SE518759C2 - Vektorer motståndskraftiga mot metylering - Google Patents

Description

518 759 9.

DNA påverkar uttrycksnivån från det särskilda DNA't. Det introducerade DNA:t kan u ø o ø n I - - | - u u - - v. också inkorporeras i det kromosomala DNA:t i en delande cell genom rekombination.

Om detta särskilda DNA blir metylerat före inkorporeringen med det kromosomala DNA:t och celldelning kommer det troligen även att metyleras under efterföljande celldelningar. Om en hög uttrycksnivå önskas är metyleringen av DNA°t i uttrycksvektorer ett problem.

Ett liknande problem förekommer också när man använder vektorer vid be- handling av rubbningar och vid vaccinering inom läkekonsten. Till exempel så är DNA-vaccinet oftast i form av en plasmid-DNA-uttrycksvektor som tillverkats i bakterier och därefter renats och givits till muskler och hud. DNA-vacciner har visat effekt mot ett stort antal virala, bakteriella och parasitiska rubbningar i dj unnodeller.

Metyleringsnivån av sådant DNA kommer emellertid att påverka uttrycksnivån av antigena-proteiner, vilka är nödvändiga för framkallandet av immunsvar mot antigenet. Samma problem gäller även för användningen av DNA-vektorer i gen- behandlingar.

Ett sätt att lösa metyleringsproblemet för nukleotidsekvenser vid överföring in i en ny värd är att manipulera generna och avlägsna alla CpG-motiv utan att förändra polypeptidema som de kodar för. Sådana modifierade gener kommer inte att metyleras. Strategin för användning av sådana modifierade gener lämpar sig väl för gener med en kortare nukleotidsekvens men kan inte tillämpas för längre nukleotidsekvenser såsom vektorer eller när det finns ett behov av flera olika vektorer.

Dessutom är promotorema som används för uttryck av gener ofta rika på CpG-motiv som inte kan avlägsnas utan att skada promotoms funktion och därmed uttrycksnivån.

Det finns ett behov av stabila optimerade vektorer som inte undergår metylering vid överföring in i en eukaryot cell för användning inom både industri och läkemedelskonsten. Genom att tillhandahålla sådana vektorer kommer industrin ha mindre problem att erhålla en konstant och ett högt uttryck av intressanta gener i eukaryota celler.

Vidare kommer läkemedelskonsten att tillhandahålla förbättrade vektorer, vektorer som inte undergår metylering vid överföring in i en mottagarvärdcell där uttrycket av nukleotidsekvensema placerade i vektorema bibehålls, vilket är 518 759 u u u - | ~ u u o » I ~ v v | nu användbart både vid vaccinering och genbehandling såväl som for alla andra behandlingar där uttrycksvektorer används.

KORT BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Uppfinningen avser vektorer som har modifierats på ett sådant sätt att metylering av vektom avsevärt minskas vid överföring av vektom in i en mottagarvärdcell. Därvid bibehålls uttrycket av vektoms nukleotidsekvens på en acceptabel nivå i en mottagarvärdcell. En nivå som bibehåller de funktioner man räknar med erhålla från nukleotidsekvensema och/eller polypeptidema som kodas av nukleotidsekvenserna. Uppfinningen avser också metoder for framställning av nämnda vektorer och användning av vektorcrna inom industrin såväl som i läkemedel, tex behandling och/eller diagnostik.

I enlighet därmed, som ett första syfte avser uppfinningen en vektor omfattande en nukleotidsekvens, vari en eller två cytosiner i åtminstone ett CpG-motiv ersatts med en cytosinmotsvarighet som är motståndskraftig mot metylering.

I ett annat syfte avser uppfinningen en givarvärdcell omfattande en vektor med en nukleotidsekvens, vari en eller två cytosiner i åtminstone ett CpG-motiv ersatts med en cytosinmotsvarighet som är motståndskraftig mot metylering.

I ett ytterligare syfte avser uppfinningen en nukleotidsekvens som är del av en vektor erhållen från en givarvärdcell och/eller en polypeptid tillverkad av en givarvärdcell.

I ytterligare ett armat syfte avser uppfinningen en farmaceutisk sammansättning omfattande en vektor och/eller en givarvärdcell och/eller en nukleotidsekvens och/eller en polypeptid och ett farmaceutiskt acceptabelt spädningsmedel, bärare, adjuvans eller hjälpämnen.

I ytterligare ett annat syfte avser uppfinningen en metod att minska metylering av CpG-motiv i en vektor i en mottagarvärd. Metoden omfattar att åtminstone en cytosin i ett CpG-motiv ersätts med en cytosinmotsvarighet.

I ytterligare ett annat syfte avser uppfinningen utrustning omfattande en vektor och/eller givarvärdcell. 518 759 I ytterligare ett annat syfte avser iippfinningen en metod att överföra en vektor, en nukleotidsekvens, en polypeptid eller en fannaceutisk sammansättning in i en mottagarvärdcell, varvid metoden väljs från listan bestående av elektroporering, mikroprojektilbeskjutning och liposomformedlad överlämning.

I ytterligare ett annat syfte avser uppfinningen en vektor, en givarvärdcell, en nukleotidsekvens, en polypeptid eller en farmaceutisk sammansättning for användning i behandling och/eller i diagnostik.

I ett slutligt syfte avser uppfinningen användningen av en vektor, en givarvärdcell, en nukleotidsekvens, en polypeptid eller en farmaceutisk sammansättning for tillverkning av ett läkemedel for användning i behandling och/eller i diagnostik.

Uppfinningen tillhandahåller fullständigt nya vektorer, i vilka cytosin i CpG- motiv har ersatts med en cytosinmotsvarighet. Cytosinmotsvarigheten är motståndskraftig mot metylering. Nämnda cytosinmotsvarigheten ersätter åtminstone 5-positionen i pyrimidinringen hos cytosin i CpG-motivet. En sådan ersättning leder till en förbättrad vektor som vid överföring in i en mottagarvärdcell, såsom en eukaryot cell, bibehåller aktiviteten/uttrycket av vektoms nukleotidsekvens. Vidare tillhandahåller uppfinningen metoder att tillverka sådana vektorer och användningen av sådana vektorer inom t ex såväl industri som inom läkemedelskonsten.

BESKRIVNING AV RITNINGARNA Uppfinningen åskådliggörs med hänvisning till ritningarna, i vilka Fig. l visar strukturen av 5-azadeoxicytidin.

Fig. 2 visar ett exempel på en allmän struktur av ett cytidinderivat.

DETALJERAD BESKRIVNING AV UPPFINNINGEN Definitioner I sammanhanget av föreliggande ansökan och uppfinning gäller följande definitioner: Uttrycket ”nukleotidsekvens” avses betyda en sekvens av två eller fler nukleotider. Nukleotiderna kan vara av genomiskt DNA, cDNA, RNA, semisyntetiskt 518 759 B eller syntetiskt ursprung eller en blandning därav. Uttrycket omfattar enkel- och dubbelsträngade former av DNA och RNA. u n ~ a « u o | u a ø ø v ; - nu Uttrycket ”vektor” avses betyda en nukleotidsekvens som vanligtvis är en cirkulär duplex av DNA med förmåga att föröka sig oberoende av kromosomalt DNA till ett flertal kopior i en värd, d v s som har kopieringstart. Vektorn kan också vara en vektor som inkorporeras med genomet hos mottagarvärdcellen. Vektorn bibehålles stabilt och/eller tillverkas i värden under förökningen, såsom genom användning av en selektionsmarkör i vektom. Vektom kan vara en bakteriofag, plasmid, fagmid, viral vektor, växttransformationsvektor, insektsvektor eller YAC (yeast artificial chromosome).

Uttrycket ”kopieringsstart” avses betyda en nukleotidsekvens, vid vilken DNA-syntesen för kopiering av vektom börjar. Kopieringsstart kan ske vid ett eller flera platser i vektorn beroende på vektom som används, såsom vid en plats i en plasmidvektor eller vid flera platser i en adenovektor. Kopieringsstart benämns allmänt kopieringsbörjan (förkortas ori-plats) i en plasmidvektor.

Uttrycket ”selektionsmarkör” avses betyda t ex en gen kodande för en polypeptid som ger motståndskraft mot en drog, t ex ampicillin, kanamycin, tetracyklin, kloramfenikol, neomycin, hygromycin eller metotrexat.

Uttrycket ”kontrollsekvens” eller ”kontrollsekvenser” avses betyda nukleotidsekvenser inblandade i kontroll av en handlingsreaktion. Detta omfattar nukleotidsekvenser och/eller proteiner inblandade i reglering, kontroll eller påverkan av uttrycket av strukturgener eller av kopiering, selektionen eller bibehållandet av en plasmid eller en viral vektor. Exempel omfattar dämpare, avstängare, förstärkare, styrare, terminatorer och promotorer.

Uttrycket ”CpG-motiv” avses betyda en dubbelsträngad nukleotidsekvens som har en cytosin följt av en guanin, vilka är länkade genom en fosfatbindning, d v s CpG- motivet har två cytosiner, en placerad i vardera sträng av den dubbelsträngade nukleotidsekvensen.

Uttrycket ”metylering” eller ”metylerat CpG-motiv” avses betyda att cytosin är metylerad på pyrimidinringen, vilket vanligtvis sker vid 5-positionen i pyrimidinringen. En eller flera metylerade CpG-motiv i en nukleotidsekvens kan leda 518 759 6» till fullständig avstängning av uttrycket av nukleotidsekvensen. Om metylerade CpG- n < v » c u v v u u v u | a nu motiv är lokaliserade inom en nukleotidsekvens som kodar for en polypeptid eller inom andra nukleotidsekvenser inblandade i uttrycket av en specifik nukleotidsekvens, tex en kontrollsekvens såsom definierat ovan, erhålls en avsevärd eller fullständig minskning av uttrycket av nämnda nukleotidsekvens.

Uttrycket ”motståndskraftig mot metylering” avses betyda frånvaro av metylering av en eller båda 5-positionema i pyridmidinringama som befinner sig i CpG-motivet. Ett eller flera CpG-motiv kan vara ometylerade inom en vektor som är motståndskraftig mot metylering. Motståndskraftighet mot metylering uppnås genom att en existerande cytosin ersätts med en cytosinmotsvarighet.

Uttrycket ”mottagarvärdcell” avses betyda en cell, vilken ej är densamma som givarvärdecellen. Inuti en mottagarvärdcell blir en vektor metylerad i CpG-motiven, eftersom mottagarvärdcellen startar metylering av CpG-motiv i nukleotidsekvenser som ej är lika nukleotidsekvensen hos mottagarvärdcellen. Detta kan ske när mottagarvärdcellen mottager en vektor som har tillverkats/multiplicerats i en givarvärdcell. Metyleringen av vektom leder till ett minskad eller fullständig avstängning av vektom.

Uttrycket ”ersatt med en cytosinmotsvarighet” avses betyda att en befintlig cytosin i ett CpG-motiv såsom definierat ovan ersätts med en cytosinmotsvarighet.

Cytosinmotsvarigheten ersätter åtminstone 5-positionen i pyrimidinringen hos cytosin.

Cytosinmotsvarigheten är motståndskraftig mot metylering. Cytosinmotsvarigheten kan emellertid ersätta cytosin delvis eller fullständigt. Cytosin ersätts med en cytosinmotsvarighet under kopieringen av vektom.

Uttrycket ”cytidinderivat” avses betyda ett cytidinderivat med förmåga att ersätta cytosin i ett CpG-motiv utan att påverka aktiviteten hos nukleotidsekvensen som innehåller det ersatta cytidinderivatet. Aktiviteten hos nukleotidsekvensen kan vara densamma som innan cytosin ersatts med ett cytidinderivat. Till exempel kommer en nukleotidsekvens, som kodar for en polypeptid, även efter ersättning av en eller flera cytosiner med cytidinderivat fortfarande vara aktiv och uttrycka polypeptiden.

Cytidinderivatet är ett derivat som inte kan undergå metylering vid 5-positionen i 5 1 8 7 5 9 “9 pyrimidinringen närvarande i cytidinderivatet. Exempel på cytidinderivat finns i Fig. l och 2.

Uttrycket ”bibehålla uttryck” avses betyda uttryck av nukleotidsekvensen som kodar för en polypeptid och innehåller en eller flera cytosinmotsvarigheter, d v s bibehåller uttrycket till åtminstone en acceptabel nivå. Nivån är högre än den ometylerade fonnen av nukleotidsekvensen. Det bibehållna uttrycket kan ligga inom ett intervall som är högre än uttrycket av den metylerade formen av samma nukleotidsekvens eller så kan uttrycket vara lika högt som uttrycket av den ometylerade formen av samma nukleotidsekvens.

Uttrycket ”givarvårdcell” avses betyda en cell som används for tillverkning/multiplicering av vektom. Under tillväxt eller multiplicering av givarvärdcellen ökar kopietalet av vektom och samtidigt ersätts cytosin i CpG-motiv med en cytidinmotsvarighet, när cytosinmotsvarigheten tillsätts i en tillräcklig mängd till tillväxtmediet som används för tillväxt av givarvärdcellen. Givarvärdcellen skiljer sig från mottagarvärdcellen, såsom givarvärdcellen är en bakteriell cell eller en viral partikel och mottagarvärdcellen är en djur- eller växtcell.

VEKTORN ENLIGT UPPFINNINGEN Enligt uppfinningen är vektorn en vektor omfattande en nukleotidsekvens, i vilken en eller två cytosiner i åtminstone ett CpG-motiv har ersatts med en cytosinmotsvarighet som är motståndskrafiig mot metylering.

Genom att tillhandahålla nämnda vektor, vilken är motståndskraflig mot metylering, bibehålls uttrycket av nukleotidsekvenser placerade i vektom till en nivå som är högre än den metylerade formen av vektom. Därvid bibehålls vektoms funktion. Vidare kan ersättningen av cytosin med cytosinmotsvarigheter användas för att reglera uttrycket av nukleotidsekvenser. En minskning eller ökning av metyleringsnivån leder till olika uttrycksnivåer, så att en ökad metyleringsnivå leder till en minskning av uttrycksnivån. Genom att ersätta cytosin med en cyftosinmotsvarighet är det möjligt att undvika metyleringsproblem, vilka kan uppstå när vektorn införs i en mottagarvärdcell. 518 759 3 Enligt en första utföringsform ersätts cytosin med en cytosinmotsvarighet som ersätter 5-positionen i pyrimidinringen hos cytosin som befinner sig i CpG-motivet.

Cytosinmotsvarigheten kan vara N, O eller C-X. X i C-X kan vara en låg- eller icke- elektrofil grupp, såsom etyl eller metoxi. Vidare kan cytosin ersättas av ett cytidinderivat, såsom 5-azacytidin och/eller S-azadeoxicytidin. 5-azadeoxicytidin kan också benämnas s-Triazin-2(1H)-on, 4-amino-1-(2-deoxi-.beta.-D-erytro- pentofiJranosyl- (SCI), 1,3,5-Triazin-2(lH)-on, 4-amino-l-(2-deoxi-.beta.-D-erytro- pentofuranosyl)- (9CI), S-aza-T-deoxicytidin eller Decitabine (USAN).

Antalet och fördelningen av cytosinmotsvarigheter inom CpG-motiven hos vektom hämmar metylering av 5-positionen i pyrimidinringen, vilket leder till bibehållandet av uttrycket av den nukleotidsekvens som kodar för polypeptider och befinner sig i vektom. Ett ökat antal inkorporerade cytosinmotsvarigheter i nukleotidsekvensregionen kodande för en polypeptid som befinner sig i vektom leder till i en ökad möjlighet att bibehålla uttrycket av nukleotidsekvenser närvarande i den regionen av nukleotidsekvenser. Ett ökat antal inkorporerade cytosinmotsvarigheter inom andra regioner av vektom kan indirekt påverka bibehållandet av en nukleotid- sekvensregion som kodar för en polypeptid. Exempel på nukleotidsekvensregioner, vilka indirekt påverkar andra nukleotidsekvensregioner, är kontrollsekvenser såsom promotorer.

Ett CpG-motiv omfattar två cytosiner som har förmåga att bli ersatta av en cytosinmotsvarighet. Antingen ersätts en eller båda. I det fallet flera cytosinmotsvarigheter är inkorporerade i vektom, kan cytosinmotsvarighetema antingen inkorporeras med en och samma sträng eller med båda strängama.

Cytosinmotsvarigheterna inkorporeras med vektom under kopieringen av vektom.

Antalet cytosinmotsvarigheter och fördelningen av dem leder till motståndskrafl mot metylering av nämnda cytosinmotsvarigheter. Förekomsten av nämnda cytosinmotsvarigheter bibehåller uttrycket av nukleotidsekvenser omfattande cytosinmotsvarigheter till en acceptabel nivå.

I en utföringsforrn ersätts åtminstone 1 % (t ex 1-5 %) av CpG-motiven med cytosinmotsvarigheter, såsom 5 % (t ex 5-10 %), 10 % (t ex 10-20 %), 20 % (t ex 20- 30 %), 30 % (t ex 30-40 %), 40 % (t ex 40-50 %), 50 % (t ex 50-60 %). Företrädesvis v o a - ø n un 518 759 q ersätts från ca 1 till ca 100 % av cytosinema med cytosinmotsvarigheter, såsom från 1 till omkring 95 % eller från omkring 5 till omkring 95 %. Cytosinmotsvarigheterna inkorporeras antingen i en eller i båda strängarna av vektoms nukleotidsekvens.

Vektom kan innefatta åtminstone en gen eller del av en gen. Vilken gen beror på vad vektom ska användas till. En möjlig genkandidat kan vara en som ger upphov till ett immunsvar mot influensa och därmed användbar i syfte att vaccinera människor. Vidare kan vektom innefatta en eller flera kontrollsekvenser.

Kontrollsekvenser som gör det möjligt att bibehålla och multiplicera vektom i en lämplig givarvärdcell och/eller kontrollsekvenser som gör det möjligt att bibehålla och/eller multiplicera vektom i mottagarvärdcellen. Ytterligare kontrollsekvenser kan förekomma, vilka gör det möjligt att uttrycka en gen och/eller del av en gen i en mottagarvärdcell till en lämplig uttrycksnivâ. Valet av kontrollsekvenser beror på den önskade uttrycksnivån för genen eller del av genen och en fackman har fönnåga att identifiera sådana kontrollsekvenser.

Vektom kan vara vilken vektor som helst, så länge som vektom har förmåga att multipliceras i värden (mottagare och/eller givare), d v s har en kopieringsstart. Det skall förstås att inte alla vektorer och kontrollsekvenser fiingerar lika bra för att uttrycka en intressant nukleotidsekvens. Inte heller kommer en värd att fungera lika bra med samma uttryckssystem. En fackman har emellertid förmåga att göra ett urval bland dessa vektorer, kontrollsekvenser och värdar utan onödigt experimenterande.

Vid val av vektor måste t ex hänsyn tas till värden, eftersom vektom måste multipliceras i givar- och/eller mottagarvärdcell eller ha förmåga att inkorporeras med mottagarvärdcellens kromosom. Vektoms kopietal, förmågan att kontrollera kopietalet och uttrycket av andra protein som vektom kodar för, såsom selektionsmarkörer, ska också beaktas. Vid val av en kontrollsekvens ska en mängd faktorer beaktas. Dessa omfattar t ex sekvensens relativa styrka, dess kontrollerbarhet och dess kompatibilitet med nukleotidsekvensen som kodar för den intressanta polypeptiden, i synnerhet med avseende på möjliga sekundära strukturer. Värdar ska väljas med avseende på deras kompatibilitet med vald vektor, toxiciteten av polypcptiden som kodas av nukleotidsekvensen, deras utsöndringsegenskaper, deras förmåga att vecka o . c o u on 518 759 en u u a . » . u n a o ø . - | . ~ en polypeptiden korrekt, deras fermentatioris? eller odlingsbetingelser och enkelhet för rening av produkterna som kodas av nukleotidsekvensen.

Vektom kan vara en autonomt replikerande vektor, d v s en vektor som existerar som en extrakromosomal enhet, där kopieringen är oberoende av den kromosomala kopieringen, t ex en plasmid. Altemativt är vektom en som inkorporeras med mottagarvärdcellsgenomet och kopieras tillsammans med kromosomen/kromosomerna, in i vilken/vilka den har inkorporerats. En vektor som inkorporerats med genomet hos mottagarvärdcellen kan vara fördelakti g att använda, då en särskild gen och/eller del av en gen och/eller kontrollsekvens behöver skyddas från framtida möjliga metyleringsproblem. Metylering kan ske vid kopiering av genomet som vektom inkorporerats med. Ett annat exempel är då det finns behov att avlägsna en särskild gen och/eller del av gen och/eller kontrollsekvens närvarande i ett genom. Uttrycket av genen och/eller del av genen och/eller kontrollsekvensen kan minskas på grund av metyleringen och ersättning av en sådan metylerad gen och/eller del av gen och/eller kontrollsekvens med en ometylerad form kan eventuellt öka uttrycksfönnågan av genen i förhållande till den metylerade. Ersättningen kan genom- föras med hjälp av metoder såsom homolog rekombination. Genen och/eller del av genen och/eller kontrollsekvensen kan regleras upp eller ner med hjälp av sådana ersättningar. En vektor omfattande en eller flera cytidinmotsvarigheter, vilken inkorporerats med ett genom, kan vid kopieringen av genomet ge upphov till nya kopior av genomet omfattande nämnda vektor utan en eller flera cytidinanaloger. Den nya kopian av genomet, vilken innehåller en vektor, kan emellertid ändå vara motståndskrafiig mot metylering, även om ingen cytidinanalog finns i den nya kopian av vektom placerad i den nya kopian av genomet.

Vektom kan vara en uttrycksvektor, i vilken nukleotidsekvensen kodande för polypeptiden enligt uppfinningen är operativt bunden till ytterligare segment som behövs för transkription av nukleotidsekvensen. Vektom erhålls vanligtvis från plasmid-DNA eller viralt DNA. Ett antal lämpliga uttrycksvektorer för uttryck i värdcellema nämnda häri är kommersiellt tillgängliga eller beskrivs i litteraturen.

Användbara uttrycksvektorer för eukaryota värdar omfattar t ex vektorer omfattande kontrollsekvenser från SV40, bovint papillomvirus, adenovirus och cytomegalovirus. 518 759 .. .. .. .: .... _' 1 \ Specifika vektorer är tex pCDNA3. 1(+)\Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) och pCI-neo (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Användbara vektorer for jästceller omfattar Zu-plasmiden och derivat därav, POTl-vektorn (US 4,93 1,373), pJSO37-vektorn beskriven i Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996 och pPICZ A, B eller C (Invitrogen). Användbara vektorer för insektsceller omfattar pVL941, pBG3l I (Cate el al., ”Isolation of the Bovine and Human Genes för Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human Gene in Animal Cells”, Cell, 45, s. 685-98 (1986), pBluebac 4.5 och pMelbac (båda kan erhållas från Invitrogen). Användbara uttrycksvektorer för bakteriella värdar omfattar kända bakterieplasmider, såsom plasmider från E. coli, omfattande pBR322, pET3a och pET12a (båda från Novagen Inc., WI, USA), plasmider för bredare värdurval, såsom RP4, fag-DNA, t ex det stora urvalet derivat av fag lambda, t ex NM898 och andra DNA-fager, såsom M13 och filamentösa enkelsträngade DNA-fager. Exempel på lämpliga virala vektorer är adenovirala vektorer, adenoassocierade virala vektorer, retrovirala vektorer, lentivirala vektorer, herpesvektorer och cytomegalovirala vektorer.

Andra vektorer som kan användas i uppfinningen omfattar de som medger att nukleotidsekvensen som kodar för polypeptiden uppförökas i kopietal. Sådana uppförökande vektorer är väl kända inom tekniken. De omfattar t ex vektorer som kan uppförökas med DHFR-uppförökning (se t ex Kaufman, US Patent nr. 4,470,46 1, Kaufman och Sharp, ”Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Uttryck”, Mol. Cell. Biol., 2, s. 1304- 19 (1982)) och glutaminsyntetas- (”GS”) uppförökning (se t ex US 5,l22,464 och EP 33 8,841).

Den rekombinanta vektom kan vidare innefatta en DNA-sekvens, vilken möjliggör för vektom att kopieras i värdcellen i fråga. Ett exempel på en sådan sekvens (när värdcellen är en däggdjurscell) är SV40-kopieringsstarten. När värdcellen är en jästcell är lämpliga sekvenser, som möjliggör för vektom att kopieras, jästplasmid 2u kopieringsgenema REP 1-3 och kopieringsstartten.

Vektom kan även innefatta en selektionsmarkör, t ex en gen där dess produkt komplementerar en toxinrelaterad brist i värdcellen, såsom genen som kodar för dihydrofolatreduktas (DHFR) eller Schizosaccharomyces pombe TPI-genen (beskrivet 518 759 k. av P.R. Russell, Gene 40, 1985, s. 125-136) eller en som ger motståndskraft mot en drog, t ex ampicillin, kanamycin, tetracyklin, kloramfenikol, neomycin, hygromycin eller metotrexat. För Saccharomyces cerevísíae omfattar selektionsmarkörema ura3 och leu2. För filamentösa svampar omfattar selektionsmarkörer amdS, pyrG, arcB, niaD och sC.

Uttrycket ”kontrollsekvenser” definieras häri att omfatta alla delar som är nödvändiga eller fördelaktiga för uttryck av polypeptiden enligt uppfinningen. Varje kontrollsekvens kan vara naturlig eller främmande för nukleinsyrasekvensen som kodar för polypeptiden. Sådana kontrollsekvenser omfattar, men är ej begränsade därtill, en ledarsekvens, polyadenyleringssekvens, propeptidsekvens, promotor (inducerbar eller konstitutiv), förstärkare eller uppströms aktiverande sekvens, signalpeptidsekvens och transkriptionsterminator. Som minst omfattar kontrollsekvensema en promotor.

Ett stort antal kontrollsekvenser kan användas i föreliggande uppfinning. Så- dana användbara kontrollsekvenser omfattar kontrollsekvensema associerade med strukturgener hos föregående uttrycksvektorer såväl som vilken sekvens som helst, vilken är känd för att kontrollera uttrycket av gener i prokaryota eller eukaryota celler eller deras virus, och olika kombinationer därav.

Exempel på lämpliga kontrollsekvenser för att styra transkriptionen i däggdjursceller omfattar tidiga och sena promotorer av SV40 och adenovirus, t ex adenovirus 2 stora sena promotor, MT-l- (metallotionein) promotor, cytomegalovirus mellan tidiga genpromotor (CMV) av människa eller gnagare, den humana förlängningsfaktor lot- (EF-lot) promotom, den minimala värmeshock Drosophíla protein 70 promotor, Rous Sarcoma Virus (RSV) promotor, den humana ubikitin C- (UbC) promotom, den humana tillväxtfaktorhormonterminatom, SV40 eller adenovirus Elb region polyadenyleringssignaler och Kozak consensussekvensen (Kozak, M., J. Mol. Biol. 20 augusti 1987, l96(4):947-50).

För att förbättra uttryck i däggdjursceller kan ett syntetiskt intron föras in i den icke-översatta Sïregionen av nukleotidsekvensen kodande för polypeptiden. Ett exempel på ett syntetiskt intron är det syntetiska intronet från plasmid pCI-Neo eller 518 759 få från ß-globingenen (erhålls från Promega Corporation, WI, USA). Dessutom kan ett IRES-beståndsdel inkluderas.

Exempel på lämpliga kontrollsekvenser for att styra transkriptionenen i insektsceller omfattar polyhedrinpromotorn, P 1 O-promotorn, Autographa calzfornica polyhedrosvirus grundläggande proteinpromotom, baculovirus mellantidiga gen 1- promotom och baculovirus 39K försenade-tidiga genpromotom och SV40 polyadenyleringssekvensen. Exempel på lämpliga kontrollsekvenser for användning i jästvärdceller omfattar promotorema for jästs ot-parande systemet, jästs triosfosfatisomeras- (TPI) promotor, promotorer från jästs glykolytiska gener eller alkoholdehydrogenasgener, ADH2-4c-promotorn och den inducerbara GAL- promotom. Exempel på lämpliga kontrollsekvenser for användning i filamentösa svampvärdceller omfattar ADH3 -promotom och terminatom, en promotor erhållen från genema som kodar for Aspergíllus oryzae TAKA amylastriosfosfatisomeras eller alkaliskt proteas, ett A. níger ot-amylas, A. níger eller A. nidulans glukoamylas, A. nídulans acetamidas, Rhizomucor míeheí asparagínsyraproteinas eller lipas, TPI 1- terminatorn och ADH3 -terrninatom. Exempel på lämpliga kontrollsekvenser for användning i bakteriella värdceller omfattar promotorer för lac-systemet, trp-systemet, TAC- eller T RC-systemet och de större promotorregionema av fag lambda.

Närvaron eller frånvaron av en signalpeptid beror t ex på uttrycksvärdcellen, som används for framställning av polypeptiden som ska uttryckas (vare sig det är en intracellulär eller extracellulär polypeptid) och huruvida det är önskvärt att erhålla utsöndring. För användning i filamentösa svampar kan signalpeptiden på lämpligt sätt erhållas från en gen kodande for ett Aspergíllus sp. amylas eller glukoamylas, en gen kodande for ett Rhízomucor míeheí lipas eller proteas eller ett Humícola lanugínosa lipas. Signalpeptiden erhålls företrädesvis från en gen kodande for A. oryzae TAKA amylas, A. níger neutralt ot-amylas, A. níger syrastabilt amylas eller A. níger glukoamylas. För användning i insektsceller kan signalpeptiden på lämpligt sätt erhållas från en insektsgen (se vidare WO 90/05783) såsom den Lepidopteran manduca sexta adipokinetiska hormonforlöparen (se vidare US 5,023,328), honungsbi melittin (Invitrogen), ecdysteroid UDP-glukosyltransferas (egt) (Murphy et al., Protein Expression and Purification 4, 349-357 (1993) eller humant pankreatiskt lipas (hpl) 518 759 \'-\ (Methods in Enzymology, 284, s. 262-272, 1997). En föredragen signalpeptid for u u - | ø a o» användning i däggdjursceller är den från hG-CSF eller den murina Ig kappa lätta kedjans signalpeptid (Coloma, M. (1992) J. Imm. Methods 152289-104). För användning i jästceller har lämpliga signalpeptider visat sig vara ot-faktorn signalpeptid från S. cereviciae (se vidare US 4,870,008), en modifierad karboxipeptidassignalpeptid (se vidare L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, s. 887-897), jäst BARI-signalpeptiden (se vidare WO 87/02670), jäst asparaginsyraproteas 3- (YAP3) signalpeptiden (se vidare M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, s. 127-137) och den syntetiska ledarsekvensen TA57 (WO 98/32867).

Vilken lämplig givarvärdcell som helst kan användas för att bibehålla och tillverka vektorn enligt uppfinningen, såsom en eukaryot eller prokaryot cell, t ex bakterier, svampar (inklusive jäst), växter, insekter, däggdjur eller andra lämpliga djurceller eller cellinjer såväl som transgena djur eller växter. Givarvärdcellen kan vara en givarvärdcell tillhörande en GMP- (Good Manufacturing Practice) certifierad cellinje, såsom en däggdjurscellinje. Exempel på bakteriella givarvärdceller omfattar grampositiva bakterier såsom stammar av Bacíllus, t ex B. brevis eller B. subtílis, Pseudomonas eller Streptomyces eller gramnegativa bakterier såsom stammar av E. coli. Exempel på lämpliga filamentösa svamp-givarvärdceller omfattar stammar av Aspergillus, t ex A. oryzae, A. níger eller A. nidulans, F usarium eller T ríchoderma.

Exempel på lämpliga jäst-givarvärdceller omfattar stammar av Saccharomyces, t ex S. cerevísíae, Schízosaccharomyces, Klyveromyces, Pichía, såsom P. pastoris eller P. methanolíca, Hansenula såsom H Polymorpha eller Yarrowía. Exempel på lämpliga insektsgivarvärdceller omfattar en Lepídoptora-cellinje såsom Spodoptera frugíperda (Sf9 eller Sf2l) eller T richoplusioa ní-celler (High Five) (US 5,077,214). Exempel på lämpliga däggdjursgivarvärdceller omfattar ovariecellinjer av kinesisk hamster (CHO) (t ex CHO-K1, ATCC CCL-61), grön apa cellinjer (COS) (t ex COS 1 (ATCC CRL- 1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)), musceller (t ex NS/O, njur (BHK) cellinjer från hamsterunge (t ex ATCC CRL-1652 eller ATCC CCL-10) och humana celler (t ex HEK 293 (ATCC CRL-1573)), såväl som växtceller i Vävnadskultur. Ytterligare lämpliga givarvärdcellinjer är kända inom tekniken och erhålls från offentliga förvaringsställen såsom American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. 518 759 15 I en särskild utforingsform avser uppfinningen en nukleotidsekvens, vilken I I I I . . ' . - . . . . - . . . n erhållits från en givarvärd innehållande nukleotidsekvensen som en del av vektom.

Vektorn och givarvärden är en vektor och en givarvärd såsom beskrivet ovan.

Nukleotidsekvensen kan vara en gen och/eller del av en gen och/eller en eller fler kontrollsekvenser såsom nämnt i det ovanstående. Ett exempel på gen eller gener som är intressanta är gener som kodar for cellkämeprotein, såsom gener kodande for influensacellkärneproteinet som kan användas for vaccinering. Ett annat exempel är genen som kodar for tyrosinhydroxylas, vilken kan vara användbar for behandling av Parkinsons sjukdom. Ett tredje exempel är gener som kodar for faktor X eller VIII inblandade i blodkoagulationskomplexet eller interferon gamma. Dessutom är alla typer av gener, som kan användas i genbehandling såsom genkandidater som kan användas i behandling av cancer lämpliga for att användas enligt uppfinningen, såsom tymidinkinas från Herpes Simplex Virus (HSV).

I en annan utforingsform avser uppfinningen en polypeptid framställd av givarvärdcellen, varvid polypeptiden kodas av en nukleotidsekvens som är del av vektom i enlighet med uppfinningen och beskrivs i det ovanstående.

I en annan utforingsform avser uppfinningen en fannaceutisk sammansättning omfattande ovanstående beskrivna vektor och/eller givarvärdcell och/eller en nukleotidsekvens erhållen från vektom och/eller en polypeptid och ett farmaceutiskt acceptabelt spädningsmedel, bärare, adjuvans eller hjälpämne.

Vektom, nukleotidsekvensen, polypeptiden eller en fannaceutisk sammansättning såsom beskrivet ovan kan överföras in i en mottagarvärdcell under användning av ett lämpligt transforrnationsforfarande såsom elektroporering, mikroprojektilbeskjutning eller liposomformedlad avlämning.

Vektom, nukleotidsekvensen, polypeptiden eller en farrnaceutisk sammansättning såsom beskrivet ovan kan användas i behandling och/eller i diagnostik.

Vektorn, nukleotidsekvensen, polypeptiden eller en farrnaceutisk sammansättning såsom beskrivet ovan kan användas for tillverkning av ett läkemedel for användning i behandling och/eller i diagnostik. 518 759 Ho .

METOD ATT TILLVERKA VEKTORN ENLIGT UPPFINNINGEN En utföringsforin enligt uppfinningen avser en metod som minskar metyleringen av CpG-motiv i en vektor i en mottagarvärd, där metoden omfattar ersättandet av åtminstone en cytosin i ett CpG-motiv med en cytosinmotsvarighet, vektom har beskrivits ovan.

Enligt en annan utfóringsform enligt uppfinningen omfattar metoden stegen att: tillhandahålla en vektor, överföra vektom in i en givarvärdcell, odla givarvärdcellen innehållande vektom i ett tillväxtmedium bestående av en lämplig mängd av cytosinmotsvarigheter och skörda den uppförökade vektom omfattande insatta cytosinmotsvarigheter i en eller två cytosiner i åtminstone ett CpG-motiv.

Vektom är en vektor såsom det beskrivits ovan och givarvärden är en givarvärdcell såsom det beskrivits ovan.

Vektom och givarvärden väljs beroende på vilket syftet är att skapa den specifika vektor med insatta cytosinmotsvarigheter och en fackman inom området kan utföra detta urval. Vektom förs in i givarvärden med hjälp av en lämplig metod vilket är beroende på vilken givarvärd som har valts. Införandet av en vektor in i en bakteriell givarvärdcell kan t ex åstadkommas med protoplasttransfonnation (se t ex Chang och Cohen, 1979, Molecular General Genetics 1682111-115) där man använder sig av kompetenta celler (se t ex Young och Spizizin, 1961, Journal of Bacteríology 822823-829 eller Dubnau och Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56:209-221), elektroporering (se t ex Shigekawa och Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751) eller konjugation (se t ex Koehler och Thome, 1987, Journal of Bacteriology l69:577l-5278). Svampceller kan transforrneras med hjälp av protoplastfonnation. Transformation av protoplaster och regenerering av cellväggen sker på ett sätt känt per se. Lämpliga sätt att transformera Aspergillus-värdceller beskrivs i EP 238 023 och US 5,679,543. Lämpliga sätt att transformera F usarium- arter beskrivs av Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 och WO 96/00787. J äst kan transforrneras med hjälp av metoder beskrivna av Becker och Guarente, I Abelson, J .N. och Simon, M.I., red., Guide to Yeast Genetícs and Molecular Biology, Methods in Enzymology, volym 194, s. 182-187, Academic Press, Inc., New York, Ito et al, 518, 759 t? 1983, Journal of Bacteríology 1532163, Hinnen et al., 1978, Proceedings of the Na- tional Academy of Sciences USA 75:1920 och såsom det beskrivits av Clontech O! Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA (i produktprotokollet för YeastmakerTM Yeast Transformation System Kit). Transformation av insektsceller och tillverkning av heterologa polypeptider kan utföras såsom det beskrivits av Invitrogen. Metoder att föra in exogent DNA i däggdjursgivarvärdceller omfattar kalciumfosfatåstadkommen transfektion, elektroporering, DEAE-dextranåstadkommen transfektion, liposomåstadkommen transfektion, virala vektorer och transfektionsmetoden beskriven av Life Technologies Ltd, Paisley, Storbritannien där man använder Lipefactamin 2000. Dessa metoder är väl kända inom tekniken och beskrivs t ex i Ausbel et al. (red.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA.

I framställningsmetodema enligt föreliggande uppfinning odlas cellema i ett tillväxtmedium lämpligt för upprätthållande och/eller framställning av vektom under användning av metoder kända inom tekniken. Exempelvis kan cellerna odlas med skakflasksodling, småskalig eller storskalig fermentering (omfattande kontinuerliga, batch-, fedbatch- eller fastfasfermenteringar) i laboratorium eller industriella ferrnenterare, där fermenteringen utförs i ett lämpligt medium och under betingelser som medger att vektom, nukleotidsekvensen eller polypeptiden uttrycks och/eller isoleras. Vektom, nukleotidsekvensen eller polypeptiden kan användas i kemisk eller farrnaceutisk industri. Odlingen sker i ett lämpligt tillväxtmedium omfattande kol- och kvävekällor och oorganiska salter under användning av metoder kända inom tekniken.

Lämpliga medier erhålls från kommersiella leverantörer eller kan framställas enligt publicerade sammansättningar (t ex i kataloger från American Type Culture Collection). Odlingen av däggdjursgivarceller utförs enligt etablerade metoder, t ex såsom det beskrivs i (Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, red. av Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc., Totowa, New Jersey, USA och Harrison MA och Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997).

Cytosinmotsvarigheten som beskrivs ovan tillsätts till tillväxtmediet i en lämplig mängd som är tillräcklig för att erhålla en vektor med en tillräcklig mängd av cytosinmotsvarigheter inkorporerade med nukleotidsekvensen för att erhålla ett önskat 5 1 8 7 5 9 (18 f uttryck av nukleotidsekvensema kodande för polypeptidema. Mängden v u . n a o: cytosinmotsvarigheter beror på flera faktorer omfattande vektorstorleken, mängden av CpG-motiv och värdcellen. I eukaryota celler används t ex ofta 10 uM 5-azacytidin och/eller 5-azadeoxicytidin. Cytosinmotsvarigheten kan tillsättas antingen fore odling eller under odlingssteget.

Efter odling skördas givarvärden genom exempelvis centrifugering och vektom återvinns genom metoder kända inom tekniken. Exempel på metoder är de som nämns i Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbour Press) (1989) och Qiagen Inc.

Mängden och fördelningen av cytosinmotsvarigheter som finns i vektom efter framställning i en lämplig givarvärd kan bestämmas med t ex användning av märkt 5- azacytidin och/eller S-azadeoxicytidin, HPLC, GC eller TC.

SATS ENLIGT UPPFINNINGEN I enlighet därmed avser uppfinningen ett sats omfattande en vektor såsom beskrivet ovan och/eller en givarvärdcell såsom beskrivet ovan omfattande en beskrivning hur vektom och/eller vektom och givarvärdcellen används.

Denna sats kan vidare omfatta ett tillväxtmedium som är lämpligt for givarvärdcellens förmåga att växa och föröka vektom.

Denna sats kan användas för framställning av en polypeptid inom industrin eller i en metod att behandla ett däggdjur som lider av en rubbning eller är i behov av vaccinering. Exempel på rubbningar är influensa och cancer.

FARMACEUTISK ANVÄNDNING OCH FORMULERINGAR Enligt en utföringsforrn av uppfinningen kan vektom, givarvärden, nukleotidsekvensen, polypeptiden eller den farmaceutiska sammansättningen enligt uppfinningen användas för flera tillämpningar omfattande vaccinering och genbehandling.

När vektom och/eller givarvärden emellertid används for behandling av en rubbning eller vaccinering, är det viktigt att nukleotidsekvensema som skapar vektom är nukleotidsekvenser (t ex kopieringsstart och kontrollsekvenser), vilka bibehåller 518 759 \°\ deras aktivitet såsom uttryck av en polypeptid i mottagarvärden, d v s i patientens neo- u u . c u o n u a a v a v | ø nu celler. I fallet när vektom t ex används för vaccinering av en människa, är det viktigt att en promotor används uppströms av nukleotidsekvensen kodande för en polypeptid som ger upphov till ett immunsvar, d v s promotom är aktiv i den mänskliga cellen.

Promotom kan vara inducerbar och/eller kontinuerlig. I fallet där man använder en inducerbar promotor, kan den vara inducerbar med hjälp av ett medel som antingen administreras tillsammans med eller efter vektom och/eller givarvärden. Promotom kan vidare induceras med hjälp av ett medel framställt i patienten, antingen lokalt eller systemiskt.

Exempelvis, om plasmider som kodar för insulin införs intramuskulärt genom elektroportering, uttrycker plasmiden insulin under en tid och sedan försvagas uttrycket. En metyleringsmotståndskraftig plasmid kommer å andra sidan troligen att ha en konstant uttryck under en lång tid. Om en sådan plasmid har en tetracyklin- inducerbar promotor skulle insulinproduktionen kunna kontrolleras genom oral administrering av tetracyklin. Denna typa av genbehandling skulle kunna tillämpas på patienter med diabetes med insulinbrist eller på hemofiliska patienter där en gen som skall uttrycka en koaguleringsfaktor saknas.

I en andra utföringsform används vektorn/givarvärden, nukleotidsekvensen, polypeptiden eller den farmaceutíska sammansättningen enligt uppfinningen för tillverkning av ett läkemedel för behandling av rubbningar eller vaccinering, såsom cancer. I dagens cancerbehandling fokuserar man på andra behandlingar än klassisk radiobehandling och kemobehandling. Två lovande områden mot cancer är antiangiogen behandling och immunbehandling. Båda behandlingama kan utnyttja genbehandling för framställning av antiangiogena medel eller for framställning av immunstimulerande eller toxiska medel. Dessa typer av behandlingar kan optimeras genom användning av metyleringsmotståndskraftiga vektorer, både som rena plasmider eller som virala vektorer som gjorts motståndskraftiga mot metylering. Ett genetiskt modifierat adenovirus, vilket uttrycker genen för Herpes Simplex Thymidin- kinas (HSV-TK), kan t ex framställas i närvaro av en beskriven cytosinmotsvarighet.

DNA av adenoviruset kommer att innehålla denna motsvarighet och vid en infektion uttrycker adenoviruset högre nivåer av HSV-TK under en lång tidsperiod i jämförelse 518 759 9,0 med ett adenovirus som inte har metyleringsmotståndskraftig DNA. Tumörceller kan - c - c ; | n n . n u ø v n Q ou sedan dödas med en herpesvirus-drog. Dödandet står i förhållande till produktionen av HSV-TK, d v s ju högre koncentration av HSV-TK desto känsligare kommer tumörcellcn att vara for läkemedlet.

I en annan utföringsform används vektorn/givarvärden, nukleotidsekvensen, polypeptiden eller den fannaceutiska sammansättningen enligt uppfinningen i en metod att behandla ett däggdjur, som har en rubbning eller är i behov av vaccinering.

Vaccineringar har av tradition utförts med hjälp av muterade eller avdödade virus.

Vaccinering med DNA använder proteiner som kodas av patogenens DNA. En sådan gen eller gener klonas i en plasmid eller i en annan vektor. Plasmider som kodar for ett eller flera patogena proteiner kan injiceras, t ex intramuskulärt. Plasmiden uttrycker det eller de patogena proteinema som igenkänns av immunsystemet hos individen.

Denna typ av immunisering skyddar sedan mot efterföljande infektion av patogenen.

Styrkan hos immunsvaret är beroende av produktionen av det patogena proteinet. En alltför liten produktion av det eller de patogena proteinema kan eventuellt inte kännas igen av immunsystemet. Följaktligen kommer immunisering av både människor och djur med metyleringsmotståndskraftiga vektorer att förbättra effektiviteten.

Farmaceutiska formuleringar av vektorn/givarvärden, nukleotidsekvensen, polypeptiden enligt uppfinningen administreras vanligtvis i en sammansättning som omfattar en eller flera farmaceutiskt förenliga bärare eller hjälpämnen. Sådana farmaceutiska sammansättningar kan framställas på ett sätt som är känt inom teknikområdet, är tillräckligt lagringsstabila och lämpliga för administrering till människor och djur. Den farmaceutiska sammansättningen kan vara lyofiliserad.

”Farmaceutiskt acceptabel” betyder en bärare eller hjälpämne som vid använd dosering och använda koncentrationer inte orsakar några oönskade effekter i patienten till vilken den/det administreras. Sådana farmaceutiskt acceptabla bärare eller hjälpämnen är väl kända inom tekniken (se Remington°s Pharmaceutical Sciences, 18:e upplagan, A.R. Gennaro, red. Mack Publishing Company (1990) och Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3:e upplagan, A. Kibbe, red., Pharmaceutical Press (2000). 518 759 3-\ Den farmaceutiska sammansättningen kan blandas med adjuvans som laktos, u n ~ « ø ~ q ø u - | ~ I o o u nu sukros, stärkelsepulver, cellulosaestrar av alkansyror, stearinsyra, talk, magnesiumstearat, magnesiumoxid, natrium- och kalciumsalter av fosfor- och svavelsyror, akacia, gelatin, natriumalginat, polyvinylpyrrolidon och/eller polyvinylalkohol och tabletteras eller kapslas in for sedvanlig administrering.

Altemativt kan de lösas i saltlösning, vatten, polyetylenglykol, propylenglykol, etanol, oljor (såsom majsolja, jordnötsolja, bomullsfröolja eller sesamolj a), dragantgummi och/eller olika buffertar. Andra adjuvanser och sätt att administrera är väl kända inom det farmaceutiska teknikornrådet. Bäraren eller spädningsmedlet kan omfatta tidsfordröjningsmaterial, såsom glycerylmonostearat eller glyceryldistearat, ensamma eller med ett vax, eller andra material som är väl kända inom teknikområdet.

De farmaceutiska sammansättningarna kan utsättas for sedvanliga farmaceutiska metoder såsom sterilisering och/eller innehålla sedvanliga adjuvanser som konserveringsmedel, stabilisatorer, vätmedel, emulgeringsmedel, buffertar, fyllnadsmedel etc, vilka beskrivits någon annanstans häri.

Den farmaceutiska sammansättningen enligt uppfinningen kan administreras lokalt eller systemiskt såsom ovanpå, intravenöst, oralt, parenteralt eller som implantat och även rektal användning är möjlig. Lämpliga fasta eller flytande farmaceutiska beredningsfonner är t ex granulat, pulver, tabletter, belagda tabletter, (mikro)kapslar, suppositorier, siraper, emulsioner, suspensioner, krämer, sprayer, droppar eller injicerbar lösning i ampullfonn och även preparationer med utdragen frisättning av aktiva föreningar, i vilka beredningarnas hjälpämnen, spädningsmedel, adjuvanser eller bärare används som de brukar göras och såsom beskrivits ovan.

Den farrnaceutiska sammansättningen administreras till en patient i en farmaceutiskt effektiv dos. Med "farmaceutiskt effektiv dos" menas en dos som är tillräcklig for att leda till önskade effekter i förhållande till tillståndet for vilket den administreras. Den exakta dosen beror på föreningens aktivitet, administreringssättet, rubbningens typ och svårighetsgrad. Beroende på patientens ålder och kroppsvikt, kan olika doser behövas. Administreringen av dosen kan utföras både genom en enkel administrering i fonn av en enskild dosenhet eller också flera mindre dosenheter och 518 759 :Lä även genom flera administreringar av delade enheter vid specifika intervall. Till - . | - ø c u u u ~ n - Q - o: exempel vaccinering.

Den farmaceutiska sammansättningen enligt uppfinningen kan administreras ensam eller i kombination med andra terapeutiska medel. Dessa medel kan inblandade som en del av samma farrnaceutiska sammansättning eller administreras separat.

"Patienten" enligt uppfinningen omfattar både människor och andra däggdjur.

Följaktligen är metoderna tillämpbara både för humanbehandling och veterinärtill- lämpningar.

Följande exempel är menade att illustrera, men inte att begränsa uppfinningen på något sätt, i någon utformning eller form, endera uttryckligen eller underförstått.

EXEMPEL Exempel 1 Framställning av metvleringsmotståndskraftig plasmid-DNA i bakterier 1. Ympa 2 ml vanligt LB-medium och 50 ug/ml ampicillin i ett 10 ml provrör med en E. coli innehållande en intressant plasmid. 2. Odlingen inkuberas i en skak (200 rpm) vid 37°C över natt. 3. Övemattsodlingen används sedan för att ympa ett 500 ml LB-medium i en 2 liters odlingskolv. Kolven inkuberas vid 37°C i en skak tills tillväxten av bakterier når OD(650) av 0,5 till 0,8. 4. Sïdeoxiazacytidin eller annan deoxicytidinanalog tillsätts till en koncentration på 10 |.1M och kloramfenikol tillsätts till en slutlig koncentration av 180 ug/ml. 5. Odlingen inkuberas vid 37 °C på en skak såsom ovan över natt. 6. Bakterierna pelleteras genom sedvanlig centrifugering och plasmid-DNA isoleras enligt Qiagen Inc. Maxiprep standardprotokoll.

Exempel 2 Framställning av adenovirus med metvleringsmotståndskraftig DNA 518 7.59 Qjš n | o u nu . Sprid ut 911 eller 293 celler i vanliga T-75-kolvar för att vara 60-90 % konfluerande vid tidpunkten för infektion (ca lxl07 celler/T-75). Vanligtvis är 15 till 20 T-75-kolvar tillräckliga för att göra en högtiterstock.

Infektera celler med virussupematant med en infektionsmultiplicering (MOI) på 5 till 10 PFU (plackbildande enheter) per cell.

. På dag 2 tillsätts 5'-deoxiazacytidin till en koncentration av 10 uM.

. När alla celler har vuxit ihop och ungefär hälften av cellerna lösgjorts (vanligtvis vid 3 till 4 dagar efter infektion), skörda och slå samman alla kolvar. Centrifugera i 5 minuter i en bänkcentrifug (~5 00 g) och avlägsna supematanten.

. Slamma upp pelleten i 8,0 ml steril PBS. Genomför 4 cykler av frysning/tining/vortex. Centrifugera lysatet i Sorvall HS4-rotom vid 6000 rpm (7000 g) vid 4°C i 5 minuter.

. Väg upp 4,4 g CsCl i ett 50 ml koniskt rör, överför 8,0 ml av klar virussupematant till röret och blanda väl genom vortexning. Överför CsCl-lösningen (ca 10 ml, densitet 1,35 g/ml) till ett 12 ml polyallomer-rör för en SW4l-rotom. Täck röret med 2 ml mineral olja. Bered ett balansörör. Centrifugera gradienten i SW 41 rotom vid 32 000 rpm, l0°C, i 18 till 24 timmar.

. Samla upp virusfraktionen (ca 0,5 till 1,0 ml) med en 3 ml spruta och en l8g nål.

För in nålen underifrån genom röret nedifrån. Blanda med lika volym 2X Lagrings Buffert (2X Lagrings Buffert = 10 mM Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 % BSA och 50 % glycerol, sterilfiltreras). Lagra virusstocken vid -20°C.

. Kontrollera virustitem med GFP (föredras) eller med en plaque analys (se nedan) eller immunhistokemisk infargning eller avläs helt enkelt OD vid 260 nm. För att avläsa OD tillsätt 15 ul virus till 15 ul blanklösning (blanklösning = 1,35 g/ml CsCl blandat med lika volym 2X Lagrings Buffert) plus 100 ul TE/0,l % SDS, vortexa i 30 sekunder, centrifugera i 5 minuter. Mät A260. En A260-enhet innehåller ~l x 1012 viruspartiklar (partiklarzinfektösa partiklar ska vara ungefär 2011). 518 759 SLM o o e v o ø . v c u u Q ø c | | e oo Exempel 3 Mätning av inkorpoeringsgraden S-azadeoxicvtidin i DNA.

Metod 1 Tillsätts T-deoxiazacytidin till medierna innehållande växande celler till en koncentration av 10 pM. Tillsätt även en spårmängd MC-märkt deoxiazacytidin, t ex 5 pCi. Om den specifika aktiviteten av märkt azacytidin är 500 Ci/mmol är detta lika med 10 pmol azacytidin. Om den använda volymen är 100 ml, är koncentrationen av den radiomärkta nukleotiden 100 pM. Förhållandet mellan den kalla och inmärkta nukleotiden är då 100 000: 1. Radioaktiviteten hos det isolerade DNA:t mäts i en scintillationsräknare och inkorporeringen uppskattas beroende på eeintiiietienetäitnetene effektivitet (1 ci = 1 x 10” tips).

Metod 2 Tillsätt 5'-deoxiazacytidin till mediema innehållande växande celler till en koncentration av 10 pM. Azacytidin-molekylen kan separeras från cytidin med hjälp av HPLC. Det isolerade DNA:t behandlas med DNA-ase I, så att en hög koncentration av fria nukleotider bildas. Proverna injiceras på en lämplig HPLC-kolonn och nukleotiderna separeras till cytidin, tymidin, guanin, adenin respektive 5'-azacytidin.

Koncentrationen av azacytidin mäts i förhållande till cytidin.

Claims (35)

o Q | u u nu 5 1 8 7 5 9 aš PATENTKRAV

1. En vektor omfattande en nukleotidsekvens, vari en eller två cytosiner i åtminstone ett CpG-motiv har ersatts med en cytosinmotsvarighet som är motståndskraftig mot metylering.

2. Vektom enligt patentkrav l, vari cytosinmotsvarigheten ersätter S-positionen i pyrimidinringen hos cytosin som befinner sig i CpG-motivet med N, O eller C-X.

3. Vektom enligt patentkrav 2, vari cytosinmotsvarigheten är ett cytidinderivat.

4. Vektom enligt patentkrav 3, vari cytidinderivatet är S-azacytidin och/eller 5- azadeoxicytidin.

5. Vektorn enligt patentkrav 2, vari X är en låg eller icke-elektrofll grupp.

6. Vektorn enligt patentkrav 5, vari den låga icke-elektrofila gruppen väljs från gruppen bestående av etyl och metoxi.

7. Vektom enligt något av föregående patentkrav , vari den eller de ersatta cytosinema är placerade i en och samma DNA-sträng eller i båda DNA-strängama hos vektom.

8. Vektom enligt något av föregående patentkrav , vari vektorn väljs från gruppen bestående av plasmider, bakteriofager, fagmider och virala vektorer.

9. Vektom enligt något av föregående patentkrav , vari antalet cytosinmotsvarigheter och fördelningen av cytosinmotsvarigheter förändrar nukleotidsekvenserna omfattande nämnda cytosinmotsvarigheter så att de blir metyleringsmotståndskraftiga och bibehåller uttrycket av nukleotidsekvensema omfattande CpG-motiv som innehåller cytosinmotsvarigheter.

10. lO. Vektom enligt något av föregående patentkrav , vari åtminstone l % av CpG- motiven har ersatts med cytosinmotsvarigheter.

11. ll. Vektorn enligt patentkrav 10, vari åtminstone 5 % av CpG-motiven har ersatts med cytosinmotsvarigheter.

12. Vektom enligt patentkrav ll, vari åtminstone 10 % av CpG-motiven har ersatts med cytosinmotsvarigheter.

13. Vektorn enligt patentkrav l2, vari åtminstone från omkring 1 % till omkring 100 % av CpG-motiven har ersatts med cytosinmotsvarigheter. 518 759 :Le u - ~ n | o u ~ u u u v u n oo

14. Vektorn enligt något av föregående patentkrav, vari vektom omfattar åtminstone en gen eller del av en gen.

15. Vektorn enligt något av föregående patentkrav, vari vektom omfattar en eller flera kontrollsekvenser för uttryck.

16. En givarvärdcell omfattande en vektor enligt något av patentkraven 1-15.

17. Givarvärdcellen enligt patentkrav 16, vari givarcellen är en eukaryot eller en prokaryot cell.

18. Givarvärdcellen enligt patentkrav 17, vari givarvärdcellen väljs från gruppen bestående av isolerade bakterier, svampar, växter, insekter, däggdjur eller andra lämpliga djurceller eller cellinjer såväl som transgena djur eller växter.

19. Givarvärdcellen enligt något av patentkraven 15-18, vari givarvärdcellen är en värdcell tillhörande en GMP-certifierad cellinje.

20. Givarvärdcellen enligt patentkrav 19, vari cellinjen är en däggdjurscellinje.

21. En nukleotidsekvens erhållen från givarvärdcellen enligt något av patentkraven 16- 20, nukleotidsekvensen är del av vektom enligt något av patentkraven l-15.

22. Nukleotidsekvensen enligt patentkrav 21, vari nukleotidsekvensen är en eller flera gener och/eller del av en eller flera gener och/eller en eller flera kontrollsekvenser för uttryck.

23. En polypeptid tillverkad av givarvärdcellen enligt något av patentkraven 16-20, nukleotidsekvensen som kodar för polypeptiden är del av vektom enligt något av patentkraven 1-15.

24. En farmaceutisk sammansättning omfattande vektom enligt något av patentkraven 1-15 och/eller givarvärdcellen enligt något av patentkraven 16-20 och/eller nukleotidsekvensen enligt patentkraven 21-22 och/eller polypeptiden enligt patentkrav 23 och ett farrnaceutiskt acceptabelt spädningsmedel, bärare, adjuvans eller hjälpämne.

25. En metod att minska metyleringen av CpG-motiv i en vektor i en mottagarvärd, varvid metoden omfattar att man ersätter åtminstone en cytosin i ett CpG-motiv med en cytosinmotsvarighet enligt något av patentkraven 1-15.

26. Metoden enligt patentkrav 25, vari förfarandet omfattar stegen att i) tillhandahålla en vektor, ii) överföra vektorn in i en givarvärdcell, iii) odla givarvärdcellen innehållande vektom i ett tillväxtmedium bestående av en lämplig mängd 518 759 aa- cytosinmotsvarigheter och iv) skörda den uppfórökade vektom omfattande u u - o a » ~ n n u o n n ~ - - uv inkorporerade cytosinmotsvarigheter i åtminstone ett CpG-motiv.

27. Metod enligt patentkrav 26, vari cytosinmotsvarigheten är ett cytidinderivat.

28. Metoden enligt patentkrav 27, vari cytidinderivatet är 5-azaeytidin och/eller 5-aza- deoxicytidin.

29. Metoden enligt något av patentkraven 26-28, vari den skördade vektom är en vektor enligt något av patentkraven 1-15.

30. Metoden enligt något av patentkraven 25-29, vari givarvärdcellen är en givarvärdcell enligt något av patentkraven 16-20.

31. Metoden enligt något av patentkraven 25-29, vilken används i liten- eller storskalig tillverkning av en nukleotidsekvens och/eller en polypeptid inom den kemiska industrin såsom den fannaceutiska industrin.

32. En sats omfattande en vektor enligt något av patentkraven l-15 och/eller en givarvärdcell enligt något av patentkraven 16-20.

33. En metod att överföra en vektor enligt något av patentkraven 1-15, en nukleo- tidsekvens enligt något av patentkraven 21-22, en polypeptid enligt patentkrav 23 eller en farmaceutisk sammansättning enligt patentkrav 24 in i en mottagarvärdcell, varvid metoden väljs från listan bestående av elektroporering, mikroproj ektilbeskjutning och liposomforinedlad överlämning.

34. En vektor enligt något av patentkraven 1-15, en givarvärdcell enligt patentkraven 16-20, en nukleotidsekvens enligt något av patentkraven 21-22, en polypeptid enligt patentkrav 23 eller en farrnaceutiskt sammansättning enligt patentkrav 24 för användning vid behandling och/eller i diagnostik.

35. Användning av en vektor enligt något av patentkraven 1-15, en givarvärdcell enligt patentkraven 16-20, en nukleotidsekvens enligt något av patentkraven 21-22, en polypeptid enligt patentkrav 23 eller en farmaceutisk sammansättning enligt patentkrav 24 för tillverkning av ett läkemedel for användning vid behandling och/eller i diagnostik.