SE513149C2 - Läkemedelsdistributionssystem med tvåstegsmålsökning, till specifika celler eller vävnad och till dess cellkärna - Google Patents

Description

513 149 2 1996) eller föreningar som interagerar elektrostatiskt med DNA såsom spermin, spermidin och putrecinderivat (Sjöberg et al 1997 i press). ill En strategi för att uppnå tvästegsmålsökning av nuklider innefattar användning av dubbelstrângat DNA konjugerat till den tumörsökande molekylen. Man har nyligen visat att det är möjligt att koppla epidermal tillvåxtfaktor (EGF) till en SO-mer självkomplementär oligonukleotid och att det sålunda bildade DNA- EGF-konjugatet binder specifikt till EGF-receptorn på humana gliomceller som överuttrycker receptorn. Vidare visade man att DNA-EGF-konjugatet internali- serades och bröts ner efter bindning till receptorn (Gedda and Carlsson, 1997).

Ett av de problem som emellertid mäste lösas innan strategin blir ett starkt alternativ för tvåstegsmålsökning vid tumörterapi innefattar den låga stabilite- ten av konjugatets DNA-del i systemisk cirkulation. Vidare möjliggör ovan angivna koncept endast ett mycket begränsat antal toxiska substanser, dvs. nuklidbårande DNA-bindare, som kan associeras med varje tumörsökande bârarkonjugat. Detta år en allvarlig begränsning eftersom endast en liten frak- tion av konjugaten kan förväntas nå målcellerna och via målsökningsämnet binda till cellytan. Efter internalisering och nedbrytning av DNA-målsöknings- komplexet kommer dessutom endast ett begränsat antal av de toxiska mole- kylerna att nå sitt slutmål, dvs. det nukleära DNA:t.

Liposomer har under en lång tid varit intressanta som potentiella läkemedels- bårare. Den unika strukturen möjliggör transport av både fettlösliga och vattenlösliga substanser. För att öka cirkulationstid och öka stabiliteten av liposomerna är det viktigt att välja en rätt lipidsammansättning i liposom- membranet. Destabiliseringen av liposomerna kan vidare minimeras om lipo- somytan förses med polymerer. Flera typer av polymerer ger ökad cirkulations- tid men polyetylenglykol (PEG) har hittills givit det bästa resultatet (Lasic and Martin 1995). 513 149 När liposomen, som är fylld med en toxisk substans, har bundit till målcellen måste liposomens innehåll tömmas. Detta sker naturligt genom passivt läckage och liposommembranets permeabilitet kan också modifieras genom att sam- mansättningen av lipidema varieras. Upptaget genom passiv diffusion är inte särskilt effektivt, det mesta av liposominnehållet förloras redan innan det når cellmembranet. Beroende på läkemedlets egenskaper, såsom fettlöslighet och laddning, kan en väsentlig del fastna i cellmembranet.

Ett sätt att öka upptaget och samtidigt undvika membranlokalisation, är att använda ligander, antikroppar och antikroppsfragment eller andra lämpliga ämnen, med hög specificitet för receptorer eller andra målstrukturer med endo- cytotoxisk förmåga. Internalisering av hela liposomer i celler har visats i in vitro-experiment där folsyra, eller ett Fabïfragment riktat mot glykoprotein p185HER2 konjugerades till stabiliserade liposomer (Kirpotin et al 1997 , Lee och Low 1994, Park et al. 1995). När liposomen har internaliserats i cellen kan den inneslutna substansen antingen diffundera genom liposom- och endosom- membranerna in i cytoplasman eller, i vissa fall, frigöras efter lysozymal ned- brytning av bärarliposomen. Emellertid måste fortfarande problemet lösas med att rikta läkemedlen till kärnan hos specifika målceller.

Sammanfattning av uppfinningen Föreliggande uppfinning löser problemet med att rikta läkemedel till kärnan hos specifika målceller. Genom att tillhandahålla ett nytt tvåstegsrnålsöknings- system för läkemedelstillförsel, tillhandahåller uppfinningen effektiv tillförsel av olika läkemedel till tumörcellers kärnor. Detta betyder att toxiciteten för nor- mala organ minimeras. Ytterligare en fördel är att uppfinningen möjliggör administrering av terapeutiska doser också till spridda tumörceller och meta- staser. Syftet med uppfinningen är att behandla eller analysera både stora tumörmassor såväl som små tumörcellskluster och enskilda spridda tumör- celler. 513 149 Enligt uppfinningen tillförs stora mängder nuklider till tumörcellerna och dessa nuklider kommer att nå och binda det nukleära DNA:t. Det senare betyder att varje radioaktivt sönderfall kommer att skada nukleärt DNA och därigenom kommer den terapeutiska processen att bli effektivare. Faktum är att samma mängd radioaktiva nuklider kommer att ge åtminstone tio gånger större skada när radioaktiviteten är lokaliserad i det nukleära DNA:t än när den är lokalise- rad utanför cellkärnan. Samma argument gäller när stabila nuklider för neu- tron- eller foton-aktivering används.

I en första aspekt avser uppfinningen således ett läkemedelsdistributionssystem med tvästegsmålssökning, vilket innefattar en kombination av: a) en lipidbärare försedd med cellmålsökningsämndn) för att rikta läkemedels- distributionssystemet till specifika celler eller vävnad; och b) läkemedel inneslutet i lipidbäraren och försett med ett DNA-målsöknings- ämne fór att rikta läkemedlet till kårnoma hos specifika målceller.

Förhållandet mellan a) och b) kan variera mellan 1 till 10-8, beroende på det valda läkemedlet. Möjligheten av att innesluta ett stort antal läkemedel i en lipidbärare betyder att den terapeutiska effektiviteten kommer att öka drama- tiskt jämfört med kända tumörläkemedel.

Företrädesvis är läkemedlen nuklider som antingen kan vara radioaktiva eller stabila eller andra DNA-skadande substanser, såsom PNA- och DNA-alkyleran- de ämnen. Läkemedlen kan användas antingen fór terapeutiska eller diagnost- iska ändamål. För nuklider är ovanstående förhållande mellan a) och b) före- trädesvis i det undre området. För andra DNA-skadande substanser, kommer en mindre mängd läkemedel att vara tillräcklig.

Lipidbäraren kan vara godtyckligt lipidaggregat med förmåga att innesluta ett läkemedel och den föredragna lipidbäraren är en liposom, kubosom, hexasom eller micell.

VN 513149 5 Cellmålsökningsämnet som år associerat med liposomytan är valt från gruppen bestående av naturliga eller syntetiska ligander, antikroppar, antikroppsfrag- ment eller andra biomolekyler som är lämpliga för ändamålet.

Enligt uppfinningen kan olika typer av toxiska innehåll, såsom nuklider, an- vändas. Nuklider såsom ”SI (Auger-strålning) och 211At (oc-partiklar) ge hög lokal jonisationsdensitet och skada DNA mycket effektivt. Stràlare med kort räckvidd kräver en målsökningsdel som möjliggör internalisering av liposomerna.

Bland stabila nukleider, är bor (1010) en föredragen typ av cancerämne. Efter administrering av liposomerna, bestrålas tumörområdet i detta fall med neutro- ner. Härvid bildas icke stabil UB och det sönderdelas snabbt och ger partikel- strålning i form av He (ot-partiklar) och Li-kärnor, som effektivt kommer att döda den målsökta cellen (Carlsson et al. 1994). Liksom för substanser med korträckviddstrålning, ska den borerade substansen lokaliseras i kärnan och helst binda till tumörcellens nukleära DNA. ß-strålare med lång räckvidd, såsom 1311, kan användas som ett komplement.

Sådana nukleider ger terapeutisk verkan även om radionukliden endast binder till cytoplasman eller membranet av cellen. Dessa typer av ß-strålare kan an- vändas för att erhålla korseldsbestrålning i större cellgrupperingar.

DNA-målsöknirigssubstansen som är kopplad direkt till nukliderna kan vara en DNA-interkalator och / eller en förening som interagerar elektrostatiskt eller rea- gerar kemiskt med DNA.

I en andra aspekt, avser uppfinningen en metod för cancerterapi, innefattande att man till en individ i behov därav administrerar en terapeutiskt effektiv mängd av läkemedelsdistributionssystemet enligt uppfinningen. Om läke- medelsdistributionssystemet innefattar en nuklid som ska aktiveras, innefattar metoden också det ytterligare steget av att besträla cancerområdet. 513 149 Således avser uppfinningen stabiliserade liposomer med dubbel målsökning Ltargeting), SLT-partiklar, för transport av en toxisk substans till cellkârnan.

Genom att innesluta den toxiska substansen i SLT-partiklar kommer upptaget i tumörer att öka betydligt samtidigt som interaktioner av substansen med friska organ och vävnader kan minimeras. En lämpligt vald målsökningsligand möjlig- gör också administrering av en toxisk substans i terapeutiska doser också till spridda tumörceller.

Detaljerad beskrivning av uppfinningen Uppñnningen kommer nu att beskrivas närmare med hänsyn till de medföljan- de ritningarna och exemplen.

Figur 1 visar en SLT-partikel fylld med en toxisk substans; och Figur 2 visar SLT-partiklar (1) som binder till receptorer (2) på ytan av målcellen och som internaliseras genom endocytos (3). Det toxiska innehållet frigörs (4) och kan diffundera in i cytoplasman.

EXEMPEL: Framställníng av SLT-partiklar med olika egenskaper a. Lipidbäraren Strukturen av SLT-partiklarna, deras stabilitet och läckage bestäms för det mesta genom liposomdelens egenskaper. Sammansättningen i lipidmembranet, såväl som koncentration och typ av PEG-polymer, kommer att ändras och an- passas till det toxiska innehållet och målsökningsämnena som används.

Liposomernas storlek kommer också att varieras. Genom att välja liposomer av lämplig storlek, cirka 100 nm, kan man uppnå en ackumulation i tumörväv- nad. Tumörens endotel är mer permeabelt än normalt endotel vilket betyder att liposomer kommer att ackumulera i tumörvävnaden. Analyser av struktur och storlek kommer att utföras genom kryo-transmissionselektromikroskopi, ljus- spridning, NMR och olika fotofysikaliska metoder. 513 149 Sammanfattningsvis måste lipidbäraren ha följande egenskaper: - vara stabil mot extracellulärt läckage av det infångade läkemedlet - ha kvaliteter som möjliggör långa cirkulationstider - ha en storlek som möjliggör extravasation och ackumulering i tumörvävnaden. b. Förstastegsmålsökningsämnen Koppling av målsökningsâmnen kan utföras på ett antal sätt. Antingen kan målsökningsåmnet förses med en lipofil region, som är fäst i fosfolipidmernbra- net av SLT-partiklarna, eller så kan de fästas till den yttre PEG-delen genom olika kemiska metoder.

Cellmålsökningsämnena är företrädesvis valda från gruppen av substanser som binder till mål bestående av till exempel folat eller EGF-receptorer som överut- trycks i vissa typer av tumörceller; c-erb-B2-protein som är relaterat till EGF- receptorn och ofta förefaller att förekomma rikligt i vissa ardenocarcinom, hematopoietíska mål, såsom CD2O eller CD32-antigenerna som uttrycks i vissa hematopoietiska tumörsjukdomar. Således finns det fler potentiella mål.

Cellmålsökningsämnet måste ha följande egenskaper: - hög och specifik affinitet för receptorer och antigener som överuttrycks på målcellerna - mediera intracellulär deposition av toxisk komponent - Visa en stabil koppling till liposomens utsida. c. Andrastegsmålsökniiigsämnen Föredragna föreningar enligt uppfmningen är borerade och radionuklidbärande DNA-interkalatorer såsom fenantridin, akridin och naftalimidderivat, och också föreningar som interkalerar elektrostatiskt med DNA såsom spermin, spermidin och putrecinderivat. Interkalatorerna är särskilt lämpliga för tumörterapi på grund av att både den aktiva substansen och DNA-interkalationen i sig kan ge en terapeutisk verkan. 515 149 Andrastegsmålsökningsämnet måste ha följande egenskaper: - hög affmitet för det nukleära DNA:t - hög vattenlöslighet vid fysiologiskt pH och jonstyrka - möjliggöra effektiv påfyllning för att fylla lipidbäraren - visa minimalt läckage när det är inneslutet i lipidbäraren. d. Läkemedel [nuklider] Nuklider för terapi Kortrâckviddstrålare, som ger hög lokal jonisationsdensitet, till exempel 1251 (Anger-strålning) och 211At (oz-partiklar) kommer att användas för att uppnå maximal effekt i en enskild màlsökt cell.

Vidare kommer den stabila nukliden 1°B att testas. 1°B aktiveras genom externt applicerade neutroner. Andra alternativ âr stabil jod eller brom som kan aktive- ras med fotoner.

Vidare kan dessa kombineras med radionuklider med långräckvidd ß-strålnirig, i synnerhet halogener såsom 1311, men också andra nuklider såsom 32P och metallerna 67Cu och 189Re. Dessa används för att uppnå korseldsbestrålning i större cellgrupperingar.

Nuklider för distributionsstudier in vivo Gammastrålare kommer att inkorporeras i lipidbärare för att möjliggöra distri- butionsstudier i människor genom PET- och SPECT-teknik (Nilsson et al 1995, Westlin et al 1995). För detta ändamål avser vi också att använda positron- strålare i halogengruppen med relativt långa halveringstider såsom 'ffiBr och 1241, som är lämpliga för "makromolekulär" PET. För SPECT avser vi att använda halogener såsom 1311. al 513 149 9 e. sammansättning av en lovande SLT-partikel Unilarnellâra liposomer med en diameter av 50-150 nm bestående av 50-58 mo1% 1,2-distearoyl-sn-Glycero-3-fosfokolin (DSPC), 40 mo1% kolesterol ((Chol) och 2-10 mo1%, 1,2-distearoy1-sn-G1ycero-S-fosfoetanolamin-N [poly(etyleng1yko1)-2000] (PEG(2000)-DSPE).

Liposomerna har epidennal tillvâxtfaktor (EGP) kovalent bunden till den distala änden av PEG-kedjorna.

I liposomernas vattenhaltiga inre år föreningen 1,8-Diamino-4-N-3-[12-(N-9- akridinyl-ß-arninopropyl)-p-karboran-1-yl] propyl-4-azooktanväteklorid (W SA 1) innesluten som har följande strukturformel: Formuleringen innehåller 15-40 mg/ ml total lipid och 1-4 mg/ ml WSA1 vilket motsvarar cirka 6 x 105 - 1,3 x 106 WSAl/liposom. 513 149 - 10 Referenser Carlsson, J .; Gedda, L.; Grönvik, C.; Hartman, T.; Lindström, A.; Lindström, P.; Lundquist, H.; Lövquist, A.; Malmquist, J.; Olsson, P.; Essand, M.; Pontén, J.; Sjöberg, S.; and Westermark, B. 1994. Strategy for boron neutron capture therapy against tumor cells With over-expression of the epidermal growth factor- receptor. Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 30: 105-115.

Gedda, L.; Silvander, M.; Sjöberg, S.; Tjarks, W., and Carlsson, J. 1997. In vitro characterisation of boronated phenantridinium analogues. Submitted to Anti- Cancer Drug Design.

Kirpotin, D.; Park, J.W.; Hong, K.; Zalipsky, S.; Li, W.; Carter, P.; Benz, C.C., and Papahadjopoulos, D. 1997. Sterically stabilized anti-I-IERZ immunoliposomes: design and targeting to human breast cancer cells in vitro.

Biochemistry 36:66-75.

Lasic, D. and Martin, F. (Eds), 1995. Stealth Liposomes. CRC Press, Boca Raton.

Lee, R.J. and Low, P.S. 1994. Delivery of liposomes into cultured KB cells via folate-receptor mediated endocytosis. J. Biol. Chem. 43198-3204.

Nilsson, S.; Reubi, J.C.; Kälkner, K.M.; Laissiue, J.A.; Horisberger, U., Olerud, C., and Westlin, J .E. 1995. Metastatic hormone-refractory prostatic adenocarcinoma express somostatin receptors and is visualized by 1 l-In-DTPA- D-Phe-1-octreotíde scintigraphy. Cancer Res. 55 :5805-58 1 0. 513 149 ll Park, J.W., Hong, K., Carter, P., Asgari, H., Guo, L.Y., Keller, G.A., Wirth, C., Shalaby, R., Kotts, C., Wood, W.I., Papahadjopoulos, D., and Benz, C.C. 1995.

Development of anti-p185I-IER2 irnmunoliposomes for cancer therapy. Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 1327-1331.

Press, O. W. 1995. Treatment of recurrent lymphomas With unmodified antibodies and radioirnmunoconjugates. Tumor Targeting 131-35.

Sjöberg, S.; Carlsson, J .; Ghaneolhusseini, H.; Gedda, L.; Hartman, T; Malmquist, J .; Naeslund, C.; Olsson, P.; and Tjarks, W. "Chemistry and biology of some low molecular weight boron compounds for Boron Neutron Capture Therapy", J. Neuro-Oncol. 19969, 33, 41-52.

Sjöberg, S. "Boron Chemistry for NCT".." In; Larsson, B.; Crawford, J. and Weinreich (eds.) Advances in NCT Vol. 2: Chemistry and Biology. Elsevier Scientific, Amsterdam 1997 in press.

Westlin, J.E.; Edgren, M.; Letocha, H.; Stridsberg, M.; Wilander, E., and Nilsson, S. Positron emission tomography utilizing ll-C-S-hyrdroxytryphtophan, plasma biochemistry and neuroendocrine irnmunohistochemistry of metastatic renal cell carcinoma. Oncology Reports 2543-548.

Claims (5)

513 149 12 NYA PATENTKRAV

1. Lâkemedelsdistñbutíonssystem med tvàstegsrnålsökning, känneteck- nat av att det innefattar a) en lipidbärare försedd med cellmålsökningsämnem) för att rikta läkeme- delsdistributionssystemet till specifika celler eller vävnad; och b) läkemedel inneslutet i lipidbäraren och försett med ett DNA-målsöknings- ämne för att rikta läkemedlet till kärnorna hos specifika mälceller, varvid läkemedlet är radioaktiva eller stabila nuklider lämpliga för aktivering.

2. Läkemedelsdistributionssystem enligt krav 1, kännetecknat av att för- hållandet mellan a) och b] är 1 till 1043.

3. Läkemedelsdistributíonssystem enligt krav 1 eller 2, kännetecknat av att cellmålsökningsâmnet är valt från gruppen bestående av naturliga eller syntetiska ligander, antikroppar och antikroppsfragment.

4. Läkemedelsdistributionssystem enligt något av kraven 1-3, känneteck- nat av att DNA-målsökningsämnet är en DNA-ínterkalator eller ett ämne som interagerar elektrostatiskt eller reagerar kemiskt med DNA.

5. Läkemedelsdistributionssystem enligt något av kraven l-4, känneteck- nat av att det innefattar: a) som en lipidbärare, unílamellära liposomer med en diameter av 50-150 nm bestående av 50-58 mol% 1,2-distearoyl-sn-Glycero-3-fosfokolin (DSPC), 40 mol% kolesterol ((Chol) och 2-10 mol%, 1,Z-distearoyl-sn-Glycero-S- fosfoetanolarnin-N-[poly(ety1englykol)-2000] (PEG(2000)-DSPE); och såsom ett cellmålsökningsämne, epidermal tillväxtfaktor (EGF) kovalent bunden till den distala änden av PEG- kedjorna; och, såsom DNA-målsökningsläkemedel, 513 - -149 13 b) föreningen 1,8-Diamino-4-N-3-[12-(N-Q-akridinyl-3-aminopropy1)-p- karboran- l-yl] propyl-4-azooktanväteklorid (WSAI).