SK108894A3 - Sialyltransferases and isolated dna fraction coding sialyltransferases - Google Patents

Description

Sialyltransferázy a izolované DNA frakcie kódujúce sialyltransferázy

Táto prihláška vynálezu nadväzuje na prihlášku číslo 07/850,357, ktorá bola podaná 9. marca 1992.

Oblast techniky fc

Predložený vynález sa týka skupiny génov sialyltransferá*- zy, skupiny glykozyltransferáz, ktoré spôsobujú terminálnu sialyláciu glycidových skupín glykoproteínov, glykolipidov a oligosacharidov a ktoré obsahujú konzervatívnu oblasť homológie v katalytickej doméne. Do skupiny génov sialyltransferáz patria Galpl,3GalNac a2,3 sialyltransferáza a Gali,3(4)GlcNAc a2,3 sialyltransferáza.

Vynález sa ďalej týka nových foriem a ich zmesí a zvlášť spôsobov a metód identifikácie a prípravy členov skupiny génov sialyltransferázy v značných, použiteľných množstvách. Tento vynález sa tiež týka prípravy izolovaného kódu deoxyribonukleovej kyseliny (DNA) pre prípravu sialyltransferáz; spôsobu získavania molekúl DNA, ktoré kódujú sialyltransferázy,· expresie sialyltransferáz ľudí a cicavcov, ktoré využívajú takúto DNA, ako aj nových zlúčenín, zahrňujúcich nové nukleové kyseliny kódujúce sialyltransferázy alebo ich fragmenty. Tento vynález je tiež zameraný na deriváty sia. lyltransferázy, zvlášť na deriváty, ktorým chýba cytoplazmajfc ¹ ' tická alebo transmembránová časť proteínu alebo obe časti, a na ich prípravu rekombinantnými DNA technikami.

Doterajší stav techniky

Sialyltransferázy sú skupinou enzýmov, ktoré katalyzujú prenos kyseliny sialovej (SA) na terminálnu čast glycidových skupín glykolipidov a oligosacharidov vo všeobecnej reakcii:

Cytididín-5-monofosfát-kyselina sialová (CMP-SA) +

HO—akceptor —> CMP + SA—O—akceptor (Beyer, T.A. a kol., Adv. Enzymol. 52, 23-175 (1981)).

Sialyltransferázy sa nachádzajú hlavne v Golgiho aparáte buniek, kde sa zúčastňujú v posttranslačnýeh glykozylačných cestách. (Fleischer, B.J., Celí Biol. 89 , 246-255 (1981)). Nachádzajú sa tiež v telesných tekutinách, ako je materské mlieko, kolostrum a krv. Pre syntézu všetkých známych sialyloligosacharidových sekvencii je potrebných najmenej 10-12 rozličných sialyltransferáz. Každá z nich by sa mala líšit enzymatícky svojou špecificitou pre sekvenciu oligosacharidov akceptora a anomérnou väzbou, ktorá vzniká medzi kyselinou sialovou a cukrom, ku ktorému je viazaná. Štyri sialyltransf erázy sa už izolovali. (Beyer a kol. cit vyššie; Weinstein, J. a kol., J. Biol. Chem. 257, 13835-13844 (1982); Miagi, T. a Tsuiki, S. Eur. J. Biochem. 125, 253-261 (1982); a Joziasse, D. H. a kol., J. Biol. Chem. 260, 4941-4951 (1985)). Menovite,

Gaipi, 4GlcNAc ct2-6—sialyltransferáza a

Gaipi,3(4)GlcNAc a2-3-sialyltransferáza boli pripravené z membrán krysej pečene (Weinstein a kol. cit. vyššie).

Ďalšie glykozyltransferázy, ktoré sa izolovali ako rozpustné enzýmy v sére, mlieku alebo v kolostre, zahrnujú sialyl-, fukozyl-, galaktozyl-, N-acetylglukózaminyl- a N-acetylgalaktózaminyltransferázy (Beyer a kol. cit. vyššie). Izolovala sa aj hovädzia a ľudská p-N-acetylglukózamid-fll, 4-galaktozyltransferáza (Narimatsu, H. a kol., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 83., 4720-4724 (1986)); Shaper, N. L. a kol., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 83, 1573-1577 (1986); Appert,

H.E. a kol., Biochem. Biophys. Res. Common. 139. 163-168 (1986); a Humpreys-Beyer, M. G. a kol., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 83 , 8918-8922 (1986)). Tieto izolované glykozyltransferázy sa líšia veľkosťou, čo môže byt spôsobené odstránením častí proteínu, ktoré nie sú významné z hľadiska jeho aktivity, ako sú domény premostujúce membrány.

Z porovnanie sekvencii aminokyselín odvodených z klonov cDNA, ktoré kódujú glykozyltransferázy, ako sú galaktozyltransferázy, sialyltransferáza, fukozyltransferáza a N-acetylgalaktózaminyl-transferáza, vyplýva, že tieto enzýmy nemajú prakticky žiadnu sekvenčnú homológiu. Určitý pohlad na to, aké štruktúrne vzťahy sú v tejto skupine glykozyltransferáz, dáva nedávna analýza primárnych štruktúr klonovaných sialyltransferáz (Weinstein, J. a kol., cit. vyššie). Tieto však všetky majú krátke NH₂-terminálne cytoplazmické ukončenie, doménu na zakotvenie signálu zo 16-20 aminokyselín a rozsiahlu kmeňovú čast, za ktorou nasleduje veľká katalytická doména s COOH-koncom (Weinstein, J. a kol., J. Biol. Chem. 262, 17735-17743 (1987); Paulson, J.C. a kol., J. Biol. Chem. 264, 17615-17618 (1989)). Domény na zakotvenie signálu fungujú ako neštiepiteľné signálne peptidy a ako oblasti premostujúce membrány a orientujú katalytické domény týchto glykozyltransferáz v dutinách Golgiho aparátu. V rámci skupín glykozyltransferáz, ktoré majú podobné akceptorné aleoo donorné substráty, by sa dali očakávať rovnaké sekvencie aminokyselín; v katalytických oblastiach glykozyltransferáz sa však našlo prekvapujúco málo oblastí homológie a nenašla sa ani žiadna významná oblast sekvenčnej homológie s inými proteínmi v GenBanke (Shaper, N.L. a kol., J. Biol. Chem. 216. 10420-10428 (1988), D'Agostaso, G. a kol., Eur.

183. 211-217 (1989) a Weinstein, J. a kol·., J.

263, 17735-17743 (1987)). Je to zvlášť prekvapujúce pre Gal al,3-GT a GlcNAc P1,4-GT, dve galaktozyltransferázy. Kým však tieto galaktozyltransferázy nevykazujú žiadnu celkovú homológiu, majú bežný hexapeptid KDKKND v Gal al,3-GT (hovädzia, 304-309) a RDKKNE v GlcNAc pi,4-GT (hovädzia, ľudská, myšia, aminokyseliny 346-351) (Joziasse a kol., J. Biol. Chem. 264, 14290-14297 (1989)).

J. Biochem. Biol. Chem.

Sialové kyseliny sú terminálne cukry na glycidových skupinách, ktoré sa nachádzajú na glykoproteínoch a glykolipidoch a sú značne rozšírené v živočíšnych tkanivách (Momol, T. a kol., J.Biol. Chem. 261, 16270-16273 (1986)). Sialové kyseliny hrajú významnú úlohu v biologických funkciách glycido4 vých štruktúr vďaka ich terminálnej polohe. Kyselina sialová napríklad vystupuje ako ligand pre naviazanie chrípkového vírusu na hostiteľskú bunku (Paulson, J.C., The Receptors (Receptory), zv. 2, red. P.M. Conn, s. 131-21.9, Academic Press (1985)). Už len zmena vo väzbe kyseliny sialovej postačuje na zmenu hostiteľskej špecificity (Roger, G.N. a kol., Náture 304, 76-78 (1983)). Adhezívna molekula neurónovej bunky (NCAM) podlieha vývojovo regulovanej polysialylácii, o ktorej sa predpokladá, že ovplyvňuje adhéziu buniek prostredníctvom NCAM počas vývoja nervového systému (Rutishauer, U. a kol., Science 240. 53-37 (1988) a Rutishauer, U., Adv. Exp. Med. Biol. 265, 179-180 (1990)). Nedávno sa zistilo, že glycidová štruktúra sialyl lewis X (SLe^x) pôsobí ako ligand pre adhézne molekuly leukocytov endotelu (E-Selektín), ktorý sprostredkuje väzbu neutrofilov na aktivované bunky endotelu (Lowe a kol., 1990; Phillips a kol., 1990; Goelz a kôl., 1990; Walz a kol., 1990; Brandley a kol., 1990). Pre P-selektín (granula aktivovaná doštičkami k vonkajším proteinom membrán; CD62), ďalší prvok skupiny selektínov (Stoolman, L.M. , Celí 56, 907-910 (1989)) sa tiež ukázalo, že rozpoznáva SLe* prítomnú v monocytoch a v PMN (Larsen a kol.,

USA 87, 6674-6678 (1990); Momol a kol

oc. NAtl.	Ac.ad.	Sci .
J. Biol.	Chem.	261.
Natl. Acad	. Sci.	USA
J. Biol.	Chem.	263 .
. Eňzymol.	52 , 23	-175

88, 6224-6228 (1991); Chán, K.F.J.,

568-574 (1988); Beyer, T.A. a kol., Ad’ (1981)). V oboch prípadoch je kyselina sialová kľúčovou zložkou glycidovej štruktúry k tomu, aby fungovala ako ligand. Glycidovým štruktúram obsahujúcim kyselinu sialovú sa popri ich úlohe pri adhézii buniek prisudzuje i bezprostredný účinok na diferenciáciu. Hematopoetická bunková línia HL-60 sa môže indukovať k diferenciácii pôsobením glykolipidu G_M3. Predpokladá sa, že gangliozidy hrajú úlohu pri ovplyvňovaní účinkov rastového faktora - proteínkinázy a pri riadení bunkového cyklu.

Ako je opísané v Patente USA č. 5,047,335, jedna takáto sialyltransferáza bola izolovaná. Aj keď sa získali určité množstvá prečistenej” sialyltransferázy, sú dostupné vo veľmi malých množstvách, a to sčasti preto, že ide o proteiny viazané na membránach endoplazmatického retikula a Golgiho aparátu. Značné ekonomické náklady a prácnosť izolácie týchto sialyltransferáz ich zaraďujú medzi ťažko dostupné materiály. Predmetom tohto vynálezu je izolácia sialyltransferázy kódovanej DNA a príprava použiteľných množstiev sialyltransferázy cicavcov, zvlášť ľudí, s použitím rekoinbinantných DNA techník. Ďalej sú predmetom tohto vynálezu spôsoby získania ďalších prvkov génovej skupiny sialyltransferáz, kódovaných DNA, z rozličných tkanív, ako aj z iných organizmov. Ďalším predmetom tohto vynálezu je príprava nových foriem sialyltransferáz. Ešte ďalším predmetom vynálezu je získanie dokonalejších prostriedkov pre katalýzu prenosu kyseliny sialovej do terminálnych polôh určitých glycidových skupín. Tieto a ďalšie predmety vynálezu sa ozrejmia z celkovej špecifikácie.

Podstata vynálezu

Objekty tohto vynálezu sa realizovali spôsobom, ktorý zahrňuje: identifikáciu klonujúcich génov, ktoré kódujú sialyltransferázy cicavcov (definované nižšie) a zahrňujú, bez obmedzenia sa iba na tieto, bravčovú Gal01,3GalNAc ct2,3 sialyltransferázu a krysiu Gäl(3l, 3 ( 4 )GlcNAc a2,3 sialyltransf erázu (odlišnú od krysej Gaipi,4GlcNAc a2,6 sialyltransferázy); zabudovanie tohto génu do rekombinantného DNA vektora; transformáciu vhodného hostiteľa vektorom s týmto génom; expresiu génov sialyltransferázy cicavcov v týchto hostiteľoch; a získanie sialyltransferázy cicavcov, ktorá sa takto pripraví. Pre dosiahnutie expresie sialyltransferázy sa môže použiť množstvo iných rekombinantných techník. Tento vynález umožňuje pripraviť sialyltransferázu cicavcov alebo aj jej deriváty rekombinantnou technikou a zároveň poskytuje prostriedky pre prípravu takýchto sialyltransferáz. Sialyltransferázy sú proteínmi so zriedkavým výskytom a ťažko sa izolujú. Izolácia a identi6 fikácia génov sialyltransferáz bola mimoriadne ťažká. mRNA bola ťažko dostupná a bunkové línie alebo iné zdroje väčších množstiev mRNA boli nedostupné. Tento vynález po prvýkrát vymedzil skupinu génov sialyltransferázy definovanú konzervatívnou oblasťou homológie v katalytickej doméne enzýmov.

Tento vynález sa týka látok a metód pre prípravu sialyltransf erázy cicavcov rekombinantnou DNA technológiou, ktorá zahrňuje: 1) nájdenie a identifikáciu úplnej DNA sekvencie enzýmov a ich 5'-bočnéj oblasti; 2) konštrukciu klonujúceho a expresného nosiča, ktorý zahrňuje uvedenú sekvenciu DNA, umožňujúcu expresiu proteínu sialyltransferázy cicavcov, ako aj ich spojenie alebo konjugácie signálnych N-koncov; a 3) živé bunkové kultúry alebo iné geneticky zmenené expresné systémy s nosičmi, ktoré sú schopné produkovať sialyltransferázu cicavcov. Tento vynález sa ďalej týka látok a spôsobov prípravy DNA, ktorá kóduje bunkovú tvorbu sialyltransferázy cicavcov. Ešte ďalším aspektom tohto vynálezu sú nové zlúčeniny zahrňujúce deoxyribonukleotidy a ribonukleotidy, ktoré sa využívajú pri príprave klonov umožňujúcich expresiu sialyltransf erázy . Ešte .iným aspektom tohto vynálezu je sialyltransferáza v zásade zbavená všetkých prirodzene sa vyskytujúcich látok, s ktorými sa bežne nachádza v krvi alebo v tkanivách, t.j. sialyltransferáza pripravená rekombinantnými. prostriedkami nebude obsahovať tie nečistoty, ktoré sa normálne nachádzajú v jej živom fyziologickom prostredí. Navyše, v závislosti od použitej metódy prípravy môže na takejto sialyltransferáze prebehnúť aj glykozylácia do väčšej alebo menšej miery v porovnaní s materiálom získaným z jeho fyziologického prostredia, t.j. z krvi alebo tkanív. Tento vynález sa ďalej týka nových derivátov sialyltransferázy, zvlášť derivátov, ktorým chýbajú sialyltransferázové zvyšky s terminálnou amino skupinou, napr. deriváty bez krátkej NH₂ cytoplazmatickej domény alebo bez hydrofóbnej N-terminálnej sekvencie na zakotvenie signálu, ktorá tvorí transmembránovú doménu sialyltransferázy a kmeňovú čast.

JÝ. ÁíX’-itf ίώλ j '·.·:.·'Γ

Sialyltransferáza cicavcov a jej deriváty podľa tohto vynálezu je použiteľná pri adícii kyselín sialových na glycidové skupiny, ktoré sa nachádzajú v glykoproteínoch a glykolipidoch. Sialyltransferáza a jej deriváty sú navyše použiteľné enzymaticky tak, že pripájajú kyselinu sialovú na reťazce cukrov za vzniku glycidov, ktoré pôsobia ako determinujúce členy pri biologickom rozpoznaní. Takéto enzýmy sialyltransferázy sa môžu využiť v multienzýmových systémoch pre syntézu oligosacharidov a ich derivátov (Ichikawa a kol., J. Am. Chem. Soc. 113, 4698 (1991) a Ichikawa a kol., J. Am. Chem. Soc. 113, 6300 (1991)). A nakoniec, DNA, zvlášť konzervatívna oblasť homológie katalytických domén, ktorá kóduje skupinu génov sialyltransferázy, je použiteľná ako prostriedok pri klonovaní génu kódujúceho ďalšie členy skupiny génov sialyltransferázy. Iné použitie sialyltransferázy a DNA kódujúcej sialyltransferázu je zrejmé pre pracovníkov so skúsenosťami v tejto oblasti.

Prehľad obrázkov

Obrázok 1. Sekvencia nukleotidov a aminokyselín bravčovej

Gal01,3GalNAc a2,3 sialyltransferázy (a2,3-O). Sekvencia nukleotidov bravčovej a2,3-O mRNA sa určila DNA sekvenčnou analýzou dvoch prekrývajúcich sa klonov J1ST1 a TST2. Predpokladané aminokyseliny polypeptidu vané od prvého zvyšku N-konca analogického izolovaného proteínu. Rámčekom je vyznačená navrhnutá sekvencia na zakotvenie signálu. Potenciálne miesta pre glykozyláciu v sekvencii Asn-X-Thr sú vyznačené hviezdičkou (*). Sekvencia odpovedá dlhej forme a2,3 sialyltransferázy zakódovanej prekrývajúcimi sa klonmi ^STl a ^ST2.

Obrázok 2. Sekvencia nukleotidov a aminokyselín krysej

Gal|3l, 3 (4 )GlcNAc α2,3-sialyltransferázy (a2,3-N). Sekvencia nukleotidov krysej «2,3-N mRNA sa určila DNA sekvenčnou analýzou. Predpokladané aminokyseliny polypeptidu sialyltransferázy sú uvedené nad sekvenciou DNA a sú číslované od prvého zvyšku konečného proteínu, ako sa určilo sekvenovaním N-terminálneho proteínu.

Obrázok 3. Čistenie a2,3-O sialyltransferázy na CDP-hexanolamínovej agaróze (eluovanie KC1). Dva kilogramy zhomogenizovanej bravčovej pečene sa prenieslo na stĺpec CDP-hexa* nolamínovej agarózy a eluovalo sa s lineárnym gradientom KCl (viď Experimentálne postupy). Pre jednotlivé frakcie * sa stanovovala koncentrácia proteínu a aktivita sialyltransferázy s použitím laktózy ako akceptorného substrátu. Ako je vyznačené, dva piky aktivity enzýmu sa separovali na vzorku A a B.

Obrázok 4. Čistenie a2,3-O sialyltransferázy na CDP-hexanolamínovej agaróze (stĺpec III, eluovanie CDP). Aktivity enzýmu sa stanovili pomocou špecifického akceptorného substrátu nemrznúceho glykoproteínu (AFGP). Eluovanie enzýmovej aktivity v stĺpcoch A a B odpovedalo predovšetkým proteínom s 48 kDa, resp. 45 kDa (viď vložený výrez, SDS-PAGE). Tieto dve látky, A forma a B forma α2,3 sialyltransferázy, mali špecifické aktivity 8-10 jednotiek/mg proteínu. Tieto 48 kDA a 45 kDA látky sa naniesli na membránu PVDF a analyzovali sa NH₂-terminálnym sekvenovaním .

Obrázok 5. NH₂-terminálne sekvencie aminokyselín 48 kDa a 45 kDa peptidov a2,3-O sialyltransferázy. Podčiarknutých je <·· hydrofóbnych aminokyselín v blízkosti NH₂-konca 48 kDa peptidu, ktoré predstavujú predpokladanú doménu na zakotvenie signálu.

Obrázok 6. Reštrikčná mapa a stratégia sekvenovania v dvoch cDNA klonoch ot2,3-0 sialyltransferázy.

Obrázok 7. Porovnanie štruktúr domén a oblastí homológie dvoch sialyltransferáz. A: Porovnaním primárnych sekvencial α2,6 sialyltransferázy a a2,3-O sialyltransferázy sa našla oblasť. 45 aminokyselín so 64% sekvenčnou identitou a 84% sekvenčnou podobnosťou. B: Homologická doména premostuje spojenie medzi exonmi 2 a 3 a2,6 sialyltransferázy a leží vo vnútri katalytických domén oboch enzýmov.

_ŕ. Obrázok 8. Expresia rozpustnej, katalytický aktívnej a2,3-O sialyltransferázy. A: cDNA, ktorá riadi expresiu • rozpustnej formy a2,3-O sialyltransferázy, sp-ST, sa vytvorila výmenou cytoplazmatickej domény divokého typu sialyltransferázy a domény na zakotvenie signálu za inzulínový signálny peptid; predpokladá sa, že sp-ST kóduje 38 kDa vylučovaný proteín, keď sa prenesie do hostiteľských buniek. B: sp-ST sa zaviedla do expresného vektora pSVL a preniesla sa do buniek COS-1; 48 (hodín) po transfekcii boli bunky pulzovo značené po dobu 2 hodín v prostredí obsahujúcom Tran35S^-label; za tým nasledovala 5 hodinová preháňacia perióda v prostredí bez značkovača. Toto prostredie sa izolovalo, 15-krát skoncentrovalo a analyzovalo sa SDS-PAGĽ/fluorografiou. Analyzovali sa dvojice vzoriek sp-ST a bunkových prostredí s iini tovanou transfekciou. C: Urobila sa transfekcia buniek COS-1 s lipofektínom (+ sp-ST) alebo lipofektínom samotným (imitácia) ako 7B; 48 hodín po transfekcii sa prostredie odobralo, 15-krát skoncentrovalo a zisťovala sa sia² lyltransferázová aktivita so špecifickým akoeptorným substrátom AFGP (Sadler, J.E. a kol. J. Biol. Chem. 254, 4434-4443 (1979)).

Obrázok 9. Spektrum CID tryptického peptidu s nétjdlhšou sekvenciou z enzýmu Gal a2,3-N sialyltransferázy. Sekvencia peptidu je Leu-Thr-Pro-A-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-His-Cys*-Arg, MH⁺=1283,6. Cys znamená karboxymetylcysteín. Ióny s retenciou náboja pri Nkonci sú označené ako ióny a, b, c a ióny s C-koncom sú označené ako fragmenty x, y a z (Biemann, K., Meth. Enzymol.

ŕ.

193. 886-887 (1990)). Prvé ióny (a,x) vznikajú štiepením medzi a uhlíkom a karbonylovou skupinou. Ióny y a b vznikajú, keď sa štiepi peptidová väzba. Prítomnosť iónov c a z je spôsobená štiepením medzi aminoskupinou a a uhlíkom. Číslovanie týchto fragmentov sa vždy začína pri príslušnom konci. K fragmentácii bočného reťazca dochádza medzi0 a y uhlíkmi aminokyselín za vzniku takzvaných d (N-terminálnych) a w (C-terminálnch) iónov. Pozorované fragmentové ióny sú uvedené v tabuľke. V jednotlivých riadkoch sú uvedené ióny patriace do tej istej série.

Obrázok 10. Spektrum CID karbamylovaného tryptického peptidu z enzýmu Gal a2,3-N sialyltransferázy. Sekvencia peptidu je Leu-Asn-Ser-Ala-Pro-Val-Lys, MH^f- 771,4. Fragmentácia jasne poukazuje na modifikáciu pri N-konci a nie pri e-aminoskupine lyzínového zvyšku. Intenzívny ión pri m/z 669 (w7) potvrdzuje prítomnosť N-terminálneho leucínu v tomto peptide. Ióny označené hviezdičkou sú pozadím súvisiacim s matricou (Falick a kol., Rapid Commun. Mass Spectrom.

318 (1990)). Pozorované fragmenty sú uvedené v tabuľke. V jednotlivých riadkoch sú uvedené ióny patriace do tej istej série.

Obrázok 11. Porovnanie Peptidov 1 a 11 odvodených z Gal01,3(4) GlcNAc α2,3-sialyltransferázy (ST3N) so sialyltransf erázami klonovanými predtým. Gal.01,4GlcNAc α2,6-sialyltransferáza (ST6N) a Gal01,3GalNAc a2,3-sialyltransferáza (ST3O) sú znázornené ako prúžky. Obdí žnik ohraničený plnou čiarou označuje sekvenciu na zakotvenie signálu. Šrafovaný obdĺžnik označuje oblasť homológie, ktorá sa našla medzi týmito dvomi sialyltransferázami.

Obrázok 12. Konzervovaná oblasť spoločná trom klonovaným sialyltransf erázam. Tri klonované sialyltransferázy sú krysia Gal01,3(4)GlcNAc bravčová Gal0l,3GalNAc krysia Gal01,4GlcNAc «2,3-sialyltransferáza (ST3N), a?., 3-sialyltrarisferáza (ST3O) a «2,6-sialyltransferáza (ST6N).

'.ť,v .‘.'Ζίώ k.:<·.♦ t·-ί

- 11 Oblast pozostáva z 55 aminokyselín od zvyšku 156 po zvyšok 210 Gaipi,3(4JGlcNAc α2,3-sialyltransferázy (ST3N). Zhodujúce sa aminokyseliny sú vyznačené rámčekmi.

Obrázok 13. Predpokladaná sekvencia aminokyselín v amplifikovanom fragmente SMI a porovnanie s predtým charakterizovanou konzervatívnou oblasťou homológie. Z porovnania konzervatívnej oblasti homológie klonovanej a charakterizovanej sialyltransferázy a amplifikovaného fragmentu SMI sa získala spoločná konzervatívna oblast homológie. Invariantné aminokyseliny sú vyznačené velkými písmenami, kým aminokyseliny prítomné vo viac ako 50% konzervatívnej oblasti homológie sú uvedené ma 1ými písmenami. Polohy, v ktorých sa nachádza r alebo q, sú označené b; polohy, v ktorých je i alebo v, sú označené x. Podčiarknuté aminokyseliny označujú oblasti, ktoré sa použili pri vytvorení degenerovaných primérov. Zmeny v predtým invariantných aminokyselinách, ktoré sa našli v amplifikovanom fragmente, sú označené hviezdičkami.

Obrázok 14. Sekvencia nukleotidov a predpokladaná sekvencia aminokyselín v STX1. Predpokladaná sekvencia aminokyselín najdlhšieho otvoreného čítacieho rámca kóduje konzervatívnu oblast homológie SMI (aminokyseliny 154-208); vyznačená je tieňovaným obdĺžnikom. Predpokladaná sekvencia na zakotvenie signálu (aminokyseliny 8-23) je v rámčeku a potenciálne miesta pre glykozyláciu cez N-väzbu sú podčiarknuté.

Podstata vynálezu

Tu uvádzaná sialyltransferáza alebo deriváty sialyltransferázy označujú iné sialyltransferázové enzýmy ako je krysia Gaipi,4GlcNAc a2,6 sialyltransferáza, ktoré obsahujú konzervatívnu oblast homológie v katalytickej doméne a sú enzymaticky aktívne pri prenose kyseliny sialovej na térmi12 nálne polohy cukrových reťazcov glykoproteínov, glykolipidov, oligósacharidov a pod. Príkladmi enzymaticky pôsobiacich sialyltransferáz sú tie, ktoré sú schopné prenosu kyseliny sialovej z CMP-kyseliny sialovej na akceptorný oligosacharid, pričom tento akceptor sa mení v závislosti od konkrétnej sialyltransferázy .

Pod konzervatívnou oblasťou homológie sa rozumie séria aminokyselín v jednej sialyltransferáze, ktorá je v zásade identická s takou istou sériou aminokyselín v inom sialyltransf erázovom enzýme, keď sa sekvencie týchto dvoch enzýmov porovnajú, v skupine sialyltransferázových génov podľa tohto vynálezu konzervatívna oblasť homológie je v katalytickej doméne a zasahuje cez najmenej 7 za sebou idúcich aminokyselín, výhodne cez najmenej 20 aminokyselín a najvýhodnejšie cez najmenej 55 aminokyselín, ktoré majú sekvenciu aminokyselinových zvyškov 156-210 na obr. 2 alebo zvyškov 142-196 na obr. 1. Ked máme identifikovanú konzervatívnu oblasť homológie, môžu sa urobiť varianty sekvencie aminokyselín konzervatívnej oblasti a zaradia sa do jednej alebo niekoľkých z týchto troch tried: substitučné, inzerčné alebo delečné varianty. Tieto varianty sa normálne pripravujú lokálne-špecifickou mutagenézou nukleotidov v DNA kódujúcej sialyltransferázu, čím sa pripraví DNA kódujúca sialyltransf erázu s variantom konzervovanej oblasti homológie.

Medzi sialyltransferázy sa tiež zahrňuje napríklad krysia Gal(3l, 3 ( 4 ) GlcNAc a2,3 sialyltransf eráza (tu označovaná ako a2,3-N), ktorá tvorí sekvencie NeuNAca2,3Gal01,3GlcNAc a NeuAcaž , 3Gal|3l, 4GlcNAc , ktoré často ukončujú zložité oligosacharidy s N-väzbou. Iným príkladom enzýmu, ktorý patrí k sialyltransferázam, je bravčová Gaipi,3GalNAc a2,3 sialyltransf eráza (tu označovaná ako ct2,3-O), ktorá vytvára NeuAca2,3Gal01,3GalNAc nachádzajúci sa na cukrových reťazcoch viazaných O-väzbou na treonín alebo serín, alebo ako terminálna sekvencia na určitých gangliozidoch.

- 13 Medzi sialyltransferázy v tom zmysle, ako sa tento termín tu používa, patrí sialyltransferáza s natívnou glykozyláciou a amino sekvencie krysej a bravčovej sialyltransferázy, ako sú uvedené na obr. 1 alebo 2, analogická sialyltransferáza z iných živočíšnych druhov, ako napr. hovädzia, ludská a pod., a taktiež z iných tkanív, deglykozylované a neglykozylované deriváty takýchto sialyltransferáz, varianty sekvencie aminokyselín sialyltransferázy a kovalentné deriváty sialyltransf eráz vytvorené in vitro. Všetky tieto formy sialyltransf erázy obsahujú konzervatívnu oblast homológie a sú enzymaticky aktívne alebo, ak nie sú aktívne, sú nositeľmi najmenej jedného imunitného epitopu spoločného s enzymaticky aktívnou sialyltransferázou.

Varianty sekvencie aminokyselín sialyltransferázy sa zaraďujú do jednej alebo niekoľkých z týchto troch tried: substitučné, inzerčné a delečné varianty. Tieto varianty sa normálne pripravujú lokálne špecifickou mutagenézou nukleotidov v DNA kódujúcej sialyltransferázu, čím vzniká DNA kódujúca variant, a následnou expresiou DNA v rekombinantnej bunkovej kultúre. Variantné fragmenty sialyltransferázy, ktoré majú až asi 100-150 zvyškov, sa môžu pohodlne pripraviť pomocou syntézy in vitro. Varianty sekvencie aminokyselín sú charakterizované vopred stanovenou povahou variácie, vlastnosťou, ktorá ich odlišuje od prirodzene sa vyskytujúcich alelických alebo medzidruhových variácii sekvencií aminokyselín sialyltransferázy. Tieto varianty v konzervatívnej oblasti homológie sa typicky vyznačujú kvalitatívne rovnakou biologickou aktivitou ako prirodzene sa vyskytujúci analóg.

Kým miesto pre zavedenie variácie sekvencie aminokyselín je vopred určené, samotná mutácia nemusí byt vopred určená. Napríklad pre optimalizáciu účinnosti mutácie na danom mieste sa môže náhodná mutagenéza viest na cieľový kodón alebo cieľovú oblast a expresie variantov sialyltransferázy sa môžu triediť z hľadiska optimálnej kombinácie požadovaných aktivít. Metódy na vykonanie substitučných mutácií na vopred určenom mieste v DNA so známou sekvenciou sú dobre známe, napríklad mutagenéza priméru Ml3 alebo mutagenéza založená na PCR.

Substitúcie aminokyselín sú typicky substitúciami jednotlivých zvyškov; pri inzercii ide približne o 1 až 10 aminokyselinových zvyškov; pri eliminácii ide asi o 1 až 30 zvyškov. Inzercie a eliminácie sa robia výhodne v susediacich pároch, t.j. eliminácia 2 zvyškov alebo inzercia 2 zvyškov. Substitúcie, inzercie a eliminácie alebo ich ľubovoľné kombinácie sa môžu kombinovať tak, aby sa dospelo ku konečnej konštrukcii. Je zrejmé, že mutácia, ktorá sa má urobiť v DNA kódujúcej variant sialyltransferázy, nesmie umiestniť sekvenciu mimo čítací rámec a je výhodné, ak nevytvorí ďalšie oblasti, ktoré by mohli vytvárať sekundárne štruktúry mRNA (EP 75,444A). Substitučné varianty sú tie, v ktorých najmenej jeden zvyšok v sekvenciách na obr. 1 alebo 2 sa odsoránil a iný zvyšok sa vložil na jeho miesto. Takéto substitúcie sa všeobecne robia v súhlase s nasledujúcou Tabuľkou 1 v prípade, že je potrebné jemne doladiť vlastnosti sialyltransferázy.

Tabuľka 1

Pôvodný zvyšok Príklad substitúcie

Ala	ser
Arg	lys
Asn	gin; his
Asp	glu
Cys	ser
Gin	asn
Glu	asp
Gly	pro
His	asn; gin
íle	leu; val
Leu	ile; val
Lys	arg; gin; i
Met	leu; ile
Phe	met; leu;
Ser	thr
Thr	ser
Trp	tyr
Tyr	trp; phe
Val	ile; leu

Podstatné zmeny vo funkcii a imunologickej identite sa vyvolajú selektívnymi substitúciami, ktoré sú menej konzervatívne ako substitúcie podľa Tabuľky 1, t.j. voľbou zvyškov, ktoré sa významnejšie líšia svojím vplyvom na zachovanie (a) štruktúry polypeptidového reťazca v oblasti substitúcie, napríklad v listovej alebo špirálovej konformácii, (b) náboja alebo hydrofóbnosti molekuly v cieľovom mieste alebo (c) objemu bočného reťazca. Substitúcie, pri ktorých sa všeobecne očakáva, že vyvolajú najväčšie zmeny vo vlastnostiach sialyltransf erázy , sú tie, pri ktorých (a) hydrofilný zvyšok, napr. seryl alebo treonyl, sa nahradí hydrofóbnym zvyškom, napr. leucylom, izoleucylom, fenylalanylom, valylom alebo alanylom, alebo naopak; (b) cysteín alebo prolín sa nahradí iným zvyškom alebo naopak; (c) zvyšok s elektropozitívnym bočným reťazcom, napr. lyzyl, arginyl alebo histidyl sa nahradí elektronegatívnym zvyškom, ako jie glutamyl alebo aspartyl, alebo naopak; alebo (d) zvyšok, ktorý má objemnú bočnú skupinu, napr. fenylalanín, sa nahradí zvyškom, ktorý nemá bočnú skupinu, napr. glycín, alebo naopak.

Velkú skupinu variantov vzniknutých substitúciou alebo elimináciou tvoria také varianty, ktoré zahrňujú transmembránovú alebo aj cytoplazmatickú oblast sialyltransferázy. Cytoplazmatická doména sialyltransferázy je sekvencia aminokyselinových zvyškov, ktorá má začiatok pri štartovacích kodónoch uvedených na obr. 1 a 2 a pokračuje približne 11 ďalších zvyškov. Predpokladá sa, že v krysích a v bravčových sialyltransferázach zvyšky 10-28, resp. 12 až 27 slúžia ako stop transfer sekvencia. Konformačné oblúky zavedené zvyškami Phe-Val-Arg-Asn a Pro-Met-Arg-Lys-Lys-Ser-Thr-Leu-Lys pre krysiu, resp. bravčovú sialyltransferázu a elektropozitívny charakter týchto zvyškov, spolu s transmeinbránovou oblasťou popísanou nižšie, zabraňujú prechodu sialyltransferázy cez bunkovú membránu.

Transmembránová oblast sialyltransferázy je lokalizovaná v bravčovej sekvencii okolo zvyškov 12-27 (kde Ala je +1 v obr. 2) a v krysej sekvencii na analogickom mieste. Táto oblast je silne hydrofóbnou doménou a má vhodnú veíkost na premostenie lipidovej dvojvrstvy bunkovej membrány. Predpokladá sa, že spolu s cytoplazmatickými doménami pôsobí tak, že zakotvuje sialyltransferázu v Golgiho aparáte alebo endoplazmatickom retikule.

Vynechanie alebo substitúcia cytoplazmatickej alebo transmembránovej domény alebo oboch ul'ahčí získanie rekombinantnej sialyltransferázy znížením jej afinity k bunkovým alebo membránovým lipidom a zvýšením jej rozpustnosti vo vode, takže k udržaniu sialyltransferázy vo vodnom roztoku nie sú potrebné detergenty. (Viď napr. U. S. Patent č. 5,032,519 popisujúci prípravu rozpustnej β-galaktozid a2,G-sialyltransferázy, ktorý sa tu uvádza ako literárny odkaz). Vynechanie samotnej cytoplazmatickej domény pri zachovaní transmembránovej sekvencie vedie k sialyltransferáze, ktorú by bolo treba rozpúšťať s detergentom. Sialyltransferáza s vynechanou cytoplazmatickou doménou by sa ľahšie zavádzala ’· do membrán, čím by sa umožnilo zamerať jej enzymatickú aktivitu. Cytoplazmatické a transmembránové domény je '.ýhodnejšie vylučovať ako substituovať (napríklad aminokyseliny 1-33 v krysej a2,3-N sialyltransferáze pre stop transfer sekvenciu na prípravu rozpustnej sialyltransferázy).

Cytoplazmaticky alebo aj transmembránovo (C-T) deletované alebo substituované sialyltransferázy sa môžu syntetizovať priamo v rekombinantnej bunkovej kultúre alebo spojením so signálnou sekvenciou, výhodne s hostiteľsko-homologickým signálom. Napríklad pri konštrukcii prokaryotického expresného vektora sa C-T domény vylúčia v prospech bakteriálnej alkalickej fosfatázy, lpp alebo tepelne stabilných lídrov enterotoxínu II, a pre kvasinky sa domény substituujú kvasinkovou invertázou, alfa faktorom alebo lídrami kyslej fosfatázy. V bunkách cicavcov sa expresia C-T domén nahradí virálnym sekrečným lídrom buniek cicavcov, napríklad gD signálom herpesu simplex. Keď hostite! rozpozná sekrečný líder, signálna peptidáza hostiteľa je schopná rozštiepiť väzbu polypeptidu lídra pripojeného pri jeho C-konci na C-T elimi. novanú sialyltransferázu. Výhodou C-T eliminovanej siai lyltransferázy je, že sa môže vylučovať do prostredia kultú! ry. Tento variant je rozpustný vo vode a nemá významnú afinitu k lipidom bunkových membrán, čím sa značne zjednodušuje i jeho získanie z rekombinantnej bunkovej kultúry.

i í

i Prídavok detergentu, ako je neiónový detergent, by sa mohol využit na rozpustenie, stabilizáciu a prípadne aj zvýšeS j nie biologickej aktivity proteínov, ktoré obsahujú sekvenciu | pre zakotvenie na membráne. Výhodným detergentom je napríklad ΐ

kyselina deoxycholová a môžu sa použiť aj Tween, NP-40 a Triton X-100, ako aj iné detergenty. Voíba detergentu závisí na úvahe odborníka a od konkrétnych podmienok a povahy polypeptidu(ov), ktorého(ých) sa to týka.

Mutagenéza substitúciou alebo elimináciou sa využíva pre vylúčenie glykozylačných miest s väzbou na N alebo 0. Prípadne sa pripraví v rekombinantnéj prokaryotickej bunkovej kultúre neglykozylovaná sialyltransferáza. Môže sa požadovať aj eliminácia cysteínu alebo iných labilných zvyškov, napríklad pre zvýšenie oxidačnej stability sialyltransferázy. Eliminácie alebo substitúcie potenciálnych miest proteolýzy, napr. dibázických zvyškov, ako je Arg Arg, sä dosiahne elimináciou jedného z bázických zvyškov alebo substitúciou jedného z nich za glutaminylový alebo histidylový zvyšok.

Varianty sekvencií aminokyselín sialyltransferázy vzniknuté inzerciou sú také, v ktorých jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov sa zavedie na vopred určené miesto v cielovej sialyltransferáze. Častejšie sa inzerčné varianty vytvárajú pripojením heterológnych proteínov alebo polypeptidov k amínovému alebo karboxylovému koncu sialyltransferázy.

DNA kódujúca sialyltransferázu sa získa z iných zdrojov a) získaním banky cDNA z rozličných tkanív, ako je pečeň alebo slinné žlazy príslušného zvieraťa, b) prevedením hybridizačnej analýzy so značenou DNA, ktorá kóduje konzervatívnu oblast homológie sialyltransferázy alebo jej fragmenty (obvykle väčšie ako 30bp), aby sa detegovali klony v banke cDNA obsahujúce homologické sekvencie a c) analýzou týchto klonov reštrikčnou enzýmovou analýzou a sekvenovaním nukleových kyselín na identifikáciu klonov s plnou dĺžkou. Ak klony s plnou dĺžkou sa nenachádzajú v banke, potom sa môžu získať vhodné fragmenty z rozličných klonov a spojiť na miestach reštrikcie spoločných pre klony, aby sa zostavil kloň s plnou dĺžkou.

- 19 »

Výraz v zásade zbavený (čoho) alebo v zásade čistý, ktorý sa používa na popísanie stavu sialyltransferázy vyrobenej podlá tohto vynálezu, znamená, že je zbavená proteínov alebo iných materiálov, ktoré sú pridružené k sialyltransferáze v jej prirodzene sa vyskytujúcom fyziologickom prostredí in vivo, napríklad keď sa sialyltransferáza získa z krvi alebo z tkanív extrakciou a čistením. Čistota sialyltransferázy vyrobenej metódou podľa tohto vynálezu bola vyššia alebo rovná 95% na celkovú hmotnosť proteínu; dávala jeden saturovaný pás (pri Coomasieho modrom farbení) na polyakrylamidovej gélovej elektroforéze a mala špecifickú aktivitu najmenej asi 500 nmol/mg proteínu/min.

Tu používané výrazy podstatná podobnosť: alebo podstatná identita označujú vlastnosť polypeptidovej sekvencie alebo sekvencie nukleových kyselín, v ktorej polypeptidová sekvencia mala najmenej 70% sekvenčnú identitu v porovnaní s referenčnou sekvenciou a sekvencia nukleových kyselín mala najmenej 80% sekvenčnú identitu v porovnaní s referenčnou sekvenciou. Percentá sekvenčnej identity sa počítali vylúčením malých eliminácií alebo prídavkov, ktoré dohromady tvorili menej než 35 percent referenčnej sekvencie. Referenčná sekvencia môže byt častou väčšej sekvencie, napríklad takých, ako sú na obr. 1 a 2; referenčná sekvencia je však dlhá najmenej 18 nukleotidov v prípade polynukleotidov a má najmenej 6 aminokyselinových zvyškov v prípade polypeptidov .

Vo všeobecnosti sa na klonovanie DNA sekvencií pri konštrukcii vektorov použiteľných v tomto vynáleze používajú prokaryoty. Napríklad E. coli K12 kmeň 294 (ATCC č. 31446) je obzvlášť výhodný. Ďalšie použitelné mikrobiálne kmene zahrňujú E. coli B a E. coli X1776 (ATCC č. 31537). Tieto príklady slúžia na ilustráciu a nie sú ohraničujúce.

Prokaryoty sa tiež používajú pre expresiu. Môžu sa použiť vyššie uvedené kmene alebo tiež E. coli W3110 (F' , proi

- 20 >

totrofný, ATTC č. 27325), bacily, ako sú Bacillus subtllus a iné enterobaktérie, ako sú Salmonella typhimurium alebo Serratia marcescans. a rozličné druhy pseudomonas.

Vektory plazmidov, ktoré obsahujú promótory a riadiace sekvencie odvodené z látok kompatibilných s hostiteľskými bunkami, sa vo všeobecnosti používajú u týchto hostiteľov. Vektor obyčajne nesie replikačné miesto, ako aj značkovacie sekvencie, ktoré sú schopné vykonať fenotypovú selekciu v transformovaných bunkách. Napríklad E. coli sa typicky transformuje pri použití pBR322, plazmidu pripraveného z druhu E. coli (Bolivar a kol., Gene 2_, 95 (1977)). pBR322 obsahuje gény pre ampicilínovú a tetracyklínovú rezistenciu, a tak poskytuje jednoduchý prostriedok pre identifikáciu transformovaných buniek. Plazmid pBR322 alebo iný mikrobiálny plazmid musí tiež obsahovat alebo musí byt modifikovaný tak, aby obsahoval promótory a iné riadiace elementy, ktoré sa bežne používajú pri rekombinantnéj konštrukcii DNA.

Medzi promótory vhodné pre použitie s prokaryotickými hostiteľmi patria napríklad β-laktamázové a laktózové promótorové systémy (Chang a kol., Náture 275. 615 (1976); a Goeddel a kol., Náture 281, 544 (1979)), alkalická fosfatáza, tryptofánový promótorový systém (Goeddel, D., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980)) a hybridné promótory, ako je tac promótor (de Boer, H., PNAS (USA) 80, 21-25 (1983)). Aj iné funkčné bakteriálne promótory sú vhodné. Ich Sekvencia nukleotidov je všeobecne známa, čo umožňuje odborníkovi funkčne ich pripojiť na DNA kódujúcu sialyltransferázu (Siebenlist a kol., Celí 2 (1980)) s pomocou linkerov alebo adaptorov, aby sa dosiahlo ľubovoľné požadované miesto reštrikcie. Promótory pre použitie v bakteriálnych systémoch budú tiež obsahovat Shine-Dalgarnovu (S.D.) sekvenciu funkčne pripojenú na DNA kódujúcu sialyltransferázu.

Okrem prokaryotov sa môžu použiť aj eukaryotické mikróby, ako sú kvasinkové kultúry. Saccharomyces cerevisiae alebo bežné pekárske kvasinky sú najbežnejšie používanými eukaryotickými mikroorganizmami, aj keď je k dispozícii velký počet iných kmeňov. Pre expresiu v Saccharomyces sa napríklad bežne používa plazmid YRp7 (Stinchomb a kol., Náture 282, 39 (1979); Kingsman a kol., Gene 7, 141 (1979); Tschemper a kol., Gene 10, 157 (1980)). Tento plazmid už obsahuje gén trpí, ktorý poskytuje selekčný značkovač pre mutantný kmeň kvasiniek, ktoré nemajú schopnost rast v tryptofáne, napríklad ATCC č. 44076 alebo PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)). Prítomnosť lézie trpí ako charakteristiky bunkového genómu hostiteľských kvasiniek tak poskytuje účinné prostredie pre detekciu transformácie rastom v neprítomnosti tryptofánu .

Vhodné promótorove sekvencie pre použitie s kvasinkovými hostiteľmi zahrňujú promótory pre 3-fosfoglycerátkinázu (Hitzeman a kol., J. Biol. Chem. 255 2073 (1980)) alebo iné glykolytické enzýmy (Hess a kol., J. Adv. Enzýme Reg. 7, 149 (1968); a Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), ako sú enoláza, glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza, hexokináza, pyruvátdecarboxyláza , fosfofruktokináza, glukóza-6-fosfát izomeráza, 3-fosfoglycerátmutáza, pyruvátkináza, triosefosfát izomeráza, fosfoglukózo izomeráza a glukokináza.

Iné kvasinkové promótory, ktoré sú inducibilnými promótormi, navyše s výhodou transkripcie, riadenej rastovými podmienkami, sú promótorové oblasti pre alkoholdehydrogenázu 2, izocytochróm C, kyslú fosfatázu, degradatívne enzýmy spojené s metabolizmom dusíka, metalotioneín, glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu a enzýmy zodpovedné za využitie maltózy a galaktózy. Vhodné vektory a promótory pre použitie v kvasinkovej expresii sú ďalej popísané v: R. Hitzeman a kol., Európska patentová publikácia č. 73,657A. Kvasinkové enhancery sa tiež s výhodou používajú s kvasinkovými promótormi .

Riadiaca oblast označuje špecifickú sekvenciu pri .j..;,:;

koncoch 5' a 3' eukaryotických génov, ktorá môže pôsobiť pri riadení buď transkripcie alebo translácie. Prakticky všetky eukaryotické gény majú oblast bohatú na AT lokalizovanú približne 25 až 30 báz nahor (protiprúdne) voči miestu, kde začína transkripcia. Iná sekvencia nachádzajúca sa 70 až 80 báz nahor od začiatku transkripcie mnohých génov je oblast CXCAAT, v ktorej X môže byt ľubovoľný nukleotid. Pri konci 3' väčšiny eukaryotických génov je sekvencia AATAAA, ktorá môže byt signálom pre adíciu poly A ukončenia k 3¹ koncu prepisovanej mRNA.

Výhodné promótory, ktoré riadia transkripciu z vektora v hostiteľských bunkách cicavcov, sa môžu získat z rozličných zdrojov, napríklad genómy vírusov, ako sú: polyoma, Simian Vírus 40 (SV40), adenovírus, retrovírusy, vírus β-hepatitídy a najvýhodnejšie cytomegalovírus, alebo z heterológnych promótorov cicavcov, napr. promótor beta aktín. Skoršie a neskoršie promótory vírusu SV40 sa pohodlne získajú ako reštrikčný fragment SV40, ktorý tiež obsahuje SV40 virálny zdroj replikácie (Fiers a kol., Náture 273, 113 (1978)). Bezprostredný skorý promótor ľudského cytomegalovín?.su sa pohodlne získa ako reštrikčný fragment HindlII E (Greenaway,

P.L. a kol., Gene 18 , 355-360 (1982)). Pochopiteľne, promótory z hostiteľských buniek alebo z príbuzných druhov sú tu tiež užitočné.

Transkripcia DNA kódujúcej enkefalinázu vyššími eukaryotmi sa zvyšuje inzerciou sekvencie enhancera do vektoru. Enhancery sú cis-pôsobiace elementy DNA, obyčajne asi od 10-300 bp, ktoré pôsobia na promótor, aby zvýšil svoju transkripciu. Enhancery sú orientačne a pozične pomerne nezávislé a nachádzajú sa v polohe 5' (Laimins, L. a kol., PNAS 28, 993 (1981)) a 3' (Lusky, M.L. a kol., Mol. Celí Bio. 3, 1108 (1983)) voči transkripčnej jednotke, v introne (Banerji, J. L. a kol., Celí 22, 729 (1983)) , ako aj v samotnej kódujúcej sekvencií (Osborne, T. F. a kol., Mol. Celí Bio. 4, 1293 (1984)). Mnohé sekvencie enhancerov sú teraz známe z gé23

nov cicavcov (globín, elastáza, albumín, a-fetoproteín a inzulín). Bežne však sa môže použiť enhancer z vírusu eukaryotickej bunky. Príkladmi sú SV40 enhancer na neskorej strane replikačného zdroja (bp 100-270), enhancer cytomegalovírusového skorého promótora, enhancer polyoma na neskorej strane replikačného zdroja a enhancery adenovírusu.

Expresný vektor, ktorý sa používa v eukaryotických hostiteľských bunkách (bunky kvasiniek, húb, hmyzu, rastlín, živočíchov, ľudí alebo nukleované bunky z iných viacbunkových organizmov) budú tiež obsahovať sekvencie potrebné pre termináciu transkripcie, ktorá môže ovplyvniť expresiu mRNA. Tieto oblasti sa prepisujú ako polyadenylované segmenty v neprenesenom úseku mRNA kódujúcej sialyltransferázu. Neprenesené 3' oblasti tiež zahrňujú transkripčné terminačné miesta.

Expresné vektory môžu obsahovať selekčný gén, tiež nazývaný selektova teľný značkovač. Príkladmi, selektovateľných značkovačov pre bunky cicavcov sú dihydrofolát reduktáza (DHFR), ornitíndekarboxyláza, biochemické značkovače rezistentné voči viacerým liečivám, adenozíndeamináza, asparagínsyntetáza, glutamínsyntetáza, tymidínkináza alebo neimycín. Keď sa takéto selektovateľné značkovače prenesú do hostiteľských buniek cicavcov, transformovaná hostiteľská bunka môže prežiť pod selektívnym tlakom. Existujú dve samostatné kategórie selektívnych režimov, ktoré sa bežne používajú. Prvá kategória je založená na metabolizme bunky a na použití mutantnej bunkovej línie, ktorá nemá schopnosť rásť nezávisle od použitého média. Dvomi príkladmi sú bunky CHO DHFR a myšie bunky LTK. Tieto bunky nemajú schopnosť rásť bez prídavkov takých živín, ako sú tymidín a hypoxantín. Pretože tieto bunky nemajú určité gény potrebné pre úplnú nukleotidovú syntézu, nemôžu prežívať, kým sa im neposkytne v použitom médiu chýbajúca čast reťaze nukleotidovej syntézy. Inou možnosťou ako použiť vhodné médium je zavedenie intaktného génu DHFR alebo TK do buniek, ktoré nemajú príslušné gény, a tým zmeniť ich rastové požiadavky. Jednotlivé bunky, ktoré sa

- 24 netransformovali génom DHFR alebo TK, nebudú schopné prežit v neobohatenom médiu.

hostispôsoDruhou kategóriou je dominantná selekcia označujúca selekčnú schému používanú v lubovolných druhoch buniek a nevyžadujúca použitie mutantnej bunkovej línie. Tieto schémy bežne používajú určitú drogu na zastavenie rastu telských buniek. Tieto bunky, ktoré majú nový gén, by bovali expresiu proteínu prenášajúceho drogovú rezistenciu a prežívali by selekciu. Príkladmi takéhoto použitia dominantnej selekcie je aplikácia liečiv neomycínu (Southern, P. a Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. i, 327 (1982)), kyseliny mykofenolovej (Mulligan, R. C. a Berg, P., Science 209, 1422 (1980)) alebo hygromycínu (Sugden, B. a kol., Mol. Celí Biol. 5, 410-413 (1985)). Tieto tri uvedené príklady využívajú bakteriálne gény pod eukaryotickou kontrolou na prenesenie rezistencie na príslušné liečivo G418 alebo neomycín (genticín), xgpt (kyselinu mykofenolovú), resp. na hygromycín.

Amplifikácia označuje zväčšenie alebo replikáciu izolovanej oblasti v chromozómovej DNA bunky. Amplifikácia sa dosiahne použitím selekčného činidla, napr. metotrexátu (MTX), ktorý inaktivuje DHFR. Dôsledkom amplifikácie alebo akumulácie viacnásobných kópií génu DHFR sú väčšie množstvá vyprodukovanej DHFR v prítomnosti väčších množstiev MTX. Amplifikačný tlak sa vyvoláva, bez ohľadu na prítomnosť endogénnej DHFR, prídavkom ešte väčších množstiev MTX do prostredia. Amplifikácia požadovaného génu sa môže dosiahnuť kotransfekciou hostiteľskej bunky cicavco\z plazmidom, ktorý má DNA kódujúcu požadovaný proteín, a DHFR alebo amplifikačný gén kointegráciou, a nazýva sa koamplifikáciou. To, že bunka požaduje viac DHFR, čo je splnené replikáciou selekčného génu, sa zaistí výberom len tých buniek, ktoré môžu rásť v prítomnosti stále väčšej koncentrácie MTX. Za predpokladu, že gén kódujúci požadovaný heterológny proteín, sa kointegruje so selekčným génom, replikácia tohto génu často umožňuje replikáciu génu kódujúceho požadovaný proteín. Výsledkom je, že zväčšenie množstva kópií génu, t.j. amplifikovaný gén, ktorý kóduje požadovaný heterológny proteín, spôsobuje väčšiu expresiu požadovaného heterológneho proteínu.

Uprednostňovanými hostiteľskými bunkami, vhodnými pre expresiu vektorov podľa tohto vynálezu, ktoré kódujú sialyltransferázu vo vyšších eukaryotoch, sú: CV1 línia obličiek opíc transformovaná SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línia (293) obličiek ľudského embrya (Graham, F.L. a kol., J. Gen. Virol. 36. 59 (1977)); bunky obličiek mláďat škrečkov (BUK, ATCC CCL

10); DHFR buniek vaječníkov čínskych škrečkov (CHO, Urlaub a Chasin, PNAS (USA) 77, 4216 (1980)); myšie bunky (TM4, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)); bunky opičej obličky (CV1 ATCC CCL 70); bunky obličky africkej zelenej opice (VERO-76, ATCC CRL 1587); bunky humánneho cervikálneho karcinómu (HELA, ATCC CCL 2); bunky obličky psa (MDCK, ATCC CCL 34); bunky krysej pečene (buffalo) (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ludské pľúcne bunky (W138, ATCC CCL 75); bunky ľudskej pečene (Hep G2, HB 8065); myší tumor mliečnej žľazy (MMT 060562, ATCC CCL 51); a bunky TRI (Mather, J.P. a kol., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-46 (1982)); bakulovírusové bunky.

Transformácia znamená zavedenie DNA do organizmu, aby DNA bola schopná replikácie, buď ako extrachromozomálny element alebo chromozomálnou integráciou. Ak nie je uvedené ináč, tu použitá metóda pre transformáciu hostiteľských buniek je metóda Grahama, F. a Van der Eba, A., Virology 52. 456-457 (1973)). Môžu sa však použiť aj iné metódy pre zavedenie DNA do buniek, ako je nukleárna injekcia alebo protoplastová fúzia. Ak sa použijú prokaryotické bunky alebo bunky, ktoré obsahujú významné konštrukcie bunkovej steny, uprednostňovanou metódou transfekcie je kalciové pôsobenie s použitím chloridu vápenatého publikované Cohenom, F.N. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 (1972).

Pre analýzu potvrdzujúcu správnu sekvenciu vo vytvorených plazmidoch sa používajú ligačné zmesi na transformáciu kmeňa 294 E.coli K12 (ATCC 31446) a podľa potreby sa transformanty selektujú podľa ampicilínovej alebo tetracyklínovej rezistencie. Plazmidy z transformantov sa pripravujú, analyzujú reštrikciou alebo aj sekvenujú metódou Messinga a kol., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981) alebo metódou Maxama a kol. Methods in Enzymology 65. 449 (1980).

Hostiteľské bunky možno transformovať expresnými vektormi podľa tohto vynálezu a kultivovať v bežných živných pôdach príslušne upravených pre indukovanie promótorov, selekciu transformantov alebo amplifikáciu génov. Podmienky kultivácie, ako sú teplota, pH a podobne, sú také, aké sa použili pre hostiteľské bunky vybraté pre expresiu a budú zrejmé pre odborníka v tejto oblasti.

Transfekcia označuje prijatie expresného vektora hostiteľskou bunkou,či už fakticky prebehla expresia kódovacích sekvencii alebo nie. Skúseným odborníkom v oblasti je známe veľké množstvo metód transfekcie, napríklad CaPO₄ a elektroporácia. Úspešná transfekcia sa obyčajne pozná podľa akejkoľvek indikácie pôsobenia tohto vektora, ktoré prebehne vo vnútri hostiteľskej bunky.

Pre lepšie pochopenie nasledujúcich príkladov sa popíšu určité často sa vyskytujúce metódy a výrazy.

Plazmidy sa označujú malým p, pred ktorým alebo aj za ktorým sú veľké písmená alebo aj čísla. Tu uvádzané východiskové plazmidy sú buď komerčne dostupné, neobmedzene verejne dostupné alebo sa môžu pripraviť z dostupných plazmidov podľa publikovaných postupov. Okrem toho sú skúseným pracovníkom v tejto oblasti známe aj iné plazmidy ekvivalentné tým, ktoré sa tu popisujú.

Digescia DNA označuje katalytické štiepenie DNA reštrikčným enzýmom, ktorý pôsobí len na určité sekvencie

- 27 v DNA. Rozličné tu použité reštrikčné enzýmy sú komerčne dostupné a ich reakčné podmienky, kofaktory a iné požiadavky sa použili s tým, že by mali byt skúseným odborníkom známe. Pre analytické účely sa normálne používa 1 ^ig plazmidu alebo fragmentu DNA s približne dvomi jednotkami enzýmu v približne 20 μΐ tlmivého roztoku. Na účely izolácie fragmentov DNA pre prípravu plazmidov sa typicky 5 až 50 pg DNA štiepi 20 až 250 jednotkami enzýmu vo veľkom objeme. Výrobcovia špecifikujú vhodné tlmivé roztoky a množstvá substrátu pre konkrétne reštrikčné enzýmy. Obyčajne sa používa inkubačný čas okolo 1 hodiny pri 37 °C, ale môže sa i meniť. podľa pokynov dodávateľa. Po digescii sa robí elektroforéza reakčnej zmesi priamo na polyakrylamidovom géli, aby sa izoloval požadovaný fragment.

Veľkostná separácia fragmentov vzniknutých štiepením sa robí pomocou 8 percentného polyakrylamidového gélu popísaného v: Goeddel, D. a kol., Nucleic Acids Res., 8, 4057 (1980).

Defosforylácia označuje odstránenie terminálneho 5' fosfátu pôsobením bakteriálnej alkalickej fosfatázy (BAP). Tento postup zabraňuje dvom reštrikčným koncom odštiepeného fragmentu DNA, aby sa cirkularizovali alebo vytvorili uzavretú slučku, ktorá by bránila inzercii iného fragmentu DNA na mieste reštrikcie. Postupy a činidlá pre defosforyláciu sú bežné (Maniatis, T. a kol., Molecular Cloning (Molekulové klonovanie), s. 133-134 (1982)). Reakcie s BAP sa vykonávajú v 50 mM Tris-e pri 68 “C, aby sa potlačila aktivita exonukleáz, ktoré môžu byť. prítomné v enzýmových preparátoch. Reakcie prebiehali 1 hodinu. Po reakcii sa fragment DNA izoloval na géli.

Oligonukleotidy označujú buď jednoduchú špirálu polydeoxynukleotidu alebo dve komplementárne polydeoxynukleotidové špirály, ktoré sa môžu chemicky syntetizovať.. Takéto syntetické oligonukleotidy nemajú 5' fosfát a tak sa nemôžu naviazať na iný oligonukleotid bez prídavku fosfátu s ATP ' áOSÍSääiäŕ'ääsS ťi'í \ ^;ΰν.·4·*'»»ϋΑ1ί,^'.ί Jt**¹· i'ÚI'.gč.i^.ú.·..· »’:M.·. Z 4.-5¾. · v prítomnosti kinázy. Syntetický oligonukleotid sa naviaže na fragment, ktorý nebol defosforylovaný.

Naviazanie (ligácia) znamená proces tvorby fosfodiesterových väzieb medzi dvomi fragmentárni nukleových kyselín v dvojitej špirále (Maniatis, T. a kol., cit. vyššie, s. 146). Ak sa nestanoví ináč, naviazanie sa uskutoční s použitím známych pufrov a podmienok s 10 jednotkami ligázy T4 DNA (ligáza) na 0,5 p.g približne ekvirnolárnych množstiev fragmentov DNA, ktoré majú byt naviazciné. Konštrukcia vhodných vektorov obsahujúcich požadované kódovacie a riadiace sekvencie využíva štandardné ligačné techniky. Izolované plazmidy alebo fragmenty DNA sa štiepia, upravujú a opätovne naväzujú do formy, ktorá sa požaduje pre prípravu vyžadovaných plazmidov.

Vyplnenie alebo tupé ukončenie označuje postup, pri ktorom sa koniec jednoduchej špirály na kohezívnom konci nukleovej kyseliny štiepenej reštrikčným enzýmom, konvertuje na dvojitú špirálu. Týmto vytvorí sa tupý koniec, prostriedkom pre konverziu sa eliminuje kohezívny koniec a Tento postup je univerzálnym konca reštrikčného rezu, ktorý môže byt kohezívny s inými koncami vytvorenými len jedným alebo niekoľkými ďalšími reštrikčnými enzýmami, za vzniku konca kompatibilného s ľubovoľnou tupo ukončenou endonukleázou alebo inými vyplnenými kohéznymi koncami. Normálne sa tupé ukončenie uskutoční inkubáciou 2 - 15 pg výslednej DNA mM MgCl₂, 1 mM ditiotreitolu, 50 mM

7,5) pri asi 37 “C v prítomnosti jednotiek Klenowho fragmentu DNA polymerázy I a 250 μΜ roztoku každého zo štyroch deoxynukleozid trifosfátov. Inkubácia sa normálne skončí po 30 minútach fenolovou a chloroformovou extrakciou a vyzrážaním etanolom.

v tlmivom roztoku s 10 NaCl, 10 mM Tris (pH

Polynukleotidy zodpovedajúce alebo komplementárne k úsekom objavených sekvencii sa môžu použit ako hybridizačné sondy pre identifikáciu alebo aj pre izoláciu príslušného »'UJ·>.· i germlinového génu. Takéto polynukleotidy sa tiež môžu použiť ako hybridizačné sondy na screening cDNA a knižníc genómov, aby sa izolovali cDNA a gény kódujúce polypeptidy, ktoré sú štruktúrne a evolučné príbuzné sialyltransferázovým sekvenciám podľa tohto vynálezu. Okrem toho takéto polynukleotidy môžu slúžiť ako priméry pre amplifikáciu sekvencii germlinových génov alebo príbuzných sekvencii polymerázovou reťazovou reakciou (PCR).

Hybridizačné sondy, ktoré sa používajú pre identifikáciu a izolovanie ďalších druhov cDNA sialyltransferázy, sú vytvorené na báze nukleotidových a zistených aminokyselinových sekvencii uvedených na obr. 1 a 2. Hybridizačné sondy, ktoré sa normálne značkujú zavedením rádioizotopu, sa môžu skladať z jedného alebo viacerých spoločenstiev degenerovaných nukleotidov, ktoré kódujú celú konzervatívnu oblasť aľtebo jej časť, zodpovedajúcu 55 zvyškovému segmentu od aminokvselinového zvyšku 134 po aminokyselinový zvyšok 189 v bravčovej a2,3-O sialyltransferáze (obr. 1). Zvlášť heptapeptidový motív -Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thrje vysoko konzervatívny a hybridizačné sondy obsahujúce degenerované oligonukleotidy kódujú tento motív alebo varianty tohto motívu, v ktorom jedna alebo dve aminokyseliny sú zmenené a najmenej 4 až 5 aminokyselín heptapeptidu ostáva nezmenených. Degenerované oligonukleotidové sondy kódujúce varianty heptapeptidového motívu s jednoduchou alebo dvojitou substitúciou aminokyselín sú tiež použitelné pre triedenie príbuzných druhov cDNA sialyltransf erázy . Okrem degenerovaných nukleotidov sa ako sondy môžu použiť fragmenty klonovaných polynukleotidov, napríklad tie, ktoré sú na obr. 1 a 2; je výhodné, ak tieto sondy pokrývajú heptapeptidový motív a ak sa to požaduje, konzervatívny segment 55 aminokyselinových zvyškov popísaný vyššie.

Genomické alebo cDNA klony kódujúce sialyltransferázu sa môžu izolovať z bánk klonov s použitím hybridizačných sond vytvorených na báze sekvencii nukleotidov sialyltransferázy, ako sú na obr. 1 a 2. Keď sa požaduje kloň cDNA, je výhodná

V‘” * < í«.~í.'«UC 5iA' banka klonov odvodených z buniek pre expresiu sialyltrransferáz. Syntetická sekvencia polynukleotidov, zodpovedajúca celým sekvenciám uvedeným na obr. 1 a 2 alebo ich častiam, sa môže vytvoriť chemickou syntézou oligonukleotidov. Okrem toho sa môže na amplifikáciu fragmentov DNA z geriomických súborov DNA, mRNA alebo z bánk klonov cDNA použiť polymerázová reťazová reakcia (PCR) s použitím primérov podľa údajov o sekvenciách z obr. 1 a 2. Metóda PCR je popísaná v U.3. Patentoch 4,683,195 a 4,683,202. Okrem toho možno použiť metódu PCR využívajúcu jeden primér vybratý podľa údajov na obr. 1 a 2 a druhý primér, ktorý nevychádza z týchto sekvenčných údajov. Môže sa napríklad použiť druhý primér, ktorý je homologický alebo komplementárny k polyadenylačnému segmentu.

Pre odborníka v tejto oblasti je zrejmé, že substitúcie, vylúčenia a prídavky nukleotidov sa môžu použiť pri polynukleotidoch podľa tohto vynálezu. Tieto substitúcie, eliminácie a prídavky nukleotidov nemôžu podstatne porušiť schopnosť polynukleotidu hybridizovať sa na jednu z, polynukleotidových sekvencií na obr. 1 a 2 za hybridizačných podmienok, ktoré sú dostatočne prísne, aby došlo k špecifickej hybridizácii.

Sekvencie nukleotidov a aminokyselín uvedené na obr. 1 a 2 umožňujú odborníkovi so skúsenosťami v tejto oblasti pripraviť peptidy, ktoré zodpovedajú celým zakódovaným polypeptidovým sekvenciám alebo ich častiam. Takéto polypeptidy sa môžu pripraviť v prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských bunkách expresiou polynukleotidov kódujúcich sialyltransferázu(y) plnej dĺžky alebo ich fragmenty a analógy. Okrem toho sa takéto polypeptidy môžu syntetizovať chemickými metódami alebo vyrobiť in vitro translačnými systémami s použitím vzoru polynukleotidu pre priamu transláciu. Metódy pre expresiu heterológnych proteínov v rekombinantných hostiteľoch, chemická syntéza polypeptidov a translácie in vitro sú dobre známe a sú bližšie popísané v: Maniatis a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulárne

Š i,

H klonovanie: Laboratórna príručka), 2. vyčl. , Cold Spring

Harbor, New York, 1989, a Berger a Kimmel, Methods in Enzymology (Metódy v enzymológii), zv. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (Príručka techník molekulového klonovania), Academic Press, San Diego, Calif., 1987.

Odborníci v tejto oblasti môžu pripraviť, fragmenty sialyltransferáz. Výhodné amino- a karboxy- konce fragmentov alebo ich analógov sa nachádzajú pri hraniciach štruktúrnych alebo aj funkčných domén, napríklad v blízkosti aktívneho miesta enzýmu. Fragmenty, ktoré obsahujú v podstate jednu alebo viac funkčných domén, sa môžu pripojiť, k heterológnej polypeptidovej sekvencii, pričom výsledný proteín prejavuje funkčnú vlastnosť (vlastnosti), ako je enzymatická aktivita vlastná fragmentu. Na druhej strane, delečné polypeptidy, z ktorých sa vylúčila jedna alebo viac funkčných domén, vykazujú stratu vlastnosti, ktorú bežne má vylúčený fragment.

Jedným z najúčinnejších prostriedkov pre prípravu veľkých množstiev funkčne aktívneho próteínu z klonovaných génov je expresia bakulovírusového eukaryotického génu (Summers, M. a Luckow, V., Bio/Technology 6, 47 (1988); zaradené ako literárny odkaz). Polypeptidy sialyltransferázy podľa tohto vynálezu sa môžu pripraviť z klonovaných polynukleotidov expresiou v bakulovírusovom expresnom systéme (Invitrogen Corporation, San Diego, USA).

. Typická sialyltransferáza a jej rekombinantný expresný produkt sa získal podľa nasledujúceho protokolu:

1. Sialyltransferáza z bravčovej pečene sa vyčistila až do dosiahnutia homogenity.

2. Určila sa N-terminálna aminokyselinová sekvencia bravčovej , sialyltransferázy.

3. Chemicky sa syntetizovala oligonukleotidová sonda zodpoveí,í dajúca 18 aminokyselinám v blízkosti NH₂ terminálnej ľ sekvencie.

ť ; 4. Zostavili sa banky cDNA v ^IgtlO za použitia a) mRNA oboha-.V* , úť ‘ sť tľ tenej náhodne iniciovaným poly.A-i- z bravčových slinných žliaz, b) mRNA obohatená oligo dT iniciovaným polyA+ z krysej pečene a c) mRNA obohatená oligo dT iniciovaným poly A+ z krysieho mozgu.

5. Použil sa súbor rádioakívne značkovanývh syntetických deoxyoligonukleotidov komplementárnych ku kodónom pre sekvencie aminokyselín sialyltransferázy popísané nižšie, ako sú:

a) 5' ACC CTG AAG CTG CGC ACC CTG CTG GTG CTG TTC ATC TTC CTG ACC TCC TTC TT 3'

b) 5' GAC GTC GGG AGC AAG ACC ACC 3'

6. Náhodne iniciovaná banka bravčových slinných žliaz sa triedila s pomocou chemicky syntetizovaných oligonukleotidových krátkych a dlhých sond označených pomocou poly-nukleotidkinázy a ³²P-ATP. Dvojito pozitívne škvrny sa izolovali a sekvenovali.

7. Jedna škvrna označená ³²P sa použila na opätovný screening oligo dT iniciovaných bánk bravčových slinných žliaz.

8. Z dvoch prekrývajúcich sa klonov sa získal úplný čítací rámec pre bravčovú sialyltransferázu. cDNA z krysej pečene a z mozgu obsahovala konzervatívnu oblast homológie, ktorá sa určila sekvenčnou analýzou DNA získaného klonu.

9. Z dvoch prekrývajúcich sa klonov v plazmide sa zostavila cDNA plnej dĺžky kódujúca bravčovú sialyltransferázu a sekvenovala sa. Malo by sa ocenit, že vyriešenie sekvencií DNA na obr. 1 a 2 umožňuje pripravovať sondy z konzervatívnej oblasti homológie cDNA sialyltransferázy, čím sa značne zjednoduší , resp. zvýši sa účinnosť sondovania cDNA alebo bánk genómov z týchto alebo iných druhov alebo z iných tkanív týchto alebo iných druhov, čo umožňuje vyhnúť sa izolovaniu a sekvenovaniu sialyltransferázy a príprave sondovacích súborov .

10. cDNA plnej dĺžky kódujúce bravčovú a krysiu sialyltransferázu sa potom upravili do expresného prostriedku, ktorý sa. použil na transformovanie vhodných hostiteľských buniek. Tieto bunky sa potom pestovali v kultúre za produkcie požadovanej sialyltransferázy.

11. Biologicky aktívna zrelá sialyltransferáza pripravená

V-)·.·/

- 33 v vyššie uvedeným postupom mala alternatívne formy, ako je uvedené na obr. 4 a 5, čoho dôsledkom sú dve látky o molekulovej hmotnosti 45 kDa a 48 kDa.

Polynukleotidy podľa tohto vynálezu rekombinantne pripravené polypeptidy a fragmenty sialyltransferázy alebo jej aminokyselinové substitučné varianty sa môžu pripraviť na zákla' de sekvenčných údajov, ktoré poskytujú obrázky 1, 2, 3, 5, a 8 alebo na základe sekvenčných údajov získaných z nových cDNA sialyltransferázy izolovaných metódou podľa tohto vynálezu. Príprava polynukleotidov a polypeptidov sialyltransferáz vyrábaných rekombinantne sa vykoná podľa známych metód, ktoré sú popísané v: Maniatis a koľ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulové klonovanie: Laboratórna príručka), 2. vydanie, Cold Spring Harbor, New York, 1989, a Berger a Kimmel, Methods in Enzymology (Metódy v enzymológii), zväzok 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (Príručka techník molekulového klonovania), Academic Press, San Diego, USA, 1987, ktoré sa tu uvádzajú ako literárny odkaz. Po funkčom pripojení (t.j. umiestnení, ktoré zabezpečuje funkčnosť) na expresnú riadiacu sekvenciu sa môžu urobiť expresie polynukleotidovýc-h sekvencií v hostiteľoch tak, aby transkripcia sekvencie polynukleotidu prebiehala vo vhodných podmienkach pre transkripciu.

Špecifická hybridizácia sa tu. definuje ako tvorba i hybridov medzi polynukleotidovou sondou (napr. polynukleotid

I í . podľa tohto vynálezu, ktorý môže zahrňovať substitúcie, elii minácie alebo aj adície) a špecifického cieľového polynukleo! tidu (napr. polynukleotidu, ktorý má komplementárnu sekvenciu), kde sa sonda výhodne hybridizuje na taký špecii·¹ ; fický produkt, že napr. sa identifikuje jednoduchý pás na : Northern škvrne RNA pripravenej z eukaryotických buniek, ktoí j ré obsahujú cielovú RNA alebo sa získa jeden hlavný produkt

PCR, ak sa polynukleotidová sonda použije ako PCR primér.

V niektorých prípadoch môže byt cieľová sekvencia prítomná vo ; viac ako jednom druhu polynukleotidu (napr. určitá cieľová

S ;

sekvencia sa môže vyskytovať, vo viacerých členoch skupiny génov sialyltransferázy alebo v alternatívne spájaných RNA prepísaných z rovnakého génu). Je zrejmé, že optimálne podmienky pre hybridizáciu sa budú meniť v závislosti na zložení sekvencie a dížke(ach) sondy (sond) a výsledného produktu(ov) a na výbere experimentálnej metódy. Na výber vhodných hybridizačných podmienok sa môžu použiť rôzne príručky (viď Maniatis a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor, New York, 1989, a Berger a Kimmel, Methods in Enzymology, zv. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, San Diego, 1987, ktoré sa tu uvádzajú ako literárny odkaz).

Polynukleotidy opačného zmyslu (antlsense) sú polynukleotidy, ktoré: (1) sú komplementárne celým sekvenciám uvedeným na obr. 1 a 2 alebo ich častiam, alebo aj sekvenciám získaným z nových cDNA sialyltransferázy izolovanej metódou podľa tohto vynálezu, a (2) ktoré sa špecificky hybridizujú na komplementárnu cielovú sekvenciu. Takéto komplementárne polynukleotidy opačného zmyslu môžu obsahovať nukleotidové substitúcie, adície, eliminácie alebo transpozície za predpokladu, že špecifická hybridizácia na príslušnú cielovú sekvenciu (napr. zodpovedajúcu obr. 1 a 2) sa zachová ako funkčná vlastnosť polynukleotidu. Komplementárne polynukleotidy opačného zmyslu zahrňujú rozpustné oligonukleotidy RNA alebo DNA opačného zmyslu, ktoré sa môžu hybridizovat špecificky na individuálne druhy mRNA sialyltransferázy alebo na niekoľko členov skupiny mRNA sialyltransferázy a zabrániť transkripcii druhov mRNA alebo aj translácii kódovaného polypeptidu (Ching a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86. 10006-10010 (1989); Broder a kol., Ann. Int. Med. 113, 604-618 (1990); Loreau a kol., FEBS Letters 274, 53-56 (1990); Holcenberg a kol., W091/11535; U.S.S.N. 07/530,165 (Nový ľudský CRIPTO gén); W091/09865; W091/04753; W090/13641; a EP 386563, všetky sú tu uvedené ako literárne odkazy). Polynukleotidy opačného zmyslu preto inhibujú produkciu kódovaného polypeptidu(ον). V tomto zmysle môžu poly35 nukleotidy opačného zmyslu, ktoré inhibujú transkripciu alebo aj transláciu jednej alebo viacerých sialyltransferáz, menit kapacitu alebo aj špecificitu bunky ku glykozylačným polypeptidom.

Polynukleotidy opačného zmyslu sa môžu pripraviť z heterológnej expresnej kazety v transfektantnej alebo transgenickej bunke, ako je transgenická pluripotentná hematopoetická kmeňová bunka požívaná na častočnú alebo úplnú rekonštitúciu populácie hematopoetických kmeňových buniek indivídua. Polynukleotidy opačného zmyslu môžu zahrňovať aj rozpustné oligonukleotidy, ktoré sa dávkujú do vonkajšieho prostredia, buď v kultivačnom médiu in vitro alebo v obehovom ústrojenstve alebo v intersticiálnej kvapaline in vivo. Ukázalo sa, že rozpustné polynukleotidy opačného zmyslu prítomné vo vonkajšom prostredí získajú prístup k cytoplazme a inhibujú transláciu špecifických druhov mRNA. V niektorých praktických uskutočneniach vynálezu zahrňujú polynukleotidy opačného zmyslu metylfosfonátové štruktúry, prípadne sa môžu použit fosforotioláty alebo O-metylribonukleotidy alebo tiež chimerické oligonukleotidy (Dagle a kol., Nucleic Acids Res. 18, 4751 (1990)). Pre niektoré aplikácie môžu polynukleotidy opačného zmyslu zahrňovať polyamidové nukleové kyseliny (Nielsen a kol., Science 254, 1497 (1991)). Všeobecné metódy týkajúce sa polynukleotidov opačného zmyslu viď v: Antisense RNA and DNA, red. D.A. Melton, Cold Spring Harbor LAboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988.

Polynukleotidy opačného zmyslu komplementárne k jednej alebo viacerým sekvenciám sa využívajú na inhibíciu translácie príbuzného druhu mRNA a tým spôsobujú zníženie množstva zodpovedajúceho kódovaného polypeptidu. Takéto nukleotidy opačného zmyslu môžu mat terapeutickú funkciu inhibíciou tvorby jednej alebo viacerých sialyltransferáz in vivo.

Je možné vytvoriť transgenické orgamizmy s jednou alebo viacerými integrovanými kópiami transgénu sialyltransferázy.

íSíSíSca wJ^u^iíJ»íSítJ»’íií5fl »^ú'iiyf£ťVÍt,VÄľíaTii«íi«‘ .?j?ir,/'S(· kmv

- 36 Transgény sialyltransferázy sú polynukleotidy, ktoré obsahujú sekvenciu polynukleotidov kódujúcu proteín sialyltransferázy alebo jej fragment funkčne pripojený k promótoru a pripojený k voliteľnej značkovacej sekvencií, ako je G-418 rezistenčný gén.

S použitím genetickej manipulácie je možné vyvinúť trangenický modelový systém alebo aj úplný bunkový systém obsahujúci transgén sialyltransferázy vhodný pre použitie, napríklad ako modelové systémy pre screening liečiv a hodnotenie účinnosti liečiv. Navyše, takýto modelový systém poskytuje prostriedok pre určenie biochémie sprevádzajúcej metabolizmus sialyltransferázy, čím sa poskytuje základ pre racionálny návrh liečiva a experimentálne skúšanie.

Jedným z prístupov na vytvorenie transgenických organizmov je nasmerovanie mutácie na požadovaný gén homologickou rekombináciou v bunkovej línii embryonického kmeňíi (ES) in vitro, za čím by nasledovala mikroinjekcia modifikovanej bunkovej línie ES do hostiteľského blastocytu a následná inkubácia v nepravej matke (viď Frohman a Martin, Celí 56. 145 (1989)). Môže sa tiež použiť technika mikroinjekcie mutovaného génu alebo jeho časti do jednobunkového embrya, za čím by nasledovala inkubácia v nepravej matke. Môžu sa použiť rozličné transgenické organizmy, zvlást transgenické organizmy, ktoré spôsobujú expresiu prirodzene sa vyskytujúceho proteínu sialyltransferázy. Môžu sa tiež vytvoriť transgenické organizmy s transgénami, ktoré kódujú mutačne zmenený (napr. mutagenizovaný) proteín(y) sialyltransferázy, ktoré podľa požiadaviek môžu a nemusia mat enzymatickú aktivitu. Sú známe aj ďalšie metódy pre vytvorenie transgenických organizmov.

Okrem toho lokálne smerovaná mutagenéza alebo aj génová konverzia sa môžu použiť na mutáciu génovej alely sialyltransferázy, buď endogénnej alebo transfektovanej tak, že mutovaná alela kóduje variantnú sialyltransferázu.

Na inzerciu sekvencie sialyltransferázy do hostiteľského genómu na špecifickom mieste sa môže tiež použiť homologická rekombinácia, napríklad v mieste zodpovedajúcej hostiteľskej sialyltransferázy. V jednom type homologickej rekombinácie sa vymení jedna alebo viac hostiteľských sekvencii; napríklad hostiteľská alela sialyltransferázy (alebo jej čast) sa nahradí mutovanou sialyltransferázovou sekvenciou (alebo jej častou). Okrem tejto metódy nahradenia génu sa môže použiť homologická rekombinácia, ktorá zacieli polynukleotid kódujúci sialyltransferázu na iné špecifické miesto, ako je miesto hostiteľskej sialyltransferázy. Homologická rekombinácia sa môže použiť na vytvorenie transgenických organizmov iných ako ľudských alebo aj na prípravu buniek, ktoré obsahujú mutované alely sialyltransferázy. Cielenie génov sa môže použiť na narušenie a inaktiváciu jedného alebo viacerých endogénnych génov sialyltransferázy; takzvaná knokautová transgenéza už bola popísaná pre iné gény (W091/10741; Kuhn a kol., Science 708. 707 (1991)).

Nasledujúce príklady len ilustrujú najlepšie v súčasnosti známe spôsoby praktického uskutočnenia vynálezu, ale nemôžu sa pokladať za ohraničenie tohto vynálezu. Všetky tu zaradené literárne citácie sa výslovne chápu ako literárne odkazy.

Príklad 1

Izolácia bravčovej sialyltransferázy

Izolácia dvoch foriem a2,3-0 sialyltransferázy ct2,3-O sialyltransf eráza sa izolovala s pomocou kombinácie dvoch už popísaných postupov (Sadler, J.E. a kol., J. Biol. Chem. 254. 4434-4443 (1979) a Conradt, H.S. a kol., In: Sialic Acids 1988 Proceedings of the Japanese-German Symposium on Sialic Acid (Kyselina sialová 1988, Zborník japonsko-nemeckého sympózia o kyseline sialovej), red. Schauer

- 38 a Yamakawa, s. 104-105, Verlag Wissenschaft and Bildung, Kiel, 1988). Enzým sa izoloval z extraktu Triton X-100 bravčovej pečene afinitnou chromatografiou v troch za sebou zaradených kolónach CDP-hexanolamínovej agarózy. Elučné profily z prvého a tretieho purifikačného kroku sú na obr. 3, resp. 4. Na obr. 3 vidiet, že sa pozorovali dva piky aktivity sialyltransferázy v elučnom profile prvého afinitného stĺpca. Tieto dva piky sa oddelili spojením príslušných frakcií do vzorky A a B, pričom neskôr sa zistilo, že v týchto dvoch vzorkách sú dve formy a2,3-O sialyltransferázy líšiace sa molekulovou hmotnosťou.

Druhé kolo afinitnej purifikácie týchto vzoriek viedlo k odstráneniu väčšiny kontaminujúcej a2,6 sialyltransferázy, ktorá sa tiež nachádza v bravčovej pečeni (Sadler, J.E. a kol., J. Biol. Chem. 254. 4434-4443 (1979)). Po tretom kole afinitnej chromatografie sa frakcie zo stĺpca analyzovali a zistilo sa, že jednotlivé frakcie obsahujú rozšírenú 48 kDa formu (Obr. 4A, frakcie 4-6) alebo 45 kDa formu (obr. 4B, frakcie 2-6) molekulovej hmotnosti a2,3 sialyltransferázy. Tieto dva druhy proteínu sa označili ako Forma A, resp. Forma B. Špecifická aktivita frakcií z píkov pre obe kolóny bola

8-10 jednotiek/mg proteínu. Silný pás (“44 kDa) viditeľný vo frakcii 6 na obr. 4, stĺpec A, nie je a2,3 sialyltransferáza a predstavuje jednu z najvýznamnejších nečistôt v oboch vzorkách A aj B po predchádzajúcom delení, pretože nemá enzymat.ickú aktivitu v poslednom kroku afinitnej chromatografie.

Aktivita sialyltransferázy sa analyzovala s laktózou alebo aj s nízkomolekulovým nemrznúcim glykoproteínom ako substrátom (Sadler, J.E. a kol., J. Biol. Chem. 254, 4434-4443 (1979)). Enzým sa izoloval z bravčovej pečene podľa popísaných metód (Sadler, J.E. a kol., J. Biol. Chem., 254, 4434-4443 (1979) a Conradt, II.S. a kol., In: Sialic Acids 1988 Proceedings of the Japanese-German Symposium on Sialic Acid, red. Schauer a Yamakawa, s. 104-105, Verlag Wissenschaft and Bildung, Kiel, 1988) s určitými modifikácia- 39 i mi. V stručnosti, 2 kg pečene sa zhomogenizovali v tlmivom roztoku a pripravili sa membrány podía popísanej metódy (Sadler, J.E. a kol., J. Biol. Chem., 254. 4434-4443 (1979)). Membrány sa trikrát extrahovali tlmivým roztokom (Conradt, H.S. a kol., In: Sialic Acids 1988 Proceedings of the Japanese-German Symposium on Sialic Acid, red. Schauer a Yamakawa, s. 104 - 105, Verlag Wissenschaft and Bildung, Kiel, 1988) a extrakt sa prepustil cez 1,5 1 stĺpec CDP-hexanolamínovej agarózy (stĺpec 1) (16 μΜ/ml). Po premytí stĺpca 3 litrami pufra B sa stĺpec eluoval s lineárnym gradientom 0,05 až 1,0 M KCl (2,5 1 x 2,5 1) v pufri B. Frakcie obsahujúce ot2,3 sialyltransf erázu sa spojili do dvoch vzoriek A, resp. B (viď obr. 3). Vzorky sa dialyzovali oproti tlmivému roztoku B a použili sa v druhom kole afinitnej chromatografie na CDP-hexanolaminovej agaróze (stĺpce IIA a IIB). Pre vzorku A sa použil 150 ml stĺpec a pre vzorku B 30 ml stĺpec; dva preparáty zo stĺpca I (celkove zo 4 kg pečene) ša zaviedli na ten istý stĺpec v kroku II. α2,3-sialyltransferáza sa eluovala gradientom 0 - 2,0 mM CTP (750 ml pri vzorke A, 150 ml pri vzorke B) v pufri B. Frakcie s aktívnou a2,3 sialyltransferázou sa odsolili na G50 Sephadexe, nechali dôjst do rovnováhy v tlmivom roztoku a aktívne frakcie sa aplikovali na 1,0 ml stĺpec CDP-hexanolamínovej agarózy (čast III), kde sa eluovali s krokovým gradientom 0,1 až 1,0 mM CTP (20 krokov po 1,0 ml) v pufri B (viď obr. 2). Aktívne frakcie sa oddelili a kombinovaný výtažok z oboch stĺpcov bol 2,5 jednotky pri špecifickej aktivite 8-10 jednotiek/mg proteínu.

kDa a 45 kDa peptidy sialyltransferázy (viď obr. 4) sa rozdelili na SDS-polyakrylamidových géloch (Leammli, U.K., Náture 227, 680-685, [1970]) elektroeluovali na membráne PVDF (Immobilon Transfer, Millipore) a zafarbili Coomasieho Brilantnou Modrou (Sigma). Pásy sialyltransferázy sa vyrezali a urobila sa na nich NH₂-terminálna aminokyselinová sekvenčná analýza Edmanovou degradáciou pomocou proteínového sekvencera Applied Biosystems 475A.

- 40 Frakcie obohatené o 48 kDa formu (forma A) a 45 kDa formu (forma B) sialyltransferázy sa delili polyakrylamidovou gólovou elektroforézou (PAGE), naniesli sa na membránu PVDF a analyzovali NH₂-terminálnym sekvenovaním. Pre každý z peptidov sa získalo 22 aminokyselinových zvyškov (obr. 5). NH₂-terminálna sekvencia Formy A obsahovala hydrofóbny úsek aminokyselín v súhlase s predpokladom Sadlera a kol. (J. Biol. Chem., 254 , 4434-4443 (1979)) a Wescotta a kol. (J.

Biol. Chem. 260, 13109-13121), že menšie formy vznikli z väčších foriem protolytickým štiepením hydrofóbneho peptidu. Predpokladá sa, že táto oblast zapríčiňuje detergenčné vlastnosti a afinitu k membránam vlastné Forme A.

Príklad 2

Bravčová sialyltransferázová cDNA

Poly A+ RNA sa použila ako vzor pre vytvorenie jednoduchého vlákna cDNA s použitím súpravy dodávanej firmou Invitrogen. Táto cDNA slúžila ako vzor v polymerázovej reťazovej reakcii (PCR) s použitím činidiel a postupov od firmy Perkin Elmer Cetus. Použité špecifické podmienky boli 92° po dobu l min; 50° po dobu 2 min a 72° po dobu 2 min. pre denaturačný, spevňovací, resp. polymerizačný stav. PCR reakcie sa iniciovali s 30bp, oligonukleotidmi zodpovedajúcimi sekvenciám ohraničujúcim l20bp elimináciu pri 3' konci STÍ. Produkty amplifikačnej reakcie sa oddelili ha 2% agarózovom géli; identifikovali sa dva špecifické pásy líšiace sa o 120bp, zodpovedajúce klonom STÍ a ST2, ktoré sa identifikovali zafarbením etídium bromidom. Tieto pásy sa eluovali z gélu (súprava Qiaex, Qiagen), subklonovali do TA vektora (Invitrogen) a sekvenovali, ako je uvedené vyššie na jednoznačnú identifikáciu.

ABiWUXSlVíÁi'i.X’Jí'J-.ΛΚΜΛΙ i.uw · !.·.·*. ..·< r·».!.*. ·« · ·

Izolácia RNA a vytvorenie banky cDNA

Čerstvé bravčové slinné žlazy (menej ako 30 inin post mortem) sa zmrazili a dopravovali sa v zmesi suchý lad-etanol. Úplná RNA sa izolovala podía postupu Chomczynského a Sacchiho (Anál. Biochem. 162, 155-159 (1987)). Poly A+ RNA sa čistila oligo dT-celulózovou chromatografiou (Pharmacia). cDNA v dvojitej špirále sa syntetizovala obrátenou transkripciou poly A+ RNA s použitím náhodných hexamérov ako primérov pomocou súpravy pre syntézu cDNA Pharmacia a podlá postupov odporúčaných výrobcom. EcoRI adaptéry sa naviazali na IgtlO spotrebovaný EcoRI a zbalili sa in vitro (ProMega). Screening Banky cDNA sa robil infekciou E. coli C600 na zbalenej zmesi.

Izolácia a sekvenovanie klonov cDNA

Všetky postupy sa vykonali podlá Maniatisa a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1982, ak nie je uvedené ináč. Oligonukleotidová sonda 53bp (5'ACCCTGAAGCTGCGCACCCTGCTGGTGCTGTTCATCTTCCTGACCTCCTTCTT3') zodpovedajúca 18 aminokyselinám v blízkosti NH₂-terminálnej sekvencie vyčisteného 48 kDa sialyltransferázového peptidu (viď obr. 5) sa koncovo označil ³²P na mernú aktivitu 10⁷ cpm/mol. Urobil sa screening 500,00 plakov nukleotidovou hybridizáciou v nasledujúcom predhybridizaónom/hybridizačnom roztoku: 5xSSC, 50 mM NaH₂PO₄, pH 6,7, 20% formamid, 5x

Denhardtov roztok, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml DNA zo spermií lososa pri 37° (Wood, W., In: Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, s. 443). Nitrocelulózové filtre (Schleicher a Schuell, 0,45 m póre) sa premyli v 0,2x SSC, 0,1% SDS pri 42° po dobu 40 min. Získal sa jeden silne hybridizovaný kloň, ^STl, ktorý obsahoval otvorený čítací rámec kódujúci zodpovedajúce izolované 48kDa a 45 kDa peptidy sialyltransf erázy . Druhý kloň, ŽIST2, sa izoloval nukleotidovou hybridizáciou pomocou reštrikčného fragmentu z 3' konca ΛΞΤ1.

- 42 Táto sonda, reštrikčný fragment 0,5 kb Pvu II- EcoRI, sa označkovala s použitím iniciačnej súpravy a [a-³²P]dCTP (Amersham).

Reštrikčné fragmenty EcoRI, zodpovedajúce inzertom cDNA fágových DNA, sa subklonovali na pUC vektory (Pharmacia). Subklony sa sekvenovali pomocou súpravy T7 od firmy Pharmacia. Sekvenčné údaje sa analyzovali počítačom pomocou programu DNASTAR (DNASTAR Inc.,WI, USA).

Pre klonovanie cDNA pre a2,3 sialyltransferázu sa vyskúšalo niekoiko stratégií klonovania, ktoré vychádzali z informácií o sekvencií aminokyselín uvedenej na obr. 5. V prvom priblížení sme pripravili priméry polymerázovej reťazovej reakcie v snahe vytvoriť sondu pokrývajúcu NH^terminálne sekvencie 48 a 45 kDa druhov proteínu, predpokladajúc ich spojitosť v intaktnom enzýme. V retrospektíve bol tento predpoklad nesprávny kvôli nepresnostiam v sekvencii aminokyselín získaných pre 45 kDa typ (viď obr. 5 a 6). Zlyhali tiež pokusy o získanie pozitívneho klonu využívajúceho krátke (16-20bp) degenerované nukleotidy, ako sondy pre screening cDNA bravčových slinných žliaz. Prístup, ktorý sa nakoniec ukázal byt úspešný, využil nedegenerovanú 53bp oligonukleotidovú sondu vytvorenú pre oblasť 17 aminokyselín NH₂-konca formy A. Sonda 53bp sa použila na screening 500,000 plakov IgtlO banky cDNA bravčovej slinnej žľazy. Získal sa jednoduchý 1,6 kb kloň ISTI, ktorý mal konzervatívny ATG štartovací kodón (Kozák, M., Celí 49, 283-292 (1986) a Kozák, M., Nuc. Acids Res. 12., 857-87 2 (1984)), otvorený čítací rámec kódujúci NH₂-terminálnu sekvenciu aminokyselín Formy A aj Formy B a2,3 sialyltransferázy a žiadny vnútrorámcový stop kodón. Skutočnosť, že NH₂-terminálne sekvencie aminokyselín oboch foriem «2,3 sialyltransferázy boli prítomné v prenesenom otvorenom čítacom rámci jlSTl naznačuje, že kloň ^STl kódoval časť a2,3 sialyltransferázy.

Reštrikčný fragment 3' ^STl sa použil ako sonda pre získanie druhého prekrývajúceho klonu ^ST2 z tej istej banky (obr. 6). ^ST2 ukončuje otvorenú čítaciu oblast začínajúcu v ASTl. Dohromady tieto dve cDNA kódujú jednoduchý otvorený čítací rámec (909-1029, viď nižšie), 600bp 5' neprenesenú oblast a lOOObp 3' neprenesenú oblast. Sekvencia nukleotidov, ako aj prenesená sekvencia aminokyselín pre 1029bp otvorený čítací rámec, je na obr. 7. Medzi očakávanou sekvenciou aminokyselín v prenesenom otvorenom čítacom rámci 2ST1 a sekvenciou aminokyselín získanou priamou analýzou izolovaných proteínov sa našla dobrá zhoda.

Sekvencie prekrývajúcich sa oblastí /ISTI a 2ST2 sú identické po celej dĺžke s výnimkou jednej 120bp medzery v 2ST1. Špecifický otvorený čítací rámec pokračuje po oboch stranách tohto prerušenia v AST1 (obr. 6). Aby sa zistilo, či jedna alebo obidve formy cDNA predstavujú skutočnú mRNA, urobila sa PCR analýza s použitím primárov obklopujúcich túto medzeru na vzore cDNA odvodenom obrátenou transkripciou poly A + RNA z bravčových slinných žliaz. Týmto spôsobom sa detegovali amplifikované fragmenty PCR zodpovedajúce ÄST1 a Λ3Τ2 (údaje sa neuvádzajú). Produkty PCR sa subklonovali a sekvenovali na potvrdenie ich identity a zistilo sa, že l

obidva sú identické zodpovedajúcim oblastiam v ASTl a ^ST2. Priame klonovanie cDNa a aj výsledky amplifikácie PCR tak naznačujú, že existujú dva druhy a2,3 sialyltransferázy v bravčových slinných žl'azách, ktoré sa líšia prítomnosťou resp. neprítomnosťou 120bp inzercie v otvorenom čítacom rámci.

Predpokladaná velkosť proteínu sialyltransferázy (1029bp otvorený čítací rámec) je 39 kDa so štyrmi možnými N-väzbovými glykolyzačnýrai miestami (viď obr. 7) (Bouse, E., Biochem. J* 209. 331-336 (1983)). Využitím troch z týchto miest sa získa proteín s predpokladanou veľkosťou okolo 48 kDa , ktorá sa pozorovala pre Formu A izolovanej sialyltransferázy. Hoci amino-terminálna sekvencia obsahuje dva ATG kodóny v tesnej blízkosti, len prvý z nich leží v iniciačnom mieste silného konzervatívneho prenosu (Kozák, M., Celí 49, 283-292 (1986) a Kozák, M., Nuc. Acids Res. 12, 857-872 (1984)). Kyte-Doolittlova hydropatická analýza našla jednu potenciálnu membránu-premostujúcu oblasť pozostávajúcu zo 16 hydrofóbnych zvyškov, lokalizovanú 11 zvyškov od amino-konca (obr. 7). Tento štruktúrny detail naznačuje, že a2,3 sialyltransferáza má podobne, ako iné študované glykozyltransferázy, membránovú orientáciu typu II a že táto jedna hydrofóbna oblasť slúži ako neštiepitelná, amino-ukončená doména na zakotvenie signálu (Paulson, J.C. a Colley, K.J., J. Biol. Chem. 264, 17615-17618 (1989)).

Otvorený čítací rámec zakódovaný /STÍ a /ST2 obsahuje úplnú NH₂“terminálnu sekvenciou aminokyselín získanú z oboch foriem A i B a2,3-O sialyltransferázy. Ako je vidieť na obr. 6, NH₂-terminálna sekvencia Formy A sa nachádza 8 aminokyselín od predpokladaného štartovacieho miesta translácie otvoreného čítacieho rámca; zodpovedajúca NH ₂-u.končená sekvencia Formy B sa nachádza 27 aminokyselinových zvyškov ďalej v smere COOH-ukončenia proteínu. Pretože Forma B a2,3 sialyltransf erázy je plne katalytický aktívna. (Rearick, J.I. a kol., J. Biol. Chem. 254, 4444-4451 (1979)), sekvencia proteínu medzi predpokladaným iniciátorom metionínom enzýmu plnej dĺžky a amino-koncom Formy B nie je pravdepodobne potrebný z hľadiska enzymatickej aktivity. Proteolyticky citlivá oblasť a2,3~O sialyltransferázy, ktorá leží medzi doménou na zakotvenie signálu a katalytickou doménou, sa zdá byt kmeňovou oblasťou, ako bola definovaná pre skôr študované glykozyltransferázy (Weinstein, J. a kol.,, J. Biol. Chem. 262, 17735-17743 (1987) a Paulson, J.C. a Colley, K.J., J. Biol. Chem. 264, 17615-17618 (1989)).

> Ako už bolo opísané, dvadsať mg úplnej RNA z bravčových alebo krysích tkanív sa podrobilo elektroforéze na 1,0% agarózovom géli obsahujúcom 2,2 M formaldehydu (26) a prenieslo i

I ŕ

sa na nitrocelulózové filtre (Schleicher a Schuell). Nitroce- lulózové filtre sa hybridizova1i ³²P-značenými sondami cDNA a S premyli sa, ako už bolo opísané.

Príklad 3

Expresia rozpustnej bravčovej sialyltransferázy

Vylúčitelný chemický proteín sa vytvoril medzi predpokladanou katalytickou doménou a2,3-O sialyltransferázy a inzulínovou signálnou sekvenciou spojením C-konca 890bp klonu ^ST2 a M-terminálnej časti vektora pGIR-199 (Hsueh a kol., J. Biol. Chem. 261, 4940-4947 (1986)) na mieste Sac I , ktoré obsahoval čítací rámec oboch vektorov. Táto chiméra, sp-ST, sa podrobila digescii reštrikčnými enzýmami Nhe I a sma I, izoloval sa 1,0 kb fragment a subklonoval sa do pSVL (Pharmacic;) po digescii s Xba I a Sma I, ktoré štiepia miesta obsiahnuté v polylinkeri. Výsledná konštrukcia sa nazvala pSVL-spST a použila sa ako vektor pre prechodnú expresiu rozpustnej formy a2,3-O sialyltransferázy v bunkách COS-1. Superstočená DNA, pSVL-spST sa transfektovala do buniek COS-1 pomocou lipofektínu podľa postupu odporúčaného výrobcom. (60 mm kultivačná miska obsahujúca 50 % konfluentných buniek sa transfektovala s 5 μ9 DNA a 20 ml lipofektínového činidla). Štyridsaťosem hodín po transfekcii sa bunkové prostredie COS-1 oddelilo a 15-krát skoncentrovalo na filtroch Centricon 30 (Amicon) pre analýzu aktivity a2,3-O sialyltransferázy. Aktivita <x2,3-O sialyltransferázy sa stanovila pomocou nemrznúceho glykoproteínového akceptora podľa publikovanej metódy (Sadler a kol., J. Biol. Chem. 254, 4434-4443 (1979)).

Štyridsaťosem hodín po transfekcii s pSVL-spST sa bunky COS (60 mm kultivačná miska) premyli médiom bez met (DMEM, 5% fetálne teľacie sérum) (Gibco) a kultivovali sa v rovnakom prostredí 1 hodinu. Bunky sa pulzovo označili 150 mCi/150 pmol ³⁵S-met Express značkovacom (NEN) v 1,5 ml média bez met po dobu 2 hodín. Tieto bunky sa potom premyli PBS a preháňali 5 hodín v prostredí bez ³⁵S-met značkovača. Prostredie obsahujúce vylúčené proteíny sa oddelilo, skoncentrovalo 15-krát, spracovalo SDS-PAGE a analyzovalo flourografiou.

Ako sa už uviedlo, Forma B a2,3-O sialyltransferázy je enzyinaticky aktívny produkt proteolytického štiepenia enzýmu plnej dĺžky viazaného na membránu. Preto predpokladáme, že rozpustný chimerický proteín by si zachoval aktivitu a2,3-O sialyltransferázy, ak by obsahoval celú sekvenciu formy B. Na vytvorenie takéhoto rozpustného proteínu sa vybralo reštrikčné miesto nahor (protiprúdne) od NH₂-konca B-peptidovej sekvencie ako miesto spojenia /ST2 cDNA s vektorom kódujúcim inzulínovú signálnu sekvenciu pGIR-199. Ako je znázornené na obr. 9a, táto konštrukcia kóduje spojovací proteín, ktorý nazývame signálnym peptidom -ST (sp-ST) a ktorý pozostáva z inzulínovej signálnej sekvencie nasledovanej 9 aminokyselinami kódovanými linkerom pGIR, a úplnú prepokladanú katalytickú doménu a2,3-O sialyltransferázy. Očakávalo sa, že konštrukcia sp-ST riadi syntézu 38 kDa vylúčiteíného proteínu, ak sa transfektuje do hostiteľských buniek cicavcov. Podobná stratégia pre prípravu rozpustných foriem glykozyltransferáz sa už úspešne použila (Paulson, J.C. a Colley, K.J., J. Biol. Chem. 264., 17615-17618 (1989); Colley,

K.J. a kol. J. Biol. Chem. 264, 17619-17622 (1989); Larsen, R.D. a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87., 6674-6678 (1990 ) ).

Konštrukcia sp-ST sa umiestnila do expresného vektora pSVL a prechodne preniesla do buniek COS-1. Po 48 hodinách sa transfektované bunky udržiavali 2 hodiny v médiu obsahujúcom Trans³⁵S-značkovač, za čím nasledovalo 5 hodín preháňania v médiu bez značkovača; toto médium sa oddelilo, 15-krát skoncentrovalo a analyzovalo SDS-PAGE/fluorografiou. Obr. 9b ukazuje, že médium obsahuje významnú 38 kDa látku, sp-ST proteín očakávanej veľkosti. V paralelnej transfektovanej kultúre sa médium oddelilo 48 hodín po transfekcii, skoncentrovalo c £ í »

í.

f sa a analyzovalo na aktivitu a2,3-O sialyltransferázy. Ako [ ukazuje obr. 9c, prostredie z buniek transfektovaných s sp-ST ' obsahovalo milijednotky/ml sialyltransferázy, kým médium z imitovane transfektovaných buniek (slepého pokusu) nemalo významnú aktivitu.

Príklad 4

Izolácia a sekvenovanie sialyltransferázy z krysej pečene

Podobne ako iné glykozyltransferázy, ktoré sú proteínmi membrán endoplazmatického retikula a Golgího aparátu, sialyltransferázy patria k proteínom s nízkym výskytom, ktoré sa tažko izolujú. To vysvetľuje, prečo len dva členy tejto skupiny sa klonovali. Prvá sa izolovala Gaipi,3(4)GlcNAc α2,3-sialyltransferáza (a2,3-N) 800,000-násobným skoncentrovaním z pečene krysy v roku 1982 Weinsteinom a kol., pričom sa získalo okolo 10 μ9/η9 tkaniva (Weinstein, J. a kol., J. Biol. Chem. 257, 13835-13844 (1982) a Weinstein,

J. a kol., J. Biol. Chem. 13845-13853 (1982)). Hoci sa urobilo niekoľko pokusov o získanie informácií o sekvencii aminokyselín alebo vypestovať protilátky proti enzýmu pomocou konvenčných metód, tieto pokusy boli neúspešné, pretože sa dalo získať len malé množstvo zriedeného proteínu. Aj hmotnostné spektrometria hrá stále významnejšiu úlohu v riešení štruktúry biologicky dôležitých makromolekúl. Vývoj nových ionizačných metód a prístrojovej techniky rozšíril dostupný rozsah hmotnosti a citlivosť detekcie. Vysokorozlišovacia tandemová hmotnostné spektrometria sa stala účinnou technikou pre sekvenovanie proteínov (Mathews, W.R. a kol., J. Biol. Chem. 262, 7537-7545 (1987)), ako aj pre určenie posttranslačných a chemických modifikácií (Dever, T.E. a kol., J. Biol. Chem. 264, 20518-20525 (1989); Settineri, C.A. a kol., Biomed. Environ. Mass Spectrom. 19., 665-676 (1990); a DeWolf Jr., W.E. a kol., Biochem. 27, 90993-9101 (1988)). Z tohto dôvodu sa použila hmotnostné spektrometria na získa48 nie sekvencie aminokyselín sialyltransferázy.

Redukcia a karboxymetylácia

Približne 13 μ9 Gaipi,3(4)GlcNAc α2,3--sialyltransf erázy (a2,3N) sa prenieslo do 350 ml 30mM kakodylátu sodného (pH = 6,5), 100 mM NaCl 0,1% Triton CF-54 a 50% glycerolu. Pridali sa Tris.HCl (pH - 8,0), guanidín.HCl a ditiotreitol do konečnej koncentrácie 0,2 M, 6 M, resp. 7 mM. Redukcia sa vykonala pri 60 C pod argónom v čase 1,5 hodiny. K zmesi sa pridal jódacetát sodný (1,32 mg) v 2,5 ml 0,2 M Tris.HCl pufru. Alkylácia sa vykonala pri normálnej teplote pod argónovou atmosférou v tme, počas 1,5 hodiny.

Dialýza

Zredukovaná a karboxymetylovaná a2,3N sa dialyzovala oproti 4 litrom 50 mM N-etylmorfolxnacetátového tlmivého roztoku (pH = 8,1) pomocou mikrodialyzačného systému Bethesda Research Labs (BRL) s dialyzačnou membránou pripravenou BRL s hranicou molekulovej hmotnosti 12-14 kDa. Keď sa dialýza skončila, do dialyzačných komôr sa pridával 10% SDS, až sa dosiahla výsledná koncentrácia približne 0,1 %. Obsah komôr sa vysušil pomocou SpeedVac koncentrátora (Savant). Na odstránenie SDS sa vykonalo Konigsbergovo zrážanie (Konigsberg, W.H., Henderson, L., Methods in Enzymology 91, 254-259 (1993)).

Tryptická digescia

Vyzrážaná a2,3N sa rozpustila v digesčnom roztoku (100 mM Tris.HCl, 2M močovina, 1 mM CaCl₂, pH = 8,0), až sa dosiahla koncentrácia proteínu približne 2 mg/ml. a2,3N sa digerovala 10% trypsínom (w/w) (Boehringer-Mannheim, čistota pre sekvenovar.ie, rozpustený v 1 mM HCl) pri 37 ’C. Po 7 hodinách digescie sa k zmesi pridala ďalšia dávka trypsínu, až sa dosiahla konečná koncentrácia približne 13 %. Digescia sa zastavila po 18 hodinách. Produkt digescie sa rozdelil HPLC s reverznými fázami (ABI C18 stĺpec, 1,0 x 100 mm) s dodávacím systémom pre rozpúšťadlo ABI 140A. Rozpúšťadlom A bol

0,1% TFA vo vode. Rozpúšťadlom B bol 0,08% TFA v 70% acetonitr;i.le/30% vody. Systém pracoval pri rýchlosti prietoku 50 ml/min. Desať minút po nástreku sa obsah rozpúšťadla B zvýšil z 0 % na 50 % počas 90 minút a potom na 100 % počas 30 minút. Peptidy sa detegovali pomocou absorbančného detektora ABI 783Λ pracujúceho pri 215 nm. Niektoré z frakcií sa esterifikovali pomocou zmesi HCI/n-hexanol.

Hmotnostná spektrometria

Kvapalinová hmotnostndi spektrometria sekundárnych iónov (LSIMS) sa robila s pomocou hmotnostného spektrometra s dvojitou fokusáciou Kratos MS50S, ktorý bol vybavený zdrojom LSIMS a magnetom s vysokým polom. Približne jedna pätina každej zachytenej frakcie sa použila pre analýzu LSIMS. Ako kvapalná matrica sa použil jeden mikroliter zmesi glycerol/tioglycerol 1:1 okyslenej 1 % TFA. Vzorky sa zberali zo špičky sondy. Najintenzívnejší molekulový ión sa vybral pre kolízne indukovanú disociačnú analýzu (CID). Tieto experimenty sa vykonali na štvorsektorovom hmotnostnom spektrometri Kratos Concept IIHH vybavenom elektrooptickým multikanálovým array detektorom, ktorý je schopný zaznamenávať súčasne sekvenčné 4%-né segmenty hmotnostného rozsahu. Kolízna energia sa nastavila na 4 keV, kolíznym plynom bolo hélium a jeho tlak sa nastavil tak, aby znížil intenzitu iónu prekurzora na 30% jeho pôvodnej hodnoty. Použil sa zvyšok z každej vzorky s 1 ml vyššie uvedenej matrice. Údaje vysokoenergetickej CID sa interpretovali s pomocou počítača.

Tandemová hmotnostná spektrometria je účinnou metódou pre sekvenovanie proteínov, ktorá má určité výhody oproti bežnej Edmanovej technike. S touto technikou je možné sekvenovanie dokonca ekvimolárnych zmesí. Pre analýzu hmotnostnou spektrometriou sa niekolko prvých frakcií z HPLC esterifikovalo, aby sa zvýšila ich hydrofóbnost a tým zlepšilo ich rozprášenie (..Falick, A.M. a Maltby, D.A. , Anál. Biochem. 182, 165-169 (1989)). LSIMS analýza každej frakcie poskytla viacnásobné molekulové ióny, ktoré poukazovali na prítomnosť viac než jedného peptidu v každom z nich. Tridsať najintenzívnejších molekulových iónov sa použilo pre CID analýzu. V týchto experimentoch sa pík izotopu ¹²C sledovaného iónu selektuje v prvom hmotnostnom spektrometri. Iba jeho fragmenty z disociácie vyvolanej kolíziou s héliom v kolíznej bunke, ktorá je umiestnená medzi dvomi spektrometrami, sa detegujú v druhom hmotnostnom spektrometri. Pri disociačnej analýze indukovanej vysokoenergetickými zrážkami (CID) dochádza k fragmentácii hlavne pozdĺž peptidového reťazca. Tiež sa pozoruje viacnásobné štiepenie, t.j. fragmentácia bočných aminokyselinových reťazcov. Fragmentáciou pozdĺž peptidového reťazca vzniká séria iónov, ktoré sa líšia hmotnosťou zvyškov aminokyselín, čím sa dá zistiť sekvencia aminokyselín. Vysoká energia pri fragmentácii poskytuje dodatočnú informáciu o identite aminokyselín, čím sa potvrdzujú získané sekvencie a umožní sa rozlíšenie izobarického páru Leu/Ile (Johnson, S.R. a kol., Anál. Chem. 59, 2621-2625 (1987)). Fragmentácia bočných reťazcov sa pozoruje hlavne vtedy, keď sú v sekvencií bázické aminokyseliny, t.j. Arg, Lys alebo His (Johnson, R.S. a kol., Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 86, 137-154 (1988)).

Prednostná protonizácia bázických aminokyselinových zvyškov na N-konci alebo v jeho blízkosti väčšinou spôsobuje retenciu náboja na tomto konci molekuly. Peptidy obsahujúce bázické aminokyseliny na C-konci alebo v jeho blízkosti dávajú väčšinou C-terminálne fragmenty. Trypsín je teda výhodný pre počiatočnú digesciu. Interpretácia vysokoenergetických CID údajov nakoniec poskytla 14 sekvencií (viď Tabulka 2 a obr. 9). Analýzou CID spektier sa zistilo, že počas tryptickéj digescie prebiehajú niektoré bočné reakcie. Dva produkty rozkladu trypsínu sa identifikovali pri m/z 659,3 či 1153,6 (obr. 9). Z dôvodov dlhého inkubačného času a chýbajúceho vhodného lapača sa niektoré tryptické peptidy karbamylovali na svojich N-koncoch. Zatial čo takéto bočné reakcie by zamedzili Edmanovu degradáciu, N-terminálne modifikácie môžu byt dokonca užitočné pri hmotnostne-spektrometrickom sekvenovaní. CID analýza týchto modifikovaných peptidov bola skutočne užitočná pri potvrdení niektorých z vyššie uvedených sekvencií, pričom .'í 'i.

i

- 51 v jednom prípade umožnila rozlíšiť N-terminálny leucín a izoleucín (obr. 10).

Príklad 5

Sialyltransferáza z krysej pečene

PCR amplifikácia špecifickej sondy cDNA

Na základe sekvencii aminokyselín jedenástich zo štrnástich peptidov odvodených z a2,3N sa syntetizovalo 22 degenerovaných súborov oligonukleotidov so špirálami oboch zmyslov (Genosys). Východiskový PCR experiment sa navrhol na základe pozorovania, že peptid 11 a peptid 1 sú homológne s oblasťou lokalizovanou v blízkosti stredu už klonovanej sialyltransferázy, Gaipi,4GlcNAc α2,6-sialyltransferázy (Weinstein, J. a kol., J. Biol. Chem. 257. 13835-13844 (1982)) a vyššie opísanej a2,3-O (obr. 11). Urobili sa dve skupiny PCR experimentov s použitím buď priméru rovnakého zmyslu k peptidu 11 alebo priméru opačného zmyslu k peptidu 1 kombinovaného s oligonukleotidovými primérmi k iným peptidom a prvému vláknu cDNA syntetizovanému z úplnej RNA krysej pečene ako vzoru. Amplifikácia sa vykonala začínajúc so stupňom tavenia vzoru (5 minút pri 94 ’C), s pomocou súpravy GeneAmpTM pre amplifikáciu DNA s AmpliTaqTM DNA polymerázou (Perkin Elmer Cetus), 35-násobným cyklovaním, 1 minútu pri 94 ’C, 1 minútu pri 37 C a 2 minúty pri 72 ’C, a skončilo finálnym extenzným krokom (15 minút pri 72 ’C). Týmito PCR reakciami sa vytvorilo niekolko fragmentov cDNA. Za predpokladu, že peptidy 1 a 11 reprezentujú súvislý úsek aminokyselín, sa vykonal ďalší súbor PCR experimentov využívajúc stratégiu hniezdovania primérov (Mullis, K.B. a Faloona, F., Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987)) za účelom identifikácie špecifických fragmentov cDNA. Pomocou tohto prístupu sa .identifikoval špecifický fragment cDNA, llsense-14antisense (lls~14as). Fragment cDNA lls-14as sa klonoval v Bluescript plazmide (Stratagene) a sekvenoval pomocou univerzálnych pri52 mérov (Stratagene) a súpravy Sequenase Version 2.0 (USB).

Klor.ovanie sialyltransferázy

Z poly (A) + RNA z krysej pečene sa zostavila banka cDNA pomocou súpravy pre syntézu cDNA od firmy Pharmacia (Gubler, U. a Hoffman, B.J., Gene 2_5, 263-269 (1983)). cDNA iniciovaná oligo(dT) sa syntetizovala a naviazala na EcoRI-Notl linkery. cDNA sa potom naviazali na Xgt DNA štiepenú EcoRl (Promega). Po in vitro zbalení s extraktom zbalujúcim DNA (Stratagene) sa fágy naniesli na hostitelský kmeň E. coli C600 hfl- (Promega). Urobil sa screening približne 1 milióna plakov so sondou lls-14as cDNA (Gubler, U. a Hoffman, B.J., Gene 25. 263-269 (1983)). Dva pozitívne fágy (18-1 a 9-1) sa izolovali a subklonovali do Bluescript plazmidového vektora (Stratagene.) pre sekvenovanie.

Izolácia klonov cDNA

Pre screening proteínov na homológiu so známymi proteínmi sa použila Dayhoffova databáza proteínov.. Toto prehľadanie podalo prvý dôkaz homológie medzi a2,3-N a inými klonovanými sialyltransferázami. Touto analýzou sa zistilo, že peptid 11 (Tabuľka 2) je homológny so sekvenciou prítomnou v krysej i ľudskej β-galaktozid «2,6-sialyltransferáze (Tieto dva enzýmy sú z 80% konzervatívne, Gu, T.J. a kol., FEBS 275. 83-86 (1990) a Lance, P. a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164, 225-232 (1989)). Keď sa táto analýza rozšírila aj o sekvenciu bravčovej a2,3~O, našiel sa ďalší peptid, peptid 1 (Tabuľka 2), so sekvenciou v oboch klonovaných sialyltransf erázach. Porovnanie týchto peptidov so sekvenciami prítomnými v už klonovaných sialyltransferázach naznačujú, že tieto dva peptidy reprezentujú súvislý úsek aminokyselín, ktorý bol rozštiepený pri arginínovom zvyšku počas trypsínovej digescie (obr. 11).

Tabuľka 2

Sekvencie aminokyselín peptidov odvodených z Gaipi,3(4)GlcNAc a2,3 sialyltransferázy

Peptid	Sekvencia aminokyselín Poloha	zvyšku v Gal a2,3-ST (obr.4)
1	LeuAsnSerAlaProValLys	186-192
2	MetAlaAlalleLys	340-344
3	GluProProGluIleArg	264-269
4	GlyLysAspAsnLeuIleLys	130-136
5	LeuProAlaGluLeuAlaľhrLys	69-76
6	AlalleLeuSerValľhrLys	137-143
7	IleLeuAsnProTyr	270-274
8	LeuThrProAlaLeuAspSerLeuHisCysArg	147-157
9	ValSerAlaSerAspGlyPheTrpLys	247-255
10	ValIleThrAspLeuSerSerGlylle	366-374
11	IleAspAspTyrAspIleVallleArq	177-185
12	GluPheValProProPheGlylleLys	121-129
13	LeuGlyPheLeuLeuLys	59-64
14	AspSerLeuPheValLeuAlaGlyPheLys	222-231

Podčiarknuté sekvencie vykazujú homológiu s inými známymi enzým?, m i sialyltransferázy (25,26).

Aminokyselina vytlačená kurzívou je jedinou, ktorá sa nezhoduje so sekvenciou aminokyselín odvodených zo sekvencie nukleotidov Gal a2,3-ST cDNA.

Skutočnosť, že peptid 11 a peptid 1 prejavovali homológiu so sekvenciou už predtým identifikovanú ako konzervatívna oblast homológie v strede iných dvoch klonovaných sialyltransferáz, poskytla základ pre našu stratégiu klonovania (obr. 11). Predpokladali sme, že peptid 11 a peptid 1 by .mohli byt blízko stredu próteínu, takže sa navrhol experiment, ktorý vytvorí dlhú sondu cDNA. Na základe sekvencii aminokyselín 14 peptidov sialyltransferázy sa pre použitie v PCR experimentoch syntetizovali degenerované oligonukleotidové priméry jedného i druhého zmyslu. V týchto experimentoch primér 11 sense a 1 antisense sa skombinovali s inými primérmi v snahe amplifikovat dlhé fragmenty cDNA a2,3-N. V týchto experimentoch sa pomnožilo niekolko fragmentov cDNA. Za predpokladu, že peptid 11 a peptid 1 predstavujú súvislý úsek. aminokyselín, primér 11 a primér 1 sa použili v hniezdovanej stratégii (Mullis, K.B. a Fallona, F., Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987)) pre identifikáciu špecifických fragmentov cDNA. Fragment amplifikovaný s použitím primérov 11 sense a 14 antisense boli približne rovnakej veľkosti, ako fragment amplifikovaný s použitím primérov 1 sense a 14 antisense, čo naznačuje, že vytvorený fragment bol výsledkom špecifického účinku primérov a nie artefaktom.

Klonovanie a charakterizácia llsense-14 antisense fragmentu odhalilo, že peptid 11 a 1 sú skutočne kontinuálne. Porovnaním sekvencie fragmentu cDNA s dvomi klonovanými sialyltransf erázami (Weinstein, J. a kol., J. Biol. Chem. 262, 17735-17743 (1987)) sa zistilo, že homológia siaha od peptidu 1 cez 18 aminokyselín. Z dôvodu homológie predpokladáme, že cDNA fragment lls-14as sa pomnožil z mRNA sialyltransferázy. Sekvencia tiež naznačuje, že fragment cDNA nebol fragmentom Gal pi,4GlcNAc α2,6-sialyltransferázy, ktorej je veľa v krysej pečeni (Weinstein, J. a kol., J. Biol. Chem. 257, 13835-13844 (1982)).

Fragment lls-14as sa použil na screening oligo dT iniciovanej banky cDNA krysej pečene, z ktorej sa získali po screeningu 1 milióna plakov 2 pozitívne klony. Charakterizácia pozitívnych klonov ukázala, že kloň ST3N-1 obsahoval 2,1 Kb inzert, kým kloň ST3N-2 bol značne kratší, s dĺžkou iba 1,5 Kb. Northern analýza ukázala, že Gal a2,3-ST mRNA mala 2,5 Kb (viď nižšie), čo naznačuje, že kloň ST3N-1 by mohol obsahovať úplnú kódujúcu sekvenciu Gal a2,3-ST.

Primárna štruktúra α2,3-Ν sialyltransferázy

Sekvenčnou analýzou sa zistilo, že kloň ST3N-1 obsahoval úpný otvorený čítací rámec sialyltransferázy (obr. 2). Skladá sa z 82 bp 5'-neprenesenej oblasti, otvoreného čítacieho rámca dĺžky 1122 bp, 3¹-neprenesenej oblasti a poly (A) ukončenia. Otvorený čítací rámec klonu ST3N-1 kóduje protein s 374 aminokyselinami s predpokladanou molekulovou hmotnosťou 42033. S výnimkou jednej aminokyseliny kóduje otvorený čítací rámec každú zo 14 sekvencií peptidov získaných analýzou izolovanej sialyltransferázy hraotnostnou spektrometriou. To potvrdzuje, že cDNA klonu ST3N-1 je naozaj zhodná s cDNA sialyltransferázy. Ako sa pozorovalo pre iné klonované glykozyltransferázy (Paulson, J.C. a Colley, K.J., J. Biol. Chem. 264, 17615-17618 (1989)), prepokladá sa, že a2,3-N má krátke N-terminálne cytoplazmatické ukončenie, sekvenciu na zakotvenie signálu s približne 20 zvyškami a velkú C-terminálnu oblast, v ktorej je katalytická doména enzýmu.

Príklad 6

Expresia rozpustnej krysej sialyltransferázy

Na prípravu rozpustnej formy sialyltransferázy pre enzymatickú charakterizáciu sa vytvoril spojený protein obsahujúci katalytickú doménu enzýmu a štiepiteľnú inzulínovú signálnu sekvenciu v expresnom vektore cicavcov pSVL (Pharmacia). Katalytická doména sialyltransferázy sa pomnožila PCR pomocou priméru 5' v polohe +182 (obr. 11), nadol (po prúde) od transmembránovej domény a pomocou priméru 3' lokalizovaného v 3'UTR nahor od polyadenylačného miesta. Reakcie PCR sa vykonali podľa vyššie uvedeného postupu pri teplote 55’C. PCR produkt sa subklonoval na BamHI-EcoRI miesta pGIR-199 (dar K. Drickhamera), čoho dôsledkom bola fúzia sialyltransferázy do .rámca inzulínovej signálnej sekvencie, ktorá je v pGIR vektore (Huseh, E.C. a kol-, J. Biol. Chem. 261, 4940-4947 (1986)). Výsledný spojený protein sa zaviedol na Xba I-Sma

I miesta expresného vektora pSVL za vzniku expresného plazmidu pBD122.

Pre prechodnú expresiu v bunkách COS-1 sa expresný plazmid pBD122 (20 mg) transfektoval do buniek COS-1 na 100 mm miskách pomocou lipofektínu podlá pokynov výrobcu (BRL). Po 48 hodinách sa médium s bunkovou kultúrou oddelilo a skoncentrovalo pomocou mikrokoncentrátora Centricon 10. Koncentrované médium sa analyzovalo na aktifitu sialyltransf erázy pomocou oligosacharidov ako akceptorného substrátu. Prenos kyseliny sialovej na oligosacharidy sa sledoval pomocou ionexovej chromatografie (Sadler, J.E. a kol.,

J. Biol. Chem. 254, 5934-5941 (1979) a Paulson, J.C. a kol., J. Biol. Chem. 264, 10931-10934 (1989)).

Aby sa potvrdilo, že kloň ST3N-1 skutočne kóduje a2,3-N sialyltransferázu, uskutočnili sme expresiu klonu v bunkách COS-1. Sekvencia aminokyselín klonu ST3N-1 ukázala, že proteín obsahuje NH₂-terminálnu sekvenciu na zakotvenie signálu, o ktorej sa predpokladá, že zakotvuje enzým v Golgiho aparáte bunky (Paulson, J.C. a Colley, K.J., J. Biol. Chem. 264, 17615-17618 (1989)). Na uľahčenie funkčnej analýzy enzýmu sme sa snažili získat rozpustnú formu enzýmu, ktorý by sa po expresii mohol vylučovať z buniek. Vytvoril sa spojený proteín pomocou štiepitelnej inzulínovej signálnej sekvencie, ktorá nahradila sekvenciu so zakotveným signálom pri NH₂~konci sialyltransferázy. Po expresii plazmidu pBD122 v bunkách COS-1 sa z buniek vylučoval enzým a prejavoval aktivitu sialyltransferázy.

Enzymatické vlastnosti a2,3-N sialyltransferázy sa najprv charakterizovali pre izolovaný protein (Weinstein, J. a kol., J. Biol. Chem. 257, 13845-13853 (1982)). Zistilo sa, že využíva β-galaktozidové akceptory obsahujúce buď sekvenciu C^aipi, 3GlcNAc alebo Gaipi, 4GlcNAc, ktoré vytvárajú sekvencie NeuAcct2,3Gal31,3GlcNAc a NeuAca2,3Gal01,4GlcNAc, ktoré často ukončujú N-pripojené oligosacharidy komplexného typu.

- 57 Enzým vylučovaný bunkami, ktoré boli transfektované expresným plazmidom pBD122 boli schopné využívať β-galaktozidové akceptory obsahujúce buď sekvenciu Gaipi,3GlcNAc alebo Gaipi,4GlcNAc (Tabulka 2); bunky transfektované pôvodným vektorom nevylučovali takúto aktívnu sialyltransferázu. Vylučovaný enzým je schopný sialovat aj asialo-αΐ kyslý glykoproteín. Tieto údaje sa zhodujú s enzymatickými vlastnosťami izolovanej a2,3-N.

Príklad 7

Expresia a2,3-N sialyltransferázy v bakulovíruse

Terminálny tetrasacharidový sialylový Lewis^x (Sle^x: SAct?., 3Gal31,4GlcNAc[ al, 31^;'uc ] ) bol identifikovaný ako ligand pre P-selektín a E-selektín, a teda syntetický oligosacharid obsahujúci štruktúru SI.e^x je kandidátom pre blokovanie interakcií selektín-ligand. Úplná chemická syntéza SLe^x je technicky a ekonomicky náročná, ale použitie špecifických glykozyltransferáz na pripojenie koncovej kyseliny sialovej a fukózového zvyšku k základnému sacharidu syntetizovanému chemicky túto syntézu volného SLe^x ulahčuje. Gén kódujúci a2,3-N sialyltransferázu sa klonoval z banky cDNA krysej pečene a ukázalo sa, že má špecifickú aktivitu a2,3 (Gaipi,3/4GlcNAc) sialyltransferázy po expresii v transfektovaných bunkách C05-1 (Wen a kol., pripravovaný rukopis). Čast klonu cDNA kódujúca enzymatickú čast polypeptidu, ale s chýbajúcou doménou zakotvujúcou signál/membránu, sa pripojila k preinzulínovej signálnej sekvencií za vzniku cDNA kódujúcej rozpustný a vylúčitelný protein a2,3 NST. Táto cDNA sa klonovala v transfer vektore bakulovírusu a použila sa na transfekciu hmyzích buniek Sf-9 v prítomnosti bakulovírusovej DNA divokého typu. Rekombinantný vírus obsahujúci DNA a2,3-N sialyltransferázy sa izoloval a prečistil a použil na infekciu buniek Sf-9. Infikované bunky vylučovali do prostredia ot2,3 NST vo velkých množstvách a tento protein sa izoloval chromatografiou na io- 58 nexe .

Bunky Sf-9 sa zakúpili z ATCC. DNA vektory pGIR199 a BleuBac sa získali od J.C. Paulsona, resp. z Invitrogenu (San Diego, CA). Bunky Sf-9 sa pestovali v kultúre s hustotami 0,3 a 1,5 milióna buniek na mililiter v Graces Insect prostredí (dodávanom s 0,33% hydrolyzátu laktalbumínu a 0,33% kvasinkolátu), ktorý dodal Gibco (Grand Island, NY), spolu s 10% tepelne inaktivovaného séra teľacieho embrya (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Toto prostredie sa nazvalo GCMS+10%FCS.

Rozpustná forma a2,3-N sialyltransferázy sa pripravila nasledujúcim spôsobom. cDNA reprezentujúca úplnú mRNA a2,3-N sialyltransferázy sa použila ako vzor pre PCR používajúcu dva nukleotidy ako ampliméry, ktoré hybridizovali (5') práve v C-terminálnej polohe kombinovanej signálnej/zakotvujúcej oblasti enzýmu a (3') nahor od poly(A) adičného miesta v 3' neprenesenej oblasti. Obidva oligonukleotidy kódovali BamHI miesta na ich 5' koncoch, čím umožnili, aby produkty PCR sa klonovali v mieste BamHI pGIR199 pripojenom v rámci s preinzulínovou signálnou sekvenciou. Bočné miesta Nhel sa použili na umožnenie génovej fúzie a tento fragment cDNA sa klonoval v bakulovírusovom transfer vektore pBluebac, čo riadil bakulovírusový polyhedrínový promótor. Všetky rekombinantné DNA manipulácie sa vykonali za podmienok odporúčaných v inštrukciách ich výrobcov. pBluebac vektor obsahuje gén β-galaktozidázy E.coli riadený rozličnými bakulovírusovými promótormi, a tak vírusy po rekombinácii a prijatí vektora DNA môžu konvertovať chromofór X-gal na modrý produkt.

Vytvorenie rekorabinantného bakulovírusu sa urobilo s pomocou expresného systému MaxBac (Invitrogen) presne podlá protokolov odporúčaných výrobcom. V stručnosti, plazmid a DNA vírusu divokého typu sa zmiešali a použili na transfekciu buniek Sf-9 metódou fosforečnanu vápenatého. Transfektované e

bunky produkovali vírus a tento sa nanášal na kultivačné médium. Rekombinantný vírus sa identifikoval analýzou plakov «>!ij..

'τ podľa modrej farby vznikajúcej reakciou β-galaktozidázy na X-gal v plakoch pri koncentrácii 150 μg/ml, a izoloval sa od vírusu divokého typu opakovaným riedením a tvorbou plakov. Vyčistený vírus sa rozšíril do 500 ml infekciou čerstvých buniek Sf-9. Analyzovalo sa niekoľko klonov na schopnosť vylučovať a2,3-N sialyltransferázu do infikovaného bunkového prostredia skúšaním dávok prostredia priamo rádioaktívnou metódou popi saňoví nižšie.

Pre vypestovanie veľkých množstiev vírusu sa infikovalo 3.10⁶ buniek Sf-9 v 25 cm² tkaninovej kultivačnej nádobe v 5 ml GCMS + 10% FCS jedným modrým plakom bez vírusu divokého typu a nechalo sa rásť 5-7 dní pri tepote 27 ’C. Získaných 5 ml vírusu sa vyčírilo odstredením a ďalej sa expandovalo. Bunky Sf-9 v logaritmickej fáze rastu (0,5 - 1,5.10⁶ buniek/ml) sa infikovali pri koncentrácii 1.10⁷ buniek na ml pri multiplicite infekcie (moi) 1 za predpokladu titru vírusu 1.10⁸ jednotiek tvoriacich plaky (pfu) na mililiter v 5 ml látky. Bunky sa spätne 10-krát rozriedili v GCMS + 10%FCS a nechali rásť 5-7 dní pri 27 ’C. Získaný vírus sa vyčíril a jeho titer sa stanovil analýzou plakov, pričom väčšinou bol vyšší ako 10⁹ pfu/ml. Na expresiu a2,3-N sialyltransferázy sa 2,5.10⁹ buniek Sf-9 v logaritmickej fáze rastu nanieslo na všetky vrstvy Ten Tray Celí Factoru (Nunc, Naperville, IL), tu označovaného CF-10. Každý z CF-10 mal celkovú kultivačnú plochu 6000 cm² a bunky boli infikované rekombinantným bakulovírusom pri moi = 5 v objeme 300 ml. Po 1 hodinovej inkubácii sa pridal 1 liter bezsérového média Excell-400 (JRH Biosciences) a bunky sa inkubovali pri 27 ’C 72 hodín. Prostredie sa potom vyčírilo a pref iltrovalo cez 0,2μπι filter. Pridalo sa čerstvé médium (Excell 400 s prídavkom 2% séra teľacieho embrya) a bunky sa inkubovali pri 27 ’C ďalších 48 hodín, po čom sa médium zobralo, vyčírilo a prefiltrovalo.

Aktivita a2,3-N sialyltransferázy sa analyzovala modifikáciou už publikovanej metódy (Sadler a kol., 1979). 14 μg vzorky sa v 30 μΐ objeme zmiešalo s 3,5 μΐ lakto-N-tetrózy (Galj.il, 3GlcNAc01,3Gaipi,4Glc) a s 12,5 μΐ analytického činidla popísaného nižšie. Vzorky sa krátko pomiešali, odstredili ku dnu reakčnej skúmavky a inkubovali pri 37°C 10 minút. Reakčná zmes sa okamžite zriedila 1 ml 5mM fosfátového tlmivého roztoku s pH 6a naniesla sa na stĺpec 0,5 ml ionexu. To, čo prešlo cez stĺpec, spolu s 1 ml na premytie sa zachytilo do scintilačnej kyvety a počítali sa impulzy. Jednotka je definovaná ako množstvo enzýmu potrebné na prenos jedného mikromólu kyseliny sialovej na akceptor za minútu.

Vzorka obsahovala buď čistý supernatant alebo supernatant zriedený tak, aby sa reakcia udržala v lineárnom rozsahu, pri približnom výtoku zo stĺpca 10000 cpm. Analytické činidlo sa pripravilo vysušením 0,65 ml (50 uCi) [¹⁴ C]-CPM-kyseliny sialovej (NEN, Boston, MA) a jej suspendovaním vo 0,65 ml vody obsahujúcej 2,3 mg CMP-kyseliny sialovej. K tomuto sa pridalo 0,96 1 M tlmivého roztoku kakodylátu sodného s pH 6, 0,48 ml 20% Tritonu CF--54, 0,29 ml roztoku hovädzieho sérového albumínu (50 mg/ml) (všetko získané od firmy Sigma, St. Louis, MO) a vody do celkového objemu 8 ml. Stanovila sa merná aktivita tohto analytického činidla, rozdelilo sa na dávky a skladovalo pri -20 C. Použil sa ionex AG1-X8, 200-400 mesh, fosfátová forma (Bioraď, Richmond, CA).

Koncentrovanie a čistenie a2,3-N sialyltransferázy. Médium (1-3 litre) obsahujúce a2,3 NST sa sfiltrovalo a skoncentrovalo na približne 250 ml v špirálovom kazetovom systéme Amicon CH2PRS vybavenom kazetou S1Y10. Na odsolenie koncentrovaného supernatantu sa jednotka potom spustila v diafiltračnom móde s tromi objemami lOmM kyseliny kakodylovej, 25mM NaCl, 25% glycerolu s pH 5,3 (Tlmivý roztok A). Vzorky sa potom preniesli na stĺpec (2,5 x 17 cm) S-Sepharose Fast Flow (od firmy Pharmacia) nasýtený tlmivým ~roztokom A, pri rýchlosti prietoku 2 ml/min. Keď sa preniesla celá vzorka, stĺpec sa premýval tlmivým roztokom A dovtedy, kým OD₂₈g vytekajúceho roztoku sa vrátil na základnú líniu (1,6 objemov stĺpca). α2,3 NGT sa potom vymyla zo stĺpca roztokom 50 mM kyseliny kakodylovej, 1 M NaCl, 25% glycerolu s pH 6,5. Frakcie obsahujúce oc2,3 NST sa zachytili a dialyzovali cez noc oproti 1 1 zmesi 50 mM kyseliny kakodylovej, 0,5 M NaCl, 50% glycerolu s pH 6,0 a skladovali sa pri -80 ”C.

Príklad 8

Distribúcia a2,3-N sialyltransferázy v tkanivách krysy

Pre zistenie distibúcie klonovanej krysej a2,3-N sialyltransferázy v tkanivách sa izolovala úplná RNA z rozličných tkanív krysy a sondovala sa ³²P-označenou cDNA sialyltransferázy. Hybridizácia na mRNA o približne 2,5 Kb sa pozorovala vo všetkých testovaných tkanivách. Ako sa pozorovalo pre tieto dve klonované sialyltransferázy, a2,3-N sialyltransf eráza vykazuje rozdielne expresie v tkanivách krysy. Najvyššia hladina mRNA α2,3-sialyltransferázy sa našla v mozgu. Stredné hladiny expresie sa pozorovali v pečeni, obličkách, hrubom čreve, srdci, vaječníkoch a pľúcach, kým v slinných žľazách, slezine a tenkom čreve sa našli nízke hladiny mRNA. Naproti tomu sa najvyššia hladina mRNA Galfil, 4GlcNAc a2,6-sialyltransferázy (4,7 a 4,3 Kb, 41, 46) našla v krysej pečeni a v slinných žľazách, kým nízke hodnoty mRNA sa našli v srdci, vaječníkoch a mozgu.

Príklad 9

Konzervatívna oblasť homológie v katalytickej doméne

Konzervatívna oblasť skupiny sialyltransferáz - Porovnaním primárnych štruktúr troch klonovaných sialyltransferáz sa našla rozsiahla oblasť homológie (obr. 12). Táto oblasť sa skladá z 55 aminokyselín od zvyšku 156 po zvyšok 210 a2,3-N sialyltransferázy so 42% identických aminokyselín a 58% ami62 nokyselín zachovaných vo všetkých troch enzýmoch. Sekvencie týchto troch sialyltransferáz nemajú významnú homológiu mimo tejto oblasti. Pretože táto oblast homológie je lokalizovaná v blízkosti stredu katalytickej domény enzýmu, môže táto oblast reprezentovať konzervatívnu štruktúru potrebnú pre enzymatickú aktivitu týchto sialyltransferáz.,

Tri členy sialyltransferázovej skupiny glykozyltransferáz sa klonovali. Hoci 85% sekvencií troch klonovaných sialyltransferáz nemá významnú homológiu, oblast 55 aminokyselín v strede každej molekuly je vysoko konzervatívnych, čo naznačuje, že môže íst o proteínový motív skupiny sialyltransferáz. Proteínový motív je dobre uchovaná skupina aminokyselín v určitej oblasti. Iné zvyšky aminokyselín mimo tejto oblasti sa zvyčajne konzervujú slabo, takže v proteínoch obsahujúcich rovnaký motív je celková homológia nízka. Podlá tejto definície je konzervatívna oblast definovaná primárnou štruktúrou troch klonovaných sialyltransferáz motívom skupiny sialyltransferáz.

Proteínové motívy sa často zúčastňujú na katalýze a väzbe ligandov (Hodgman, T.C., Comput. Applic. Biosci. 5, 1-13 (1989); Bairoch, A., Prosíte: A Dictionary of Protein Sites and Patterns (Slovník miest a vzorov proteínov), 5.vyd, Ženevská univerzita (1990); a Sternberg, M.J.E., Náture 349. 111 (1991)). Všetky tri klonované sialyltransferázy katalyzujú prenos kyseliny sialovej z CMP-NeuAc vo väzbe a2,3 alebo a2,6 terminálnej galaktózy za vzniku nasledujúcich sekvencií:

NeuAca2,3 Gaipi,3(4)GlcNAc- (ST3N)

NeuAca2,3 Gal(31,3GlcNAc- (ST3O)

NeuAca2,3 Gaipi,4GlcNAc- (ST6N)

Všetky tri enzýmy majú rovnakú funkciu. Viac ako 50 % zvyškov v konzervatívnej oblasti sú bud polárne aminokyseliny alebo aminokyseliny s nábojom, čo je v súlade s tým, že sú na povrchu enzýmu. V tejto oblasti šest z týchto zvyškov s nábojom je rovnakých vo všetkých troch sialyltransferázach. Je velmi nápadné, že v jednom úseku konzervatívnej oblasti je sedem aminokyselinových zvyškov, ktoré sú identické pre všetky tri sialyltransferázy - Asp.Val.Gly.Ser.Lys.Thr.Thr (obr. 12 ) .

Príklad 10

Klonovanie novej sialyltransferázy s pomocou konzervatívnej oblasti homolóqie

Konzervatívna oblast homológie sa použila na klonovanie iného člena rodiny génov sialyltransferázy.

PCR klonovanie degenerovanými oligonukleotidmi

Syntetizovali sa dva degenerované nukleotidy zodpovedajúce 5' a 3' koncom konzervatívnej oblasti homológie (obr.13) (Genosys). Sekvencie primérov 5' a 3' boli 5^:GGAAGCTTTGSCRNMGSTGYRYCRTCGT, resp.

5¹CCGGATCCGGTRGTYTTNSNSCCACRTC (N=A+G+T+C, S=G+C, R A + G, M = A + C, Y = C + T). PCR experimenty sa vykonali so lOOpmol každého priméru a s cDNA prvého vlákna syntetizovaného z mozgu novorodenej krysy ako vzoru. Amplifikácia sa vykonala 30 cyklami teploty 94 “C po dobou 1 minúty, 37 ’C 1 minútu a 72 ’C 2 minúty. Po digescii s Bam Hl a Hind III sa produkty PCR subklonovali do týchto miest Bluescriptu KS (Stratagene, 11099 North Torrey Pines Road, LA Jolla, CA 92037). Subklony sa charakterizovali sekvenovaním primérom T3. Amplifikovaný fragment z jedného z týchto subklonov, SMI, sa použil v ďalšom na screening génu obsahujúceho SMI, ktorý kóduje sialyltransferázu.

Klonovanie génu obsahujúceho SMI

Náhodne iniciovaná DNA z mozgu novorodenej krysy sa naviazala na EcoRI-NotI linker, ktorý sa následne naviazal na ^gtio po digescii EcoRI. Vytvorená banka sa zbalila pomocou extraktu Stratagene Gigapack II a naniesla na E. coli C600 hfl. Urobil sa screening približne 10⁶ plakov s klonovaným fragmentom SMI PCR. Štyri klony STX1-4 sa izolovali a subklonovali do Nôti miesta Bluescriptu (Stratagene) pre ďalšiu analýzu.

Northern analýza

Úplná RNA z tkanív krysy sa pripravila pomocou publikovanej kyslej fenolickej procedúry (Chomoznsyi, P. a kol., Anál. Biochem. 162. 136-159 (1987)). Vzorky RNA boli izolované z krysích mláďat do štyroch dní od narodenia. Urobila sa elektroforéza RNA v 1% agarózovom géli obsahujúcom formaldehyd, preniesla sa do nitrocelulózy a hybridizovala sa podlá štandardného postupu (Krieger, M.: Gene transfer and expnession (Génový prenos a expresia), Stockton Press, New York, 1990). Škvrny sa skúšali fragmentom 900bp EcoRI izolovaným z STX1, čisteným na géli a rádioaktívne značkovaným.

Konštrukcia rozpustnej formy STX

Skrátená forma STX bez prvých 31 aminokyselín čítacieho rámca sa pripravila PCR amplifikáciou s 5' primérom obsahujúcim vnútrorámcové Ban Hl miesto a 3'primérom umiestneným 50 bp nadol od kodónu stp. Amplifikácia sa vykonala 30 cyklami teploty 94 ’C po dobu 1 minúty, 45 ’C 1 minútu a 72 ’C 2 minúty. Spojený vektor pGlR201 protA sa vytvoril inzerciou fragmentu BcII/Bam Hl izolovaného z pRIT5 (Pharmacia LKB Biotech,Inc., 1025 Atlantic Avenue, Suite 101, Alameda, CA 94501), ktorý kóduje IgG väzbovú doménu proteínu A do Bam Hl miesta pGIR201 (dar Dr. K. Drickamera, Columbia University). Amplifikovaný fragment sa subklonoval do Bam Hl miesta pGIR201protA, pričom prebehlo pripojenie STX k inzulínovej signálnej sekvencii a k proteínu A vo vektore. Fragment Nhe obsahujúci pripojený proteín sa subklonoval do plazmidu pSVL za vzniku expresného plazmidu AX78.

Expresia rozpustnej formy STX

Expresný plazmid AX78 (10 μg) sa transfektoval do buniek COS-1 v 10 cm miskách. Dva dni po transfekcii sa médium odobralo a inkubovalo s IgG sepharózou (Pharmacia) l hodinu pri normálnej teplote. Produkt sa analyzoval na aktivitu sialyltransferázy pomocou oligosacharidov, nemrznúceho glykoproteínu, zmesných gangliozidov a membrán mozgu krysích novorodencov po pôsobení neuraminidázy ako akceptorných substrátov. Prenos kyseliny sialovej na tieto akceptory sa meral pomocou ionexovej (Weinstein, J. a kol., J. Biol. Chem. 257, 13835-13844 (1982)), veľkostnej (id.) a zostupnej papierovej chromatografie (McCoy, R.D. a kol., J. Biol. Chem. 260, 12695-12699 (1985)).

Rovnaké transfekcie sa vykonali pre pulzovo značkované experimenty. Po 36 hodinovej expresii sa misky inkubovali pri 37 C s 2,5 ml DMEM-metionínu. Po 1 hodine sa pridalo k prostrediu 250uCi ³⁵S-značkovača (Amerhham, 2636 S. Clairebrook, Arlington Heights, IL 60005) a misky sa inkubovali ďalšie 3 hodiny. Na konci tohto času sa misky opláchli a inkubovali cez noc s kompletným DMEM. Označený spojený proteín sa izoloval inkubáciou s IgG sepharózou (Pharmacia). Po naviazaní sa produkt prepláchol, povaril v Laemalliovom vzorkovacom pufri a uvoľnený proteín sa analyzoval SDS-PAGE/fluorografiou.

PCR amplifikácia konzervovanej oblasti homológie príbuznej tej, ktorá sa našla v popisovaných sialyltransferázach.

Kým približne 70 % aminokyselín prítomných v konzervatívnej oblasti homológie je konzervatívnych, najväčšie súvislé konzervatívne oblasti sú v sekvenciách aminokyselín na koncoch konzervatívnej oblasti homológie (obr. 13). Zistilo sa, že sekvencia aminokyselín v blízkosti C-terminálneho 'konca konzervatívnej oblasti homológie obsahuje súvislý úsek siedmich invariantných zvyškov. Silná konzervatívnosť tejto sekvencie aminkyselín umožnila skonštruovať pomerne málo zložitý oligonukleotid s 256-násobnou degeneráciou, ktorý obsahuje všetky pozorované variácie v použití kodónu. Vytvorenie oligonukleotidu zodpovedajúcemu N-terminálnemu koncu konzervatívnej oblasti homológie bolo zložitejšie. Aminokyseliny v tejto oblasti prejavujú väčšiu variabilitu ako tie, ktoré sú na opačnom konci konzervatívnej oblasti homológie. Konštrukcia oligonukleotidu bola ďalej komplikovaná vysokou redundanciou aminokyselín kodónu. Aby sa kompenzovali tieto faktory, syntetizoval sa oligonukleotid z 5' konca konzervatívnej oblasti homológie s 1026-násobnou degeneráciou. Aj keď táto úroveň zložitosti je už blízko hranice degenerácie, ktorú umožňujú PCRE experimenty, výsledný primér zahrňoval všetky sekvencie nukleotidov, pre ktoré sa zistilo, že kódujú túto oblast konzervatívnej oblasti homológie.

Neurálny vývoj je zložitý proces, počas ktorého sa glykozyltransferázy dynamicky regulujú, čo je zrejmé z výrazných zmien v expresii glycidov na povrchu buniek. Z tohto dôvodu sa pre pokusy izolovať nové sialyltransferázy vybral mozog krysích novorodencov. S použitím cDNA z mozgu krysích novorodencov ako vzoru poskytli PCR experimenty s degenerovanými primérmi 150 bp pás, ktorý je v súhlase so známou vel’kostou konzervatívnej oblasti homológie. Subklonovaním a sekvenovanim sa zistilo, že pás bol zmesou dvoch fragmentov DNA. Z 30 charakterizovaných jedincov 56 % kódovalo a konzervatívnu oblast homológie; zvyšné klony kódovali zvláštnu konzervatívnu oblast homológie SMI. SMI obsahuje trochu prekvapujúco pät zmien v aminokyselinách, pre ktoré sa zistilo, že sú invariantné v troch už klonovaných sialyltransferázach. Keďže tieto zmeny znižujú celkový počet invariantných zvyškov, informácie z novej sekvencie získané charakterizáciou SMI zvyšujú celkovú konzervatívnosť sekvencie.

Predpokladaná sekvencia aminokyselín SMI neprejavuje podobnosť so žiadnou individuálnou konzervatívnou oblasťou homológie. V niektorých polohách (aminokyseliny 1, 2, 53, 54) je SMI podobná a2,6 konzervatívnej oblasti homológie; v iných polohách (aminokyseliny 8, 9, 54, 55) sa SMI podobá sekvenciám, ktoré sú v a2,3 konzervatívnej oblasti homológie. Pretože konzervatívna oblast homológie je z 85 % konzervatívna, táto rovnováha podobností vedie k tomu, že SMI je približne zo 45 % homológny s inými členmi skupiny génov sia67 lyltransferázy.

Primárna štruktúra génu obsahujúceho SMI

Sekvenčnou analýzou 1,5 kb klonu STX1 sa identifikoval

375 aminokyselinový otvorený čítací rámec, ktorý kóduje konzervovanú oblast homológie SMI, ktorá sa charakterizovala predchádzajúcimi PCR experimentami (obr. 14). Získaná

.. sekvencia aminokyselín STX1 naznačuje, že tento proteín je transmembránový proteín typu II, ako sa pozorovalo pri , všetkých ostatných klonovaných sialyltransferázach.

Predpokladaná sekvencia aminokyselín STX1 poukazuje na prítomnosť hydrofóbnej oblasti 8 zvyškov od amino konca proteínu, ktorý by mohol služit ako doména na zakotvenie signálu. Konzervatívna oblast homológie je lokalizovaná v blízkosti stredu proteínu. Celková veľkosť proteínu STX a relatívna poloha hydrofóbnej oblasti a konzervatívnej oblasti homológie silzie pripomínajú primárne sekvenčné vlastnosti klonovaných sialyltransferáz. Hoci STX neprejavuje žiadnu inú homológiu s klonovanými sialyltransferázami než je konzervatívna oblast homológie, spomínaná štruktúrna podobnosť týchto génov znamená, že STX je najnovším členom tejto skupiny génov.

Enzymatická charakterizácia STX

Prirodzene sa vyskytujúce rozpustné formy sialyltransferázy sa nachádzajú v rozličných sekrétoch a v telesných tekutinách (Paulson, J.C. a kol., J. Biol. Chem. 252, 2356-2367 (1977) a Hudgin, R.L. a kol., Can J. Biochem. 49, 829-837 (1971)). Tieto rozpustné formy vznikajú protolytickou di* ‘•ý gesciou, ktorá štiepi kmeňovú oblast sialyltransferázy a tým uvolňuje katalytickú doménu od transmembránového zakotvenia. Rozpustné sialyltransferázy sa môžu vytvárať rekombinantne nahradením endogénnej domény pre zakotvenie signálu štiepiteľnou signálnou sekvenciou (Colley, K.J. a kol., J. Biol. Chem. 264. 17619-17622 (1989)). Na uľahčenie funkčnej analýzy •STX sa vytvorila rozpustná forma proteínu nahradením prvých 31 aminokyselín šitepitelnou inzulínovou signálnou sekvenciou a IgG väzbovou doménou proteínu A. Väzbová doména IgG sa za68 viedla do konštrukcie s cieľom detegovat rozpustný proteín STX. Podobné spojené proteíny s ST3N sa aktívne vylučujú z expresných buniek, sú viazané IgG sepharózou a sú enzymaticky aktívne. Keď sa urobila expresia plazmidu obsahujúceho spojenie proteín A/STX (AX78) v bunkách COS-1, izoloval sa 85 kDa proteín. Veľkosť spojeného proteínu je približne o 15 kDa väčšia, ako predpokladaná molekulová hmotnosť polypeptidu, čo naznačuje, že sa využíva viac potenciálnych N-väzbových glykozylačných miest STX.

Viazaný spojený proteín sa analyzoval na aktivitu sialyltransferázy pomocou niekoľkých akceptorných substrátov. V prípade β-galaktozidného akceptora obsahujúceho Gaipi,3(4) GlcNAc sekvenciou sa nepozorovala žiadna aktivita. Taktiež sa nepozoroval prenos kyseliny sialovej na O-väzbové oligosacharidy nemrznúceho glykoproteínu. Expresia STX v mozgovom tkanive naznačuje, že tento gén by sa mohol zúčastňovať biosyntézy glykolipidov; zmesné gangliozidy izolované z hovädzieho mozgu však nefungovali ako akceptorný substrát. Membrány mozgu novorodencov po pôsobení neuroamidázy boli jediným substrátom, ktorý prejavoval len slabú schopnosť slúžiť ako akceptor. Inkubácia týchto membrán so spojeným STX proteínom spôsobila iba 50 % zvýšenie aktivity voči pozadiu.

Vývojové a tkanivovo-špecifické expresie STX

Pre určenie spôsobu expresie a velkosti správy génu STX sa Northern škvrny skúšali fragmentom 900bp EcoRI izolovaným z STX1. Z rozličných študovaných tkanív bola hybridizácia 5,5kb správy pozorovaná len v RNA z krysieho mozgu. Nepozorovala sa žiadna krížová hybridizácia príbuzných konzervatívnych oblastí homológie. Obmedzená expresia STX je odchýlkou od rozličných tkanivovo-špecifických expresii, ktoré sa pozorovali pre študované sialyltransferázy. Keďže každý z týchto génov je riadený nezávisle, čo vedie k rozličným ^spôsobom expresie v rozličných tkanivách, vo všeobecnosti expresia každej sialyltransferázy je rôzna v odlišných tkanivách (Paulson, J.C. a kol. J. Biol. Chem. 264. 10931-10934 (1989)). Naproti tomu expresia STX prebieha len v mozgu novorodencov. Nezdá sa však, že expresia by bola všeobecným embryonickým javom, pretože v obličke novorodencov sa nepozorovala žiadna odozva.

Claims (39)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sialyltransferáza v podstate bez substancií nachádzajúcich sa v in vivo fyziologickom prostredí s výhradou, že sialyltransferáza je iná, ako krysia Ga'lpl, 4GlcNAc a2,6 sialyltransferáza.
2. 2. Sialyltransferáza podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že je rozpustná vo vode.
3. 3. Sialyltransferáza podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že vopred určený aminokyselinový zvyšok je. substituovaný, pridaný alebo eliminovaný,
4. 4. Sialyltransferáza podlá nároku 3, vyznačujúca sa tým, že amino terminálna transmerabránová doména je eliminovaná.
5. 5. Sialyltransferáza podlá nároku 3, vyznačujúca sa tým, že amino terminálna cytoplazmatická doména je eliminovaná.
6. 6. Sialyltransferáza podlá nároku 3, vyznačujúca sa tým, že domény amino terminálnej transmembránovej, cytoplazmatickej a kmeňovej oblasti sú eliminované.

   f
7. 7. Sialyltransferáza podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že je bez sprievodnej natívnej glykozylácie s výhradou, že sialyltransferáza je iná, ako krysia Gaipi,4GlcNAc a2,6 sialyltransferáza.
8. 8. Izolovaná DNA frakcia kódujúca sialyltransferázu s výhradou, že je iná ako krysia Gaipi,4GlcNAc a2,6 sialyltransferáza .
9. 9. Izolovaná DNA frakcia podlá nároku 8, vyznačujúca sa tým, « že neobsahuje introny sialyltransferázy.

   - 71
10. 10. Izolovaná frakcia DNA podlá nároku 8, vyznačujúca sa tým, že. neobsahuje genomickú DNA kódujúcu iný peptid, ktorého DNA je z toho istého živočíšneho druhu, ako izolovaná frakcia DNA.
11. 11. Izolovaná frakcia DNA podlá nároku 8, vyznačujúca sa tým, že v ňom DNA kóduje sialyltransferázu s konzervatívnou oblasťou homológie zloženou z najmenej asi 20 aminokyselín.
12. 12. Izolovaná frakcia DNA podlá nároku 8, vyznačujúca sa tým, že v nej DNA kódujúca sialyltransferázu má konzervatívnu oblasť homológie sialyltransferázy zloženú najmenej z asi 5 aminokyselín heptapeptidu -Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thr.
13. 13. Izolovaná frakcia DNA podlá nároku 12, vyznačujúca sa tým, že jej konzervatívna oblasť homológie je zložená najmenej z približne heptapeptidového motívu vybratého z aminokyselinových zvyškov 156 - 210 sekvencie aminokyselín na obr. 2.
14. 14. Izolovaná frakcia DNA póla nároku 13, vyznačujúca sa tým, že jej heptapeptidový motív je -Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thr.
15. 15. Izolovaná frakcia DNA podlá nároku 12, vyznačujúca sa tým, že jej konzervatívna oblasť je zložená najmenej z približne heptapeptidového motívu vybratého z aminokyselinových zvyškov 142 - 196 sekvencie aminokyselín na obr. 1.
16. 16. Izolovaná frakcia DNA podlá nároku 15, vyznačujúca sa tým, že jej heptapeptidový motív je -Asp-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thr.

    «
17. 17. Izolovaná frakcia DNA podlá nároku 8, vyznačujúca sa tým,

    ÄJ<Cás?. .

    72 že DNA sialyltransferáza má konzervatívnu oblasť homológie zloženú z najmenej asi 48 aminokyselín.
18. 18. Izolovaná frakcia DNA podlá nároku 17, vyznačujúca sa tým, že konzervatívna oblasť homológie zložená z najmenej asi 55 aminokyselín je vybraná z aminokyselinových zvyškov 156 - 210 sekvencie aminokyselín na obr. 2.
19. 19. Rekombinantný expresný vektor, vyznačujúci sa tým, že obsahuje DNA kódujúcu sialyltransferázu s výhradou, že uvedená sialyltransferáza nie je krysia Gaipi,4GlcNAc a2,6 sialyltransferáza.
20. 20. Sústava, vyznačujúca sa tým, že obsahuje bunku transformovanú rekombinantným vektorom podlá nároku 19.
21. 21. Sústava podlá nároku 20, vyznačujúca sa tým, že bunka je eukaryotická bunka.
22. 22. Spôsob prípravy sialyltransferázy, vyznačujúci sa tým, že pozostáva z krokov vytvorenia vektora s DNA kódujúcou sialyltransferázu, transformovania hostitelskej bunky vektorom a z kultivovania transformovanej bunky s výhradou, že táto sialyltransferáza nie je ΰθΐβΐ,4GlcNAc a2,6 s.Lalyltransferáza.
23. 23. Spôsob podlá nároku 22, vyznačujúci sa. tým, že naviac zahrňuje krok izolovania uvedenej sialyltransferázy.
24. 24. Spôsob podlá nároku 23, vyznačujúci sa tým, že hostitelská bunka je eukaryotická bunka.
25. 25. Spôsob podlá nároku 24, vyznačujúci sa tým, že eukaryotická bunka je bunková línia COS.

    «
26. 26. Spôsob podlá nároku 24, vyznačujúci sa tým, že eukaryoΛ/aTL/i. s& ·

    - 73 ti oká bunka je bunková .línia obličky íudského embrya.
27. 27. Izolovaná frakcia DNA kódujúca polypeptid s aminokyselinovou sekvenciou uvedenou na obr. 1 alebo na obr. 2.
28. 28. Spôsob prípravy DNA kódujúcej sialyltransferázu, vyznačujúci sa tým, že sa skladá z:

    a. prípravy oligonukleotidových sond zodpovedajúcich konzervatívnej oblasti homológie sialyltransferázy;

    b. screeningu banky DNA hybridizáciou pomocou oligonukleotidových sond ;

    c. detekcie hybridizácie z kroku b; a

    d. izolácie produktu z kroku c.
29. 29. Spôsob podlá nároku 28, vyznačujúci sa tým, že oligonukleotidová sonda má sekvenciu nukleotidov kódujúcu Λορ-Val-Gly-Ser-Lys-Thr-Thr alebo jej varianty.
30. 30. Spôsob získania DNA kódujúcej sialyltransferázu, vyznačujúci sa tým, že sa skladá z:

    a) konštruovania banky nukleových kyselín obsahujúcej gén kódujúci sialyltransferázu;

    b) amplifikácie DNA kódujúcej sialyltransferázu s použitím polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) pomocou priméru, ktorý sa viaže na páry bázy kódujúcej najmenej asi 5 aminokyselín heptapeptidu v konzervatívnej oblasti homológie;

    c) subklonovania PCR produktov do vhodného vektora;

    d) sekvenovania jednotlivých PCR klonov, aby sa identifikovala konzervatívna oblasť homológie obsahujúca klony;

    e) screeningu banky nukleových kyselín pomocou produktu z kroku (d); a

    f) izolovania produktu z kroku e).

    t
31. 31. Izolovaná frakcia DNA podía nároku 8, vyznačujúca sa tým,

    - 74 že najmenej 17 zo 48 aminokyselín sekvencie 156-210 na obr. 2 je konzervatívnych.
32. 32. Izolovaná frakcia DNA podlá nároku 8, vyznačujúca sa tým, že najmenej 17 zo 48 aminokyselín sekvencie 142-196 na obr. 1 je konzervatívnych.
33. 33. Sialyltransferáza podlá nároku 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje sekvenciu aminokyselín, ktorá je uvedená na obr.

    14.
34. 34. Izolovaná frakcia DNA podlá nároku 8, vyznačujúca sa tým, že obsahuje sekvenciu nukleotidov, ktorá je uvedená na obr. 14.
35. 35. Rekombinantný expresný vektor podlá nároku 19, vyznačujúci sa tým, že uvedená DNA obsahuje sekvenciu nukleotidov, ktorá je znázornená na obr. 14.
36. 36. Sústava, vyznačujúca sa tým, že obsahuje bunku transformovanú rekombinantným expresným vektorom podlá nároku

    35.
37. 37. Spôsob podlá nároku 22, vyznačujúci sa tým, že uvedená DNA obsahuje sekvenciu nukleotidov, ktorá je znázornená na obr. 14.
38. 38. Fragment DNA kódujúci konzervatívnu oblasť homológie.
39. 39. Fragment DNA podlá nároku 38, vyznačujúci sa tým, že obsahuje sekvenciu nukleotidov, ktorá je uvedená na obr.