SE524094C2 - Detection of changes of magnetic response of magnetic particle(s) with external layer in carrier fluid, involves changing a hydrodynamic volume of the particle which implies change of frequency - Google Patents

Abstract

Detecting changes of a magnetic response of magnetic particle(s) provided with an external layer in a carrier fluid involves implying that upon modification of an effective volume of the particle or its interaction with the fluid, a hydrodynamic volume of the particle implies a change of frequency where an out of phase component of a magnetic susceptibility has its maximum. Detection of changes of a magnetic response of magnetic particle(s) provided with an external layer (21, 22) in a carrier fluid, includes using a measuring method comprising measuring the characteristic rotation time of the magnetic particle with respect to the external layer. The measuring method involves measuring Brownian relaxation in the carrier fluid under the influence of an external alternating magnetic field. The method further involves that upon modification of the effective volume of the particle or its interaction with the carrier fluid a hydrodynamic volume of the particle changes, which implies a change of the frequency (fmax) where an out of phase component of the magnetic susceptibility has its maximum. Independent claims are also included for: (1) a device for detecting changes of a magnetic response with magnetic particle(s) provided with the external layer in the carrier fluid, comprising a generating mechanism for generating the alternating magnetic field; at least two identical detection coils connected to detection electronics and sample containers for absorbing carrier fluid; and a measuring mechanism for measuring a change in the frequency where the out phase component of a magnetic susceptibility has its maximum at modification of the effective volume of the particle or its interaction with the carrier fluid when a hydrodynamic volume of the particle is changed; and (2) a method of determining an amount of molecules in a carrier fluid containing magnetic particles, comprising providing particles with a layer, which inter-/reacts with the substance to be analyzed; mixing the magnetic particles with the sample to be analyzed regarding molecules; filling a sample container with the fluid being prepared according the mixing step; placing a sample container in the detection system; applying an external measurement field over the sample with a certain amplitude and frequency; measuring the magnetic response (both the in phase and out of phase components) at this frequency; changing the frequency and performing again according to the placing and applying steps; and analyzing the result through determining a Brownian relaxation time from in phase and out of phase components by using data in the examined frequency interval.

Description

524 094 1 » ø o ~ a. a o Den slutgiltiga storleken i denna process beror på ett antal olika parametrar under tillverkningen. 524 094 1 »ø o ~ a. A o The final size of this process depends on a number of different parameters during manufacture.

Magnetiseringen i små magnetiska partiklar kan relaxera på två olika sätt, dels via Néel relaxation eller via Brownsk relaxation. Dessa relaxationsfenomen är relaterade till partiklar med en magnetiskt ordnad struktur. De skall inte förväxlas med kärnmagnetiska (N MR) resonansfenomen, då de senare beskriver resonanser inom atomkäman. De senare resonansfenomen har resonansfrekvenser typiskt i GHz-området till skillnad mot resonansfrekvenser för de fenomen som behandlas i detta patent som ligger i intervallet från några Hz till några MHz.The magnetization in small magnetic particles can relax in two different ways, partly via Néel relaxation or via Brownian relaxation. These relaxation phenomena are related to particles with a magnetically ordered structure. They should not be confused with nuclear magnetic resonance phenomena (N MR) resonance phenomena, as the latter describe resonances within the atomic nucleus. The latter resonant phenomena have resonant frequencies typically in the GHz range as opposed to resonant frequencies for the phenomena treated in this patent which range from a few Hz to a few MHz.

Néel relaxation I Néel relaxationen relaxerar magnetiseringen i partikeln utan att partikeln fysiskt roterar (ingen termisk blockering). Relaxationstiden för denna typ av relaxation beror starkt på storlek, temperatur, material och (vid höga partikelkoncentrationer) på den magnetiska växelverkan mellan partiklarna. För att denna relaxation skall föreligga måste magnetiseringsriktningen i partikeln ändra riktning snabbt med tiden, partiklarna måste vara superparamagnetiska. Néel relaxation tiden i nollfält kan vi beskriva enligt nedanstående ekvation: LV r N = roe ”T där rg är en karakteristisk relaxationstid, K är den magnetiska anisotropikonstanten, V magnetisk partikelvolym, k Boltzman's konstant och T temperaturen.Néel relaxation In the Néel relaxation, the magnetization in the particle relaxes without the particle physically rotating (no thermal blockage). The relaxation time for this type of relaxation depends strongly on size, temperature, material and (at high particle concentrations) on the magnetic interaction between the particles. In order for this relaxation to exist, the direction of magnetization in the particle must change direction rapidly with time, the particles must be superparamagnetic. Néel relaxation time in zero field we can describe according to the following equation: LV r N = roe ”T where rg is a characteristic relaxation time, K is the magnetic anisotropy constant, V magnetic particle volume, k Boltzman's constant and T the temperature.

Brownsk relaxation Iden Brownska relaxationen roterar magnetiseringsriktningen när partikeln fysiskt roterar. För att denna relaxation skall föreligga måste magnetiseringen vara låst i en specifik riktning i partikeln, partikeln måste vara termiskt blockerad. Relaxationstiden för Brownsk relaxation beror på hydrodynamisk partikelvolym, viskositet av den bärvätska där partiklama är dispergerade i, koppling mellan partikelns yta och vätskeskiktet 10 15 20 25 524 094 närmast dess yta (hydrofobicitet respektive hydrofilicitet), partikelns yttopografi samt på temperaturen. Den Brownska relaxationstiden kan approximativt beskrivas enligt nedanstående ekvation: = 3VH17 T” kr där VH är den hydrodynamiska volymen för den totala partikeln (inklusive polymer skiktet), 17 viskositeten för den omgivande bärvätska, k Boltzmann°s konstant och T är temperaturen. I härledningen ovan har man antagit en perfekt vätning (hydrofilicitet) samt en konstant rotationshastighet (den initiala approximationen har försummats).Brownian relaxation The Brownian relaxation rotates the direction of magnetization when the particle physically rotates. In order for this relaxation to exist, the magnetization must be locked in a specific direction in the particle, the particle must be thermally blocked. The relaxation time of Brownian relaxation depends on the hydrodynamic particle volume, viscosity of the carrier liquid in which the particles are dispersed, coupling between the surface of the particle and the liquid layer closest to its surface (hydrophobicity and hydrolysis), the surface topography and the temperature. The Brownian relaxation time can be approximately described according to the following equation: = 3VH17 T In the derivation above, a perfect wetting (hydro fi licity) and a constant rotational speed have been assumed (the initial approximation has been neglected).

Den Brownska relaxationstiden beror alltså på partikelns (effektiva) storlek samt på omgivningens inverkan på partikeln. För att särskilja om en partikel uppvisar Brownsk relaxation eller Neélsk relaxation kan man bl.a. studera huruvida ändrad yttre påverkan (till exempel annan vätskeviskositet, temperatur ändringar, applicerat statiskt magnetfält) ändrar relaxatíonstiden.The Brownian relaxation time thus depends on the (effective) size of the particle and on the effect of the environment on the particle. To distinguish whether a particle exhibits Brownian relaxation or Neelian relaxation, one can e.g. study whether altered external influences (eg other liquid viscosity, temperature changes, applied static magnetic field) change the relaxation time.

Man kan även studera fenomenen i frekvensdomänen, varvid det gäller att bestämma resonansfrekvensema för partikelsystemet ifråga. Dessa kan erhållas t.ex. m.h.a. AC- susceptometri (för Brownsk relaxation några Hz till kHz regionen och för Néelsk relaxation typiskt i MHz regionen).It is also possible to study the phenomena in the frequency domain, in which case it is a matter of determining the resonant frequencies of the particle system in question. These can be obtained e.g. m.h.a. AC susceptometry (for Brownian relaxation a few Hz to the kHz region and for Néelsk relaxation typically in the MHz region).

Som synes ovan beror Brownsk rörelse (Brownsk relaxation) bl.a. på partikelns volym: ju större en partikel är desto längre blir relaxationstiden dvs. desto mindre blir partikelns rörelse. Relaxationstider för partiklar större en ca lum är mycket längre än l sekund, vilket i praktiken innebär en försumbar rörelse. Trots det kan även sådana partiklar användas vid detektion. Större partiklar kan dock uppvisa andra typer av relaxationer där partiklamas tröghet och bärvätskans viskoeleastiska egenskaper måste inkluderas för en tillfredställande datatolkning.As seen above, Brownian movement (Brownian relaxation) depends i.a. on the particle volume: the larger a particle is, the longer the relaxation time, ie. the less is the motion of the particle. Relaxation times for particles larger than about lum are much longer than 1 second, which in practice means a negligible movement. Nevertheless, such particles can also be used in detection. Larger particles can, however, exhibit other types of relaxations where the inertia of the particles and the viscoelastic properties of the carrier liquid must be included for a satisfactory data interpretation.

Frekvensberoende susceptibilitet Magnetiseringen for ett partikelsystem i ett altemerande magnetfält kan beskrivas enligt: 10 15 20 25 524 094 M = zH =H där M är magnetiseringen, H det altemerande yttre magnetfältet, 1 den frekvensberoende komplexa susceptibíliteten bestående av en ifas komponent (realdel), j, och en ur fas komponent (imaginärdel), 1". Ifas och urfas komponenterna för ett magnetiskt partikelsystem kan approximativt beskrivas som: : Zo iqzflffy .. _ roa/w) l *iiflzfyflï Där 10 är DC värdet av susceptibiliteten och r är relaxationstiden för magnetisk z. relaxation.Frequency-dependent susceptibility The magnetization of a particle system in an alternating magnetic field can be described as: M = zH = H where M is the magnetization, H is the alternating external magnetic field, j, and an out of phase component (imaginary part), 1 ". If the and out of phase components of a magnetic particle system can be approximately described as: Zo iqz relaxation time for magnetic z. relaxation.

Om vi antar att vi har ett partikelsystem med varierande partikelstorlekar där en del partiklar genomgår Brownsk relaxation (de större partiklarna) och en del Néelsk relaxation (de mindre partiklarna) erhåller man ett magnetiskt responsbidrag från båda relaxationsprocesserna beroende av frekvensområde AC fältet. F ig. 1 visar schematiskt den totala magnetiska responsen som funktion av frekvensen för ett partikelsystem som uppvisar både Brownsk och Néelsk relaxatíon. Den övre kurvan (streckad linje) i figuren är realdelen av susceptibiliteten och den undre kurvan (heldragen linje) är den imaginära delen av susceptibiliteten. Maximumet för imaginärdelen vid lägre frekvenser är från den Brownska relaxationen och maximumet vid högre frekvenser är från den Néelska relaxationen. Den totala magnetiska responsen blir då summan av bidragen från de båda processerna för både real och imaginärdel av susceptibiliteten.If we assume that we have a particle system with varying particle sizes where some particles undergo Brownian relaxation (the larger particles) and some Néelsk relaxation (the smaller particles), we obtain a magnetic response contribution from both relaxation processes depending on the frequency range AC field. F ig. 1 schematically shows the total magnetic response as a function of the frequency of a particle system exhibiting both Brownian and Neelic relaxation. The upper curve (dashed line) in the figure is the real part of the susceptibility and the lower curve (solid line) is the imaginary part of the susceptibility. The maximum for the imaginary part at lower frequencies is from the Brownian relaxation and the maximum at higher frequencies is from the Néelska relaxation. The total magnetic response then becomes the sum of the contributions from the two processes for both real and imaginary part of the susceptibility.

För denna tillämpning är man endast intresserad av den Brownska relaxationen, varför koncentreras diskussionen vid dessa lägre frekvenser.For this application, one is only interested in the Brownian relaxation, which is why the discussion is concentrated at these lower frequencies.

För ett partikelsystem med partiklar som uppvisar Brownsk relaxation med endast en hydrodynamisk volym erhåller man ett maximum i urfas komponenten ( 1", den imaginära delen av den komplexa susceptibiliteten) vid en frekvens enligt: I 0 9 :lo n var anna n u I v a se anno en :noe av 10 15 20 25 524 094:ßïfifs::@1f 1 __ kT 21:15 6/rVH77 finax _ Runt denna frekvens, f,,,,,,, kommer realdelen av susceptibiliteten, j, att minska kraftigt medan den imaginära delen av susceptibiliteten, x" , kommer att uppvisa ett maximum.For a particle system with particles exhibiting Brownian relaxation with only a hydrodynamic volume, a maximum in the primordial component (1 ", the imaginary part of the complex susceptibility) is obtained at a frequency according to: I 0 9: lo n var anna nu I va se anno en: noe av 10 15 20 25 524 094: ßï fi fs :: @ 1f 1 __ kT 21:15 6 / rVH77 finax _ Around this frequency, f ,,,,,,, the real part of the susceptibility, j, will decrease sharply while the imaginary part of the susceptibility, x ", will exhibit a maximum.

Värdet av 1" vid maximumet (B i figur 1) är bl.a. ett mått på antalet partiklar som genomgår Brownsk relaxation medan nivån hos den magnetiska responsen för g' (C i figur 1) efter maximumet i g" är ett mått på totala antalet partiklar som fortfarande magnetiskt kan följa med det applicerade AC fältet (i detta fall partiklar som genomgår Néelsk relaxation). Vid tillräckligt låga frekvenser kan alla partiklar magnetiskt följa med AC fältet, d.v.s. realdelen av susceptibiliteten vid dessa låga frekvenser (A i figur 1) är ett mått på det totala antalet partiklar. Bidraget från de Brownska partiklarna kan då kvantifieras som skillnaden mellan totalbidraget, A, och det Néelska bidraget, C (D i figur 1). Vid högre frekvenser erhålles ett nytt maxima i g" p.g.a. den Néelska relaxationen (E i figur 1). Jämförelse mellan dessa två värden är alltså ett mått på koncentrationen av partiklar i ett prov som genomgår den Brownska relaxationen vilket är av intresse för denna tillämpning. Bredden hos maximumet hos 1" , 6 fmax, (och hastigheten på avklingningen av x) är ett mått på energidissipationen pga. vätskans återverkan på partiklar (friktionen). Fiiktionen varierar med (framför allt) spridningen i den hydrodynamiska volymen mellan partiklarna som en partikelpopulation i ett prov kan uppvisa, men beror i viss mån också på statistiska (temperaturberoende) fluktuationer.The value of 1 "at the maximum (B in Figure 1) is, among other things, a measure of the number of particles undergoing Brownian relaxation, while the level of the magnetic response of g '(C in Figure 1) after the maximum in ig" is a measure of total the number of particles that can still magnetically accompany the applied AC field (in this case particles undergoing Néelsk relaxation). At sufficiently low frequencies, all particles can magnetically follow the AC field, i.e. the real part of the susceptibility at these low frequencies (A in Figure 1) is a measure of the total number of particles. The contribution from the Brownian particles can then be quantified as the difference between the total contribution, A, and the Néelska contribution, C (D in Figure 1). At higher frequencies a new maximum is obtained due to the Neelsian relaxation (E in Figure 1). Comparison between these two values is thus a measure of the concentration of particles in a sample undergoing the Brownian relaxation which is of interest for this application. The width at the maximum of 1 ", 6 fmax, (and the rate of decay of x) is a measure of energy dissipation due to. the effect of the liquid on particles (friction). The fiction varies with (above all) the distribution in the hydrodynamic volume between the particles that a particle population in a sample can show, but also depends to some extent on statistical (temperature-dependent) fluctuations.

Genom att mäta susceptibilitet, den Brownska relaxationstiden samt energidissipationen skulle man kunna bestämma den totala partikelkoncentrationen, graden av partiklar som genomgår Borownsk relaxation i denna partikelpopulation, medelstorleken av en partikel i en bärvätska samt spridningen i partikelvolymer.By measuring susceptibility, the Brownian relaxation time and the energy dissipation, one could determine the total particle concentration, the degree of particles undergoing Borownian relaxation in this particle population, the average size of a particle in a carrier liquid and the dispersion in particle volumes.

Man har tidigare använt magnetiska partiklar som bärare av biomolekyler eller antikroppar för att mäta förändringar i deras magnetiska respons. I dessa metoder har man antingen bundit partiklarna till en fast yta eller låtit partiklama att aggregera. Man har mätt hur den magnetiska remanensen avtar med tiden [6] efter det att partikelsystemet blivit magnetiserat eller så har man mätt upp den magnetiska responsen då ett externt 10 15 20 25 524 094 .n n.. magnetfält applicerades över de magnetiska paitiklama [S] I dessa mätningar har man kunnat skilja mellan den Néelska relaxationen och den Brownska relaxationen.Magnetic particles have previously been used as carriers of biomolecules or antibodies to measure changes in their magnetic response. In these methods, the particles have either been bound to a solid surface or the particles have been allowed to aggregate. It has been measured how the magnetic remanence decreases with time [6] after the particle system has been magnetized or the magnetic response has been measured when an external magnetic field was applied over the magnetic particles [S ] In these measurements it has been possible to distinguish between the Néelska relaxation and the Brownian relaxation.

Mätningarna har utförts med en helt annan teknik än vad som är fallet för föreliggande uppfinning, så kallad SQUID-teknik som kräver kryovätskor och avancerad elektronik har använts. Även Grossman et al, ref. 6, använder sig också av antikroppsbeklädda magnetiska nanopartiklar för att bestämma särskilda målmolekyler, men kombinerar detta med SQUID teknologin, dvs. med en supraledande detektor.The measurements have been performed with a completely different technique than that of the present invention, so-called SQUID technology which requires cryo-liquids and advanced electronics has been used. Also Grossman et al, ref. 6, also uses antibody-coated magnetic nanoparticles to determine specific target molecules, but combines this with SQUID technology, ie. with a superconducting detector.

Det finns minst tre väsentliga skillnader mellan förfarande enligt föreliggande uppfinning och ovan nämnda metoder: (i) de fysikaliska principer bakom mätningarna enligt uppfinningen är annorlunda från tidigare arbeten då andra har valt att mäta i tidsdomänen i st. f. i frekvensdomänen såsom redovisas här, samt att det är nödvändigt att ”förmagnetisera” paitikelsystemet. (ii) Den mätmetod som många använder för mätningar bygger på en, visserligen mycket känslig, men dyr och komplicerat teknologi, - nämligen på SQUID- teknologin. (iii) Uppfinningen baseras på att agglomerering av partiklar undvikes. Detta åstadkommes genom att förse partiklarna med en yta som har sådana egenskaper så att agglomerat inte bildas. T ex kan partiklarnas yta vara täckt med monoklonala antikroppar, som reagerar specifikt med den substans som skall analyseras. Enligt känd teknik har biomolekyler med multipla bindningsställen analyserats Kötitz et al, ref. 7, har också studerat den Brownska relaxationen i system av magnetiska nanopartiklar. De har använt sig av magnetiska kulor som var täckta med biotin. De har till detta system tillsatt olika mängd avidin. Då avidin har 4 bindningsställen till biotin, bildas avidin-inducerade agglomerat. I föreliggande metod väljs molekyl 1 och molekyl 2 på ett sådant sätt att agglomerat inte bildas. Det kan t ex vara monoklonala antikroppar (molekyl 1) som binds in till den magnetiska kulan. Denna monoklonala antikropp skall u cc o 10 15 20 25 30 524 094 o - » n ; n - . . - a. endast binda till en specifik epitop på målmolekylen, vilket leder till förhindrande av agglomerat (fig. 9).There are at least three significant differences between the method according to the present invention and the above-mentioned methods: (i) the physical principles behind the measurements according to the invention are different from previous work as others have chosen to measure in the time domain in st. f. in the frequency domain as reported here, and that it is necessary to "pre-magnetize" the paiticle system. (ii) The measurement method used by many for measurements is based on a technology, albeit very sensitive, but expensive and complicated, - namely the SQUID technology. (iii) The invention is based on avoiding agglomeration of particles. This is accomplished by providing the particles with a surface that has such properties that agglomerates do not form. For example, the surface of the particles may be covered with monoclonal antibodies, which react specifically with the substance to be analyzed. According to the prior art, biomolecules with multiple binding sites have been analyzed Kötitz et al, ref. 7, has also studied the Brownian relaxation in magnetic nanoparticle systems. They have used magnetic beads that were covered with biotin. They have added different amounts of avidin to this system. When avidin has 4 binding sites to biotin, avidin-induced agglomerates are formed. In the present method, molecule 1 and molecule 2 are selected in such a way that agglomerates are not formed. For example, it may be monoclonal antibodies (molecule 1) that bind to the magnetic bead. This monoclonal antibody should u cc o 10 15 20 25 30 524 094 o - »n; n -. . - a. only bind to a specific epitope on the target molecule, leading to the prevention of agglomerates (fi g. 9).

Det som ytterligare skiljer metoden enligt uppfinningen från liknande metoder är att här studeras hur den magnetiska responsens frekvensberoende ändras vid olika mätfrekvenser med en relativ enkel mätuppställning. Det som ytterligare skiljer föreliggande metod är att enligt uppfinningen bindes olika biomolekyler eller antikroppar till partikelytan som ändrar den hydrodynamiska volymen. Enligt tidigare metoder så binder man partiklarna till en fast yta eller låter partiklar att aggregera.What further distinguishes the method according to the invention from similar methods is to study here how the frequency dependence of the magnetic response changes at different measuring frequencies with a relatively simple measuring setup. What further distinguishes the present method is that according to the invention different biomolecules or antibodies bind to the particle surface which changes the hydrodynamic volume. According to previous methods, the particles are bound to a solid surface or particles are allowed to aggregate.

Kortfattad Beskrivning av Uppfinningen Uppfinningen avser att detektera förändringar av den magnetiska responsen hos magnetiska partiklar som uppvisar den Brownska relaxationen i en bärvätska (t.ex. vatten eller en lämplig buffert vätska, eller annan vätska lämplig for de biomolekyler som är det slutliga målet för detektionen) under inverkan av ett yttre AC-magnetfält. Vid modifiering av partiklamas effektiva volym eller deras växelverkan med den omgivande vätskan, till exempel då biomolekyler eller antikroppar bindes på deras ytor, så kommer den hydrodynamiska volymen av respektive partiklar att ändras (öka) vilket innebär en ändring (minskning) av den frekvens, fm, där urfas komponenten av den magnetiska susceptibiliteten har sitt maximum.Brief Description of the Invention The invention aims to detect changes in the magnetic response of magnetic particles which exhibit the Brownian relaxation in a carrier liquid (eg water or a suitable buffer liquid, or other liquid suitable for the biomolecules which is the ultimate target of the detection). ) under the influence of an external AC magnetic field. When modifying the effective volume of the particles or their interaction with the surrounding liquid, for example when biomolecules or antibodies are bound on their surfaces, the hydrodynamic volume of the respective particles will change (increase) which means a change (decrease) of the frequency, fm , where the phase-out component of the magnetic susceptibility has its maximum.

Därför innefattar den inledningsvis nämnda metoden utnyttjande av en mätmetod innefattande mätning av nämnda magnetiska partikelns karaktäristiska rotationstid med hänsyn till nämnda yttre skikts påverkan. Nämnda mätmetod innebär mätning av Brownsk relaxation i nämnda bärvätska under inverkan av ett yttre altemerande magnet fält. Nämnda mätning innebär mätning av i- och/eller urfaskomponenter av en magnetisk susceptibilitet i ett frekvensplan. Dessutom innebär nämnda mätning att vid modifiering av partikelns effektiva volym eller dess växelverkan med den omgivande vätskan ändras en hydrodynamisk volym av respektive partikel, vilket innebär en ändring av den frekvens ( fm) där en urfas komponent av den magnetiska susceptibiliteten har sitt maximum. Mätningen är i själva verket en relativ mätning, varvid ändringar i ett u oo I apan aa 10 15 20 25 ~ ~ ~ a na a v som a n u: n nu -o a. n... n . a. a a - n o u. a n; n n .. n nu » n u u a n Q u. n n f... »n u a u a n - »nu »v - u -a u s u n o w « ._ .nu n. nu ~- nu. modifierat partikelsystem jämfóres med ett ursprungligt system. För mätningen användes åtminstone två provhållare och två detektorspolar. F öreträdesvis användes en oscillatorkrets vid en frekvens, d.v.s. resonansfrekvensen, där detektorspolar placeras som ett frekvensbestämmande element i oscillatorkretsen så att de ligger ur fas med varandra. Därför effekten eller amplituden av oscillationer från oscillatorkretsen över spolar mäts.Therefore, the initially mentioned method comprises utilizing a measuring method comprising measuring the characteristic rotation time of said magnetic particle with regard to the influence of said outer layer. Said measuring method involves measuring Brownian relaxation in said carrier liquid under the influence of an external alternating magnetic field. Said measurement involves measuring in- and / or phase-out components of a magnetic susceptibility in a frequency plane. In addition, said measurement means that when modifying the effective volume of the particle or its interaction with the ambient liquid, a hydrodynamic volume of the respective particle changes, which means a change of the frequency (fm) where a phase component of the magnetic susceptibility has its maximum. The measurement is in fact a relative measurement, whereby changes in a u oo I apan aa 10 15 20 25 ~ ~ ~ a na a v as a n u: n nu -o a. N ... n. a. a a - n o u. a n; n n .. n nu »n u u a n Q u. n n f ...» n u a u a n - »nu» v - u -a u s u n o w «._ .nu n. nu ~ - nu. modified particle system is compared to an original system. At least two sample holders and two detector coils were used for the measurement. Preferably, an oscillator circuit is used at a frequency, i.e. the resonant frequency, where detector coils are placed as a frequency determining element in the oscillator circuit so that they are out of phase with each other. Therefore, the power or amplitude of oscillations from the oscillator circuit across coils is measured.

En extem oscillator-/frekvensgenerator kan anordnas, varvid spolar placeras i en altemerande brygga så att skillnaden mellan bägge detektorspolar mäts, och att fasskillnaden mellan frekvensgeneratoms utgångsström och/eller -spänning och en ström/spänning over bryggan mäts. I detta fall kan en amplitudskillnad mellan oscillatoms utgängs- ström/spänning mätas och jämföras med en amplitud hos strömmen/spänningen i bryggan. Mätningen utföres vid en eller flera olika frekvenser.An extreme oscillator / frequency generator can be provided, in which coils are placed in an alternating bridge so that the difference between the two detector coils is measured, and that the phase difference between the output generator and / or voltage of the frequency generator and a current / voltage across the bridge is measured. In this case, an amplitude difference between the output current / voltage of the oscillator can be measured and compared with an amplitude of the current / voltage in the bridge. The measurement is performed at one or olika your different frequencies.

Dessutom kan en bruskälla användas och att systemets respons analyseras med hjälp av en FFT (Fast F ourie Transform) analys av en utgående signal.In addition, a noise source can be used and that the system's response is analyzed by means of an FFT (Fast Fourier Transform) analysis of an output signal.

Enligt ett utförande nollställes signalskillnad mellan nämnda spolar, vilken sker genom att mekaniskt justera in läge hos respektive provhållare altemativt ändra läget av respektive detektionsspole så att differenssignalen minimeras. Nämnda nollställning kan ske genom att minimera signalen genom att tillföra en bestämd mängd av ett magnetiskt ämne i ett av utrymmen där provhållama är placerade, så att ämnet skapar ett extra bidrag till den ursprungliga signalen som kan därigenom nollställas. Det magnetiska ämnet uppvisar väsentligen noll magnetisk förlust (imaginärdel=O) och att en realdel av susceptibiliteten är konstant i det undersökta frekvensområdet.According to an embodiment, the signal difference between said coils is reset, which takes place by mechanically adjusting the position of the respective sample holder or alternatively changing the position of the respective detection coil so that the difference signal is minimized. Said zeroing can take place by minimizing the signal by applying a certain amount of a magnetic substance in one of the spaces where the sample holders are located, so that the substance creates an extra contribution to the original signal which can thereby be zeroed. The magnetic substance exhibits substantially zero magnetic loss (imaginary part = 0) and that a real part of the susceptibility is constant in the frequency range examined.

Företrädesvis men inte uteslutande används metoden i analysinstrument för analys av olika biomolekyler eller andra molekyler i vätska. Nämnda molekyler, innefattar en eller flera av proteiner i en vätskelösning, såsom blod, blodplasma, serum eller urin. Nämnda analys (molekyl 2) kan kopplas till nämnda partikel genom interaktion med en andra -nnon 10 15 20 25 30 5 2 4 0 g l z '_ Nu I u n q .n u .. n... . .Preferably but not exclusively, the method is used in analytical instruments for the analysis of various biomolecules or other molecules in liquid. Said molecules, comprise one or fl era of proteins in a liquid solution, such as blood, blood plasma, serum or urine. Said assay (molecule 2) can be coupled to said particle by interaction with a second -nnon 10 15 20 25 30 5 2 4 0 g l z '_ Nu I u n q .n u .. n .... .

Q -l I w : : z o» e n p . ._ e» »- . .. ., _ »a »en - .. u a - u ' 'h . " I s . . _ , l n - n .u .a n.. molekyl (molekyl 1), vilken innan analysens början kopplas till partikeln. Molekyler som kan interageras specifikt med varandra kan innefatta en eller flera av antikropp - antigen, receptor - hormon, två komplementära enkelsträngar av DNA och enzym - substrat / enzym ~ inhibitor.Q -l I w:: z o »e n p. ._ e »» -. ..., _ »A» en - .. u a - u '' h. "In s.. hormone, two complementary single strands of DNA and enzyme substrate / enzyme inhibitor.

Enligt en töredragen utförande modifieras den magnetiska partikelns yta genom att belägga ytan med en eller flera av dextrane, med alkanethioler med lämpliga ändgrupper eller med vissa peptider. Dextranytan (eller annan lämpligt mellanskikt) kan sedan en forsta molekyl, t ex en antikropp, bindas in med hjälp av t ex cyanobromidaktivering eller med karboxylsyraaktivering.According to a preferred embodiment, the surface of the magnetic particle is modified by coating the surface with one or more of dextrans, with alkane ethiols having suitable end groups or with certain peptides. The dextran surface (or other suitable intermediate layer) can then be bound to a first molecule, eg an antibody, by means of eg cyanobromide activation or by carboxylic acid activation.

Uppfinningen avser även en anordning för utförande av en metod för detektering av förändringar av en magnetisk respons hos åtminstone en magnetisk partikel försedd med ett yttre skikt i en bärvätska, vilken metod innefattar mätning av nämnda magnetiska partikelns karaktäristiska rotationstid med hänsyn till nämnda yttre skikts påverkan.The invention also relates to an apparatus for performing a method for detecting changes in a magnetic response of at least one magnetic particle provided with an outer layer in a carrier liquid, which method comprises measuring the characteristic rotation time of said magnetic particle with regard to the influence of said outer layer.

Anordningen innefattar åtminstone två väsentligen identiska detektionsspolar anslutna till detekteringselektronik och provhållare för upptagande av bärvätska. Nämnda detektionsspolar och provhållare kan omges av en excitationsspole för alstring av ett homogent magnetiskt fält vid nämnda provhållare. Enligt ett utförande när nämnda excitationsspole, mätspolar samt provhållare placerade koncentriskt samt injusterade kring dess vertikala centrumaxel. Anordningen kan dessutom innefatta ett oscillatorsystem där detekteringsspolama utgör frekvensbestämmande element i en oscillatorkrets. Nämnda spolar är anordnade i oscillatoms returslinga. Spolama som omger respektive prov är elektriskt fasvridna gentemot varandra så att resonansfrekvensen bestäms av skillnaden mellan respektive spolens induktans och resistans. Spolama är placerade i en AC-brygga. En op-förstärkare kan anordnas för subtrahering av två spänningar från varandra.The device comprises at least two substantially identical detection coils connected to detection electronics and sample holders for receiving carrier liquid. Said detection coils and sample holder can be surrounded by an excitation coil for generating a homogeneous magnetic field at said sample holder. According to an embodiment when said excitation coil, measuring coils and sample holder are placed concentrically and adjusted around its vertical center axis. The device may further comprise an oscillator system where the detection coils constitute frequency determining elements in an oscillator circuit. Said coils are arranged in the return loop of the oscillator. The coils surrounding each sample are electrically phase shifted relative to each other so that the resonant frequency is determined by the difference between the inductance and resistance of the respective coil. The coils are placed in an AC bridge. An op amplifier can be provided for subtracting two voltages from each other.

Anordningen innefattar i ett utförande en faslåsningskrets. I en andra utföringsforrn innefattar anordningen oscillator/frekvensgenerator signaler för att generera tidsvariabel u n o oss: oc nun: 10 l5 20 k) 'Jl 524 094 n. .- ' - - - s. 10 ström for att excitera spolama medelst vitt brus. Frekvensberoende information erhålles genom en FFT-filtrering av responsen.The device in one embodiment comprises a phase locking circuit. In a second embodiment, the device comprises oscillator / frequency generator signals for generating time variable u n o os: oc nun: 10 l5 20 k) 'Jl 524 094 n..' '- - - p. 10 current to excite the coils by means of white noise. Frequency-dependent information is obtained by an FFT filtering of the response.

Uppfinningen avser även en metod för bestämning av mängd av molekyler i en bärvätska innehållande magnetiska partiklar innefattande stegen att: A. förse partiklar med ett skikt, vilket inter-/reagerar med den substans som skall analyseras, B. blanda de magnetiska partiklama med det prov som skall analyseras med avseende på molekyler, fylla en provbehållare med vätskan som har förberetts enlig B, placera provhållare i detekteringssystem, FUUO applicera ett externt mätfált över provet med en viss amplitud och frekvens, F11 uppmäta den magnetiska responsen (både ifas och urfas komponenterna) vid denna frekvens, G. ändra frekvens och utför mätning igen enligt D och E, H. analysera resultatet genom att bestämma en Brownsk relaxationstid från ifas och urfas komponenter genom att använda data i det undersökta frekvensintervallet.The invention also relates to a method for determining the amount of molecules in a carrier liquid containing magnetic particles comprising the steps of: A. providing particles with a layer, which inter- / reacting with the substance to be analyzed, B. mixing the magnetic particles with the sample to be analyzed for molecules, fill a sample container with the liquid prepared according to B, place sample container in detection system, FUUO apply an external measuring field over the sample with a certain amplitude and frequency, F11 measure the magnetic response (both ifas and urphase components) at this frequency, G. change frequency and perform measurement again according to D and E, H. analyze the result by determining a Brownian relaxation time from ifas and urphase components by using data in the examined frequency range.

Metoden innebär dessutom att bestämma frekvensskiftet (for samma värde av ifas och urfas komponent) vid olika frekvenser. Nämnda molekyl består av en biomolekyl.The method also involves determining the frequency shift (for the same value of the ifase and out-of-phase component) at different frequencies. Said molecule consists of a biomolecule.

Beskrivning av figurerna I det följande beskrivs uppfinningen med hänsyn till några utfóringsforrner med hänvisning till bifogade figurer, i vilka: Fi g. 1 visar den magnetiska responsen som funktion av frekvens för ett partikelsystem som uppvisar både Brownsk och Néelsk relaxation, Fig. 2 visar schematiskt ett snitt genom en roterande magnetisk partikel med lämpliga mellanskikt och biomolekyler, ca 0 o r n oo coca o' oan- 10 15 20 25 30 524 094 . en ..- 11 Fig. 3 visar hur ifas och urfas komponenten av den magnetiska susceptibiliteten varierar med frekvensen vid rumstemperatur för två olika hydrodynamiska diametrar, Fig. 4 visar en spoles ekvívalenta krets.Description of the figures In the following, the invention is described with reference to some embodiments with reference to the accompanying figures, in which: Fig. 1 shows the magnetic response as a function of frequency for a particle system which exhibits both Brownian and Néelsk relaxation, Fig. 2 shows schematically a section through a rotating magnetic particle with suitable intermediate layers and biomolecules, approx. Fig. 3 shows how the phase and out-phase component of the magnetic susceptibility varies with the frequency at room temperature for two different hydrodynamic diameters, Fig. 4 shows the equivalent circuit of a coil.

Fi g. 5 visar ett schematiskt snitt genom ett exemplariskt mätsystein, enligt uppfinningen, Fig. 6 visar injustering av mätsystemet, enligt uppfinningen m.h.a. av tillsats ett magnetiskt material som uppvisar j=konstant och 1"=0 i det frekvenintervall som används vid mätningen av den Brownska relaxationen, Fig. 7 visar schematiskt en alternativ detektionskrets (differentiell mätning utan excitationsspole), enligt uppfinningen, Fig. 8 visar schematiskt en applikation, enligt uppfinningen, och Fig. 9 visar en monoklonal antikropp som interagerar specifikt med endast en epitop på ett antigen.Fig. 5 shows a schematic section through an exemplary measuring system, according to the invention, Fig. 6 shows adjustment of the measuring system, according to the invention m.h.a. of addition a magnetic material having j = constant and 1 "= 0 in the frequency range used in the measurement of the Brownian relaxation, Fig. 7 schematically shows an alternative detection circuit (differential measurement without excitation coil), according to the invention, Fig. 8 shows schematically an application, according to the invention, and Fig. 9 shows a monoclonal antibody that interacts specifically with only one epitope on an antigen.

Beskrivning av uppfinningen Figur 3 visar hur ifas och urfas komponenten av den magnetiska susceptíbiliteten varierar med frekvensen vid rumstemperatur för två olika hydrodynamiska diametrar, 50 nm (kurvoma 2) och 60 nm (kurvoma 1) då partiklarna genomgår Brownsk relaxation.Description of the invention Figure 3 shows how the phase and out-phase component of the magnetic susceptibility varies with the frequency at room temperature for two different hydrodynamic diameters, 50 nm (curves 2) and 60 nm (curves 1) as the particles undergo Brownian relaxation.

Partiklarna är dispergerade i vatten. Urfas komponenterna för respektive partikel uppvisar ett maximum vid den frekvens som motsvarar den Brownska relaxationstiden medan ifas komponenter avklingar vid den frekvensen.The particles are dispersed in water. The phase-out components for each particle have a maximum at the frequency corresponding to the Brownian relaxation time, while the phase components decay at that frequency.

Ett känt förfarande är att detektera både g' och 1" över ett brett frekvensintervall från några Hz till uppemot några MHz för de olika (yt-)modifikationer och jämföra dessa med varandra (se figur 1 och 3) via en efterbehandling av den insamlade datan.A known method is to detect both g 'and 1 "over a wide frequency range from a few Hz to up to a few MHz for the various (surface) modifications and compare these with each other (see Figures 1 and 3) via a post-processing of the collected data. .

Om önskemålet är att undersöka effekten av partikelmodifieringen (-modifieringar) så bör vätskans viskositet förbli konstant. Viskositetsändringar ändrar också partiklamas Brownska rörelse, och ändrar 1' och 1" frekvensberoende. Inverkan av viskositetsändringar kan därför vara svåra att skilja från bidrag orsakade p. g.a. partikelmodifikationer. Å andra sidan kan effekten utnyttjas för att jämföra olika vätskors viskositet varvid man använder identiska partiklar men ändrar vätskan ifråga. 0100 v o u c o o at: a: :oss av 10 15 20 25 524 094 .n ..- 12 En metod är att fokusera på detektionen av gpch 1" vid endast en frekvens, fm, och samtidigt bestämma åfmm eller kring ett fåtal diskreta frekvensvärden. Vid behov kan man i ett separat karakterisera ett givet partikelsystem, till exempel map graden av Brownsk relaxation eller storleksspridning.If the desire is to investigate the effect of the particle modification (modifications), the viscosity of the liquid should remain constant. Viscosity changes also change the Brownian motion of the particles, changing the frequency dependence of 1 'and 1 ". The effect of viscosity changes can therefore be difficult to distinguish from contributions caused by particle modifications. On the other hand, the effect can be used to compare different liquid viscosity the liquid in question. discrete frequency values. If necessary, one can in a separate characterize a given particle system, for example map the degree of Brownian relaxation or size distribution.

För att dessa metoder skall fungera måste partiklama ha en termiskt blockerad magnetisk kärna (magnetisk partikelvolym) vilket begränsar partikelstorlekar och den magnetiska anisotropin av den magnetiska kärnan.For these methods to work, the particles must have a thermally blocked magnetic core (magnetic particle volume) which limits particle sizes and the magnetic anisotropy of the magnetic core.

Ett typiskt partikelsystem lämplig att användas för denna metod är en partikel med en magnetisk kärna av magnetit eller maghemit med en diameter på ca. 20 nm. Det finns även andra material med partiklar som uppvisar termiskt blockerad magnetisering, t.ex.A typical particle system suitable for use in this method is a particle with a magnetic core of magnetite or maghemite with a diameter of approx. 20 nm. There are also other materials with particles that exhibit thermally blocked magnetization, e.g.

Co dopad järnoxid eller CoFe2O4 med en storlek på cza 10 nm - 15 nm, ev. sällsynta jordartsmetaller, och andra.Co doped iron oxide or CoFe2O4 with a size of cza 10 nm - 15 nm, possibly. rare earth metals, and others.

I många applikationer, speciellt de som behandlas nedan, beläggs den magnetiska kärnan med ett extra skikt, till exempel en polymer såsom polyacrylamid eller dextran.In many applications, especially those discussed below, the magnetic core is coated with an additional layer, for example a polymer such as polyacrylamide or dextran.

Naturligtvis kan även andra beläggningsmaterial förekomma, till exempel metallskikt (såsom Au), andra polyrnerer, specifika kemiska föreningar såsom silaner eller thioler, etc. Ofta är det lämpligt att välja skiktets tjocklek så att den totala partikeldiametem varierar från ca. 25 nm upp till 1 um (eller högre).Of course, other coating materials may also be present, for example metal layers (such as Au), other polymers, specific chemical compounds such as silanes or thiols, etc. It is often convenient to choose the thickness of the layer so that the total particle diameter varies from approx. 25 nm up to 1 μm (or higher).

För att erhålla så stor procentuell frekvensändring vid partikelmodifikationer som möjligt skall dock relativt små partiklar (kring 50 nm) användas. Det antas att om totalstorlekar (diametrar) från cza 50 nm till l um används så erhålles tillräckligt stora procentuella frekvensändringar med vår metod.However, in order to obtain as large a percentage change in the frequency of particle modifications as possible, relatively small particles (around 50 nm) must be used. It is assumed that if total sizes (diameters) from about 50 nm to 1 μm are used, sufficiently large percentage frequency changes are obtained with our method.

Fig. 2 illustrerar en magnetisk kärna 20 belagd med 2 st. extra skikt 21, 22 som roterar medurs. De i figuren visade tjock svarta linjer mellan olika skikten illustrerar mellanytsmaterialet som kan vara skilt från materialet som skiktets bulk består av. Till det yttre skiktet 22 har långa och smala biomolekyler 23 fästs. Skissen av partikeln skall illustrera ytterligare ett viktigt villkor som partikelpreparation bör uppfylla: materialet i de olika skikten skall väljas så att de olika skikten förankras till varandra såpass starkt n n en: a lo: Illa n u n v u ciao nu auto ha no.cø 10 15 20 25 30 13 (mellanskiktens bindningsenthalpín är hög) att de hindras från att rotera i förhållande till varandra då ett yttre magnetfält appliceras på partikeln.Fig. 2 illustrates a magnetic core 20 coated with 2 pcs. extra layers 21, 22 which rotate clockwise. The thick black lines shown in the figure between the different layers illustrate the intermediate surface material which may be different from the material of which the bulk of the layer consists. Long and narrow biomolecules 23 are attached to the outer layer 22. The sketch of the particle should illustrate another important condition that particle preparation should meet: the material in the different layers should be chosen so that the different layers are anchored to each other so strongly nn a: a lo: Illa nunvu ciao nu auto ha no.cø 10 15 20 25 13 (the binding enthalpy of the interlayers is high) that they are prevented from rotating relative to each other when an external magnetic field is applied to the particle.

Fig. 3 visar hur ifas och urfas komponenten av den magnetiska susceptibiliteten varierar med frekvensen vid rumstemperatur for två olika hydrodynamiska diametrar, 50 nm (kurvorna 2) och 60 nm (kurvorna l) då partiklama genomgår Brownsk relaxation.Fig. 3 shows how the phase and out-phase component of the magnetic susceptibility varies with the frequency at room temperature for two different hydrodynamic diameters, 50 nm (curves 2) and 60 nm (curves 1) as the particles undergo Brownian relaxation.

Paitiklarna är dispergerade i vatten. Urfas komponentema för respektive partiklar uppvisar ett maximum vid den frekvens som motsvarar den Brownska relaxationstiden medan ifas komponenter avklingar vid den frekvensen. I figur 3 visas dessutom hur den magnetiska responsen kommer att ändras i frekvensplanet vid olika hydrodynamiska volymer. I dessa beräkningar har termiskt blockerade magnetiska kärnor och endast en partikelstorlek (i ett verkligt partikelsystem har vi alltid en viss storleksfördelning antagits, vilket kommer att ge en något bredare magnetisk respons i frekvensplanet men det kommer inte att påverka vår metod. I figuren kan man se att när den hydrodynamiska diametern ökar kommer den magnetiska responsen att skifta nedåt i frekvens. Genom att mäta detta frekvensskift skulle man kunna bestämma om, till exempel, en viss biomolekyl har bundit till ytan (den hydrodynamiska volymen har då ökat) eller om inbindning av olika biomolekyler har ägt rum. Då frekvensskiften beror på biomolekylers storlekar samt på karaktären av deras växelverkan med den omgivande vätskan skulle man även kunna bestämma de relativa koncentrationer av respektive biomolekyler eller antikroppar genom att studera hur stort frekvensskiftet är.The paiticles are dispersed in water. The phase components for each particle have a maximum at the frequency corresponding to the Brownian relaxation time, while the phase components decay at that frequency. Figure 3 also shows how the magnetic response will change in the frequency plane at different hydrodynamic volumes. In these calculations, thermally blocked magnetic cores and only one particle size (in a real particle system we have always assumed a certain size distribution, which will give a slightly wider magnetic response in the frequency plane but it will not affect our method. In the figure you can see that as the hydrodynamic diameter increases, the magnetic response will shift downward in frequency. By measuring this frequency shift, one could determine whether, for example, a particular biomolecule has bound to the surface (the hydrodynamic volume has then increased) or whether binding of different Since the frequency shifts depend on the sizes of the biomolecules and on the nature of their interaction with the surrounding liquid, it would also be possible to determine the relative concentrations of the respective biomolecules or antibodies by studying how large the frequency shift is.

En ofta använt metod är att man detekterar förändringen i inducerad spänning för ett dubbelspolsystem (detekteringsspolsystem) positionerat i en excitationsspole. Provet placeras i en av detekteringsspolama. Man använder sig i detta fall av lock-in förstärkarteknik för att mäta upp signalen från provet. Denna metod är mycket känslig och används i de flesta kommersiella AC-susceptometrar. Frekvensintervallet brukar typiskt vara från ca. 0,01 Hz upp till 10 kHz. Det är svårt att mäta vid högre frekvenser med detta mätsystem. Det är möjligt att mäta upp till något högre frekvenser, t.ex. 60 kHz, men detta kräver ett specifikt designat mätsystem. För att mäta susceptibiliteten vid ännu högre frekvenser, t.ex. upp till 10 MHz, kan man använda sig av en metod som baseras på detektionen av förändringar i induktans och resistans för ett toroidspolsystem med ett mjukmagnetiskt material (t ex mu-metall eller någon typ av ferritmaterial om 524 094 -- 14 höga mätfrekvenser skall användas). Provet placeras då i en tunn slit (gap) i den magnetiska toroiden och man mäter toroidens kretsparametrar då gapet är tomt respektive efter det att man placerat sitt prov i slitten.A commonly used method is to detect the change in induced voltage for a dual coil system (detection coil system) positioned in an excitation coil. The sample is placed in one of the detection coils. In this case, lock-in amplifier technology is used to measure the signal from the sample. This method is very sensitive and is used in most commercial AC susceptometers. The frequency range is typically from approx. 0.01 Hz up to 10 kHz. It is difficult to measure at higher frequencies with this measuring system. It is possible to measure up to slightly higher frequencies, e.g. 60 kHz, but this requires a specially designed measuring system. To measure susceptibility at even higher frequencies, e.g. up to 10 MHz, one can use a method based on the detection of changes in inductance and resistance for a toroidal coil system with a soft magnetic material (eg mu-metal or some type of ferrite material if 524 094 - 14 high measuring frequencies are to be used ). The sample is then placed in a thin slit (gap) in the magnetic toroid and the toroidal circuit parameters are measured when the gap is empty or after placing your sample in the slit.

Gemensamt för alla dessa metoder är att man kan representera egenskaper hos en lindat 5 spole med en ekvivalent elektrisk krets bestående av en induktans, L, i serie med en resistans, R, (som är anslutna till en kapacitans, C, parallell med dessa. Kapacitansen beror på den elektriska isolationen av tråden och kan oftast försummas vid lägre frekvenser) där kretsens resistans och induktans ändras då ett magnetiskt prov placeras i spolen. 10 Om en variabel (AC) ström I(cot) (som äri fas med AC-magnetfåltet) flyteri kretsen så kommer den att inducera en komplex spänning vars realdel är i fas med strömmen medan den imaginära delen är fasförskjuten i förhållande till I(u)t).Common to all these methods is that one can represent properties of a wound coil with an equivalent electrical circuit consisting of an inductance, L, in series with a resistor, R, (which are connected to a capacitance, C, parallel to these. The capacitance depends on the electrical insulation of the wire and can usually be neglected at lower frequencies) where the resistance and inductance of the circuit changes when a magnetic sample is placed in the coil. If a variable (AC) current I (cot) (which is in phase with the AC magnetic field) ter the outer circuit, it will induce a complex voltage whose real part is in phase with the current while the imaginary part is phase shifted in relation to I (u ) t).

Ett annat, ofta använt, sätt att karakterisera Brownsk rörelse hos ett partikelsystem är att studera partiklarnas respons på ett variabelt magnetfält i tidsdomänen: s.k. 15 relaxationstidsmätriingar. Då uppfinningen behandlar mätningar i frekvensdomänen kommer vi att avstå från en närmare beskrivning av mätmetodiken vid relaxationstidsmätningar.Another, often used, way of characterizing Brownian motion in a particle system is to study the response of the particles to a variable magnetic field in the time domain: so-called 15 relaxation time measurements. When the invention deals with measurements in the frequency domain, we will refrain from a more detailed description of the measurement methodology in relaxation time measurements.

Eftersom i första hand skillnader skall bestämmas i susceptibiliteten som uppstår vid olika partikelpreparationer (eller jämföra viskositeter hos två olika vätskor) konstrueras 20 ett mätsystem annorlunda än gängse använda mätsystem. Mätsystemet 50, som visas schematiskt i Fíg. 5, består av två identiska detektionsspolar 51, 52, som omger två st. identiska provhållare 53,54 liknande de som finns kommersiellt tillgängliga. Mätspolar och provhållare omges av en excitationsspole 55 vars uppgift är att alstra ett homogent magnetiskt fält vid de bägge provhållare. Excitationsspole, mätspolar samt provhållare är 25 placerade koncentriskt samt inj usterade kring den vertikala centeraxeln. Både respektive ' provets läge samt respektive mätspolens läge kan justeras separat. Det finns inget behov av en excitationsspole då man använder de två sistnämnda, altemativa detekteringsmetoder. ll Uli o o 1:00 l: int! De väsentliga fördelama med systemet är dels möjligheten till komparativa mätningar :...: 30 och dels de olika möjligheterna till justering av systemet. Mätsystemets känslighet Du o o I noe en coon en anno- 10 15 20 k) UI 524 094 15 bestäms inte endast av S/N förhållandet utan också av obalansen mellan två nominellt identiska delsystem innehållande provhållare 1 (53) respektive provhållare 2 (54) med var sin detekteringsspole. Obalansen som mäts utan provhållare eller med identiska provhållare kan uppstå till exempel p. g.a.: 0 Något olika varvtal i respektive detekteringsspole 0 Inhomogent magnetfält pga. av små toleranser vid tillverkning vad gäller placering av prov i förhållande till respektive detekteringsspolen resp. excitationsspolen 0 Olika inbördes placeringar av provhållare inuti detektionsspolar 0 lnverkan av tillverkningstoleranser För att nollställa (balansera ut) skillnaden i signal mellan detekteringsspolama kan två olika metoder användas: Systemet är konstruerat så att det är möjligt att mekaniskt justera in läge hos respektive provhållare altemativt ändra läget av respektive detektionsspole något så att obalans differenssignalen minimeras.Since primarily differences are to be determined in the susceptibility that occurs in different particle preparations (or compare viscosities of two different liquids), a measuring system is constructed differently from commonly used measuring systems. The measuring system 50, which is shown schematically in Figs. 5, consists of two identical detection coils 51, 52, which surround two pcs. identical sample holders 53.54 similar to those commercially available. Measuring coils and sample holders are surrounded by an excitation coil 55 whose task is to generate a homogeneous magnetic field at the two sample holders. Excitation coil, measuring coils and sample holder are placed concentrically and injected around the vertical center axis. Both the position of the respective sample and the position of the respective measuring coil can be adjusted separately. There is no need for an excitation coil when using the latter two, alternative detection methods. ll Uli o o 1:00 l: int! The essential advantages of the system are partly the possibility of comparative measurements: ...: 30 and partly the different possibilities for adjustment of the system. The sensitivity of the measuring system Du oo I noe en coon en anno- 10 15 20 k) UI 524 094 15 is determined not only by the S / N ratio but also by the imbalance between two nominally identical subsystems containing sample holder 1 (53) and sample holder 2 (54) with was its detection coil. The imbalance measured without sample holders or with identical sample holders can occur for example due to: 0 Slightly different speeds in the respective detection coil 0 Inhomogeneous magnetic field due to of small tolerances during manufacture in terms of placement of samples in relation to the respective detection coil resp. excitation coil 0 Different mutual positions of sample holders inside detection coils 0 Influence of manufacturing tolerances To zero (balance out) the difference in signal between the detection coils, two different methods can be used: The system is designed so that it is possible to mechanically adjust the position of each sample holder or of the respective detection coil slightly so that the imbalance of the difference signal is minimized.

Systemet är dock konstaterat för att på ett snabbare och enklare sätt signalen, genom att en bestämd mängd av torra magnetiska partiklar (kulor) föres i ett av utrymmen där provhållarna är placerade (se Fig. 5 och 6). Partiklama skapar ett extra bidrag till den ursprungliga signalen som kan därigenom justeras (nollställas). Dessa torra magnetiska partiklar skall inte uppvisa några magnetiska förluster (X”=0) samt att realdelen av susceptibiliteten skall vara konstant (X'=konstant) i det undersökta frekvensområdet.However, the system has been found to transmit the signal in a faster and simpler way, by passing a certain amount of dry magnetic particles (spheres) into one of the spaces where the sample holders are located (see Figs. 5 and 6). The particles create an extra contribution to the original signal which can thereby be adjusted (reset). These dry magnetic particles should not show any magnetic losses (X '= 0) and that the real part of the susceptibility should be constant (X' = constant) in the frequency range examined.

Det finns alternativa detektionsmetoder: Mätspolar som ett återkopplingselement (”feed-back” element) i en oscillatorkrets: Ett alternativt sätt att jämföra två olika preparationer eller modifieringar av magnetiska partiklar kvantítativt är att följa de därvid inducerade frekvensändringar m.h.a. ett oscillatorsystem där detekteringsspolama {dvs. LR(C)-kretsarna} utgör de fiekvensbestämmande elementen i en oscillatorkrets, till exempel, i oscillatorns .coon 10 15 20 25 16 returslinga (dess ”feed-back” krets). Det är välkänt att en sådan oscillators resonansfrekvens blir fmax, medan dess godhetstal blir ett mått på åfnax., d.v.s. ett mått på partiklarnas energiförluster (friktion). Då detektionsspolama utgör de frekvensbestämmande elementen i kretsen kommer resonansfrekvensen att följa ändringar av spolens L och R värden vilket sker då partiklamas susceptibilitet ändras.There are alternative detection methods: Measuring coils as a feedback element ("feed-back" element) in an oscillator circuit: An alternative way to compare two different preparations or modifications of magnetic particles quantitatively is to follow the thereby induced frequency changes m.h.a. an oscillator system in which the detection coils {i.e. The LR (C) circuits} constitute the fi sequencing elements in an oscillator circuit, for example, in the return loop (its feed-back) circuit of the oscillator .coon 10 15 20 25 16. It is well known that the resonant frequency of such an oscillator becomes fmax, while its goodness number becomes a measure of åfnax., I.e. a measure of the particles' energy losses (friction). Since the detection coils constitute the frequency-determining elements in the circuit, the resonant frequency will follow changes in the values of the coil L and R, which occurs when the susceptibility of the particles changes.

Då detektering av AC-skillnader mellan spolama önskas, d.v.s. jämförelse av två olika partikelsystem (eller två olika vätskor) bör spolama som omger respektive prov elektriskt fasvridas gentemot varandra så att resonansfrekvensen bestäms av skillnaden mellan respektive spolens induktans {AL (= L|-L2)} och resistans {AR (= R|-R2)}. Ett sätt att åstadkomma detta m.h.a. av endast passiva komponenter är att placera spolar i en AC- brygga. Aktiva komponenter, t.ex. op-fórstärkare, kan användas, vilket medför enkelt subtrahering av två spänningar från varandra.When detection of AC differences between the coils is desired, i.e. comparison of two different particle systems (or two different liquids), the coils surrounding each sample should be electrically phase shifted relative to each other so that the resonant frequency is determined by the difference between the respective coil inductance {AL (= L | -L2)} and resistance {AR (= R | - R2)}. A way to achieve this m.h.a. of only passive components is to place coils in an AC bridge. Active components, e.g. op-amplifiers, can be used, which easily subtracts two voltages from each other.

Oscillatorkretsen kan utformas så att inte endast frekvensen detekteras utan också ändringar i den totala effekten (eller amplituden på oscillationema) som spolen utsätts för vid olika partikelpreparationer: Frekvens och dissipation kommer att bestämma de effektiva ändringarna av kretsens AL (= Li-Lg) och AR (= Rl-Rz). Dessa ändringar utgör ett mått på förändringar av dissipationen i kretsen. Man kan också bestämma en absolut mått på dissipationen genom att mäta avklingningen av svängningen då spolen fi-ånkopplas från oscillatorkretsen.The oscillator circuit can be designed so that not only the frequency is detected but also changes in the total power (or amplitude of the oscillations) to which the coil is subjected during various particle preparations: Frequency and dissipation will determine the effective changes of the circuit AL (= Li-Lg) and AR (= R1-Rz). These changes are a measure of changes in the dissipation in the circle. An absolute measure of the dissipation can also be determined by measuring the decay of the oscillation when the coil fi- is connected from the oscillator circuit.

Genom att detektera förändringar i oscillatorfrekvens samt avklingning av signalamplitud från oscillatorsystemet eller effektändringar (eller amplitudändringar) kan responsen av partiklarna vid en specifik frekvens,f,,,a,,, anpassat till det partikelsystem som används samt godhetstalet (energifórluster) vid den frekvensen bestämmas.By detecting changes in oscillator frequency and attenuating signal amplitude from the oscillator system or power changes (or amplitude changes), the response of the particles at a specific frequency, f ,,, a ,,, adapted to the particle system used and the goodness number (energy losses) at that frequency can be determined .

Förfarandet förenklar mätsystemet då behovet av att ha en separat excitationsspole försvinner Mätspolar som drivs mha av en frekvensgenerator En annan mätprincip för att detektera den önskade spänningsdifferensen bygger på faslåsning (en s.k. Phase Locked Loop, PLL) enligt Fig. 7, som visar en principskiss över 10 15 20 25 30 u; :no 524 094 -= 17 en alternativ detektionskrets 70 där man använder en variabel frekvensgenerator alternativt brusgenerator 71, som ingångssignal samt mäter den komplexa spänningsskíllnaden m.h.a. en faslåst slinga. Spänningsskillnaden åstadkommes mha. lämplig inkoppling av operationsförstärkare 72. Liknande effekt kan fås även då man bildar en AC-brygga där två av bryggans fyra grenar utgörs av spole 73 respektive spole 74. Teoretisk bestäms spänningsskíllnaden förskjuten med OO respektive med 900 i förhållande till ingångssignalen. I praktiken tillkommer en viss extra fasförskjutning pga. operatíonsjörstärkare. Återigen detektering av signalskyllanden vid en och samma frekvens mellan de två detekteringsspolama önskas.The method simplifies the measuring system when the need to have a separate excitation coil disappears. Measuring coils operated by means of a frequency generator 10 15 20 25 30 u; : no 524 094 - = 17 an alternative detection circuit 70 where a variable frequency generator or noise generator 71 is used, as input signal and measures the complex voltage difference m.h.a. a phase locked loop. The voltage difference is achieved by means of suitable connection of operational amplifier 72. A similar effect can also be obtained when an AC bridge is formed where two of the four branches of the bridge consist of coil 73 and coil 74, respectively. In practice, a certain extra phase shift is added due to operational amplifier. Again, detection of signal flushes at one and the same frequency between the two detection coils is desired.

En möjlig princip att åstadkomma spänningsskíllnaden enligt figuren är genom användning av operations(instrument)-förstärkare i en lämplig koppling. En annan möjlighet bygger på att placera respektive spole i en AC-brygga. Bryggan matas av en oscillator/frekvensgenerator med variabel frekvens varvid amplituden hos strömmen som flyter genom spolarna hölls konstant. Amplituden hos den resulterade spänningsskíllnaden för en given fasförskjutning i förhållande till ingångssignalen kan bestämmas m.h.a. en PLL krets 75 (fasskillnaden blir proportionell mot en DC-spänning som bestäms/ genereras av PLL kretsen). Tillsammans med mätning av signalens amplitud får man återigen en tillräcklig beskrivning av provkarakteristika vid en viss frekvens. Metodens fördelar är framför allt att kunna mäta paxtikelsystemets magnetiska egenskaper över ett relativt brett frekvensintervall samt att excitatíonsspole ej behöves.A possible principle to achieve the voltage difference according to the figure is by using operational (instrument) amplifiers in a suitable connection. Another possibility is based on placing the respective coil in an AC bridge. The bridge is supplied by an oscillator / frequency generator with variable frequency, the amplitude of the current flowing through the coils being kept constant. The amplitude of the resulting voltage difference for a given phase shift in relation to the input signal can be determined by means of a PLL circuit 75 (the phase difference becomes proportional to a DC voltage determined / generated by the PLL circuit). Together with the measurement of the amplitude of the signal, a sufficient description of the test characteristics at a certain frequency is again obtained. The advantages of the method are above all to be able to measure the magnetic properties of the paxticle system over a relatively wide frequency range and that an excitation coil is not needed.

Ett alternativ till att använda oscillator/frekvensgenerator signaler för att generera tidsvariabel ström är att excitera spolarna m.h.a. vitt brus. Fördelen är att man kan erhålla frekvensberoende information genom en F FT-filtrering av responsen utan att behöva använda frekvensgenerator.An alternative to using oscillator / frequency generator signals to generate time-variable current is to excite the coils m.h.a. white noise. The advantage is that one can obtain frequency-dependent information by an F FT filtering of the response without having to use a frequency generator.

Den sensor som beskrivs skall vara ett generellt analysinstrument för analys av olika biomolekyler eller andra molekyler i vätska. Exempel på molekyler som kan analyseras kan vara t ex proteiner som finns i vätskelösning, såsom blod, blodplasma, serum, urin.The sensor described shall be a general analytical instrument for the analysis of different biomolecules or other molecules in liquid. Examples of molecules that can be analyzed can be, for example, proteins that are in liquid solution, such as blood, blood plasma, serum, urine.

Förutsättningen för att metoden ska fungera är att analysen (molekyl 2) kan kopplas till partikeln på något sätt, t ex genom specifik interaktion med en annan molekyl (molekyl 10 15 20 25 524 G94 :v- 18 1) som redan innan analysens början har kopplats till kulan, såsom visas i Fig. 8).The prerequisite for the method to work is that the assay (molecule 2) can be linked to the particle in some way, for example by specific interaction with another molecule (molecule 10 15 20 25 524 G94: v-18 1) which already before the start of the assay has connected to the ball, as shown in Fig. 8).

Observera att dimensionerna (molekylernas storlek i förhållande till kulans storlek) inte är skalenliga.Note that the dimensions (size of the molecules in relation to the size of the sphere) are not scalable.

Eftersom specifika interaktioner är vanligt förekommande i biologiska system är det troligt att sensorn kan få en framträdande roll för analyser inom detta område, tex för analys av biokemiska markörer för olika sjukdomar. Exempel på molekyler som kan interagera specifikt med varandra är: a) antikropp ~ antigen b) receptor - hormon c) två komplementära enkelsträngar av DNA d) enzym - substrat / enzym - inhibitor Partikelsystemet (t ex partikelstorlek och val av molekyl 1) skall anpassas efter storlek och art på molekyl 2.Since specific interactions are common in biological systems, it is likely that the sensor may have a prominent role for analyzes in this area, for example for the analysis of biochemical markers for various diseases. Examples of molecules that can interact specifically with each other are: a) antibody ~ antigen b) receptor - hormone c) two complementary single strands of DNA d) enzyme - substrate / enzyme - inhibitor The particle system (eg particle size and choice of molecule 1) must be adapted by size and species of molecule 2.

Sensom kan t ex användas inom medicinsk diagnostik. Den nya biosensom skulle t ex kunna ersätta vissa ELISA-analyser (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Denna metod används idag i hög utsträckning för att bestämma halter av biokemiska markörer (t ex proteiner) som finns i komplexa kroppsvätskor, såsom blod, serum och cerebrospinalvätska. Exempel på ELISA analyser som bör kunna ersättas med den nya biosensom är: a) analys av tau-protein i cerebrospinalvätska (del i diagnos av Alzheimers sjukdom) b) analys av PSA i serum (diagnos av prostatacancer) c) analys av akutfasproteiner som mäts i samband med hjärtsjukdom d) analys av CA 125 i serum (diagnos av cancer i äggstockama) Det kan antas att sensom kan användas för detektion av flera markörer samtidigt genom användandet av kulor med olika storlekar och/eller av olika material i samma system. De olika kuloma ska då också vara belagda med olika ”biomolekyl l” (Fig 8). 10 15 20 25 u; »ao 524 °94:ß:fi:::e 19 Den nya tekniken kan användas för ”low throughput screening", dvs. genomförandet av en eller ett fåtal analyser åt gången, eller for ”high throughput screening”, dvs. genomförandet av ett stort antal analyser simultant. Det senare kan åstadkommas genom att mångfaldiga sensom.Sensors can, for example, be used in medical diagnostics. The new biosensor could, for example, replace certain ELISA assays (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). This method is widely used today to determine levels of biochemical markers (eg proteins) found in complex body fluids, such as blood, serum and cerebrospinal fluid. Examples of ELISA assays that should be able to be replaced by the new biosensor are: a) analysis of tau protein in cerebrospinal fluid (part of the diagnosis of Alzheimer's disease) b) analysis of serum PSA (diagnosis of prostate cancer) c) analysis of acute phase proteins measured in connection with heart disease d) analysis of CA 125 in serum (diagnosis of ovarian cancer) It can be assumed that the sensor can be used for the detection of several markers simultaneously by the use of beads of different sizes and / or of different materials in the same system. The different spheres must then also be coated with different “biomolecule l” (Fig. 8). 10 15 20 25 h; »Ao 524 ° 94: ß: fi ::: e 19 The new technology can be used for" low throughput screening ", ie the implementation of one or a few analyzes at a time, or for" high throughput screening ", ie the implementation of a large number of analyzes simultaneously.The latter can be accomplished by multiplying the sensor.

Uppfinningen baseras på användandet av magnetiska partiklar. För att molekyl 2 i provet ska kunna fasta på den magnetiska kulan kan den magnetiska kulans yta modifieras på ett ändamålsenligt sätt. Detta kan ske t ex genom att belägga kulans yta med dextran, med alkanethioler med lämpliga ändgrupper, med vissa peptider, etc. På dextranytan (eller annan lämpligt mellanskikt) kan sedan molekyl 1, t ex en antikropp, bindas in med hjälp av t ex cyanobromidaktivering eller med karboxylsyraaktivering. När molekyl 1 är kopplad till den magnetiska kulan blandas kuloma med det prov som skall analyseras, t CX SCfLlm.The invention is based on the use of magnetic particles. In order for molecule 2 in the sample to be able to attach to the magnetic ball, the surface of the magnetic ball can be modified in an appropriate manner. This can be done, for example, by coating the surface of the bead with dextran, with alkane ethiols with suitable end groups, with certain peptides, etc. On the dextran surface (or other suitable intermediate layer) molecule 1, for example an antibody, can then be bound by means of e.g. cyanobromide activation or with carboxylic acid activation. When molecule 1 is attached to the magnetic sphere, the spheres are mixed with the sample to be analyzed, t CX SCfLlm.

För att bestämma närvaro av biomolekyler eller antikroppar i en bärvätska innehållande magnetiska partiklar med den metod som vi föreslår, måste följande steg utföras i provpreparering, mätning och analys av mätdata. 1. Blanda de magnetiska partiklama med det prov som skall analyseras med avseende på en viss substans. 2. Fyll en provbehållare med det prov som har preparerats enligt punkt 1. 3. Placering av provbehållare i detekteringspolama eller detekteringssystemet (beroende på vad man använder för utrustning för att mäta upp den magnetiska responsens frekvensberoende). 4. Applicering av ett extemt mätfält över provet med en viss amplitud och frekvens. 5. Uppmätning av den magnetiska responsen (både ifas och urfas komponentema) vid denna frekvens. 6. Ändra frekvens och utför mätning igen enligt punkterna 4 och 5. 7. Analysen av resultatet blir att bestämma den Brownska relaxationstiden från ifas och urfas komponenterna genom att använda alla data i det undersökta 10 15 20 524 o94š,,¿;¿¿¿ 20 frekvensintervallet (upp till ca. 10 kHz). En alternativ analys skulle kunna vara att enbart bestämma hur stort frekvensskiftet är (för samma värde av ifas och urfas komponent) vid ett par olika frekvenser.To determine the presence of biomolecules or antibodies in a carrier liquid containing magnetic particles with the method we propose, the following steps must be performed in sample preparation, measurement and analysis of measurement data. Mix the magnetic particles with the sample to be analyzed for a specific substance. 2. Fill a sample container with the sample prepared in accordance with paragraph 1. 3. Place the sample container in the detection poles or detection system (depending on the equipment used to measure the frequency dependence of the magnetic response). 4. Application of an extreme measuring field across the sample with a certain amplitude and frequency. 5. Measurement of the magnetic response (both the phase and out-of-phase components) at this frequency. 6. Change the frequency and perform the measurement again according to points 4 and 5. 7. The analysis of the result will be to determine the Brownian relaxation time from the ifas and urphase components using all the data in the examined 10 15 20 524 o94š ,, ¿; ¿¿¿ 20 frequency range (up to about 10 kHz). An alternative analysis could be to only determine how large the frequency shift is (for the same value of the ifas and out-of-phase component) at a couple of different frequencies.

Systemet tillåter en kvantitativ jämförelse mellan olika vätskors viskositeten Viskositeten kan mätas analogt med vad som har beskrivits i uppfinningen i övrigt med den skillnaden att man använder identiska partiklar vid viskositetsmätningar. Frekvensändringar uppstår p. g.a. olika viskositeter. Det är inte endast resonansfrekvensen, fmax, som kommer att ändras utan också ö fmax. Metodens fördel jämfört med andra sätt att mäta viskositet är: 0 relativt små vätskemängder som behövs 0 möjligheten att mäta viskositeten lokalt kring partikeln vilket möjliggör detektion av viskositetsgradienter i en vätskevolym Denna viskositets detekterings metod bygger dock på att partiklama fortfarande är stabila ide olika vätskoma.The system allows a quantitative comparison between the viscosity of different liquids. The viscosity can be measured analogously to what has been described in the invention in general, with the difference that identical particles are used in viscosity measurements. Frequency changes occur due to different viscosities. It is not only the resonant frequency, fmax, that will change but also ö fmax. The advantage of the method compared to other ways of measuring viscosity is: 0 relatively small amounts of liquid needed 0 the possibility to measure the viscosity locally around the particle which enables the detection of viscosity gradients in a liquid volume However, this viscosity detection method

Uppfinningen begränsas inte till de visade och beskrivna utföringsforrnerna.The invention is not limited to the embodiments shown and described.

Modifieringar, ändringar och skillnader inom ramen för de närslutna patentkravens skyddsomfáng kan förekomma. 20 524 094 a. a..Modifications, changes and differences within the scope of the enclosed patent claims may occur. 20 524 094 a .. a ..

Referenser 1.References 1.

E. Kneller, in:Magnetism and Metallurgy vol. 1, eds. A.E. Berkowitz and E. Kneller, Academic Press New York (1969) 365.E. Kneller, in: Magnetism and Metallurgy vol. 1, eds. A.E. Berkowitz and E. Kneller, Academic Press New York (1969) 365.

C.P. Bean and J. Livingston, J. Appl. Phys. 30 (1959) 12OS.C.P. Bean and J. Livingston, J. Appl. Phys. 30 (1959) 12OS.

L. Néel, C.R. Acad. Sci. 228 (1949) 664.L. Néel, C.R. Acad. Sci. 228 (1949) 664.

Brown, W.F., 1963, J. Appl. Phys. 34, 1319.Brown, W.F., 1963, J. Appl. Phys. 34, 1319.

Fannin, P.C., Scaife, B.K.P. and Charles, S.W, 1988 J. Magn. Magn. Mater., 72, 95.Fannin, P.C., Scaife, B.K.P. and Charles, S.W, 1988 J. Magn. Magn. Mater., 72, 95.

R. Kötitz, T. Bunte, W. Weitschies, L. Trahms, Superconducting quantum interference device-based magnetic nanoparticle relaxation measurement as a novel tool for the binding specific detection of biological binding reactions, J. Appl. Phys., 81, 8, 4317, 1997.R. Kötitz, T. Bunte, W. Weitschies, L. Trahms, Superconducting quantum interference device-based magnetic nanoparticle relaxation measurement as a novel tool for the binding specific detection of biological binding reactions, J. Appl. Phys., 81, 8, 4317, 1997.

R. Kötitz, H. Matz, L. Trahms, H. Koch, W. Weitschies, T.Rheinlander, W. Semmler, T. Bunte, SQUID based remanence measurements for immunoassays, IEEE Transactions on Applied Superconductivity, vol. 7, no. 2, 3678-81, 1997.R. Kötitz, H. Matz, L. Trahms, H. Koch, W. Weitschies, T.Rheinlander, W. Semmler, T. Bunte, SQUID based remanence measurements for immunoassays, IEEE Transactions on Applied Superconductivity, vol. 7, no. 2, 3678-81, 1997.

K. Enpuku, T. Minotani, M. Hotta, A. Nakohado, Application of High T c SQUID Magnetometer to Biological Immunoassays, IEEE Transactions on Applied Superconductivity, Vol. 11, No. 1, 661-664, 2001.K. Enpuku, T. Minotani, M. Hotta, A. Nakohado, Application of High T c SQUID Magnetometer to Biological Immunoassays, IEEE Transactions on Applied Superconductivity, Vol. 11, no. 1, 661-664, 2001.

H. L. Grossman, Y. R. Chemla, Y. Poon, R. Stevens, J. Clarke, and M. D. Alper, Rapid, Sensitive, Selective Detection of Pathogenic Agents using a SQUID Microscope, Eurosensors XIV, 27-30, 2000.H. L. Grossman, Y. R. Chemla, Y. Poon, R. Stevens, J. Clarke, and M. D. Alper, Rapid, Sensitive, Selective Detection of Pathogenic Agents using a SQUID Microscope, Eurosensors XIV, 27-30, 2000.

. Applications of Magnetic Particles in Immunoassays, Mary Meza. Ch.22 (pp.303-309) in “Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers” ed. Häfeli, et al. Plenum Press, New York,l997; Lecture at conference in Rostock, Germany September 1996. 11. “The art of electronics”, P. Horowitz and W. Hill, Cambridge Univ. Press, 2"d edition (1989). 12. “Design of crystal and other harmonic oscillators”, B. Parzen, Wiley-Intersci Publ. (1933). Applications of Magnetic Particles in Immunoassays, Mary Meza. Ch.22 (pp.303-309) in “Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers” ed. Häfeli, et al. Plenum Press, New York, l997; Lecture at conference in Rostock, Germany September 1996. 11. “The art of electronics”, P. Horowitz and W. Hill, Cambridge Univ. Press, 2 "d edition (1989). 12.“ Design of crystal and other harmonic oscillators ”, B. Parzen, Wiley-Intersci Publ. (1933)

Claims (1)

1. 0 15 20 25 30 1. E” ~ an: n» 524 094:.I=:1I:'=..: ~ Patentkrav Metod för detektering av förändringar av en magnetisk respons hos åtminstone en magnetisk partikel försedd med ett yttre skikt i en bärvätska, varvid metoden innefattar utnyttjande av en mätmetod innefattande mätning av nämnda magnetiska partikelns karaktäristiska rotationstid med hänsyn till nämnda yttre skikts påverkan, vilken mätmetod innebär mätning av Brownsk relaxation i nämnda bärvätska under inverkan av ett yttre alternerande magnet fält, kännetecknad av, att nämnda mätning innebär dessutom att vid modifiering av partikelns effektiva volym eller dess växelverkan med bärvätskan ändras en hydrodynamisk volym av partikeln, vilket innebär en ändring av den frekvens ( fmax) där en urfas komponent av den magnetiska susceptibiliteten har sitt maximum. Metod enligt krav 1, kännetecknad av, att nämnda mätning innebär mätning av i- och/eller urfaskomponenter av en magnetisk susceptibilitet i ett frekvensplan. Metod enligt krav 1, kännetecknad av, att mätningen innefattar en relativ mätning, varvid ändringar i ett modifierat partikelsystem jämföres med ett ursprungligt system. Metod enligt krav 3, kännetecknad av, att åtminstone två provhållare och två detektorspolar användes. Metod enligt krav 4, kännetecknad av, 10 15 20 25 30 10. 11. .- ~ ~ c . n n . - ø a. 524 094 2. _.. att en oscillatorkrets används vid en frekvens, d.v.s. resonansfrekvensen, där spolar placeras som ett frekvensbestämmande element i oscillatorkretsen så att de ligger ur fas med varandra. Metod enligt krav 5, kännetecknad av, att en effekt eller amplitud av oscillationer från oscillatorkretsen över spolar mäts. Metod enligt krav 4, kännetecknad av, att en extern osciIlator-/frekvensgenerator anordnas, varvid spolar placeras i en alternerande brygga så att skillnaden mellan bägge spolar mäts, och att fasskillnaden mellan frekvensgeneratorns utgångsström och/eller -spänning och en ström/spänning over bryggan mäts. Metod enligt krav 7, kännetecknad av, att en amplitudskillnad mellan oscillatorns utgångs- ström/spänning mäts och jämförs med en amplitud hos strömmen/spänningen i bryggan. Metod enligt krav 8, kännetecknad av, att mätningen utföres vid en eller flera olika frekvenser. Metod enligt krav 3, kännetecknad av, att en bruskälla användes och att systemets respons analyseras med hjälp av en FFT (Fast Furle Transform) analys av en utgående signal. Metod enligt krav 3, 5 10 15 20 25 30 524 094 kännetecknad av, att en signalskillnad mellan nämnda spolar nollställes. 12. Metod enligt krav 11, kännetecknad av, att nämnda nollställning sker genom att mekaniskt justera in läge hos respektive provhållare alternativt ändra läget av respektive detektionsspole så att differenssignalen minimeras. 13. Metod enligt krav 11, kännetecknad av, att nämnda nollställning sker genom att minimera signalen genom att tillföra en bestämd mängd av ett magnetiskt ämne i ett av utrymmen där provhållarna är placerade, så att ämnet skapar ett extra bidrag till den ursprungliga signalen som kan därigenom nollställas. 14. Metod enligt krav 13, kännetecknad av, att nämnda magnetiska ämne uppvisar väsentligen noll magnetisk förlust (imaginärdel=0) och att en realdel av susceptibiliteten är konstant i det undersökta frekvensområdet. 15. Metod enligt något av kraven 1-14, kännetecknad av, att metoden användas i analysinstrument för analys av olika biomolekyler eller andra molekyler i vätska. 16. Metod enligt krav 15, kännetecknad av, att nämnda molekyler, innefattar en eller flera av proteiner i en vätskelösning, såsom blod, blodplasma, serum eller urin. 10 15 20 25 30 524 094::tæs:rr. 4 17. Metod enligt krav 15, kännetecknad av, att nämnda analys (molekyl 2) kopplas till nämnda partikel genom interaktion med en andra molekyl (molekyl 1), vilken innan analysens början kopplas till partikeln. 18. Metod enligt krav 15, kännetecknad av, att molekyler som kan interageras specifikt med varandra innefattar en eller flera av antikropp - antigen, receptor - hormon, två komplementära enkelsträngar av DNA och enzym - substrat/ enzym - inhibitor. 19. Metod enligt något av föregående krav, kännetecknad av, att den magnetiska partikelns yta modifieras genom att belägga ytan med en eller flera av dextrane, med alkanethioler med lämpliga ändgrupper eller med vissa peptider. 20. Metod enligt krav 19, kännetecknad av, att dextranytan (eller annan lämpligt mellanskikt) kan sedan en första molekyl, t ex en antikropp, bindas in med hjälp av t ex cyanobromidaktivering eller med karboxylsyraaktivering. 21. Anordning för detektering av förändringar av en magnetisk respons hos åtminstone en magnetisk partikel försedd med ett yttre skikt i en bärvätska, vilken metod innefattar mätning av nämnda magnetiska partikelns karaktäristiska rotationstid med hänsyn till nämnda yttre skikts påverkan, varvid mätningen innebär mätning av en Brownsk relaxation i nämnda bärvätska under inverkan av ett yttre alternerande magnetfält, vilken anordning innefattar medel för att åstadkomma nämnda alternerande fält, åtminstone två väsentligen identiska detektionsspolar anslutna till detekteringselektronik och provhållare för upptagande av bärvätska, kännetecknad av, 10 15 20 25 30 524 094 att anordningen innefattar medel för mätning av en ändring av den frekvens (fmax) där en urfas komponent av en magnetisk susceptibilitet har sitt maximum vid modifiering av partikelns effektiva volym eller dess växelverkan med bärvätskan då en hydrodynamisk volym av partikeln ändras. 22. Anordning enligt krav 21, kännetecknad därav, att nämnda detektionsspolar och provhållare omges av en excitationsspole för alstring av ett homogent magnetiskt fält vid nämnda provhållare. 23. Anordning enligt krav 22, kännetecknad därav, att nämnda excitationsspole, mätspolar samt provhållare är placerade koncentriskt samt injusterade kring dess vertikala centrumaxel. 24. Anordning enligt krav 21, kännetecknad därav, att anordningen innefattar ett oscillatorsystem där detekteringsspolarna utgör frekvensbestämmande element i en oscillatorkrets. 25. Anordning enligt krav 21, kännetecknad därav, att nämnda spolar är anordnade oscillatorns returslinga. 26. Anordning enligt krav 21, kännetecknad därav, att spolarna som omger respektive prov är elektriskt fasvridna gentemot varandra så att resonansfrekvensen bestäms av skillnaden mellan respektive spolens induktans och resistans. 27. Anordning enligt krav 21, 10 15 20 25 30 . . . n. . . .. .. . --_ ,°'. .I 2. .. . .. . . . . .. . .. . _ _ _ , . . . . . . . . . . . . : _ __ _ _ _ _ ... ... .. . . . . . _ _ _ _ _ _ ; g g' .. _.. . . 6 I u. .- - n ~ . u kännetecknad därav, att spolarna är placerade i en AC-brygga. 28. Anordning enligt krav 26, kännetecknad därav, att en op-förstärkare är anordnad för subtrahering av två spänningar från varandra. 29. Anordning enligt krav 21, kännetecknad därav, att anordningen innefattar en faslåsningskrets. 30. Anordning enligt krav 21, kännetecknad därav, att anordningen innefattar oscillator/frekvensgenerator signaler för att generera tidsvariabel ström för att excitera spolarna medelst vitt brus. 31. Anordning enligt krav 21, kännetecknad därav, att frekvensberoende information erhålla genom en FFT-filtrering av responsen. 32. Metod för bestämning av mängd av molekyler i en bärvätska innehållande magnetiska partiklar innefattande stegen att: A. Förse partiklar med ett skikt, vilket inter-/reagerar med den substans som skall analyseras, B. Blanda de magnetiska partiklarna med det prov som skall analyseras med avseende på molekyler, C. Fylla en provbehållare med vätskan som har förberetts enlig B, D. Placera provhållare i detekteringssystem, E. Applicera ett externt mätfält över provet med en viss amplitud och frekvens, 10 15 33. 34. 524 Ûglëßafisfvt .-~n~ v-uq- 7 v F. Uppmäta den magnetiska responsen (både ifas och urfas komponenterna) vid denna frekvens, G. Ändra frekvens och utför mätning igen enligt D och E, H. Analysera resultatet genom att bestämma en Brownsk relaxationstid från ifas och urfas komponenter genom att använda data i det undersökta frekvensintervallet. Metod enligt krav 32, kännetecknad av, att bestämma frekvensskiftet (för samma värde av ifas och urfas komponent) vid olika frekvenser. Metod enligt något av kraven 32-33, kännetecknad av, att nämnda molekyl består av en biomolekyl.A method for detecting changes in a magnetic response of at least one magnetic particle having an outer surface.................................. layer in a carrier liquid, the method comprising utilizing a measuring method comprising measuring the characteristic rotation time of said magnetic particle with respect to the influence of said outer layer, which measuring method involves measuring Brownian relaxation in said carrier liquid under the influence of an external alternating magnetic field, characterized by that said measurement also means that when modifying the effective volume of the particle or its interaction with the carrier liquid, a hydrodynamic volume of the particle changes, which means a change of the frequency (fmax) where a phase component of the magnetic susceptibility has its maximum. Method according to claim 1, characterized in that said measurement involves measuring in- and / or out-of-phase components of a magnetic susceptibility in a frequency plane. Method according to claim 1, characterized in that the measurement comprises a relative measurement, wherein changes in a modified particle system are compared with an original system. Method according to Claim 3, characterized in that at least two sample holders and two detector coils are used. Method according to claim 4, characterized by, 10. 15 20 25 30 10. 11. .- ~ ~ c. n n. - ø a. 524 094 2. _ .. that an oscillator circuit is used at a frequency, i.e. the resonant frequency, where coils are placed as a frequency determining element in the oscillator circuit so that they are out of phase with each other. Method according to claim 5, characterized in that an effect or amplitude of oscillations from the oscillator circuit across coils is measured. Method according to claim 4, characterized in that an external oscillator / frequency generator is arranged, wherein coils are placed in an alternating bridge so that the difference between the two coils is measured, and that the phase difference between the output current and / or voltage of the frequency generator and a current / voltage across the bridge measured. Method according to claim 7, characterized in that an amplitude difference between the output current / voltage of the oscillator is measured and compared with an amplitude of the current / voltage in the bridge. Method according to Claim 8, characterized in that the measurement is carried out at one or more different frequencies. Method according to claim 3, characterized in that a noise source is used and that the response of the system is analyzed by means of an FFT (Fast Furle Transform) analysis of an output signal. Method according to claim 3, characterized in that a signal difference between said coils is reset. Method according to claim 11, characterized in that said zeroing takes place by mechanically adjusting the position of the respective sample holder or alternatively changing the position of the respective detection coil so that the difference signal is minimized. Method according to claim 11, characterized in that said zeroing takes place by minimizing the signal by applying a certain amount of a magnetic substance in one of the spaces where the sample holders are located, so that the substance makes an extra contribution to the original signal which can thereby being reset. Method according to claim 13, characterized in that said magnetic substance exhibits substantially zero magnetic loss (imaginary part = 0) and that a real part of the susceptibility is constant in the frequency range examined. Method according to one of Claims 1 to 14, characterized in that the method is used in analytical instruments for the analysis of various biomolecules or other molecules in liquid. A method according to claim 15, characterized in that said molecules comprise one or more of proteins in a liquid solution, such as blood, blood plasma, serum or urine. 10 15 20 25 30 524 094 :: tæs: rr. Method according to claim 15, characterized in that said assay (molecule 2) is coupled to said particle by interaction with a second molecule (molecule 1), which is coupled to the particle before the start of the analysis. Method according to claim 15, characterized in that molecules that can be interacted specifically with each other comprise one or more of antibody - antigen, receptor - hormone, two complementary single strands of DNA and enzyme - substrate / enzyme - inhibitor. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the surface of the magnetic particle is modified by coating the surface with one or more of dextrans, with alkane ethiols with suitable end groups or with certain peptides. Method according to Claim 19, characterized in that the dextran surface (or other suitable intermediate layer) can then be bound in a first molecule, for example an antibody, by means of, for example, cyanobromide activation or by carboxylic acid activation. An apparatus for detecting changes in a magnetic response of at least one magnetic particle provided with an outer layer in a carrier liquid, the method comprising measuring the characteristic rotation time of said magnetic particle with respect to the influence of said outer layer, the measurement comprising measuring a Brownian relaxation in said carrier liquid under the action of an external alternating magnetic field, which device comprises means for producing said alternating field, at least two substantially identical detection coils connected to detection electronics and sample holders for receiving liquid liquid, characterized in that the device comprises means for measuring a change in the frequency (fmax) where a primer component of a magnetic susceptibility has its maximum when modifying the effective volume of the particle or its interaction with the carrier liquid when a hydrodynamic volume of the particle changes. Device according to claim 21, characterized in that said detection coils and sample holder are surrounded by an excitation coil for generating a homogeneous magnetic field at said sample holder. Device according to claim 22, characterized in that said excitation coil, measuring coils and sample holder are placed concentrically and adjusted around its vertical center axis. Device according to claim 21, characterized in that the device comprises an oscillator system in which the detection coils constitute frequency-determining elements in an oscillator circuit. Device according to claim 21, characterized in that said coils are arranged in the return loop of the oscillator. Device according to claim 21, characterized in that the coils surrounding each sample are electrically phase-shifted relative to each other so that the resonant frequency is determined by the difference between the inductance and the resistance of the respective coil. Device according to claim 21, 10 15 20 25 30. . . n. . .. ... --_, ° '. .I 2. ... ... . . . ... ... _ _ _,. . . . . . . . . . . . : _ __ _ _ _ _ _ ... ...... . . . . _ _ _ _ _ _; g g '.. _ ... . 6 I u. .- - n ~. u characterized in that the coils are placed in an AC bridge. Device according to claim 26, characterized in that an op amplifier is arranged for subtracting two voltages from each other. Device according to claim 21, characterized in that the device comprises a phase locking circuit. Device according to claim 21, characterized in that the device comprises oscillator / frequency generator signals for generating time-varying current to excite the coils by means of white noise. Device according to claim 21, characterized in that frequency-dependent information is obtained by an FFT filtering of the response. A method for determining the amount of molecules in a carrier liquid containing magnetic particles comprising the steps of: A. providing particles with a layer which inter- / reacts with the substance to be analyzed, B. Mixing the magnetic particles with the sample to be analyzed for molecules, C. Fill a sample container with the liquid prepared according to B, D. Place sample container in detection system, E. Apply an external measuring field over the sample with a certain amplitude and frequency, 10 33. 34. 524 Ûglëßa fi sfvt. F. Measure the magnetic response (both the phase and out-phase components) at this frequency, G. Change the frequency and perform the measurement again according to D and E, H. Analyze the result by determining a Brownian relaxation time from ifas and urfas components by using data in the examined frequency range. Method according to claim 32, characterized by determining the frequency shift (for the same value of the ifase and out-of-phase component) at different frequencies. Method according to any one of claims 32-33, characterized in that said molecule consists of a biomolecule.