SE526643C2 - Metod för att undvika blekning vid tillämpning av fluorescenskorrelationsspektroskopi - Google Patents

Description

526 643 överlapp i fluorescens kommer emellertid att ge signal i båda detektionsområdena och därmed hög men falsk korrelation eftersom signalen härrör fiän samma färgämne.

Tack vara sin utmärkta känslighet samt att mätmetoden inte permanent förstör det system man ' studerar är FCS synnerligen väl lämpad i en rad biofysikaliska sammanhang. Metoden har använts för att studera enzyrners aktivitetsgrad, specifika signalproteiners funktioner i levande celler, proteinaggregation samt för DNA-sekvensering , för att närrma några tillämpningar.

Teknikens ståndpunkt Fluoræeenskorrelationsspektroskopi (F CS) beskrivs i den kända tekniken exempelvis i publikationen F luorescence Correlation Spectroscopy - An Introduction to its Concepts and Applications, Peta Schwille och Elke Haustein, Experimental Biophysics Group, Max~ Planck-lnstitute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany, 2002. Denna skrift ingärí on-line publikationen "Fluorescence oorrelation spectroscopy - an introduction to its concepts and applications", Petra Scwille och Elke Haustein, Biophysics Textbook Online (BTOL), 2002. Denna publikation är härmed införlivad genom referens som beskrivning av den i sig kända delen av genomförandet av uppfinningen. I publikationen beskrivs såväl teoretisk bakgrund som experimentella realiseringar. I FCS-mätningar enligt denna publikation och annan känd teknik sker excitation av molekyler med en kontinuerlig ljuskälla altemativt med en pulsad ljuskälla med hög repetitionsfrekvens i området 40 MHz (MegaHertz) och uppåt, vilket ger en så kallat kvasikontinuerlig ljuskälla. På så sätt belyses molekylerna på hela deras väg in och ut ur detektionsvolymen, vilket ger bieffekten blekning, det vill säga att molekylerna förlorar sina fluorescerande egenskaper. Kvasikontinuerliga ljuskällor har typiskt repetitionsfrekvenser på omkring 75 IVII-Iz (megahertz), och elektronik för utförande av korrelation har ofia en sarnplingsfiekvens på minst 10 MHz (megahertz).

Allmänt uttryckt arbetar man inom känd teknik med kvasíkontinuerliga pulsfrekvenser och samplingsfrekvenseri storleksordning MHz (MegaHertz).

- En annan publikation som beskriver Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) enligt känd teknik är "Fluorescence correlation spectroscopy: molecular recognition at the single molecular level", E Van Craenenbroeck och Y Engelborghs, J. Mol. Recognit. 13, p 93-100, 2000. Denna publikation är härmed införlivad genom referens som beskrivning av den i sig kända delen av genomförandet av uppfinningen. 10 15 20 25 30 526 643 Ytterligare en publikation som beskriver Fluorescenskorrelationsspektroskopi (F CS) enligt känd teknik är ”Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications”, Oleg Krichevsky och Grégoire Bonnet, Rep. Prog. Phys. 65 (2002) 251-297.

I patentpublikationen WO03/021240 beskrivs en metod för att detektera lumiscerande molekyler genom optisk excitering i en konfokal mätvolym, varvid olika slag av lumiscerande exciteras vid olika tidpunkter i ett sampel och varvid ernitterad strålning från de olika slagen av molekyler registreras av en detektor.

Metoder för FCS enligt teknikens ståndpunkt begränsas av att det är nödvändigt att modifiera biomolekyler för att ge dem goda fluorescensegenskaper samt att dessa molekyler trots det bleks och förlorar sina fluorescerande egenskaper alltför snabbt.

Syfte med uppfinningen Uppfinningen syftar till att lösa det generella problemet med otillfredsställande fluorescensegenskaper hos molekyler i samband med Fluorescenskorrelationsspektroskopi (F CS).

Aspekter av problemet som uppfinningen avser lösa är att: - Eliminera effekten av blekning av fluorescerande molekyler. För att kunna studera molekyler av intresse, exempelvis proteiner, så modifieras dessa enligt känd telmik med olika färgämnen. Ãven om dessa färgärrmen har utmärkta fluorescensegenskaper så bleks de trots allt förhållandevis snabbt och detta är ett problem i många tillämpningar, exempelvis vid studier av långsamma processer. Analys av data försvåras också; blekning innebär potentiell risk att underskatta diffusionstiden och partikelantalet.

- Eliminera nödvändigheten att modifiera biomolekyler fór att ge dem goda fluorescensegenskaper. Ett än mer allvarligt problem med blekning är att det inte är möjligt att använda proteiners inneboende fluorescensegenskaper för FCS. Aminosyroma tryptofan och tyrosin som finns representerade i det närmaste samtliga proteiner bleks alltför snabbt för att kunna användas för FCS enligt känd teknik. Det är emellertid i många sammanhang synnerligen önskvärt att kunna studera proteineri deras naturliga form, utan att behöva modifiera dern, eftersom detta kan ändra den egenskap man vill studera Vid bestämning om 10 15 20 25 30 526 643 proteiner bildar aggregat år detta viktigt då situation kan uppstå att proteinet upphör att bilda aggregat när det modifieras.

Sammanfattning av uppfinningen Enligt uppfinningen, som är en förbättring av FCS-metoden, elimineras det ovannämnda problemet och begränsningarna, och därmed åstadkommas en FCS-metod som är mer användbar.

Uppfirmingen löser problemet genom att minimera antalet excitationer av molekylerna till det minimala antal som krävs för att åstadkomma observerbarhet. Uppfinningen är baserad på det faktum som anges av sarnplingsteorernet, nämligen att ett tillräckligt krav för att korrekt kunna studera ett tidsförlopp är att samplingsfrekvensen är minst dubbelt så hög som den frekvens man studerar. Enligt uppfinningen är det väsentligen tillräckligt att excitera , molekylerna i genomsnitt två gånger per passage genom detektionsvolymen. Genom denna minimering av excitationer elimineras i praktiken problemet med blekning, eftersom blekning uppträder i försumbar utsträckning vid detta låga antal excitationer. Uppfinningen har bland annat följande tekniska effekter och fördelar. 1) FCS på icke modifierade proteiner kan göras med uppfinningen. Genom pulsning av excitationsenergin minimeras blekningen av molekyler till en så pass låg nivå att det är möjligt att använda proteiners blekningskänsliga fluoroforer tryptofan och tyrosin, istället för färgämnesmolekyler. Detta gör det möjligt att studera proteineri deras nativa form utan att störa systemet utöver excitation. Det är med uppfinningen därför också möjligt att studera processer och proteiner i deras naturliga niiljö utan att behöva modifiera DNA för uttryck av fárgänmesmårlcta proteiner. Sammantaget åstadkommer uppfinningen en FCS-metod som är mer användbar i medicinska tillämpningar och möjliggör nya diagnostiska metoder. Utöver proteiner och biomolekyler finns det också andra blekningskänsliga molekyler av intresse.

Uppfinningen är naturligtvis tillåmpbar och nyttig även vid analys av sådana molekyler. 2) Med FCS enligt uppfinningen finns ingen begränsning för långsamma förlopp. I traditionell FCS enligt känd teknik med kontinuerlig belysning i detektionsvolymen så 10 15 20 25 30 526 643 bleks färgämnen förr eller senare beroende på deras inneboende fotostabilitet. Detta gör att långsamma förlopp där molekylema tillbringar stor del i fokus är omöjliga att studera med FCS enligt känd teknik. I och med att tekniken enligt uppfinningen med pulsad exeitation är anpassad efter det tidsßrlopp man önskar studera så behövs endast två excitationer per passage oavsett hur lång tid en passage tar. 3) FCS enligt uppfinningen medger mildare krav på prestanda hos färgämnen. Det finns en rad färgämnen som har otillräckliga egenskaper ßr FCS enligt känd teknik när det gäller kvantutbyte för emission och fotostabilitet men som är tillgängliga med hjälp av pulsad excitation enligt uppfinningen. 4) Förbättrade möjligheter för tvåfárgs-FCS medelst uppfinningen. Genom att separera excitationspulserrla för de två färgämnena går det att minimera överlapp i fluorescens mellan färgämnen. Detta kommer att leda till kraftigt förbättrat signal- till brusförhållande vid korrelationsanalys och det kommer att göra det enklare att välja i två eller fler färgärrmen lämpliga för FCS. 5) Bättre signal- till brusförhållande. I traditionell FCS enligt känd teknik begränsas blekning genom att excitationen hålls på en förhållandevis låg nivå. Med den förbättrade F CS-metoden enligt uppfinningen möjliggörs pulsad excitation med högre lasereffekt och därmed högre signal. l allmänna ordalag kommer tillförlitligheten hos FCS-metoden att förbättras genom uppfinningen med lågt frekvent pulsad excitationsenergi , även om man väljer att modifiera de studerade molekylema med färgämnen. Risk för att diffusionstid och partíkelantal underskattas minimeras; friare val av färgänmen gör att man kan välja system som passar det experiment man vill utföra snarare än att i första hand se till att man tillgodoser kraven för FCS, såsom har varit nödvändigt med FCS enligt känd teknik.

En aspekt av uppfinningen innefattar en metod för fluorescenskorrelationsspektroskopi varvid molekyler exponeras med energi för åstadkommande av excitation av nämnda molekyler och varvid det detekteras påföljande fluorescens från nämnda molekyler. Vid tillämpningar av uppfinningen strävas det i huvudsak efter att minimera energiapplicering på molekylema och företrädesvis appliceras nämnda excitationsenergi i pulser med en pulsfrekvens l0 20 25 30 Sïó 643 huvudsakligen motsvarande den dubbla difïusionsfrekvensen hos nämnda molekyler. Därmed exponeras nämnda molekyler med nämnda energi i huvudsak genomsnittligen två gånger per nämnda molekylers passage genom en detektionsvolym av en lösning innehållande nämnda molekyler.

Difusionstiden för studerade molekyler ligger i allrnänhet i området av 0.01 till 10 ms (rnilliselcunder). I tillämpningar enligt uppfinningen används därför en pulsfrekvens för exponering av energi företrädesvis i området av 200 till 0.2 kHz (kiloHertz).

Enligt uppfinningen används vid analys av diffusionsprocesser företrädesvis pulsfiekvenser i storleksordning kHz (kiloHertz), alltså i det begränsade området av 0.01 till 999 kI-lz (kiloHertz). Vid tillämpningar av uppfinningen som analyserar snabbare processer, exempelvis kemiska reaktioner, kan pulsfrekvenser i MHz-området (megaHerz) förekomma.

Det gemensamma för olika tillämpningar av uppfinningen är att pulsera det exciterande ljuset med minst två pulser per period hos den studerade processens tidsvariation. Efiersom period och fiekvens hos den studerade processens tidsvariation inte alltid är helt känd på förhand uppskattar man vid praktisk tillämpning av uppfinningen nämnda period och frekvens, och sätter pulsfrekvensen för energiexponeringen i omrâdet mellan 2 och ungefär 10 pulser per period. “ Enligt andra aspekter av uppfinningen exponeras nämnda molekyler med pulser av energi av en första och en andra våglängder. Detta används typiskt vid FCS-analys enligt uppfinningen av molekyler som kan vara färgade med två färgämnen, och med två färgämnen är det vanligtvis fördelaktigt och i en del fall nödvändigt med två excitationsvåglängder. I ytterligare aspekter av uppfinningen exponeras Vmolekylerna med energi i pulser av en första och en andra fórbestämda pulsfrekveriser och eventuellt med en förbestämd tidsfördröjning mellan pulsema av nämnda första och andra pulsfrekveriser. Med tidsfördröjningen separeras pulsema som härrör från respektive färg med ett tidsintervall. Det detekteras emission från nämnda molekyler av fluorescens med en första och en andra fórbestämda våglängder.

Nämnda molekyler är i en utföringsform av uppfinningen modifierade med ett fárgämne.

Nämnda molekyler kan innefatta ett ßrsta slag av molekyler som är modifierade med ett första färgämne och ett andra slag av molekyler som är färgade med ett andra färgämne.

I olika tillämpningar av uppfinningen kan tvåfárgs-FCS enligt uppfinningen användas vid analys av en molekyl som är modifierad med två färgämnen, varvid en process klyver 10 15 20 25 30 526 643 molekylen och därmed separerar de två färgämnena. I andra tillämpningar har man två molekyler ned var sitt olika färgat fárgämne, och när dessa molekyler fogas ihop kan korskorrelation detekteras.

Ytterligare aspekter av uppfinningen innefattar en apparat för fluorescenskorrelationsspektroskopi varvid molekyler exponeras med energi ßr åstadkommande av excitation av nämnda molekyler och varvid det detekteras påföljande emission från nämnda molekyler av fluorescens med en förbestämd våglängd, varvid organ anordnade att åstadkomma steg och funktioner enligt ovan. Vidare kan uppfinningen innefatta en datorprogramprodukt för styrning av en apparat för fluorescenskorrelationsspektroskopi varvid molekyler exponeras med energi för åstadkommande av excitation av nämnda molekyler och varvid det detekteras påßljande emission från nämnda molekyler av fluorescens med en förbestämd våglängd, innefattande programkod anordnad att styra en datorprocessor till att utföra stegen och funktionema enligt ovan.

I allmänna ordalag kan UPPfinningen användas för att studera tidsvarierande förlopp och processer där nämnda tidsvariation kan mätas med fluorescens. Diffusion, kemiska förlopp och population av långlivade energinivåer hos studerade system är exempel på detta.

Korrelationsanalys används enligt uppfinningen för att bestämma antalet enheter, tex. antalet molekyler, som bidrar till fluorescens samt frekvensen hos processens tidvariation. För åskådlighetens skull förklaras uppfinningen närmare genom exemplifierande utföringsformer som utförs på diffusion som process.

Kort beskrivning av ritningarna Uppfinningen skall nedan ßrklaras med hänvisning till de bifogade ritningar-na, i vilka: Fig 1 visar grafer över absorption och emission för två vanliga färgämnen under excitation enligt känd teknik; Fig 2 visar grafer över de två färgänmena enlig Fig I under excitation enligt uppfinningen; Fig 3-6 visar visar grafer som illustrerar olika experiment med uppfinningen; Fig 7 visar ett översiktligt blockschema över steg innefattade i en utföringsform av metoden enligt uppfinningen.

Beskrivning av utföríngsformer av uppfmningen Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCSl 10 15 20 25 Kärnan i FCS är att mäta fluorescens och beräkna autokorrelation på den detekterade signalen. För att få mätbar korrelationsarnplitud måste antalet molekyler eller partiklar som bidrar till fluorescenssignalen vara lågt. Detta kräver att dessa partiklar har mycket goda fluorescensegenskaper så att signalen över huvudtaget kan detekteras. Det ßr närvarande vanligaste tillvägagångssättet är att fokusera laserljus med ett diffraktionsbegränsat objektiv till en volym med längdmått av samma storlek som våglängden, vilket ger en volym av storleksordning femtoliter. Emittexad fluorescens samlas in med samrna optik, s.k. epi- illumination, och autokorrelation beräknas enligt: där <1 är tidsmedelvärdet av intensiteten och r är separationen i tid mellan två grupper av data som ska korreleras. Med en Gaussisk intensitetsprofil för tvärsnittet hos laserstrålen så ges autokorrelationen av: l/2 1 1 1 GMT? 4D: 4D: 1 + 2 1+ 2 mo zo där D är diffiisionskonstanten, m0 diametern på detektionsvolymen och zo är längden. För att erhålla god korrelationsamplitud så måste partikelantalet N vara lågt vilket samtidigt innebär lägre intensitet och sämre signal- till brusßrhållande.

Vanligtvis fixeras geometrin ßr detektionsvolymen vilket leder till att det är partikelantalet N och den laterala difilrsionstiden (må / 4D) som bestäms. Partikelantal gör det möjligt att bestämma koncentration och studera kemiska reaktioner medan diñiisionstid ger ett mått på storlek och kan användas för att studera exempelvis aggregation.

Frekvenssamband Uppfinningen bygger på uppfinnamas insikt om följande samband. 10 15 20 25 30 526 643 Vid tidsdiskreta observationer av tidskontinuerliga förlopp genom sampling vid en viss samplingsfrekvens gäller det välkända samplingsteoremet. Sampling kan betraktas som pulser av observationstillfïâllen eller detektioner med cm viss pulsfi-ekveris av en tidsberoende storhet som varierar med en viss studerad frekvens. Detta betraktelsesätt används i ßreliggande uppfinning.

I Fluorescenskorrelationsspektroskogi (PCS) har man en observerad volym av någon substans som innehåller molekyler. Dessa molekyler diffunderar in i och ut ur observationsvolymen pga termisk rörelse. En tidsberoende storhet i detta sammanhang är antalet molekyler som företrädesvis i medeltal befinner sig i den observerade volymen. Antalet molekyler i observationsvolymen vid varje given tidpunkt följer ett i princip tidskontinuerligt förlopp.

Rent matematiskt är förloppet i och för sig tidsdiskret eftersom ett antal, dvs storleken hos en mängd anges av naturliga tal, mellan vilka det är diskreta steg. För praktiska syften kan emellertid detta antal molekyler betraktas som uppvisande ett tidsdiskret förlopp.

Molekylerna befinner sig i observationsvolymen under en viss ßreträdesvis genomsnittlig tid, som i FCS-sammanliang kallas diffusionstiden. I en fiekvensbeskrivning varierar det tidskontinuerliga förloppet med en frekvens som motsvarar ett samband där diffusionsfrekvensen = l/diffiisionstiden.

Den observerade volymen med molekylema bestiälas med energi som har en viss våglängd.

Molekyler i den observerade volymen exciteras av energin och avger därefter ett fluorescerande ljus (fluorescens) med en viss våglängd.

Medelst en ljusintensitetsdetektor observeras fluorescensemissionen i egenskap av en parameter som är beroende av antalet molekyleri den observerade volymen. Observationen av fluorescensernissionen, dvs. detektionen av intensiteten hos fluorescensemissionen fi-ån exciterade molekylerna som befinner sig i den observerade volymen pågår kontinuerligt under FCS. Detta kan liknas vid en kamera med ständigt öppen slutare. intensiteten hos fluorescenseniissionen är beroende av antalet exciterade molekyler som befinner sig i den observerade volymen. Fluorescensen från en molekyl efter en puls av excitationsenergi bidrar till intensiteten och är därmed observerbar/detekterbar under den tid som den exciterade molekylen befinner sig i den observerade volymen tills den har 10 15 20 25 30 526 643 10 diffunderat ut. Således är en molekyl observerbar/detekterbar under den genomsnittliga diffiisionstiden.

För att detektera en fluorescensintensitet som rätt motsvarar antalet molekyler i den observerade volymen måste samtliga molekyler i volymen vara exciterade. Enligt föreliggande uppfinning sker bestrålning av observationsvolymen med exciterande energi i pulser med en viss pulsfiekvens. Genom att pulsa excitationsenergin får fluorescensemissionen från molekylerna i observationsvolymen en tidsdiskret karaktär med en frekvens som är beroende av diffusionsfrekvensen. Därmed blir sarnplingsteorernet tillämpbart och således för att via pararnetern fluorescensernission korrekt observera tidstörloppet för en frekvensbeskrivning av antalet molekyler i observationsvolymen är det nödvändigt och tillräckligt att pulsfrekvensen hos excitationsenergin är dubbla diífusionsfrekverisien. Det vill säga att under tiden varje molekyl befinner sig i observationsvolymen hinner den bestrålas av en excitationspuls i genomsnitt två gånger. - Eficrsom excitationsenergin är tidsdiskret genom den pulsade bestrålningen blir i fluorescensemissionen fiån observationsvolyrnen också pulsad, alltså tidsdiskret. Utsignalen fiån detektorn för detektering av fluorescensemissionen blir då också diskret, det vill såga utsignalen innefattar pulser av intensitetstoppar efter varje excitationspuls. För att utsignalen fiån detektorn skall leverera en signal som motsvarar ett korrekt antal molekyler i observationsvolymen är det således tillräckligt att i enlighet med uppfinningen applicera ernitteringsenergi i pulser med en pulsfiekvens huvudsakligen motsvarande den dubbla diffusionsfiekverisen hos de för tillfället studerade molekylema. I Uppfinningen kan liknas vid en kamera med öppen slutare och pulserande belysning med möjlighet till en minimal eller minsta pulsfi-ekvens som lika med dubbla diffusionsfi-ekvensen.

Detta ger en tidsdiskret detektering eller sarnpling av en pararneter med tidsdiskret karaktär som är beroende av ett åtminstone i princip tidskontinuerligt förlopp. Detta i kontrast till känd teknik, som kan liknas vid en karnera med öppen slutare och kontinuerlig belysning eller kvasikontinuerli g belysning. Vilket alltså enligt känd teknik ger en tidskontinuerlig detektering av en åtminstone i princip tidskontinuerlig pararneter som är beroende av ett i princip tidskontinuerligt förlopp.

Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) med nulsad excitation 10 15 20 25 30 526 643 ll Fig 7 visar i ett översiktligt blockschema de principiella stegen för utförande av FCS med pulsad excitation enligt en utföringsform av uppfinningen, innefattande följande steg: 7_02: Anordna en observationsvolym enligt FCS med molekyler som skall studeras. 103: Applicera på observationsvolymen excitationsenergi i pulser med pulsfrekvens i området huvudsakligen motsvarande dubbla difñtsionsfiekvensen hos molekylema.

WE: Registrera emitterad fluorescens från observationsvolymen. ]_O_8_: Analysera nämnda registrerade fluorescens som är beroende av antalet molekyler i observationsvolymen.

Pulsad excitation enligt uppfinningen kommer generellt inte att innebära någon större förändring i hur ett FCS-instrument ser ut utan det kommer att vara möjligt att använda existerande utrustningar med modifierad styming av excitationsenergin. Enligt en föredragen utföringsforrn av uppfinningen krävs organ för att pulsa emitteringen av energi fiån excitationskällan, att repetitionsfiekvensen ska vara styrbar eller justerbar och att i korrelationsanalys sker med samma tidsupplösning som excítation.

Pulsningen och styrningen av repetitionsfrekvensen ñr pulsningen åstadkommas i olika utföringsforrner av uppfinningen exempelvis medelst en apertur med styrbar genomsläpplighet för excitationsenergi som genereras av excitationskällan.

I en utföringsform av uppfinningen anpassad för experiment med två färgämnen är dessutom excitationspulserna för de olika färgämnena styrbart separerbara i tiden. Genom tidsseparering av excitationspulsema minimeras det största problemet vid dessa typer av mätningar, nämligen falsk korrelation från färgämnen som emitterar i båda vâglängdsintervallen. Som exempel visas i Fig l grafer för absorbtion och emission för två vanlig färgämnen, Alexa Fluor 532 (ovan i figuren) och Alexa Fluor 633 (nedan i figuren) från Molecular Probes, Eugene, OR. Om excitationen sker samtidigt krävs det att den detektor som ska mäta signalen från Alexa Fluor 633 har ett filter som inte släpper igenom signal under 650 nm för att undvika att den även ska detektera signal från Alexa Fluor 532. Såsom framgår av Fig 1 har även Alexa Fluor 532 en betydande emission upp till 650 nm. Detta innebär att en stor del av emissionen fiån Alexa Fluor 633 filtreras bort enbart för att undvika överlapp av signal och detta innebär att signal- till brusförhållandet försämras avsevärt. Det är ett stort problem för tvåfárgs-F CS enligt känd teknik, att hitta två färgämnen som inte överlappar i emission 10 15 20 25 30 526 643 12 samtidigt som excitationsvåglängden inte får vara allt för olika. För stor olikhet leder nämligen till olika geometri för excitation.

När istället excitationspulserna är separerade, såsom i utßringsformer av uppfinningen, ßreträdesvis minst så mycket så att signalen hinner klinga av, givet det excitemde tillståndets livstid så vet man exakt vilket tärgärnne som exciteras vid en given tidpunkt och följaktligen i vilken detektor som den önskvärda signalen registreras.

I Fig 2 visas grafer genererade vid ett experimentet vid vilket en detektor iör grönt ljus är ßrsedd med ett filter som släpper igenom ljus med våglängder kortare än 600 mn och en detektor tör rött ljus med våglängd längre än 600 nm. När en grön laser (532 nm) belyser provet så exciteras dels Alexa Fluor 532 men även Alexa Fluor 633 till viss del. Vid en röd _ laserpuls (633 nm) så kommer enbart Alexa Fluor 633 exciteras och den röda detektorn tar emot ljus. Korrelation beräknas nu mellan grön fluorescens när den gröna lasern belyser provet och röd fluorescens vid röd excitation. På detta vis försvinner den så kallade cross-talk eller överhörning som annars skulle ha uppstått samtidigt som det är möjligt att ta till vara på maximalt av emitterad fluorescens. Denna princip gör det enklare att välja färgämnen men förbättrar också koirelationsanalysen. Det bör även vara möjligt att utöka detta till fler än två färgämnen och därmed öppnas möjligheter att studera reaktioner där fler reagenter deltar och mer än en bindning skapas eller bryts.

Beskrivning av modell Effekten av att pulsa excitationskällan kan visas med en enkel datormodell. Derma modell tar hänsyn till diffusion av molekyler in och ut ur detektionsvolymen (som är densamma som excitationsvolymen), excitation och relaxation samt blekning. Modellen är O-dimensionell, d.v.s. geometrin antas vara syrnmenisk i alla avseenden.

Omgivningen utanför detektionsvolymen antas vara oförändrad med avseende på antal molekyler. Flux av molekyler in i volymen antas vara lika med det flux som är riktat ut vilket ger att sannolikheten ßr att en molekyl diffunderar in eller ut ges av ekvationen At P. =-- dig Tdw 10 15 20 25 526 643 där At är det tidsintervall som betraktas och 14,37 den genomsnittliga diffusionstiden. I varje tidssteg i beräkningarna testas detta för varje molekyl. Detta ger antal molekyler som befinner sig i volymen vid varje enskilt tillfälle och därmed är utsatta för excitation. I Nästa steg är att bestämma hur mycket fluorescens de molekyler som befinner sig i volymen ger upphov till. Detta sker genom beräkning av hur energinivåer populeras via excitation och depopuleras genom relaxation till lägre energinivåer. Systemet som används antas ha tre nivåer, ett grundtillstånd N 1 (lägst energi) och två exciterade tillstånd, N; och N 3. Övergångshastighet (antal övergångar fi-ån en nivå till en arman per tidsenhet) betecknas kf,- dâr i representerar initial nivå och j slutnivå. I Fig 3 visas ett energinivådiagram med övergângshastigheter i enlighet med detta.

Population av de olika energinivåema bestäms av ekvationssystemet: N1=“k12N1+k21N2+ks1Ns Nz =+kx2N1'k21Nz 'kzsNz I Na =+k23N2 'ksiNa N=N,+N,+N, N 1: 2 = 3 = 0 där N betyder tidsderivatan av N. Inkluderat är även antagandet om järnvikt, Relaxation av N; med övergång till grundtillståndet kan ske antingen strålningslöst via kollisioner (k2°f” ) eller via emission av foton (kffd ). Antalet utsända fotoner per tidsenhet ges av N 2 kf och med antagandet att emissionen är isotrop, att ljusinsarnlande optik täcker rymdvinkeln-Q och att detektorns effektivitet är å så ges detekterad intensitet av: 1 I 71-' 10 15 20 25 30 526 643 14 Övergångshastigheter kan fås från litteraturen och några enkla beräkningar. Excitation ges av intensiteten hos excitationskållan (hm), tvärsnittsarean hos detektionsvolymen samt molekylens absorptionsförmåga (extinktionskoeñícient 6): 1,,,,,_ mio 81,” i nwå aoouv, w: ka: = 5 I F CS-experiment används som regel diifialctionsbegránsade objektiv vilket ger att diametern (2 mo) hos volymen är ungefär lika med laserljusets våglängd. Relaxationshastigheterria ges av livstiden r; och kvantutbytet 45 fór N23 q,_ kr _ a." kzrid +kzciu+kzs k21+k23 l "=k21+k23 1.' Molekylerna i modellen kan ha en eller flera tryptofan som står för den fluoresccns som berälmas. Tryptofan har en extinktionskoeflicient på 5500 M1 cm* (vid 280 nm) och fiån litteraturen fås att t; är 3 ns, d: är 10-30 % och kg; 20-80 106 S4. Övergångshastigheten fór N; uppskattas till 106 S4.

Det stora problemet för F CS är blekning och uppstår då N; populeras. Detta tillstånd år ett triplettillstånd med spin lika med 1 (medan N 1 och N; är singlettillstånd och har spin 0) och långlivat eftersom relaxation till grundtillståndet kräver ändring av spin. Molekyler i detta långlivade tillstånd (livstid omkring 1 us) har gott om tid att kollidera med 02 (triplett) och därmed relaxera till grundtillståndet samtidigt som O; (singlett) bildas. Denna i sin tur är mycket reaktiv och riskerar att förstöra molekylens fluorescerande egenskaper. För att ta hänsyn till detta betraktas alla tryptofaner som hamnar i N; som blekta och fortsättningsvis odugliga.

Resultat Graferna i F ig 4 - Fig 6 beskriver effekten av pulsad excitation. De motsvarar tre olika ”experiment” och vart och ett beskrivs av den fluoresccns som registreras samt resultatet av 10 15 20 25 30 526 643 15 beräkning av autokorrelation. I beräkningar har de sämsta villkoren antagits, d.v.s. kvantutbytet är 10 % och kg; är 80 106 s". Vidare antas intensiteten hos laserpulserna variera med 10 %, puls till puls, och utöver det ligger det 20 % brus. Antalet molekyler är 10, d.v.s utan blekning ska det firmas 10 molekyler i genomsnitt i volymen (dock inte vid varje enskild tidpunkt). Diffusionstiden är 100 ps, tidsintervallet i beräkningarna är 1 us och totala mättiden 100 ms.

I figur 4 visas kontinuerlig excitation av molekyler med en tryptofan. Utan blekning skulle autokorrelationskurvan (heldragen blå, knappt synbar) följa den röda linjen som beskriver diffusion. Detta är effekten av blekning, molekylerna bleks så fort de kommer in i volymen, intensiteten blir minimal och autokorrelationskurvan bestäms enbart av blekningsprocessen.

Grafema enligt Fig 5 erhålls i ett annat experiment i vilket excitationen pulsas med Nyqvistfiekvensen, difiixsionstiden är 100 p.s vilket innebär en excitationspuls var 50 ps.

Resultatet är slående, autokorrelationskurvan är synlig och beskrivs väl av den sarnmantagna effekten av diffusion och blekning. Blekning kan också betraktas som en slags diffusion, när en molekyl upphör att avge fluorescens så blir det liktydigt med att den har länmat volymen.

I det tredje experimentet, Fig 6, har molekylerna fem tryptofarier. Autokorrelationskurvan följer diffusionen nära och blekning har blivit enlångsam och inte särkilt viktig process.

Noterbart är också att korrelationsamplituden vid r=0 är 0.1 vilket stämmer bra mot att det i genomsnitt ska vara 10 molekyler i volymen (G(1:=0)=1/IV).

Sammanfattningsvis är effekten av pulsad excitation uppenbar, det vill säga att den negativa verkan av blekning undanröjs. Det är också klart att det är möjligt med FCS på proteiner som innehåller flera tryptofaner. Det är för närvarande oklart om det med uppfinningen kommer att vara möjligt att utföra mätningar på proteiner med endast en tryptofan, men detta är inte av avgörande betydelse. Pulsad excitation enligt uppfinningen förbättrar situation vad gäller blekning, dessutom innehåller de flesta proteiner fler än en tryptofan.

Uppfinningen kan varieras och implementeras på olika sätt inom ramen för de bifogade patentkraven.

Claims (17)

526 643 nu n 4 u n f.. n u n n z: . ; Q' 1 ' ' ' ' ' ' ' o "n n n u u u 0 I uu n v n 0 I , u o o o l 16 | n z :II ' ,' q u con uu n s u Patentkrav

1. En metod ßr fluorescenskorrelationsspektroskopi vid studium av ett tidsvarierande förlopp varvid molekyler exponeras med energi ñr åstadkommande av excitation av nämnda molekyler och varvid det detekteras påßlj ande emission från nämnda molekyler av fluorescens med en fórbestämd våglängd, kännetecknad av att nämnda energi appliceras i pulser med en pulsfrekvens åtminstone uppgående till två pulser per period hos det studerade tidsvarierande förloppet.

2. Metoden enligt föregående krav, varvid nämnda energi appliceras i pulser med en pulsfrekvens i området av två till 10 pulser per period hos det studerade tidsvarierande förloppet.

3. Metoden enligt krav 1, varvid nämnda energi appliceras i pulser med en pulsfrekvens i området av 0.01 till 999 kHz.

4. Metod enligt krav 1, varvid närrmda energi appliceras i pulser med en pulsfrekvens i området av 0.2 till 200 kiloHertz.

5. Metod enligt något av föregående krav, varvid antalet fluorescensemitterande enheter bestäms medelst en korrelationsanalys av nämnda detekterade emission.

6. Metod enligt något av föregående krav, varvid frekvensen hos den fluorescensemitterande processens tidsvariation bestäms medelst en korrelationsanalys av nämnda detekterade emission.

7. Metod enligt något av föregående krav, varvid nämnda energi appliceras i pulser med en pulsfrekvens huvudsakligen motsvarande den dubbla diffusionsfrekvensen hos nämnda molekyler.

8. Metoden enligt föregående krav, varvid nämnda molekyler exponeras med pulser av energi av en första och en andra våglängd. k) t!! 0: 0 , ,,. °..' ...Nå . .. .abb O-g Q-'l OOIO O nu no 0000 oo o o o 0 O I 0 o o 0 00 o I .U o oc u 0 000001 oc 00 o nu 0 526 643 -uno o u. .u u v ,' p n o n v g o 0 0 0 0 0 a n 0 o n o n .z _: z ,' . . p n oo- o u l 0 ' ° I , . . o 0 0 17 . u 2 o I ~ _' _ ._ u.. nu n e n e

9. Metoden enligt något av föregående krav, varvid nämnda molekyler exponeras med energi i pulser av en första och en andra fórbestämda pulsfrekvenser och med en förbestämd tidsfördröj ning mellan pulserna av nämnda första och andra pulsfrekvenser.

10. Metoden enligt något av föregående krav, varvid det detekteras emission fiån nämnda molekyler av fluorescens med en första och en andra fórbestämda våglängder.

11. Metoden enligt något av föregående krav, varvid nämnda molekyler är modifierade med ett färgämne.

12. Metoden enligt något av föregående krav, varvid nämnda molekyler innefattar ett forsta slag av molekyler som är modifierade med ett första färgämne och ett andra slag av molekyler som är färgade med ett andra färgämne.

13. Metoden enligt något av föregående krav, varvid nämnda molekyler innefattar fler än två slag av molekyler som är modifierade med olika färgämnen.

14. Metoden enligt något av föregående krav, varvid nämnda molekyler är av ett ßrsta slag som är modifierade med två eller flera olika färgämnen.

15. Metoden enligt något av föregående krav, varvid nänmda molekyler exponeras med nämnda energi i huvudsak genomsnittligen två gånger per nämnda molekylers passage genom en detektionsvolym av en lösning innehållande nämnda molekyler.

16. En apparat för fluorescenskorrelationsspelctroskopi varvid molekyler exponeras med energi för åstadkommande av excitation av nämnda molekyler och varvid det detekteras påföljande emission från närrmda molekyler av fluorescens med en förbestämd våglängd, kännetecknad av organ anordnade att åstadkomma steg och funktioner enligt något av kraven 1-1 5 .

17. En datorprogramprodukt för styrning av en apparat fór fluorescenskorrelationsspektroskopi varvid molekyler exponeras med energi för åstadkommande av excitation av nämnda molekyler och varvid det detekteras påföljande emission från nämnda molekyler av fluorescens med en förbestâmd frekvens, o. n Iso 0 oc! 0 0 0 t 0 A I u I o n 0 000 I O I I 0 u q 00 I o n :in o u an: ull o o 0 a 000 I ln i oo n 526 643 .u :“.: z OI o o g n u o u u o 0 I f . u n u en o a o n n n o c z z _' , q o 18 z z z 0.0 I .U g ., ,,,. oroa nu kännetecknad av progmmkod anordnad att styra en datorprocessor till att utföra stegen och flmktionerna enligt något kraven 1-15.