SE535010C2 - Förfarande för förbättring av groning av embryon från tillverkat frö - Google Patents

Description

535 010 2 Vid en utföringsform inbegriper skottbegränsningen dessutom ett adsorbentmaterial i håligheten. Vid en utföringsform är adsorbentmaterialeti håligheten träkol. Vid en utföringsform är adsorbentmaterialet i håligheten ett näringsämnesbehandlat träkol. l en annan aspekt tillhandahålls med föreliggande uppfinning förfaran- den för förbättring av groningen av ett växtembryo med utgångspunkt fràn ett tillverkat frö. Vid en utföringsform inbegriper förfarandet stegen av (a) sam- mansättning av ett tillverkat frö inbegripande ett fröhölje och en skottbegräns- ning, varvid skottbegränsningen inbegriper en hålighet; (b) tillsättning av nä- ringsmedium inbegripande ett adsorbentmaterial till fröhöljet, varvid adsor- bentmaterialet förekommer i mediet i en koncentration av från cirka 30 g/l till cirka 100 g/l; (c) placering av ett växtembryo i skottbegränsningens hålighet; och (d) odling av det tillverkade fröet vid betingelser som är lämpliga för gro- ning av växtembryot.

Vid en utföringsform inbegriper förfarandet stegen av (a) sammansätt- ning av ett tillverkat frö inbegripande ett fröhölje och en begränsning, varvid begränsningen inbegriper en hålighet; (b) tillsättning av näringsmedium in- begripande ett adsorbentmaterial till fröhöljet, varvid adsorbentmaterialet före- kommeri mediet i en koncentration av frän cirka 30 g/l till cirka 100 g/l; (c) placering av ett växtembryo i begränsningens hålighet; (d) tillsättning av ett adsorbentmaterial till håligheten; och (e) odling av det tillverkade fröet vid betingelser som är lämpliga för groning av växtembryot.

Det bör inses att turordningen av stegen vid förfarandet kan förändras utan att man frångår uppfinningens innebörd. Ett adsorbentmaterial kan tex placeras i begränsningens hålighet innan embryot placeras i begränsningen.

Beskrivning av ritningarna Ovanstående aspekter och många av de åtföljande fördelarna med föreliggande uppfinning framgår tydligare och inses lättare genom hänvisning till efterföljande beskrivning, betraktad tillsammans med de åtföljande rit- ningama. l FlGUR 1 visas i tvärsnittsvy ett exempel på ett tillverkat frö inbegri- pande ett embryo för användning vid förfarandena enligt föreliggande upp- finning. 10 15 20 25 30 535 CVIÜ 3 I FIGUR 2 visas ett diagram över graderna av groning av embryon som placerats i ett tillverkat frö i relation tiil ökande mängder av träkol i närings- mediet. Observationer gjordes 19 dagar efter såning.

I FIGUR 3 visas ett diagram över graderna av groning av embryon som placerats i ett tillverkat frö i relation till ökande mängder av träkol i närings- mediet. Observationer gjordes 26 dagar efter såning.

I FIGUR 4 visas ett diagram över organlängder för embryon som place- rats i ett tillverkat frö i relation till ökande mängder träkol i näringsmediet. Ob- servationer gjordes 35 dagar efter såning.

I FIGUR 5 visas ett diagram över förekomsten av embryon som place- rats i ett tillverkat frö i relation till ökande mängder av träkol i näringsmedlet.

Observationer gjordes 35 dagar efter såning.

Detaljerad beskrivning Såvida inget annat specifikt definieras har alla här använda uttryck samma innebörd som de skulle ha för fackmannen på området för föreliggan- de uppfinning.

Såvida inget annat anges, avser samtliga koncentrationsvärden som är uttryckta i procent vikt per volymsenhet.

I en aspekt tillhandahålls med föreliggande uppfinning ett tillverkat frö inbegripande (a) ett fröhölje; (b) ett näringsmedium inbegripande ett adsor- bentmaterial, varvid adsorbentmaterialet förekommer i mediet i en koncentra- tion av från cirka 30 g/l till cirka 100 g/l (t ex frän cirka 50 g/l till cirka 100 g/l, från cirka 60 g/l till cirka 100 g/l, eller frän cirka 75 g/l till cirka 100 g/|); och (c) en skottbegränsning, varvid skottbegränsningen inbegriper en hålighet. Vid en utföringsform inbegriper det tillverkade fröet dessutom ett växtembryo.

FIGUR 1 visas i tvärsnittsvy ett exempel på ett tillverkat frö 20 inbe- gripande ett växtembryo 42 placerat däri. Såsom visas i FIGUR 1 är embryot 42 placerat inuti en hålighet 34, står i funktionell kontakt med ett närings- medium 26 och är på lämpligt sätt inneslutet däri med hjälp av en levande ändtillslutning 43. Det inses att F IGUR 1 tillhandahåller en representatlv ut- föringsform av ett tillverkat frö 20, men förfarandet enligt uppfinningen är inte begränsat till den särskilda utföringsform av det tillverkade fröet som visas i FIGUR 1. I det i FIGUR 1 visade exemplet på utföringsform inbegriper det 10 15 20 25 30 535 010 4 tillverkade fröet 20 ett fröhölje 24, ett näringsmedium 26, en bottenförslutning 28 och en eventuell skottbegränsning 22.

Det här använda uttrycket ”fröhölje” hänför sig till en struktur som är analog med den för ett naturligt fröhölje som skyddar växtembryot och andra inre strukturer hos det tillverkade fröet fràn mekanisk skada, uttorkning, attack av mikrober, svampar, insekter, nematoder, fåglar och andra patogener, her- bivorer och skadedjur, för att nämna några funktioner. Fröhöljet 24 kan vara tillverkat av ett flertal material inkluderande, dock inte begränsade till, cellulo- samaterial, glas, plast, formbar plast, härdade polymerhartser, paraffin, vaxer, lacker och kombinationer därav, såsom ett vaximpregnerat papper. Materia- len av vilka fröhöljet är tillverkat är i allmänhet icke-toxiska och ger en grad av styvhet. Fröhöljet kan vara bionedbrytbart, även om fröhöljet vanligtvis förblir intakt och beständigt mot penetrering av växtpatogener tills efter emergensen av det groende embryot. Fröhöljet kan vara format med utgångspunkt från en del av ett rörformigt material. Fröhöljet kan vara ett avkllppt sugrör av fiber- material, såsom papper. Sugrörsdelarna kan vara förbehandlade i ett lämpligt beläggningsmaterial, såsom vax. Alternativt kan fröhöljet vara format med ut- gångspunkt från en rörforrnig del av ett bionedbrytbart plastmaterial. Ett så- dant material är polymjölksyra ("PLA”), som säljs av NAT-UR i Los Angeles, Kalifornien. Ett annat lämpligt material är en polykaprolakton (“PCL”) bland- ning, såsom CAPA 6800 (Perstorp Polyols lnc., Toledo, Oklahoma 43612) med eller utan ett mjukningsmedel i form av 1% Tegomer H Sl644O (Degussa Goldschmidt Chemical Corp, 914 East Randolph Road, Hopewell, Virginia 23860). Sådana bionedbrytbara plaströr kräver eller kräver ej en vaxbelägg- ning, eftersom sådana rör redan är beständiga mot omgivande element. Till- satser, såsom antibiotika och växttillväxtregulatorer, kan tex sättas till frö- höljet genom införlivning däri för åstadkommande av ett eller flera skikt av frö- höljet eller genom beläggning eller på annat vis behandling av skiktet eller skikten med tillsatsen med hjälp av konventionella medel.

Med hänvisning till de tillverkade fröerna och förfarandena enligt upp- finningen står näringsmediet 26 i funktionell kontakt med växtembryot som är placerat i det tillverkade fröet 20. Det här använda uttrycket ”näringsmedium” hänför sig till en näringsämneskälla, såsom vitaminer, mineraler, kol och 10 15 20 25 30 535 010 5 energikällor, och andra fördelaktiga föreningar som används av embryot un- der groningen. Näringsmediet 26 är således analogt med gametofyten hos ett naturligt frö. Ett näringsmedium 26 enligt uppfinningen kan inkludera ett ämne som gör att mediet blir halvfast eller har en stelnad konsistens vid normala omgivande betingelser. Vanligtvis förekommer näringsmediet 26 i form av en hydratiserad gel. En "gel" är ett ämne som bereds som en kolloidal lösning och som bildar eller kan bringas att bilda ett halvfast material. En sådan om- vandling av en flytande gellösning till ett halvfast material benämns här "härd- ning” eller ”stelning” av gelen. Uttrycket ”hydratiserad gel” hänför sig till en vatteninnehållande gel. Sådana geler framställs genom först upplösning i vat- ten (där vattnet fungerar som lösningsmedel eller ”kontinuerlig fas") av ett hydrofilt polymert ämne (som fungerar som löst ämne eller ”dispers fas"), som vid härdning kombineras med den kontinuerliga fasen för bildning av det halv- fasta materialet. Vattnet blir således homogent associerat med de upplösta molekylerna utan någon betydande separation av den kontinuerliga fasen från den dispersa fasen. Vattenmolekyler kan emellertid fritt avlägsnas från en härdad hydratiserad gel, såsom genom förångning eller uppsugning av ett groende embryo. I härdat tillstånd har dessa geler egenskapen av eftergivliga fastämnen, såsom en gelatinmassa, där eftergivligheten gradvis minskar och gelen blir mer "fast" vid beröring när den relativa mängden av vatten i gelen minskar.

Förutom att vara vattenlösliga är lämpliga lösta ämnen för gelen varken cytotoxiska eller väsentligen fytotoxiska. Det här använda uttrycket "väsentli- gen icke-fytotoxiskt" ämne är ett ämne som inte på något betydande sätt interfererar med normal växtutveckling, såsom genom att avdöda ett betydan- de antal växtceller, väsentligen förändra den cellulära differentieringen eller mognaden, orsaka mutationer, förstöra ett betydande antal cellmembraner eller på ett betydande sätt avbryta den cellulära metabolismen eller på ett betydande sätt avbryta någon annan process.

Lämpliga lösta ämnen för gelen inkluderar, men är inte begränsade till, följande: natriumalginat, agar, agaros, amylos, pektin, dextran, gelatin, stär- kelse, amylopektin, modifierade cellulosor, såsom metylcellulosa och hydroxi- etylcellulosa, och polyakrylamid. Andra hydrofila lösta ämnen i gelen kan ock- 10 15 20 25 30 535 010 6 så användas, så länge som de har liknande hydratiserings- och gelnings- egenskaper och saknar toxicitet.

Gelerna bereds vanligtvis genom upplösning av ett ämne som ska lösas i gelen, vanligtvis i en fin partikelform, i vatten för bildning av en gellös- ning. Beroende pä det särskilda ämnet som ska lösas i gelen är upphettning vanligtvis nödvändig, ibland ända till kokning, innan ämnet som ska lösas i gelen löses upp. Efterföljande kylning gör att många gellösningar ”stelnar” eller "härdas" reversibelt (gelas). Exempel inkluderar gelatin, agar och aga- ros. Sådana lösta ämnen i gelen benämns "reversibla", eftersom återupp- hettning av en härdad gel återbildar gellösningen. Lösningar av andra lösta ämnen i gelen kräver ett ”komplexbildande” ämne, som tjänar till att kemiskt härda gelen genom tvärbindning av lösta molekyler i gelen. Natriumalginat härdas t ex genom tillsättning av kalciumnitrat (Ca(NO3)2) eller salter av andra tvävärda joner till gellösningen, såsom, dock utan begränsning till, kalcium, barium, bly, koppar, strontium, kadmium, zink, nickel, kobolt, magnesium och jäm. Många av de lösta ämnena i gelen som kräver komplexbildande medel härdas irreversibelt, varvid återupphettning inte återetablerar gellösningen.

Koncentrationen av det lösta ämnet i gelen varierar beroende på det särskilda Iösämnet för gelen. En användbar koncentration av natriumalginat ligger t ex inom ett område av cirka O,5% till cirka 2,5% (vikt/volym), före- trädesvis cirka 0,9% till 1,5% (vikt/volym). En användbar koncentration av agar ligger i området cirka O,8% till cirka 2,5% (vikt/volym), företrädesvis cirka 1,8% (vikt/volym). Geler som härdats genom komplexbildning kräver i allmän- het mindre löst ämne för gelen för bildning av en tillfredsställande gel jämfört med ”reversibla” geler.

Näringsmediet 26 inbegriper vanligtvis en eller flera kolkällor, ett adsor- bentmaterial, vitaminer och mineraler. Lämpliga kolkällor inkluderar, men är inte begränsade till, monosackarider, disackarider och/eller stärkelser. Lämp- liga adsorbentmaterial inkluderar, men är inte begränsade till, träkol, poly- vinylpolypyrrolidon och silikageler. Näringsmediet 26 kan också inbegripa aminosyror och en röksuspension. Lämpliga aminosyror inkluderar amino- syror som vanligtvis finns införlivade i proteiner, liksom aminosyror som vanligtvis inte finns införlivade i proteiner, såsom argininosuccinat, citrullin, 10 15 20 25 30 535 CVIÜ 7 kanavanin, ornitin och D-stereoisomerer. En lämplig röksuspension innehåller en eller flera föreningar som bildats med hjälp av processen för förbränning av organiskt material, såsom trä eller annat cellulosamaterial. Lösningar som innehåller dessa biprodukter från förbränning av organiska material kan bildas genom förbränning av organiskt material, tvättning av det förkolnade materia- let med vatten och uppsamling av vattnet. Lösningarna kan också erhållas genom upphettning av det organiska materialet och kondensation och utspäd- ning av flyktiga ämnen som frisätts vid sådan upphettning. Vissa typer av rök- suspensioner kan köpas från kommersiella leverantörer, tex Wright's Con- centrated Hickory Seasoning Liquid Smoke (B&G Foods, Inc. Roseland, New Jersey 07068). Röksuspension kan införlivas i näringsmediet 26 i vilken som helst av ett flertal former. Röksuspensionen kan t ex införlivas som en aero- sol, ett pulver eller som en aktiverad lera. Ett exempel på koncentration av den flytande röksuspensionen, om en sådan är närvarande, är enligt Wright's Concentrated Hickory Seasoning Liquid Smoke mellan 0,0001 ml och 1 ml röksuspension per liter medium. Näringsmediet 26 kan också inkludera en eller flera föreningar som är involverade i kvävemetabolismen, såsom urea eller polyaminer.

Näringsmediet 26 inkluderar syrebärande ämnen för förbättring av bå- de absorptionen av syre och retentionen av syre för näringsmediet 26, vilket möjliggör att mediet kan upprätthålla en syrekoncentration som är högre än den som annars skulle förekomma i mediet enbart genom absorptionen av syre från atmosfären. Exempel på syrebärande ämnen inkluderar perfluor- kolväten, såsom FC-77 (3M Corporation, St. Paul, Minnesota), som emulge- rats med ett ytaktivt ämne, såsom Pluronic F-68, tillgänglig från BASF Corp., Parsippany, New Jersey. Exempel på syrebärande ämnen beskrivs i USA- patentansökan nr 5 564 224 (t ex spalt 9, rad 44, till spalt 11, rad 67), som härmed är införlivad genom referens.

Näringsmediet 26 kan också innehålla hormoner. Lämpliga hormoner inkluderar, men är inte begränsade till, abscisinsyra, cytokininer, auxiner och gibberelliner. Abscisinsyra är ett sesquiterpenoidväxthormon som är implike- rad i ett flertal växtfysiologiska processer (se t ex Milborrow, J. Exp. Botany 52:1145-1164 (2001); Leung & Giraudat Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. 10 15 20 25 30 535 CHÜ 8 Biol. 49:199-123 (1998)). Auxiner är växttiilväxthormoner som befrämjar cell- delning och tillväxt. Exempel på auxiner för användning i groningsmediet in- kluderar, men är inte begränsade till, 2,4-diklorfenoxiättiksyra, indol-3-ättik- syra, indol-3-smörsyra, naftalenättiksyra och hydroxikanelsyra ("chlorogenic acid"). Cytokininer är växttiilväxthormoner som påverkar organisationen hos celler under delning. Exempel pà cytokininer för användning i groningsmediet inkluderar, men är inte begränsade till, t ex 6-bensylaminopurin, 6-furfuryl- aminopurin, divätezeatin, zeatin, kinetin och zeatinribosid. Gibberelliner är en klass av diterpenoidväxthormoner (se t ex Krishnamoorthy Gibberellins and Plant Growth, John Wiley & Sons, (1975)). Representativa exempel pà gibbe- relliner som är användbara vid utövandet av föreliggande uppfinning inklude- rar gibberellinsyra, gibberellin 3, gibberellin 4 och gibberellin 7. Ett exempel pä en användbar blandning av gibberelliner är en blandning av gibberellin 4 och gibberellin 7 (benämnd gibberellin 4/7), såsom den gibberellin 4/7 som säljs av Abbott Laboratories, Chicago, Illinois.

Näringsmediet 26 kan också inkludera antimikrobiella ämnen. Lämpli- ga antimikrobiella ämnen är tillgängliga från Sigma-Aldrich, St. Louis, Missou- ri, och säljs som Product nr A5955. Antimikrobiella ämnen kan t ex användas i en koncentration av 1 ml/l.

När abscicinsyra är närvarande i näringsmediet 26 används det van- ligtvis i en koncentration av i området från cirka 1 mg/I till cirka 200 mg/I. När det förekommer i näringsmediet 26 är koncentrationen av gibberellin(er) van- ligtvis mellan cirka 0,1 mg/I och cirka 500 mg/I. Auxiner kan t ex användas i en koncentration av fràn 0,1 mg/I till 200 mg/I. Cytokininer kan tex används i en koncentration av från 0,1 mg/I till 100 mg/I.

Exempel på näringsmedium beskrivs i USA-patentskriften nr 5 687 504 (t ex spalt 8, rad 63 till spalt 9, rad 41) och USA-patentpubliceringsskriften nr 2003/0167684, som härmed är införlivad genom referens. Ett representativt näringsmedium 26 är KE64-50, vars sammansättning beskrivs i tabell 1 nedan.

Vid en utföringsform av uppfinningen är koncentrationen av adsorbent- materialet i näringsmediet 26 fràn cirka 30 g/l till cirka 100 g/l. Vid en annan utföringsform är koncentrationen av adsorbentmaterialet i näringsmediet 26 10 15 20 25 30 535 010 9 från cirka 50 gll till cirka 100 g/l. Vid en annan utföringsform är koncentratio- nen av adsorbentmaterialet i näringsmediet 26 från cirka 60 g/I till cirka 100 g/l. Vid en annan utföringsform är koncentrationen av adsorbentmaterialeti näringsmediet 26 från cirka 75 g/l till cirka 100 g/l. Vid en utföringsform är adsorbentmaterialet träkol. Vid en utföringsform är adsorbentmaterialet nä- ringsämnesbehandlat träkol. Det här använda uttrycket "näringsämnes- behandlat” träkol hänför sig till träkol som har behandlats med ett medium som innehåller ett flertal näringsämnen, såsom en kolkälla, vitaminer, minera- ler och aminosyror, varvid träkolet absorberar och bevarar näringsämnen frän mediet. Ett representativt medium som används för beredning av närings- ämnesbehandlat träkol är mediet KE64-50. Ett representativt förfarande för framställning av näringsämnesbehandlat träkol beskrivs i Exempel 2.

Skottbegränsningen 22 hos ett tillverkat frö framställs lämpligtvis med utgångspunkt fràn ett poröst material med en hårdhet som är tillräckligt stark för att motstå punktering eller fraktur pga ett groende embryo, såsom ett kera- miskt material eller ett porslinsmaterial, och inkluderar en ändtillslutnings- portion 30 och en hjärtbladsbegränsningsportion 32. Begränsningsportionen 32 har en inneryta för kontakt och omslutning av åtminstone skottänden hos ett växtembryo och motstär penetration av skottänden under groning. Skott- begränsningen förhindrar embryots skottände, såsom hjärtbladen, från att växa in i och inneslutas i näringsmediet (även benämnt näringsmedium).

Hjärtbladsbegränsningsportionen 32 är lämpligtvis integralt eller enhetligt for- mad tillsammans med ändtillslutningsportionen 30. Skottbegränsningen 22 inkluderar även en sig i längdriktningen sträckande hålighet 34 som sträcker sig genom ändtillslutningsportionen 30 och delvis genom ena änden av hjärt- bladsbegränsningsportionen 32. Den öppna änden av håligheten 34 är känd som en hjärtbladsbegränsningsöppning 36. Håligheten 34 är storleksanpas- sad till att mottaga ett växtembryo 42 däri. Såsom visas i FlGUR 1 inbegriper skottbegränsningen 22 ett flertal porer 27, varvid porerna 27 ger närings- mediet 26 tillgång till insidan av hàligheten 34 inbegripande embryot 42 och tillåter därför näringsmediet 26 att funktionellt komma i kontakt med embryot 42 vid betingelser som är tillräckliga för att ge ett konditionerat embryo, sä- som beskrivs här. 10 15 20 25 30 535 010 10 Begränsningen är porös för att ge embryot tillgång till vatten, närings- ämnen och syre. Skottbegränsningen kan vara tillverkad av vilket lämpligt material som helst som inkluderar, men som inte är begränsat till, glasartat material, metallmaterial, elastmaterial, keramiskt material, lermaterial, gips- material, cementmaterial, stärkelseartat material, kittliknande material, synte- tiskt polymermaterial, naturligt polymermaterial och klistermaterial. Exempel på skottbegränsningar beskrivs i USA-patentskriften nr 5 687 504 (t ex spalt 3, rad 61 till spalt 4, rad 13; spalt 18, rad 7, till spalt 22, rad 2), som härmed är införlivad genom referens.

Hela eller endast en del av växtembryot 42 kan införas i skottbegräns- ningen 22. Vanligtvis införs åtminstone skottänden av embryot i skottbegräns- ningen 22. Ytan för näringsupptaget hos ett tillverkat frö 20 är begränsad till ytan av växtembryot 42 som står i direkt kontakt med innerytan av skott- begränsningen 22. Under groning av växtembryon har hjärtbladen visat sig vara de primära organen för näringsupptag (Brown & Gifford, Plant Physiol. 33:57-64 (1958)).

Antingen kan innerytan av skottbegränsningen 22 eller växtembryot 42, eller bådadera, bringas i kontakt med en hydratiserad gel, antingen före eller efter införing av växtembryot 42 i skottbegränsningen 22. Exempel på ut- föringsformer av hydratiserade geler är såsom beskrivits ovan för närings- mediet 26. Den hydratiserade gelen kan inbegripa endast lösta ämnen för ge- len och vatten, eller kan den inbegripa växtnäringsämnen och andra ämnen, såsom beskrivs för näringsmediet 26. innerytan av skottbegränsningen kan bringas i kontakt med en hydrati- serad gellösning, som härdas för bildning av en hydratiserad gel. En hålighet 34 kan därefter åstadkommas i den hydratiserade gelen i skottbegränsningen 22, och växtembryot 42 kan införas i håligheten 34 i den hydratiserade gelen i skottbegränsningen 22. Dessutom, eller altemativt, kan åtminstone en del av växtembryot 42 (såsom hjärtbladen) bringas i kontakt med en hydratiserad gellösning, som härdas för bildning av en hydratiserad gel före införing av växtembryot 42 i skottbegränsningen 22.

Såsom dessutom visas i FIGUR 1 omger vid en utföringsform av upp- finningen adsorbentmaterialet 80 embryot 42 i håligheten 34, antingen full- 10 15 20 25 30 535 Üfiü 11 ständigt eller partiellt, och ökar ytarean av embryot 42, som står i funktionell kontakt med näringsmediet 26, vilket tillhandahåller ett flertal vägar för nä- ringsämnena från näringsmediet 26 för att nå embryot 42. Lämpliga adsor- bentmaterial inkluderar aktivt träkol, Dowex-hartser, zeoliter, aluminiumoxid, lera, diatomit, silikagel och kiselgur. Under sammansättningen av det tillverka- de fröet 20 avsätts adsorbentmaterialet 80 i hàligheten 34 på vilket känt sätt som helst, inkluderande manuellt. Adsorbentmaterialet 80 avsätts företrädes- vis, men inte nödvändigtvis, i hàligheten 34 på så sätt att den väsentligen centrerar växtembryot 42 inuti häligheten 34. Även om det är föredraget att adsorbentmaterialet 80 väsentligen centrerar växtembryot 42 inuti häligheten 34, behöver växtembryot 42 inte vara positionerat på sä sätt. Adsorbent- materialet 80 behöver endast positionera växtembryot 42 inuti håligheten 34 pà vilket känt sätt som helst för att sätta växtembryot 42 i funktionell kontakt med näringsmediet 26. Dessutom är det inte nödvändigt för adsorbentmate- rial 80 att ”omge” växtembryot 42. Adsorbentmaterialet 80 kan i befintligt skick fullständigt eller partiellt omge växtembryot 42. Vid andra utföringsformer inom ramen för de efterföljande patentkraven behöver adsorbentmaterialet 80 endast fylla, antingen fullständigt eller partiellt, en eller två sidor av utrymmet mellan växtembryot 42 och hàlighetens väggar, Vid en utföringsform är adsorbentmaterialet 80 i håligheten 34 träkol.

Företrädesvis föreligger träkolet i form av ett pulver och aktiveras genom be- handling med en syra, såsom HCI eller fosforsyra. Aktivt träkol är kommer- siellt tillgängligt. Pulverformigt aktivt träkol av typ NORIT® CNSP eller DARCO® KB-G ärt ex tillgängliga från Norit Americas lnc., Marshall, Texas.

Vid en annan utföringsform är adsorbentmaterialet 80 i häligheten 34 ett nä- ringsämnesbehandlat träkol. Ett exempel pä ett förfarande för framställning av näringsämnesbehandlat träkol för införing i håligheten 34 beskrivs i Exempel 2.

Det här använda uttrycket ”växtembryo” hänför sig till antingen ett zy- gotiskt växtembryo eller ett somatiskt växtembryo. Ett zygotiskt växtembryo är ett embryo som finns inuti ett botaniskt frö som producerats genom sexuell reproduktion. Somatiska embryon kan produceras genom odling av embryo- gen vävnad med hjälp av standardmetoder vid laboratoriebetingelser vid vilka 10 15 20 25 30 535 010 12 cellerna som inbegriper vävnaden separeras från varandra och tvingas ut- vecklas till mycket smà fullständiga embryon.

Det här använda uttrycket “ett somatiskt växtembryo” hänför sig till ett embryo som producerats genom odling av totipotenta växtceller, såsom meri- stemvävnad, vid laboratoriebetingelser där cellerna som inbegriper vävnaden separeras från varandra och tvingas utvecklas till små fullständiga embryon.

Alternativt kan somatiska embryon produceras genom induktion av ”klyv- ningspolyembryogenes” av zygotiska embryon. Metoder för produktion av somatiska växtembryon som är lämpliga för användning vid förfarandena enligt uppfinningen är standardmässiga inom teknikområdet och har tidigare beskrivits (se t ex USA-patentskrifterna nr 4 957 866, 5 034 326, 5 036 007, 5 041 382, 5 236 841, 5 294 549, 5 482 857, 5 563 061 och 5 821 126). Växt- vävnad kan tex odlas i ett initeringsmedium som inkluderar hormoner för ini- tiering av bildningen av embryogena celler, såsom embryosuspensormassor med förmåga att utvecklas till somatiska embryon. De embryogena cellerna kan därefter odlas vidare i ett underhàllsmedium som befrämjar etablering och förökning av de embryogena cellerna. Därefter kan de för-ökade embryo- gena cellerna odlas i ett utvecklingsmedium som befrämjar utvecklingen av somatiska embryon, som dessutom kan underkastas efterutvecklingsbehand- lingar, såsom behandlingar med kyla. De somatiska embryon som används vid förfarandena enligt uppfinningen har fullbordat utvecklingsskedet av den somatiska embryogenesprocessen. De kan också ha underkastats en eller flera efterutvecklingsbehandlingar. växtembryon som är lämpliga för användning vid förfarandena enligt uppfinningen kan härröra från vilken växtart som helst, såsom dihjärtblads- försedda eller monohjärtbladsförsedda växter, gymnospermer etc. Barrträds- embryon som är lämpliga för användning vid förfarandena enligt uppfinningen kan härröra från barrträdstyper inkluderande, men inte begränsade till, emb- ryon från gul sydstatstall (”Loblolly pine") och embryon från douglasgran. För användning i tillverkade frön 20 enligt föreliggande uppfinning utvecklas växt- embryot 42 vanligtvis tillräckligt för att ha en skottände och en rotämnesände.

Hos vissa växtarter inkluderar skottänden ett eller flera hjärtblad i något ut- 10 15 20 25 30 535 Ü'IÜ 13 vecklingsskede. Hos andra typer av växter är hjärtbladet eller hjärtbladen belägna på andra ställen än i skottänden. l en annan aspekt tillhandahålls med föreliggande uppfinning förfaran- den för förbättring av groningen av ett växtembryo med utgångspunkt från ett tillverkat frö. vid en utföringsform inbegriper förfarandet stegen av (a) sam- mansättning av ett tillverkat frö inbegripande ett fröhölje och en begränsning, varvid begränsningen inbegriper en hålighet; (b) tillsättning av näringsmedium inbegripande ett adsorbentmaterial till fröhöljet, varvid adsorbentmaterialet förekommer i mediet i en koncentration från cirka 30 g/l till cirka 100 g/l; (c) placering av ett växtembryo i begränsningens hålighet; och (d) odling av det tillverkade fröet vid betingelser som är lämpliga för groning av växtembryot.

Vid en utföringsform inbegriper förfarandet stegen av (a) sammansättning av ett tillverkat frö inbegripande ett fröhölje och en begränsning, varvid begräns- ningen inbegriper en hålighet; (b) tillsättning av näringsmedium inbegripande ett adsorbentmaterial till fröhöljet, varvid adsorbentmaterialet förekommer i mediet i en koncentration av från cirka 30 g/l till cirka 100 g/l; (c) placering av ett växtembryo i begränsningens hålighet; (d) tillsättning av ett adsorbent- material till häligheten; och (e) odling av det tillverkade fröet vid betingelser som är lämpliga för groning av växtembryot.

Betingelser som är lämpliga för groning av tillverkade fröer är standard- mässiga inom området och inkluderar betingelser som är lämpliga för groning av naturliga fröer. Det tillverkade fröet kan t ex sås i vilken som helst av ett flertal miljöer, såsom sand, vermikulit, steril jord och/eller på fältet (natunig jord). Steril tvättad sand av typ ColesTM, som är tillgänglig från ett flertal buti- ker med trädgårdsprodukter, kan t ex användas.

Ett exempel på ett förfarande för sammansättning av ett växtembryo 42 till ett tillverkat frö 20 beskrivs i Exempel 3.

Förfarandena enligt uppfinningen förbättrar groningen av ett växt- embryo med utgångspunkt från ett tillverkat frö, såsom visas i Exempel 4, 5 och 6.

Följande exempel tillhandahålls i syfte att belysa, men inte begränsa, uppfinningen. 10 15 20 535 G10 14 EXEMPEL Exempel 1 l detta exempel visas ett representativt förfarande för framställning av ett lämpligt näringsmedium för användning vid uppfinningen.

Fullständigt näringsmedium (KE64-50) framställs genom kombination av basmediet KE64 (Tabell 1) med komponentema iTabell 2, såsom beskri- vits. KE64-50 bereds med utgångspunkt från i förväg beredda förrådslös- ningar. Den erforderliga mängden av varje förrådslösning (som inte är värme- labil) sätts till vatten. Kemikalier som inte härrör från förrådslösningar (såsom träkol och agar) vägs upp och sätts direkt till mediet. Efter det att de ej värme- labila kemikaliema och föreningarna tillsatts, justeras mediets volym till en lämplig nivå, och pH-värdet justeras till 5,7. Medlet steriliseras därefter genom autoklavering under 25 minuter.

TABELL 12 FORMULERING AV BASMEDIET KE64 Mediumkom Slutkoncentration 301 1 10 0 0 06 299 1800 0 1000 0 6 0 - 0 ° 0 Ferricitrat 60 Pluronic F-68 10 18 Filtersteriliserade, värmelabila komponenter (Tabell 2) tillsätts efter det att mediet har kylts till 40°C. 10 535 CVIÜ 1 5 TABELL 2 Mediumkom ponent Slutkoncentration (mM) Slutkoncentration (mgfl)_ Myoinositol 0,5549 100,0 Tiamin-HCI 0,0030 1,0 Pyridoxin-HCI 0,0012 0,25 Nikotinsyra 0,0081 1,0 Riboflavin 0,0021 0,125 Ca-pantotenat 0,50 Biotin 0,0003 0,0010 Folsyra 0,8077 0,1250 L-asparagin 1 ,8255 106,7 L-glutamin 0,3646 266,7 L-lysin-2HC| 0,7612 53,3 DL-serin 0,4631 80 L-prolin 1,5310 53,3 L-arginin-HCl 0,4552 266,7 Urea 13,3200 800 L-valin 0,5983 53,3 L-alanin 0,2203 53,3 L-Ieucin 0,2448 80 L-treonin 0,3226 26,7 L-fenylalanin 0,1720 53,3 L-histidin 0,1308 26,7 L-tryptofan 02035 26,7 L-isoleucin 1,2930 26,7 L-metionin 0,7100 26,7 _L_-glycin 0,0003 53,3 L-tyrosin 0,2242 53,3 L-cystein 0,6098 26,7 Sackaros 50 g/l Gibberillinsyra (GAW) 0,1 Antimikrobiella ämnen 1,0 mlll Exempel 2 I detta exempel beskrivs ett representativt förfarande för beredning av näringsämnesbehandlat träkol för användning vid uppfinningen. Basmediet KE64 (Tabell 1)framställs såsom beskrivs i Exempel 1, men utan Pluronic F- 68 och utan agar. Näringsämnesbehandlat träkol bereds enligt följande: 23,3 g träkol av 100 mesh sätts till 1 liter basmedium av typ KE64. Komponenterna autoklaveras och får svalna till 40°C. Komponenterna i Tabell 2, som beskrivs i Exempel 1, tillsätts sterilt till basmediet KE64, och mediet omrörs för bland- 10 15 20 25 30 535 G10 16 ning av komponenterna. Mediet filtreras genom filterpapper av typ Whatman nr 1 i en Buchnertratt för uppsamling av träkolet. En fuktbalansvåg används för bestämning av fukthalten iträkolskakan, och torrvikten av träkolet beräk- nas. Om det näringsämnesförsedda träkolet ska sättas till hàligheten hos det tillverkade fröet, torkas det först tills det blir ett flytande material.

Exempel 3 I detta exempel beskrivs ett representativt förfarande för sammansätt- ning av växtembryon till tillverkade frön och groning av tillverkade frön. I ett exempel på ett förfarande för framställning av ett tillverkat frö för användning vid uppfinningen framställs fröhöljet genom avskärning av en polykaprolakton- slang till lämplig längd. Keramiska skottbegränsningar framställs genom injek- tion av en porslinsremsa i en förformad mall med en nål i centrum för åstad- kommande av den skottaccepterande håligheten. Remsan får torka till en konsistens som tillåter avlägsnande av den förformade begränsningen.

Begränsningen upphettas därefter till en temperatur som medger att porslinet bildar en porös men sammansmält struktur. Begränsningen kan tvättas med syra för avlägsnande av föroreningar, om så är önskvärt. Locken tillverkas genom försträckning av ParafilmW' (Pechiney Plastic Packaging, Chicago, Illinois 60631).

Zygotiska embryon bereds med utgångspunkt från botaniska fröer.

Fröna ytsteriliseras med hjälp av metoder som är liknande de som beskrivits tidigare (Cyr et al, Seed Sci. Res. 1:91-97 (1991)). Fröna knäcks så att de öppnas, och de zygotiska embryona dissekeras ut från megagametofyten med hjälp av en skalpell och pincett i ett dragskáp med laminärt flöde.

Somatiska embryon framställs med hjälp av standardmetoder som tidi- gare beskrivits (se t ex USA-patentskrifterna nr 4 957 866, 5 034 326, 5 036 007, 5 041 382, 5 236 841, 5 294 549, 5 482 857, 5 563 061 och 5 821 126). Växtvävnad kan t ex odlas i ett initieringsmedium som inkluderar hormoner för initiering av bildning av embryogena celler, såsom embryo- suspensormassor med förmåga att utvecklas till somatiska embryon. De embryogena cellerna kan därefter odlas vidare i ett uppehållsmedium som befrämjar etablering och förökning av de embryogena cellerna. Därefter kan de förökade embryogena cellerna odlas i ett utvecklingsmedium som befräm- 10 15 20 25 30 535 CVIÜ 17 jar utveckling av somatiska embryon, som dessutom kan underkastas efter- utvecklingsbehandlingar, såsom behandlingar med kyla. De somatiska embryon som används vid förfarandena enligt uppfinningen har fullbordat ut- vecklingsskedet i den somatiska embryogenesprocessen. De kan också ha underkastats en eller flera efterutvecklingsbehandlingar.

Tillverkade fröer sätts samman genom termobondning av den kera- miska skottbegränsningen 22 till fröhöljet 24. Fröhöljet 24 fylls därefter med näringsmedium 26, och ett embryo förs in i håligheten 34 i hjärtbladsbegräns- ningen 22 med hjärtbladsänden först. Torrt träkolsfyllmaterial 80 (antingen näringsämnesbehandlat eller ej näringsämnesbehandlat) kan fyllas i hjärt- bladsbegränsningen efter det att embryot har införts i håligheten 34. Efter det att träkolet har tillsätts, tillsluts fröna därefter med hjälp av en andra ändtill- slutning genom placering av denna över den öppna änden av fröet och sam- mansmältning av locken till ytan med hjälp av värme. De primära ändtillslut- ningarna doppas i en blåvaxblandning innan de fästs till den andra ändtillslut- ningen. Detta befrämjar tillfredsställande bindning mellan de primära och se- kundära ändtillslutningarna. Fröna penslas därefter med antimikrobiella ämnen.

En lämplig mängd av steril sand bereds genom förbränning av 2 liter sand vid en temperatur av 191 °C (375°F) under 24 timmar. Sanden sätts därefter till iförväg steriliserade tråg, och 285 ml vatten tillsätts. Därefter åstadkoms fåror, och lådan tillsluts. Lådan innehållande sand autoklaveras därefter under 1 timme vid 121 °C och ett tryck av 1 atmosfär.

De tillverkade fröerna sås i sanden och tillåts gro. Vanligtvis odlas de tillverkade fröerna vid kontinuerligt ljus vid rumstemperatur (23°C) under fyra- fem veckor.

Exempel 4 Detta exempel visar ett representativt förfarande enligt uppfinningen för förbättring av groningen av ett växtembryo med utgångspunkt från ett tillver- kat frö. Tillverkade fröer sattes samman såsom beskrivs i Exempel 3 men med de nedan beskrivna variationerna, och zygotiska embryon av gul syd- statstall infördes i fröna (ett embryo per frö). I varje försök nedan sattes träkol till basmediet KE64, som beretts såsom beskrivs i Exempel 1, före autoklave- 10 535 010 18 ring. Koncentrationen av träkol i mediet var 2,5 g/l, 60 g/l eller 100 g/l. Vid vissa behandlingar varträkolet näringsämnesbehandlat, såsom beskrivs i Exempel 2. Vid vissa utföringsformer var träkolet inte näringsämnesbehand- lat. Efter autoklavering tillsattes resten av komponenterna för beredning av ett fullständigt KE64-medium.

Tvà olika skottbegränsningar, Typ A och Typ B, användes vid behand- lingama. Vid vissa behandlingar sattes träkol även till håligheten i skott- begränsningen. Vid vissa behandlingar var träkolet som sattes till håligheten näringsämnesbehandlat. Vid vissa behandlingar var träkolet som sattes till håligheten inte näringsämnesbehandlat. Vid vissa behandlingar sattes inte träkol till håligheten. Fröna fick därefter gro, såsom beskrivs i Exempel 3.

Behandlingarna beskrivs nedan.

Tyg A av skottbegränsning Behandling 1: Komplett KE64-medium + 2,5 g/l ej näringsämnes- behandlat trä kol Behandling 2: Komplett KE64-medium + 60 g/l ej näringsämnes- behandlat träkol Behandling 3: Komplett KE64-medium + 60 g/l näringsämnesbehandlat träkol Behandling 4: Komplett KE64-medium + 2,5 g/l ej näringsämnes- behandlat träkol, och näringsämnesbehandlat träkol i håligheten Behandling 5: Komplett KE64-medium + 60 g/l ej näringsämnes- behandlat träkol, och näringsämnesbehandlat träkol i håligheten Behandling 6: Komplett KE64-medium + 60 g/l näringsämnesbehandlat träkol, och näringsämnesbehandlat träkol i håligheten Behandling 7: Komplett KE64-medium + 2,5 g/l ej näringsämnes- behandlat träkol, och ej näringsämnesbehandlat träkol i håligheten Tyg B av skottbegränsning Behandling 8: Komplett KE64-medium + 2,5 g/l ej näringsämnes- behandlat träkol, och näringsämnesbehandlat träkol i 10 15 20 25 535 CVlO 19 håligheten Komplett KE64-medium + 60 g/l ej näringsämnes- behandlat träkol, och näringsämnesbehandlat träkol i håligheten Behandling 9: Behandling 10: träkol, och näringsämnesbehandlat träkol i håligheten RESULTAT Data uppsamlades 28 dagar efter såning. Åtskilliga parametrar mättes för bestämning av effekterna av ökning av mängden träkol i näringsmediet och/eller tillsättning av träkol till skottbegränsningens hålighet. Längderna av rotämnet, hypokotylen, hjärtbladen och epikotylen mättes. Uttrycket "rotämne" hänför sig till den del av det växtembryo som utvecklas till den primära roten hos den resulterande plantan. Uttrycket ”hjärtblad” hänför sig allmänt till den första, det första paret av eller den första kransen (beroende på växttypen) av bladliknande strukturer på växtembryot som primärt tjänar till att göra närings- ämnesföreningar i fröet tillgängliga för embryot under utveckling, men funge- rar i vissa fall som näringsämnesförråd eller fotosyntesstrukturer. Uttrycket ”hypokotyl” hänför sig till den del av ett växtembryo eller en groddplanta som är belägen under hjärtbladen, men ovanför rotämnet. Uttrycket "epikotyl" hän- för sig till den del av groddplantans stam som ligger ovanför hjärtbladen.

Organlängderna mättes i centimeter och visas i Tabell 3.

Groningsgraden mättes och visas i Tabell 4. Normaliteten för grodd- ämnena bedömdes också och visas i Tabell 5. Embryona undersöktes och klassades som normala; skulle vara normala om de var fullständigt extrahera- de från håligheten; onormala; fullständigt extraherade från håligheten, men inte normala; och oförändrade. Uttrycket "normalt groddämne” eller ”normali- tet” betecknar närvaron av samtliga förväntade delar av en växt vid utvärde- ringstillfället. l fallet med gymnospermer karakteriseras normaliteten av att rotämnet har en längd av mer än 3 mm och inga synligt urskiljningsbara miss- bildningarjämfört med utseendet hos embryon som bringas att gro med ut- gàngspunkt från ett naturligt frö. "Onormal” avser att vävnaden på åtminstone ett organ är svälld, och att roten och hjärtbladen är döda. ”Fullständigt extra- herad, men onormal" innebär att groddämnet har kommit ut helt och hället Komplett KE64-medium + 60 g/l näringsämnesbehandlat 535 010 20 från hàiigheten, men är onormalt. ”Oförändrad” innebär att embryot inte har förändrats frän dag ett för försöket.

Tabell 3: OrganIänÉr (up mätta i cm) Behandling Rotämne d<0,0001" Hypokotyl d=0 ,2788 Hjänbiad u=o,1 174 Epikoiyi a=0,2o74 Typ A av begränsning Medium: 2,5 g/l ej närings- ämnesbehandlat träkol Hàlighet: inget träkol 1,035 2,02 1,16 0,43 Medium: 60 g/l ej närings- ämnesbehandlat träkol Hàlighet: inget träkol 1,35“ 3,81 1,26 0,43 Medium: 60 g/l närings- ämnes behandlat träkol Hälighet: Inget träkol 1,465” 2,21 1,3 0,43 Medium: 2,5 g/l ej närings- ämnesbehandiat träkol Hálighet: Näringsämnes- behandlat träkol 1,14” 1,91 1,21 Medium: 60 g/l ej närings- ämnesbehandlat träkol Hàlighet: Näringsämnes- behandlat träkol 1 34“'°<° 2,46 1,32 0,13 Medium: 60 g/l närings- ämnesbehandlat träkol Hàlighet: Näringsämnes- behandlat träkol 1 '54A,B,C,D 2,71 1,41 0,52 Medium: 2,5 g/l ej närings- ämnesbehandlat träkol Hàlighet: Ej nänngsämnes- behandlat träkol 1 94%” 2,63 1,77 0,28 Typ B av begränsning Medium: 2,5 g/l ej närings- ämnesbehandlat träkol Hàlighet: Näringsämnes- behandlat träkol 1 s9^'“-° 2,52 1,42 0,42 Medium: 60 g/l ej närings- ämnesbehandlat träkol Hálighet: Näringsämnes- behandlat träkol 2,20” 2,88 1,47 0,16 10 Medium: 60 g/l närings- ämnesbehandlat träkol Hålighet: Näringsäm nes- behandlat träkol 2,32^ 2,62 1,55 0,16 5 Följt av samma bokstav: ej signifikant avvikande 535 (HO 21 Tabell 4: Groningsgrad Behandling Över1 Partiellz Unders Uppoch-ner* d=0,1310 G=0,Ö10O (l=0,0022 =0,3457 Typ A av begränsning 1 Medium: 2,5 g/l ej närings- 13,9% 19,4% 55,6% 8,3% ämnesbehandlat träkol Hàlighet: inget träkol 2 Medium: 60 g/l ej närings- 41,7% 22,2% 27,8% 5,6% ämnesbehand lat träkol Hàlighet: inget träkol 3 Medium: 60 g/l närings- 36,1% 11,1 % 44,4% 2,8% ämnesbehandlat träkol Hàlig het: Inget träkol 4 Medium: 2,5 g/l ej närings- 11,1% 8,3% 77,8% 0% ämnesbehandlat träkol Hàlighet: Näringsämnes- behandlat träkol 5 Medium: 60 g/l ej närings- 22,2% 16,7% 55,6% 5,6% ämnesbehandlat träkol Hàlighet: Näringsämnes- behandlat träkol 6 Medium: 60 g/l närings- 19,4% 16,7% 61 ,1% 0% ämnesbehandlat träkol Hálighet: Näringsämnes- behandlat träkol 7 Medium: 2,5 g/l ej närings- 30,6% 33,3% 30,6% 2,8% ämnesbehandlat träkol Hàlighet: Ej närings- ämnesbehandlat träkol Typ B av begränsning 8 Medium: 2,5 g/l ej närings- 38,9% 27,8% 30,6% 0% ämnesbehandlat träkol Hàlighet: Näringsämnes- behandlat träkol 9 Medium: 60 g/l ej närings- 36,1% 25% 36,1% 2,8°/> ämnesbehandlat träkol Hàlighet: Näringsämnes- behandlat träkol 10 Medium: 60 g/l närings- 33,3% 25% 36,1% 2,8% ämnesbehandlat träkol Hàlighet: Näringsämnes- behandlat träkol "Över" avser hjärtblad och hypokotyl ovanför marken 2"Partiell“ avser viss grön vävnad som visar sig ovanför marken ”Under” avser att ingenting visas ovanför marken “Upp-och-ner” innebär att roten har dött och att hypokotylen vänts upp i luften 535 C110 22 Tabell 5: Normalitet Behandling Normala Skulle vara Onormala Fullstän- Oför- normala digt extra- ändrade om de vore herade, fullständigt onormala extrahera- de a=0,0206 u=0,1325 a=0,6576 d=0,4540 a=0,1064 Typ A: Begränsning 1 Medium: 2,5 g/l ej 13,9% 5,6% 27,8% 5,6% 44,4% näringsämnes- behandlat träkol Hàlighet: lngïträkol 2 Medium: 60 g/l ej 36,1% 19,4% 25% 0% 19,4% näringsämnes- behandlat träkol Hà@et: Eget träkol 3 Medium: 60 g/l 36,1% 5,6% 25% 0% 27,8% näringsämnes- behandlat träkol Hflghet: lflçt träkol 4 Medium: 2,5 g/l ej 8,3% 8,3% 25% 0% 58,3% näringsämnes- behandlat träkol Hàlighet: Närings- ämnesbehandlat träkol 5 Medium: 60 g/l ej 16,7% 8,3% 36,1% 0% 36,1% näringsämnes- behandlat träkol Hålighet: Närings- ämnesbehandlat träkol 6 Medium: 60 g/l 16,7% 13,9% 16,7% 0% 50% näringsämnes- behandlat träkol Hálighet: Närings- ämnesbehandlat träkol 7 Medium: 2,5 g/l ej 33,3% 22,2% 19,4% 2,8% 22,2% näringsämnes- behandlat träkol Hàlighet: Ej närings- ämnesbehandlat träkol Typ B: Begränsning 8 Medium: 2,5 g/l ej 36,1% 16,7% 13,9% 0% 27,8% näringsämnes- behandlat träkol Hålighet: Närings- ämnesbehandlat träkol 10 15 20 535 Ü'IÜ 23 Behandling Normala Skulle vara Onormala Fullstän- Oför- normala digt extra- ändrade om de vore herade. fullständigt onormala extrahera- de G=0,0206 a=O,1325 cr=0,6576 d=0,4540 a=0,1064 9 Medium: 60 g/l ej 41 ,7% 8,3% 13,9% 2,8% 33,3% näringsämnes- behandlat träkol Hålighet: Närings- ämnesbehandlat träkol 10 Medium: 60 g/l 27,8% 30,6% 16,7% 0% 25% näringsämnes- behandlat träkol Hålighet: Närings- ämnesbehandlat träkol Värdena i Tabell 3, 4 och 5 visar allmänt en ökning i organlängd, groningsgrad och normalitet hos embryon som grott med utgångspunkt från tillverkade frön, i vilka näringsämnet inkluderar en hög halt av träkol (60 g/l jämfört med 2,5 g/l).

Exempel 5 l detta exempel visas ett representativt förfarande enligt uppfinningen för förbättring av groningen av ett växtembryo med utgångspunkt fràn ett till- verkat frö. Tillverkade frön sattes samman såsom beskrivs i Exempel 3, men enligt de nedan beskrivna variationerna, och zygotiska embryon av gul syd- statstall infördes i fröna (ett embryo per frö). Vid varje behandling nedan sat- tes träkol till basmedier KE64, som beretts såsom beskrivs i Exempel 1, före autoklavering. Koncentrationen av träkol i mediet var 0 g/l, 60 g/l eller 100 g/l.

Vid vissa behandlingar var träkolet näringsämnesbehandlat och framställt såsom beskrivs i Exempel 2. Vid vissa behandlingar var träkolet inte närings- ämnesbehandlat. Efter autoklavering tillsattes resten av komponenterna för beredning av fullständigt KE64-medium.

Endast skottbegränsningar av Typ B användes vid behandlingarna. Vid samtliga behandlingar sattes näringsämnesbehandlat träkol till håligheten i skottbegränsningen. Fröna fick därefter gro, såsom beskrivs i Exempel 3. Be- handlingarna beskrivs nedan.

Behandling 1: Komplett KE64-medium; och näringsämnesbehandlat Behandling 2: Behandling 3: Behandling 4: Behandling 5: RESULTAT 535 010 24 träkol i hàligheten Komplett KE64-medium + 60 g/l ej näringsämnes- behandlat träkol; och näringsämnesbehandlat träkol i häligheten Komplett KE64-medium + 60 g/l näringsämnesbehandlat träkol; och näringsämnesbehandlat träkol i hàligheten Komplett KE64-medium + 100 g/l ej näringsämnes- behandlat träkol; och näringsämnesbehandlat träkol i håligheten Komplett KE64-medium + 100 g/l näringsämnes- behandlat träkol; och näringsämnesbehandlat träkol i häligheten Data uppsamlades 41 dagar efter sàning. Åtskilliga parametrar upp- mättes för bestämning av effekterna av ökning av mängden träkol i närings- mediet och tillsättning av träkol till skottbegränsningens hålighet. Organ- längder mättes, och groningsgraden och normaliteten bestämdes. Dessa begrepp är definierade såsom i Exempel 4. Organlängderna visas i Tabell 6, groningsgraden visas i Tabell 7 och normaliteten visas i Tabell 8.

Tabell 6: Organlängder (uppmätta i cm) Behandling Rotämne d=0,0200 Hypokotyl d=0,0192 Hjärtbiad a=o,11s3 Epikotyl <1=0,041 5 1 Medium: inget träkol Hàlighet: Näringsämnes- behandlat träkol 1,95” 2,41” 1,44 0,375 Medium: 60 g/l ej närings- ämnesbehandlat träkol Hàlighet: Näringsämnes- behandlat träkol 2,57” 2, 62^B 1,55 0,43” Medium: 60 g/l närings- ämnesbehandlat träkol Hàlighet: Näringsäm nes- behandlat träkol 2,74” 2,9s^ 1,69 0,41” Medium: 100 g/l ej närings- ämnesbehandlat träkol Hàlighet: Näringsämnes- behandlat träkol 2,56” 2,78” 1,75 0,62^ Medium: 100 g/l närings- ämnesbehandlat träkol Hàlighet: Näringsämnes- behandlat träkol 2,99^ 2,70” 1,61 0 ,50^B 535 Ü'l0 25 Tabell 7: Groningsgrad Behamflmg q-Égïß aïärltlïz a-Uonïïgs Uåff-Joåï-:ftsar 1 Medlumnngeufäkol 57,4%“ 224% 10% 1o,2%^ Hålighet: Näringsämnes- behandlat träkol 2 Mediurfueog/lejnäfangs- 571%” 314% 10% 1,4%“ ämnesbehandlat träkol Hålighet: Näringsämnes- behandlat träkol a Medium; so g/l närings- 77,s%^ 15,7%^ 5,2% 14%” ämnesbehandlat träkol Hålighet: Näringsämnes- behandlat träkol 4 Medium: 1009/15; 5a,5°/.,^“ 343% 45% 2,9%B näringsämnesbehandlat träkol Hålighet: Näringsämnes- behandlat träkol 5 Meaiumnoo g/lnärings- 72,5%” 2o.3% 4,31% 2,9%“ ämnesbehandlat träkol Hålighet: Näringsämnes- behandlat träkol Tabell 8: Normalltet Normal Skulle Onormal Oförändrad Vala HOT- mal om det var fullständigt extrahera! Behandlin u=0,0345 u=0,0192 c=O,1183 u=0,0415 1 Mediumnngeufäkol 559%” s,a% 2o,a% 5,57., Hålighet: Näringsämnes- behandlal träkol 2 Medium: 50 g/l e; närings- 72,970” 56% 129% 5,7% ämnesbehandlat träkol Hålighet: Näringsämnes- behandlat träkol 3 Medium: eo g/l närings- ao,5%” 1o,o%^ 57% 29% ämnesbehandlat träkol Hålighet: näringsämnes- behandlat träkol 4 Medium: 1oo g/lejnärings- 72,9°/,^“ 17,1% 5,15% o,o% ämnesbehandlat träkol Hålighet: Näringsämnes- behandlal träkol s Mediumnoog/lnäfings- s4,s%^ 7,1% 43% 4,3% ämnesbehandlat träkol Hålighet: Näringsämnes- behandlat träkol 10 15 20 25 535 Ü1Ü 26 Värdena i Tabell 6, 7 och 8 visar en ökning i organlängd, groningsgrad och norma|itet i embryon som fått gro med utgångspunkt från tillverkat frö, i vilka näringsmediet inkluderar en hög halt av träkol (60 g/l jämfört med 0 g/l).

Värdena i Tabell 7 visar också en reducerad grad av groddämnen av typ ”upp-och-ned" när mängden träkol i mediet ökar.

Exempel 6 l detta exempel visas ett representativt förfarande enligt uppfinningen för förbättring av groningen av ett växtembryo med utgångspunkt från ett till- verkat frö. Tillverkade fröer sattes samman såsom beskrivs i Exempel 3, men underkastades de nedan beskrivna variationerna, och zygotiska embryon av gul sydstatstall infördes i fröna (ett embryo per frö). l varje försök nedan sat- tes träkol till basmediet KE64, som beretts såsom beskrivs i Exempel 1, före autoklavering. Basmediets volym justerades före tillsättning av träkolet. Kon- centrationen av träkolet i mediet var 0 g/l, 3 g/l, 30 g/l, 50 g/l, 60 g/l, 75 g/l eller 100 g/l. Vid samtliga försök var träkolet näringsämnesbehandlat och framställt såsom beskrivs i Exempel 2, bortsett från att inget sackaros sattes till basmediet KE64 vid beredning av det näringsämnesbehandlade träkolet för detta försök. Efter autoklavering tillsattes resten av komponenterna för be- redning av fullständigt KE64-medium (ll), som skiljer sig från vanligt fullstän- digt KE64-medium i det att sackaroskoncentrationen är 63,5 g/l.

Endast skottbegränsningar av Typ A användes vid försöken. Vid samtliga behandlingar sattes näringsämnesbehandlat träkol till håligheten i skottbegränsningen. Fröna tilläts därefter gro, såsom beskrivs i Exempel 3.

Behandlingarna beskrivs nedan. Varje behandling utfördes i genomsnitt med 60 frön per behandling.

Behandling 1: Komplett KE64-medium (ll) + 100 g/l näringsämnes- behandlat träkol Behandling 2: Komplett KE64-medium (ll) + 75 g/l näringsämnes- behandlat träkol Behandling 3: Komplett KE64-medium (ll) + 60 g/l näringsämnes- behandlat träkol Behandling 4: Komplett KE64-medium (ll) + 50 g/l näringsämnes- behandlat träkol 10 15 20 535 Ü'i0 27 Behandling 5: Komplett KE64-medium (ll) + 30 g/l näringsämnes- behandlat träkol Behandling 6: Komplett KE64-medium (ll) + 3 g/l näringsämnes- behandlat trä kol Behandling 7: Komplett KE64-medium (Il) + 0 g/l näringsämnes- behandlat träkol RESULTAT Data uppsamlades pà dag 19, 26 och 35 efter sàning. Åtskilliga para- metrar mättes för bestämning av effekterna av ökning av mängden träkol i näringsmediet och tillsättning av träkol till skottbegränsningens hålighet.

Organlängder mättes, och groningsgraden och normaliteten bestämdes. Ut- trycken är definierade såsom i Exempel 4. Groningsgraden visas i FIGURER- NA 2 och 3, organlängderna visas i FIGUR 4 och förekomsten av normalitet visas i FIGUR 5.

På dag 19 uppvisade embryon i frön med högre träkolshalt i närings- mediet en snabbare groning än frön med lägre träkolshalt (FIGUR 2). På dag 26 upprätthöll fröna med högre träkolshalt en högre groningsgrad (FIGUR 3).

Dessutom var organlängderna i allmänhet större i embryon i frön med mer träkol i näringsmediet (FIGUR 4). Slutligen visade nonnalltetsdata en högre förekomst av normala groddämnen från embryon i frön med mer träkol i nä- ringsmediet (FIGUR 5). Graden av inaktiva embryon och groddar som skulle vara normala om de extraherats fullständigt ökade däremot med minskande träkolshalt. Dessa data tyder på att ökad mängd träkol i näringsmediet ger förbättrad prestanda för embryon i det tillverkade fröet. Även om den föredragna utföringsformen av uppfinningen har belysts och beskrivits, inses det att olika förändringar kan göras därav utan att man frångär uppfinningens innebörd och skyddsomfàng.

Claims (18)

5 10 15 20 25 30 535 CVIÜ 28 PATENTKRAV

1. Tillverkat frö som inbegriper: (a) ett fröhölje, (b) ett näringsmedium inbegripande ett adsorbentmaterial, varvid adsor- bentmaterialet är träkol, polyvinylpolypyrrolidon eller silikageler och förekommer i mediet i en koncentration av från cirka 30 g/l till cirka 100 g/l; och (c) en skottbegränsning, varvid skottbegränsningen inbegriper en hålighet.

2. Tillverkat frö enligt kravet 1, varvid adsorbentmaterialet är träkol.

3. Tillverkat frö enligt kravet 2, varvid träkolet förekommeri mediet i en kon- centration av från cirka 50 g/l till cirka 100 g/l.

4. Tillverkat frö enligt kravet 2, varvid träkolet är näringsämnesbehandlat.

5. Tillverkat frö enligt kravet 2, varvid träkolet inte är näringsämnesbehandlat.

6. Tillverkat frö enligt kravet 1, varvid det dessutom inbegriper ett växtembryo placerat i skottbegränsningens hålighet.

7. Tillverkat frö enligt kravet 6, varvid det dessutom inbegriper ett adsorbent- materlal i skottbegränsningens hålighet.

8. Tillverkat frö enligt kravet 7, varvid adsorbentmaterialet i håligheten är träkol.

9. Tillverkat frö enligt kravet 8, varvid träkolet är näringsämnesbehandlat. 10 15 20 25 30 535 Û'l0 29

10. Tillverkat frö enligt kravet 8, varvid tråkolet inte är näringsämnes- behandlat.

11. Förfarande för groning av ett växtembryo med utgångspunkt från ett till- verkat frö, varvid det inbegriper: (a) sammansättning av ett tillverkat frö inbegripande ett fröhölje och en skottbegränsning, varvid skottbegränsningen inbegriper en hålighet; (b) tillsättning av näringsmedium inbegripande ett adsorbentmaterial till fröhöljet, varvid adsorbentmaterialet år tråkol, polyvinylpolypyrrolldon eller silikageler och förekommer i mediet i en koncentration av från cirka 30 g/l till cirka 100 g/l; (c) placering av ett växtembryo i skottbegränsningens hålighet; och (d) odling av det tillverkade fröet vid betingelser som är lämpliga för gro- ning av växtembryot.

12. Förfarande enligt kravet 11, varvid adsorbentmaterialet är träkol.

13. Förfarande enligt kravet 12, varvid träkolet är näringsämnesbehandlat.

14. Förfarande enligt kravet 12, varvid träkolet ej är nåringsämnesbehandlat.

15. Förfarande enligt kravet 11, varvid det dessutom inbegriper tillsättning av ett adsorbentmaterial till skottbegränsningens hålighet.

16. Förfarande enligt kravet 15, varvid adsorbentmaterialet som satts till hålig- heten är tråkol, polyvinylpolypyrrolldon eller silikageler.

17. Förfarande enligt kravet 16, varvid adsorbentmaterialet som satts till hålig- heten är träkol.

18. Förfarande enligt kravet 17, varvid träkolet som satts till håligheten är näringsämnesbehandlat.