ° C.

priemerné hodnoty z misiek. Štandardné stĺpcami vo všetkých 4 simultánne odchýlky sú prípadoch, kedy je v inaktivácii najmä pri znížené na presiahli buniek nízkych dávkach.average values from the dishes. Standard columns in all 4 simultaneous deviations are cases in which inactivation is particularly reduced to overcrowded cells at low doses.

% po ošetrení ukazuje na 84, v %% after treatment points to 84, in%

čo predstavuje ošetrených vertikálnymi veľkosť symbolov. Zlúčenina účinnejšia ako zlúčenina 2, Napríklad prežívanie buniek jerepresenting the vertical symbol sizes treated. Compound more potent than compound 2, For example, cell survival is

0,5 mM zlúčeniny 4 a 4 mM zlúčeniny 2, násobne vyššiu aktivačnú činnosť zlúčeniny so zlúčeninou 2 na tejto úrovni efektu. Pri je tento rozdiel oveľa menší.0.5mM of compound 4 and 4mM of compound 2, the fold activating activity of compound with compound 2 at this level of effect. When this difference is much smaller.

porovnaní prežívanícomparison of survival

Obr. 16 znázorňuje prežívanie buniek merané schopnosťou buniek tvoriť kolónie, pre ľudské bunky karcinómu prsníka, Τ4^Ί-ΰ, po 20 hodinovej liečbe L-glukózou (·) alebo zlúčeninou 3 (o) . Bunky boli ošetrené v otvorených plastových Petriho miskách, inkubovaných v C02-inkubátoroch pri teplote 37 °C. Graf hodnôt prežívania predstavuje priemerné hodnoty z 5 simultánne a podobne ošetrených misiek. Štandardné odchýlky sú uvedené vertikálnymi stĺpcami vo všetkých prípadoch, kedy presiahli veľkosť symbolov. Dáta ukazujú, že L-glukóza má slabý alebo žiaden vplyv na prežívanie pri koncentráciách až do 10 mM, čo bola najvyššia testovaná dávka. Zlúčenina 3 má tiež slabý efekt na tieto bunky pri koncentrácii do 2 mM, ale indukuje významný inaktivačný efekt pre vyššie koncentrácie a len 1 z 1000 buniek prežíva 20 hodín za prítomnosti 8 mM tejto zlúčeniny.Fig. 16 shows cell survival as measured by colony forming capacity, for human breast cancer cells, Τ4 ^Ί -ΰ, after 20 hours of treatment with L-glucose (·) or compound 3 (o). Cells were treated in open plastic Petri dishes incubated in CO 2 incubators at 37 ° C. The survival value graph represents the average of 5 simultaneous and similarly treated plates. Standard deviations are indicated by vertical bars whenever they exceed the symbol size. The data show that L-glucose has little or no effect on survival at concentrations up to 10 mM, which was the highest dose tested. Compound 3 also has a weak effect on these cells at concentrations up to 2 mM, but induces a significant inactivation effect for higher concentrations and only 1 in 1000 cells survives for 20 hours in the presence of 8 mM of this compound.

Záverconclusion

Obidva testované deriváty L-glukopyranózy (zlúčenina 6 a 4) inaktivujú bunky s vyššou účinnosťou ako príslušné deriváty D-glukopyranózy (zlúčenina 1 a 2). Avšak L-glukóza samotná neindukuje žiadnu, štatisticky významnú inaktiváciu buniek pri tu použitých koncentráciách. Tým je pre benzylidénové deriváty zaistený lepší účinok L-glukózy, v porovnaní s D-glukózou.Both L-glucopyranose derivatives (compounds 6 and 4) tested inactivate cells with higher efficacy than the corresponding D-glucopyranose derivatives (compounds 1 and 2). However, L-glucose alone does not induce any statistically significant cell inactivation at the concentrations used herein. This provides a better effect of L-glucose for benzylidene derivatives compared to D-glucose.

Podaniefiling

Farmaceutické kompozície podlá vynálezu možno podávať na liečbu nádorov.The pharmaceutical compositions of the invention may be administered for the treatment of tumors.

Pre vyššie uvedený účel možno zlúčeniny podľa vynálezu podávať pacientovi v akejkoľvek vhodnej forme, buď samotné alebo v zmesi s farmaceutický prijateľnými nosičmi alebo adjuvans.For the above purpose, the compounds of the invention may be administered to the patient in any suitable form, either alone or in admixture with pharmaceutically acceptable carriers or adjuvants.

Mimoriadne vhodné sú prípravky pre systémovú terapiu buď vo forme prípravkov na orálne podanie alebo parenterálne podanie.Especially suitable are formulations for systemic therapy either in the form of preparations for oral administration or parenteral administration.

Vhodné prípravky na enterálne podanie zahŕňajú tablety, kapsuly, napríklad mäkké alebo tvrdé želatínové kapsuly, granuly, granulované prášky alebo prášky, sirupy, suspenzie, roztoky alebo čapiky. Uvedené liekové formy sa pripravia v odbore známymi spôsobmi zmiešaním jednej alebo viacerých zlúčenín podľa vynálezu s jedným alebo viacerými netoxickými, inertnými, tuhými alebo tekutými nosičmi.Suitable preparations for enteral administration include tablets, capsules, for example soft or hard gelatin capsules, granules, granular powders or powders, syrups, suspensions, solutions or suppositories. Said dosage forms are prepared by methods known in the art by admixing one or more compounds of the invention with one or more non-toxic, inert, solid or liquid carriers.

Vhodné prípravky na parenterálne podanie, obsahujúce zlúčeniny podľa vynálezu, zahŕňajú injekčné alebo infúzne roztoky.Suitable formulations for parenteral administration comprising the compounds of the invention include injectable or infusion solutions.

Pri topickom podaní možno zlúčeniny všeobecného vzorca (I) podávať vo forme roztoku, masti, krému, gélu, tinktúry, spreja alebo podobného prípravku, kde uvedené prípravky obsahujú zlúčeniny všeobecného vzorca (I) v zmesi s netoxickými, inertnými, tuhými alebo tekutými nosičmi, obvykle používanými pre topické prípravky. Mimoriadne vhodné je použitie prípravku, v ktorom je účinná zložka chránená proti vzduchu, vode a podobne.For topical administration, the compounds of formula (I) may be administered in the form of a solution, ointment, cream, gel, elixir, spray or the like, wherein said formulations comprise compounds of formula (I) in admixture with nontoxic, inert, solid or liquid carriers. commonly used for topical formulations. It is particularly suitable to use a formulation in which the active ingredient is protected from air, water and the like.

Uvedené prípravky môžu obsahovať inertné alebo farmakodynamicky aktívne prísady. Tablety alebo granuly môžu napríklad obsahovať rôzne spojivá, plnivá, nosiče a/alebo riedidlá. Tekuté prípravky môžu byť napríklad vo forme sterilného roztoku. Tobolky môžu obsahovať okrem aktívnej zložky aj plnivo alebo zahusťovaci prostriedok. Ďalej možno použiť aditíva na zlepšenie chuti a vône a taktiež prísady obvykle používané ako konzervačné prostriedky, stabilizačné prostriedky, prostriedky na zachytenie vlhkosti a emulgátory, soli na ovplyvnenie osmotického tlaku, pufry a ďalšie aditíva.Said preparations may contain inert or pharmacodynamically active ingredients. For example, tablets or granules may contain various binders, fillers, carriers and / or diluents. For example, the liquid preparations may be in the form of a sterile solution. The capsules may contain, in addition to the active ingredient, a filler or a thickening agent. Furthermore, flavor enhancers and additives commonly used as preservatives, stabilizers, moisture scavengers and emulsifiers, salts for affecting the osmotic pressure, buffers and other additives can be used.

Dávky prípravky určené na podanie môžu kolísať v závislosti od indikácie, spôsobu použitia a spôsobu podania a taktiež od požiadaviek pacienta. Obvyklá denná dávka pre systémovú terapiu priemerného dospelého pacienta je asi 0,01-500 mg/kg telesnej hmotnosti, podávaná raz alebo dvakrát denne, výhodne je asi 0,05-100 mg/kg telesnej hmotnosti, podávaná raz alebo dvakrát denne a najvýhodnejšie je asi 1,0-20,0 mg/kg telesnej hmotnosti, podávaná raz alebo dvakrát denne.Dosages of the formulations to be administered may vary depending on the indication, mode of use and route of administration, as well as the requirements of the patient. The usual daily dose for systemic therapy of an average adult patient is about 0.01-500 mg / kg body weight, administered once or twice daily, preferably about 0.05-100 mg / kg body weight, administered once or twice daily, and most preferably is about 1.0-20.0 mg / kg body weight, administered once or twice daily.

Ak je to žiaduce, môže liečivý prípravok obsahujúci zlúčeninu všeobecného vzorca (I) obsahovať antioxidačný prostriedok, napr. tokoferol, N-metyl-tokoferamín, butylhydroxyanizol, kyselinu askorbovú alebo butylhydrozytoluén.If desired, the medicament containing the compound of formula (I) may contain an antioxidant, e.g. tocopherol, N-methyl-tocopheramine, butylhydroxyanisole, ascorbic acid or butylhydrozytoluene.

?? W-ôl?? W-OL

Claims (16)

1. Použitie 4,6-0-(benzylidén-di)-D-glukopyranózy, 4,6O-benzylidén-L-glukopyranózy a/alebo 4,6-0-(benzylidéndi)-L-glukopyranózy alebo jej farmaceutický prijateľné soli na prípravu liečivého prostriedku na prevenciu a/alebo liečbu nádoru pečene, nádoru ľadvín a nádoru pankreasu.Use of 4,6-O- (benzylidene-di) -D-glucopyranose, 4,6-O-benzylidene-L-glucopyranose and / or 4,6-O- (benzylidene) -L-glucopyranose or a pharmaceutically acceptable salt thereof for preparing a medicament for the prevention and / or treatment of liver tumor, kidney tumor and pancreatic tumor. 2. Použitie podľa nároku 1 na prípravu liečivého prostriedku na preventívnu liečbu nádorov indukovaných vírusmi, ako sú vírusy hepatitídy B a C, onkogénne papilómové vírusy a ďalšie onkogénne vírusy.Use according to claim 1 for the preparation of a medicament for the preventive treatment of tumors induced by viruses, such as hepatitis B and C viruses, oncogenic papilloma viruses and other oncogenic viruses. 3. Derivát benzaldehydu vhodný jako liečivý prostriedok, kde uvedeným derivátom benzaldehydu je 4,6-0-(benzylidén)L-glukopyranóza a/alebo 4,6-0-(benzylidén-di)-L-glukopyranóza alebo jej farmaceutický prijateľná sol.A benzaldehyde derivative suitable as a medicament, wherein said benzaldehyde derivative is 4,6-O- (benzylidene) L-glucopyranose and / or 4,6-O- (benzylidene-di) -L-glucopyranose or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 4.4th Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje derivát z predchádzajúcich benzaldehydu podlá ktoréhokoľvek nárokov a farmaceutický prijateľný nosič, riedidlo a/alebo prísadu.A pharmaceutical composition comprising a benzaldehyde derivative according to any one of the preceding claims and a pharmaceutically acceptable carrier, diluent and / or excipient. 5. Spôsob prípravy farmaceutickej kompozície, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa stupeň spojenia derivátu benzaldehydu podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov s farmaceutický prijateľným nosičom, riedidlom a/alebo prísadou.A process for the preparation of a pharmaceutical composition comprising the step of combining a benzaldehyde derivative according to any preceding claim with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent and / or excipient. zmenený listchanged letter 6. Derivát benzaldehydu, ktorým je 4,6-0-benzylidén-Lglukopyranóza, 4 , 6-0-(benzylidén-di)-L-glukopyra-nóza alebo jej farmaceutický prijateľná soľ.A benzaldehyde derivative which is 4,6-O-benzylidene-L-glucopyranose, 4,6-O- (benzylidene-di) -L-glucopyranose or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 1/16 prežívajúce frakcie1/16 surviving fractions O 0.2 0.4 O.G 0.8 1 1.2 1.4 1.G 1.8 2 tukaresol, 20hO 0.2 0.4 O.G 0.8 1 1.2 1.4 1.G 1.8 2 tukaresol, 20h Δ- zlúčenina 2, 20h koncentrácia (mM)Zlúčenina- compound 2, 20h concentration (mM) Obr. 1 ?/>Fig. 1? /> 2/16 syntéza proteínu (vzhľadom na kontrolu) koncentrácia (mM) tukaresol zlúčenina 22/16 protein synthesis (relative to control) concentration (mM) tukaresol compound 2 Obr. 2Fig. 2 3/16 syntéza proteínu (vzhladom na kontrolu) koncentrácia (mM)3/16 protein synthesis (relative to control) concentration (mM) -H- zlúčenina 2 -A- zilaskorb(²H)-H- compound 2 -A- zilaskorb ( ² H) Obr. 3Fig. 3 4/164/16 7/ 11 í f -(17/11 f - (1 0 1 2 3 4 5 6 7 hodiny0 1 2 3 4 5 6 7 hours Obr. 4 //> ////7/Fig. 7 //> //// 7 / 5/165/16 5 E o o o s E o o LO ó o νΟ ó5 E o o s E o o LO o o o Ο σ> σ> CO WHAT CO WHAT m xr m xr n n CJ CJ V* IN* o about V IN X- X- x— x- T~ T ~ T“ ▼ T “▼ v* in* r— r- 93ISIJ 93ISIJ X f.| X f. | CXl CXL lAJdO Lajda JQ Ul O JQ Ul <0 c •r4 <0 c • r4 X X c C BA BA < Ό ' <Ό ' U) U) úče UCE CD CD •H N • H N i—1 M i — 1 M E x— O o ó koncentrácia liečivaE x - o 0 o drug concentration 6/16 ?Ρ f K Η] (Stu) Áuizsjs iisoujolui] UBipatu6/16? K f K Η] (Stu) uuizsjs iisoujolui] UBipatu (N (N m m kP kPa nj nj .Q .Q • • c -H c -H >u o > u o M M C (U C (U H >_q H> _q Λ Λ >u > u O ABOUT i—1 i-1 N N 7/16 // /W φ c φ >ο φ a7/16 // / W φ c φ> ο φ a 100 ο100 ο Ρ ηΡ η Φ π υ Λί φ Μ ΉΦ π υ Λί φ Μ Ή CXJ CXJ X Ν X Ν Ο X) Ο X) <ϋ <ϋ ω ω c C Χ> Χ> ω ω •Η • Η Μ Μ ro ro c φ c φ Ο >ί Ί> ί ο_ ο_ >υ > υ ω ω ·□ · □ m m >—ι > -ι γΗ γΗ Ν Ν Η Ν Η Ν Obr .7Fig. 7 8/168/16 Obr. 8Fig. 8 9/16 stredná telesná hmotnosť (g)9/16 mean body weight (g) Obr. 9Fig. 9 10/16 ?P fW'(/ veľkosť tumoru (cm³)10/16 µP fW '(/ tumor size (cm ³ ) Obr.10Figure 10 11/16 stredná hodnota plochy priečneho rezu tumoru pečene (mm²) skupina11/16 mean cross-sectional area of liver tumor (mm ² ) group Obr.11Figure 11 12/1612/16 TP rýchlosť syntézy proteínu (% kontroly) zlúčenina 1, 0-1 h zlúčenina 1, 2-3 h zlúčenina 3, 0-1 h zlúčenina 3, 2-3 h koncentrácia (mM)TP protein synthesis rate (% control) compound 1, 0-1 h compound 1, 2-3 h compound 3, 0-1 h compound 3, 2-3 h concentration (mM) Obr.12Figure 12 13/16 rýchlosť syntézy proteínu (% kontroly) zlúčenina 2, zlúčenina 2, zlúčenina 4, zlúčenina 4,13/16 protein synthesis rate (% of control) compound 2, compound 2, compound 4, compound 4, 0-1 h0-1 h 3-4 h3-4 h 0-1 h0-1 h 3-4 h koncentrácia (mM)3-4 h concentration (mM) Obr.13Figure 13 14/16 zlúčenina 1, 20 h zlúčenina 3, 20 h prežívajúce frakcie14/16 compound 1, 20 h compound 3, 20 h surviving fractions Obr.14Figure 14 15/16 prežívajúce frakcie zlúčenina 2, 20 h zlúčenina 4, 20 h15/16 surviving fractions compound 2, 20 h compound 4, 20 h Obr.15Figure 15 16/16 prežívajúce frakcie .-glukóza, 20 h zlúčenina 3, 20 h16/16 surviving fractions.-Glucose, 20 h compound 3, 20 h